Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная динамика элементов вторичной структуры и корреляции флуктуаций атомных групп в белках

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная динамика элементов вторичной структуры и корреляции флуктуаций атомных групп в белках"

На правах рукописи

Михайлюк Максим Григорьевич

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА ЭЛЕМЕНТОВ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ И КОРРЕЛЯЦИИ ФЛУКТУАЦИЙ АТОМНЫХ ГРУПП В

БЕЛКАХ

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2003

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор К.В. Шайтан.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Р.Г. Ефремов,

кандидат физико-математических наук В. А. Иванов.

Ведущая организация: Институт Математических Проблем Биологии РАН,

г. Пущино

Защита диссертации состоится _ ноября 2003г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете по адресу: 119992, г. Москва, Воробьёвы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_октября 2003г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

2 ооЗ-(\ [¿£12.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В течение последних десятилетий исследование динамики биополимеров привлекает большое внимание. Однако, в отличие от низкомолекулярных структур, в биополимерах взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами существенно сложнее. В настоящее время общепринято, что фундаментальные принципы функционирования биомакромолекул обусловлены также их динамическими свойствами. Пространственное строение молекул белков, наличие элементов вторичной структуры непосредственно сказывается на организации динамического поведения глобулы. Протяженные упругие элементы полипептидного каркаса организуют флуктуационную динамику белковой макромолекулы, что весьма важно для функциональной активности. В известном смысле молекулу белка можно представить как армированную каплю, состоящую из упругих элементов различной протяженности и формы, погруженных в плотную среду из боковых групп и молекул растворителя (К.В. Шайтан, А.Б. Рубин). Элементы этой конструкции испытывают ограниченное броуновское движение с параметрами, определяемыми константами жесткости упругого каркаса и микровязкостью внутрибелковой среды. Понимание физических принципов механического устройства белковых глобул и сходных наноструктур необходимо для развития технологии молекулярного конструирования и биоинженерии.

Динамические свойства белков исследуются многими современными физическими методами, такими как водородный обмен, метод спиновых меток, люминесценция, лазерная спектроскопия, рассеяние нейтронов, рассеяние синхротронного излучения, мессбауэровская спектроскопия, ЯМР, диффузное рассеяние рентгеновских лучей (ДРРЛ). Одним из важных инструментов исследования структуры и закономерностей конформационного поведения биологических макромолекул является метод молекулярной динамики (МД), позволяющий получать детальную информацию о процессах, происходящих в системе на уровне движений отдельных атомов. В его основе лежит расчет классических (ньютоновских) траекторий движения макромолекулы в фазовом пространстве координат и импульсов ее атомов. Этот метод очень быстро развивается вместе с прогрессом в компьютерных технологиях и становится все более популярным инструментом исследований для молекулярных биологов, биохимиков, биофизиков и представителей смежных специальностей. В настоящее время этот метод оказывается чрезвычайно полезным при постановке вычислительных экспериментов по сравнительному изучению динамических свойств белков при направленной вариации их структуры. Таким образом, использование метода молекулярной динамики для изучения временных корреляций, характеризующих динамику белков и фрагментов их вторичной и третичной структуры, а также пространственных корреляций, сопровождающих конформационные перестройки биомакромолекул при изменении внешних условий, актуально и необходимо для детального понимания процессов, происходящих в живых системах на молекулярном уровне. При этом самостоятельный интерес представляет задача обработки экспериментальных данных по рассеянию рентгеновского излучения с использованием результатов молекулярной динамики и применением фурье-преобразования к анализу экспериментальных кривых.

Целью работы является сравнительное исследование динамики элементов вторичной структуры в составе молекул белка и в виде изолированных молекулярных структур, изучение пространственных и временных корреляций атомных групп, характеризующих динамику биомакромолекул при изменении внешних условий, сравнительное изучение роли дисульфядных связей в конформационной подвижности белков, использование результатов молекулярной динамики для обработки данных ДРРЛ, а также разработка методов фурье-анализа данных ДРРЛ и соответствующего программного обеспечения для получения информации о динамике водно-белковых систем.

Для достижения этих целей необходимо было поставить и решить следующие основные задачи:

1. С помощью метода молекулярной динамики провести изучение динамики элементов вторичной структуры белка (а-спирапей и ß-слоев) в виртуальной вязкой среде и в составе молекул белков (барназа, лизоцим). Исследовать температурное плавление а-спирали.

2. Провести сравнение параметров изгибных флуктуации а-спиралей, получаемых при использовании в методе молекулярной динамики силовых полей amber84 и amber96, соответствующих тяжелоатомной и полноатомной модели белка.

3. С помощью метода молекулярной динамики провести вычислительный эксперимент по сравнительному изучению динамических свойств лизоцима при направленной вариации его структуры (разрушению дисульфидных связей).

4. Применить метод молекулярной динамики к обработке экспериментальных данных по ДРРЛ лнзоцимом с различными степенями гидратации.

5. С помощью метода фурье-анализа данных ДРРЛ изучить динамику пространственных корреляций в глобулярных и мембранных белках, при изменении внешних условий (степени гидратации).

6. Провести сравнительное изучение пространственных перестроек в глобулярных белках разного строения (миоглобин (а-белок), лизоцим ((оф)-белок)) и мембранных белках (белки РЦ пурпурных бактерий Rh. sphaeroides и Rps. viridis) при изменении степени гидратации.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование динамики элементов вторичной структуры белков (а-спиралей и ß-слоев) в составе молекул белка (лизоцим, барназа) и в виде изолированных молекулярных структур. Впервые исследована точность континуального приближения для а-спиралей и ß-структур.

Впервые проведен вычислительный эксперимент по сравнительному изучению динамических свойств лизоцима при направленной вариации его структуры (разрушению дисульфидных связей).

Впервые проведено сравнение параметров изгибных флуктуаций а-спиралей, получаемых при использовании в методе молекулярной динамики силовых полей amber84 и amber96, соответствующих тяжелоатомной и полноатомной модели белка.

Впервые применен метод молекулярной динамики к обработке экспериментальных данных по ДРРЛ лизоцимом с различными степенями гидратации.

Впервые с помощью метода фурье-анализа данных ДРРЛ изучена динамика пространственных корреляций в глобулярных и мембранных белках, при изменении внешних условий (степени гидратации).

Впервые проведено сравнительное изучение пространственных перестроек в глобулярных белках разного строения (миоглобин (а-белок), лизоцим ((а+Р)-белок)) и мембранных белках (белки РЦ пурпурных бактерий Rh. sphaeroides и Rps. viridis) при изменении степени гидратации.

Практическая ценность работы. Отработана МД технология изучения изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры белков и роли ковалентных сшивок в динамической организации глобул. Установление неоднородности и нелинейности упругих элементов вторичной структуры белков (а-спиралей и ß-слоев) имеет важное значение как для развития общей теории динамики биополимеров, так и для понимания взаимосвязи динамики и функций молекул.

Проведенное на примере лизоцима изучение роли дисульфидных связей в компактизации глобулы и динамическом поведении белка важно для понимания общих принципов влияния химических сшивок на структурно-динамическую организацию макромолекул.

Использование метода молекулярной динамики для обработки экспериментальных данных по диффузному рассеянию рентгеновских лучей позволяет получить данные по структурно-динамическим перестройкам в водно-белковых системах. Применение в

дальнейшем экспериментальных методов одновременно с расчетами молекулярной динамики приведет к получению новых сведений о конформационном поведении биологических макромолекул.

Разработанный метод фурье-анализа данных ДРРЛ и соответствующее программное обеспечение открывают новые перспективы в изучении динамики пространственных корреляций в глобулярных и мембранных белках, при изменении внешних условий (степени гидратации) и могут в дальнейшем использоваться для получения информации о динамике водно-белковых систем.

Апробапин работы. Результаты работы были представлены на II съезде биофизиков России (Москва, 1999), на VI, VII и VIII научных конференциях ИХФ РАН, (2000, 2001, 2002), на 4-th International Conference on Biological Physics (Kyoto, Japan,

2001), ICAME-2001 (Oxford, GB), на 1П съезде биохимического общества (С.-Петербург,

2002), International conference 'MOssbauer spectroscopy and its applications' (St.-Petersburg, 2002), V International congress on mathematical modeling, (Dubna, 2002). Работа также докладывалась на семинарах кафедры биофизики и кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ, а также кафедры дифференциальной геометрии и приложений Механико-математического факультета МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ и 1 принята в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа (101 страница) состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (152 ссылки), иллюстрирована 31 рисунком и содержит 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1, часть 1 представлен литературный обзор по методам молекулярной динамики и результатам компьютерного изучения динамики белков. Описываются вычислительные методы, использованные в данной работе, и осуществляется выбор оптимальных условий для расчёта динамики молекул. Приводится протокол расчетов молекулярной динамики. Численное моделирование динамики молекул проводилось с использованием программных комплексов молекулярно-динамических вычислений MoDyp 1.13 build la (Биологический факультет МГУ, http://www.moldyn.ru) и PUMA (ИМПБ РАН г. Пущине).

В главе 1. часть 2 содержится литературный обзор по использованию метода рассеяния рентгеновских лучей для изучения надатомной структуры веществ, содержащих атомы одного и нескольких типов. Описаны модели (метод субчастиц, метод шаров, метод кубиков и др.), используемые для получения информации о структуре биомакромолекул при прямой обработке данных ДРРЛ.

В главе 2 изучаются изгибные флуктуации элементов вторичной структуры белка (а-спиралей и р-слоев). Изложены модельные представления о тепловых флуктуациях элементов относительно жесткого a-спирального каркаса, основанные на континуальной модели с различными граничными условиями. Для свободной а-спирали, моделируемой упругим стержнем с подпертыми концами флуктуационный профиль определяется средним квадратом смещения Дх в каждой точке Z стержня (Шайтан К.В., Рубин А.Б., 1982):

<[Дx(Z,№ шА\ 1 - ехр(- yT))sm\*Z/L),

8 Ü V

где А = {—jkT--) 3 - средняя амплитуда флуктуации в центре стержня;

я ER

4ст}„ ,L.a ,

т = ——) - время релаксации изгибных флуктуаций. Здесь L - длина, R-2.3A -я Е R

радиус, Е - модуль Юнга, т|р - микровязкость среды, с - коэффициент трения для единицы длины стержня определяемый из гидродинамических соображений.

Задача об изгибных флуктуациях ß-структур рассматривается сходным образом (Шайтан К.В., Рубин А.Б., 1982): ß-слой моделируется пластиной толщиной 2h (h~lÁ). В случае прямоугольной пластины с ребрами длиной Li~L2~L и подпертыми краями получаем:

<[Ax(Z, у, t)]1 )»£2(1- ехр(- )) sin2 ) sin2 .

Для ß-слоя амплитуда флуктуации в центре пластины и время тр равны:

В работе, методами молекулярной динамики изучался профиль флуктуаций, а также влияние температуры на модуль Юнга, амплитуды флуктуаций и времена корреляции отклонения оси а-спирали от ее среднего положения. В качестве модельных объектов были взяты полилизин и полиглицин (PolyLys, PolyGly) в а-спиральной конформации (длина спирали L=44A), состоящие из 30 аминокислотных остатков, а также самая протяженная (Н) а-спираль миоглобина (L-35.5A), состоящая из 26 остатков 13 различных типов. Полилизин в отличие от полиглицина имеет достаточно объемные боковые радикалы и напоминает "щетку". В табл. 1 представлены результаты обработки траекторий этих полипептидов, рассчитанных при температурах 300К и 400К. N- и С-концы а-спиралей в данном случае фиксировались. Приведенные в табл.1 значения параметров соответствуют центральной части а-спирали. Видно, что при повышении температуры от 300К до 400К наблюдается уменьшение значений модуля Юнга и увеличение амплитуды смещения центральной части а-спирали относительно ее оси. При этом, как и следовало ожидать, большие значения модуля Юнга характерны для полилизина Е=9.4+1012эрг/см3 (для полиглицина Е=4.1*1012 эрг/см3). При 400К отклонение центра а-спирали от оси составляет ~1.1-1.2A для всех исследованных полипептидов, тогда как время корреляции этого отклонения существенно различается. Несколько парадоксальным выглядит увеличение характерного времени изгибных флуктуаций с повышением температуры. Это обусловлено, по-видимому, нелинейным изменением упругой энергии спирали при больших деформациях. На рис. 1 изображены амплитудные флуктуационные профили полипептидов для 300К и 400К соответственно. Следует отметить, что с повышением температуры профиль изгибных флуктуаций полиглицина не меняется, тогда как у полилизина и восьмой (Н) а-спирали миоглобина этот профиль существенно деформируется и становится ближе к профилю изгибных флуктуаций полиглицина. Амплитуды флуктуаций в N-концевой части а-спирали выше, чем в центральной и в С-концевой части. То есть N-концевой участок а-спирали более динамически лабилеп, чем центральный и С-концевой. Поэтому представления об а-спирали как об однородном упругом стержне (трубке) нуждаются в определенном пересмотре.

Далее рассматривалась динамика разворачивания а-спирали миоглобина (Н) с незакрепленными концами в виртуальной вязкой среде при повышении температуры. Молекулярно динамические траектории рассчитывались как в тяжелоатомном, так и в полноатомном приближениях. В табл. 2 приводится сравнение соответствующих параметров для центральной части а-спирали. Заметное плавление а-спирали в тяжелоатомной модели за время наблюдения 5нс происходит при температуре 500К. В полноатомной модели эта температура выше - 700К. Обращает внимание значительное замедление динамики флуктуаций в полноатомной модели, что обусловлено существенным увеличением "шероховатости" поверхности потенциальной энергии при явном включении в расчет атомов водорода. Парадоксальным кажется уменьшение модуля Юнга и увеличение амплитуд флуктуаций при добавлении атомов водорода. Это

\

указывает на значительную чувствительность отдельных динамических параметров полипептидов к вариациям параметров используемого силового поля даже в том случае, если равновесные характеристики макромолекулы остаются неизменными. Эти эффекты при наличии надежных экспериментальных данных об упругих характеристиках элементов вторичной структуры, по-видимому, могут быть использованы для уточнения силовых полей. Возможно также, что в полноатомной модели за разумные времена могут возникать более точные подстройки системы (с меньшей энергией) при движении в конфигурационном пространстве существенно большей размерности. Увеличение времен релаксации при приближении к точке плавления, по-видимому, также обусловлено сильной нелинейностью данной системы.

Таблица 1. Эффективные параметры изгибных флуктуация центральной части а-спиралей с

фиксированными концами (длина траектории — 5нс, столкновительный термостат).

ЗООК 400 К

А (А) Е (эрг/см*) та (пс) А (А) Е (эрг/см3} та (пс)

Полиглицин 0.9 4.1*10" 77 1.2 3.2*10 140

Полилизин 0.6 9.4*10" 69 1.1 4*101Z 202

Миоглобин (Н) 0.6 5*10" 55 1.1 1.9*10" 301

Рисунок 1. Амплитудные флуктуациоиные профили a-спиралей при температуре 300К (слева) и 400К (справа) (-•- -полилизин, —"— -a-спираль миоглобина (Н), -+— -полиглииин). Концы спиралей закреплены.

Как известно, в a-спиральной конформации заданы определенные значения торсионных углов ф и у. Детали процесса плавления a-спирали можно увидеть на картах двухмерных распределений по углам q> и \|» плотности вероятности нахождения системы в соответствующей части конфигурационного пространства. На рис. 2 представлены соответствующие карты для N- и С-концевой части в-спирали (Н) миоглобина при температурах 300К, 600К и 700К (расчет проводился для спиралей со свободными концами). Видно, что уже при температуре ЗООК выбранные пары углов значительное время проводят в области, отвечающей Р-конформации. Вклад этой области с повышением температуры быстро растет. При 600К аминокислотные остатки А1а2 и Leu26 практически все время находятся в состоянии, соответствующей р-конформации. На рис. 3 на примере аминокислотных остатков Gln5 и Leu 12 из центральной части а-спирали (Н) миоглобина показан переход из чисто a-спиральной конформации при температуре ЗООК в а/р-конформацию при повышении температуры до 700К. Следует отметить, что при ЗООК вероятность нахождения в конформации a-спирали превышает 50% для 20 аминокислот, при 600К таких аминокислот - 18, а при 700К таких

аминокислот только 12. При этом визуально полипептид практически уже не находится в конформации а-спирали (т.е. наступает момент плавления). Надо сказать, что плавление а-спирали начинается с N-конца. Так при 600К 4 аминокислоты с N-конца находились в состоянии расплавленной а-спирали, а с С-конца - 1. Соответствующие цифры для 700К составляют 7 и 3, то есть 2 витка а-спирали с N-конца и 1 виток с С-конца. Этот результат находится в хорошем согласии с приведенными выше данными по увеличению амплитуды флуктуаций в большей степени у N-концевой части а-спирали.

Таблица 2. Сравнение тяжелоатомной и полноатомной моделей а-спирали миоглобнна (Н) с незакрепленными концами (длина траектории - 5нс, столкновительиый термостат)._

Миоглобиновая а-спираль (тяжелоатомная модель) Миоглобиновая а-спираль (полноатомная модель)

Т (К) А (А) Е (эрг/см3) Та (пс) Т (К) А (А) Е (эрг/см3) То (пс)

300 0.97 1.9*10 192 300 1.7 0.58*10" 294

400 1.19 1.6*10" 90.6 600 1.6 0.54*10" 318

500 1.44 1.4*10" 263 700 2.9 0.49*10" 446

Рисунок 2. Карты плотности вероятности нахождения системы в конфигурационном пространстве для торсионных углов <р и <|/ аминокислотных остатков А1а2 и Len26 с N- и С-концсвой части а-спирали (Н) миоглобнна при температурах 300, 600 и 700К соответственно. Стрелками показаны области, соответствующие конформации а-спирали н ft-слоя. Сплошной линией ограничена область, обычно изображаемая на картах Рамачандрана.

Процесс плавления а-спирали зависит от качественного аминокислотного состава полипептидной цепи. В случае а-спирали (Н) миоглобнна присутствие двух аминокислот Gly через 1,5 витка ускоряет процесс плавления с N-конца, а наличие аминокислот Arg и пары Ala-Lys в центральной части создает дополнительные очаги разрушения а-спирали. Отметим, что процесс плавления для тяжелоатомной модели а-спирали практически повторяет аналогичные стадии плавления в полноатомной модели. Проводилось также изучение влияния условий закрепления концов а-спирали на ее динамику. Для этого, в дополнение к моделям с жесткой фиксацией концов а-спирали и а-спирали с незакрепленными концами, рассматривался случай, когда концы миоглобиновой а-спирали (Н) в полноатомной модели были соединены с массивными частицами, масса каждой из которых составляла 1кДа (порядка 1/3 от массы всей спирали). При этом динамическое поведение в целом для всех трех случаев не менялось. Модуль Юнга,

амплитуда и характерное время флуктуаций оставались практически без изменения как для а-спирали с незакрепленными концами, так и для а-спирали с дополнительными массивными частицами. В то же время для а-спирали с фиксированными концами модуль Юнга был больше в 2.5 раза, а амплитуда и характерное время флуктуаций меньше в 1.5 и 3 раза соответственно, чем параметры, полученные в двух других случаях.

Рисунок 3. Карты плотности вероятности нахождения системы в конфигурационном пространстве для торсионных углов ф и ф аминокислотных остатков Gln5 и Leul2 из центральной части а-спирали (Н) многлобнна при температурах 300, 600 и 700К соответственно. Стрелками показаны области, соответствующие конформацни а-спирали и р-слоя. Сплошной линией ограничена область, обычно изображаемая на картах Рамачандрана.

Для изучения динамических свойств р-слоя в качестве объекта был выбран участок размером 25.6х23А протяженного Р-листа в белке GFP (1F0B). р-слой содержал 6 антипараллельных р-цепей и состоял из 100 аминокислот. Динамика Р-слоя изучалась в полноатомной модели при температуре 300К. Длина траектории составляла 5нс. Влияние растворителя моделировалось виртуальной вязкой средой с теми же параметрами, что и при изучении динамики а-спирали. Периметр Р-слоя не закреплялся. Как было показано выше, фиксация элементов вторичной структуры придает им дополнительную жесткость, но принципиально не меняет их динамического поведения. В центре р-слоя эффективные динамические параметры изгибных флуктуаций имели следующие величины: B=0.75Á, те =220пс. В рамках континуальной модели это соответствует модулю Юнга: Е=7.5*10| эрг/см3. Таким образом, упругие характеристики Р-слоя практически те же, что и у а-спирали. На рис. 4 изображен амплитудный флуктуационный профиль Р-слоя.

Для изучения динамики а-спирали и р-слоя внутри молекулы белка был выбран а+Р-белок барпаза (1BNI), состоящий из 108 аминокислот. Длина молекулярно динамической траектории белка, исследовавшегося в полноатомном приближении, составляла 10нс. Влияние растворителя моделировалось виртуальной вязкой средой, температура термостата была равна ЗООК. В табл. 3 представлены значения параметров, соответствующих центральной части а-спирали (1а) (13 аминокислот, длина 15.5Á) и Р-слоя (4 антипараллельные р-цепи, размер 8.5xl3Á). Для удобства сравнения приведены также параметры, полученные в результате обработки молекулярно динамической траектории свободной а-спирали (1а), вырезанной из барназы.

Рисунок 4. Амплитудный флуктуационный профиль р-слоя, вырезанного из белка СП". Края р-слоя выровнены вдоль оси 12.

Рисунок 5. Автокорреляционные функции, характеризующие отклонения от среднего значения центральной части оси а-спирали (1а) и р-слоя в барназе и свободной а-спирали (1а) (о- - а-спираль (1а) в барназе, -х- -р-слой в барназе, -*- -свободная а-спираль (1а) ).

Из табл. 3 видно, что эффективная жесткость погруженной в белок а-спирали примерно на 20% выше, чем у р-слоя в сходных условиях и в 3 раза выше, чем у свободной а-спирали. Амплитуда флуктуаций элементов вторичной структуры в белке примерно в 2 раза меньше, чем у свободной а-спирали. Это обусловлено окружением, которое не дает совершать относительно быстрые движения с большей амплитудой.

На рис. 5 приведены соответствующие автокорреляционные функции, характеризующие отклонения от оси центральной части а-спирали (1а) и р-слоя в барназе и свободной а-спирали (1а). Здесь также видно, что элементы вторичной структуры в белке ведут себя как существенно более жесткие структуры со значительно меньшими временами релаксации, чем аналогичные свободные элементы.

Таблица 3. Эффективные параметры изгибных флуктуаций центральной части а-спирали (1а) и р-

Барназа А (А) Е (эрг/см^) т0 (пс)

а-спираль 0.29 1.8*10" 16.4

Р-слой 0.31 1.35*10" 20.1

а-спираль (свободная) 0.48 0.65*10" 42

Таким образом, элементы вторичной структуры являются существенно неоднородными и нелинейными упругими элементами. Эффективный модуль Юнга а-спирали и р-слоя достигает максимума в центре и заметно снижается у концевых участков. Особенно это существенно у N-конца a-спирапи. Динамическая структура а-спирали напоминает скорее пружину, у которой на концах витки растянуты и ослаблены. За счет этого максимумы амплитуды изгибных флуктуаций а-спирали наблюдаются в окрестности первой и последней четверти ее длины. Эффективное плавление а-спирали начинается с N-конца. В вакууме, при температуре 700К на временах порядка 5нс свыше половины аминокислотных остатков, по крайней мере, половину расчетного времени находятся в других возможных конформациях.

Модули Юнга свободной а-спирали и свободного р-слоя, рассчитанные в полноатомном приближении, составляют Е=б-8*10" эрг/см3. В составе молекулы белка модули Юнга а-спирали и Р-слоя оказываются в 1.5-2 раза выше. Из-за стерических ограничений при флуктуациях этих элементов в структуре белка имеется заметное различие в амплитудах по сравнению с вырезанными из молекулы белка свободными

элементами вторичной структуры. Так амплитуды флуктуаций свободной а-спирали и той же а-спирали в составе барназы различаются в 1.7 раза.

Вариации параметров потенциального поля при переходе от полноатомной к тяжелоатомной модели существенно сказываются на величине модуля Юнга и амплитуде изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры. Это указывает на чувствительность этих динамических параметров к деталям описания силового поля и может быть, по-видимому, использовано в дальнейшем для уточнения силовых параметров.

В главе 3 методами молекулярной динамики ставится вычислительный эксперимент для изучения влияния дисульфидных мостиков на кояформациониую подвижность лизоцима. Отметим, что проведение подобного биохимического эксперимента практически невозможно в силу нестабильности молекулы лизоцима, лишенной дисульфидных связей. Вместе с тем, такой вычислительный эксперимент необходим для понимания общей картины динамического устройства глобулы и, в частности, для интерпретации имеющихся существенных различий в величинах среднего квадрата смещения атомных групп <ДзГ>, которые наблюдаются в экспериментах по РРМИ для лизоцима и, например, миоглобина, не содержащего дисульфидных связей. В работе методами молекулярной динамики были получены траектории для двух вариантов лизоцима: нативного (с Б-Б-связями) и модифицированного (без Б-Б-связей).

В работе были проводены сравнение и обработка корреляционных функций, характеризующих изгибные флуктуации самых длинных а-спиралей лизоцима 1а (10 аминокислот); За (12 аминокислот); 5а (11 аминокислот). Если следить за отклонением центральной части а-спиралей от ее оси, то следует отметить, что амплитудные характеристики практически не меняются для обоих вариантов лизоцима, но меняются характерные времена. В лизоциме с разрушенными Б-Б-связями характерные времена изгибных флуктуаций а-спиралей За и 5а увеличиваются приблизительно в 2-3 раза. Интересно, что две из четырех дисульфидных связей лизоцима соединены с центральной частью именно этих а-спиралей. У 1 а-спирали Б-Б-связь приходится наМ-концевую часть, и для этой спирали динамические характеристики для двух обсуждаемых вариантов молекулы лизоцима практически не менялись. На рис. 6 в качестве примера показаны автокорреляционные функции отклонения центральной части За-спирали от ее оси. В табл. 4 приведены результаты обработки этих автокорреляционных функций для трех а-спиралей из большого домена. Обработка проводилась в континуальной модели, в которой а-спираль моделируется упругим стержнем с подпертыми концами. Отметим, что значения эффективного модуля Юнга для двух а-спиралей увеличились при разрушении Б-Б-связей, что свидетельствует об общем повышении жесткости белковой конструкции.

В случае отсутствия Б-Б-связи анализ кросскорреляционных функций для отклонений центральной части а-спиралей от их осей обнаруживает появление заметных корреляций с длительными временами релаксации ~400-700пс для спиралей 1а и За, а также 5а и За. В большом домене лизоцима с дисульфидными связями взаимная корреляция между а-спиралями сохраняется на временах до ~50пс. Иными словами, флуктуации а-спиралей относительно друг друга в большом домене лизоцима при наличии Б-Б-связей становятся независимыми существенно быстрее, за времена порядка десятков пикосекунд. Сходная картина наблюдается и для кросскорреляционных функций изгибных флуктуаций а-спиралей 4а и За с Р-слоем из малого домена. То есть, как это ни парадоксально, наличие дисульфидных связей разрыхляет белковую глобулу и делает флуктуации отдельных элементов структуры более независимыми. Можно сказать, что дисульфидные связи одновременно и скрепляют участки молекулы и удерживают их от излишнего сближения, выполняя функцию "распорок". При разрыве Б-Б-связей происходит нарушение функционально значимой конформации лизоцима и элементы вторичной структуры в большей степени "наезжают" друг на друга при движении.

Таблица 4. Результаты обработки автокорреляционных функций отклонения центральной части а-

спяраля от ее оси для а-спиралей из большого домена лизоцима.

Лизоцим (св-в-связями) (а-спирали) А (А) Е (эрг/см3) Ч (пс) Лизоцим (без в-З-связей) (а-спирали) А (А) Е (эрг/см3) г« (пс)

1а 0.17 1.5*10" 4 1а 0.16 1.66*10" 3.4

За 0.15 1.9*10" 3.2 За 0.16 1.66*10" 9.1

5а 0.22 0.9*10" 23 5а 0.18 1.3*10" 43

____I 1

к 1

г 0011 к Я

•000$

Рисунок б. Автокорреляционные функции отклонения центральной части а-спирали (За) от ее оси для двух вариантов лизоцима (более медленное затухание (жирная линия) - лизоцим без Б-в-связей).

отклонений от средних расстояний между С, атомами аминокислотных остатков Аг^21-Ьуз11б и Ап*21-А]р101 из большого домена для двух вариантов лизоцима (жирная линия - лизоцим без в-Б-связей).

Чувствительность элементов структуры к взаимным движениям в молекуле лизоцима с Б-в-связями и без них можно оценить также при изучении кросскорреляционных функций отклонений от средних расстояний между Са-атомами аминокислотных остатков, находящихся в вершинах петель большого и малого домена. Следует отметить, что за времена ~50пс наблюдается быстрое исчезновение взаимных корреляций в присутствии дисульфидных связей между аминокислотными остатками Агд21-Ъуз116 и А^21-Азр101 из большого домена (рис. 7). В случае лизоцима без связей наблюдается рост устойчивой корреляции между движениями этих петель на временном интервале ~800пс. Аналогичная ситуация наблюдается для взаимных корреляций отклонений от средних расстояний между петлями большого и малого домена, т.е. между аминокислотными остатками Лзр48-А8р101 и 01у71-АзрЮ1. Этот факт подтверждает вывод о том, что в отсутствие дисульфидных связей нарушается взаимное расположение элементов вторичной и третичной структуры (большого и малого доменов) лизоцима. Это должно вести к искажению нативной конформации молекулы и в итоге к нарушению ее функции.

В табл. 5 представлены результаты обработки автокорреляционных функций отклонений от средних расстояний между боковыми радикалами аминокислотных остатков Тгр62-Тгр63 и 01и35-Азр52, участвующих в процессе взаимодействия лизоцима с субстратом. Следует отметить, что при разрушении Б-Б-связей, прежде всего, увеличиваются времена корреляции отклонений от средних расстояний между этими аминокислотными остатками (в 7-12 раз), а для остатков Тгр62-Тгр63 и величины отклонений от средних расстояний (в 1.5 раза), что также обусловлено существенным изменением формы и размера молекулы.

Таблица 5. Результаты обработки автокорреляционных функций отклонений от средних расстояний между боковыми радикалами аминокислотных остатков, участвующих в процессе взаимодействия

Лизоцим (с З-Э-связями) А (А) тДпс) Лизоцим (без Б-Э-связей) А (А) Та(пс)

Тгрб2-Тгр63 0.35 3.7 Тгр62-Тгр63 0.5 51.5

аи35-Азр52 0.28 17.3 01и35-Авр52 0.29 98.7

Таблица б. Результаты сравнения трех структур лизоцима. Хт, Ут, 2т - максимальные размеры при ориентации вдоль соответствующих осей координат, V - объем молекулы, А1, А2 - коэффициенты анизотропии структуры, <Нс'ш1п> - среднее минимальное расстояние между Са-атомами в молекуле, И - радиус инерции, [Чс<1 - число контактов между Са-атомами молекулы, при расстояниях между этими атомами меньших 14.23А._

Хт (А) Ут (А) 2т (А) V (А3) А1 А2 <11согшп> (А) Ш (А) Иса

Лизоцим (рентген, структура) 37.14 34.43 43.64 21928 0.172 0.035 3.8 14.07 2712

Лизоцим (структура с в-в-связями) 37.16 33.54 44.77 22038 0.235 0.055 3.88 14.23 2602

Лизоцим (структура без в-в-связей) 39.48 31.52 38.49 21609 0.205 0.004 3.88 13.95 2746

Рисунок 8. Кросскорреляционные функции между отклонением центральной части а-спирали (5а) от ее оси и поворотом вокруг торсионного угла х в аминокислотном остатке ТгрбЗ для двух вариантов лизоцима (жирная линия-лизоцнм без в-в-связей).

Рисунок 9. Карты контактов для двух вариантов лизоцима: с оисульфидными мостиками (точки) к без них (кружки). Учитываются Са-атомы с взаимными расстояниями меньше 14.23А. По осям обозначены номера аминокислотных остатков. Стрелками обозначены новые области на карте контактов, появляющиеся для лизоцима без связей.

Конформация "щели" между большим и малым доменом лизоцима непосредственно связана с наличием дисульфидных связей. При разрушении дисульфидных связей сильно меняется характер кросскорреляций между изгибными флуктуалиями спирали 5а и поворотом вокруг торсионного угла % в аминокислотных остатках ТгрбЗ (рис. 8) и АврЮ!, участвующих в ферментативной реакции.

Путем усреднения по траекториям были получены две структуры лизоцима: с дисульфидными мостиками и без них. Далее было проведено сравнение этих структур и стартовой структуры, определяемой данными ренттеноструктурного анализа. Часть результатов представлена в табл. б. В отсутствии Б-Б-связей меняется форма молекулы

лизоцима (главной осью становится не Z, а X) и ее размеры (объем молекулы уменьшается примерно на 2% по сравнению с не модифицированной и на 1.5% по сравнению со стартовой структурой молекулы). Отметим, что различия по этим же параметрам между стартовой структурой лизоцима с S-S-связями и усредненной по траектории составляют примерно 0.5%. Следует отметить, что минимальные расстояния между Са-атомами в молекуле лизоцима, определяемые рентгеноструктурными данными (193L), в среднем, на 0.08Ä меньше, чем соответствующие расстояния в обеих структурах, получаемые из траекторий молекулярной динамики. То есть аминокислотные остатки в структуре лизоцима по данным рентгеноструктурного анализа оказываются сближены. Введение в явном виде атомов водорода в тяжелоатомную структуру молекулы приводит к достаточно быстрой ее релаксации (за десятки пикосекунд). Вследствие того, что аминокислотные остатки в стартовой структуре сближены, количество контактов между Са-атомами (при одинаковых пространственных размерах) должно увеличиваться по сравнению со структурой лизоцима с дисульфидными мостиками усредненной по результатам МД, что, и наблюдается в табл.6. Вычислялось число контактов между Са-атомами, для которых расстояние составляло менее 14.23Ä (радиуса инерции лизоцима с дисульфидными связями). Без дисульфидаых связей количество таких контактов возрастает, что согласуется с выводом об уменьшении объема молекулы (при сохранении минимальных расстояний между Са-атомами). Наибольшим-значением радиуса инерции характеризуется лизоцим с S-S-связями, а наименьшим - без дисульфидных связей. Коэффициент анизотропии Al, демонстрирующий отклонение от сферической формы, минимален для молекулы лизоцима, определяемой рентгеноструктурными данными, а коэффициент анизотропии А2, демонстрирующий отклонение от цилиндрической формы, минимален для лизоцима без S-S-связей. Средний квадрат смещения <&хг> Са-атомов между стартовой структурой лизоцима и структурой лизоцима с S-S-связями, определяемый после совмещения этих структур, составляет 1.39Ä2, тогда как аналогичный <ДхЬ» после совмещения молекул с дисульфидными связями и без них -1.75А1

Совмещение карт контактов (изображений всех областей молекулы, для которых расстояния между Са-атомами будут меньше некоего выбранного R=14.23Ä (радиус инерции лизоцима с S-S-связями)) для двух вариантов лизоцима с дисульфидными мостиками и без них (рис. 9) демонстрирует появление новых областей на карте контактов для лизоцима без S-S-связей. Имеет место сближение следующих групп аминокислотных остатков: 43-48 (петля в малом домене) и 109-114 (7а-спираль в большом домене), 63-65 (петля в малом домене) и 109-114 (7а-спираль в большом домене), 80-85 (4а-спираль в малом домене) и 106-108 (петля в большом домене). Это говорит о сближении большого и малого доменов в лизоциме без дисульфидных связей и о нарушении конфигурации "щели" между доменами.

На основе анализа авто- и кросскорреляционных функций изгибных флуктуаций а-спиралей в большом домене лизоцима можно сделать вывод, что меньшие значения величины среднего квадрата смещения <х2> для лизоцима (по сравнению с а-спиральным глобулярным белком миоглобином), определяются прежде всего архитектурой строения молекулы лизоцима (a+ß-белок) в силу большей эффективной жесткости ß-слоя, а не наличием дисульфидных связей. Амплитуды флуктуаций элементов вторичной струкгуры лизоцима практически не меняются при разрушении дисульфидных связей. В большом домене лизоцима с S-S-связями a-спирали очень быстро (за времена порядка десятков пикосекунд) теряют взаимную динамическую корреляцию и в дальнейшем их движения происходят независимо. В лизоциме, в отсутствие дисульфидных связей, сильно (в 3-7 раз) увеличиваются характерные времена движений элементов вторичной структуры, и практически исчезает "щель" между большим и малым доменом, что должно драматическим образом сказаться на функции белка. Анализ авто- и кросскорреляционных функций отклонений от средних расстояний между боковыми

радикалами аминокислотных остатков, участвующих в процессе взаимодействия лизоцима с субстратом подтверждает вывод о значительном нарушении функционально значимой конформации "щели" между большим и малым доменом лизоцима в отсутствие дисульфидных связей.

Сравнение пространственных характеристик лизоцима с дисульфидвыми связями и без них и структуры лизоцима, определяемой рентгеноструктурными данными, показало, что рентгеноструктурные координаты тяжелых атомов задают напряженную конформавдпо молекулы в системе потенциалов amber 96. После добавления водородов эта конформация быстро релаксирует (за времена порядка десятков пикосекунд).

В лизоциме за счет S-S-связей обеспечивается больший объем молекулы, который задает больший радиус инерции (14.23Ä) по сравнению с молекулой без дисульфидных связей (13.95Ä). В отсутствие S-S-связей примерно на 2% уменьшается объем молекулы, прежде всего за счет "щели" между большим и малым доменом лизоцима. Можно сказать, что S-S-связи не только "скрепляют" элементы вторичной структуры белка за счет ковалентных связей, но и играют роль "распорок", поддерживая постоянным объем молекулы, необходимый для осуществления ее функций.

В главе 4 разрабатывается метод определения функции радиального распределения атомов с помощью интегрального Фурье-преобразования данных интенсивности ДРРЛ. Изучение небольших изменений структуры, влияющих на динамические свойства и функциональную активность, таких сложных систем, как белки (миоглобин, лизоцим, белки реакционного центра (РЦ) пурпурных бактерий и т.п.), с помощью фурье-анализа ранее практически не проводилось. Это связано, прежде всего, с существенной неупорядоченностью структуры этих систем, что, в свою очередь, затрудняет получение функции радиального распределения для многоатомного случая. В работе показано, что решение этой задачи в одноатомном (моноатомном) приближении дает хорошие результаты и позволяет улавливать небольшие изменения структуры (около 0.1Á), что практически невозможно в обычном рентгеноструктурном анализе. Основанием для применения моноатомного приближения является преобладание вклада в интенсивность рассеяния от биообъектов атомов С, N и О, для которых близки как угловые зависимости, так и интенсивности атомных формфакторов рассеяния.

В работе разработана методика определения функции радиального распределения с помощью Фурье-преобразования экспериментально измеренной интенсивности диффузного рентгеновского рассеяния. Разработанный алгоритм и программное обеспечение следуют логике статей (J.Krogh-Moe, 1956; R.Kaplow, S.Strong, BAverbach, 1965). Обработка экспериментальных данных интенсивности ДРРЛ проводится в несколько этапов. Вначале учитываются поправки на абсорбцию и поляризацию и получаются скорректированные значения интенсивности (/сотг). Далее рассчитываются интенсивности когерентного (1сы,) и некогерентного (комтоновского) (/¡пс) рассеяния:

Здесь X,] - стехиометрический коэффициент, отвечающий количеству атомов типа I в одной молекуле, О,- волновой вектор, Р,(0) - комптоновский фактор рассеяния от атома типа 1,/) - атомный фактор рассеяния, а Я(в) - поправочный множитель Брейта-Дирака, связанный с релятивистской формой волнового уравнения:

N

II

ijQ)=ыв)=z.xj.4e)-

»i

/=i

Я(0) =

1

з •

На следующем этапе производится нормировка экспериментальных данных, получаемых в опытах по ДРРЛ в условных единицах, на рассеяние от одной молекулы. В результате

мы получаем-значение интенсивности рентгеновского рассеяния в электронных единицах на молекулу:

/г(0)=«г.,(0-ие).

где а - нормировочная константа, определяемая по следующей формуле:

-2л-2—=а! о2 -°Т ез (1+. к I /«,(0) I 1сЛО)

Здесь V- объем исследуемого образца, <2тах - максимальное значение волнового вектора в эксперименте. Далее проводится Фурье-преобразование нормированной интенсивности рентгеновского рассеяния ¡(0) и находится функция радиального распределения атомов в виде 4яг(р(г) - р0) с использованием формулы: 2 г *

4пгг(р(г)—ра) — — \QiiQ)З'пО^^О. . где г - расстояние между атомами. П о

Особый интерес методика фурье-анализа данных ДРРЛ в моноатомном приближении представляет при изучении перестроек в структуре биомакромолекул, происходящих при изменении параметра, влияющего на динамику системы (температуры, вязкости, степени гидратации и т.п.). В наших экспериментах на белках в качестве такого параметра была взята степень гидратации. Надо сказать, что первый максимум функции радиального распределения, соответствующий расстоянию до ближайших соседних атомов (или первой координационной сфере), четко коррелирует со средней длиной ковалентной связи в биомакромолекулах. На эту величину перестройки в структуре белков практически не оказывают влияния. В процессе наших экспериментов мы отслеживаем относительные изменения, происходящие со следующими за первым четырьмя максимумами (или пиками) функции радиального распределения и соответственно нумеруем их, то есть второй будем называть "первым" и т.д. При этом важно отметить, что эти максимумы связаны, прежде всего, с соответствующими координационными сферами, т.е. с расстояниями от любого выбранного неводородного атома до неводородных атомов 1-го, 2-го, 3-го и т.д. порядков в структуре белка, так как вклад водородных атомов в интенсивность рентгеновского рассеяния пренебрежимо мал.

Методика фурье-анализа данных ДРРЛ была применена для исследования глобулярных и мембранных белков. В качестве глобулярных белков были взяты миоглобин и лизоцим. Ранее уже проводилось изучение структуры этих белков при помощи диффузного рассеяния рентгеновских лучей. Однако при этом в основном применялись прямые методы обработки интенсивности рентгеновского рассеяния, такие как "метод шаров" и "метод кубиков". При этом белки изучались только в растворе, и не исследовались изменения в структуре, происходящие при последовательном повышении степени гидратации. Важно также, что эти глобулярпые белки имеют различную структурную организацию: миоглобин - а-белок, имеющий в качестве элементов вторичной структуры только а-спирали, лизоцим - (а+Р)-белок, в котором а-спирали и Р-структуры не чередуются, а скорее группируются с себе подобными так, что часть молекулы приобретает пространственную укладку а-спирального типа, другая - р-типа.

Вышеописанная методика позволила обнаружить четкую корреляцию между сдвигом "первого" максимума функции радиального распределения (или ослаблением внутриглобулярных водородных связей) и возрастанием внутримолекулярной подвижности как в миоглобине (рис. 10а), так и в лизоциме (рис. 106). В случае миоглобина "первый" пик плавно сдвигается во всем диапазоне степеней гидратации от 2.4А (степень гидратации А=0.05(г(Н20)/г(белка))) до 2.9А (степень гидратации й=0.89). В случае лизоцима данный пик сдвигается от 2.5А (й=0.05) до 2.9А (й=0.45). При дальнейшей гидратации лизоцима положение "первого" максимума не изменяется.

Рисунок 10. Функции радиального распределения порошковых образцов с различными степенями гидратации: (а) миоглобина (-•- - А=0.05, сплошная линия - А-ЮЛ7, точки - А=0.89), (б) лизоцима (-+- -А=0.05, -о- -А =0.45, сплошная линия - А=1.0). Стрелками указаны положения соответствующих пиков на функции радиального распределения.

Надо отметить, что для обоих белков в функционально активном (гидратированном, Л>0.45) состоянии положение "первого" максимума достигает предельного значения в 2.9А. При этом, с повышением гидратации, растет интенсивность этого максимума. "Второй" пик не меняет своего положения (в случае лизоцима пик лежит при 4.6А) или слабо сдвигается в сторону меньших значений от 4.8А до 4.6А (при й=0.37) в случае миоглобина (рис. 10(а) и (б)). Неоднородное уширение данного пика для обоих белков сильно уменьшается с повышением гидратации. Мы связываем это явление с упорядочением структуры глобулы при гидратации. На этих же рисунках хорошо заметно постепенное формирование "третьего" максимума при повышении степени гидратации. "Третий" пик у обоих белков с добавлением воды быстро сдвигается в сторону меньших значений и стабилизируется около 6.7А, при этом также уменьшается его неоднородное уширение. Этот факт существенно отличает вид функций радиального распределения для водно-белковых систем и чистой воды. Видно, что поведение "четвертого" максимума при повышении гидратации в целом похоже на поведение "третьего", однако он окончательно стабилизируется при значениях 9.0А (миоглобин) и 9.3А (лизоцим). "Третий" и "четвертый" пики, по-видимому, отвечают за формирование гидрофобного ядра и дальних взаимодействий между элементами вторичной структуры соответственно. Различие в окончательных положениях "четвертого" максимума для лизоцима ((а+|3)-белок) и миоглобина (а-белок) можно объяснить разной третичной структурой, которая обусловлена функциональными особенностями этих белков и в случае миоглобина позволяет сформировать более компактную упаковку элементов вторичной структуры при добавлении воды.

Результаты изучения функции радиального распределения, полученной с помощью Фурье-преобразования на основании данных по диффузному рассеянию рентгеновских лучей, позволяют сделать вывод о том, что вода, в процессе гидратации белка, ослабляет внутриглобулярные водородные связи и разрыхляет белок, что приводит к увеличению внутримолекулярной подвижности. Данная методика позволила обнаружить четкую корреляцию между сдвигом "первого" максимума интенсивности рассеяния, ослаблением внутриглобулярных водородных связей, возрастанием внутримолекулярной подвижности, как в лизоциме, так и в миоглобине и появлением заметной функциональной активности. Эти результаты хорошо коррелируют с другими экспериментальными данными по увеличению теплоемкости лизоцима, изменению диамагнитной восприимчивости, времени вращательной релаксации ЭПР метки и т.д. Действие воды приводит также и к упорядочению макромолекулы, которая переходит в функционально-активное состояние при й=0.4-0.7.

Методика фурье-анализа данных ДРРЛ была применена также для исследования мембранных белков. Выбор в качестве объекта исследования РЦ Як ¡рИаего1(1ез позволил изучить вклад в функцию радиального распределения белков разных типов (Ь+М-субъединицы РЦ - а-белки, имеющие в качестве элементов вторичной структуры только а-спирали, Н-субъединица РЦ - (а+р)-белок). Ранее изменения в структуре этих белков, сопутствующие повышению гидратации, при помощи ДРРЛ не изучались.

Рисунок 11. Функции радиального распределения порошковых образцов с различными степенями гидратации: (а) РЦ (Ь+М-субъсдинииы) (о -А=0.05, * -А-0.27, точки -А=1.4б), (б) РЦ (Н-субъединииа) (-о- —АИ).05, -А=0.24, сплошная линия - А-0.51).

На рис. 11 изображены функции радиального распределения для разных степеней гидратации образцов Ь+М-субъединиц и Н-субъединицы РЦ. Хорошо заметно, что в обоих случаях поведение "первого" максимума, связанного с ослаблением водородных связей и возрастанием внутримолекулярной подвижности, в целом имеет сходную с наблюдавшейся для глобулярных белков миоглобина и лизоцима картину. Для белков РЦ в функционально активном (гидратированном, АгО.27) состоянии положение "первого" максимума достигает предельного значения в 2.9А. "Второй" максимум также как в случае глобулярных белков достаточно быстро с повышением степени гидратации стабилизируется при значении 4.6А. Однако он имеет характерное отличие от глобулярных белков в дегидратированном состоянии в виде "плеча", которое затем формирует "третий" пик. Этот пик постепенно начинает смещаться в сторону больших значений (в противоположность глобулярным белкам) до б.З-^бЛА. При этом уменьшается неоднородное уширение "второго" и "третьего" максимумов, что говорит об упорядочении структуры белкового комплекса РЦ. Поведение "четвертого" пика в основном оказывается сходным для мембранных и глобулярных белков, хотя его положение стабилизируется при заметно меньших значениях 7.9-!-8.0А. Все эти результаты говорят о том, что пространственная упаковка в мембранных белках гораздо более плотная, чем в глобулярных, что, безусловно, связано с отличиями в формировании активного центра в гидрофобной и гидрофильной среде.

Сравнивая между собой функции радиального распределения 1>М-субьединиц РЦ и Н-субъединицы РЦ, можно сказать, что с повышением степени гидрагации быстрее стабилизируется Н-субъединица (при /¡=0.24), чем Ь+М-субъединицы (при /¡>0.4). Это, по-видимому, связано как с различиями в структуре (а-белки и (а+Р)-белок)), так и с особенностями расположения РЦ в мембране. Известно, что Ь+М-субъединицы представляют собой пучок параллельных а-спиралей, полностью находящихся внутри мембраны, тогда как Н-субъединица частично экспонирована в цитоплазму, а частично заякорена в мембране. Следствием этого может быть то, что при гидратации отдельные элементы РЦ, выделенные из мембраны, по-разному реагируют на добавление воды, а значит, и с разной скоростью формируют компактную стабильную структуру.

Для выяснения этого были получены данные ДРРЛ на образцах РЦ пурпурных бактерий Rps. viridis. Эти образцы содержали все субъединицы РЦ вместе с цитохромом с, который расположен с наружной стороны фотосинтетической мембраны и непосредственно взаимодействует с бактериальной фотосинтетической системой, принимая участие в восстановлении первичного донора электрона. Этот белковый комплекс РЦ аналогичен РЦ Rh. sphaeroides, но последний выделяется без цитохромома с. На рис. 12а изображены функции радиального распределения для разных степеней гидратации на образцах РЦ вместе с цитохромом с. Прекрасно видно, что белковый комплекс РЦ стабилизируется, т.е. переходит в функционально активное состояние, начиная со степени гидратации А=0.21. Характер изменений функции радиального распределения при повышении гидратации практически повторяет тот, что мы наблюдали для РЦ Rh. sphaeroides (L+M-субъединиц и Н-субъединицы). Заметно, что у "второго" максимума также имеется "плечо", которое затем образует "третий" пик. При этом формируется компактная структура. Быстрый переход белкового комплекса РЦ в стабильное состояние при добавлении сравнительно небольшого количества воды обусловлен тем, что в дегидратированном состоянии этот комплекс находится в конформации близкой к активной. Поэтому конформационные перестройки в элементах вторичной и третичной структур, необходимые для обеспечения процесса переноса электрона, в случае полного комплекса РЦ происходят быстрее при повышении степени гидратации, чем для отдельных его субъединиц.

Рисунок 12. Функции радиального распределения порошковых образцов с различными степенями гидратации: (а) РЦ с цитохромом (-о- -А =0.1, -*- -А=0.21, -•- -й=0.35), (б) РЦ (Н-субъединица) с различной историей гидратации (-о- -случай 1, -*- -случай 2, -•- -случай 3).

Безусловно, важно знать, насколько в процессе дегидратации образуются сходные и близкие по плотности конформации для одного и того же белка. Для этого Н-субъединица РЦ Rh. sphaeroides была подвергнута следующей процедуре. Она была последовательно три раза полностью дегидратирована, а затем к ней добавлялась вода до степени гидратации й=2. В дегидратированном состоянии была измерена интенсивность ДРРЛ, а затем проведена процедура фурье-анализа данных ДРРЛ. Результапы представлены на рис. 12(6). Хорошо видно, что функции радиального распределения практически идентичны во всех трех случаях, т.е. плотность упаковки элементов вторичной структуры в белке остается одинаковой. Это свидетельствует о том, что конформационные перестройки в биосистемах, сопровождающие процесс дегидратации (а, следовательно, и гидратации) идут по одним и тем же или по достаточно близким путям по гиперповерхности потенциальной энергии биомакромолекул. Этот результат является еще одним подтверждением теории ренатурации белков, высказанной К.Анфинсеном.

При изменении степени гидратации порошковых образцов РЦ наблюдался кооперативный переход в стабильное состояние при /¡-0.3-0.4, что хорошо согласуется с

результатами других экспериментов. Он проявлялся в смещении максимумов пиков функции радиального распределения к своим предельным значениям, обусловленным конформационными перестройками в элементах вторичной структуры, обеспечивающих формирование активного центра и гидрофобного ядра (т.е. нативной структуры макромолекулы).

Очевидно, что при гидратации биомакромолекулы происходит перераспределение ее плотности и разрыхление структуры. Это, в свою очередь, обеспечивает появление внутриглобулярной подвижности, необходимой для проявления функциональной активности. Таким образом, результаты фурье-анализа данных ДРРЛ непосредственно демонстрируют влияние воды на формирование биоструктур. С одной стороны, роль воды состоит в стабилизирующем вкладе от гидрофобных взаимодействий, а с другой - в разрыхлении сетки водородных связей, ведущем к появлению конформационной подвижности в макромолекулах. Подобные, но лишь качественные, выводы делались и на основании других методик. Полученные результаты дают серьезные основания для дальнейшего использования интегрального Фурье-преобразования прн анализе структурных перестроек в биологических системах.

Для выяснения предсказательной способности вычислительных экспериментов по отношению к интегральным экспериментальным характеристикам метод молекулярной динамики был применен к обработке данных по ДРРЛ лизоцимом с различными степенями гидратации. Для этого были получены 5нс траектории для молекулы лизоцима в окружении 626 молекул воды, что соответствует степени гидратации й»0.68, и кластера из 1423 молекул воды. После усреднения структуры по траектории были посчитаны индикатрисы ДРРЛ для двух вариантов лизоцима с водой и без. Случай разбавленных растворов, когда <<: ( (Уд - объем занимаемый молекулой белка, Уу,> - удельный

объем, приходящийся на одну молекулу в образце) не подходит для учета интерференционных эффектов между молекулами в концентрированных системах, которыми являются порошковые образцы (экспериментальные данные на рис.13), поэтому необходима модификация стандартных подходов.

Когда известны координаты атомов молекулы, используют формулу Дебая для усредненной интенсивности рассеяния в вакууме:

ш)=1:/„2+ее/А

* Р.Р*Я Я.РЧ

Первая сумма в формуле берется по всем атомам в молекуле, а две другие - по каждой паре разных атомов. При возрастании концентрации межмолекулярная интерференция начинает оказывать влияние на форму кривой рассеяния в основном в области малых углов, приводя к уменьшению наблюдаемой интенсивности рассеяния. В случае порошковых образцов верно следующее соотношение: о.5<^у/ £1 > и мы вместо

/V

вычитания рассеяния от растворителя должны вычесть рассеяние от окружения с большей электронной плотностью, состоящего из таких же молекул лизоцима:

здесь \и2х - средний квадрат смещений атомов в молекуле лизоцима. Похожие решения

предлагались в статьях (Я-Нозетапп, 1950; Р.Рагак, Н.НагЬпапп е1 а1., 1992). На рис. 13а представлена обработка индикатрис рассеяния при степени гидратации й=0.05 теоретическими кривыми, полученными с помощью этой формулы ((и2) =0.45А2,

дисперсия 0.02). Для сравнения дана кривая, полученная на основании атомных координат рентгеновской структуры лизоцима, которая часто используется в

теоретических расчетах ('и2} =0.45А2, #=0.03). Хорошо заметно, что положения пика в

области £)ж1.4А"1 для экспериментальных данных и кривой рассчитанной для структуры усредненной по результатам МД совпадают, а для рентгеновской структуры его положение смещено (¡2«1.5А"'). Результаты обработки экспериментальных данных для степени гидратации А=0.45 представлены на рис.136: усредненная по результатам МД структура с 626 молекулами воды ((и2) =0.8А2, ¿Н).05), рентгеновская структура со 142

молекулами воды (\к2)=0.43А2, ¿=0.08). Видно, что при увеличении степени гидратации

происходят структурные перестройки в молекуле лизоцима, приводящие к смещению положения пиков на индикатрисе рассеяния и появлению новых. Пик .4А'1 разбивается на два плеча при 1.5 и 1.8А'1, при этом проявляется его неоднородное уширение в области 2-?-3 А"1.

Рисунок 13. Интенсивность рентгеновского рассеяния образцов лизоцима с различной степенью гидратации: (а) А=0.05 (жирная линия -эксперимент, -о- -усредненная по результатам МД структура, тонкая линия - рентгеновская структура), по оси абсцисс б(А"1) -волновой вектор, г(А) -расстояния между рассеивающими центрами, (б) А=0.45 (жирная линия -эксперимент, -о- -усредненная по результатам МД структура с 626 молекулами воды, тонкая линия - рентгеновская структура со 142 молекулами воды).

Теоретическая кривая, полученная по результатам МД, существенно лучше отображает изменения в исследуемой системе, чем кривая, рассчитанная по рентгеноструктурным данным, и поэтому имеет большую предсказательную силу. Это, по-видимому, связано с тем, что равновесная структура, полученная с помощью МД, гораздо ближе к тому набору структур, который мы имеем в экспериментальном образце. В качестве рассеивающих плотностей здесь выступают элементы вторичной структуры белка. Для более точного решения этой задачи требуется дальнейшая разработка теоретических подходов или увеличение на порядок размеров системы при расчетах МД.

По результатам МД было получено распределение молекул воды вокруг лизоцима (рис.14). Можно выделить три гидратные оболочки: первая при расстояниях между атомами кислорода в молекулах воды и неводородными атомами белка г<3.7А (137 молекул воды, степень гидратации й«0.18), вторая - 3.7^-<5.3А (242 молекулы воды, Ая0.45), третья - 5.3А<г (247 молекул воды). Большинство молекул воды из первой оболочки формируют водородные связи с атомами лизоцима, а 42 из них образуют по две водородные связи с атомами белка. Это наиболее прочно связанные с белком молекулы воды, которые не удаляются даже при дегидратации. Полученные результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными по изучению воды в кристаллах лизоцима (С.В1аке, W.Pulford, Р.АПугЫик, 1983).

о 2 4 Г (А) ' • 10 2345^ (Д) 7 В > И

Рисунок 14. Плотность распределения 626 молекул Рисунок 15. Функции радиального распределения воды по расстояниям относительно поверхности неводородных атомов для структур усредненных по лизоцима (вычислялись расстояния между атомами результатам МД: -о- -1423 молекулы воды, -+- -О в молекулах воды и неводородными атомами лизоцим с 626 молекулами воды, сплошная линия -

белка). лизоцим без воды.

Для структур лизоцима с водой и без усредненных по результатам МД были посчитаны функции радиального распределения атомов в виде 4кр(г) (рис.15). С ними сравнивается функция радиального распределения атомов кислорода в кластере из 1423 молекул воды. Следует отметить, что функция радиального распределения молекул воды, полученная с помощью МД, совпадает как с известными экспериментальными данными (А.Кайеп, Н.Ьеуу, 1972), так и с теоретическими расчетами (З.ЗаНо, ШЫшпе, 1994). Хорошо виден сдвиг положений пиков при добавлении к молекуле лизоцима воды: от 2.5 к 2.9А, от 4.8 к 4.6А, а также изменения в неоднородном упшрении пиков, что непосредственно связано с перестройками в структуре под влиянием гидратации. Важно отметить, что характер изменений соответствует результатам, полученным с помощью фурье-анализа экспериментальных данных для гидратированных порошковых образцов лизоцима. Таким образом, согласие в выводах и результатах между экспериментальными методами и молекулярной динамикой свидетельствует о высокой предсказательной способности вычислительных экспериментов по отношению к интегральным экспериментальным характеристикам. Применение в дальнейшем экспериментальных методов одновременно с расчетами молекулярной динамики приведет к получению новых сведений о конформационном поведении биологических макромолекул.

ВЫВОДЫ

На основании изложенных выше результатов можно сделать следующие выводы:

1. Элементы вторичной структуры являются существенно неоднородными и нелинейными квазиупругими элементами. Эффективный модуль Юнга достигает максимума в центре и заметно снижается у концевых участков а-спирали и на периферии р-слоя. Наименьшее значение модуля Юнга характерно для участков близких к М-концу а-спирали. Динамическая структура а-спирали напоминает скорее пружину, у которой на концах витки растянуты и ослаблены. За счет этого максимумы амплитуды изгибных флуктуаций а-спирали наблюдаются в окрестности первой и последней четверти ее длины.

2. Эффективное плавление а-спирали начинается с И-конца. В вакууме, при температуре 700К на временах порядка 5нс свыше половины аминокислотных остатков, по крайней мере, половину расчетного времени находятся в других конформациях.

3. Модули Юнга свободной а-спирали и свободного (5-слоя, рассчитанные в полноатомном приближении, составляют Е=6-8*10и эрг/см3. В составе молекулы белка модули Юнга а-спирали и Р-слоя оказываются в 1.5-2 раза выше. Из-за стерических ограничений при флуктуациях этих элементов в структуре белка имеется заметное различие в амплитудах по сравнению с вырезанными из молекулы белка свободными

элементами вторичной структуры. Амплитуды флуктуаций свободной а-спирали и той же а-спирали в составе барназы различаются в 1.7 раза.

4. Амплитуды изгибных флуктуаций а-спиралей в большом домене лизоцима мало чувствительны к наличию дисульфидных связей, в то же время, в отсутствие дисульфидных связей, сильно (в 3-7 раз) увеличиваются характерные времена движений элементов вторичной структуры. В лизоциме S-S-связи обеспечивают больший объем молекулы и больший радиус инерции (14.23Ä) по сравнению с молекулой без дисульфидных связей (13.95А). В отсутствие S-S-связей примерно на 2% уменьшается объем молекулы, прежде всего за счет "щели" между большим и малым доменом лизоцима. Можно сказать, что S-S-связи не только "скрепляют" элементы вторичной структуры белка за счет ковалентных связей, но и играют роль "распорок", поддерживая постоянным объем молекулы, необходимый для осуществления ее функций.

5. Вариации параметров потенциального поля при переходе от полноатомной к тяжелоатомной модели существенно сказываются на величине модуля Юнга и амплитуде изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры белков. Это указывает на чувствительность этих динамических параметров к деталям описания силового поля и может быть использовано в дальнейшем для уточнения силовых параметров.

6. В процессе гидратации глобулярных белков с различным строением (миоглобина (а-белок) и лизоцима ((а+р)-белок)) обнаружена четкая корреляция между сдвигом максимума функции радиального распределения, соответствующего второй координационной сфере, к предельным значениям порядка 2.9Ä, ослаблением внутриглобулярных водородных связей, возрастанием внутримолекулярной подвижности и появлением заметной функциональной активности (при А=0.4 для лизоцима; A«0.7 для миоглобина). При гидратации порошковых образцов мембранных белков (белки РЦ пурпурных бактерий Rh. sphaeroides и Rps. viridis) наблюдается кооперативный переход в стабильное состояние при А-0.3-0.4. Анализ функций радиального распределения показал, что пространственная упаковка в мембранных белках более i

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. К.В. Шайтан, А.К. Васильев, С.С. Сарайкин, М.Г. Михайлюк. 'Динамические свойства, электронное строение и функциональная активность радиопротекторов'. Биофизика, 1999, т. 44, №4, с.668-675.

2. М.Г. Михайлюк, С.С. Сарайкин 'Броуновский осциллятор в водном окружении. По данным метода молекулярной динамики'. VI научная конференция ИХФ РАН, 2000, с.22-

3. М.Г. Михайлюк, С.В. Есин, Ю.Ф. Крупянский, А.П. Мороз, П.П. Нокс, И.П. Григорьев, 'Влияние гидратации на стабилизацию структуры реакционных центров пурпурных бактерий. Результаты фурье-анализа данных диффузного рассеяния рентгеновских рентгеновских лучей (ДРРЛ)'. Седьмая научная конференция ИХФ РАН, 2001, с.46.

4. Ю.Ф. Крупянский, С.В. Есин, М.Г. Михайлюк, Г.В. Ещенко, 'Влияние гидратации на структурно-динамические характеристики лизоцима и миоглобина. Данные рэлеевского рассеяния мёссбауэровского излучения (РРМИ) и диффузного рассеяния рентгеновских рентгеновских лучей (ДРРЛ)'. Седьмая научная конференция ИХФ РАН, 2001, с.55.

5. Krupyanskii Yu.F., Esin S.V., Eshenko G.V., Mikhailyuk M.G. 'Spatio-temporal features of protein specific motions. The influence of hydration'. Abstracts of the 4-th International Conference on Biological Physics, 2001, В1-6, P. 8, Kyoto, Japan.

6. Krupyanskii Yu.F., Esin S.V., Eshenko G.V., Mikhailyuk M.G. 'Equilibrium fluctuations in lysozyme and myoglobin' Proceedings of ICAME 2001, T4-9, P.63, Institute of Physics, Oxford.

7. К.В. Шайтан, М.Г. Михайлюк, K.M. Леонтьев, С.С. Сарайкин, А.А. Беляков 'Молекулярная динамика изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры белков'. Биофизика, 2002, Т. 47, №3, с.411-419.

глобулярных.

23.

8. Yu.F. Krupyanskii, S.V. Esin, G.V. Eshenko, M.G. Mikhailyuk 'Spatio-temporal features of protein specific motions. The influence of hydration'. Journal of Biological Physics, 2002, V. 28, p.139-145.

9. M.G. Mikhailyuk, K.V. Shaitan, "Molecular dynamics of a-helix and p-structures as molecular component of protein and as isolated molecular structures in the virtual viscous medium". V International congress on mathematical modeling, Dubna, 2002, V.2, p.243.

10. M.G. Mikhailyuk, S.V. Esin, Yu.F.Krupyanskii, 'Disulfide bridges effect on dynamics of lysozyme. According to the methods of molecular dynamics'. V International congress on mathematical modeling, Dubna, 2002, V.2, p.242.

11. Ю.Ф. Крупянский, C.B. Есин, Г.В. Ещенко, М.Г. Михайлюк, Д.А. Москалев, О.Д. Ветров, 'Пространственно-временные характеристики специфических белковых движений в миоглобине и лизоциме'. III съезд биохимического общества, С.-Петербург, 2002, с.497.

12. Yu.F. Krupyanskii, S.V. Esin, G.V. Eshenko, M.G. Mikhailyuk 'Equilibrium fluctuations in lysozyme and myoglobin'. Hyperfine Interactions, 2002, V. 141, p.273-277.

13. K.B. Шайтан, А.А. Беляков, K.M. Леонтьев, C.C. Сарайкин, М.Г. Михайлюк, К.Б. Егорова, М.В. Орлов 'Геометрия энергетической поверхности и конформационная динамика: от углеводородов - к белкам и пептидам'. Химическая физика, 2003, Т.22, №2, с.57-68.

14. Ю.Ф. Крупянский, С.В. Есин, М.Г. Михайлюк, Г.В. Ещенко 'Пространственно-временные характеристики специфических белковых движений в миоглобине и лизоциме'. Химическая физика, 2003, Т.22, №2, с.41-56.

15. К.В. Шайтан, М.Г. Михайлюк, К.М. Леонтьев, С.С. Сарайкин, А.А. Беляков 'Влияние дисульфидных связей на динамику лизоцима', Биофизика, 2003, Т. 48, №2, с.210-216.

16. Ю.Ф. Крупянский, С.В. Есин, М.Г. Михайлюк 'Равновесная динамика и энергетический ландшафт простых глобулярных белков', Известия АН, Серия физическая, 2003, Т. 67, №9, с.1724-1732.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД№ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 08.10.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 789. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

in 65 1 2 2oo?-A

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Михайлюк, Максим Григорьевич

Введение.

Глава 1, часть 1. Метод молекулярной динамики.

1.1.1. Расчет траекторий движения.

1.1.2. Методы ускорения расчётов молекулярной динамики.

1.1.3. Методы интегрирования уравнений движения.

1.1.4. Ошибки интегрирования и способы их коррекции.

1.1.5. Внешние воздействия на систему, расчёт при постоянной температуре.

1.1.6. Изучение гиперповерхностей потенциальной энергии и построение карт 25 уровней потенциальной энергии.

1.1.7. Авто- и кросскорреляционные функции двугранных углов.

1.1.8. Построение двумерных и одномерных распределений вероятностей 32 значений торсионных углов.

Глава 1, часть 2. Теоретические основы рассеяния 33 рентгеновских лучей.

1.2.1. Рассеяние объектами, содержащими один тип атомов.

1.2.2. Рассеяние объектами, содержащими атомы нескольких типов.

1.2.3. Использование моделей, для получения информации о структуре 37 объекта, при обработке индикатрис рентгеновского рассеяния.

Глава 2. Молекулярная динамика изгибных флуктуации 40 элементов вторичной структуры белков.

2.1. Использование континуальной модели при описании динамики элементов 40 вторичной структуры белков.

2.2. Динамические свойства а-спиралей и р-слоя.

2.3. Динамика а-спирали и р-слоя в белке.

Глава 3. Метод молекулярной динамики как вычислительный 54 эксперимент по сравнительному изучению динамических свойств лизоцима при направленной вариации его структуры.

3.1. Постановка вычислительного эксперимента по изучению влияния 54 дисульфидных мостиков на конформационную подвижность лизоцима.

3.2. Динамика а-спиралей в большом домене лизоцима.

3.3. Динамические корреляции большого и малого доменов лизоцима.

3.4. Сравнение пространственных характеристик лизоцима с дисульфидными связями и без них.

Глава 4. Получение пространственных корреляционных функций биомакромолекул с помощью фурье-анализа данных диффузного рассеяния рентгеновских лучей.

4.1. Методика фурье-анализа данных диффузного рассеяния рентгеновских лучей.

4.2. Исследование с помощью фурье-анализа ДРРЛ глобулярных белков: миоглобина и лизоцима.

4.3. Исследование с помощью фурье-анализа ДРРЛ мембранных белков: белков реакционного центра (РЦ) пурпурных бактерий.

4.4. Метод молекулярной динамики как инструмент для обработки экспериментальных данных по ДРРЛ лизоцимом с различными степенями гидратации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная динамика элементов вторичной структуры и корреляции флуктуаций атомных групп в белках"

В течение последних десятилетий исследование динамики биополимеров привлекает большое вниманиех [1-4]. Однако, в отличие от низкомолекулярных структур, в биополимерах взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами существенно сложнее [5]. В настоящее время общепринято, что фундаментальные принципы функционирования биомакромолекул обусловлены также их динамическими свойствами [6-10]. Пространственное строение молекул белков, наличие элементов вторичной структуры непосредственно сказывается на организации динамического поведения глобулы. Протяженные упругие элементы полипептидного каркаса организуют флуктуационную динамику белковой . макромолекулы, что весьма важно для функциональной активности. В известном смысле молекулу белка можно представить как армированную каплю, состоящую из упругих элементов различной протяженности ц формы, погруженных в плотную среду из боковых групп и молекул растворителя (К.В. Шайтан, А.Б. Рубин) [11]. Элементы этой конструкции испытывают ограниченное броуновское движение с параметрами, определяемыми константами жесткости упругого каркаса и микровязкостью внутрибелковой среды. Понимание физических принципов механического устройства белковых глобул и сходных наноструктур необходимо для развития технологии молекулярного конструирования и биоинженерии.

Динамические свойства белков исследуются многими современными физическими методами, такими как водородный обмен [12,13], метод спиновых меток [14-16], рассеяние нейтронов [17,18], люминесценция [19], ЯМР [20-23], мессбауэровская спектроскопия [24-27], рэлеевское рассеяние мёссбауэровского излучения (РРМИ) [28-31], лазерная спектроскопия [32-34], рассеяние синхротронного излучения [35], диффузное рассеяние рентгеновских лучей (ДРРЛ) [36-39]. Одним из важных инструментов исследования структуры и закономерностей конформационного поведения биологических макромолекул является метод молекулярной динамики (МД) [40-44], позволяющий получать детальную информацию о процессах, происходящих в системе на уровне движений отдельных атомов. В его основе лежит расчет классических (ньютоновских) траекторий движения макромолекулы в фазовом пространстве координат и импульсов ее атомов. Этот метод очень быстро развивается вместе с прогрессом в компьютерных технологиях и становится все более популярным инструментом исследований для молекулярных биологов, биохимиков, биофизиков и представителей смежных специальностей. В настоящее время этот метод оказывается чрезвычайно полезным при постановке вычислительных экспериментов по сравнительному изучению динамических свойств белков при направленной вариации их структуры. Таким образом, использование метода молекулярной динамики для изучения временных корреляций, характеризующих динамику белков и фрагментов их вторичной и третичной структуры, а также пространственных корреляций, сопровождающих конформационные перестройки биомакромолекул при изменении внешних условий, актуально и необходимо для детального понимания процессов, происходящих в живых системах на молекулярном уровне. При этом самостоятельный интерес представляет задача обработки экспериментальных данных по рассеянию рентгеновского излучения с использованием результатов молекулярной динамики и применением фурье-преобразования к анализу экспериментальных кривых.

Целью работы является сравнительное исследование динамики элементов вторичной структуры в составе молекул белка и в виде изолированных молекулярных структур, изучение пространственных и временных корреляций атомных групп, характеризующих динамику биомакромолекул при изменении внешних условий, сравнительное изучение роли дисульфидных связей в конформационной подвижности белков, использование результатов молекулярной динамики для обработки данных ДРРЛ, а также разработка методов фурье-анализа данных ДРРЛ и соответствующего программного обеспечения для получения информации о динамике водно-белковых систем.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Михайлюк, Максим Григорьевич

Заключение и выводы.

Таким образом, в данной работе для понимания динамических принципов устройства белковых глобул была отработана методика МД вычислительных экспериментов для изучения динамики элементов вторичной структуры белков (а-спиралей и р-слоев) как в виртуальной вязкой среде, так и в составе молекул белков (барназа, лизоцим). Исследовалась динамика температурного плавления а-спиралей. На примере белка лизоцима было изучено влияние дисульфидных связей на динамику элементов вторичной структуры и конформационные перестройки, происходящие в системе при разрушении ковалентных сшивок. Метод МД был успешно использован при восстановлении экспериментальных индикатрис ДРРЛ на порошковых образцах лизоцима с различной степенью гидратации. Предложен метод фурье-анализа данных ДРРЛ, позволяющий отслеживать динамику пространственных корреляций, вызванных конформационными перестройками в биомакромолекулах при изменении внешних условий (температуры, вязкости, степени гидратации и т.п.). Этот метод был применен к сравнительному изучению пространственных перестроек в глобулярных белках разного строения (миоглобин (а-белок), лизоцим ((а+Р)-белок)) и мембранных белках (белки РЦ пурпурных бактерий Rh. sphaeroides и Rps. viridis) при изменении степени гидратации. На основании изложенных выше результатов можно сделать следующие выводы:

1. Элементы вторичной структуры являются существенно неоднородными и нелинейными квазиупругими элементами. Эффективный модуль Юнга достигает максимума в центре и заметно снижается у концевых участков а-спирали и на периферии р-слоя. Наименьшее значение модуля Юнга характерно для участков близких к N-концу а-спирали. Динамическая структура а-спирали напоминает скорее пружину, у которой на концах витки растянуты и ослаблены. За счет этого максимумы амплитуды изгибных флуктуаций а-спирали наблюдаются в окрестности первой и последней четверти ее длины.

2. Эффективное плавление а-спирали начинается с N-конца. В вакууме, при температуре 700К на временах порядка 5нс свыше половины аминокислотных остатков, по крайней мере, половину расчетного времени находятся в других конформациях.

3. Модули Юнга свободной а-спирали и свободного р-слоя, рассчитанные в полноатомном приближении, составляют Е=6-^8*10и эрг/см3. В составе молекулы белка модули Юнга а-спирали и р-слоя оказываются в 1.5-2 раза выше. Из-за стерических ограничений при флуктуациях этих элементов в структуре белка имеется заметное различие в амплитудах по сравнению с вырезанными из молекулы белка свободными элементами вторичной структуры. Амплитуды флуктуаций свободной а-спирали и той же а-спирали в составе барназы различаются в 1.7 раза.

4. Амплитуды изгибных флуктуаций а-спиралей в большом домене лизоцима мало чувствительны к наличию дисульфидных связей, в то же время, в отсутствие дисульфидных связей, сильно (в 3-7 раз) увеличиваются характерные времена движений элементов вторичной структуры. В лизоциме S-S-связи обеспечивают больший объем молекулы и больший радиус инерции (14.23А) по сравнению с молекулой без дисульфидных связей (13.95А). В отсутствие S-S-связей примерно на 2% уменьшается объем молекулы, прежде всего за счет "щели" между большим и малым доменом лизоцима. Можно сказать, что S-S-связи не только "скрепляют" элементы вторичной структуры белка за счет ковалентных связей, но и играют роль "распорок", поддерживая постоянным объем молекулы, необходимый для осуществления ее функций.

5. Вариации параметров потенциального поля при переходе от полноатомной к тяжелоатомной модели существенно сказываются на величине модуля Юнга и амплитуде изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры белков. Это указывает на чувствительность этих динамических параметров к деталям описания силового поля и может быть использовано в дальнейшем для уточнения силовых параметров.

6. В процессе гидратации глобулярных белков с различным строением (миоглобина (а-белок) и лизоцима ((а+Р)-белок)) обнаружена четкая корреляция между сдвигом максимума функции радиального распределения, соответствующего второй координационной сфере, к предельным значениям порядка 2.9А, ослаблением внутриглобулярных водородных связей, возрастанием внутримолекулярной подвижности и появлением заметной функциональной активности (при h^0.4 для лизоцима; h~0.7 для миоглобина). При гидратации порошковых образцов мембранных белков (белки РЦ пурпурных бактерий Rh. sphaeroides и Rps. viridis) наблюдается кооперативный переход в стабильное состояние при А~0.3+0.4. Анализ функций радиального распределения показал, что пространственная упаковка в мембранных белках более плотная, чем в глобулярных.

Автор благодарит научного руководителя профессора К.В. Шайтана за чётко поставленные научные задачи, постоянное внимание и многочисленные разъяснения сложных вопросов молекулярной динамики и механизмов элементарных процессов в биомакромолекулах. Автор благодарен всему коллективу лаборатории динамики биополимеров, отдела строения вещества ИХФ РАН и, прежде всего, ее руководителю Ю.Ф. Крупянскому за помощь, консультации и замечания на различных этапах работы, а также за предоставленные экспериментальные данные и плодотворное обсуждение результатов расчетов. Автор выражает свою искреннюю благодарность всем членам группы молекулярного моделирования кафедры биофизики за неоценимую помощь и всяческую поддержку. Глубокую благодарность автор выражает коллективу кафедры биофизики во главе с членом-корреспондентом РАН, профессором А.Б. Рубиным за деловую и доброжелательную атмосферу, способствовавшую выполнению данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Михайлюк, Максим Григорьевич, Москва

1. Рубин А.Б. Биофизика (тт. 1,2). М., Книжный дом "Университет", 2000, с. 915.

2. Fersht A. Structure and mechanism in protein science: A guide to enzyme catalysis and protein folding. NY., W.H. Freeman & Co., 1999, p. 437.

3. Финкелынтейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. М., Книжный дом "Университет", 2002, с. 374.

4. Крупянский Ю.Ф., Гольданский В.И., "Динамические свойства и энергетический ландшафт простых глобулярных белков", Успехи физ. науки, Т. 172, с. 1247 (2002).

5. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М., Высшая школа, 1996, с. 335.

6. Frauenfelder Н., Petsko G.A., Tsernoglou D., "Temperature-dependent x-ray diffraction as a probe of structural dynamics", Nature, v. 280, 1979, p.558.

7. H. Keller, P.G. Debrunner, "Evidence for conformational and diffusion mean square displacements in frozen aqueous solution of oxymyoglolbin", Phys. Rev. Lett., V. 45, p. 68 (1980).

8. Мессбауэр P.JI. "Стохастические движения атомов в белках", Химическая физика, т.1,№10,1982, с. 1299.

9. Rubin А.В., Shaitan K.V., Kononenko А.А., Chamorovskii S.K., "Temperature dependence of cytochrome photooxidation and conformational dynamics of Chromatium reaction center complexes", Photosynthesis Res., 1989, v. 22, p. 219.

10. Шайтан K.B., "Динамика электронно-конформационных переходов и новые подходы к физическим механизмам функционирования биомакромолекул", Биофизика, 1994, Т. 39, С. 949.

11. Шайтан К.В., Рубин А.Б., "Изгибные флуктуации альфа-спиралей и динамика фермент-субстратных взаимодействий", Мол. биол., 1983, Т. 17, №6, с. 1280.

12. Абатуров Л.В., "Водородный обмен в белках", Итоги науки и техники, сер. Молекулярная биология, М.: ВИНИТИ АН СССР, 1976, с. 126.

13. Абатуров Л.В., Лебедев Ю.О., Носова Н.Г., "Динамическая структура глобулярных белков: конформационная жесткость и флуктуационная подвижность", Мол. биол., 1983, т. 17, №3, с. 543.

14. Лихтенштейн Г.И., Кольтовер В.К., "Метод спиновых меток в молекулярной биологии", Итоги науки и техники, сер. Молекулярная биология, М.: ВИНИТИ АН СССР, 1987, с. 134.

15. Криничный В.И., Гринберг О.Я., Юданова Е.И., Лобашевская Е.В., Анциферова Л.И., Лихтенштейн Г.И., Лебедев Я.С., "Исследование лизоцима методом спиновых меток в двух-миллиметровом диапазоне", Биофизика, 1987, Т. 32, с. 215.

16. Doster W., Cusack S., Petry W., "Dynamic transition of myoglobin revealed by inelastic neutron scattering", Nature, 1989, V. 337, p. 754.

17. Smith J., Cusack S., Karplus M., "Inelastic neutron scattering analysis of low frequency motion in proteins: A normal mode study of the bovine pancreatic trypsin inhibitor", J. Chem. Phys., 1986, v. 85, №6, p. 3636.

18. Бурштейн Э.А., "Собственная люминесценция белка как метод изучения быстрой структурной динимики", Мол. биол., 1983, Т. 17, с. 455.

19. Wittebort R.J., Rothgeb Т.М., Szabo A., Gurd F.R., "The aliphatic groups of sperm whale myoglobin: a 13C-NMR study", PNAS USA, 1979, V. 76, p. 1059.

20. Аксенов С.И., "Исследование динамической структуры глобулярных белков импульсными методами ядерного магнитного резонанса", Мол. биол., 1983, Т. 17, с. 475.

21. Daragan V.A., Mayo K.H., "Asymmetric 13C-NMR multiplet relaxation and dipolar-CSA cross correlation for glycine 13Ca methylenes in peptides", Chem. Phys. Letters, V. 206, p.393.

22. Мауо K.H., Parak F., Mossbauer R.L. "Observation of the elastic and quasi-elastic nuclear gamma-resonance absorption in hemoglobin crystals", Phys. Lett. A, 1981, v. 82, N9, p. 468.

23. Гольданский В.И., Крупянский Ю.Ф., "Динамика биополимеров и стеклообразная модель белка и ДНК", Успехи физ. науки, Т. 143, с. 329 (1984).

24. Nowik I., Bauminger E.R., Cohen S.G., Ofer S., "Spectral shapes of Mossbauer absorption and incoherent neutron scattering from harmonically bound nuclei on Brownian motion: Application to macromolecular system", Phys. Rev., A, 1985, V. 31, p. 2291.

25. Chang I., Hartmann H., Krupyanskii Yu., Zharicov A., Parak F., "Dielectric relaxation models applied to the dynamics of myoglobin as determined by Mossbauer spectroscopy", Chemical Physics. 1996. V.212. P.221.

26. Chernavskii D.S., Frolov E.V., Goldanskii V.I., Kononenko A.A., Rubin A.B., "Electron Tunneling process and the segment mobility of macromolecules", Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, N. 12, p. 7212.

27. Шайтан K.B., Упоров И.В., Лукашев Е.П., Кононенко А.А., Рубин А.Б. "Фотоконформационный переход причина температурных и световых эффектов при рекомбинации зарядов в реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий", Мол. биол., 1991,т.25,№. 3,с.695.

28. Achterhold К., Keppler С., van Burck U., Chumakov A.I., Parak F., "Mossbauer effect with synchrotron radiation for the investigation of protein dynamics", Proceedings of ICAME 1999, T2-1.

29. Blake C.C.F., Pulford W.C.A., Artymiuk P.J., "X-ray studies of water in crystals of lysozyme", J. Mol. Biol., 1983, V. 167, p. 693.

30. Petsko G.A., Ringe D., "Fluctuations in protein structure from X-ray diffraction", Ann. Rev. Biophys. Biogen., 1984, v. 13, p. 331.

31. Parak F., Hartman H., Schmidt M., Corungiu G., Clementi E., "The hydration shell of myoglobin", Eur. Bioph. J., 1992, V. 21, p. 313.

32. Schmidt M., Parak F., Corungiu G., "Density distributions in the water shell of myoglobin", Int. J. Quant. Chem., 1996, V. 59, p. 263.

33. Nadler W., Brunger A.T., Schulten K., Karplus M., "Molecular and stochastic dynamics of proteins", PNAS, 1987, V. 84, p. 7933.

34. Elber R., "Multiple Conformational States of Proteins: A Molecular Dynamics Analysis of Myoglobin", Science, 1987, V. 235, P. 318.

35. Levitt M., Sharon R., "Accurate simulation of protein dynamics in solution", PNAS, 1988, V. 85, p. 7557.

36. Peraha D., Levy R.M., Karplus M., "Motions of an a-helical polypeptide: comparison of molecular and harmonic dynamics", Biopolymers, 1990, V. 29, P. 645.

37. Steinbach P.J., Brooks B.R., "Protein hydration elucidated by molecular dynamics simulation", PNAS, 1993, V. 90, p. 9135.

38. McCammon J.A., "Protein dynamics", Rep. Prog. Phys., 1984, V. 47, p. 1-46.

39. Карплус M., Мак-Каммон Дж.Э., "Динамика белковой структуры", В мире науки, 1986, С. 4.

40. PUMA комплекс программ моделирования молекулярной динамики биологических макромолекул, (Авторы: Балабаев Н.К. и др.), НИВЦ АН СССР, Пущино, 1989.

41. Lemak A. S., Balabaev N.K., "On the berendcen thermostat", Molecular simulation, 1994 v.l3,p. 117.

42. Шайтан K.B., Ермолаева М.Д., Сарайкин C.C., "Корреляция флуктуаций, карты уровней свободной энергии и явление динамического изоморфизма в ряду модифицированных дипептидов", Известия РАН, Сер. Физика, 1997, Т. 61, С. 1680.

43. Weiner S.J., Kollman Р.А., Case D.A., Singh U.C., Ghio С., Alagona G., Profeta S. Jr., Weiner P. "A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins", J. Am. Chem. Soc., 1984, V. 106, p. 765.

44. Homans S.W. "A molecular mechanical force field for the conformational analysis of oligosaccharides: Comparison of theoretical and crystal structures of Man alphal-3 Man beta 1-4 GlcNAc", Biochemistry, 1990, V. 29, p. 9110.

45. Cornell W. D., Cieplak P., Bayly С. E., Kollman P. A. "Application of RESP Charges to Calculate Conformational Energies, Hydrogen Bond Energies, and Free Energies of Solvation." J. Am. Chem. Soc., 1993, V. 115, p. 9620.

46. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M. "CHARMM: A program for macromolecular Energy, Minimization, and Dynamics Calculation", J. Сотр. Chem., 1983, V. 4, P. 187.

47. Halgren T.A. "Merck Molecular Force Field: I. Basis, Form, Scope, Parameterization and Performance of MMFF94." J. Сотр. Chem., 1996, V. 17, p. 490.

48. Halgren T.A. "Merck Molecular Force Field. II. MMFF94 van der Waals and Electrostatic Parameters for Intermolecular Interactions." J. Сотр. Chem., 1996, V. 17, p. 520.

49. C.I. Bayly, P. Cieplak, W.D. Cornell, P.A. Kollman, "A Well-Behaved Electrostatic Potential Based Method Using Charge Restraints For Determining Atom-Centered Charges: The RESP Model", J. Phys. Chem. 1993, V. 97, p. 10269.

50. W.D. Cornell, P. Cieplak, C.I. Bayly, and P.A. Kollman, "Application of RESP Charges to Calculate Conformational Energies, Hydrogen Bond Energies, and Free Energies of Solvation", J. Am. Chem. Soc., 1993, V. 115, p. 9620.

51. Go N., Scheragu H.A., "Ring closure and local conformational deformations of chain molecules", Macromoleculs, 1970, V. 3, P. 178.

52. Braun W., "Local deformation studies of chain molecules: differential conditions for changes of dihedral angles", Biopolymers, 1987, V. 26, P. 1691.

53. Helfand E. "Flexible vs rigid constraints in statistical mechanics", J. Chem. Phys, 1979, V.71, P. 5000.

54. Van Gunsteren W.F., Berendsen H.J.C., "Algorithms for macromolecular dynamics and constraint dynamics", Mol Phys, 1977, V.34, P. 1311.

55. Van Gunsteren W.F., Karplus M., "Effect of constrains, solvent and crystal environment on protein dynamics", Nature, 1981, V.293, P.677.

56. Bruccoleri R.E., Karplus M., "Chain closure with bond angle variations", Macromoleculs, 1985, V.18, P. 2767.

57. Hymphreys D.D., Friesner R.A., Berne B.J., "A multiple-time-step molecular dynamics algorithm for macromoleculs", J. Phis. Chem., 1994, V. 98, P.6885.

58. Saito M., "Molecular dynamics simulations of proteins in solution: artifacts caused by the cutoff approximation", J. Сотр. Phys., 1994, V. 101, P. 4055.

59. Press W. H., Flannery B. P., Teukolsky S. A., Vetterling W. T. In Numerical Recipes, The Art of Scientific Computing, Cambridge University Press, Cambridge (1986).

60. Verlet L., "Computer experiments on classical fluids. I. Thermodynamical properties of Lennard-Jones molecules", Phys. Rev., 1967, V. 159, p. 98.

61. К. Хир "Статистическая механика, кинетическая теория и стохастические процессы", М., Мир, 1976, с. 600.

62. Haile J.M. and Gupta S. "Extensions of the molecular dynamics simulation method. II. Isothermal systems", J.Chem.Phys., 1983, V. 79, p. 3067.

63. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., van Gunsteren W.F., Di Nola A., Haak J.R., "Molecular dinamics with coupling to an external bath", J. Chem. Phys., 1984, V. 81, p. 3684.

64. Andersen H.C., "Molecular dynamics simulations at constant pressure and/or temperature", J. Chem. Phys., 1980, V. 72, p. 2384.

65. Kuharski R.A., Candler D., Montgomery J.A., Rabii F., Singer S. J., "Stochastic molecular dynamics study of cyclohexane isomerisation", J. Phys. Chem., 1988, V. 92, p. 3261.

66. Nose S. A., "Molecular dynamics method for simulations in the canonical ensemble", Molec. Phys., 1984, V. 52, p. 255.

67. Bercowitz M., McCammon J.A., "Molecular dynamics with stochastic boundary conditions", Chem. Phys. Lett., 1982, V. 90, p. 215.

68. Brooks C.L., Brunger A., Karplus M., "Active site dynamics: A stochastic boundary MD approach", Biopolymers, 1985, V. 24, p. 843.

69. Brooks C.L., Karplus M., "Solvent effects on protein motion and protein effects on solvent motion. Dynamics of the active site region of lisozyme", J. Mol. Biol., 1989, V. 208, p. 159.

70. Brunger A., Brooks C.L., Karplus M., "Active site dynamics of ribonuclease", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, V. 82, p. 8458.

71. Голо В.Jl., Шайтан К.В., "Динамический аттрактор в термостате Берендсена и медленная динамика биомакромолекул," Биофизика, 2002, Т. 47, №4, с. 611.

72. Заславский Г.М., Сагдеев Р.З. Введение в нелинейную физику. М.: Наука, 1988, с. 368.

73. Эбелинг В., Энгель А., Файстель Р. Физика процессов эволюции. М.: УРСС, 2001, с.328.

74. Китайгородский А.И. Конформационные расчеты сложных молекул. Минск, 1970, с.130.

75. Шайтан К.В., "Конформационная динамика и новые подходы к физическим механизмам элементарных актов переноса массы, трансформации энергии и передачи информации в биомакромолекулярных структурах", Мол. биол., 1994, Т. 28, с. 670.

76. Shaitan K.V., Nemuhin A.V., Firsov D.A., Bogdan N.V., Topol I.A., "Importance of effective charges in the analysis of the electron-conformational interactions in peptides", Molecular Biol., 1997, V.31. p.108.

77. Волькенштейн M.B. Биофизика. M.: Наука, 1988, с. 591.

78. Дашевский В.Г. Конформационный анализ макромолекул. М.: «Наука», 1987, с. 284.

79. IUPAC-IUB Commission on biochemical nomenclature. Abbreviations and symbols for the description of the conformation of polypeptide chains. J. Mol. Biol., 1970, V. 52, P. 1.

80. B. Gelin, M. Karplus, "Side-Chain Torsional Potentials: Effect of Dipeptide, Protein, and Solvent Environment", Biochemistry, 1979, V. 18, P. 1256.

81. Г. Корн, Т. Корн. Справочник по математике. М.: «Наука», 1978.

82. Debye P., "Zerstreuung von Rotgenstrahlen", Ann. Phys., 1915, V. 46, p. 809.

83. Warren B.E., Gingrich N.S., "Fourier integral analysis of X-ray powder patterns", Phys.Rev, 1934, V. 46. P. 368.

84. Гинье А. Рентгенография кристаллов. M., "Физматгиз", 1961, с. 489.

85. Кривоглаз М.А. Дифракция рентгеновских лучей и нейтронов в неидеальных кристаллах. Киев, "Наукова думка", 1983, с. 307.

86. Джеймс Р. Оптические принципы дифракции рентгеновских лучей. М., ИЛ, 1950, с.582.

87. Китайгородский А.И. Рентгеноструктурный анализ мелкокристаллических и аморфных тел. М., ГИТТЛ, 1953.

88. Pings C.J., Waser J., "Analysis of scattering data for mixtures of amorphous solids or liquids", J. Chem. Phys., V. 48, p. 3016.

89. O.B. Ptitsyn, B.A. Fedorov, L.A. Voronin, "X-Ray diffuse scattering at large angles as a method of studying intramolecular packing of a protein chain", Stadia biophysica, 1974, V. 47, p. 9.

90. B.A. Fedorov, O.B. Ptitsyn, L.A. Voronin, "X-Ray diffuse scattering by proteins in solution. Consideration of solvent influence", J. Appl. Crist., 1974, V. 7, p. 181.

91. B.A. Fedorov, A.I. Denesyuk, "Large-angle X-Ray diffuse scattering, a new method for investigating changes in the conformation of globular proteins in solutions", J. Appl. Crist., 1978, V. 11, p. 473.

92. M.Y. Pavlov, B.A. Fedorov, "Improved technique for calculating X-Ray scattering intensity of biopolymers in solution: evaluation of the form, volume and surface of a particle", Biopolymers, 1983, V. 22, p. 1507.

93. Moore P.B., "Small-angle scattering. Information content and error analysis", J. Appl. Crist., 1980, V. 13, p. 168.

94. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М., "Наука", 1986, с. 279.

95. Svergun D.I., Stuhrmann Н.В., "New developments in direct shape determination from small-angle scattering. 1. Theory and model calculations", Acta Crystallog. Sect. A, 1991, V. 47, p. 736.

96. Stuhrmann H.B., "Interpretation of small-angle scattering of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering functions", Acta Crystallog. Sect. A, 1970, V. 26, p. 297.

97. Чернавский Д.С., Чернавская H.M. Белок-машина. Биологические макромолекулярные конструкции. М.: МГУ, 1999,248 с.

98. Чернавский Д.С., Хургин Ю.И., Шноль С.Э., "Концепция "белок-машина" и ее следствия", Биофизика, 1987, Т. 32, с. 775.

99. Франк-Каменецкий М.Д., "Флуктуационная подвижность ДНК", Мол. биол., 1983, Т. 17, с. 639.

100. Shaitan K.V., Ermolaeva M.D., Saraikin S.S., "Nonlinear dynamics of the molecular systems and the correlations of internal motions in the oligopeptides", Ferroelectrics, 1999, V. 220, P. 205.

101. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y., "Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, V. 96, P. 11241.

102. M.V. Matz, A.F. Fradkov, Y.A. Labas, A.P. Savitsky, A.G. Zaraisky, M.L. Markelov, S.A. Lukyanov, "Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species", Nature biotechnology, 1999, V. 17, p. 969.

103. Brooks C.L., Karplus M. "Solvent effects on protein motion and protein effects on solvent motion. Dynamics of the active site region of lysozyme", J. Mol. Biol., 1989, V. 208, p. 159.

104. Daggett V., Levitt M., "Protein unfolding pathways explored through molecular dynamics simulations", J. Mol. Biol., 1993, V. 232, p. 600.

105. Buck M., Kaiplus M., "Internal and overall peptide group motion in proteins: molecular dynamics simulations for lysozyme compared with results from X-ray and NMR spectroscopy", J. Am. Chem. Soc., 1999, V. 121, p. 9645.

106. Blake C.C.F., "Structure of hen-egg-white lysozyme", Nature, 1965, V. 206, p. 757.

107. Young A.C.M., Tilton R.F., Dewan J.C., "Thermal expansion of hen-egg-white lysozyme comparison of the 1.9 angstroms resolution structures of the tetragonal form of the enzyme at lOOKand 298K", JMB, 1994, V. 235, p. 302.

108. Куринов И.В., Крупянский Ю.Ф., Суздалев И.П., Гольданский В.И., "Изучение влияния гидратации на динамику некоторых глобулярных белков методом рэлеевского рассеяния мёссбауэровского излучения", Биофизика, 1987, Т. 32, с. 210.

109. Krupyanskii Y.F., Goldanskii V.I., Kurinov I.V., Suzdalev I.P., "Dynamics of protein-water systems revealed by Rayleigh scattering of Mossbauer radiation (RSMR) technique", Studia biophysica, v. 136, № 2,1990, p. 133.

110. Ptitsyn O.B., Finkelstein A.V., "Theory of protein secondary structure and algorithm of its prediction", Biopolymers, 1983, V. 22, p. 15.

111. Finkelstein A.V., Murzin A.G., "General architecture of the a-helical globule", J. Mol. Biol., 1988, V. 204, p. 749.

112. Bowie J.U., "Helix packing in membrane proteins", J. Mol. Biol., 1997, V. 272, p. 780.

113. Krogh-Moe J., "A method for converting experimental X-ray intensities to an absolute scale", Acta Crystallog., 1956, V. 9, p. 51.

114. Kaplow R., Strong S.L., Averbach B.L., "Radial density functions for liquid mercury and lead", Physical Review A, 1965, V. 138, p. 1336.

115. Deriu A., Ugozzoli F., "Computer program for the evolution of radial distribution functions in Rayleigh scattering of Mossbauer radiation experiments", J. Appl. Crist., 1985, V. 18, p. 122.

116. Тимченко A.A., Птицын О.Б., Сердюк И.Н., Федоров Б.А., Кравченко Н.А., "Структура лизоцима и его комплекса с ингибитором. Сравнение со структурами в кристалле", ДАН СССР, 1976, Т. 230, с. 458.

117. Narten А.Н., Levy Н.А. "Liquid water: scattering of X-rays", Water- A Comprehensive Treatise, N.-Y.: Plenum Press, 1972, V. 1, P. 311.

118. S. Saito, I. Ohmine, "Dynamics and relaxation of an intermediate size water cluster (H20)io8", J. Chem. Phys., 1994, V. 101, p. 6063.

119. Ansari A., Berendsen Y., Braunstein D., Cowen B.R., Frauenfelder H, "Rebinding and relaxation in the myoglobin pocket", Biophys. Chem., 1987, V. 26, p. 337.

120. Careri G., Gratton E., Yang P.H., Rupley J.A., "Corralation of IR spectroscopic, heat capacity, diamagnetic succeptibility and enzymatic measurements on lysozyme powder", Nature, 1980, V. 284, p. 572.

121. Finney J.L., Poole P.L., "Protein hydration and enzyme activity: the role of hydration-induced conformation and dynamics changes in the activity of lysozyme", Comments Mol. Cell. Biophys., 1984, V. 2, p. 129.

122. Hilton B.D., His E., Bryant R.G., "!H Nuclear magnetic resonance relaxation of water on lysozyme powders", J. Am. Chem. Soc., 1977, V. 99, p. 8483.

123. Shirley W.M., Bryant R.G., "Proton-nuclear spin relaxation and molecular dynamics in the lysozyme-water system", J. Am. Chem. Soc., 1982, V. 104, p. 2910.

124. Poglitsch A., Kremer F., Genzel L., "Picosecond relaxation in hydrated lysozyme observed by mm-wave spectroscopy", J. Mol. Biol., 1984, V. 173, p. 137.

125. Schinkel J.E., Downer N.W., Rupley J.A., "Hydrogen exchange of lysozyme powders. Hydration dependence of internal motions", Biochemistry, 1985, V. 24, p. 352.

126. Likhtenstein G.I., "Water and dynamics of proteins and membranes", Stud. Biophys., 1986, V. Ill,p. 89.

127. Аксенов С.И., "Роль воды в процессах функционирования биологических структур и в их регулировании", Биофизика, 1985, Т. 30, с. 220.

128. Аксенов С.И. Вода и ее роль в регулировании биологических процессов. М.: Наука, 1990, с. 117.

129. Svergun D.I., Richards S., Koch M.H., Sayers Z., Kuprin S., Zaccai G., "Protein hydration in solution: Experimental observation by X-ray and neutron scattering", PNAS USA, 1998, V. 95, p. 2267.

130. Marx D., Tuckerman M.E., Hutter J., Parrinello M., "The nature of the hydrated excess proton in water", Nature, 1999, V. 397, p. 601.

131. S as try S., "Going strong or falling apart?", Nature, 1999, V. 398, p. 467.

132. Freisner R.A., Won Y., "Spectroscopy and electron transfer dynamics of the bacterial photosynthetic reaction center", BBA, 1989, V. 977, p. 99.

133. Фотосинтез. Т. 1, под ред. Говинджи, М., Мир, 1987, с. 727.

134. Рубин А.Б. Принципы организации и регуляции первичных процессов фотосинтеза. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1995, с. 38.

135. Рубин А.Б., Кононенко А.А., Шайтан К.В., "Электронно-конформационные взаимодействия в первичных процессах фотосинтеза", Итоги науки и техники, сер. Биофизика, М.: ВИНИТИ АН СССР, 1987, Т. 21, с. 161.

136. Нольде Д.Е., Волынский П.Е., Арсеньев А.С., Ефремов Р.Г., "Моделирование пептидов и белков в мембранном окружении. I. Модель сольватации, имитирующая липидный бислой", Биоорг. Химия, 2000, Т. 26, с. 130.

137. EfremovR.G., Volynsky P., Nolde D., VergotenG., ArsenievA.S., "Implicit two-phase solvation model as a tool to assess conformation and energetics of proteins in membrane-mimetic media", Theor. Chem. Acc., 2001, V. 106, p. 48.

138. Hosemann R., Bagchi S.N. Direct Analysis of Diffraction by Matter. Amsterdam: North-Holland Publishing Company; 1962, p. 258.