Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетичесийй анализ интрогрессии элементов генома эгилопса в геном мягкой пшеницы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетичесийй анализ интрогрессии элементов генома эгилопса в геном мягкой пшеницы"

. НащоН&ЛЬНа академ1я наук Украши 1нст.итут молекулярно! бюлогп 1 генетики

На правах рукопису . • УДК 575.113; 575.015.3:633.11

Чзботар Саб 1 на В1таливна

Мэлекулярно-генетичний анал18 ютрогресп елементи< генома еплопса в геном м'яко! пшенищ

03.00.03 - молекулярна бюлопя

АВТОРЕФЕРАТ дисертацп на здобуття'наукового ступени кандидата бюлопчних наук

КИ1В 1095

Робота виконача у-tuДД1Л1 генно1 тжвнеpil Селекфйло-генетичного шституту УААН.

Науковий KepiBHiiic доктор бюлопчних наук професор IQ М. Сиволап

Оф1ц1йн1 опоненти: доктор бюгопчних наук С. С. Ыалюта

кандидат бшлой чних наук О. Ii Живслуп

Провидца установа: 1нститут генетики i цитологи АН Био-pyci

*

Захист дисертаци в^дбудеться^даУ/. 1995 р.

о..... годк:й.1 -на засхданн! Спещал1зов.до1 ради____

1нституту молекулярио5 бюлоги i генетик: HAH Украпш за адресов (252143, и. KiiiB, вул. Зоболтного, 24). 3 цисерт .щею можна ознайомитися в бЮлЮтещ 1нституту молекулярное бюлогп i генетики HAK Укра1ни

Автореферат розюлано ^tWZ-g.. 1995 р.

Вчоний секретар

Ctieuiajii30BaH0i ради ,

чсандвдзт ё:олог1ЧИХ наук ' ^ <?ГЛ. Лукаш .

Актуальность пробдеми. Розвиток теорп i практики по-лтгення сгльськогосподарсышх рослин, як правило, пов'яза-ний з розросжогояшшв розшрекня генофонду культурних вид!в за рахунок чулзор!дчого генетичного ма?ер1алу. Неэвзжаючи на значний прогрес в одержат шжвидоеих пбрид^в, молекуляр-но-гёнетичт проде'еи, що приймають участи в створеннх форм В1ддзленого пбридного поход;.ення, залишаються в целому не

виясненими. Анализ Miиливостi генома в еволюцхйному плат i

(

в зв'яэку з iHTporpeciao в^ддаленного в генетичному в1дно-шенш матерiany. став актуальиим гаяцангям молекуляржн генетики.

Потребуюгь розгляду проблем» дсслтдження i оценки Min-ливост! геном!в, выкликаноi вхддаленою пбридизащею, шдбо- ' ру шлекулярних маркеров, що дозволятеь тестувати гнтрог-реЫю чу;шр1диого генетичного watepiал/. Ефективним напрям-ком у цьому плат с вивчення генетичного полиморфизму серед культурних видiв пшенищ i ix ДИКИХ С0Р0ДИЧ1В. •

Мета за&дання роооти. Метою дисертацШкм роботие анализ форм, одержаних Bifl гхбридизацп Ti-iticum a/;-3tivum з Ae?ilops cylindrica, а також проведения ananiay Mi л- i внут-piBiißOBOi Miнливостi, уточнения фглогенетичних взашов1Д-ноеин у деяких вщцв триби Triticeae.

Еезпосередшми завданнями роботи були:

1, Одержшня i анализ öiöfliотеки клонив високоповторю-aanoi ДНК Ае. tausch!i (J). Лналаз генетичного шшморф.зыу вюок^повторюватшх посл!довностей серед вид1в Triticeae i ферм Нбр'.щкого 1ю:.од;г,ення.

2. Визначэши piaim м1йш..доно"1 MiiirtiSocTi, встановлекна

ступени гекомко! спор1днеиют! м!ж видами, залученими до в!ддалеко1 гШридизаци в результат! використання ПДРФ-ана-Л1зу Кэг-локус1е, електрофорезу заяасних б!лк!в, К^О-акот-

3. Вивчечня генетичяс! мишшгсп, що виникла у насл!-док в1ддалеио! пбридизацп, в яор1внянн1 з мьх- I внутр1-задовою вар1аб1льн1сти, класмф!каия селекщйного матер1алу в1дпов1 дко до генетичних дистанций, ¿становл^-них при досл1д-арнш р13номан1тних локус1в геношв а допомогою ЦДРФ, елект-. рофорезу запасних б1лк!в, РАРО -аншазу.

Наукова ковизка 1 практичне значения робота.

Наукова новизна дисертаци полягае в'комплексному гид-

ход! до достижения полшорф!зму форм, одержаних в1д чада*

Л5Н01 Пбридизаш!, а та"'ож пол!морф!зму вид!в ТгШсеаэ, як! представляясь пул ген!в для покрашення культурно! пшени-Ш. На основ! шдрахукку даиих, одержаних внасл!док ГЩРФ- та {?АРО--анал!зу, електрофорезу запасних б1лк!в, встаков/еш ф! -логенетичш взаековшюшення м1ж досл!джувяними видами Тписеае.

Практичне значения роботи полягае в. одержана клонотеки високопокт оржваних посл!дсвностей 0 генома Ае. 1аизспИ, ря-• ду 1Уюн!в, як1 мозиуть бути використаними при досл!джеы м!жвидового пол1морф1зму 1 детекци !нтрогрес.1 генетичного матер!алу Ае. су.Ипс!г!са в геном м'яко? пшениц!. Розроблений комплекский п!дх!д до досл1дження 1нтрогресивних форм, шр полягаг в вмкориетанн1 трьох метод!в: ПДРФ, електрофорезу еапасних б1лклв. КАРП-ана^ау, ЯК1 дозволяють- б!льш повно охарактеризувати генами 1 тестува.и" ышливють. викликану тддааеною гюридизащс-чо. Результат;! роботи мскуть знайти

використання у Б1дпов1диих селекЩйних програмах.

Апробацш роботи. Ochcbhî результату., роботи öv.n; пов1-до!дген1 на микнародкому симпоз1ум1 "Керування генетичною мшливютю с1лъськогосподэ,х!ЬКИх рослин" (Ялта, 1992), на мшгародшй' консЬеренцП "Plant Genome II"(San Lieg-o. USA, 1994), на конференцц " Молекулярнп-генетичн1 ыаркери i се-лектя рослин" (Ки1в, 1994), шдаародшй конференцц "Plant Genoire III" (San Diego. USA, 19951.

Публшащ i. QcHOBHi положения дисертацп в1дображш в 7 друкованих працях.

CrpyicTypa i обсяг роботи. Дисертаия склада ■тгься 18 встугу, огляду л1тератури, окспериментально! частини, результата i îx обговоречня та bhchobkib.

Работа викладена на 188 стпр1нках машинописного тексту, BMli4ys ZI малшок l 10 таблиць. Список використано1 Л1тера-тури становий 323 дж?рел.

На захист винсояться:

1. Резулътати Д0сл1Дження генетично! м1нливост1, що виник-ла внасл1док в1ддалено1 пбридизацИ i 1нтрогресп елемент1в чущмдного генома в гекэм м'яко1 пшениц:.

2. Розподи вид1в i селекцШшх форм за р1внем генетических дистанций на баз1 анал-sy данях 1Ц1РФ, ПЛР 1 спектра запасних

61ЛК1В. '

3. Результата ан'ал1зу Mi ж- i вкучр1шньовидово1 шнливоеп клон1в високих noBïopiB AegUops tauschil.

МАТЕР1АЛИ 1 МЕТОДИ ДОС'ЛШНКННЯ Для досл1Длення ~зято 12 форм м'якой пшениш ВС2, F6/8 гибридного яоходження, що одержан! шд ехредування ОдеськоГ

нашвкарликово! х Aegilops cylindrica; 3 сорти м" якой пшени-Ш (Triticuni aestivum L. (ABD)): Одесыса нашвкарликова, Безоста I, 06р1й, 14 BiifliB триби Triticeae: T. iranococcum L. (A), T. boeoticum Boiss (Aft). Т. durum Dosf. (AB), T. palmovae Ivanov. ( AêD), Ae.tauschii Coss (D), Ae. caudata L. (C), Ae. .umbellulatà Zhuk. (CM), Ae. cylindrica Host. (CD), Ae. orassa Boiss С/.е. ventrlcosa Taush (DMV), Ae. triunciallis L. (CCy),Ae. blunclallis Vis (Cum5, Ae. triaristata Willd (СиМ*). Ae. columnaris Zhuk. (С"мс).

ДНК вид!ля Jul з етиольованих проростмв i листя за методом, розробленим в наш!й лаборатори. Рестрикций i електро-форез проводили зПдно рекочендащй , наведених в методах анализу генома ( Дейвю, 1990). Фраедюнування ДНИ по швид-KocTi реаеощацп зд1йснювали з допомогор хроматограф! ï на Пдроксиапатит1 (Br Itter, Kohne, 1976).

Клонування Bsp 143 I фрап:энт1в ДНК Ae. tausch! i по fem HI сайту в pUC 18 проводили зпдно рекомендащй Ыан1ат1с i 1н. (1984). CKpiHiHr клошв зд1йснювали за методом Srunstein and Hogr.jss (1975). Для вид!лення пл1змидно1 ДНК Еикористовували метод луяного л!зиоу Birnboym and Doly (1979). Саузерн-блот г!бридизащю проводили,. як описсно Ма-HiaTic i 1нш. (1984).

Зоиди '¡означали методом розсляно! затравки (Feinberg, Vogelstein, 1983) з викориетанйям набору Multiprime DNA Labelling System (Anersham). Для ПДРФ~акал!зу №Ж-локус1в досл^дл^ваних форм i вид!в використали плазтду pTU 3, щр мстить микгенний спейсер pIHK reiiiB, фланкований фрагментами порлровностей 18S i 26S рРНК гешв.

Амгшфисацш ДНК з дов1Льними праймерами проводили на

прилад1 "Бютерм модель 91 ". Реакшйна сумш об'емом 20 мкл для пол!меразно! лачцюгово1 реакцп вмицувала: 50 мМ KCi. 20 мМ fpic - HCl pH 8,4 (25ЛС), 2-5 мМ MgCl, 0,01% Tv/een КО,по 0,2 мМ кажного dATP, dCTP. dTTP, dGTP, 0.2мкМ праймера 1 1 од. . Тач-пол1мерази (Биотех). У проб1рки поверх р~акщйного розчину наносили 50 мкл морального масла. АмшИфшащю проводили в рьхим1: перший цикл - 65* С - 30 сек, 75J С - 30 сёк, 94'С - 3,5.хв, другчй ци(сл -42"С - 2 хв, 72''С - 2 хв, 94'С - 1 хв, 33 цикла - 52"С - 1,6 хв, 72" С - 2 хв, 94,;'С - 1 xb, 0стсл1й цикл - 52''0 - ?хв, 72'"С - 6 хв.

В рол1 праймер1в викорисган! ол!гонуклестиднi иосл!дов-ност!, синтегован! на автоматичному ДНК-синтезатор! "AppHed Biosysteirs 380Н" фосфорамшисовим методом: Ш. Ь' -CAGGAAACASCTATGAC-3' . iE. 5'-AGöTCTTAACTTGACTAACAi-3' ПЗ. 5' -GAGCAAGTTCAGCCTGu-3' П4 ü.' -CCTTCTCAnTTQGCAAATAC-3'. Продукти аШШСлкацп фракцюнували електрофоезом в 2% яга-роз нем"/ гел1 з IxTBE.

РЕЗУЛЬТАТИ Д0СЛ1ДЖЕННЯ

1. Клонування високоповторювано! ДНК Aegilops tauschii (D) 1 аналю- MiÄ- i внутривидового пол!морф!зму ^еред деяких ви- • д1в Triticeao.

Для вйр!ыення завдань, поставлениих в робои. буж вид1-леш i клонован! високоповторюван!- посл!довност! ДНК з геному Аз. tauschii (D). Для в1дбору впп, специф!чних D геному Ае. tauschii, проводили Саузерн-блот Пбридизацш рестрикто-ванних рекомб!нантнк:с плазм!д с мР-позначеною .ДНК пшениш.

- 6 -

Ihtckchííiío пбридиsymt ПдНК вкОраковували.

Пгралелыга дот-блот пбридизатя рекомбтантних пДНК з радиоактивно позначеною -отальною ДНК Т. aostivurc i ДИК Ае. tauschii п роде шнструв ала високу с хотеть картин пбридиза-Ш1.

Для Bií'íopy специф!Щ1их геному а Ае. tauschii клон i в провели попередню "забивку" ф!льтр1в фрагментовано! до 1000 -20С п. н. ДНК T. aestivum вг1дно методу, запропоноЕаному A"Withawat-Jorson et al. (1990). фоте, виявити клоноваш поелiдэвност1, присутш тiльки в геному D Ае. tauFchil i щр не зуотр1чаються в гелош пшениц1, не вдалось.

Для визначення наявност i клонованих 'посл1довностеЯ в геномах вид i в Triticeae проводили, дот- блот пбридчзацш вст'аЕЖ ВШ з тотальною ДНК ' ï. aostivurn (ABD), Ае. tauschii (û), Ае. cylindrlca (CD), а також ячменю (Н), жита (R) 1 ДНК Vitis virtfera - виду, щр нз мае близькоспор1Днених в1Дно-п;еяь з трибо» Triticoao.

Шсл1дки дот- пбридизаап продемонструвал значну по-дЮнють D renoMiB Ае. tauschii, T. aestivum, Ае. cylindrlca, а тачож наявшеть аналог1чних ВПП в С 1 А гено-М1.

Одержат результата можуть ев^чить- про наявшеть в дссд!джуваних видах рцноланиних за р1внем дивергенци ci-мей високих noPTopiB. Представленi в однаковШ к1лькост1 ко-шй в р18них геномах висок! повтори, можл«во. забезпечують ЗйгафШ OTpyíírypiio-дииам! чн1 функцп хромосом.

Для вквчения opraHiaauii i вар1а51дыюст1 гюсл1дов- . ностэй, до часто пс'яоргжьоа в Гевощх вид1в Tritícea©, а ■ïaitOK В1Д00РУ КЛОН 1В . Ш,0 ВИЯВЛЯКГГЬ П0Л1М0рфПМ Mi к культур-

ною пшеницею : дшлми видами, тобто, потенщгшьн) корисних для детекцп штрогресп, тоталь'ну ДНК зид!в - Т.aestívum L. (ABD), Ао. tauschii Coss. ■ (D), At. cilindrica Host, (CD), Ae. caudsta L. (C), T. monococcum L (A), H.vulg?re L. (H), S. cereale (R)•рестрищрували Bam HI, Eco RI, Eco RV, Taq I 1 Пбридчзувал*: з вставками в юрстких умовах.

Серед гслонованних посл1довностей виявлэн! таядемноорга-н!зован1 i диспергован! повт.орюван1 посл!довност1.

Клоноваш посл1довност1 виявляютв мшлшпсть за к!ль-кюною наявн1стю i пол1морф1зм на piBHi довжин рестрикщйних фрагментiв. М1лшидовий толiморфiзм проявляеться при гэбриди-зацн з зовдгми pAt 231, pAt 219, pAt 48, pAt 55, pAt 613

При використанш клонованих наш ВШ внутр!видопий по-л1Морф1зи не виявлений.

Використання цих пссл!дов;юстей ¿ля детекщ i iwrpor-pecil ни дозволило виявити значний пол1морф1зм серед форм Пбридного походиення.

Насл1дки експерименту п'.дтверджують високий pi сень crio-Р1дне;юст1 геном!в досл1джуваних вид1в Tritíceas. Зтачна ге-номна опециф1чн1сть киькюного характеру i по рогподiлу показана для деяких схмей високих повторiв. . Sriдни даних Zhang, Dvorak, (1980) , Сьиташев и др. (1988) використання високих noB,TopiB для. дотекщ i штрогресп генетичкого мате-pi алу з виддалеиих вид!в досить перспективно, в той ие час, виявлення iurporpecii ЛНК близькоа.оршених гексм1р аустр!-чаеться si значни!.ш трудношдми в зв'язку з под1бним kí ль-кюним i якюним предетавшпьством ЕПП в гомолог i чких "енотах. •

Z. НДРФ-анашз mikjuibocti рДЫК

3 ж.-тою ачзначенпя рллш тжвидовс! М1Нливост1 встаиов-геккя стуиуня гсномно) cnopiдненоетз Mi» видрми, залученный до шддалр1Ш1 пбридизацп, i иокливосп диференциовати pia-ni близь.:ос;1С,лднек1 генсми, теотуючи хром^соми, що мютять ядерцеЕ1 cpi зя «затори. нами був проведен"й ЦДРО^анали варг-aÖija>HOCTi в NOR-л; кусах 14 илд;Е Tritieeae.

В проьедених дселзджелнях ДНК кохного анализу о.:ого виду ¡.озщепляли ре~триютазами Barn HI, Taq I, Мзр I, фрякцюнували за доломогою электрофорезу, переносили на найлонов! фгльтри 1 Пбридизугали злТ'-рГи 3. .

Серед роаглянутих зид!в за под»бн!стю слектрзв Г1бриди- • -аацп еид!ля1:тьо>! : Ае. columnaris (С"}/1) i Ае. triaristata (Cui,f'j Ае. сгазза (D>f) i де. ventricosä (DMV) при рестрик-Ц1 i Ваш HI i i.i'p 1. При втсорьсташп фермента Taq I ЕС! б иди ' мали спецкф:чний малюнок пбридизацп, ■ • •

Внутр.видового пол1морф!зму рДНК серод ¿ндиБ1Дуальнкх . рослин м:сцево; популяцп As. cylindrica пбридизащею з зондом pTU 3 не будо зиявлеко. .

При выотристанн1 Barn HI i Nfcp i yci фор ми Ае. tausch! i libanofliieni на «Bi групи, а э Taq I показана специф\чшст< cneicrpiB пбридизацп дослздкэних форм.

Шжсортовий полиморфном, -виявлекий гзбридизащш s pTU 3, був не суттсвий. Сорти Езаоста1 i Обрin при р^стрикцп BamHI локазували практично здентичну картин." ПбридизацП, в той чаа, як спектр сор.у Одеська иашвкарликова знач*.о Bijupia-няася. Вииор'иеташш Мзр1 в даному експеримент! не дозволило' чпко диференциовати сорти м'яко!- -пшениц!. Пбридизаща с Taql рестриктовачс! ДНК показал-'« подi6iпеть сорт!в Безоста I

. 1 Обр1Й.

Пбрвдизашя зонду- pTU 3 з ДНК штр-гресивнчх форм пшениц! вияви^а високий р!вень пол1морф1зму в район! NOR ло-кус!в ! показала iireporpeciio генетичного материалу Ae. cylindrica ь геном Т. aestivum.

В1дм1чен) TaKi зм1ни в спектрах пбрвдизащ l у формах ПбрИДНОГО ПОХОД5ЙЭННЯ В ПОр!ВНЯНН1 3 В1ШДКИМИ батьмвськими формами: повне складення спектр!в Ибридизацп, характерних батыавоьким формам, послабления штегсивкост! ряду полос i3 спектра ШбридизацИ характерного материиськШ форм!, иоява новкх полос, не в!дм!чених у батькгвських рослин.

.9-3. Анал1з пол!морф!зму запасних б!лклв

ириймаючи до уваги локализац!» ^РБК-ген i в i roniB , коду-ючих запасиi б1лки , а також те, що ïx анализ широко вико-ристбйуегъсл для гечстичяо! ошнки селекшйного матер 1 алу, було цисаво поплвняти генетичну М1нлив1сть, виявлену рчаыи-док ЦЦРФ "анашу рДНК i визначеною за даакми пол!морф!зму запасних б!лк!в.

H-ÈBHiCTs зчеплення локус!в NOR i кодуючих затаен! б i л-1си з хромосом! IB показали Snapo et al. (1985). Перэдбача-еться (jacson et al. ,1985) що.в хромосом! IB геии, кодуюч! рРНК' i запас Hi б!лки, розташован! в такому порядку NOR BI -»61i ВЗ - Glu BI. Зчеплення м!ж Gli В2 г NOR В2 вiдмiчело ! в . хррмосом! 6В (Dvorak,Chen, 1984).

Ггни,- кодуюч! запасш б!лкя ендосперму. такок як : геии рРНК, ма'оть клйстерну - орган1зац1ю, аде В1др1зняоться по к! ль кос т! коп!?. Р!бооомн! генк В!дносяться до середньопсз-торю^ано! (5ООО -10000) групп,-'а глгадинов! i глюгeaaiOBi -

- 10 -

до малокотйиих (10 -100) посл1довностей.

Велика pisHova'iiTKicTb компонентного'складу гл1адин1Е. а також високо- (1IMW) i ьизькомолекулпрних (LMW) глютеншв е'характерною для вид1в триби Triticeae.

Вну,рш''цовий нол1шрф13м гл.адинiв ' i глютеншв був ощкений в гопуляцП роолин Ае. cylindrica, si6paHHX ría полях селэкцпно-генетичного 1нституту. При , пор1внянн1 окремих рослин значкеi м!нливос?1 не виявлено.

Показана значна внутрiвидова м1нливють серед досл!джу-ваних представшиав Ае. tauschll, що булй отримаш з р1зних географ1чину зон.

Пом1тна м1нлив!сть форм в1ддаленого пбридного. г:о:сод-ження спостьр!гаегься пол!морф1змом запасних б1лк!з ен-досперму. .

У ряду Л1Н1Й (10/6, 10/11. 1V15. 14/10 .17/53 i 17/56) не сингегуеться поштшь киькостг деяких виеокомолекулярних глюдошв, типових 0деськ1й нашвкарликов!й 1 контроиьованих локусом Q1i DI. У дих Л1Н1Й експресуегься Шрогресований в пшениц» локус 6U DI Ае. cylindrica, яккЯ проявляешься у виг ляд i грули лоыльнорухомих гл1адан1в., не харачтерних для пшенит i в1дсутн1Х у в дампе еорпв obítoboí колекцн.

У лпш 11/46.шр гетерогенна по алелях локуса Sil D', кодом!нантно експресуються. обидва парэяеиьнше вар!ант(в 61л- • к1ь, як пшениц i, так i егиюпеа. лиги , в яких пшеничний capí ант б1лк1в. кодуемий локусом 611 D1 ппениц! , ем1нений на вар-ант еплояса. в SDS- гел! маюгь в середн1й. sohí спектра характерний для he. cylindrica Haoip -з чотирьох . електрофореглчних кс.люнент1в,. предйтгшлених, очевидно, Tajeo* гльэдинами.

- 11 -

4. Генетгчний пол!морф1зм, виявленй ШГР Молекулярно-генетичний полшорф1зм м.к видами Tritícea© дос л i давали методом амшиф1кацп ДНК з допомого» шшмераз-но1 ландагово! 'реакцп з довишними праймерами (RAPD).

Вказан! яраймери при ампл1ф1кацп генсмио! ДНК дозволяюсь виявляти Р1д 4 до 12 смут на зразок, & молекулярной масою з1д 2 т. п. н. до SOO п.н. Зс1гальна кллъкють р!знрма-штних за молекулярном масою смут, генеругмих ампл!ф1кац! езо ДНК з в!-.азаними праймерами, склала 1С6. Пол1ысрфн1 смути, в1дпов1дн1 продуктам ПЛР, рсзщнювали як одиночт локуси з reHOMi дослдчуваних вшив зпдно працям J, Williams et al. ( 19^0), Dsvos, Pale (1992), Kazan et al. USU3).

В робот! була розглянута ггрисутнють /В1дсутк1сть про-дугачв амшйф!кацп i ттенсизшсть лкраски смут. В1дсут-Hic'fb RAPD-полоси розцшюегьсг. як наел*док алельного стану локусш Е5№шення ш4енсивност1 окраски продукту ПЛР иохв бути насл1дком амшпфтащi фрагменту £середк:п танделного повтору в локус!, який пол!мсрфний за ¡Ш/ьклетю ко гай в no-pi внюваНих зразках. . Не виключен! в цьому зипадку i "лдмш-HocTi в гомологи поед:довностей, ¡до обмежують сайт пбриди-зацп праймера (Hunt, Page,1992).

ПЛР з праймером Ш вияьила значний миквидовкй пол шор-ф1зм, елсктрофоретичний'спектр продуктов ампл1ф:кацп е ви-. доспециф!чним. При омшафшацп о праймером П2 в<дм1чеко 20 рюних за молекулярной вагою с муг-продукт i в a».!ruif íKaui 1 ДНК,. досл1дяуваних вид!в 'Tritíceas. Ампл1ф1кац1я з праймерами ПЗ i 114 так'ож дозволяе виячляти микзидовий пол!морф!ж К1лькють смут ка зразок, що Еизначаегься при амшифп'лщ i а праймерами ПЗ, - склала в i д. 4 до 11, аз П4 - в!д'П до 17 ъ

- 12 -

залежност! вал генотипу. ■• •

Кореляцп Mi ж piBHCM площюст1 р!зних видгв Triticeae i числом ПЛР-фрагмеит1в "е в^дмзчено, що близькг до.даьих, одержат« Volf'f et al. (1993).

При ан^л!31 м^квидового псиморф1аму стало моетивим тестувати 106 ПЛР-локус1в у доелизхуваних вид! в Triticeae, де середшй р!вень 1юл!морфпих chjr серед продуктов ампл1ф:-каш! стаксвив 94,25%.

0ц1нку внутр!видового пол1морф1зму, виявленого ДНК амп-Л1ф1кашею з праймерами Ш, П2, ПЗ, П4, проводили на трьох сортах м'яко! ншеиид1 Т. aestivuirc Одеська нашвкарликова, ООрШ, Безоста I i на окремних рослинах сорту Одесыса нашвкарликова. У досшджуваних сорт!в м'яко! пшениц! прч ампл!-фгклцП ДНК з праймером Г1 знаходимо 10 смут, м!жсортового пол1морфi зму практично не виявлено ( под!бк!сть 90% ), сорти 31др1зн<шгься по однсму Фрагменту. Значного миксиртового по-л!морф!зму 113 i 114 не виявляють, piBeub пол!морфних ему г при використанк! даних праймер1в серед досл!д~уваних сортiв склав 2%. В1дм!чений низький р!вень' м.жсортово! м!нливост1 м'яко! шценищ в1дпов!дае даним за ощнкою ГО1Р детектовано-го П0Л1юрфЮму 12 сорт!в Т. aestivum Devos and Gale (1992) • i узгодяуегься з думкою 6ale (1990) про невисокий р1вень ге-нетичного иол!морф!зму серед сорив Т. aestivun, встановлено-го ПДРФ-анал1-зом.

Генетичний пол!морф!зм. виявлений серед продуктiв амп-Я!ф1кацп . !ндив1дуалышх рослин Ae. cilindrica склав 20%.

Анал!зузали зяутр!вид^ву мшливють геном!в дев'.яти продстазнкк1в виду Ао. tausch!i (в тому сшшд! "представник'Е piSHOf.Hfiib eusquarrosa i strangulata). Внаг-л!док ашшф1ка-

■Uli ДНК досл1джуваних форм з прай'мерами П1,П2,- ПЗ, П4 вияв-лено 62 rtAPD-полоси, к!льк1сть пол!морфних продукт!в ПДР еклала 61%, а р1вень под1бности 39%. . Використана в робот1 к1льк1сть праймер1в достатня для чикого розр1знення шдви-Д1В Гокремих форм Ае. tauschii.

В проведених нами досл!д&х тдтверджуегься положения про те, що диапазон внутр!видово1 м!нливост1 серед диких ви-

fliB ВИЩИЙ, Н1Ж У КУЛЬТУРНИХ ВИД1В."

-Вказан1 праймери при агпл1ф!каци з батькгеськими i iH-трогресивними форма}'и дозволили проанал1зувати 69 локус!в..

Р1В8нь пол!морф1зму серед ампл!ф!кованих фрагментов ДНК батьк1вських форм Сдесько1 яашвкапликово! i Ае. ■ cylindrica був 70 %,. 1нтрогресивн1'форми мали под1бш спектри розпод1лу продукт!в амшлф!кацп, близьк! до материнсько1 (iopv.ii.

В ряд! форм було вщл!чено наявн!сть специф1чних бать-к1вськ!й форм! RAPD-смуг. ß 10' локусах, виявлених RAPD ана-л1аом, ■ В1дм1чена 1нтрогрес!я генетичного Мс.тер1алу Ае. cylindrica в геном м'яко! пиенищ.

В спектрi продуктов ампл!ф!каци ряду форм виявлен! смути, як! не характерш батьк!вським. TaKi результати одержат по 4 локусах серед 12 1нтрогресивн/х форм.

Внасл1док проведено! роботи можна зробити висновок, що пол!ме|)азна ланцюгова речкщя j праймерами Ш, П2, ПЗ, П4 дозволяв ч1тко. розр!зняти види Triticeae i е ефективякм методом длтекцп м!нливост1, що викликаеться чнтрогре-мш чу-кор!дного генетичного матер1алу,в геном Т. aestivum.

5. Кдаетерний анал1з генетичяих дистанщй

Для виявления характеру взаемовшюшень i встаыовлення

стунэня близькост! геном1в досл1джуваних вид1в ТПНсеае не-обх1дно досл;дити фракци геноьпв з ?!зним р!внем диворген-ци 1 одержат и об' ективну картину на основ! анапзу шнли-" вост1 локус1в, характерних для всього геному. Проведено по-Р1вняння результат!в анал1з!в, отриманих з допомогою трьох методов анализу геНетичио1 м!нливост1: пол1морф1зму довлош рестрикщйних фрагмент!в, пол1морф1зму запасних сишв (гл1-адишв., г лютен пив ), а та-х>ж даних, одержаних КЛРО-'ана,и-зом. Результата експеримешчв 0ули'анал1зован1 п^рно-групо-еим методом з арифметичним середшм за програмою Ь'РША.

Лей метод дозволяе буду^ап дендрограми, посл1довно об' еднуючи види ( або групи вшив ) з м!н!мальнши генетич-ними дистанциями. Для одержання в1дпов1дних матриць дастан-Ц1й було використано алгоритм Нея,! Л! ( Не 1, Ы, 1979). Одер.каш дендрограми представлен! нг мал. 1. ЗПдно схем! показант на мал. 1 Г. види ТгШсеае згруповач1 в!дп0в!дн0 разпод!лу генетичних'дистанщй, розрахованих за даними Сау-зерн-блот пбридиза'Щ рРНК-ген!в з використанням ендонукле-аз Ваш Н1, Тая I. ^-зр I, електрофорезу запасних 01лк!в,. НАРО-аисшзу.

Проведен! нами досл1дження дозволяють доповнити уяву систематики про р!д АедИорз, висловлену рядом автор1в - Е1д (1929?, '/¡-шкоузку (1928) ! виразити переЕагу бтльш сучасн1й систематиц! то наведена Втгамбе ( Vitcoir.be, 1983).

Генетичн! дистанЩ! м!ж сортами Т. аезиуит : Одеська натвк-рджова. обр:'й, Безоста I склали: за даними ГДРФ-ана-Л1зу С,О"11-0,058, за даними анализу електрофорезу запасних бхлкгв 0,027-0,050, за даням:,! ПНР- анализу 0,010 -0,026.

Ир;: доол1Длгнк': 1нцив1дуальних росдин сорту Одеська на-

. T* aoiMKoccw л

штттлтят Т»

ÇhEÏ:

' л-сг. f~**1

4=Ё

, Т*' too*oticua Аэ , Т mImovm А* В 7- dura AS

arstivu» ASO 1 Mit I vu» MO 3 •»stlvu» ДЭЗ S A», tauscht f t>£ A»* cnttl 0П Si'VMtnco» ОП* A», cylindrica CD ■■'' 111 A*. cavdata C. —• A», lalwlluliu c"

— A», tri une1*11 s CC" m» A*. co1tnui>U Cu Hc t— A«. trl»rl»t»Va CJ rf

— A», Ыunci al is CuHb

m*

o.m

o.ui

j L

[— Aa *- A»

f— Г. il f~"L_T. ai "1_*<

„т. мтососсшк A -T. boaoticu» A* »A». caudata С »A«* cvHndrica CD ■ ». Г. tausch!1 S

V

« A*-v*atrtco«a Ott ■ A», emu рмсй-- Ла* шЬ«1 lujata Cu -»Ae. tmuncialis CC1* . A», biuaeial is Cu H^ toloreal-tm Ca Hc, tMiriitila Cu H■ T. dure» AB T* PaUova« A^D T- <№<rai ABD 1 lastivua ABO 3 «astivm ABD 2

0.009

0,1*1

0.0«

0.000

T. аэпососсиа A

T- boeoticu» A6

T. dunu» A8

7. «»stivun А9Э 1

T. aestivua ABD 3

T. aestivu» ABD 2

7. taubehii D

,1- palBsvat A^D Ae. cratsa Di! r A», eau «ta С. A», cylindrica CD Ae • vaatri ccsa Dtl^ Aa- lriinci<U> CCU Ab. columnar!* C^H^ triarittata Cu M* Aa. Ь june i al is CuKb на. uab^llulata Cu

0.1(7

от

£

■CE

iE;

аопососсша А boeotjeu» А^ dur га AB ftfrstiviw ABD J «•st I vu» ABD 2 »est i vu» АЬЭ 3 tauachii D

Ьп*

Ptlnovae AD

-et

T. -T.

■ A», crissa DJ1V -Ae.ventrjcos« DH^ • Ae. ceoàâta С

■ Ae. cvliedric* CD

» A». uab*}]i:l*ta CU . Ae. tri unci*J i s CCÜ , A». coluœr.Arie Сц . Ae. Ae.

triarjstata Cu«fc bimcialie cu H^

Мал. 1 Дендрограми ф}Логенетичних взаемов!дносин, що одержан! в результат! ' кластерного анализ генетичних дистанций, у видав Triticeae разрахованих за даними: А). 1Щ?Ф, Б), електрофореза гл1адин!в i метения!в, В). КАР0-анал1за, Г), сумарна схема за дашши ЩРФ, електрофореза запасних Oíükí з i RAPD-анализ а.

СП

ивкарликова за даними ЩРФ, [ЩР-анал1зу, електрофорезу за' пасних бита в полшорф!зму вчявлеяо.не було.

Анал1з генетичних дистантй у представшшв виду -Ае. ¿аиБсЫ 1 показав, що досл!дзк>ван1 зразки Ао. ЬаизсГШ вшв-ляюгь генетичпий пол!морф1зм. Так, генетичн1 дистанцИ вота-новлен! за даними'Саузерн-блот нбридизацп, мали Д1апазон вар'1рування-в1д 0.00 М1ж колекц1йними номерам К-529 1 Н-504 до 0,03 М1ж К-79 1 1ншими формами. 1 '.

ЗПдно електрофоретичному анал1зу гл!адшив 1 глютени-Н1в генетичш дистанцп вариовали в1д 0,037 до 0,11.

За даними Р АРБ-анализу ц! мальна генетична дистантя 0,01 В1дм1чена М1ж колектйьлми формами К-79 1 К-78.

Максимальна генетична дистантя 0,08 вшичена м!ж К-614 П1двид еизяиаггоза уаг апаЬега 1 ышими Д0СЛ1ДЭкувани-ш формами. ■

Класт рний анал!з генетичних дистанШй форм пбридного псход.гзэня, розрахованого за даними ВДРФ, електрофореза за-

• пасних б1Л1«в 1 РАР0-анал!зу, показав: формк Пбридного по-ходжлшя утворюють складний едшшй кластер з матеркнською формою Одеська нашвкарликова (мал. 2). Батьшвський вид Ае, с-у1!паг!са являс собою вШалену нлку-. Описан! вшдедан! про наявшсть з спектр!' г!бридизацп фрагмент!в,' характерних

Ас. супыпса, говорять про те, шо в!дбулась 1Нтрогрес!я

*

генетичногс матер!алу в м'яку пшешвдо. НайСпдыа блиаъкими до Одесько! нап!вкарликово! е лпш 17/53, 10/6, 10/11, 11/45, 12' 15, 14/10. Лшя 13/25 мае штрогреспо а генома жита 1

• геггтично найбиьш вшалена 31Д пших 1нтрогресивних форм.

Таким чином, мокна зрсбити висновок, то зпдчо даних, едержаних трьоь:а методами молскулярно-генетичного анад!зу,

г—0л . полух ■ Г"1—11/40

П__10/11

' ,—.10/6 jt__.il/46

Н-_ 17/53

1Г-—12/15 Т——.14/10

Ч_13/23

___17/56

Ар-су! 1пйг)са

О.ЦС о.о» о-и»

о-оя о.мг о-озг о.си о-ио О

«•11)» 0-851 0.076 с.«1 0.046 0.0» 0-015 0.000 о

-Р

.Ол-полчк-.11/40

. 10/6 ■ 11/46 .10/11

.12/15 .17/56 .17/53 14/10 ,13/25

.Ае-су11пс!гмса

г-......... Ол-пол*г <I I- 10/6

|ТТ- 11/46

~- 10/11

12/15

17/53

11/40.

17/36

14/10

13/25

Яе.су 11пс1г1са

(1-117 8-117 0.09» мп о-ои 0-039 0.020 ••ооо

0-1« 0.0?» 0.045 0.м6 0-050 0.035 0-017 о.соа /}

Мал. 2 Дендрограми кластерного розпод1леиня батькхвських форм 1 лшй пае нищ пбридного похсдженкя, пр ьдержан2 в результат! ¡кластерного анализа генетичних дистанщй, розрахова-нкх за даними: А). ОДРФ, Е). елоктрофореза гл1адин1в 1 глкггеншпв, 'В). ИАРО - анализа, Г), сумгрна схема за даними ЦЦРФ, електрофореза запасних б1ЛК1в 1 ИАРО-анаЛга.

- "1В -

генотипи пбридних форм, отриманих внасл!док двох зворотшх схрецувань у л'ятому полол1нн1 сформувалися Олизькими до ВИХ1ДН01 материнсько! форми. Насл!дки саузерн-блот пбриди-зац1х, ЯДРО- анал1зу, електро^орезу запасних б1лк1в показу-ють присутшсть в геном! ттрогресивних форм чуж>р!дного ге-нетичного мэтер{алу.

. ВИСНОВКЬ

Систематичн! дослхдлення генеткчно! мштвосп форм пшениц! в!ддалэного ¿пбридного походження в пор'внянн! з м!ж-та впутр!видовою вар!аб!льн!стю методами ЦЦРФ, електрофорезу запасних б1лк!в 1 ПЛР дал:: молишнсть зробити наступи! висновки:

1. Генетична м!нлив!сть, викликана г^ддаленою пбриди-зац1ЕЮ'Тг!Исил1 аезНуит л АегЛорз оу1тс!г!са, детектована и Р1зних Д!лянках геному: саузерн-блот пбридизащёю в Шй-лгкусах, елегсгрофорезом запасних 01дк!в у гл1адин ! г лютен шкодугачих локусах, ЯДРО-методом у локусах,•диспергованих по геному.

2. В результат! кластерного' анал1ву даких ПДРФ, ПЛР 1 спектра запасних бьичв форми гибридного, походження роопод1-лен1 у залежнют! в!д генетичних дистащЦй по вхдношенню до початковиу глдхв.

3. На основ! дакних ПДРФ, е&ектрофореза запасних Шл-глв, НАРО-анал!за визначен: генетичш дистанцп та уточнен! фьтоге.че.шчн! взаемовгдносини М1Ж досл1д..у&мши видами Ъ гЧсеае. .

4. За допомэгою молегсуляриих маркер:в детектована ¿нт-рогреС1Н генетпчного материалу Ае. су11 1 са. до генома

культурно! пшениц!.

5. itopiekp.hhh Miнливостi, одержано! В1Д шдуковано! в1ддаленою гШридизаЩ ао, з меж- та Енутрзвидовою BapiaQiль-ностю показало, шр eohr превшдуе внутривидову але нижче М1Ж-видово!.

6. Створена адонотека виспкоповторювано! ДНК Ае. tauschii (D). Ряд клон i в меле бути вик'ормстаний для вивчення межвидового г;ол!морф 1зму та детекци iHTporpeci вних форм.

Список робзт, опублшзваних по тем! дисертацп

I

1. Чеботарь С. R, Сиволап Ю. М. Исследование изменчивости генома Т. asstivum и ее диких сородичей // УппаЕление генетической изменчивостью сельскохозяйственных растений: Те'З. докл. Междунар. симпозиум. - Ялта, 1992. - С. 114 - 115.

2. Сиволап Ю, М.Чеботарь С. В. Вариабельность рДНК у некоторых Tntlceae и форм Triticum ae^tivum, полученных от отдаленной гибридизации// 1енетика. - 1993. -т. 29. ,N 12. -

С. 2023-2050. .

t

■ Р. Чеботарь С. В., Сиволап Ю. М. Клонирование высскоповторя-ющейся ДИК Aogilops tauschii (DD) и анализ мед- и внутривидового полиморфизма злаков// Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений: Тез. докл. конференции 10 - 13 мая 1994Г. .-Киев, 1994. - 0.74.

1. Sivol&p Yu. М. Cixbotar S. V. , Rybalka A. I. PCR, F7LP and «storage protein polymorphism in Tritieeae // ■International Symposium Plant' Jiotechnology and Genetic Engineering: Abstracts. -Kiev,".994. - P.°5. 5. Sivolap yu.:.L , Chobotar S. V. , Rvbalka A. I. Molsctilar

genotic analysis lntrogrossion of alion genome fragments into wheat Trlticum aestivum// Plant Genome II. The Intern. Conf. on the- Statur of Research on the Plant Genome. -January-24 -'27. 1994.- San Diego, 1994. - P. 85.

6. Сиволал Ю. ,V_ . Календарь P. H.. "еботарь С. а Исследование генетического полиморфизма злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами// Цитология и генетика, 1994. - N. 6 - С. 54 -61.

7. Si vol ар Yu., Chebotar Ь., Rybalka A. Inter- and intra- ' species genetic polymorphism of Triticeae//Plant Genome III. The Intern. Conf. on the Status of Plant Genome Research. January 15-19, 1995. - Sar D'egc.1.395 - P.'77.

Chebotar S. V. Molecule-genetic analysis introgression of elements genome a&gilops, into wheat genome.

Dissertation for scientific ■ degree of candidate of biological sciences on. speciality 03.00.03.-Molecular biology. Plant Breeding and Genetics Institute UAAS. Odessa, •1995.

Dissertation contain theoretical and experimental material for using molecular-genetics methods: RFLP, PCR -analysis of DNA and storage pi-oteins electrophoresis, for evaluation breeding forms from wide ercssing and detalization of phylogenetics relation between-14 specie's

r

of Triticeal. • .

Genetic changeability induced by wide hybridization Triticum aestivum x Aegilops oylindrica was detected in different .parts of genome: by Southern-blot hybridization -1.. NOR loci, .by storage prccems electrophoresis - in Sliadin and glutemn loci, by PCR -analysis - in loci, that

dispersed in genome.

According to cluster analysis the forms from wide crossing vere ranged between initial parents in depending of genetic distances. Intiogressions of some elements of genetic material from aegilops into wheat genome were detected.

Phylogenetlc relationships between some Tritlceaa. specios that are agronomic characters donors ha/е* been dotal led.

Чеботарь.С. В. Молекулярно-генетический анализ интрог-рессии элементов генома згилопса в геном мягкой пшеницы.

Диссертация на соискании „ченсй степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. Селекционно-генетический институт УААН, Одесса, 19У5.

Защищается диссертация, которая содержит теоретический и экспериментальный материал по использованию молекуляр-,но-генетическкх методов: ПДРФ , ЩР-анализа ДНК и электрофореза запасных белков для оценки форм, полученных ст отдаленной гибридизации и установления генетических взаимоотношений среди 14'видов трибы Trlticeac.

Генетическая изменчивость, вызванная отдаленней гибридизацией TriUcum aestivum х Aegilops cylindrica, детектирована в различных локусах генома: саузерн-блот гибридизацией в NOR-локусах, электрофорезом запасных белкоз в гл;г-_дин и глю-тенин кодирующих локусах, ПЦР-анализом в локусах, диспергированных. по геному. ■.. '

В результате кластерного анализа данных исследований .формы гибридного происхождения распределены в зависимости от генетических дистанции по отношению к исходным видам. Прч полощи молекулярных маркеров дебетирована интрогрессия генетического материала эгилопса в геном мягкой лиешны. Уточнены филогенетические- взаимоотношения у ряда видов Tritícea©, доноров ценных агрономических признаков.

Ключов! слова:

1нтрогрес1я, генетичний пол!морф1зм, шж- i внутр1ви-дова мнливють, молекулярно-ге.»етичш маркери.

Подп.к печати 23.03.°5г.Формат 60x04 1/16. Об "ем 1, 5п. л. О, Чуч. из,я,. л. Заказ № 306/3. Тираж. ЮОэкз. Ггтэтипография Одесского управления по печати,цех№3.

Ченина 49.