Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России

Бреннер, Евгений Владиславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России"

На правах рукописи

Бреннер Евгений Владиславович

□0347135Э

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ В РЕГИОНАХ РОССИИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 70п3

Новосибирск, 2009 г.

003471359

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского Отделения РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук Морозов И.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Белявская В.А.

доктор биологических наук, профессор Гуляева Л.Ф.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского Отделения РАН

Защита состоится " 26 " июня 2009 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Федеральном государственном учреждении науки Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан "_мая 2009 г.

Ученый секретарь у

диссертационного совета Карпенко Л.И.

Актуальность проблемы. Фенилкетонурия (ФКУ) является одним из распространенных наследственных заболеваний человека. Разнообразие форм этой болезни обусловлено большим количеством обуславливающих его мутаций. Известно более 500 мутаций гена фенилаланингидроксилазы (ФАТ), приводящих к ФКУ.

Спектры мутаций и нейтральных полиморфизмов ФАГ значительно различаются в разных регионах мира, что, по всей видимости, отражает особенности формирования этих популяций и различное влияние в них факторов естественного отбора. Для того чтобы более точно определить происхождение и клинические последствия той или иной мутации, необходимо как можно более полно охарактеризовать носителей этой мутации в каждой популяции.

Успешность всех подходов к лечению фенилкетонурии полностью определяется своевременностью её диагностики и возможностью получить сведения о типе мутаций, обуславливающих каждый конкретный случай заболевания. Чем раньше происходит диагностика болезни, тем лучше прогноз её терапии. Оптимальной является пренатальная диагностика фенилкетонурии.

Целью настоящей работы являлось исследование спектра мутаций, ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае, а также исследование ассоциации этих мутаций с гаплотипами ФАГ. В цели работы также входила разработка простых и достоверных методов идентификации обуславливающих ФКУ мутаций, в т.ч. пренатально.

Задачами работы являлись:

• Идентификация мутаций гена ФАГ у больных ФКУ и их родственников из указанных регионов России гипотезонезависимыми методами, позволяющими детектировать все, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.

• Разработка на основе фрагментного анализа продуктов ПЦР автоматизированного массового метода идентификации аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ.

• Исследование сцепления идентифицированных мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что при сравнении с аналогичными данными для других стран и регионов позволило судить о механизмах формирования наблюдаемого спектра мутаций.

• Разработка простого и достоверного метода пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем контаминации плодного биоматериала.

• Разработка простого универсального метода детекции точечных мутаций на основе аллель-специфичной ПЦР.

Научная новизна работы.

Исследован спектр мутаций ФАГ обуславливающих ФКУ в Саратовской области, Алтайском крае и ряде регионов Западной Сибири (Новосибирская, Кемеровская области). Впервые для регионов России идентификация обуславливающих ФКУ мутаций производилась гипотезонезависимым методом -определением нуклеотидных последовательностей районов ФАГ.

Впервые проведено систематическое исследование сцепления всего спектра мутаций ФАГ в указанных регионах России с гаплотипами этого гена, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и возможности возникновения идентифицированных мутаций в исследованных регионах России de novo.

Впервые показано независимое повторное возникновение обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H ФАГ.

Впервые показана возможность использования конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР для обеспечения дискриминации аллельных вариантов по наблюдаемой задержке при гель-электрофорезе продуктов ПЦР.

Практическая значимость работы. Идентифицированы генотипы больных ФКУ по локусу ФАГ в 71 семьях Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края. Полученные результаты предоставлены врачам местных медико-генетических консультаций и перинатальных центров для контроля правильности выбранной терапии этих случаев ФКУ.

Разработаны методические рекомендации для выполнения фрагментного анализа на автоматических генных анализаторах с использованием реактивов отечественного производства. Метод внедрён на базе Центра коллективного пользования СО РАН «Секвенирование ДНК».

Разработан скрининговый метод идентификации точковых мутаций, основанный на использовании конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР.

Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты. Осуществлена пренатальная диагностика ФКУ в двух семьях, в которых ранее были зарегистрировано заболевание.

Основные положения, выносимые на защиту.

Спектр мутаций ФАГ, обуславливающих ФКУ и ГФА в Западной Сибири и Саратовской области типичен для регионов России с преимущественно славянским населением.

Мутация У168Н ФАГ возникла повторно и независимо в разных популяциях.

Использование конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в реакции аллель-специфичной ПЦР не снижает её эффективность и специфичность и позволяет надёжно дискриминировать разные аллельные варианты по подвижности продукта ПЦР при форезе.

Комбинация секвенирования и фрагментного анализа STR и VNTR ФАГ позволяет осуществлять надёжную пренатальную диагностику ФКУ.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации сделано 6 публикаций. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «3-я Международная конференция «Фундаментальные науки -медицине» (Новосибирск, 2007 г.), «Фундаментальные науки -биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006 г.), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005 г.), International Conference "New information technology in medicine, biology, pharmacology and ecology" (Ялта-Гурзуф, 2003 г.),

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав, выводов списка литературы, иллюстрирована 22 рисунками, 9 таблицами. В списке литературы приведено 161 работа отечественных и зарубежных авторов. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Исследовался генетический материал, выделенный из крови больных и членов их семей с ранее поставленным диагнозом ФКУ, а также пациентов с диагнозом «Гиперфенилаланинемия» (ГФА). Также, когда это было возможно, в исследование включались их ближайшие родственники. Анализируемая выборка составила 256 человек из

71 неродственной семьи, в которых были зафиксированы случаи фенилкетонурии или гиперфенилаланинемии по результатам клинических биохимических тестов. Постановка диагнозов и забор крови осуществлялись врачами Барнаульского, Кемеровского и Новосибирского перинатальных центров. Все обследованные проживают на территории Новосибирской, Кемеровской, Саратовской области или Алтайского края. Проведение всего цикла работ было одобрено локальным комитетом по медицинской этике ИХБФМ СО РАН (протокол №4 заседания Этического комитета Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН от 16 июля 2007 года).

Выделение генетического материала производили стандартным методом с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.

Идентификацию обуславливающих ФКУ мутаций производили методом определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответсвующих экзонам и участкам интронов ФАГ с использованием автоматических генных анализаторов ABI 310, ABI 3100 Avant, ABI 3130x1.

Идентификацию аллелей STR и VNTR ФАГ осуществляли методом фрагментного анализа в денатурирующих условиях на автоматических генных анализаторах ABI 3100 Avant и ABI 3130x1 с использованием флуоресцентно меченого праймера.

Результаты и обсуждение

Спектр мутаций ФАГ у больных ФКУ и ГФА Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края.

В ходе работы была идентифицированы нуклеотидные последовательности всех 13 экзонов с прилегающими участками интронов 142 аллелей ФАГ больных ФКУ и ГФА Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и

Алтайского края. Мутации ФАГ были идентифицированы в 111 аллелях. В таблице 1 произведено сопоставление диагнозов с числом выявленных мутаций.

Значительное число случаев ГФА (3 из 6 наблюдаемых нами случаев) не обусловлены мутациями в обоих аллелях в структурных участках ФАГ. 19 случаев ФКУ, при которых была выявлена единственная мутация ФАГ, возможно вызваны мутациями регуляторной части гена (не исследовавшейся в данной работе), либо являются ГФА. К этой же группе можно отнести 3 случая с неподтверждённым диагнозом ФКУ.

Таблица 1. Сопоставление числа идентифицированных мутаций ФАГ и

диагнозов в семьях больных ФКУ и ГФА.

Выявлены Выявлена мутация Не выявлено

мутации в обоих в одном аллеле мутаций

Диагноз аллелях аллелях аллелях

(количество (количество (количество

случаев) случаев) случаев)

ФКУ 42 19 0

ФКУ?" 0 3 0

ГФА 1 2 3

Прочее" 0 1 0

* - Неподтверждённый диагноз: невыраженные клинические признаки при отсутствии лечения, транзиторное повышение уровня фенилаланина в крови. ** - здоровая сестра матери больного ФКУ ребёнка

В остальных 111 аллелях ФАГ было идентифицировано 20 различных типов мутаций. Спектр и частота этих мутаций в исследованных регионах РФ приведены в таблице 2.

Наиболее частой причиной исследованных случаев ФКУ является мутация экзона 12 ФАГ R408W. Эта мутация наиболее распространена в двух географических районах: СевероЗападной Европе, с самой высокой частотой в Ирландии (где она сцеплена с УМТЯ8 ФАГ), и Восточной Европе, с самой высокой частотой в прибалтийских республиках (где она сцеплена с УШИЗ ФАГ). По литературным данным превалирование

мутации Л408\У характерно и для регионов РФ с преимущественно славянским населением.

Таблица 2. Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской (НСО), Кемеровской (Кем. обл.), Саратовской (Сар. обл.) областях и Алтайском крае (Алт. Кр.). З.С. -Западная Сибирь_

№ мутация НСО N=54 Кем. Обл. N=52 Алт. Кр. N=6 3. с. N=112 Сар. обл. N=30 ВСЕГО N=142

1 1Ув2пМ31-^ 0 0 2 2 0 2

2 1У52пП91->с 1 0 0 1 0 1

3 Ь488 1 0 0 1 1 2

4 Н688 0 1 0 1 0 1

5 Ш580 1 1 0 2 1 3

б У168Н 0 1 0 1 0 1

7 Е22Ш222Г$(1е1 Ав 0 0 0 0 1 1

8 112430 0 2 0 2 0 2

9 К243Х 2 1 0 3 0 3

10 Л2610 4 2 0 6 0 6

И Р281Ь 2 1 0 3 3 6

12 ГУ87п^—>а 0 0 1 1 0 1

13 ПВДОп^Щ- >а 1 0 0 1 1 2

14 У386С 0 1 0 1 0 1

15 Е390С 1 0 0 1 0 1

16 А403У 1 0 0 1 0 1

17 Р407Ь 1 0 0 1 0 1

18 R408W 27 26 1 54 17 71

29 У414С 2 1 0 3 0 3

№ мутация нсо N=54 Кем. Обл. N=52 Алт. Кр. N=6 З.С. N=112 Сар. обл. N=30 ВСЕГО N=142

20 IVS12nt+lg->a 0 1 0 1 1 2

21 X 10 14 2 26 5 31

Второй, более редкой по частоте причиной исследованных случаев ФКУ, являются мутации экзона 7 гена ФАГ. Так, мутация R261Q была идентифицирована в 6 обуславливающих ФКУ аллелях ФАГ. R261Q имеет наибольшую частоту в Швейцарии и Турции, и, возможно, возникла независимо в разных регионах Европы. Мутация P281L также была идентифицирована в 6 обуславливающих ФКУ аллелях ФАГ. Она распространена в Южной Европе. Предположительным местом происхождения мутации считают Средиземноморье, а наиболее распространена эта мутация по литературным данным в Хорватии и Греции.

Обнаруженная в двух случаях мутация R243Q является одной из самых распространенных мутаций в странах Азии (Китае, Японии, Корее) с самой высокой частотой (18%) в Китае. Идентификация этой мутации в нашем регионе, по-видимому, свидетельствует о вкладе аллелей азиатских популяций в распространение ФКУ в регионе. Мутация была идентифицирована в гомозиготном состоянии у больного ФКУ -выходца из Узбекистана.

В то же время нами был идентифицирован ряд мутаций гена ФАГ, не являющихся характерными ни для европейских, ни для азиатских стран. Так мутации сайтов сплайсинга IVS2-13T>G и IVS2+19T>C встречаются у больных ФКУ европейских популяций с частотой, не превышающей 1%.

В ходе работы нами также были идентифицированы мутации, описанные ранее лишь в единичных случаях. База знаний о фенилкетонурии www.pahdb.mcgill.ca содержит единственную запись об идентификации у больного ФКУ мутации экзона 12 ФАГ P407L. Однако нет никаких сведений ни

о стране, в которой эта мутация была описана, ни об этнической принадлежности этого больного ФКУ. Мутация У168Н, идентифицированная нами у больного ФКУ из Западной Сибири, также до этого была описана лишь единожды - у больного ФКУ из Каталонии (Испания).

Таким образом, в ходе настоящей работы нами был определён спектр обуславливающих ФКУ и ГФА мутаций ФАГ в Саратовской области и ряде регионов Западной Сибири. Всего было идентифицировано 20 обуславливающих ФКУ типов мутаций ФАГ в 111 аллеле этого гена. Было показано, что на формирование спектра обуславливающих в Западной Сибири и Саратовской области ФКУ мутаций в значительной мере оказали влияние потоки генов из Восточной Европы (Я408Ш, Н252\¥), Скандинавии (ГУБ12пН, У414С), Западной Европы (Е280К, Ш58С>), Южной Европы (Р281), Турции (11261(2), и, в значительно меньшей степени поток генов из Азии (11243(2). Также у больных ФКУ из Западной Сибири и Саратовской области был идентифицирован ряд мутаций гена ФАГ, не являющихся характерными ни для европейских, ни для азиатских стран (1У82-13Т>0, 1У82+19Т>С), наряду с уникальными мутациями, описанными в мировой литературе в единичных случаях (Р407Ь, У168Н).

Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями, обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области.

Дополнение исследования спектра мутаций идентификацией сцепленных с этими мутациями гаплотипов исследуемого локуса позволяет со значительно большей уверенностью судить о механизмах формирования наблюдаемого спектра мутаций. «Золотым стандартом» гагаготипирования ФАГ стало определение аллельных вариантов БТЯ и УШИ повторов этого гена.

В рамках настоящей работы нами впервые производилась широкомасштабная и систематическая

идентификация аллельных вариантов STR и VNTR ФАГ, сцепленных с ранее идентифицированными мутациями этого гена у больных ФКУ из ряда регионов Сибири и Саратовской области. Особенности формирования населения Сибири в последние несколько столетий позволяют рассчитывать на идентификацию в этом регионе закономерностей, характерных как для Европы, так и для азиатских популяций. Включение в это исследование жителей Саратовской области было обосновано скудностью доступных данных об ассоциации мутаций и гаплотипов гена ФАГ ц,ля Европейской части России.

Для идентификации сцепления аллельного варианта нейтрального маркера с обуславливающей ФКУ мутацией необходимо производить семейный анализ и прослеживать передачу по наследству как мутации, так и аллельного варианта нейтрального маркера. Поэтому группа больных ФКУ и их родственников, участвовавших в этой части исследования, была сокращена по сравнению с группой, участвовавшей в идентификации обуславливающих ФКУ мутаций. Так из неё были исключены больные ФКУ - воспитанники детских домов и члены неполных семей.

Идентификация аллельных вариантов STR и VNTR ФАГ производилась методом фрагментного анализа с использованием генных анализаторов ABI 310 и ABI 3100 Avant (Applied BioSystems, USA). Было апробировано несколько модификаций этого метода: варьировались тип полимера, флуорофоры, метод их введения в продукт ПЦР, последовательности праймеров и температурный профиль ПЦР. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании капиллярного электрофореза продуктов ПЦР с флуоресцентно-меченным праймером в денатурирующих условиях. Последовательности праймеров и условия ПЦР были оптимизированы для минимизации «проскальзывания» полимеразы. Эта модификация метода и была использована в дальнейшем (рисунок 1).

Рисунок 1 Типичный пример идентификации вариантов БТЯ и УШИ повторов гена ФАГ в семье больного ФКУ методом фрагментного анализа на автоматическом генном анализаторе

В таблице 3 приведены полученные данные об ассоциации мутаций ФАГ в исследованных случаях ФКУ с аллельными вариантами БТЯ и УИТЯ этого гена.

Таблица 3. Ассоциация идентифицированных мутаций ФАГ с

№ Мутация БТЯ укта Количество аллелей

1 МВБ 234 3 1

2 Я688 238/246* 3 1

3 1*1580 234 3 1

238 3 1

4 У168Н 234 3 1

5 Е22Ю222кйе\АО 242 3 1

б Я243С> 238 3 2

238 3 2

7 К2б1д 238 8 1

242 8 1

Р28а 242 7 2

242 8 1

9 1У810пМ1§->а 246 8 1

10 Е390С 238 3 1

11 Р4071. 238 3 1

238 3 51

12 Я408\У 242 3 4

230 7 1

13 У414С 238 3 1

14 242 8 1

♦ _

Неразрешимый семейным анализом случай

Мутация 11408^^ - наиболее распространённая у исследованных больных ФКУ - оказалась ассоциированной с

УЫТЮ в 55 из 56 исследованных случаях. Этот факт хорошо согласуется с общепринятой гипотезой о рекуррентном возникновении этой мутации на территории Ирландии и Восточной Европы и распространении восточно-европейского варианта по территории России. Ассоциация в 51 случаях этой мутации также с единственным вариантом 8ТЯ238 более изменчивого БТЯ локуса ФАГ, также хорошо согласуется с литературными данными и, возможно, является свидетельством того, что рекуррентное возникновение Я408Ш произошло на территории Восточной Европы относительно недавно.

В одном из 56 исследованных случаев носительства мутации 11408^^ мы наблюдали её ассоциацию с вариантом ¥N1117 гена ФАГ, что абсолютно нетипично ни для Западной Европы (где она преимущественно ассоциирована с УЫТК8), ни для Восточной Европы (где она преимущественно ассоциирована с УИТЮ).

Наблюдаемая в нашей работе ассоциация мутации 11261<3 с УШИЗ и УЫТ{18 примерно в равных пропорциях характерна для российских популяций в частности и для европейских в целом. Также типичными для европейских популяций были наблюдаемые в нашей работе ассоциации с \fNTR и БТЯ повторами гена ФАГ мутаций Ь488, Я1580, Е22Ш222Ые1АС, Р281Ц 1У810пМ^->а, Е39(Ю, У414С, 1У812ги+1ё->а.

В тоже время в литературе не описаны ассоциации 11688 и 11243(2 с УИТЮ.

Таким образом, в настоящей работе впервые для значительных групп больных ФКУ ряда регионов Сибири и Саратовской области была исследована ассоциация обуславливающих ФКУ мутаций и аллельных вариантов БТЯ и \TNTR повторов ФАГ. Для большинства исследованных случаев была получена картина типичная для других регионов России с преимущественно славянским населением. В тоже время несколько случаев мутаций ФАГ у больных ФКУ в Западной Сибири оказались ассоциированными с нетипичными

аллельными вариантами БТЯ и УЬГГ11 повторов, что мы интерпретируем как свидетельство возможного независимого повторного (рекуррентного) возникновения этих мутаций.

Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы У168Н.

В ходе исследования спектра обуславливающих ФКУ мутаций ФАГ в Западной Сибири нами была идентифицирована мутация У168Н ФАГ. Ранее в литературе был описан лишь единственный случай этой мутации у больного ФКУ из Каталонии.

Носители У168Н из Испании

Рисунок 2. Семьи - носители мутации У168Н ФАГ

Географическая удалённость этих двух регионов, а также первичное изучение генеалогической информации о семьях

носителей мутации позволило предположить независимое рекуррентное возникновение мутации У168Н гена ФАГ в России. На рисунке 2 приведены генеалогические деревья обеих семей.

Для исследования этой гипотезы нами были идентифицированы гаплотипы ФАГ, сцепленные с каждым случаем У168Н. Был выбран следующий ряд нейтральных полиморфизмов гена ФАГ: ГУБЗп^Т, (¿232(1, У245У, Ь385Ь, БТЯ, УЬГП1. Эта система гаплотипов является модификацией одной из самых информативных из описанных в литературе.

В таблице 4 сведены данные об использованных полиморфных маркерах, их локализации, расстоянии до У168Н в т.п.н. и единицах неравновесия по сцеплению (1Л)и), а также об их аллельных состояниях, сцепленных с каждым из исследуемых случаев мутации У168Н.

Таблица 4. Гаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с обоими известными случаями мутации У168Н этого гена. Жирным шрифтом выделены

Название Локализация Расстояние до Аллельный Аллельный

маркера маркера У168Н (в вариант, вариант,

единицах сцепленный сцепленный

неравновесия по с У168Н в с У16ВН в

сцеплению - Каталонии Западной

1Л)и) Сибири

интрон 3 1,64 238 234

1У83пЬ22Т интронЗ 0,02 Т Т

(3232(3 экзон 6 0,006 й в

У245У экзон 7 0,006 в А

Ь385Ь экзон 11 0,3 А С

УИТИ интрон 13 0,36 (а1)5-Ь5-Ь2- а2-Ь2-с1

с1

Оказалось, что У168Н ассоциирована с гаплотипом ГУ83п1-22Т 0), 0232(} (§), У245У(ё), Ь385Ца), 8ТК238, УЪГП1((а1)5-Ь5-Ь2-с1) в каталонской семье и с гаплотипом 1УвЗп1;-22Т(9, (}232(1№, У245У(а), Ь385Ц§), 8Т11234, УЪГГК(а2-Ь2-с1) в семье из Сибири. Эти гаплотипы различаются аллельными вариантами полиморфизмов, лежащих как в 5'

направлении (8ТЛ), так и в 3' направлении (У245У, Ь385Ь и УШИ) от У168Н.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что рекомбинация не может являться причиной сцепления У168Н с разными аллельными вариантами У245У, Ь385Ь и УЫТЯ повторов ФАГ в реалистичном (порядка тысяч) числе поколений. Оба идентифицированных гаплотипа - У245У (§), (^2320 (§), Ь385Ца) и У245У (а), 0>232<3 (в), Ь385Цб) -являются широко распространёнными в европейских популяциях. Также широко распространены

идентифицированные по нуклеотидной последовательности варианты УШИ повторов. Отсутствие наблюдений ассоциации этой мутации с другими гаплотипами, которые могли бы являться предковыми или, наоборот, последующими вариантами гаплотипов, идентифицированных нами, позволяет сделать вывод, что мутация У168Н, как минимум, дважды возникла независимо.

Мутации ФАГ, в отношении которых показано рекуррентное возникновение, как правило, являются широко распространенными в одной или нескольких популяциях и затрагивают Срв динуклеотиды. Именно гипермутабильностью Срв динуклеотидов обычно объясняют факт неоднократного возникновения этих мутаций. В случае мутации У168Н оба этих утверждения неверны: она не затрагивает Срв динуклеотид и известно только два её случая. Низкая частота У168Н (только 2 описанных случая) косвенно свидетельствует о том, что она возникла позже других аналогичных мутаций.

Пренатальная диагностика в семьях больных ФКУ.

Максимально ранняя, в т.ч. пренатальная диагностика ФКУ, является необходимым условием эффективной терапии заболевания, улучшения прогноза течения болезни и улучшения качества жизни больных.

Ограничениями пренатальных методов диагностики является их недостаточная оперативность и достоверность.

Применяющиеся в настоящее время способы забора плодного материала не дают абсолютной гарантии отсутствия в исследуемом биологическом материале тканей матери. В этих случаях результаты молекулярно-генетического исследования могут быть неверными. В случае ФКУ пренатальная диагностика заболевания оказывается дополнительно затруднённой из-за значительного (более 500) числа мутаций, вызывающих болезнь.

В рамках настоящей работы нами выполнялась пренатальная диагностика ФКУ в двух семьях из Саратовской области. В обеих семьях ранее были зарегистрированы случаи ФКУ. Мутации ФАГ у членов этих семей нами были идентифицированы в рамках исследования спектра и частоты обуславливающих ФКУ мутаций в этом регионе России.

Диагностика ФКУ осуществлялась комбинацией разработанного метода фрагментного анализа повторов ФАГ и секвенирования экзонов этого гена.

Для первой семьи было по результатам фрагментного анализа БТЯ и УИТЯ ФАГ показано, что плод унаследовал от обоих родителей иные, нежели больной первый ребёнок, аллели ФАГ. Идентификация в биоптате плаценты только одного из присутствующих у матери аллелей БТЯ ФАГ свидетельствует об отсутствии контаминации биоптата тканями матери и достоверности проведённой пренатальной диагностики. Впоследствии методом секвенирования соответствующих экзонов ФАГ в биоптате плаценты было подтверждено отсутствие у плода унаследованных от обоих родителей обуславливающих ФКУ мутаций (рисунок 3). Беременность завершилась весной 2006 года рождением не страдающего ФКУ ребёнка.

234 ¡238 230 , 242

.1................А 1.......................1 . Х...........л. 1

Рисунок 3 Пренатальная диагностика ФКУ в семье больного ФКУ.

Случай I.

Аналогично для второй семьи было показано, что плод унаследовал от отца иной, нежели больной первый ребёнок, аллель гена ФАГ. На этом основании было предположено, что даже в худшем случае, плод будет являться клинически здоровым носителем мутации Я408'\>/ гена ФАГ, унаследованной им от матери. На основании проведённой диагностики лечащим врачом было рекомендовано матери придерживаться терапевтической диеты в целях избегания эффекта материнской фенилкетонурии. Беременность была прекращена на раннем сроке по медицинским показаниям, не связанным с носительством обуславливающих ФКУ мутаций.

Таким образом, в ходе настоящей работы, в сотрудничестве с врачами медико-генетических консультаций и перинатальных центров г. Саратова и г. Новосибирска была осуществлена пренатальная диагностика двух случаев ФКУ методами фрагментного анализа и секвенирования участков гена ФАГ из образцов ДНК, выделенных из биоптатов плодной части плаценты.

Универсальный метод идентификации

однонуклеотидных замен.

Известно около 500 мутаций ФАГ, обуславливающих ФКУ. При этом в каждой популяции лишь незначительное количество типов мутаций обуславливает подавляющее число случаев ФКУ. Поэтому в случае массовой идентификации мутаций этого гена является целесообразным комбинация секвенирования с быстрым и доступным скрининговым методом идентификации наиболее частых мутаций.

Для специфичной детекции точковых мутаций нами был предложен метод аллельспецифичной ПЦР (АС-ПЦР), основанный на использовании в качестве одного из аллельспецифичных праймеров конъюгата олигонуклеотида с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля (МПЭГ-5000, Shearwater Polymers, Inc.). При этом продукты ПЦР, соответствующие разным аллельным вариантам, имеют одинаковый нуклеотидный состав и длину нуклеотидной части, но существенно различаются по электрофоретической подвижности и должны легко детектироваться при гель-электрофорезе.

Конъюгат МПЭГ и олигонуклеотида, служащий праймером, был синтезирован в Лаборатории химии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН.

В качестве модели была выбрана мутация R408W ФАГ. В качестве матриц для АС-ПЦР использовали образцы ДНК больных фенилкетонурией и их родственников, содержащие

11408\У в гомо- или гетерозиготном состоянии, что позволило подтвердить высокую специфичность подхода.

Для обеспечения высокой специфичности метода было предложено использовать в третьих с 3' концов позициях обоих аллельспецифичных праймеров остатки разных нуклеотидов, некомплементарных геномной матрице. Гибридизация аллельспецифичного праймера такой нуклеотидной последовательности с соответствующим ему продуктом ПЦР происходит уже с участием всех оснований, а, следовательно, эффективнее, чем с геномной ДНК и с продуктом ПЦР, соответствующим праймеру, специфичному для другого аллеля. Для усиления этого эффекта было также предложено начиная с третьего цикла ПЦР поднимать температуру отжига праймера на 1,5-2°С. На рисунке 4 приведена схема предложенного метода.

'Й'-оикэя дн-: I — /Я^й

а а

rtwew ¡-'-Г

в-6-

ДЛ

«Р2_3 ---V

gissrs zm

-©--g-

■гЮМкЭ.Ч ДНК j

MPEG;;

уПример 1 J

А С.

R406W ( *!*!

aîC A

^Q-fiT

Рисунок 4 Схема предложенного метода идентификации точковых мутаций на основе мультиплексной аллель-специфичной ПЦР и использования праймера с ковалентно присоединённым к нему остатком МПЭГ.

Нами была показана высокая специфичность описанного метода АС-ПЦР в смесях, содержащих как один (рисунок 4,

дорожки 1-6), так и оба аллель-специфичных праймера (рисунок 4, дорожки 7-9). Видно, что использование МПЭГ-содержащего праймера (рисунок 4, дорожки 1,2,7,8) не снижает специфичности метода и обеспечивает существенное изменение электрофоретической подвижности соответствующего продукта ПЦР длиной 540 п.о. аналогичное его удлинению на 80-90 п.о.

ВЫВОДЫ

1. Определён спектр обуславливающих фенилкетонурию мутаций гена ФАГ в Саратовской, Новосибирской, Кемеровской областях и Алтайском крае. У 256 человек из 71 семьи идентифицировано 20 обуславливающих ФКУ типов мутаций гена ФАГ в 111 аллелях этого гена.

2. Впервые для больных ФКУ этих регионов исследована ассоциация обуславливающих ФКУ мутаций и аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ. В большинстве случаев показана типичная для других регионов России с преимущественно славянским населением ассоциация обуславливающих ФКУ мутаций и аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ.

идентифицированных мутаций (ГУ82-13Т>0, 1У52+19Т>С) не типичен ни для европейских, ни для азиатских стран, или описан в мировой литературе в единичных случаях (Р407Ц У168Н).

4. Показан факт независимого повторного возникновения обуславливающей ФКУ редкой мутации У168Н гена ФАГ, не затрагивающей «горячей точки» мутагенеза (Срв динуклеотид).

5. Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериапа тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты методами секвенирования и фрагментного анализа.

6. Разработан универсальный скрининговый метод идентификации точковых мутаций, основанный на использовании конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах: Статьи в журналах:

1. Е.В. Бреннер, Ф.О. Смагулова, И.В. Морозов. Независимое возникновение редкой мутации Y168H гена фенилаланингидроксилазы человека в России // Генетика. - 2008. - Т. 44. - № 10. - С. 1435 - 1437

2. O.A. Батурина, Е.В. Бреннер, O.A. Суслякова, А.Е. Тупикин, Ф.О. Смагулова, A.A. Бондарь, И.В. Морозов. Определение нуклеотидных последовательностей - перспективный метод

диагностики наследственных заболеваний // Сборник трудов конференции

«Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск. - 2-5 сентября 2008. - С. 76-80.

3. Е.В. Бреннер, О.А. Суслякова, Ф.О. Смагулова, И.В. Морозов. Независимое повторное возникновение редкой мутации У168Н гена фенилаланингидроксилазы человека // Приложение к журналу «Открытое образование» Материалы XIII Международной Конференции «Новые информационные технологии в медицине, фармакологии и экологии». - Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. 31 мая - 9 июня 2005. - С.47-48

4. Е. В. Бреннер, Е. Н. Иванова, Д. В. Пышный, И. В. Морозов. Универсальный метод идентификации однонуклеотидных замен.// Биоорганическая химия. - 2005. - Т. 31. - № 2. - С. 213-215.

5. Е.В. Бреннер, И.В. Морозов. Новые полиморфные сайты гена фенилаланингидроксилазы человека.// Успехи современного естествознания. - 2004. - № 6. - С. 29-30.

6. Ф.О. Смагулова, Е.В. Бреннер, Л.Ю. Котова, О.Л. Корень, В.М. Нагайцев, С.Г. Жабин, И.В. Морозов. Идентификация мутаций гена фенилаланингидроксилазы с использованием автоматического секвенатора ДНК.// Генетика. -2008. - Т. 40. - № 2. - С. 272-276

Тезисы конференций:

1. Е.В. Бреннер, О.А Суслякова., А.Е. Тупикин, Ф.О. Смагулова, А.А. Бондарь, И.В. Морозов.

Мутации и гаплотипы гена

фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Западной Сибири и Саратовской области.// Материалы

Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине». -Новосибирск. - 2006.

2. Е.В. Бреннер, И.В. Морозов. Современные подходы к генодиагностике фенилкетонурии. // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине». -Новосибирск. - 2005. - С. 68

3. E.V. Brenner, D.V. Pyshnyi, E.V. Shtufanova, I.V. Morozov. New effective method for phenylketonuria associated mutations identification. //Proceedings of International Conference "NEW INFORMATION TECHNOLOGY IN MEDICINE, BIOLOGY, PHARMACOLOGY AND ECOLOGY", - Ukraine, Krym, Yalta-Gurzuf, -1-10 June 2003. - P. 393-394.

4. F.O. Smagulova, E.V. Brenner, G.P. Kitainik, L.Yu. Kotova, O.L. Koren, S.G. Jabin, V.M. Nagaicev, I.V. Morozov. Molecular Genetics of Phenylketonuria in Western Siberia.// Human Genome Meeting. Poster Book. - 2002. - Shanghai, China. - P. 171.

Изд. Лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001 Подписано к печати и в свет 06.05.09

Формат бумаги 60x84. Печ. л. 1,1 Уч.-изд. л.1,1. Тираж 100, Заказ № 71 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бреннер, Евгений Владиславович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Введение.

2.1.1. Метаболизм феншаланина в норме.

2.1.2. Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии.

2.1.3. Материнская фенилкетонурия.

2.1.4. Современная классификация форм фенилкетонурии.

2.2. Распространенность фенилкетонурии.

2.3. Структура фенилаланингидроксилазы.

2.4. Структура гена ФАГ.

2.5. Мутации гена ФАГ.

2.6. Влияние мутаций гена фенилаланингидроксилазы на проявления фенилкетонурии

2.6.1. Моделирование влияния мутаций гена ФАГ на структуру фенилаланингидроксилазы.

2.6.2. Экспрессия in vitro как метод исследования эффекта мутаций на активность ФАГ.

2.6.3. Модель общего механизма влияния мутаций гена ФАГ.

2.7. Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика фенилкетонурии.

2.7.1. Исследование полиморфизма сайтов рестрикции гена ФАГ.

2.7.2. Исследование полиморфизма STR и VNTR повторов гена ФАГ.

2.7.3. Исследование происхождения мутантных аллелей.

2.8. Перспективные подходы к терапии фенилкетонурии.

2.8.1. Диетотерапия.

2.8.2. Генотерапия фенилкетонурии.

2.8.3. Медикаментозная терапия фенилкетонурии.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.2.1. Обследованная группа.

3.2.2. Консервирование крови.

3.2.3. Выделение геномной ДНК из крови по МйИег.

3.2.4. Полимеразная цепная реакция.

3.2.4.а) ПЦРрайонов гена ФАГ.

3.2.4.6) РеПЦР STR и VNTR гена ФАГ.

3.2.5. Электрофорез в агарозном геле.

3.2. б. Электрофорез в полиакриламидном геле.

3.2.7. Очистка продуктов ПЦР.

3.2.7.а) Очистка продуктов ПЦР сорбцией на стекловолокне.

3.2.7.6) Гелъфгшътрация продуктов ПЦР на колонках Centrisep Spin Columns.

3.2.7.в) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-5058 3.2.7.г) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G

3.2.8. Реакция Сэнгера.

3.2.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера.

3.2.10. Фрагментный анализ продуктов ПЦР на автоматических генных анализаторах.

3.2.10. а) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов.

3.2.10.6) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных праймеров.

3.2.10.в) Спектральная калибровка генных анализаторов для выполнения фрагментного анализа.

3.2.10.г) Определение поправки между реальными и наблюдаемыми при фрагментном анализе размерами.

3.2.11. Компьютерная обработка данных.

3.2.11.а) Анализ электрофореграмм.

3.2.11.6) Анализ секвенограмм автоматических генных анализаторов.

3.2.11.в) Анализ электрофореграмм при фрагментном анализе.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Полиморфизм гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Западной Сибири Алтайского края и Саратовской области.

4.1.1. Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае.

4.1.2. Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями, обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области.

4.2. Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы Y168H.

4.3. Пренатальная диагностика фенилкетонурии в семьях больных фенилкетонурией

4.4. Универсальный метода идентификации однонуклеотидных замен.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России"

Фенилкетонурия (ФКУ) является одним из распространенных наследственных заболеваний человека. Большое клиническое и биохимическое разнообразие форм этой болезни обусловлено большим разнообразием обуславливающих его мутаций (известно более 500 мутаций гена ФАГ, приводящих к ФКУ). Помимо тяжести заболевания в каждом случае генотип больного ФКУ определяет эффективность традиционной диетотерапии и возможность использования альтернативных способов терапии ФКУ (например, фенилаланинаммиаклиазой).

Спектры мутаций и нейтральных полиморфизмов гена ФАГ значительно различаются в разных популяциях и географических регионах мира. Это, по всей видимости, является отражением особенностей формирования этих популяций и различного влияния факторов естественного отбора на больных ФКУ, имеющих разный жизненный уклад, традиции питания и т.п. Для того чтобы более точно определить происхождение и клинические последствия той или иной мутации, необходимо как можно более полно охарактеризовать носителей этой мутации в каждой популяции. Дополнение таких исследований идентификацией гаплотипов гена ФАГ позволяет делать выводы о генетической структуре популяции, выявлять потоки генов, её формирующих, а также оценивать степень вероятности возникновения той или иной мутации de novo.

В. то же время многообразие обуславливающих фенилкетонурию мутаций делает её своевременную диагностику трудновыполнимой и дорогостоящей, поскольку требует привлечения, методов1 массового типирования точковых мутаций, либо секвенирования гена фенил ал анингидроксил азы у каждого пациента. Таким образом, существует насущная- потребность, в недорогих, быстрых и достоверных методах идентификации обуславливающих фенилкетонурию мутаций, применимых в условиях клинических лабораторий, в. том числе для пренатальной диагностики.

Целью настоящей настоящей работы являлось исследование спектра мутаций, гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае, а также исследование ассоциации этих мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и- возможности возникновения- идентифицированных мутаций в исследованных регионах «

России de novo. В цели-настоящей-работы также входила разработка простых и достоверных методов1 идентификации обуславливающих ФКУ мутаций, в т.ч. пренатально.

Задачами работы,являлись:

Идентификация мутаций гена ФАГ у больных ФКУ и их родственников из указанных регионов России гипотезонезависимыми методами, позволяющими детектировать все, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.

• Разработка на основе фрагментного анализа продуктов ПЦР автоматизированного' массового метода' идентификации аллельных вариантов^ТЯ h VNTR повторов гена ФАГ.

• Разработка простого универсального метода детекции точечных мутаций на основе аллель-специфичной ПЦР.

Научная новизна работы:

Исследован спектр мутаций гена фенилаланингидроксилазы (ФАГ) обуславливающих ФКУ в. Саратовской области, Алтайском крае и ряде j регионов Западной Сибири (Новосибирская, Кемеровская области). Впервые для регионов России идентификация обуславливающих ФКУ мутаций производилась гипотезонезависимым методом - определением нуклеотидных последовательностей районов гена ФАГ, позволило1 детектировать любые, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.

Впервые проведено систематическое исследование сцепления всего спектра мутаций гена' ФАГ в указанных регионах России с гаплотипами этого гена, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и возможности возникновения идентифицированных мутаций в исследованных регионах России de novo.

Доказано независимое повторное возникновение обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H гена ФАГ, что было неизвестно ранее.

Практическая значимость работы. Идентифицированы генотипы больных ФКУ по локусу ФАГ в 73 семьях Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края. Полученные результаты предоставлены врачам местных медико-генетических консультаций и перинатальных центров для контроля правильности выбранной стратегии терапии этих случаев ФКУ.

Разработаны методические рекомендации для выполнения фрагментного анализа на автоматических генных анализаторах с использованием реактивов отечественного производства, что сделало возможным внедрение этого метода на базе Центра коллективного пользования СО РАН «Секвенирование ДНК».

Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты с помощью секвенирования и фрагментного анализа.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «3-я Международная конференция «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007 г.), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006 г.), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005 г.), International Conference "New information technology in medicine, biology, pharmacology and ecology" (Ялта-Гурзуф, 2003 г.),

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Введение

Фенилкетонурия (ФКУ, McKusick MIM 261600) является одним из распространённых и хорошо изученных наследственных заболеваний человека. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Впервые ФКУ была описана в 1934 году норвежским врачом и биохимиком Феллингом (Foiling, 1934а). Им было установлено, что ФКУ развивается в результате нарушения нормального метаболизма незаменимой аминокислоты фенилаланина и накопления в тканях организма токсичных продуктов альтернативных путей его деградации. Феллинг предложил и первый метод диагностики фенилкетонурии, основанный на качественной реакции патологических метаболитов фенилаланина в моче больного фенилкетонурией с хлоридом железа (III) (Foiling, 1934b). В настоящее время этот метод применяется в отношении всех новорождённых большинства стран в т.ч. и России. Хотя он и не даёт представления о тяжести заболевания в каждом конкретном случае и является, по существу, поздней диагностикой фенилкетонурии (т.к. её диагностика происходит уже после формирования ЦНС и начала активации патологического метаболизма фенилаланина), он прочно занял место среди обязательных анализов новорожденных, в т.ч. и потому, что предъявляет минимальные требования к необходимому оборудованию и квалификации персонала.

2.1.1. Метаболизм фенилаланина в норме

В норме in vivo ключевой стадией метаболизма фенилаланина является его гидроксилирование с образованием тирозина. Было показано, что для гидроксилирования фенилаланина необходимо, как минимум, два белковых фактора (Mitoma, 1956). В последствии эти факторы были охарактеризованы

Kaufman, 1958a, 1959, 1963) как ферменты фенилаланингидроксилаза (ФАГ) и дигидроптеридинредуктаза (ДГПР). Первый из них непосредственно катализирует реакцию гидроксилирования фенилаланина. Второй осуществляет восстановление дигидробиоптерина до тетрагидробиоптерина - кофактора фенилаланингидроксилазы, окисляемого в процессе гидроксилирования фенилаланина.

Дальнейшие исследования показали, что гидроксилирование фенилаланина достаточно сложный процесс, в котором участвуют ещё дополнительно не менее 4-х ферментов и их кофакторов. Схематически этот процесс приведён на рисунке 1.

GTP

02 +

GTP-CH н I сн,—с—соон * I

NH2

L-фенилаланин

НО' н I сн2—с—соон I nh2 L-тирозин

DHNP

6-PTS

6-РТ

NADPH+H

H,N Н

NAD

N « ^

4а-карбиноламин

4а-карбиноламин дегидратаза н2о А

NADH+H+ IIzN [j qBH2

Рис. 1. Гидроксилирование фенилаланина, включая синтез и регенерацию птеридинового кофактора. Обозначения: GTP- гуанозин-трифосфат, GTP-CH- GTP-циклогидролаза, DHNP- d -эритро-дигидронеоптерин трифосфат, 6-PTS- 6-пирувоил тетрагидробиоптерин, 6-РТ—пирувоил тетрагидробиоптерин, qBH2~ хиноидный дигидробиоптерин, ВН4Х-эритро-тетрагидробиоптерин

Фенилаланингидроксилаза . катализирует гидроксилирование фенилаланина до тирозина и сопутствующее этому окисление кофактора тетрагидробиоптерина (ВЩ) до 4а-карбиноламина. Регенерация ВЩ осуществляется в1 две стадии 4а-карбиноламин дегидратазой и дигидроптеридинредуктазой. Синтез ВЩ de novo осуществляется из гуанозинтрифосфата в несколько стадий с участием GTP - циклогидролазы, 6-пирувоилтетрагидробиоптеринсинтазы (6-PTS) и сепиаптеринредуктазы.

Следует отметить, что ВН4 является кофактором не только ФАГ, но и тирозингидроклилазы - ключевым: . ферментом метаболизма катехоламиновых нейромедиаторов, а также триптофангидроксилазы — ферментом, участвующем1 в метаболизме сератониновых медиаторов: Таким образом, суммарный уровень биосинтеза и регенерации ВН4 должен соответствовать суммарной потребности этих ферментов в кофакторе.

Первоначально в экспериментах с клетками печени эмбрионов крысы было показано, что гидроксилирование фенилаланина преимущественно происходит в печени (Crawfurd et al, 1981). Однако в более поздних работах демонстрируется важная роль почек в этом процессе. Было также высказано предположение; что; почки являются основным источником тирозина (Moller et al, 2000). .

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Бреннер, Евгений Владиславович

5. ВЫВОДЫ

3. Показано, что на формирование спектра обуславливающих в Западной Сибири и Саратовской области ФКУ мутаций гена ФАГ в значительной мере оказали влияние потоки генов из Восточной Европы (R408W, R252W), Скандинавии (IVS12ntl, Y414C), Западной Европы (Е280К, R158Q), Южной Европы (Р281), Турции (R261Q), и, в значительно меньшей степени поток генов из Азии (R243Q). Ряд идентифицированных мутаций (IVS2-13T>G, IVS2+19T>C) не типичен ни для европейских, ни для азиатских стран, или описан в мировой литературе в единичных случаях (P407L, Y168H).

4. Показан факт независимого повторного возникновения обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H гена ФАГ, не затрагивающей «горячей точки» мутагенеза (CpG динуклеотид).

5. Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты методами секвенирования и фрагментного анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бреннер, Евгений Владиславович, Новосибирск

1. Барановская С.С., Шевцов С.П., Максимова С.П., Кузьмин А.И., Шварц Е.И. Спектр мутационных повреждений гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией г. Санкт-Петербурга. // Доклады Академии наук. 1995. Т.340. №5. С.709-711.

2. Викторова Т.В., Мурзабаева С.С., Карунас А.Ю., Магжанов Р.В., Хуснутдинова Е.К. Молекулярно- генетический анализ фенилкетонурии в Башкирии. // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №7. С.992-995.

3. Патрушев Л.И., Зыкова Е.С., Каюшин A.JL, Коростелёва М.Д., Мирошников А.И., //Биоорган, химия. 1998. Т.24. С. 194-200

4. Смагулова Ф.О. Молекулярная природа фенилкетонурии в новосибирской области. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Новосибирск, 2000

5. Abadie V, Lyonnet S, Melle D, Berthelon M, Caillaud C, Labrune P, Rey F, Rey J, Munnich A. Molecular basis of phenylketonuria in France.// Dev Brain Dysfunct 1993. V.6: P. 120-126.

6. Aoki K, Wada Y. Outcome of the patients detected by newborn screening in Japan. // Acta Paediatr. 1993. V.30. P.429-414.

7. Aulehla-Scholz: Communication to PAHdb to CR Scriver Jan. 22 1999

8. Aulehla-Scholz С, Heilbronner H. Mutational spectrum in German patients with phenylalanine hydroxylase deficiency. // 2003 .Hum Mutat V. 21.1. P.399-400.

9. Baranovskaya S, Shevtsov S, Maksimova S, Kuzmin A, Schwartz E. The mutations and VNTRs in the phenylalanine hydroxylase gene of phenylketonuria in St Petersburg.// J Inherit Metab Dis. 1996. V.19(5). P.705.

10. Baric I., Mardesic D., Gjuric G., Sarnavka V., Gobel-Schreiner В., Lichter-Konecki U., Konecki, Trefz F.K. Haplotype distribution and mutations at the PAH locus in Croatia. // Hum Genet. 1992. V.90. P. 155-157

11. Betts S, Haase-Pettingell C, King J. Mutational effects on inclusion body formation. /Лn: 1997 Richards FM, Eisenberg DF, Kim PS, editors. Advances in protein chemistry 50: protein misassembly. New York: Academic Press, p 243-264.

12. Bickel H., Bachmann C., Beckers R. Neonatal mass screening for metabolic disorders.// Eur. J. Pediatr. 1981. V.137. P133-139i

13. Bonora GM, Ivanova E, Zarytova V, Burcovich B, Veronese FM. Synthesis and characterization of high-molecular mass polyethylene glycol-conjugated oligonucleotides.// Bioconjug Chem. 1997 Nov-Dec V.8(6). P.793-797.

14. Bosco P, Cali F, Meli C, Mollica F, Zammarchi E, Cerone R, Vanni C, Palillo L, Greco D, Romano V. Eight new mutations of the phenylalanine hydroxylase gene in Italian patients with hyperphenylalaninemia.// Hum Mutat 1998. V. 11. P.240-243

15. Bross P, Corydon TJ, Andresen BS, Jorgensen MM, Bolund L, Gregersen N. Protein misfolding and degradation in genetic diseases.// 1999. Hum Mutat V.14. P.186-198.

16. Byck S, Morgan К, Tyfield L, Dworniczak B, Scriver CR. Evidence for origin, by recurrent mutation, of the phenyla-laninehydroxylase R408W mutation on two haplotypes inEuropean and Quebec populations. // Hum Mol Genet 1994. V.3. P.1675-1677.

17. Byck S., Tyfield L., Carter K., Scriver C.R. Prediction of Multiple Hypermutable Codons in the Human PAH Gene: Codon 280 Contains Recurrent Mutations in Quebec and Other Populations. // Hum Mutat 1997. V.9. P.316-321.

18. Charikova E.V., Khalchitskii S.E., Antoshechkin A.G., Schwartz E.I. Distribution of some point mutations in the phenylalanine hydroxylaase gene of phenylketonuria patients from the Moscow region. // Hum. Hered. 1993. V.43.P.244-249.

19. Chehin R., Thorolfsson M., Knappskog P. M., Martinez A., Flatmark Т., Arrondo J.L.R. , Muga A. Domain structure and stability of human phenylalanine hydroxylase inferred from infrared spectroscopy.//FEBS Letters. 1998. V.422. P.225-230

20. Chesnoy S., Huang L., Structure and function of lipid-DNA complexes for gene delivery// Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000. V.29. P. 27-47.

21. Chien YH, Chiang SC, Huang A, Chou SP, Tseng SS, Huang YT, Hwu WL. Mutation spectrum in Taiwanese patients with phenylalanine hydroxylase deficiency and a founder effect for the R241C mutation.// Hum Mutat. 2004 V.23(2). P.206.

22. Christensen R., Kolvraa S., Blaese R.M., Jensen T.G., Development of a skin-based metabolic sink for phenylalanine by overexpression of phenylalanine hydroxylase and GTP cyclohydrolase in primary human keratinocytes// Gene Ther. 2000. V.7. P.1971-1978.

23. Christensen R., Guttler F., Jensen T.G., Comparison of epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts as potential target cells for somatic gene therapy of phenylketonuria// Mol. Genet. Metab. 2002. V.76 P.313-318.

24. Cristiano R.J., Smith L.C., Woo S.L., Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primary hepatocytes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. V.90. P.2122-2126.

25. Crawfiird M., Cibbs D., Sheppard D. Studies on human phenylalanine monooxygenase: Restricted expression. // J. Inher Metab. Dis. 1981. V.4. P.191-195.

26. Daiger S. P., Lidsky A. S, Chakraborty R., Koch R., Cuttler F., Woo S.L.C. Effective use of polymorpic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxylase (PAH) locus in prenatal diagnosis of phenylketonuria.// Lancet. 1986. V.l. P.229-232.

27. Daiger SP, Reed L, Huang S-Z et al. Polymorphic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxylase (PAH) locus in Asian families with phenylketonuria (PKU). // Am J Hum Genet. 1989 V.45(2). P.319-324.

28. Davis M. D., Parniak M. A., Kaufman S., Kempner E. The role of phenylalanine in structure-function relationships of phenylalanine hydroxylase revealed by radiation target analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.491-495

29. De La Vega, Isaac F.M., H., Scafe, C.R. A Tool for Selecting SNPs for Association Studies Based on Observed Linkage Disequilibrium Patterns. //Pacific Symposium on Biocomputing 2006 V.l 1. P.487-498

30. Dianzani I, Giannattasio G, de Sanctis L, Alliaudi C, Lattanzio P, Dionisi Vici C, Burlina A, Burroni M, Sebastio G, Carnevale F, et al. Characterization of phenylketonuria alleles in the Italian population.// Eur J Hum Genet 1995. V.3. P.294-302.

31. DiLella AG, Marvit J, Brayton K, Woo SL. An amino-acid substitution involved in phenylketonuria is in linkage disequilibrium with DNA haplotype 2.//Nature 1987. V.327. P.333-336.

32. Doskeland AP, Flatmark T. Recombinant human phenylalanine hydroxylase is a substrate for the ubiquitinconjugating enzyme system. //Biochem J 1996. V.319. P.941-945.

33. Dutton C, Sommer SS. Simultaneous detection of multiple single-base alleles at a polymorphic site.// Biotechniques. 1991 Dec;l l(6):700-2.

34. Dworniczak B, Aulehla-Scholz C, Horst J: Phenylalanine hydroxylase gene: silent mutation uncovers evolutionary origin of different alleles. // Clin Genet. 1990 V.3 8(4). P.270-273.

35. Dworniczak В., Kalaydjieva L., Aulehla-Scholz C., Ullrich K., Kremcnsky I., Radeva В., Horst J. Recurrent nonsense mutation in exon 7 of the phenylalanine hydroxylase gene. // Hum. Genet. 1991. V.87. P.731-733.

36. Eiken HG, Knappskog PM, Apold J, Flatmark T. PKU mutation G46S is associated with increased aggregation and degradation of the phenylalanine hydroxylase enzyme.// Hum Mutat 1996a. V.7. P.228-238.

37. Eiken HG, Knappskog PM, Boman H, Thune KS, Kaada G, Motzfeldt K, Apold J. Relative frequency, heterogeneity and geographic clustering of PKU mutations in Norway.// Eur J Hum Genet 1996. V.4. P.205-213.

38. Eisensmith R.C., Woo S.L.C. Molecular basis of phenylketonuria and related hyperphenylalaninemias: Mutations and polymorphisms in the human phenylalanine hydroxylase gene. // Hum. Mutat. 1992a. V.l. P.13-21.

39. Eisensmith R.C., Okano Y., Dasovich M., Wang T, Guttler F., Lichter-Konecki U., Konecki D. S., Svensson E., Hagenfeldt L., Rey F., Munnich

40. Eisensmith R.C., Woo S.L., Somatic gene therapy for phenylketonuria and other hepatic deficiencies// J. Inherit. Metab. Dis. 1996. V.19. P.412^23.

41. Ellingsen S., Knappskog P.M., Jaran A., Eiken H.G. Diverse PAH transcripts in lymphocytes of PKU patients with putative nonsense (G272X, Y356X) and missense (P281L, R408Q) mutations. // FEBS Letters. 1999. V.457. P.505-508

42. Erlandsen H and Stevens RC, The Structural Basis of Phenylketonuria.// Mol Genet Metab. 1999 V.68(2). P. 103-125.

43. Fiege B, Blau N. Assessment of tetrahydrobiopterin (BH4) responsiveness in phenylketonuria.// J Pediatr. 2007 V. 150(6). P.627-630.

44. Foiling A. Utskillelse av fenylpyrodriesyre i urinen som stoflikifteanomali i fortindelse med imbecillitet.//Nord. Med. Tidskr. 1934a.V.8. P.1054-1059

45. Foiling A. Uber Ausscheidung von Phenylbrenztraubensaure in den Ham als Stoff-wechselanomalie in Verbindung mit Imbezillitat.// Ztichr. Ptysiol. Chem. 1934b V. 227. P. 169-176.

46. Forrest SM, Dahl HH, Howells DW, Dianzani I, Cotton RGH. Mutation detection in phenylketonuria by using chemical cleavage of mismatch: Importance of using probes from both normal and patient samples. // Am J Hum Genet. 1991 V.49(l). P.175-183.

47. Fusetti F., Erlandsen H., Flatmarki Т., Stevens R. C. Structure of tetrameric human phenylalanine hydroxylase and its Implications for phenylketonuria.// The Journal of biological chemistry. 1998. V. 273, P.l 6962-16967.

48. Gamez A, Perez B, Ugarte M, Desviat LR. Expression analysis of phenylketonuria mutations: effect on folding and stability of the phenylalanine hydroxylase protein. //J Biol Chem 2000. V.275. P.29737— 29742.

49. Garcia-Diaz M, Bebenek K, Krahn JM, Pedersen LC, Kunkel ТА. Structural analysis of strand misalignment during DNA synthesis by a human DNA polymerase.// Cell. 2006 V. 124(2). P.331-342.

50. Giannattasio S, Dianzani I, Lattanzio P, Spada M, Romano V, Cali F, Andria G, Ponzone A, Marra E, Piazza A. Genetic heterogeneity in five Italian regions: analysis of PAH mutations and minihaplotypes. //Hum Hered. 2001. V.52(3). P.154-159.

51. Goltsov AA, Eisensmith RC, Konecki DS, Lichter-Konecki U, Woo SL. Associations between mutations and a VNTR in the human phenylalanine hydroxylase gene. //Am J Hum Genet. 1992 V.51(3). P.627-636.

52. Gramer G, Burgard P, Garbade SF, Lindner M. Effects and clinical significance of tetrahydrobiopterin supplementation in phenylalanine hydroxylase-deficient hyperphenylalaninaemia.// J Inherit Metab Dis. 2007 V.30(4). P.556-562. Epub 2007 Aug 6

53. Grenett H.E., Ledley F.D., Reed L.L., Woo S.L.C. Full-length cDNA for rabbit tryptophan hydroxylase: Functional domains and evolution of aromatic amino acid hydroxylases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V.4. P.5530-5534.

54. Guldberg P, Henriksen KF, Guttler F. Molecular analysis of phenylketonuria in Denmark: 99% of the mutations detected by denaturing gradient gel electrophoresis.// Genomics 1993. V.17. P. 141-146.

55. Guldberg P, Mallmann R, Henriksen KF, Guttler F. Phenylalanine hydroxylase deficiency in a population in Germany: mutational profile and nine novel mutations.// Hum Mutat 1996. V.8. P.276-279.

56. Harding C.O., Wild K., Chang D., Messing A., Wolff J.A., Metabolic engineering as therapy for inborn errors of metabolism-development of mice with phenylalanine hydroxylase expression in muscle// Gene Ther. 1998. V.5 P.677-683.

57. Harding C.O., Neff M., Jones K., Wild K., Wolff J.A., Expression of phenylalanine hydroxylase (PAH) in erythrogenic bone marrow does not correct hyperphenylalaninemia in Pahenu2 mice// J. Gene Med. 2003. V.5. P.984-993.

58. Hashem N, Bosco P, Chiavetta V, Cali F, Ceratto N, Romano V. Preliminary studies on the molecular basis of hyperphenylalaninemia in Egypt.// Hum Genet 1996. V.98. P.3-6

59. Hennermann JB, Vetter B, Wolf C, Windt E, Buhrdel P, Seidel J, Monch E, Kulozik AE. Phenylketonuria and hyperphenylalaninemia in eastern Germany: a characteristic molecular profile and 15 novel mutations.// Hum Mutat 2000. V.l5. P.254-260.

60. Hufton S. E., Jennings I. G.,. Cotton R. G. H. Structurer function analysis of the domains required for the multimerisation of phenylalanine hydroxylase.// Biochimica et Biophysica Acta. 1998. V.1382. P.295-304.

61. Hwu W.L., H.Y. Yeh, S.W. Fang, H.S. Chiang, Y.W. Chiou, Y.M. Lee, Regulation of GTP cyclohydrolase I by alternative splicing in mononuclear cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V.306. P.937-942.

62. Jaruzelska J, Matuszak R, Lyonnet S, Rey F, Rey J, Filipowicz J, Borski K, Munnich A. Genetic background of clinical homogeneity of phenylketonuria in Poland.// J Med Genet 1993. V.30. P.232-234.

63. Jervis G. A. Studies on phenylpyruvic oligophrenia. The position of the metabolic error. // J. Biol. Chem. 1947. V.169. P.651-656.

64. Jervis G.A. Phenylpyruvic oligophrenia deficiency oi phenylalanine-oxidizing system. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1953. V.82. P.514-515.

65. John S.W.M., Scriver C.R., Laframboise R., Rozen R. In vivo and in vivo correlalions for the I65T and MIV mutation, at the phenylalanine hydroxylase locus.// Hum. Mut. 1992. V.l. P.147-153.

66. Kasnauskiene J, Giannattasio S, Lattanzio P, Cimbalistiene L, Kucinskas V. The molecular basis of phenylketonuria in Lithuania.// Hum Mutat 2003. V.21.P.398.

67. Kaufman S. A new cofactor required for the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine.//J. Biol. Chem. 1958a. V.230. P.931-939.

68. Kaufman S. Studies on the mechanism of the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine. // J. Biol. Chem. 1959. V.234. P.2677-2682.

69. Kaufman S. The structure of the phenylalanine-hydroxylation cofactor.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. V.50. P. 1085-1093.

70. Kayaalp E, Treacy E, Waters PJ, Byck S, Nowacki P, Scriver CR //Human phenylalanine hydroxylase mutations and hyperphenylalaninemia phenotypes: a metanalysis of genotype-phenotype correlations. Am J Hum Genet 1997. V.61. P. 1309-1317

71. Khidiiatova IM, Khusnutdinova EK. Genomic structure and DNA diagnosis of hereditary monogenic diseases in the Volga-Ural region/ Mol Biol (Mosk). 2004. V.38(l). P.139-149.

72. Koch R., Azen C., Friedman E.G., Williamson M.L. Paired comparisons between early treated PKU children and their matched sibling controls on intelligence and school achievement lest results at eight of age.// J. Inher. Metab. Dis. 1984. V.7. P.86-90.

73. Koch R., Moseley K. D., Yano S., Nelson M. Jr., Moats R. A. Large neutral amino acid therapy and phenylketonuria: a promising approach to treatment// Molecular Genetics and Metabolism 2003. V.79: P. 110-113

74. Krause W, Epstein C, Averbook A, Dembure P, Elsas L () Phenylalanine alters the mean power frequency of electroencephalograms and plasma L-dopa in treated patients with phenylketonuria.// Pediatr Res 1986. V.20. P.1112-1116

75. Kuzmin A.I., Eisensmith R.C., Goltsov A.A., Sergeeva N.A., Schwartz E.I., Woo S.L. Complete spectrum of PAH mutations in Tataria: presence of Slavic, Turkic and Scandinavian mutations// Eur J Hum Genet. 1995. V.3(4). P.246-255.

76. Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM. Enhanced allele-speciflc PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers.// Hum Mutat. 2003 V.22(l). P.79-85.

77. Kuzmin A.I., Eisensmith R.C., Goltsov A.A., Sergeeva N.A., Schwartz E.I., Woo S.L.C. Complete spectrum of PAH mutations in Tataria: presence of Slavic, Turkic and Scandinavian mutations. // Europ J Hum Genet. 1995. V.3. P.246-255.

78. Lee DH, Koo SK, Lee KS, Yeon YJ, Oh HJ, Kim SW, Lee SJ, Kim SS, Lee JE, Jo I, Jung SC. The molecular basis of phenylketonuria in Koreans.//J Hum Genet. 2004. V.49(ll). P.617-621. Epub 2004 Oct 16.

79. Lidsky AS, Guttler F, Woo SL. Prenatal diagnosis of classical phenylketonuria by DNA analysis. // Lancet. 1985 V. 1(8428). P.549-551.

80. Lillevali H., Ounap K., Metspalu A. Phenylalanine hydroxylase gene mutation R408W is present 84% of Estonian phenylketonuria chromosomes.// Eur J Hum Genet. 1996. V.4. P. 296-300

81. Lin C.M., Tan Y., Lee Y.M., Chang C.C., Hsiao K.J., Expression of human phenylalanine hydroxylase activity in T lymphocytes of classical phenylketonuria children by retroviral-mediated gene transfer//J. Inherit. Metab. Dis. 1997. V.20. P.742-754.

82. Liu T.J., Kay M.A., Darlington G.J., Woo S.L. Reconstitution of enzymatic activity in hepatocytes of phenylalanine hydroxylasedeficient mice, Somat. Cell.// Mol. Genet. 1992. V.18. P.89-96.

83. Liu Q, Thorland EC, Heit JA, Sommer SS. Overlapping PCR for bidirectional PCR amplification of specific alleles: a rapid one-tube methodfor simultaneously differentiating homozygotes and heterozygotes.// Genome Res. 1997 V.7(4). P.389-398.

84. Mallolas J, Vilaseca MA, Campistol J, Lambruschini N, Cambra FJ, Fuste ME, Mila M. Clinical, biomedical, neurological and molecular study of 11 patients with new mutations in PAH gene. // Rev Neurol. 2000 V.31(10). P.907-10.

85. Maniatis N, Collins A, Xu CF, McCarthy LC, Hewett DR, Tapper W, Ennis S, Ke X, Morton NE. The first linkage disequilibrium (LD) maps: delineation of hot and cold blocks by diplotype analysis.// Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V.99. P.2228-2233.

86. McKinzie PB, Parsons BL. Detection of rare K-ras codon 12 mutations using allele-specific competitive blocker PCR.// Mutat Res. 2002 V.517(l-2). P.209-220.

87. McDonald J.D., Andriolo M., Cali F., Mirisola M., Puglisi-Allegra S., Romano V., Sarkissian C.N., Smith C.B., The phenylketonuria mouse model: a meeting review// Mol. Genet. Metab. 2002. V.76. P.256-261.

88. Michals-Matalon K, Bhatia G, Guttler F, Tyring SK, Matalon R. Response of phenylketonuria to tetrahydrobiopterin.// J Nutr. 2007 V.137. P.1564S-1567S; discussion P.1573S-1575S.

89. Mitoma C., Auld R.M., Udenfriend S. On the nature of enzymatic defect in phenylpyruvic oligophrenia. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. V.94.1. P.634-635.

90. Moller N.E , Meek S., Bigelow M., Andrews J., Nair K.S. The kidney is an important site for in vivo Phenylalanine-to-tyrosine conversion in adult

91. Humans: a metabolic role of the kidney. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. P.l242-1246

92. Morales G, Requena С. M., Jimenez-Ruiz A., Lopez M.C., Ugarte M., Alonso C. Sequence and expression of the Drosophila phenylalanine hydroxylase mRNA. // Gene. 1990. V.93. P.213-219.

93. Murphy ВС, Scriver CR, Singh SM. CpG methylation accounts for a recurrent mutation (с.1222С>Т) in the human PAH gene.// Hum Mutat. 2006 V.27(9). P.975.

94. Nagasaki Y., Matsubara Y., Takano H., Fujii K., Senoo M., Akanuma J., Takahashi K., Kure S., Нага M., Kanegae Y., et al., Reversal of hypopigmentation in phenylketonuria mice by adenovirus- mediated gene transfer//Pediatr. Res. 1999. V.45. P.465-473.

95. Nechyporenko MV, Livshits LA. Molecular and genetical study of phenylketonuria in Ukraine (abstract).// Eur J Hum Genet 2002. V.101 P.236.

96. O'Donnell K, O'Neill C, Tighe O, Bertorelle G, Naughten E, Mayne P, Croke D. The mutation spectrum of hyperphenylalaninaemia in the Republicof Ireland: the population history of the Irish revisited.// Eur J Hum Genet2002. V.10. P.530-538.

97. Okano Y., Wang T, Eisensmith R.C, Guttler F., Woo S.L.C. Recurent mutation in the human phenylalanine hydroxylase gene. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V.46. P.919-924.

98. Okano Y, Eisensmith RC, Guttler F, Lichter-Konecki U, Konecki DS, Trefz FK, Dasovich M, Wang T, Henriksen K, Lou H, et al. Molecular basis of phenotypic heterogeneity in phenylketonuria.// N Engl J Med 1991a. V.324. P:1232-1238.

99. Okano, Y., Wang, Т., Eisensmith R. C., Longi R., Giovannini M, Cerone R., Romano C., Woo S.L.C. Phenylketonuria missense mutations in the Mediterranean. // Genomics. 1991b. V.9. P.96-103.

100. Ozalp L., Coskun T, Ceyhan M., Tokol S., Oran O., Erdem G., Tekinalp O., Durmus Z., Tarikahya Y. Incidence of phenylketonuria and hyperphenylalaninemia in a sample of the newborn population. // J. Inher. Metab. Dis. 1986. V.9. P.237-239.

101. Ozguc M, Yilmaz E, Erdem H, Coskun T, Tokatli A, Ozalp I: Association between mutations and the variable number tandem repeat alleles in sample of Turkish phenylketonuria patients.// J Inher Metab Dis 1994. V.17. P.373-374.

102. Penrose L.S., Quastel J.H. Metabolic studies in phenylketonuria. // Biochem. J. 1937. V.31.P 266-274.

103. Perez B, Desviat LR, Ugarte M. Analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in the Spanish population: mutation profile and association with intragenic polymorphic markers.// Am J Hum Genet 1997. V.60. P.95-102.

104. Pey AL, Desviat LR, Gamez A, Ugarte M, Perez B. Phenylketonuria: genotype-phenotype correlations based on expression analysis of structural and functional mutations. //Hum Mutat 2003. V.21. P.370-378.

105. Pietz J, Dunckelmann R, Rupp A, Rating D, Meinck HM, Schmidt H, Bremer HJ Neurological outcome in adult patients with early-treated phenylketonuria. //Eur J Pediatr 1998. V.157. P.824-830

106. Pronina N, Giannattasio S, Lattanzio P, Lugovska R. The molecular basis of phenylketonuria in Latvia.// Hum Mutat 2003. V.21. P.398-399.

107. Ramus S., Forrest S.M., Saleeba J.A., Cotton R.G.H. CpG hotspot causes second mutation in codon 408 of the phenylalanine hydioxylase gene.// Hum. Genet. 1992. V.90. P.147-148.

108. Romano V, Lio D, Cali F, Scola L, Leggio L, D'Anna C, DeLeo G, Salermo A. A methodological strategy for PAH genotyping in populations with a marked molecular heterogeneity of hyperphenylalaninemia. //Mol Cell Probes. 2001 V.15(l). P.13-19.

109. Scriver CR, Kaufman S. The hyperphenylalaninemias. In: Scriver CR, Beaudet al, Sly SW, Valle D (eds) Childs B, Kinzler KW, Vogelstein В (assoc eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease.// 2001, 8 ed. McGraw-Hill, New York, Ch. 77

110. Scriver CR, Hurtubise M, Konecki D, Phommarinh M, Prevost L, Erlandsen H, Stevens R, Waters PJ, Ryan S, McDonald D, Sarkissian C. PAHdb 2003: What a Locus-Specific Knowledgebase Can Do // Hum Mutat 2003. V.21. P.333-344

111. Smagulova FO, Brenner EV, Kotova Liu, Koren' OL, Nagaitsev YM, Zhabin SG, Morozov IV. Identification of mutation of the phenylalanine hydroxylase gene using an automated DNA sequencer. // Genetika. 2004 V.40(2). P.272-276.

112. Smith S.C., Kemp В. E., McAdam W. J., Mercer J.E.B., Cotton R.G. Two apparent molecular weight forms of human and monkey phenylalaninehydroxylase are due to phosphorylation // J. Biol. Chem. 1984. V.259. P.l 1284-11289

113. Song F, Jin YW, Wang H, Zhang YM, Yang YL, Zhang T. Mutations in exon 7 of the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene in Chinese patients with phenylketonuria (abstract). //Yi Chuan. 2005 V.27(l). P.53-56.

114. Spaapen J.M., Estela Rubio-Gozalbo M. Tetrahydrobiopterin-responsive phenylalanine hydroxylase deficiency, state of the art// Molecular Genetics and Metabolism 2003. V.78. P.93-99

115. Sueoka H., Moshinetsky A., Nagao M., Chiba S. Mutation screening of phenylketonuria in the Far East of Russia.// J Hum Genet 1999. V.44. P.368-371

116. Svensson E, Eisensmith RC, Dworniczak B, von Dobeln U, Hagenfeldt L, Horst J, Woo SL. Two missense mutations causing mild hyperphenylalaninemia associated with DNA haplotype 12. //Hum Mutat 1992. V.l.P.129-137.

117. Tighe O., Dunican D., O'Neill C. Genetic Diversity Within the R408W Phenylketonuria Mutation Lineages in Europe // Hum Mut 2003. V.21. P.387-393.

118. Thomas C.E., Ehrhardt A., Kay M.A., Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy// Nat. Rev. Genet. 2003. V.4. P.346-358.

119. Thony В., Auerbach G., Blau N. Tetrahydrobiopterin biosynthesis, regeneration, and functions// Biochem. J. 2000. V.347. P. 1-16.

120. Traiger-Synodinos J., Kanavakis E., Kalogerakou M. Preliminary mutation analysis in the phenylalanine hydroxylase gene in Greek PKU and HPA patients. //Hum. Genet. 1994. V.94. P.573-575.

121. Tsai T.-F., Hsiao K.-J., Su T.-S. Phenylketonuria mutation in Chinese haplotype 44 identical with haplotype 2 mutation in northern-Eiropean caucasian. //Hum. Genet. 1990. V.84. P.409-411.

122. Tyfield LA, Stephenson A, Cockburn F, Harvie A, Bidwell JL, Wood NA, Pilz DT, Harper P, Smith I. Sequence variation at the phenylalaninehydroxylase gene in the British Isles.// Am J Hum Genet 1997. V.60. P.388-396.

123. Viktorova TV, Murzabaeva SSh, Karunas AU, Magzhanov RV, Khusnutdinova EK. Molecular genetic analysis of phenylketonuria in Bashkiria /Genetika. 1997. V.33(7). P.992-995.

124. Villasana D, Butler IJ, Williams JC, Roongta SM. Neurological deterioration in adult phenylketonuria. // J Inherit Metab Dis 1989. V.12. P.451-457

125. Walitza S., Renner T.J., Dempfle A. Konrad K., et.al. Transmission disequilibrium of polymorphic variants in the tryptophan hydroxylase-2 gene in attention-deficit/hyperactivity disorder. // Mol. Psychiatry. 2005. V.10. P.1126-1132.

126. Wang T, Okano Y., Eisensmith R.C., Lo W.H.Y., Huang S. -Z., Zeng Y.T., Liu S-R., Woo S.L.C. Missense mutationns prevalent in Orientals with phenylketonuria: Molecular characterization and clinical implications.// Genomics. 1991b. V.10. P.449-456.

127. Waters PJ, Parniak MA, Hewson AS, Scriver CR. Alterations in protein aggregation and degradation due to mild and severe missense mutations

128. A104D, R157N) in the human phenylalanine hydroxylase gene (PAH).// Hum Mutat 1998. V.12. P.344-354.

129. Waters P.J. How PAH Gene Mutations Cause Hyper-phenylalaninemia and Why Mechanism Matters: Insights From In Vitro Expression. // Hum Mutat 2003. V.21.P.357-369.

130. Werner-Felmayer G., Golderer G., Werner E.R., Tetrahydrobiopterin biosynthesis, utilization and pharmacological effects// Curr. Drug Metab. 2002. V.3. P.159-173.

131. Wickner S, Maurizi MR, Gottesman S. Posttranslational Quality Control: folding, refolding, and degrading proteins.// Science 1999. V.286. P. 18881893.

132. Williams К Benefits of normalizing plasma phenylalanine: impact on behaviour and health. A case report. // J Inherit Metab Dis 1998. V.21. P.785-90

133. Woo SL, Lidsky AS, Guttler F et al. Cloned human phenylalanine hydroxylase gene allows prenatal diagnosis and carrier detection of classical phenylketonuria. //Nature. 1983. V.306(5939). P.151-155.

134. Woolf L.I., Vulliamy D.G. Phenylketonuria with a study of the effect upon it of glutamic acid. // Arch. Dis. Child. 1951. V.26. P.487-494.

135. Zekanowski C, Jurkowska M, Bal J. Association between minihaplotypes and mutations at the PAH locus in Polish hyperphenylalaninemic patients.// HumHered 2001. V.51. P.l 17-120.

136. Zekanowski C, Nowacka M, Zgulska M, Horst J, Cabalska B, Mazurczak T. Frequencies of the most common mutations responsible for phenylketonuria in Poland.//Mol Cell Probes 1994. V.8. P.323-324.

137. Zschocke J, Graham CA, Carson DJ, Nevin NC. Phenylketonuria mutation analysis in Northern Ireland: a rapid stepwise approach. //Am J Hum Genet 1995. V.57. P.1311-1317.

138. Zschocke J, Mallory JP, Eiken HG, Nevin NC. Phenylketonuria and the peoples of Northern Ireland. //Hum Genet 1997. V.100. P.189-194.

139. Zschocke J.,-Hoffmann G. Phenylketonuria mutations in Germany. // Hum Genet 1999. V.104. P.390-398

140. Zschocke J. Phenylketonuria Mutations in Europe. //Hum Mutat 2003. V.21. P.345-356.

141. Zygulska M, Eigel A, Pietrzyk JJ, Horst J. Phenylketonuria in southern Poland: a new splice mutation in intron 9 at the PAH locus.// Hum Mutat 1994. V.4. P.297-299.

Информация о работе

Бреннер, Евгений Владиславович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы