Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная природа фенилкетонурии в Новосибирской области

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная природа фенилкетонурии в Новосибирской области"

на правах рукописи

РГЗ ОД

Г ГШ

СМАГУЛОВА ФАТИМА ОЛЖАБАЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА ФЕНИЛКЕТОНУРИИ В НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ

03.00.04 - биохимия

г» р

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени-кандидата биологических наук

Новосибирск • 2000 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН и на базе областной научно-практической лаборатории ДНК-диагностики Государственного Новосибирского Областного Диагностического Центра

Морозов И.В. Масленников А.Б.

Научные руководители:

кандидат биологических наук кандидат медицинских наук Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Коваленко С.П.

доктор биологических наук, профессор Загребельный С.Н.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта

Защита состоится "/£" г. в 9__часов

на заседании диссертационного совета

в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " " О^'УЬ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

О.С. Федорова

О V/ I ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Исследование молекулярной природы наследственных заболеваний человека является одной из актуальных задач современной биологии. Важное значение эти исследования приобрели в последнее время, в связи с внедрением в широкую медицинскую практику методов молекулярной биологии для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Фенилкетонурия (РКи) - одно из распространенных аутосомно-рецессивных наследственных заболеваний человека, обусловленное нарушением метаболизма фенилаланина, которое вызвано недостаточной активностью фермента фенилаланингидроксилазы (РАН). Из-за высокой частоты встречаемости в России (1 на 10000 новорожденных в год) фенилкетонурия представляет собой важную медико-социальную проблему. Заболевание в большинстве случаев поддается диетотерапии в случае своевременной (пренаталыюй и постнатальной) диагностики. При отсутствии своевременной терапии токсические метаболиты фенилаланина оказывают деструктивное воздействие на центральную нервную систему, в результате чего развивается умственная отсталость.

Исследования причин РК11 на молекулярном уровне показали, что в подавляющем большинстве случаев заболевание связано с мутациями в структуре гена фенилаланингидроксилазы (РАН). Спектр мутаций и их распространенность имеют выраженные региональные и этнические особенности. Изучение спектра мутаций гена РАН в разных регионах показали, что РКи - крайне гетерогенное наследственное заболевание. В настоящее время известно более 400 мутаций гена РАН, большинство из которых являются точковыми заменами. Несмотря на высокую гетерогенность спектра мутаций, несколько мутаций обычно являются превалирующими в той или иной популяции.

Идентификации мутаций у больных РКи является достаточно сложной задачей, учитывая значительную длину гена РАН (105000 п.н), и большое количество выявленных мутаций (более 400). Знание региональных особенностей спектра мутаций позволяет увеличить эффективность такой идентификации (в первую очередь за счет первоначального скрининга наиболее частых мутаций в регионе). Идентификация мутации важна для применения дифференцированного подхода к лечению заболевания, поскольку различные мутации в разной степени снижают активность РАН. Изучение спектра мутаций разных регионов может помочь более точно исследовать процессы возникновения и распространения мутаций, обуславливающих РКи. Поскольку заболевание в подавляющем большинстве случаев связано с нарушением одного гена, модель РКи является

перспективной для развития корректирующих генетические дефекты методов лечения, таких как соматическая генная терапия.

Цени и задачи работы

Целью настоящей работы было определение спектра мутаций гена фенилаланингидроксилазы в группе больных фенилкетонурией, проживающих на территории Новосибирской области, путем анализа нуклеотидных последовательностей экзонов и поиск новых полиморфных сайтов в нитронах гена. На основании полученных данных планировалось подобрать эффективные методы детекции наиболее распространенных мутаций.

В ходе работы планировалось решить следующие задачи:

• изучить спектр мутаций в экзонах (3, 5, б, 7, 10, 11, 12) гена РАН, кодирующих функционально важные участки фермента,

• определить неизвестную ранее нуклеотидную последовательность интрона 7 гена РАН человека,

• осуществить поиск в интронах гена РАН потенциальных полиморфных сайтов,

• подобрать эффективные методы детекции выявленных мутаций гена РАН. Научная новизна работы

• Впервые определен спектр мутаций гена РАН у больных фенилкетонурией Новосибирской области.

• Определена неизвестная ранее нуклеотидная последовательность интрона 7 гена РАН человека.

• Выявлены неизвестные ранее полиморфные сайты в интронах гена РАН человека, которые могут быть рекомендованы как генетические маркеры для идентификации аллелей.

Научно-практическая ценность работы

Выявленный спектр мутаций позволил предложить эффективные методы детекции наиболее распространенных из них, внедрение которых в медицинскую практику может повысить эффективность диагностики РКи. Выявленные в структуре гена РАН полиморфные сайты могут быть использованы как генетические маркеры для оценки носительства и идентификации аллелей. В процессе работы создан набор молекулярных зондов (фрагментов генов, продуктов ПЦР и олигонуклеотидов - праймеров для ПЦР) для различных

областей гена РАН человека, а также набор ДНК фрагментов гена РАН, содержащих охарактеризованные мутации.

Публикации и апробация работы

Результаты работы были представлены в виде устных докладов на конференции "Геномика- медицине" (Москва, 1999) и международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Гурзуф, Украина, 2000), а также в виде стендового сообщения на международной конференции "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии" (ЕШЕ№-2000, Новосибирск, 2000). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 20 рисунков, 16 таблиц; список цитируемой литературы включает 263 ссылки. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, обсуждения результатов и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ген фенилаланингидроксилазы человека (РАН) находится на 12 хромосоме в районе 12q22-24.1 и состоит из 13 экзонов, разделенных нитронами различной протяженности (от 1000 п.н. до 23500 п.н.). Несмотря на то, что ген РАН привлекает интерес многих исследователей, его полная структура до сих пор неизвестна. Известна структура мРНК РАН (2400 п.н), составляющая около 2 % полной длины гена (105000 п.н), а также фрагментов интронов, непосредственно прилежащих к границам экзонов. К настоящему времени в структуре гена обнаружено более 400 мутаций, большинство из которых являются точковыми заменами (www.mcgill.ca/pahdb).

Настоящее исследование проведено в группе из 34 неродственных больных с классической формой фенилкетонурии, родившихся и проживающих на территории Новосибирской области. Пациенты были выявлены в ходе биохимического скрининга (по уровню фенилаланина в моче), а также в ходе клинического приема. Диагноз фенилкетонурия был поставлен врачом-генетиком медико-генетического отдела государственного областного Новосибирского диагностического центра (ГНОДЦ) Китайник Г.П.

В лаборатории ДНК диагностики ГНОДЦ соискателем совместно с сотрудниками диагностического центра была выделена ДНК пациентов, проведены исследования мутаций методом рестрикционного анализа, а также методом ПЦР получены ДНК экзонов и интрона 7 гена фенилаланингидроксилазы. Работа по секвенированию ДНК и подбору методов детекции наиболее распространенных мутаций была осуществлена соискателем в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

В работе были исследованы экзоны 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, фрагменты интронов, прилегающих к перечисленным экзонам гена, а также интрон 7 гена фенилаланингидроксилазы больных PKU. Для исследования были выбраны наиболее важные для функционирования фермента районы гена РАН, кодирующие домены фермента, ответственные за конформационную стабильность и каталитическое превращение субстрата. Мутации в них, как правило, приводят к значительному снижению активности фермента.

ДНК экзонов и интронов гена размером от 200 до 1000 была получена методом полимеразной цепной реакции. Поиск мутаций осуществляли с использованием метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и по результатам секвенирования продуктов ПЦР методом Сэнгера с использованием радиактивной и флуоресцентной (на автоматическом секвенаторе ABl 310 (Perkin Elmer,США)) меток. Метод автоматического секвенирования наиболее удобен для идентификации мутаций в гетерозиготном состоянии,

поскольку позволяет производить полуколичественную оценку интенсивностей сигналов, что дает возможность различать мутации и артефакты секвенирования. Для детекции мутаций были использованы также полимеразная цепная реакция с введением сайта рестрикции (АСИБ ПЦР) и электрофорез в градиенте денатурирующего агента ДОСОЕ).

Предварительно у пациентов методом рестрикциошюго анализа был осуществлен скрининг мутации К408\У в экзоне 12, являющейся наиболее распространенной в популяциях Восточной Европы. Мутация 1*408\У оказалась наиболее распространенной и в обследованной группе. Было обнаружено 9 гомозиготных и 20 гетерозиготных носителей данной мутации. ДНК 25 пациентов (кроме гомозигот по мутации 1М08\У) были исследованы на наличие других мутаций методом прямого секвенирования продуктов ПЦР.

В результате проведенного исследования было идентифицировано 91.1% предположительно обуславливающих РКи аллелей в обследованной группе. Было обнаружено 12 типов мутаций, приводящих к нарушению активности РАН: 10 мутаций, приводящих к заменам аминокислот, одна мутация сайга сплайсинга и одна микроделеция. В интронах гена было выявлено 5 неизвестных ранее

Ж1Ш1-4» нитрон

ЮОО \14SV R1SW

И« 0

ЕМОК ",™с PÍ81L

R1SSQ

Sin/i

ц

S349P

I I I I

ЗМсЛ 45Ig/c — 574с/1 V>lc/t

> 60

ОЕЬ 02324

R40SW Y414C IVSUoll I 90

J_I_i_i_I_I

■

Рис.1. Мутации и полиморфные сайты в структуре гена РАН, выявленные в ходе настоящего исследования. На рисунке стрелками отмечены позиции мутаций и полиморфных сайтов.

полиморфных сайтов. На рисунке 1 показано положение идентифицированных в настоящей работе мутаций и полиморфных сайтов в структуре гена РАН.

Мутации экзона 12 в структуре гена РАН

В экзоне 12 выявлены две мутации, приводящие к замене аминокислоты и одна мутация области сплайсинга (табл. 1).

Таблица 1. Мутации экзона 12 гена РАН среди больных фенилкетонурией в Новосибирской области.

Локализация Мутация Замена Частота (%)

ДНК Белок

Экзон 12 Я408\У* ссс->тсс Аг£->Тгр 55.88

Экзон 12 У414С ТАС->"ГОС Туг->Су5 1.47

Интрон 12 1315+1ё->а Делеция экзона 12 5.88

Примечание4, по терминологии, принятой консорциумом исследователей гена РАН, замена С->Т в кодоне 408 обозначается И408\У, где Я обозначает исходную (нормальную) аминокислоту в однобуквсином коде, 408 - номер кодона, содержащего мутацию, V/ -однобуквешшй код возникающей в результате замены аминокислоты. Мутация сайта сплайсинга обозначается 1У512пИ-1§->а (однобуквенная замена в первом нуклеотиде интрона 12 гена РАН, нумерация нуклеотидов осуществляется от начала интрона). Частоты мутаций указаны в процентном соотношении данного аллеля к общему числу аллелей, предположительно обуславливающих РК1) в обследованной группе (6В).*- мутации в составе Срв-динуклеотидных пар.

Как уже было отмечено, мутация К408\У (замена кодона 408 ССО на ССА, приводящая к замене аргинина на триптофан) - самая распространенная в обследованной группе. В результате мутации происходит разрушение водородных связей аргинина в 408 положении с аминокислотными остатками лейцинов в 308, 309 и 311 положениях, что в свою очередь приводит к дестабилизации доменов фермента и нарушению их правильной ориентации по отношению к субстрату. Это значительно снижает активность РАН, приводя к тяжелым формам болезни.

Среди других мутаций экзона 12 в обследованной группе была обнаружена мутация У414С (рис. 2). Мутация приводит к замене А-^О во втором основании кодона 414, в результате чего тирозин в 414 положении меняется на цистеин. Эта замена не приводит к радикальным изменениям в структуре белка, поэтому 50% остаточной активности фермента сохраняется (РиэеШ е( а1, 1998).

О А_Т С С А Т С

~ — Рис. 2. Идентификация мутации У414С в

гетерозиготном состоянии. Справа »{о—результат секвенирования экзона 12

с ________^ с здорового человека, слева - с мутацией

3» ЯВ У414С в гетерозиготном состоянии

| и, ^^

В интроне 12 мы выявили также мутацию 1\'512п1^->а, нарушающую донорный сайт сплайсинга (частота 4.4%). Мутация приводит к делеции целого экзона 12 во время сплайсинга РНК, в результате образуется укороченный белок без 52 аминокислот, входящих в тетрамеризующий домен, что приводит к

значительному понижению активности фермента из-за конформационной нестабильности белка (МагуЦ е1 а1, 1987).

Мутации в структуре экзона 7

Наибольшее число различных мутаций в обследованной группе было обнаружено в экзоне 7 гена РАН (кодоны 236-281). Этот экзон играет важную роль в функционировании белка: он отвечает за связывание с кофактором (аминокислотные остатки 264-290), образование активного центра, конформационную стабильность фермента (аминокислотные остатки 252-272); поэтому мутации в этом экзоне, как правило, приводят к значительному уменьшению активности фермента и, как следствие, к тяжелым случаям фенотипического проявления заболевания.

В структуре экзона 7 больных РК1), жителей Новосибирской области, нами обнаружено пять разных мутаций, приводящих к заменам аминокислот, и одна замена (вТС на СТА) не изменяющая аминокислотного состава белка (табл.2.).

Таблица 2. Мутации экзона 7 гена РАН в обследованной группе.

Локали -зация Мутация Замена Частота (%)

ДИК Белок

Экзон 7 1?2430* СвА^САА 1.47

Экзон 7 У245У** СТС/вТА Уа1/Уа1 -

Экзон 7 11252\У* свс^тсс А^->Тгр 1.47

Экзон 7 1*261(3* СОА-^САА 5.88

Экзон 7 Е280К* САА->ААА С1и->Ьув 1.47

Экзон 7 Р281Ь* О^-ХЛ^ Делеция экзона 8 7.35

Примечание: *- мутации в составе СрО-дннуклеотидных пар; ** (/) - молчащие замены, не приводящие к замене аминокислотного остатка (при расчете частот мутаций не учитываются).

Самая частая мутация экзона 7 - Р281Ь (7.35%) затрагивает последний кодон экзона 7 (рис. 3). Мутация приводит к значительному снижению активности фермента РАН. Несмотря на то, что она находится вне сайта сплайсинга, она приводит к делеции экзона 8 во время сплайсинга РНК, вследствие чего образуется крайне нестабильный укороченный белок.

Другая распространенная мутация экзона 7 мутация 11261(3 (рис.3). Замена аргинина на глутамин в аминокислотной последовательности белка приводит к значительному снижению активности фермента.

Кроме вышеперечисленных, в экзоне 7 гена РАН больных РКи Новосибирской области были обнаружены мутации Е280К и Ы252\У (рис.3), приводящие к тяжелым формам заболевания. Мутация К252\У, также как и

11408\У, в значительной степени изменяет сеть водородных связей в молекуле белка, что приводит к перестройке конформационной структуры белка, нарушающей процесс олигомеризации фермента.

С А Т С

С л т с„.

.....- С

С А т с

Г, А Т С (1

С ! -С

< л

-от А е С-

, А ^ А =1 С|А-

Рис. 3. Идентификация мутаций экзона 7 у больных фенилкетонурией в гетерозиготном состоянии: Н261<3(а), Я252\У (Ь), Р2811(с), Е280К (с)). Слева результат секвенирования фрагмента геномной ДНК экзона 7 здорового человека, справа - пациента с мутацией экзона 7 в гетерозиготном состоянии, стрелками указаны позиции замен.

Одной из возможных причин большего количества мутаций в экзоне 7 является относительно высокий процент Срв динуклеотидов (6 Срй пар из 23 в мРНК). Все найденные нами мутации 7 экзона затрагивают Срв динуклеотидные пары. Однако преобладание мутаций в экзоне 7 гена РАН не обязательно означает, что данный экзон является "горячей точкой" мутагенеза. Такая кластеризация может быть следствием функциональной важности района, кодируемого экзоном 7.

Мутации экзонов 5, б, 10, 11 гена РАН

В экзоне 5 гена РАН у больных РКи была обнаружена мутация Ш 580, также приходящаяся на Срй динуклеотидную пару (рис. 4). Замена аргинина на глутамин приводит к значительному изменению конформационной структуры фермента, и, как следствие, к значительной потере его активности и тяжелому течению заболевания.

Таблица 3. Мутации экзонов 5, 6, 10, 11 гена РАН в обследованной группе.

Локализация Мутация Замена Частота (%)

ДНК Белок

экзон 5 Я 158(2* ССО->САО Агя^ап 4.41

экзон 6 Е2210222Глс1е1А0 с!е1АС(663,664) Сдвиг рамки 2.94

экзон 6 С>232<2** САА/САв апАПп -

экзон 10 8349Р ТСА->ССА Зег^Рго 1.47

экзон 11 У386С ТАТ-^ТвТ Туг^Сув 1.47

Примечание- *мугации в составе Срв-дииуклеотидных пар; ** (/) - молчащие замены, не приводящие к замене аминокислотного остатка (при расчете частот мутаций не учитываются).

CiA.SC 7 ОС Г Т СТ' Т С Г Г сд 90 100

952. 816.

о1А,

Рис. 4. Идентификация мутации Я 158(2 (экзон 5) методом автоматического секвенирования. Стрелкой указана нуклеотидная замена ССвСАв в гетерозиготном состоянии.

В одном случае мутация Л 158(2 обнаружена в сочетании с редкой мутацией Е221Ш22Г$с1е1АС экзона 6. Микроделеция двух пар оснований АО, затрагивающая 221 и 222 кодоны, может привести к сдвигу рамки считывания и остановки синтеза белка за счет преждевременной терминации синтеза. У пациентов обследованной группы обнаружены два случая этой микроделеции.

Другие выявленные в обследованной группе мутации относятся к редким. Так, при секвенировании экзона 10 нами обнаружена единичная мутация 8349Р, приводящая к полной потере активности фермента, а в экзоне 11 гена -мутация У386С.

Исходя из полученных соискателем данных о распространении мутаций, обуславливающих РКи, можно предположить, что на распространение фенилкетонурии в Новосибирской области оказали влияние потоки генов из

Восточной Европы (1ШШ, И252\У), Скандинавии (1У812п11, У414С), Западной Европы (Е280К, 1Ш8(2), Южной Европы (Р281), Турции (1*2610), а также Юго-Восточной Азии (1X243(3). На рисунке 5 схематически изображены потоки генов, предположительно оказавших влияние на распространение РКи в регионе.

Г7&

- . у 4'Т г*' ,1М /\Х{Г281Ь'

Рис.5.

Схематическое изображение потока генов, оказавших влияние на распространение фенилкетонурии в Новосибирской области.

Сочетание аллелей и мутационная гетерогенность в обследованной группе

Большинство выявленных нами мутаций гена РАН обнаружены в компаундном состоянии (т.е. в сочетании, как правило, двух различных мутаций в гетерозиготном состоянии). Как известно, комбинация разных мутаций может давать разный эффект на уровне белка, приводя к разной степени тяжести проявления заболевания. Большинство обуславливающих РКи аллелей обнаружены в сочетании с наиболее распространенным аллелем 1*408\У (табл. 4)

Таблица 4. Сочетание аллелей у больных РКи в Новосибирской области.

Аллель 1 Аллель 2 Число случаев

11158(2 Я408\У 2

Е22Ш222Г5<)е1АС а 158(2 1

К2430 К408\У 1

Я252\У Р281Ь 1

Я261<2 {*408\У 3

Е280К R408W 1

Р281Ь R408W 4

в349Р R408W 1

У386С игбкз I

И408У/ X (нендент.) 6

У414С К408\У 1

И408\У 3

Идентификация основной части (более 90%) обуславливающих РК1) аллелей в обследованной группе позволила использовать для оценки гетерогенности мутаций гена РАН в популяции Новосибирской области предложенный Гульдбергом (СиМЬе^ й а1, 1996) критерий - теоретическую оценку частоты гомозигот (таблица 5). Данный показатель служит мерой сравнения мутационной гетерогенности разных популяций. Он позволяет прогнозировать диагностическую эффективность скрининга наиболее распространенных в популяции мутаций. Обследованная нами группа характеризуется средней степенью гетерогенности, что обусловлено значительным вкладом распространенной мутации Я408\У. Пять из выявленных мутаций (К408\У, Р281Ц 1*261(3, Я158С>, 12т 1) наиболее распространены, и на их долю приходится 78% аллелей, обуславливающих РК11 в обследованной группе.

Таблица 5. Мутационная гетерогенность гена РАН в разных популяциях.

Регион/популяция X N хромосом определенные мутации (%)

США 0.06 294 94.9

Сев. Ирландия 0.14 242 99.6

Дания 0.17 378 98.4

Южная Польша 0.44 80 91.3

Исландия 0.26 34 100

Нидерланды 0.08 68 92.6

Татария 0.19 27 100

Йеменские евреи 1.00 44 100

Норвегия 0.10 236 99.6

Новосиб. область 0.37 68 91.1

> 2

Примечание: ^ х - сумма квадратов 1-го аллеля.

Идентификация полиморфных сайтов в структуре гена РАН

Поскольку в локусе гена РАН не обнаружено какой-либо горячей точки рекомбинации, полиморфные локусы в районе гена РАН могут использоваться для идентификации обуславливающих PKU аллелей гена РАН. Ассоциации мутаций в структуре гена РАН и определенных полиморфных сайтов имеют важное значение в пренатальной диагностике и при выявлении носительства в семьях больных PKU. При секвенировании экзонов гена РАН были обнаружены диаллельные полиморфные локусы: замена V245V в экзоне 7, а также замена Q232Q в экзоне 6 (таблицы 2, 3). В обоих случаях в результате замен образуются сайты для эндонуклеаз рестрикции {Alui, Dde1). Полиморфный локус V245V может быть использован как генетический маркер в обследуемой группе, поскольку замена GTG->GTA встречается с высокой частотой у больных PKU (частота аллеля GTA в 245 кодоне 10.3 %).

Для дальнейших поисков потенциальных полиморфных сайтов был выбран интрон 7, находящийся рядом с наиболее функционально важным экзоном гена. Как известно, замены в интронах могут существенно влиять на процессинг РНК и синтез белка (Гилберт, 1994). После получения фрагмента ДНК, содержащего интрон 7, методом ПЦР, мы определили неизвестную ранее нуклеотидную последовательность интрона 7 РАН человека (GenBank AN AF204239), длина которой составила 1058 пар нуклеотидов.

Анализ последовательности интрона 7 у больных PKU Новосибирской области показал, что в структуре этого интрона находятся несколько неизвестных ранее полиморфных сайтов, в среднем одна замена приходится на 250 пар оснований (рис.6).

1 11 21 31 «1 51 61 71

GTGAGTACTGTCCTCC^GCTACCAGTTGCCAGGCACAATGAGCGCCATCTTTTCCTGCTGCAAGAATGAGGTTTGGGTTC

81 91 101 111 121 131 141 151

ATTGCTC3GCTGGTCCACAGGA.CTAGTTGTCTXGACTGTTTGCTGGTAGTACTAAAAACAATTCATCTATTCTGGAGATTT

lei 171 1S1 191 201 211 221 231

GCTCCATCCAAGTAGA TAGACCAGACT CATTCGAGA~TTGGrCATCCTGTGATCCAATAACTCAGAACTCCCTTGGCAGT

241 251 261 271 291 291 301 311

GAGAATGA^GATCCCAATCAAGTTCGAAAGTCAAAGCTACGAAGTTGCAAATGAGAACAGGAACAivGTGGCAGCCAAGG

321 331 341 351 361 371 381 391

TATCTCAATACCTCCTAAGTATACXTCTASATTACTCTrATCTITCTTTSCCTAGATTOTGTATTGGGTAGAGGTAGAGA

401 411 421 431 441 451 461 471

ATTGCAGCCATTATGCTTCTTACTrGGGTGTTTCGTTATCCCCTTAGTCTGATAAAACTTATGCAACTTATAAAAAAATT

*

481 491 501 511 521 531 S41 551

AATGGAACATCCAAAATTGTTTTTCCTTGCCCATAAAGTTCATTGCTACAAATCCAAAAAGACCTGTTCCAAATGGACAT

561 571 581 591 «01 611 621 631

AGCACATACAGTGTTAAATAAATGTAGGTTTTCTTCCCTCACTGCTGTCCACCTCCAGACTAACAGAAGAGCAGCACTGT »

£41 651 661 671 681 691 701 711

TTTTGTTTTAGTTCCCAGTGGAATAGCTGAGCATATTGTATCTGCCCAGGGAAGTCAATACCAGGGAGAAGACAGGATGA

721 731 741 751 761 771 781 791

GAAGTGTTCATGACTCATAGCTCACTTAGGTATATGGGAGCATGTCCACAGGAATATTAGCTCTTCTGCCCGGTACCCCA

801 811 821 831 841 851 861 871

CTGGGGATACTCTTAAGACCCTTGGCTGCTGTGCCCTACCCTGCACCTGTCTCTTATTTTTCCTTCCTTTTCTTCTTTTT

881 891 901 911 921 931 941 951

ACCTTGTACCCTGCCTTTTATGATCCCAACCTCTGCATATCACTTATTCCTGGGAGAGGGATCATAAGCCTAAAAGAGTT

961 971 931 991 1001 1011 1021 1031

ATTTCCATTCTTTCTGSCCATTCCTCATGTAGAAAGACTGAGTCTGGCTTGGCTTAAACCTCCTCCCCTCCGAGCTCTCT

1041 1051

GTGCTTTCTGTCTTTCAG

Рис.6. Нуклеотидная последовательность интрона 7 гена РАН* обозначены позиции полиморфных сайтов

В таблице 6 указаны выявленные в настоящей работе полиморфные сайты интрона 7, а также замены в других интронах (нуклеотидные последовательности которых были определены частично), обнаруженные в ходе поиска мутаций в структуре гена РАН.

локализация замена аллели

интрон 5 с.510-54а^ п=7, a/g=6, а/а=1

интрон 7 с.842+332сЛ п=4, с/с=2, сЛ=2

интрон 7 с. 842+45 ^/с п=9, §/ё=7, g/c=2

интрон 7 с.842+574сЛ п=12, I, с/с=1

интрон 7 с. 842+791сЛ* п=29, с/с=18, (/с=10, (Л=1

интрон 10 с. 1065+97g/a* п=10, ф=5, 8/5=5

* отмечены нуклеотиды в составе СрС пар.

На рисунке 7 приведены примеры идентификации полиморфных сайтов в структуре гена РАН альтернативными методами.

с; А Т С с А X с с л т с

332<Л 79ТсЛ

Рис.7. Полиморфные сайты в структуре интрона 5, выявленные секвенированием ДНК с использованием радиоактивного мечения (приведены все варианты аллелей) и интрона 7 гена РАН (а, Ь), выявленные методом автоматического секвенировании ДНК с использованием флуоресцентной метки. Стрелками указаны позиции полиморфных сайтов.

Все выявленные полиморфные сайты являются однонуклеотидными заменами; два из них приходятся на Срв динуклеотиды, которые являются предполагаемыми горячими точками мутагенеза в структуре геномов млекопитающих. Ассоциации выявленных полиморфных сайтов с мутациями у больных РКи Новосибирской области суммированы в таблице 7.

Таблица 7. Ассоциации некоторых полиморфных сайтов и мутаций гена РАН.

Образцы интрон10+97 экзон 7+735 в/А интрон 7 +791 сЛ Мутации

1. && ею с/с Я408\У/8349Р

2. а а с/1 Р28ИЛ)ЕЬ

3. && с/с с/с Я261<3/У386С

4. g/a в/А с/1 У414С/Х

5. СЮ с/с R40BW/X

6. С/А сЛ R408W/X

7. е/е. СЮ с/с R408W/X

8. х/х в/А сЛ R408W/X

9. {?/а О/А с/1 R408W/X

10. Я/а в/А 1/1 Ri58Q/DEL

11. с;/с с/с R408W/P281L

Примечание: ОЕЬ обозначена мутация Е22Ш2221'5с1е1АО, х

неидентифицированнные аллели

Выявленные в результате проведенного исследования в структуре гена РАН неизвестные ранее полиморфные сайты могут быть рекомендованы как дополнительные маркеры для генетических исследований, связанных с идентификацией аллелей этого гена.

Методы детекции мутаций

Знание спектра мутаций региона дает возможность ограничить первичный поиск мутаций определением нескольких самых распространенных с использованием более простых альтернативных методов, а также получить панель образцов ДНК с мутациями для использования в качестве контрольных. Для наиболее распространенных в Новосибирской области мутаций гена РАН автором были предложены эффективные при использовании в клинической практике методы их идентификации (таблица 8).

экзон мутация предложенные методы

5 R158Q ACRSPCR

6 Е221 D222fsdel AG DGGE

6 Q232Q KFLV(+Ddel)

7 R243Q RFLP(+AccB7I)

7 V245V RFLP(-t-AM)

7 R252W RFLPMval)

7 R261Q RFLP(-//;«/I)

7 P281L ACRS PCR

10 S349P RFLP(+Accß7I)

12 R408W RFLP(+£col30I)

12 Y414C RFLP(+F/!w4HI)

Примечание (+) означает наличие, (-) исчезновение сайта для эндонуклеазы рестрикции.

Использование метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (/1РЬР)

Для детекции мутаций картированием возникающих (исчезающих) сайтов эндонуклеаз рестрикции были подобраны соответствующие эндонуклеазы рестрикции (перечислены в таблице 8). Например, последовательность в А МТС в экзоне 7 аллеля здоровых людей распознается эндонуклеазой рестрикции Яш/1, которая расщепляет продукт ПЦР экзона 7 на два продукта. Замена ССС/ТСО в результате мутации в 261 кодоне, приводит к исчезновению сайта узнавания Нт]I, в результате чего соответствующий продукт ПЦР не гидролизуется этой эндонуклеазой (рис. 8). Этод метод наиболее прост и удобен, однако он применим только, если в случае замены возникает или исчезает сайт для эндонуклеазы рестрикции.

296

157 ■ 139 1

1 2 3 4 ш

307 .267 .234

■ 213

■ 184

124

Рис. 8. Идентификация мутации 11261(3 методом ЯРЬР. Электрофорез в 6% ПААГ геле.

Продукт ПЦР образца здорового человека до (3) и после (4) рестрикции НшД, продукт ПЦР гетерозиготного носителя мутации 1*261(2 До (1), после рестрикции Нт]I (2).

ПЦР с введением сайта эндонуклеазы рестрикции при помощи олигонуклеотидных прагшеров (ЛС/?5 ПЦР)

В случае отсутствия в районе детектируемой мутации подходящих сайтов для эндонуклеаз рестрикции в качестве метода, альтернативного

секвенированию, использовали ПЦР с введением сайта эндонуклеазы рестрикции при помощи олигонуклеотидных праймеров. При этом один из праймеров выбирают в непосредственной близости от детектируемой мутации и вносят изменения (как правило, одну замену) в его нуклеотидную последовательность относительно структуры геномной ДНК так, чтобы продукт ПЦР содержал сайт эндонуклеазы рестрикции, исчезающий или возникающий в результате этой мутации. В данной работе для детекции частых мутаций P281L (7.35%) и R158Q (4.41%) использовали сайт одной и той же эндонуклеазы рестрикции Mspl (CCGG) (рис. 9). Преимущество метода ACRS ПЦР - в простоте исполнения и воспроизводимости, не уступающих RFLP. Использование одной эндонуклеазы Mspl в обоих случаях дополнительно упрощает детекцию мутаций.

i 2 д 4,,,,,.,„. м

Г '' *" 242 *

и&-<~* -ihfó =—147

124 —. «и» Lw

Рис. 9. Использование ПЦР с введением сайта эндонуклеазы рестрикции при помощи олигонуклеотидных праймеров для идентификации мутации R158Q (а) и P281L (Ь). Электрофорез в 6% полиакриламидном геле.

a. Исходный продукт ПЦР экзона 5 РАН здорового человека (фрагмент 146 п.н.) до гидролиза (4), этого же продукта после расщепления Mspl (фрагмент 124 п.н., фрагмент 22 п.н. не виден) (2) и продуктов ПЦР экзона 5 РАН разных пациентов с мутацией R158Q в гетерозиготном состоянии после расщепления Mspl (фрагменты 124 п.н и 146 п.н.) (1, 3).

b. Исходный продукт ПЦР экзона 7 РАН здорового человека (фрагмент 161 п.н.) до гидролиза (1), этого же продукта после расщепления Mspl (фрагмент 137 п.н., фрагмент 24 п.н. не виден) (2) и продуктов ПЦР образцов ДНК разных пациентов с мутацией P281L в гетерозиготном состоянии после расщепления Mspl (фрагменты 137 п.о и 161 п.н.) (3, 4).

Применение эектрофореза в градиенте денатурирующего агента (DGGE)

Для идентификации микроделеции был применен анализ продуктов ПЦР с использованием электрофореза в градиенте денатурирующего агента. Метод основан на изменении точки плавления гетеродуплекса, формирующегося из образца ДНК здорового человека и образца с мутацией, из-за наличия неспаренного основания. Такое изменение точки плавления можно выявить при гель-электрофорезе в градиенте денатурирующего агента.

Так микроделеция в два нуклеотида в случае мутации E221D222fsdelAG приводит к значительному уменьшению стабильности гетеродуплекса (рис. 10).

Для детекции гомозиготного варианта мутации необходимо проводить отжиг продукта ПЦР с соответствующим фрагментом ДНК здорового человека. Этот метод не требует никаких дорогостоящих реагентов, таких как, например, ферменты. Необходимо лишь наличие контрольных образцов ДНК с делецией и без нее.

Рис. 10. Идентификация микроделеции электрофорезом в 6 % ПААГ в градиенте мочевины (0 —» 8 М): 1 -продукт ПЦР области экзона 6 (383 п.н.) гена РАН здорового человека, 2 и 3 - продукты ПЦР геномной ДНК разных пациентов с мутацией Е22Ю222Г5с1е1АО в гетерозиготном состоянии.

Таким образом, на основании выявленного спектра мутаций в структуре гена РАН в обследованной группе пациентов были предложены простые методы детекции наиболее распространенных из них, что открывает дополнительные возможности ранней диагностики РКЦ и создает предпосылки для применения новых подходов коррекции заболевания и диетотерапии.

Автор благодарит: к.б.н. Морозова И.В. за огромную неоценимую помощь в экспериментальной части работы и написании диссертации, д.б.н. Мертвецова Н.П. за инициацию работ по данной тематике и привлечение к ним соискателя, к.х.н. Бондарь A.A. за помощь в работе и ценные советы при оформлении диссертации, Тупикина А.Е за помощь в работе, Попову B.C. за техническую поддержку; всех сотрудников НИБХ СО РАН за дружескую атмосферу, способствующую плодотворной работе.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам диагностического центра ГНОДЦ: к.м.н. Масленникову А.Б. за организацию в лаборатории ДНК-диагностики возможности получения амплификатов геномной ДНК больных PKU и поддержку данной работы, Китайник Г.П., Пауль Г.А., Забаровой Л.В. и Шориной А.Р. за проведенную работу по выявлению больных PKU Новосибирской области.

выводы

1. Проведено исследование спектра и частот мутаций гена фенилаланингидроксилазы в группе из 34 больных фенилкетонурией Новосибирской области. Методом секвенирования ДНК идентифицировано 10 типов мутаций, приводящих к заменам аминокислот, одна микроделеция, одна мутация сайта сплайсинга. Большинство обнаруженных мутаций (К408\У, Р281Ц И2610, 1У512пП, И1580) имеют европейское происхождение.

2. Определена неизвестная ранее нуклеотидная последовательность нитрона 7 гена фенилаланингидроксилазы человека. В интронах гена РАН обнаружено 5 неизвестных ранее полиморфных сайтов, являющихся однонуклеотидными заменами, которые могут быть рекомендованы как генетические маркеры для оценки носительства и популяционных исследований.

3. На основании выявленного спектра подобраны простые методы детекции наиболее распространенных из найденных мутаций, которые могут быть рекомендованы для использования в клинико-диагностической практике, в частности ИРЬР, ПЦР с введением сайта рестрикции и электрофорез в градиенте денатурирующего агента.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Г. Смагулова Ф.О., Масленников А.Б, Морозов И.В., Китайник Г.П. Мутации в структуре экзона 7 гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Новосибирской области // Генетика. 2000. Т.36. №6. С.849-852.

2. Смагулова Ф.О, Морозов И.В. Спектр и методы детекции мутаций в структуре гена фенилаланингидроксилазы больных фенилкетонурией Новосибирской области II Биоорганическая химия. 2000. Т.26. №11. С.838-843.

3. Смагулова Ф.О., Морозов И.В. Новые полиморфные сайты в структуре гена фенилаланингидроксилазы человека // Генетика. 2000. Т.36. №12. С.1716-1720.

4. Масленников А.Б., Смагулова Ф.О, Китайник Г.П., Оробей A.M. Эффективность рестрикционного анализа при типировании мутаций гена фенилаланингидроксилазы //Генетика человека и патология. 2000. Выпуск 5. С.152-157.

Определенная в настоящей работе нуклеотидная последовательность интрона 7

гена фенилаланингидроксилазы помещена в банк данных (GenBank AN

AF204239).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Смагулова, Фатима Олжабаевна

выводы

1. Проведено исследование спектра и частот мутаций гена фенилаланингидроксилазы в группе из 34 больных фенилкетонурией Новосибирской области. Методом секвенирования ДНК идентифицировано 10 типов мутаций, приводящих к заменам аминокислот, одна микроделеция, одна мутация сайта сплайсинга. Большинство обнаруженных мутаций (11408\¥, Р28И, 112610,1У812пП, Ю58С>) имеют европейское происхождение.

2. Определена неизвестная ранее нуклеотидная последовательность интрона 7 гена фенилаланингидроксилазы человека. В интронах гена РАН обнаружено 5 неизвестных ранее полиморфных сайтов, являющихся однонуклеотидными заменами, которые могут быть рекомендованы как генетические маркеры для оценки носительства и популяционных исследований.

3. На основании выявленного спектра подобраны простые методы детекции наиболее распространенных из найденных мутаций, которые могут быть рекомендованы для использования в клинико-диагностической практике, в частности КБЬР, ПЦР с введением сайта рестрикции и электрофорез в градиенте денатурирующего агента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смагулова, Фатима Олжабаевна, Новосибирск

1. Abadie V., Lyonnet S., Maurin N., Berhelon M., Caillaud C., Ciraud F., Maltei J. R., Rey J., Rey F., Munnich A. CpG dinucleotide are mutation hot spots in phenylketonuria. // Genomics. 1989. V.5. P.936-939.

2. Abadie V., Lyonnet S., Melle D., Berthelon M., Caillaud C., Labrune P., Rey F., Rey J., Munnich A. Molecular basis of phenylketonuria in France. // Dev. Brain Dys. 1993. V.6. P.120-126.

3. Abita J.-P., Blandin-Savoja F., Rey F. Phenylalanine hydroxylase. Evidence that the enzyme from human liver might not be a phosphoprotein. // Biochem. Int. 1983. V.7. P727-737.

4. Aoki K, Wada Y. Outcome of the patients detected by newborn screening in Japan. // Acta Paediatr. 1993. V.30. P.429-414.

5. Apold J., Eiken H. G., Odland E., Freotiksen A., Bakken A., Lorens J.G., Bowman H. A termination mutation prevalent in Norwegian haplotype 7 phenylketonuria genes.// Am. J. Hum. Genet. 1990. V.47. P.1002 -1007.

6. Apold J., Eiken, H. G., Svensson H., Kunert E., Kozak L., Cechak P., Guttler F., Giltay J., Lichter-Konecki U., Melle D., Zaruzellska J. M. The phenylketonuria C272X haplotype 7 mutation in European population. // Hum. Genet. 1993. V.92. P. 107-109.

7. Armstrong M.D., Tyler F.H. Studies on phenylketonuria. Restricted phenylalanine intake in phenylketonuria.// J. Clin. Invest. 1955. V.34. P.565-580.

8. Aulehla-Scholz C., VorgerJ M., Sautter E., Leupold D., Mahlmann R., Ullrich K., Olek K., Horst J. Phenylketonuria: Distribution of DNA diagnostic patterns in German families. // Hum. Genet. 1988. V.78. P. 353-355

9. Avigad S., Cohen B. E., Bauer R., Schwartz G., Fiydman M., Woo S.L.C., Shiloh Y. A single origin of phenylketonuria in Yemenite Jews. // Nature. 1990. V.144. P.168-170.

10. Ayling J. E., Pirson W.D., At-Janabi J. M., Helfand G.D. Kidney phenylalanine hydroxylase from man and rat: Comparison with the liver enzyme. // Biochemistry. 1974. V.13. P.78-85.

11. Baric I., Mardesic D., Gjuric G., Sarnavka V., Gobel-Schreiner B., Lichter-Konecki U., Konecki, Trefz F.K. Haplotype distribution and mutations at the PAH locus in Croatia. // Hum Genet. 1992. V.90. P. 155-7

12. Baric I., Mardesic D., Sarnovoka Y., Lichter-Konecki U., Konecki D. S., Trefz F.K. Geographical distribution of the P281L mutation at the phenylalanine hydroxylase locus: possible origin in southwestern Europe. // Inher Metab Dis 1994. V.17. P.376-377.

13. Bartholome K., Lutz P., Bickel H. Determination of phenylalanine hydroxylase activity in patients with phenylketonuria and hyperphenylalaninemia. // Pediatr. Res. 1975. V.9. P.899-903.

14. Berg K., Saugstad. A linkage study of phenylketonuria. // Clin. Gen. 1974. V.6. P147-152.

15. Bick U., Fahrendorf G., Ludolph A.C., Vassallo. P., Weglage J., Ullrich K. Disturbed myelination in patients with treated hyperphenylalaninemia: Evaluation with magnetic resonance imaging.// Eur. J. Pediatr. 1991. V. 150. P.185-189.

16. Bickel H., Gerrard J., Hickmans E. M. The influence of phenylalanine intake on the chemistry and behavior of a phenylketonuria child. // Acia Pediatr. Scand. 1954. V.43.P.64-77.

17. Bickel H., Bachmann C., Beckers R. Neonatal mass screening for metabolic disorders.// Eur. J. Pediatr. 1981. V.137. P133-139.

18. Blaskovics M., Guidici T. A new variant of biopterin deficiency.// N. Engl. J. Med. 1988. V.319. P.1611-1612.

19. Boehringer Mannheim. PCR Applications Manual. Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica. 1995.

20. Byck S., Morgan K., John S.W.M., Blanc L., Bouchard. G., Scriver C. R. Extended RFLP and Hindlll specific haplotypes at the PAH (PKU) locus on chromosomes in France and Quebec. // Am. J. Hum. Genet. 1992. V.51. Suppl.l. A571.

21. Byck S., Tyfield L., Carter K., Scriver C.R. Prediction of multiple hypermutable codons in the human PAH gene: codon 280 contains recurrent mutations in Quebec and other populations. // Hum. Mutat. 1997. V.9. P. 316321.

22. Campbell D. G., Hardie D. G, Vulliet P. R. Identification of four phosphorylation sites in the N-terminal region of tyrosine hydroxylase. // J. Biol. Chem. 1986. V.261. P. 10489-10492.

23. Centerwall W. R., Neff C. A. Phenylketonuria: a case report of children of Jewish ancestry. // Arch. Pediat. 1961. Y.78. P. 379-384.

24. Chakraborty R., Lidsky A. S,. Daiger S. P., Guttler F,. Sullivan S., DiLella A. G., Woo S.L.C. Polymorphic cDNA haplotypes at the human phenylalanine hydroxylase locus and their relationship with phenylketonuria.// Hum. Genet. 1987. V.76. P.40-46.

25. Charikova E.V., Khalchitskii S.E., Antoshechkin A.G., Schwartz E.I. Distribution of some point mutations in the phenylalanine hydroxylaase gene of phenylketonuria patients from the Moscow region. // Hum. Hered. 1993. V.43. P .244-249.

26. Chehin R., Thorolfsson M., Knappskog P. M., Martinez A., Flatmark T., Arrondo J.L.R., Muga A. Domain structure and stability of human phenylalanine hydroxylase inferred from infrared spectroscopy.//FEBS Letters. 1998. V.422. P.225-230

27. Cohen B. E., Bodonyi E., Szeinberg A. Phenylketonuria in Jews. // Lancet. 1961. V.l.P.344-345.

28. Cooper D. N, Youssoufian H. The CpG dinucleotide and human genetic disease. // Hum. Genet. 1988. V.78. P.151-155.

29. Crawford M., Cibbs D., Sheppard D. Studies on human phenylalanine monooxygenase: Restricted expression. // J. Inher Metab. Dis. 1981. Y.4. P.191-195.

30. Gurthrie R. Blood screening for phenylketonuria. // JAMA. 1963. V. 178. P863.

31. Daiger S. P., Lidsky A. S, Chakraborty R., Koch R., Cuttler F., Woo S.L.C. Effective use of polymorpic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxylase (PAH) locus in prenatal diagnosis of phenylketonuria.// Lancet. 1986. V. 1. P.229-232.

32. Davis M. D., Parniak M. A., Kaufman S., Kempner E. The role of phenylalanine in structure-fiinction relationships of phenylalanine hydroxylase revealed by radiation target analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.491-495

33. Dhondt J. L., Farriaux J. P., Boudha A., Largilliere C., Ringel J., Roger, M.M., Leeming R.J. Neonatal hyperphenylalaninemia presumably caused by guanosine triphosphatecyclohydrolase activity.// J. Pediatr. 1985. V.106. P.954-956.

34. Dhondt J. L., Guilhaud P., Rolland M., Dorche C., Andre S., Forzy G., Hayte J. Neonatal hyperphenylalaninemia presumably caused by a new variant of biopterin synthetase deficiency. // Eur. J. Pediatr. 1988. V. 147. P.153-157.

35. DiLella A. G., Kwok S.C.M., Ledley F.D., Marvit J., Woo S.L.C. Molecular structure and polymorphic map of the human phenylalanine hydroxylase gene.// Biochemistry. 1986. V.25. P.743-749.

36. DiLella A. G., Marvit J., Brayton K., Woo S.L.C. An amino-acid substitution involved in phenylketonuria is in linkage disequilibrium with DNA haplotype 2. // Nature. 1987. V.327. P.333-336.

37. DiLella A.G., Huang W.M., Woo S.L.C. Screening for phenylketonuria mutations by DNA amplification with the polymerase chain reaction.// Lancet. 1988. V.l.P.497-499.

38. DNA Sequencing. Second Edition. Amersham Life Science 1994.

39. Dworniczak B., Aulehla-Scholz C., Kalaydjieva L., Ullrich K., Bartholome K., Grudda K., Horst J. Aberrant splicing of phenylalanine hydroxylase mRNA: The Major cause for phenylketonuria in parts of Southern Europe. //Genomics. 1991a. V. 11 P.242-246

40. Dworniczak B., Grudda K., Stumper J., Bartholome K., Aulehla-Scholz C., Horst J. Phenylalanine hydroxylase gene: novel missense mutation in exon 7 causing severe phenylketonuria.// Genomics. 1991b. V.9. P. 193-199.

41. Dworniczak B., Kalaydjieva L., Aulehla-Scholz C., Ullrich K., Kremcnsky I., Radeva B., Horst J. Recurrent nonsense mutation in exon 7 of the phenylalanine hydroxylase gene. // Hum. Genet. 1991c. V.87. P.731-733.

42. Dworniczak B., Wedemeyer N., Eigel A., Horst. J.J. PCR detection of the Pvull (Ea) RFLP at the human phenylalanine hydroxylase (PAH) locus. //Nucl. Asids Res. 1991d. V.19. P.1958.

43. Dworniczak B., Wedemeyer N., Horst J.J. PCR detection of the Bglll RFLP at the human phenylalanine hydroxylase (PAH) locus.// Nucleic Asids Res. 1991e. V.19. P.1958.

44. Dworniczak B., Kalaydjieva L., Pankoke S., Aulehla-Scholz C., Alien G., Horst J. Analysis of exon 7 of the human phenylalanine hydroxylase gene: A mutation hot spot? Hum. // Mutat. 1992. V.l. P. 138-146.

45. Dzhura I., Naidenov V., Zhuravleva S., Kostyuk P., Shuba Y. Expression of Ca 2+ channels from rat brain with model phenylketonuria in Xenopus oocytes. // Brain Research. 1998. V.783. P.280-285

46. Eisensmith R.C., Woo S.L.C. Phenylketonuria and the phenylalanine hydroxylase gene. // Mol. Biol. Med. 1991. V.8. P.3-18.

47. Eisensmith R.C., Woo S.L.C. Molecular basis of phenylketonuria and related hyperphenylalaninemias: Mutations and polymorphisms in the human phenylalanine hydroxylase gene. // Hum. Mutat. 1992a. V.l. P.13-21.

48. Eisensmith R.C., Okano Y., Dasovich M., Wang T, Guttler F., Lichter-Konecki U., Konecki D. S., Svensson E., Hagenfeldt L., Rey F., Munnich A., Lyonnet

49. Eisensmith R.C., Woo S.L.C. Molecular Genetics of Phenylketonuria: From Molecular Anthropology to Gene Therapy. // Advances in Genetics. 1995. V.32. P. 199-271

50. Ellingsen S., Knappskog P.M., Jaran A., Eiken H.G. Diverse PAH transcripts in lymphocytes of PKU patients with putative nonsense (G272X, Y356X) and missense (P281L, R408Q) mutations. // FEBS Letters. 1999. Y.457. P.505-508

51. Erlandsen H., Stevens R.C. The Structural Basis of Phenylketonuria. // Mol Genet Metab. 1999. V.68. P. 103-125.

52. Foiling A. Utskillelse av fenylpyrodriesyre i urinen som stoflikifteanomali i fortindelse med imbecillitet.// Nord. Med. Tidskr.l934a.V.8. P.1054-1059.

53. Foiling A. Uber Ausscheidung von Phenylbrenztraubensäure in den Harn als Stoff-wechselanomalie in Verbindung mit Imbezillität.// Ztichr. Ptysiol. Chem. 1934b V. 227. P.169-176.

54. Forrest S. M., Dahl H.-H., Howells D. W., Diazani I, Cotton R.G.H. Mutation detection in phenylketonuria using chemical cleavage of mismatch: Importance of using probes from both normal and patient samples.// Am. J. Hum. Genet. 1991. V.49.P.175-183.

55. Fusetti F., Erlandsen H., Flatmarki T., Stevens R.C. Structure of tetrameric human phenylalanine hydroxylase and its Implications for phenylketonuria.// The Journal of biological chemistry. 1998. V. 273. P. 16962-16967.

56. Gold R. J.M., Maag U.R. Neal J.L, Scriver C.R. The use of biochemical data in screening for mutant alleles and in genetic counseling. // Ann. Hum. Genet. 1974. V.37. P.315-326.

57. Goltsov A.A., Eisensmith R.C., Konecki D.S., Lichter-Konecki U., Woo. S.L.C. Linkage disequilibrium between mutations and a VNTR in the human phenylalanine hydroxylase gene. // Am. J. Hum. Genet. 1992a. V.51. P627-636.

58. Goltsov A.A., Eisensmith R.C.,Woo. S.L.C. Detection of the XmnI RFLF at the human phenylalanine hydroxylase locus by PCR. // Nucleic Asids Res. 1992b. V.20. P.927.

59. Goltsov A.A., Eisensmith R.C., Naughten E.R., Woo S.L.C. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria.// Hum. Mol. Genet. 1993. V.2. P.577-581.

60. Grenett H.E., Ledley F.D., Reed L.L., Woo S.L.C. Full-length cDNA for rabbit tryptophan hydroxylase: Functional domains and evolution of aromatic amino acid hydroxylases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V.4. P.5530-5534.

61. Guerin T., Walsh G.A., Donlon J., Kaufrnan S. Correlation of rat hepatic phenylalanine hydroxylase, with tetrahydrobiopterin and GTP concentrations// The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 1998. V.30.1. P. 1047-1054.

62. Guldberg P., Henriksen K.F., Guttler F. Molecular analysis of phenylketonuria in Denmark: 99% of the mutations detected by denaturing gradient gel electrophoresis. // Genomics. 1993a. V.17. P141-146.

63. Guldberg P., Henriksen K.F., Lou H.C., Guttler F. Aberrant phenylalanine metabolism in phenylketonuria heterozigotes // J. Inher. Metab. Dis. 1998. V.21. P.365-372

64. Guthrie R., Susi A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants.// Pediatrics. 1963. V.32. P.338-343.

65. Guttler F., Ledlley F. D„ Lidsky A.S., Dilella A.G,. Sullivan S.E., Woo S.L.C. Correlation between polymorphic DNA haplotypes at phenylalanine hydroxylase locus and clinical phenotypes of phenylketonuria.// J. Pediatr. 1987. V.110. P.68-71.

66. Guttler F., Guldberg. P., Henriktsen K.F., Mikkelsen I., Olsen B., Lou H. Molecular basis for the phenotypical diversity of phenylketonuria and related hyperphenylalaninemias. //J. Inher. Metab.Dis. 19.93. V.16.P.602-604.

67. Hartl F., Hlodan R., Langer T. Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations.// Trends Biochem. Sci. 1994. Y.19. P. 20-25.

68. Herrmann F., Wulf K., Wehnert M., Siedlitz G., Guttler F. Haplotype analysis of clasical and mild phenofype of phenylketonuria in the German Democratic Republic. // Clin. Genet. 1988. V.14. P.176-180.

69. Hoang L., Byck S., Prevost. PAH mutation analysis Consortium Database: a database for disease-producing and other allelic variation at the human PAH locus//Nucl. Acids Res. 1999. V.24. P.127-131.

70. Hofman K. J, Steel G., Kazazian H.H., Valle D. Phenylketonuria in U.S. blacks: Molecular analysis of the phenylalanine hydroxylase gene.// Am. J. Hum. Genet. 1991. V.48. P.791-798.

71. Hommes F.A. On the mechanism of permanent brain dysfunction in hyperphenylalaninemia. // Biochem. Med. Metab. Iol. 1991. V.46. P.277-287.

72. Hommes F.A. The effect of hyperphenylalaninemia on the muscarinic acetylcholine receptor in the HPH-5 mouse brain.// J. Inherited Metab. Dis. 1993. V.16.P.962-974.

73. Hufton S.E., Jennings I.G.,. Cotton R.G.H. Structurer function analysis of the domains required for the multimerisation of phenylalanine hydroxylase.// Biochimica et Biophysica Acta. 1998. V.1382. P.295-304.

74. Iwaki M., Philips R.S., Kaufman S. Proteolytic modification of the amino-terminal and carboxyl-terminal regions of rat hepatic phenylalanine hydroxylase. // J. Biol. Chem. 1986. V.261. P2051-2056.

75. Jaruzelska J., Matuszak R., Lyonnet S., Rey F., Rey J., Filipowiez J., Borski K., Munnich A. Genetic background of clinical heterogeneity of phenylketonuria in Poland.// J. Med. Genet. 1993a. V.30. P.232-234. '

76. Jaruzelska J., Melle D., Matuszak R., Borski K., Munnich A. A new 15 bp deletion in exon II of the phenylalanine hydroxylase gene in phenylketonuria. // Hum. Mol. Genet. 1993b. V.l. P.763-764.

77. Jennings I.G., Kemp BE., Cotton R.G.H. Localization of cofactor binding sites with monoclonal anti-idiotype antibodies: Phenylalanine hydroxylase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.5734-5738.

78. Jennings I., Cotton R. Structural similarities among enzyme pterin binding sites as demonstrated by a monoclonal anti-idiotypic antibody.//J. Biol Chem. 1990. V.265. P. 1885-1889.

79. Jervis G.A. The genetics of phenylpyruvic oligophrenia. (A contribution to the study of the influence of heredity on mental defect. // J. Ment. Sci. (London) 1939. V.85.P.719-762.

80. Jervis G.A., Block R.J., Boilling D., Kanze L. Phenylalanine content of blood and spinal fluid in phenylpyruvic oligophrenia. // J Biol. Chem. 1940. V.134. P105-113.

81. Jervis G.A. Studies on phenylpyruvic oligophrenia. The position of the metabolic error. // J. Biol. Chem. 1947. V.169. P.651-656.

82. Jervis G.A. Phenylpyruvic oligophrenia deficiency oi phenylalanine-oxidizing system. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1953. V.82. P.514-515.

83. Jervis G.A. Phenylpyruvic, oligophrenia (phenylketonuria).// A. Res. Nerv. Ment. Dis. 1954. V.33. P.259-282.

84. John S.W.M., Rozen R., Laframhoise R., Laherge C., Scriver C.R. RFLP haplotypes associated with hyperphenylalaninemia alleles at the phenylalanine hydroxylase (PAH) locus in French-Canadians.// Am. J. Hum. Genet. 1988. V.431. Suppl.l. A216.

85. John S.W.M., Rozen R., Laframboise R., Laberge C., Scriver C.R. Novel PKU mutation on haplotype 2 in French-Canadians.// Am. J. Hum. Genet. 1989. V.45. P.905-909.

86. John S.W.M., Scriver C.R., Laframboise R., Rozen R. In vivo and in vivo correlalions for the I65T and MIY mutation, at the phenylalanine hydroxylase locus.// Hum. Mut. 1992. V.l. P.147-153.

87. Kalanin J., Takarada Y., Kagawa S., Yamashita. K., Ohtsuka N., Matsuoka A. Gypsy phenylketonuria: a point mutation of the phenylalanine hydroxylase gene in gypsy families from Slovakia. //Am. J. Med. Genet. 1994. V.49. P.235-239.

88. Kalaydjieva L, Dworniczak B., Aulehla-Scholz C., Kremensky I., Bronzova J., Eigel A., Horst J. Classical phenylketonuria in Bulgaria; RFLP haplotypes and frequency of the major mutations. // J. Med. Genet. 1990. Y.27. P.742-745.

89. Kalaydjieva L., Dwomiczak B., Aulehla-Scholz C., Devoto M., Romeo G., Sturhmann M., Horst J. Phenylketonuria mutation in southern Europeans.// Lancet. 1991a. V.337. P.865.

90. Kalaydjieva L., Dwomiczak B., Aulehla-Scholz C., Devoto M.,

91. Romeo G., Sturhmann M., Kucinskas V., Yurgelyavicius V., Horst J. Silent mutations in the phenylalanine hydroxylase gene as an aid to the diagnosis of phenylketonuria. //J. Med. Genet. 1991b. V.28. P.686-690.

92. Kalaydjieva L., Dwomiczak, B. Kucinskas V., Yurgeliavicius V., Kunert E., Horst. Geographical distribution gradients of the major PKU mutations and the linked haplotypes.//Hum. Genet. 1991c.V.86. P.411-413.

93. Kamaryt J., Mrskos A., Podhradska D., Kolcova V., Cahalska B., Duczynska N., Borzymowska J. PKU locus:Genetic linkage with human amylase (Amy) loci and assignment to linkage group I. // Hum. Genet. 1978. V.43. P.205-210.

94. Kang E.S., Kaufman S., Gerald P.S. Clinical and biochemical observations of patients with atypical phenylketonuria. //Pediatrics. 1970. V.45. P.83-92.

95. Kaufman S. A new cofactor required for the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine.// J. Biol. Chem. 1958a. Y.230. P.931-939.

96. Kaufman S. Phenylalanine hydroxylation cofactor in phenylketonuria.// Science. 1958b. V.128. P.1506-1508.

97. Kaufman S. Studies on the mechanism of the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine. // J. Biol. Chem. 1959. V.234. P.2677-2682.

98. Kaufman S. The structure of the phenylalanine-hydroxylation cofactor.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. V.50. P.1085-1093.

99. Kaufman S. A protein that stimulutes rat liver phenylalanine hydroxylase. // J. Biol. Chem. 1970. V.245. P.4751-4759.

100. Kaufman S., Holtzman N. A., Milstein S., Butler I.J, Krumholtz A. Phenylketonuria due to a deficiency of dihydropteridine reductase.// N. Engl. J. Med. 1975a. V.293. P.785-790.

101. Kaufman S., Max E. E., Kang E.S. Phenylalanine hydroxylase activity in liver biopsies from hyperphenylalaninemia heterozygotes; deviation from proportionality with gene dosage. // Pediatr. Res. 1975b. V.9. P.632-634.

102. Kaufman S., Berlow S., Summer G. K., Milstein S., Schulman J. D., Orloff S., Spielberg S., Pueschel S. Hyperphenylalaninemia due to a deficiency ofbiopterin. A variant form of phenylketonuria. //N.Engl. J. Med. 1978. V.299. P.673-679.

103. Kaufinan S. A model of human phenylalanine metabolism in normal subjects and in phenylketonuric patients. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.V. 96. P.3160-3164.

104. Kayaalp EE, Treacy E,. Waters PJ, Byck S, Nowacki P, Scriver CR. Human phenylalanine hydroxylase mutations and hyperphenylalaninemia phenotypes:a metanalysis of genotype-phenotype correlations. // Am J Hum Genet. 1997. V.61. P.1309-1317

105. Kerr G.R., Chamove A.S., Harlow H.F., Waisman H.A. 'Fetal PKU': the effect of maternal hyperphenylalaninemia during pregnancy in the rhesus monkey (Macaca mulatta).// Pediatrics. 1968. V.42. P.27-36.

106. Kleiman S., Schwartz G., Woo S.L.C., Shiloh Y. A 22-bp deletion in the phenylalanine hydroxylase gene causing phenylketonuria in an Arab family. // Hum. Mutat. 1992. V.l. P. 344-346.

107. Kleiman S., Li J., Schwartz G., Eisensmith R.C., Woo S.L.C., Shiloh Y. Inactivatton of phenylalanine hydroxylase by a missense mutation, R270S, in a Palestinian kinship with phenylketonuria. // Hum. Mol Genet. 1993. V.2. P.605-606.

108. Kleppe R., Uhlemann K., Knappskog P.M. Urea-induced Denaturation of Human Phenylalanine Hydroxylase.//The Journal of biological chemistry. 1999. V. 274. P. 33251-33258.

109. Koch R., Azen C., Friedman E.G., Williamson M.L. Paired comparisons between early treated PKU children and their matched sibling controls on intelligence and school achievement lest results at eight of age.// J. Inher. Metab. Dis. 1984. Y.7. P.86-90.

110. Konecki D.S., Wang Y., Trefz F., Lichter- Konecki U., Woo SLC. Sructural characterization of 5' Regions ot the human phenylalanine hydroxylase gene.// Biochemistry. 1992. V.31. P.8363-8368.

111. Kuzmin A.I., Eisensmith R.C., Goltsov A.A., Sergeeva N.A., Schwartz E.I., Woo S.L.C. Complete spectrum of PAH mutations in Tataria: presence of Slavic, Turkic and Scandinavian mutations. // Europ J Hum Genet. 1995. V.3. P.246-255.

112. Kwock S.C.M., Ledley F.D., DiLella A.G., Robson K.J.H., Woo. S.LG. Nucleotide sequence of a full-length complementary DNA clone and amino acid sequence of human phenylalanine hydroxylase. // Biochemistry. 1985. V.24. P.556-561.

113. Labrune P., Melle D., Rey F., Berthelon M., Caillaud C, Rey J., Mumiich A., Lyonett S. Single-strand conformation polymorphism of mutations and base substitutions in phenylketonuria. // Am. J. Hum. Genet. 1991. Y.48. P. 11151120.

114. Lazarus R.A., Benkovic S.J., Kaufman S. Phenylalanine hydroxylase stimulator protein is a 4a-carbinolamine dehydratase. // J. Biol. Chem. 1983. V.258. V. 10960-10962.

115. Ledbetter S.A., Ledbetter D.H., Ledley F.D., Woo S.L.C. Localization of phenylalanine hydroxylase (PAH) and alpha-1 antitrypsin (AAT) loci in mouse genome by synteny and in situ hybridization. // Am. J. Hum. Genet. 1987. V.41. A173. (Abstract).

116. Ledley F.D., DiLella A.G., Kwok S.C.M., Woo S.LC. Homology between phenylalanine hydroxylase and tyrosine hydroxylase reveals common structural and functional determinants. // Biochemistry. 1985. V.4. P.3389-3394.

117. Ledley F.D., Levy H.L., Woo S.L.C. Molecular analysis of the inheritance of phenylketonuriaa and mild hyperphenylalaninemia in families with both disordes. //N. Engl. J. Med. 1986. V.314. P.1276-1280.

118. Lenke R.R., Levy H.L. Maternal phenylketonuria and hyperphenylalaninemia: An international survey of the outcome of untreated and treated pregnancies. // N. Engl. J. Med. 1980. V.303. P. 1202-1208.

119. Levy H.L. Phenylketonuria: old disease, new approach to treatment. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. P.1811-1813

120. Li J, Eisensmith R. C., Wang T., Lo W.H.Y., Huang S.-Z., Zeng Y.-T., Yuan L.-F., Liu, S.-R, Woo S.L.C. Identification of three novel missense PKU mutations among Chinese. // Genomics. 1992. V.13. P.894-895.

121. Lichter-Konecki U., Schlotter M., Konecki D. S., Labeit S., Woo S.L.C., Trefz F.K. Linkage disequilibrum between mutation and RFLP haplotype at the phenylalanine hydroxylase locus in the German population. // Hum. Genet. 1988b. V.78. P.347-352.

122. Lichter-Konecki U., Schlotter M., Yaylak C, Ozguk M., Qoskun T, Ozalp I., Wendel U., Batzler U., Trefz F.K and Konecki D. DNA haplotype analysis at the phenylalanine hydroxylase locus in the Turkish population.// Hum. Genet. 1989. V.81. P.373-376.

123. Lidsky AS, Robson K., Thirumalachary C., Barker P., Ruddle F., Woo S.L.C. The PKU locus in man is on chromosome 12. // Am. J. Hum. Genet. 1984. V.36. P.527-533.

124. Lidsky AS., Guttler F., Woo S.L.C. Prenatal diagnosis of classical phenylketonuria by DNA analysis.// Lancet. 1985a. V.l. P. 1549-551.

125. Lidsky AS, Law M.L., Morse H.G., Kao F.T., Woo S.L.C. Regional mapping of the phenylalanine hydroxylase gene and the phenylkelonuria locus in the human genome. // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1985b. V.82. P.6221-6225.

126. Lillevali H., Ounap K., Metspalu A. Phenylalanine hydroxylase gene mutation R408W is present 84% of Estonian phenylketonuria chromosomes.// Eur J Hum Genet. 1996. V.4. P. 296-300/

127. Lin C.-H., Hsiao K.-J., Tsai T.-F., Chao H.-K., Su T.-S. Identification of a missense phenylketonuria mutation at codon 408 in Chinese.// Hum. Genet. 1992. V.89. P.593-596.

128. Liu S.-R., Zuo Q.-H. Newborn screening for phenylketonuria in eleven districts. //ChiMed. J. 1986. V.99. P.113-118

129. Liu T.-J., Kay M.A., Darlington G. J., Woo S.L.C. Reconstitution of enzymatic activity in hepatocytes of phenylalanine hydroxylase-deficient mice.// Somat. Cell. Mol Genel. 1992. V.8. P. 89-96.

130. Liu T.-T., Hsiao K.-J. Identification of a common 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase mutation at codon 87 in Chinese phenylketonuria caused by tetrahydrobiopterin synthesis deficiency.// Hum Genet. 1996. V.98. P.313-316.

131. Lockyer J., Cook R.G., Milstein S., Kaufinan S., Woo S.L.C, Ledley F.D. Structure and expression of human dihydrobiopterine reductase.// Proc. Natl. Acad Sci USA. 1987. V.84. P.3329-3333.

132. Marvit J., DiLella A.G., Brayton K., Ledley F.D., Robson, KJ.H., Woo S.L.C. GT to AT transition at a splice donor site causes skipping of the preceding exon in phenylketonuria. //Nuclear Acids Res. 1987. V.15. P.5613-5628.

133. Matsuo K., Hommes F.A. The development of the muscarinic acetylcholine receptor in normal and hyperphenylalaninemic rat cerebrum. // Neurochem. Res. 1988. V.13. P.867-870.

134. McBurnie M.A., Kronmal R.A., Williamson M., Roche A.F. Physical growth of children treated for phenylketonuria.// Ann. Hum. Biol. 1991. V. 18. P.357-368.

135. McDonald D., Bode V., Dove W., Shedlovsky A. Pahhph5-: A mouse mutant deficient in phenylalanine hydroxylase. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1990. V.87. P.1965-1967.

136. McDonald J.D., Charlton C.K. Characterization of mutations at the mouse phenylalanine hydroxylase locus. // Genomics. 1997. V.39. P402-405.

137. Meijer H., Jongbloed R.J., Hekking M., Spaapen J.M., Geraedts P.M. RFLP haplotyping and mutation analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in Dutch phenylketonuria families. // Hum Genet 1993. V.92. P588-592.

138. Miller SA., Dyckes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. // Nucl Asids Res. 1988. V. 16. P.1215.

139. Mitoma C. Studies on partially purified phenylalanine hydroxylase. // Arch. Biochem. Biophys. 1956. V.60. P.476-484.

140. Mitoma C., Auld R.M., Udenfriend S. On the nature of enzymatic defect in phenylpyruvic oligophrenia. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. V.94. P.634-635.

141. Moller N.E , Meek S., Bigelow M., Andrews J., Nair K.S. The kidney is an important site for in vivo Phenylalanine-to-tyrosine conversion in adult Humans: a metabolic role of the kidney. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. P.1242-1246

142. Morales G, Requena C. M., Jimenez-Ruiz A., Lopez M.C., Ugarte M., Alonso C. Sequence and expression of the Drosophila phenylalanine hydroxylase mRNA. // Gene. 1990. V.93. P.213-219.

143. Murthy L., Berry H.K. Phenylalanine hydroxylase activity in liver from humans and subhuman primates: Its probable absence In kidney.// Biochem. Med. 1975. V12. P.392-397.

144. Nagatsu T., Ichinose H. Comparative studies on the structure of human tyrosine hydroxylase with those of the enzyme of various mammals. // Comp. Biochem. Physiol. 1991. V.98. P.203-210.

145. Nowacki P., Byck S., Prévost L., Scriver C.R. .The PAH mutation analysis consortium database: update 1996. // Nucl Asids Res. 1997. V.25. P. 139-142

146. Okano Y., Wang T, Eisensmith R.C, Guttler F., Woo S.L.C. Reçurent mutation in the human phenylalanine hydroxylase gene. // Am. J. Hum. Genet. 1990a. V.46. P.919-924.

147. Okano Y., Wang T., Eisensmith R. C., Steinmann B., Gitzelmann R., Woo S.L.C. Missense mutations associated with RFLP haplotypes I and 4 of the human phenylalanine hydroxylase gene. // Am. J. Hum. Genet. 1990b. V.4. P. 18-25.

148. Okano Y., Eisensmith R.C., Dasovich M., Wang T., Guttler P., Woo S.L.C. A prevalent missense mutation in Northern Europe associated with hyperphenylalaninemia. //Eur. J. Pediatr. 1991a. V.150. P.347-352.

149. Okano Y., Eisensmith R.C., Guttler F., Lichter-Konecki U., Konecki D., Trefz F.K., Dasovich M., Wang T, Henrikson K., Lou H., Woo S.L.C. Molecular basis of phenotypic heterogeneity in phenylketonuria. // N. Engl. J. Med. 1991b. V.324. P.1232-1238.

150. Okano, Y., Wang, T., Eisensmith R. C., Longi R., Giovannini M, Cerone R., Romano C., Woo S.L.C. Phenylketonuria missense mutations in the Mediterranean. // Genomics. 1991c. V.9.P. 96-103.

151. Okano Y, Hase Y., Lee D.-H., Furuyama J.-I., Shintaku, Oura T., Isshiki G. Frequency and distribution of phenylketonuric mutations in Orientals.// Hum. Mutat. 1992. V.l. P.216-220.

152. Okano Y., Hase Y„ Lee D.-H., Takada G, Shigematsu Y, Oura T, Isshiki G. Molecular and population genetics of phenylketonuria in Orientals: Correlation between phenotype and genotype. // J. Inher. Metab Dis. 1994a. V.17. P.156-159.

153. Okano Y., Asada M., Kang Y. Molecular characterization of phenylketonuria in Japanese patients. // Hum. Genet. 1998. V.103. P.613-618.

154. Orkin S. H., Kazazian H.H. The mutation and polymorphism of the human b-globin gene and its surrounding DNA. // Annu. Rev. Genet. 1984. V. 18. P. 131171.

155. Ozalp L., Coskun T, Ceyhan M., Tokol S., Oran O., Erdem G., Tekinalp O., Durmus Z., Tarikahya Y. Incidence of phenylketonuria and hyperphenylalaninemia in a sample of the newborn population. //J. Inher. Metab. Dis. 1986. V.9. P.237-239.

156. Park Y.S., Seoung C.S., Lee S.W., Oh K., Lee D.H., Yim J. Identification of three novel mutations in Korean Phenylketonuria patients: R53H, N207D, Y325X. // Human Mutation. 1997. Mutation in brief.

157. Paul T.D., Brandt I.K., Elsas, L.J., Jackson C.E., Nance C.S., Nance W.E. Linkage analysis using heterozygote detection in phenylketonuria.// Clin Genet. 1979a. V. 16. P.217-232.

158. Penrose L.S., Quastel J.H. Metabolic studies in phenylketonuria. // Biochem. J. 1937. V.31.P 266-274.

159. Perez B., Desviat L.R., Ugarte M. Analysis of Phenylalanine Hydroxylase gene in the Spanish population: Mutation profile and Association with Intragenic polymorphic markers. // Am. J. Hum. Genet. 1997. V.60. P.95-102.

160. Perez B. Effect of the S349L PKU mutation on the folding, stability, and activity of the PAH protein. //Eur. J. Hum. Genet. 1998. V.6. P. 167. Suppl 1

161. Perez B, Desviat L.R., De Lucca M., Cornejo V., Raimann E., Ugarte M. Molecular Characterization Of Phenylalanine Hydroxylase Deficiency In Chile. II Human mutation. Mutation in Brief. 1999. 243.

162. Pietz J., Kreis R, Rupp A., Mayatepek E., Rating D., Boesch C., Bremer H.J. Large neutral amino acids block phenylalanine transport into brain tissue in patients with phenylketonuria. // J. Clin. Invest. 1999. V103. P.l 169-1178.

163. Pigeon D., Ferrara P., Gros F., Thibault J. Rat pheochromocytoma tyrosine hydroxylase is phosphorylated on serine 40 by an associated protein kinase. // J. Biol. Chem. 1987. V.262. P.6155-6158.

164. Pontoglio M., Faust D.M., Weiss M.C. Hepatocyte Nuclear Factor la Gene Inactivation Impairs Chromatin Remodeling and Demethylation of the Phenylalanine Hydroxylase Gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.491^495

165. Ramus S., Forrest S.M., Saleeba J.A., Cotton R.G.H. CpG hotspot causes second mutation in codon 408 of the phenylalanine hydioxylase gene.// Hum. Genet. 1992. V.90. P.147-148.

166. Riess O., Michael A., Speer A., Meiske W., Cobet G., Coutelle C. Linkage disequilibrium between RFLP haplotype 2 and the affected PAH allele in PKU families from the Berlin area of the German Democratic Republic. // Hum. Genet. 1988. V.78. P.343-346.

167. Robson K.J.H., Chandra T., MacGillivray R.T.A., Woo S.L.C. Polysome immunoprecipitation of phenylalanine hydroxylase mRNA from rat liver and cloning of its cDNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V.79. P4701-4705.

168. Rosenblatt D., Scriver C.R. Heterogeneity in genetic control of phenylalanine metabolism in man. // Nature. 1968. V.218. P.677-679.

169. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. // Nucl Acids Res. 1989. V.17 P.8543.

170. Sambrook J., Fritsch F.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

171. Sarkar G., Sommer S. Access to a messenger RNA sequence of its protein product is not limited by tissue or species specificity. // Science. 1989. V.244. P.331-334.

172. Saugstad L.F. Increased "reproductive casualty" in heterozygotes for phenylketonura. // Clin. Genet. 1973. V.4. P.105-114.

173. Saugstad L.F. Heterozygote advantage for the phenylketonuria allel. // J. Med. Genet. 1977. V.14. P. 20-24.

174. Scriver C.R., Kaufman S., Woo S.L.C. Mendelian hyperphenylalanineinia. // Annu. Rev. Genet. 1988. V.22. P.301-321.

175. Scriver C.R., John S.W.M., Rozen, R., Eisensmith R., Woo S.L.C. Associations between populations. PKU mutations and RFLP haplotypes at the PAH locus: An overview. // Dev. Brain Dys. 1993. V.6. P.l 1-25.

176. Scriver CR, Kaufinan S, Eisensmith RC, Woo SLC. The hyperphenylalaninaemia. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds)

177. The methabolic and molecular bases of inherited disease, 1995. Vol 1, 7th edn. McGraw-Hill, New York, pp 1015-1077.

178. Scriver R. An Ongoing Debate Over Phenylalanine Hydroxylase Deficiency in Phenylketonuria. // J. Clin. Invest. 1998. V.101. P.2613-2614

179. Scriver C.R. Monogenic traits are not simple. Lessons from phenylketonuria.// TIG. 1999. V.15. P.267-272.

180. Shirahase W., Oya N., Shimada M. A new single base substitution in a Japanese phenulketonuria (PKU) patient.// Brain Dev. 1991. V. 13. P.283-284.

181. Smith S.C., Kemp B. E., McAdam W. J., Mercer J.E.B., Cotton R.G. Two apparent molecular weight forms of human and monkey phenylalanine hydroxylase are due to phosphorylation // J. Biol. Chem. 1984. V.259. P.l 128411289.

182. Smooker P.M., Cotton R.G.H. Molecular basis of dihydrobiopteridine reductase deficiency. // Hum Mut. 1995. Y.5. P.279-284.

183. Stoll J., Goldman D. Isolation and structural characterization of the murine tryptophan hydroxylase gene. // J. Neurosci. Res. 1991. Y.28. P.457-465.

184. Stuhrmann M., Riess 0., Monch E., Kurdoglu G. Haplotype analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in Turkish phenylketonuria families. // Clin. Genet. 1989. V.36. P.l 17-121.

185. Sullivan S.L, Lidsky A.S., Brayton K., DiLella A.G., King M., Connor M., Cockburn F., Woo S.L.C. Phenylalanine hydroxylase deletion mutant from a patient with classical PKU. // Am. J. Hum. Genet. 1985. V.37. A177.

186. Svensson E., von Dobeln U, Hagenfeldt L. Polymorphic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxylase locus and their relation to phenotype in Swedish phenylketonuria // Hum. Genet. 1991. V.87. P.l 1-17.

187. Svensson E., Eisensmith R.C., Dworniczak B., von Dobeln U., Hagenfeldt L., Horst J., Woo S.L.C. Two missense mutations causing hyperphenylalaninemia associated with DNA haplotype 12. //Hum. Mutat. 1992. V.l. P.129-137.

188. Svensson E., von Dobeln U., Eisensmith R.C., Hagenfeldt L., Woo. S.L.C. Relation between genotype and phenotype in Swedishi phenylketonuria and hyperphenylalaninemiapatients. //Eur. J. Ped. 1993a. V.152. P. 132-139

189. Svensson E., Wang Y., Eisensmith R., Hagenfeldt L., Woo S.L.C. Three polymorphisms but no disease-causing mutations in the proximal part of the promoter of the phenylalanine hydroxylase gene. // Eur. J. Hum. Gen. 1993b. V.l. P.306-313.

190. Syvanen A.-C., Landegren U., Isaksson A., Brookes U.G.A. Enthusiasm mixed with scepticism about single-nucleotide polymorphism markers for dissecting complex disorders. // European Journal of Human Genetics. 1999. V.7. P.98-101

191. Takahashi K., Kure S., Matsubara Y., Narisawa K. Novel phenylketonuria mutation detected by analysis of ectopically transcribed phenylalanine hydroxylase mRNA from lymphoblast. // Lancet. 1992. V.340. P. 1473.

192. Takarada Y., Yamashita K., Ohtsuka N., Kagawa S., Matsuoka A. Novel mutation in exon 7 of the phenylalanine hydroxylase gene in a Chinese patient with phenylketonuria. // Clin. Chem. 1993c. V.39. P.2357.

193. Thompson A. J., Tillotson S., Smith I., Kendall B., Moore S.G., Brenton D.P. Brain MRI changes in phenylketonuria: associations with dietary status.// Brain. 1993. V.l 16. P.811-821.

194. Traiger-Synodinos J., Kanavakis E., Kalogerakou M. Preliminary mutation analysis in the phenylalanine hydroxylase gene in Greek PKU and HPA patients. //Hum. Genet. 1994. V.94. P.573-575.

195. Treacy E, Byck S., Clow C., and Scriver C.R. "Celtic" phenylketonuria chromosomes found? Evidence in two regions of Quebec province. // Eur. J. Hum. Genet. 1993. V.22. P.220-228.

196. Trefz F.K., Bartholome K., Bickel H., Lutz P., Schmidt H., Seyberth H.W. In vitro residual activities of the phenylalanine hydroxylation system in phenylketonuria and variants. // J. Inher. Metab. Dis. 1981. V.4. P.101-102.

197. Trefz F.K., Lichter-Konecki U., Konecki D.S., Schlotter M., Bickel H. PKU and non-PKU hyperphenylalaninemia: Differentiation, indication for therapy and therapeutic results. // Acta Paediatr. Jpn. 1988. V.30. P.397-404.

198. Trefz F.K., Yoshino M., Nishiyori A., Aengeneyndt F., Schmidt-Mader B., Lichter-Konecki U., Konecki, D.S. RFLP pattern in Japanese PKU families: New polymorphisms for mutant phenylalanine hydroxylase gene.// Hum. Genet. 1990. V.85. P. 121-122.

199. Tsai T.-F., Hsiao K.-J., Su T.-S. Phenylketonuria mutation in Chinese haplotype 44 identical with haplotype 2 mutation in northern-Eiropean caucasian. // Hum. Genet. 1990. V.84. P.409-411.

200. Tyfield L.A., Osborn M.J., Holton B. Molecular heterogeneity at the phenylalanine hydroxylase Ioicus in the population of th south-west of England. //J. Med. Genet. 1991. V.28. P.244-247.

201. Tyfield L.A., Osborn M.J., King S.K., Jones M.M., Holton J. B. Molecular basis of phenylketonuria at English population// Dev. Brain Res. 1993. V.6. P.60-67.

202. Tyfield L.A., Stephenson A, Cockburn F, Harvie A, Bidwell J.L., Wood N.A., Pilz D.T., Harper P., Smith I. Sequence variation at the phenylalanine hydroxylase gene in the British Isles. // American Journal of Human Genetics. 1997. V.60. P.388-96.

203. Udenfriend S., Cooper J.R. The enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine.//J. Biol. Chem. 1952. V.194. P.503-511.

204. Verelst P., Francois B., Cassiman J.J., Raus J. Heterogeneity of phenylketonuria in Belgium. //Dev. Brain Dys. 1993. V.6. P.97-108.

205. Wang T, Okano Y., Eisensmith R.C., Lo W.H.Y., Huang S. -Z., Zeng Y.T., Liu S-R., Woo S.L.C. Missense mutationns prevalent in Orientals with phenylketonuria: Molecular characterization and clinical implications.// Genomics. 1991b. V.10. P.449-456.

206. Wang T., Okano Y., Eisensmith RC., Lo W.H.Y., Huang S.-Z., Zeng Y.-T., Woo S.L.C. Identification of a novel PKU mutation in Chinese; Further evidence for multiple origins of PKU in Asia. // Am. J. Hum. Genet. 1991c. V.48. P.628-630.

207. Wedemeyer N., Dworniczak B., Horst. PCR detection of the Mspl (Aa) RFLP at the human phenylalanine hydroxylase (PAH) locus.// Nucl. Acids Res. 1991. V.19. P.1959.

208. Woo S.L.C., Lidsky A.S., Guttler F., Chanda T, Robson K.J.H. Cloned human phenylatanine hydroxylase gene allows prenatal diagnosis and carrier detection of classical phenylketonuria. //Nature. 1983. V.306. P.151-155.

209. Woo S.L.C. Molecular basis and population genetics of phenylketonuria. Biochemistry. 1989. V.28. P. 1-7.

210. Woolf L.I., Vulliamy D.G. Phenylketonuria with a study of lhe effect upon it of glutamic acid. // Arch. Dis. Child. 1951. V.26. P.487-494.

211. Woolf L.I., Griffiths R., Moncrieff A. Treatment of phenylketonuria with a diet low in phenylalanine. // Br. Med. J. 1955. Y.l. P.57-64.

212. Woolf L.I., McBea M.S., Woolf F.M., Calahane S.F. Phenylketonuria as a balanced polymorphism: The nature of the heterozygote advantage.// Am J. Hum. Genet. 1975. V.38. P.461-469.

213. Woolf L.I. The heterozygote advantage in phenylketonuria. // Am. J. Hum. Genet. Letter. 1986. V.38. P.773-775.

214. Zschocke J., Hoffmann G.F. Phenylketonuria mutations in Germany. // Hum. Genet. 1999. V.104. P.390-398.

215. Zygulska M., Eigel A., Aulehla-Scholz C.P, Horst J. Molecular analysis of PKU haplotypes in the population of southern Poland. // Hum. Genet. 1991.V.86. P.292-294.

216. Барановская C.C., Шевцов С.П., Максимова С.П., Кузьмин А.И., Шварц Е.И. Спектр мутационных повреждений гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией г. Санкт-Петербурга. // Доклады Академии наук. 1995. Т.340. №5. С.709-711.

217. Викторова Т.В., Мурзабаева С.С., Карунас А.Ю., Магжанов Р.В., Хуснутдинова Е.К. Молекулярно- генетический анализ фенилкетонурии в башкирии. //Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №7. С.992-5.

218. Гилберт С. Биология развития в 3 томах. Т.2. М. Мир. 1994. 235С

219. Иващенко Т.Э., Белова Е.Г., Баранов B.C. Простой и надежный метод детекции мутации R408W 12-го экзона гена фенилаланингидроксилазы в молекулярной диагностике фенилкетонурии. // Генетика. 1993. Т.29. № 5. С.862-865.

220. Морозов И.В. Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы. // Дис канд. биол. наук. Н: Новосибирский Институт Биоорганической Химии, 1998, с 126.