Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная структура и эволюция D17Leh80-подобных локусов в t-комплексе домовой мыши

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная структура и эволюция D17Leh80-подобных локусов в t-комплексе домовой мыши"



? О С С И и.С К А Я А К АДЕМИ-Я НАУК

ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

Институт цитологии и генетики А На правах рукописи

ФИЛИППОВ Валерий Алексеевич

УДК 575.13 ; 579.871.1 .

МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА И ЭВОЛЮЦИЯ Ш7ЬеЬ80-П0Д0ЕНЫХ ЛОКУСОВ В х-КОМПЛЕКСЕ ДОМОВОЙ МЫШИ

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссерташш на соискание ученой степени кандидата оиологических наук

Новосибирск - 1993

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Каракин Евгений- Иннокентьевич - доктор

биологических наук, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Залетаев Дмитрий Владимирович - кандидат биологических наук, Медико-генетичесюг" научный центр РАМН, г. Москва.

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится -А "¡ЯлдА

ЧН-

ванногс

1993 Г.

на . ^^УУЧллМЛ лМ._ заседании специализированного совета по

защите диссертаций на соискание ученой степени'.доктора наук при Институте цитологии и генетики СО РАН ( JL-00Z.I1.01 ) в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан "¡Х^ " ^лл^Х_ 1993 г_

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук А.Я. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Акт2§льность_проблемы. Одним из наиболее интенсивно изучаемых районов генома мыши является t-комплекс, расположенный в прицентромерной части 17-ой хромосомы, обшей длиной около 20 млн. нуклеотидов iSilver, 1985). В этом районе сосредоточено много генов, влияших на эмбриональное развитие и формирование половых клеток, мутации по которым часто вызывают летальный эффект и стерильность самцов (Bennett, 1975s Klein et al., 1982). В природных популяциях домовых мышей широко, до 40$ от общего числа, распространена t форма 17 хромосомы с измененным проксимальным районом (Ruvinsky et al., 1991). За счет нарушения сегрегации хромосом в мейозе в пользу t формы, t-гаплотипы, несмотря на наличие летальных мутаций, успешно- поддерживаются в природных- популяциях (Klein et al., 1982). Наличие четырех инверсий, непосредственно примыкапдих друг к другу, предохраняют t-комплекс от рекомбинационного • разрушения (Silver, 1985). Интенсивное молекулярно-генетическое изучение этого района позволило выделить и охарактеризовать ряд генов, ответственных за известные мутации: например, ген Т, при уменьшении дозы которого за счет нарушения эмбрионального развития происходит недоразвитие хвоста (Herrmann et al., 1990; Wilkinson et al.. 1990), или ген Ter - ключевой локус в механизме нарушения менделевской сегрегации хромосом в мейозе (Cebra-Thomas et al., 1991). 'Сравнительное картирование мыши и человека показало, что хотя у человека нет подобной структуры, обладавдей. всеми свойствами t-комплекса, t-гомологичные последовательности у человека представлены в основном одной синтенной группой в 6 хромосоме, но при этом она разделена центромерой (Bibbins.et al., 1989). .

Однако получение новой информации о строении и эволюции указанного района остается весьма актуальной задачей. В этой связи наше внимание привлек Tu 80 - один из клонов, выделенных методом микродиссекции и по данным гибридизации с геномной ДНК мыши отнесенных к уникальным последовательностям iRoehme et al., 1984). Согласно данным Комитета по 17-ой хромосоме Ju80 локализован в третьей инверсии 1п(17)3 на расстоянии 9,50 сМ от центромеры между маркерами Тег (8,70 сМ) и Tcd3 (9.93 сМ). Району локализации клона Ти80 присвоено имя D17Leh80 . (Committee for Mouse Chromosome 17,

:Э91>.

Задачи_исследоваш5ь Первая задача состояла в определении нуклеотидной последовательности -(¡-специфического клона íu80, ранее выделенного из центральной части t-комплекса' мыши (Koehme et al., 1984). Вторая задача заключалась в выделении- из геномной библиотеки 17-ой хромосомы мыши Ти80-гомологичных фрагментов, определении нуклеотидных последовательностей гомологичных участков и проведении их сравнительного анализа. В третьих, была поставлена задача оценить эволюционную консервативность изучаемых структур с помощью геномной блот-гибридизации и полимеразной цепной реакции í PCR). И четвертая задача заключалась в локализации Tueo-гомологичных районов у человека с помощью" in situ гибридизации на'метафазных хромосомах'.'

• На^ная_новизна_рез2льтатоЕ^ Впервые определена нуклёотидная последовательность одного из t-специфических 'молекулярных зондов из района ■ третьей инверсии ъ-комплекса. Выделен еше один TuSO-гомологичныа клон из 17-ой хромосомы мши - НОУ 1 . Определение первичных структур обоих гомологов выявило наличие общей открытой рамки считывания как в Ти80, так и в NOV 1, в случае NOV 1 зафиксировано встраивание В2 повтора в район общей гомологии. Анализ нуклеотидных последовательностей позволил идентифицировать в их составе два "района -. фрагмента, гомологичного LINE 1 элементу мыши, и фрагмента, гомологичного первому интрону С£-гена иммуноглобулина мыши. Предложена модель возникновения Ти80-предковой последовательности за счет незаконной рекомбинации по району общей гомологии между LINE 1 .элементом и первым интроном С€-гена. Показана эволюционная консервативность ХивО-подобных структур , у млекопитающих. Локализация ТиЗО-гомологичного фрагмента у человека показала, что TuSO-гомологичная последовательность входит в единую синтенную группу t-гомологов человека.

При проведении экспериментальной части работы был модифицирован и успешно применен новый вариант геномной полимеразной цепной реакции, когда ■ одна, из олигонуклеотидных затраЕок представляет ' собой часть . высокоповторяюшейся последовательности. с помощью

злектрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК удалось освободиться от основного количества геномных повторов.

существенно затрудняпшх проведет« рек.

- ------На примере возникновения ТиЗО-подобных" последовательностей

показана реализация принципа блочной эволюции, когда за счет рекомбинации два независимо эволшиснируших фрагмента образуют новую эболшионно консервативную структуру.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

_Агтрдбаиия_работы^ Материалы исследования были представлены на 3 школе-семинаре по генетике п селекции животных, 1963 ■.Алтай), на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических, процессов", 1930 (Москва), на VII международном совещании по молекулярной генетике мыши, ¡990 (Прага, ЧССР), на II Всесоюзной конференции "Геном человека-¡Л", 1991 (Москва) и на 5 Международном совещании по картированию генома мыши, 1991 ■; Нидерланды).

Структ^ра_и_ооъем_диссертаиии^ Диссертация состоит из ЕЕедения, четырех глав и выводов. Текст диссертации содержит 39 страниц, включая 18 рисунков и 2 таблицы. В списке литературы 79 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярный зонд ТивО (Иовйте а1.. 1984). встроенный в рис 9 был любезно предоставлен Б; Геррманом и Г. Лерахом (ФРГ •. Мечение проводили с помощью ник-трансляции ИЯ^Ьу еХ а1,1977) или в присутствии статистической затравки 1Ге1пЬе^,Рове1Б1е1п, 1983) до специфической радиоактивности 1-10x10'' срт/мкг- ДНК. Геномная, библиотека была предоставлена Винчеком Ушсек et а1.. 1939).

Скринирование библиотеки проводили стандартным способом при плотности засева около о х Ю4 5.о.е. на стандартную чашку Петри (Маниатис и др.. 1884).

Гидролизаты геномной ДНК, выделенной по стандартному методу. ' :■ мкг на дорожку, разделяли в 1%. агарозе ТАЕ. Перенос на капроновый фильтр фирмы "Еио-Рэд" щелочным методом и гибридизацию проводили кар: рекомендовано фирмой "Еио-Рэд" ¡США»

Определение первичной последовательности проводили по метолу Максама-Гилберта с получением набора однонаправленных делений Хелодилов, Краев, 1990).

По.тимеразную цепную реакцию •:РОН) проводили, как описано

а

(Sambrook et al., 1988), кроме кошентрации MgCl2 и температуры отхига олигонуклеотидных затравок. Для получения матрицы для PCR геномную ДНК Гидролизовали с помощью EcoRi. Полученный гидролизат разделяли электрофорезом в I% легкоплавкой агарозе (Sigma), фракцию EcoRi-фрагментов длиной 2-3 kb вырезали, плавили при iO°C и использовали в качестве матрицы для проведения PCR.

Гибридизацию In situ проводили, как описано ранее (Grafo-datsky et al., 1992).

Для компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей был использован пакет программ "КОНТЕКСТ" (Соловьев и Рогозин, 1986). Поиск последовательностей, сходных с исследуемой проводился по, базе данных жвх (версия 19). Построение филогенетических деревьев проводился методом уникальных" замен из пакета программ "YOSTORG" (Zharkikh et al., 1991). "

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ '

Выделение клона GM801 из геномной библиотеки R4 4-1.

Для выделения Ти80-подобных последовательностей из генома домашней мыши была использована геномная библиотека, полученная на основе XEMBL 3 вектора и клеточной линии Р.4 4-1. Данная клеточная линия представляет собой гибрид хомяк х мышь, где мышиный геном представлен единственной хромосомой - 17, в которой находится район t-комплекса. В качестве зонда при скринировании использовали ДНК плазмиды pTu80 (Roehme et al., 1984). В результате скринирования приблизительно из 10ь клонов библиотеки был отобран один клон,даший положительный ответ, обозначенный нами как GM 801.

■ Рекомбинантный клон GM 801 содержал вставку геномной ДНК длиной 7,4 kb. Геномная вставка, обозначаемая далее как НОУ 1, состойт';;из трех EcoRi-фрагментов длиной 3,2, 2,5 и 1,6 kb, эти фрагменты были переклонированы в соответствующие сайты плазмиды pUC 19. В результате переклонирования нами было получено 6 индивидуальных плазмид, имеших вставки в двух различных -направлениях.

' - Определение первичной структуры Тиво фрагмента.

Для дальнейшего анализа молекулярной структуры изучаемого t-спеиифического района домовбй мыши была определена первичная

структура Tu 30 фрагмента и части фрагмента NOV 1 длиной 1.6 kb, содержащей.участок, гомологичный Ти80г Определение" первичной последовательности Tu 80 показало, что он представляет собой фрагмент ЛНК..длиной 324 нуклеотидов. Данные о нуклеотидной последовательности Tu8û зарегистрированы в банке нуклеотидных последовательностей EMBL под номером X 58284 MU В2 ШТЬЕНвО. Характерной особенностью данной последовательности является наличие полшаА) и поли idï) трактов, а также неканонического сайта полиаденилирования iaatagai на З'-конце последовательности Tu 80.

Компьютерный анализ молекулярной структуры TuSO позволил обнаружить в пределах открытой рамки считывания фрагмент длиной ÎOO нуклеотидов, гомологичный участку LINE 1 элемента (Loeb et al., 1986), и непосредственно примыкающий к нему фрагмент длиной 147 нуклеотидов, гомологичный первому интрону С£ - гена иммуноглобулина мыши ilshida et al., 1982).

Известно, что уровень повторенное™ UNE 1 элемента в геноме мыши достигает 10" {Fanning and Singer, 1987). В этой связи представляется неясным поведение клона ТивО в геномном блоте. где, как уже отмечалось, обнаруживается только три копии. Наиболее простое объяснение этого факта состоит в том, что уровень гомологии между ТивО и соответствующей областью из LINE I менее 30«. В стандартных условиях гибридизации такой уровень гомологии недостаточен для связывания зонда ТивО с гомологичными участками множества LIHE 1 повторов. Экспериментальные данные по гибридизации ТивО г геномной ДНК мыши подтверждают это предположение. Результаты скринирования геномной библиотеки также показывают, что ТиЗО ведет себя как уникальная последовательность.

Определение нуклеотидной последовательности îuSû-гомологичного участка из ДНК фрагмента НОУ 1.

В ДНК рекомбинантного клона ОМ 801 участок, гомологичный Tu ■iO, находится на 3'-конце £eoPi фрагмента длиной 1,6 kb. Для определения его первичной структуры первоначально был получен набор делений этого Фрагмента, с их помощью и была определена искомая нуклеетидная последовательность. Кроме того, как сказалось, TuSC-гомологичный участок примыкает непосредственно к £.2kt EsoRi-фрагменту, поэтому была определена первичная

структура 5'-области 2,5кЪ фрагмента. Таким образом, из рекомбинантного клона GM 801 первичная нуклеотидная последовательность была определена на у.частке длиной более. 2200 оснований. ДНК последовательность Novi зарегестрирована в банке нуклеотидных последовательностей IMBL как Х58283 MU ЫЫЕ1 D17LEH80. Компьютерный анализ просеквенированной

последовательности показал, что наиболее ярким отличием от последовательности Tu 80 является внедрение в тиао-гомологичный фрагмент В2 повтора. Кроме того, в непосредственной близости обнаружена eme одна копия В2 элемента. В2 повторы относятся к одним из наиболее распространенных повторов грызунов, это небольше ДНК последовательности длиной около 200 нуклеотидов,. имешие на 3'-конце poly(dA) "хвост", характерный для всех ретрогранспозонов. и фланкированные небольшими прямыми повторами, образующимися, вероятно, в результате встройки В2 элемента в ДНК. (Bains, Temple-Smith, 1989).

5'-конец- гтросеквенированного участка из NOV i фрагмента представляет собой 3'-концевую часть LINE 1 элемента с выраженным polyA -трактом. ЫЫЕ 1 повторы, также как' и В2 элементы, чрезвычайно распространены в геноме млекопитающих."Полноразмерный ЫЫЕ 1 элемент представляет собой последовательность ДНК длиной 6-7 kb, содержащую длинную-открытую рамку считывания, которая, как полагают, кодирует белок, имеющий сходство с обратной рестриктазой (Hattori et al., 1986).

Таким образом, определение нуклеотидной последовательности выделенного фрагмента NOV 1 позволило идентифицировать ряд известных структур в его составе: два В2 повтора и 3'-коней LIME 1 элемента. Сравнение последовательностей В2 повторов с уже известными последовательностями В2 повторов мыши и хомяка однозначно указывают, .-что NOV 1 представляет собой участок геномной ДНК мыши. Так, • уровень гомологии выделенных нами Б2 повторов с В2 элементами мыши составляет около Э8%, тогда как с Б2 элементами хомяка уровень гомологии раиен 85s. Уровень гомологии между известной -структурой LINE 1 элемента мыши и ЫЫЕ 1 элемента из NOV 1 также, однозначно указывает на принадлежность выделенного фрагмента НОУ 1 к геномной ДНК мыши. А поскольку при выделении 'ДНК НОУ 1 нами была использована геномная библиотека, где мышиный геном представлен только 17-й хромосомой мыши, то

можно сделать вывод, что выделенный фрагмент NOY 1 локализован на 17 хромосоме."

Компьютерный анализ последовательности NOY 1, как и в случае с Ти80, обнаружил фрагмент, гомологичный LINE 1 элементу и 1-ому интрону СЕ гена иммуноглобулина. Наиболее существенное отличие в строении этой последовательности по сравнению с TuSO состоит во внедрении повтора В2 в район, гомологичный 1-ому интрону Се-

гена иммуноглобулина. Кроме того установлено, что в 5 - области

«

просеквенированного участка NOY 1 располагается 3 - конец LINE i »

элемента. На 3 - конце Nov I последовательности находится еие один В2 повтор и АТ-богатый район. Открытая рамка считывания, обнаруженная нами в Ти80, выявляется и при изучении гомологичного фрагмента из NOV 1. Анализ последовательностей Ти80 и NOV 1 позволил построить схему молекулярно-генетической организации этих фрагментов ДНК, представленную на рис. I.

Рис. I. Схематическое изображение молекулярно-генетической структуры ri?Leh60 ;Tu80) и Di7Movi. Сверху изображена генетическая карта части 17 хромосомы мыши. Принятые обозначения: I - фрагмент, гомологичный LINE 1 элементу; 2 - фрагмент,' гомологичный первому интрону С£-гена; 82 повтор; 4 - LIUE1

элемент; 5 - неидентифицированная последовательность; 6. -неизученная последовательность.

Сравнительный анализ первичной структуры ТивО и NOV 1 Результаты • выравнивания . изучаемых последовательностей

представлены на рис. 2. Видно, что у LINE 1 к С£ - гена

существует общий фрагмент ■ длиной 12 нуклеотидов с 3

несовпадениями. .Его можно рассматривать в качестве сайта

незаконной рекомбинации, имевшей место в прошлом. Была

OLJPI'LHKLF.H К I Е V Е

GAQTrCTATCAOACCTTCAAAQAAQATCTAATTCCAATTCTQCi^AAACTATTTCACAAAATAaAAaTAflA LI-«

OASPXLFNSVHKVETE GAATTC-ATCAQACCTTCAAA-AAOACGCATCACCAATACTCTTCAATTCAGTTCACAAAQTAGAAACAGA Т1ЯО

OL TPICLKLYHKIKTE GA~TTCCATCAQACCTTCAQAQAAQACCTAACTCCAATACTCTTAAAACTATACCACAAAATAAAAACM1A Hovt DO « D =♦+ ♦♦♦ * »+♦+ +♦+ ♦♦♦ + ♦ ++

TVTICILPMRHN* ACAQTTACACTQTQTATTCTCCCTTOQAQATCMAACAGrTT С

qtlphsfyekm •••• ••«

АООТ AGTCTACCCAACTCATTTTATQAAOCC ACT ATT ACTCTGA U-A2

aTQPNSFVEATVTLSILPHRNN S АШААСССААСССМТТССТТСТАСаААШХАСАОТТАСАСТОАОТАПСТСССТТааАаАТ(»«АСАаТТ tuso

QTLPNSFVEATVTLHILSMRNNa АааААСАСТАСССААТТСАТТСТАТОАА(ЮСАСАаТТАСАСТВСАТАТТСТАТСТТааМАТОаААТааТТ Novl = = + 3 г s s s+ '

FCLIRMLSSF

ТСТ(ГГСТААТСАааААСТТаТС>СААТТТССТТТСАТАа»аПАСТТСАТААОАаАI lllll ПС-ТАСТТСТ с fclfr nfaqf

tctqtctcttcaqqaactttocacaattttcattca—qaaaa£ttcataaqagatttttttcc—acttqa Т|)вО fclionlsqf

тттатстсаттааамсттвтсасадттт-----cataoacoacttcataaoaoi iiiiii iccctacttct hovi

■ ■ ♦ ♦♦ ♦♦ DODOO OD И • • DO ••

ATCATOTTTAOTOATC---CAAATAOATTTTAAAAACTQa С

ACCATQTTTAQTOaTOTTTCAACCAaATTTTAAAAACTQO TUSO

ATCATOTTTAATATTC---CAAATAOATTT ГАААААСТАТ Novl

• * •• *doo •• u

Рис. 2. Область гомологии последовательностей ЫЫЕ1 !Ы-А2) (ЬоеЬ et а!., 1986), С£-гена иммуноглобул1ша (1зЫйа ег а1.,1982), Ти80

и ыоу1 . Область гомологии между Ы-А2 'и С£ обозначена как •. Для

открытых рамок трансляции приведены их аминокислотные последовательности. Делении обозначены символом "С, в области ОКР синонимичные замены обозначены символом "=", кесинонимичные -"+", а несовпадения - Стрелками указаны последовательности, использованные в качестве затравок в полимеразной цепной реакции.

предпринята попытка оценить вероятность рекомбинационного события • между двумя изучаемыми последовательностями с помощью метода . Монте-Карло. Вероятность возникновения по случайным причинам

рекомбинационного reтеродуплекса, где_____уровень _. гомологии

перекрывающихся последовательностей LINE 1 и СЕ-гена достигает значений приближенных к максимальным, составляет Ю-4. Следовательно, вероятность двух таких независимых рекомбинашонных актов приводящих к образованию молекул с идентичной последовательностью в зоне рекомбинации мала Ю~8).

Дополнительным аргументом в пользу единственности происхождения предковой Ти80 - подобной последовательности может служить локализация Iu80 и его гомологов на 17 хромосоме. Не следует упускать из вида также, что вероятность эволюционной фиксации любого рекомбинационного или мутационного акта крайне низка. Таким образом, общий вывод к которому мы приходим состоит в том, что обнаруженный вариант последовательности Ти80 -результат дупликации и последующей дивергенции.

С4-

Как уже было отмечено, в Ти80 и NOV 1 обнаружены гомологичные достаточно протяженные участки с открытой рамкой считывания. После выравнивания последовательностей была выявлена зона гомологии" без делений и вставок с открытой рамкой считывания, длина которой составила 147 п.н.

Сравнение изучаемых последовательностей TuSO и NOV 1 показывает, что средний уровень сходства гомологичных районов составляет около 78 % и значительно колеблется на различных отрезках от 70 % на 5 - конце до 89 % в центре, соответствующем зоне рекомбинации. В целом, центральная часть обоих фрагментов (Tu80; NOV 1) консервативнее краевых районов»

Саузерн-гибридизация NOV 1-фрагмента с геномной'-ДНК различных организмов.

Для проверки эволюционной консервативности исследуемого фрагмента был проведен ряд гибридизаций 1,6 kb EcoRl фрагмента из NOV1 с геномной ДНК ряда организмов.

На рис. 3 показан результат гибридизации меченого фрагмента 1,6 kb с гидролизатами геномных ДНК ряда млекопитающих. Из схемы видно, что все исследованные млекопитающие имеют Ти80-гомологич-ные последовательности в составе своего генома,при этом у свиньи, полевки и овцы таких ДНК последовательностей как минимум две, в то время как у человека был зарегистрирован только один EcoRl фрагмент длиной около 2 kb, несущий Ти80-гомологичный участок.

1 2 3 4 5 6

•5,0 '2,8 1,7

Рис. 3. Схема радиоавтографе

фш гибридизации Р-мече -ного зонда 1,6кЪ с геномной ДНК овцы (I. 2 ), полевки (3,4), свиньи (5) и человека (6). Для гидролиза использованы рестршстазы: ЕсоЯ1 (б), ВатК1 (1,4) И ВзрШ (2,3,5). Справа указан размер в кЬ.

Полимеразная цепная реакция геномной ДНК человека.

12 3 4

ВШв

9т

4

А Б

Рис. 4. А). Электрофоретический анализ продуктов PCR EcoRi-фрагментов геномной ДНК длиной около 5кЪ и ), длиной 2-3 къ 12) в 5% ПААГ. на дорожке 3-фрагмент Тиво, М - маркеры молекулярной массы (BspRi-гидролизат ДНК плазмиды pUCi9>. Б). Гибридизация продуктов PCR с меченым фрагментом Tu80. I -продукт PCR EooRi-фрагментов геномной ДНК человека длиной 2-3 кЬ, 2 - ДНК фрагмент Ти80.

При планировании эксперимента по проведению полимеразной цепной .реакции (далее - PCR) геномных ДНК мыш и человека для получения копий Ти80-подобных фрагментов было необходимо

преодолеть ряд трудностей, связанных с тем, что одна из олигонуклеотидных затравок~е нашем случае имеет большую гомологию с UNE 1 элементом. При этом возникает большая вероятность того, что синтез с этой затравки будет происходить преимущественно на ЫЫЕ 1 элементах в силу их значительной представленности в геноме млекопиташих, и в значительно меньшей степени на 2-3 копиях интересующего нас участка. С этой целью при синтезе была выбрана последовательность, тлеющая наибольшую гомологию с Ти80 и NOY 1 последовательностями и наиболее отличную от ЫЫЕ1 (Ы-А2 ) : последовательность llNEi > gagtïctatcagaccttca последовательность lueo gaattc-atcagaccttca

последовательность NOV1 ga-TTCCATCAGaccttca

затравка для PCR gaattccatcagaccttca

Что касается второй затравки; то эта последовательность представляет собой конец общ'ей открытой рамки считывания для N0V1 и Tu80 длиной 17 нуклеотидов с Sal g1-линкером на 5'-конце: gtcgacaaattgtgacaagttcc. Обе эти последовательности, использованные для синтеза затравок показаны на рис. 2 * в виде стрелок.

Первоначально условия проведения PCR подбирали на линейной форме плазмиды pïu80. Условия реакции считались оптимальными, если синтезировался в осноеном один фрагмент длиной 176 нуклеотидов. По результатам , этих экспериментов были подобраны :ледушие условия проведения реакции: концентрация MgCl2 - 2,5 mM и температура отжига - 51°С.

Для освобождения от основного пула LINE1 повторов из геномной ДНК в качестве матрицы для • PCR использовали ЕсоР1-фрагменты ДНК человека длиной 2-3 kb. После 50 циклов PCR продукты реакции можно было наблюдать при у/ф освещении • фис. 4А). Из рисунка видно, что при использовании в качестве матрицы EcoRi-фрагментов геномной ДНК человека длиной от 2 до 3 kb синтезируется фрагмент длиной примерно 180-200 нуклеотйдов ; дорожка 2>. что соответствует аналогичному фрагменту в TuSO клоне

В случае использования в качестве матрицы EcoRi фрагментов ДНК человека длиной около 5kb синтеза индивидуальных фрагментов в реакции PCR не наблюдается i дорожка I). Гибридизация синтезированного фрагмента длиной около 200 нуклеотидов с ДНК Ти.80 фрагмента указывает на специфичность полимеразной цепной

реакции (рис. 4Б). Таким образом, используя в качестве гграймеров олигонуклеотиды, гомологичные краевым участкам обшей гомологии фрагментов Tueo и MOV 1, выделенных из геномной ДНК мыши, с помощью полимеразной цепной реакции из геномной ДНК человека удалось выделить Ти80-гомологичную последовательность.

Результаты анализа Ти80-подобных последовательностей у ряда млекопиташих.

Как показала блот-гибридизация с геномными ДНК ряда млекопиташих (рис. 3), все проанализированные организмы имеют в составе своей ДНК Ти80-подобные последовательности. Одним из основных результатов настоящей работы является обнаружение Ти80-гомологичной последовательности у человека. Поэтому была поставлена задача более подробно изучить гомолога Tu80 у человека. С этой целью была проведена полимеразная цепная реакция геномной ДНК человека. В качестве олигонуклеотидных затравок были использованы краевые участки района общей гомологии TuSO и tJ^vt (рис. 2). Поскольку один из праймеров имеет значительную гомологию с LINE1 элементом для эффективного проведения PCP. в качестве матрицы использовали не тотальную геномную ДНК, a EcoRi фрагменты ДНК человека длиной 2-Зкь, среди которых по данным Саузерн блот-гибридизашш находится Tueo-гомологичная последовательность. Действительно, при полимеразной цепной реакции этой фракции обнаружен фрагмент, длина которого примерно соответствует фрагменту, получаемому на ДНК мыши (рис. 4А>, причем наблюдаемый продукт PCR является результатом специфической полимеразной реакции, что видно по гибридизации с Iu80 (рис.4Б). Это еще одно свидетельство того, что ' Ти80-гомологичная последовательность существует и в геноме чеовека. Условия проведения реакции, однако, не позволяют определить сколько копий Tu80—гомологов имеется в геноме человека.

In situ гибридизация NOV 1 фрагегнта с метафазными хромосомами человека.

Наличие интенсивной гибридизации с геномной ДНК человека позволило нам надеяться на возможность локализации человеческого аналога локусов Di7Leh80 и I>i7Novi на хромосомах человека. С зтой целью был проведен ряд- гибридизаций 1,6 kb eccri фрагмента из n0v1 с метафазными хромосомами человека. На рис. 5 представлены результаты гибридизации ^Н-меченного фрагмента 1,6 kt с

метафазннми хромосомами человека.

Рис. 5. Распределение зерен серебра по метафазным хромосомам человека при in situ гибридизации с NOV 1 фрагментом.

В ходе гибридизации было проанализировано 150 метафазных пластин. Анализ распределения зерен серебра показал, что из выявленных 623 зерен 98 (15,7$) локализовались на 6-ой паре хромосом (Х-=П5,5: Р<0.001). из которых 45 ( 45,9$) локализовались в районе 6q22-q24. Таким образом, показана абсолютно достоверная локализация Ти80-гомологичного участка на 6 хромосоме человека. Обращает на себя внимание и некоторая концентрация метки (19$) в районе 6р22-р21. . „ .....- ■

Локализация Di7Leh80 аналога у человека представляет собой значительный интерес, поскольку, находясь а третьей инверсии близко к границе с четвертой инверсией, он попадает в район, по которому у человека наблюдается разрыв t-гомологичной синтенной группы. Данные по in situ гибридизации однозначно определили локализацию В17ЬеЬ80 гомолога в 6q22-q24 районе, где находится большинство t-гомологов второй и третьей инверсии.

Построение филогенетического древа.

Достаточная степень изученности LINE 1-подобных семейств у разных видов млекопитающих позволяет построить филогенетическое древо на основе . 'первичной . структуры \ нуклеотидных последовательностей у человек^, кролика (Demer3 et al., 1986),.

крысы (Зоагез ег а1., 1935! и изучаемых фрагментов Ти80 и НОУ 1 (рис. 6). Структура древа соответствует принятым филогенетическим отношениям между изучаемыми таксонами. При построении древа, представленного на рис.6 положение корня древа было скорректировано с учетом 1,5-кратного превышения скорости фиксации замен у грызуноЕ ; Ы ег а1., 1990).

Рис. 6. Филогенетическое древо Ти80-подобных фрагментов и гомологичных участков LINE 1 элементов .разных видов: Ыос -кролик (О. cuniculus), ЫНа - человек (Н. sapiens i, HMd - мышь !М. domesticus), L1En - крыса iR. norvegicus).

Анализ нуклеотидной последовательности Tuao и Nov 1 однозначно указывает на их рекомбинационное происхождение. Сайт рекомбинации установлен достаточно точно и вероятность этого события, согласно нашей оценке, слишком' мала, чтобы допустить возможность независимого, повторного осуществления рекомбинационного акта и последующей фиксации вновь возникшей последовательности в геноме. Следовательно, можно думать, чт:> существовала предковая последовательность, дупликация которой привела к появлению Ти80 и NOV 1. Естественно возникает вопрос времени возникновения исходной последовательности. По имеющимся оценкам время дивергенции от общего предка для приматов и грызунов лежит в диапазоне 60-100 млн.лет ¡Fanning ana cinger, 1987). Исходя из положения ХиЗО и UOV 1 на древе можно предположить, что предковая последовательность возникла не позднее, чем 27-33 млн.лет.

Если изучаемые TuSO-подойные последовательности имеют функциональное значение, то их рекомоияаиионное возникновение можно рассматривать как иллюстрацию принципа олочной эволюции.

Го есть такого процесса, когда два независимо эволюционирующих фрагмента ДНК. объединяясь 'в" один, могут приобретать новое функциональное значение. Экспериментальная проверка такого предположения принципиально возможна.

ВЫВОДЫ

I. Определена первичная структура ДНК последовательности из 17-ой хромосомы мыши - NOY 1, которая представляет ' собой последовательность, гомологичную ранее выделенному t-специфичному ДНК фрагменту XuSO.

2.. На основе данных по первичной структуре представлена молекулярно-генетическая организация Ти80-гомологичного участка NOV 1.

3. Показано, что NOV 1 и Tu80 имеют одинаковые открытые рамки-считывания, причем уровень гомологии наиболее высок в центральной части ORF.Oee открытые рамки состоят из двух идентифицированных' районов: фрагмента, гомологичного 0RP2- LINE 1 элемента мыши, и фрагмента, гомологичного первому интрону С£-гена иммуноглобулина мыши.

4. Исходя из строения ЫЫЕ 1 элемента и С£-гена можно предположить, что Tuso-полобная структура возникла в результате рекомбинации по участку обшей гомологии длиной 12 нуклеотидов, а lu.80 и NOV 1 являются результатом дупликации и последующей дивергенции предксвой последовательности. Оценено время возникновения TuSO-подобной гтредковой последовательности.-.

5. Показана высокая эволюционная консервативность Ти80-подобной последовательности у ряда млекопитающих,- в том числе и у человека.

3. ТивО-гомологичный локус у человека картирован, в районе 6q22-q24 шестой хромосомы.

Работы, опубликованные по теме диссертации: I. Филиппов В.А., Лобков Ю.И., Федорова S.B., Богачев С.С., Холодилов Н.Г. Анализ последовательностей ДНК человека и ряда млекопитающих, гомологичных t-специфичным фрагментам домовой мыши //' Тез. докл. 3 школы-семинара по генетике и селекции жгоотных. Изе,Си6.отд. АН СССР. Сер.Биол.науки, Вып. 2.-1989- С.

9-10,

2. Филиппов В.А., Федорова Е.В., Лобков Ю.И., Винчек В., Рувинский А.О. Молекулярно-генетическое исследование локуса Д17Т80 из Т-Н-2 комплекса домовой мыши и его аналогов у ряда организмов. // Тез.докл. VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные

' механизмы генетических процессов".- Москва, 1990.- С. 116.

3. Filippov V.A., Pedorova E.Y., Lobkov УЛ., Ruvinsky A.O.,

• Vihcek V. Molecular structure of D17Leh80 locus of t-complex. // Abstracts of VII International workshop on the molecular genetics of mouse.- Prague, Czechoslovakia, 1990.- P.56.

4. Филиппов В.А., Федорова E.В., Рогозин И.Б., Холодилов Н.Г., Рувинский А.О. Сравнительный анализ структуры Ти80-аналогичных . последовательностей // Тез.докл. II Всесоюзной конференции "Геном человека-91".- Москва, 1991.- с. 95-96.

' 5.' Filippov V.А., Pedorova E.V.. Rogozin I.В., Kholodilov N.G., Ruvinsky A.O. Molecular organization and evolution of the D17Leh80-like loci in mouse t-complex // Abstracts of the 5 International workshop on mouse genome mapping.-Nitherlanda, 1991. - P. 77.

6. Филиппов В.А., Федорова E.B., Рогозин И.Б., Холодилов Н.Г., Рувинский А.О. Молекулярная организация . и эволюция D17ЬеЬ80-подобных локусов ~ в t-комплексе домовой мыши // генетика - 1992,- Т.228 - С.124-135.

7. Filippov V.A., Fedorova E.V., Rogozin I.В., Kholodilov N.G., Ruvinsky A.O. Molecular' organization and evolution of the D17beh80-like loci in the mouse t-complex // Mammalian Genome.- 1992- V. 3- P. 11-16.