Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модуляция пектинами проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на овальбумин

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Модуляция пектинами проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на овальбумин"

003488072

На правах рукописи

ХРАМОВА ДАРЬЯ СЕРГЕЕВНА

МОДУЛЯЦИЯ ПЕКТИНАМИ ПРОНИЦАЕМОСТИ КИШЕЧНОЙ СТЕНКИ И ИММУННОГО ОТВЕТА НА ОВАЛЬБУМИН

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Сыктывкар - 2009

003488072

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Учреждения Российской академии наук Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН (заведующий отделом к.б.н., доцент С.В. Попов).

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Попов Сергей Владимирович

академик

Оводов Юрий Семенович

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Добродеева Лилия Константиновна

доктор биологических наук, ст.н.с. Головко Владимир Александрович

Ведущая организация: Учреждение РАН Институт иммунологии

и физиологии УрО РАН (г. Екатеринбург)

Защита состоится «24» декабря 2009 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета Д 004.017.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии Коми НЦ УрО РАН по адресу: 167982, Республика Коми, Сыктывкар, ул. Первомайская, 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии Коми НЦ УрО РАН по адресу: 167982, Республика Коми, Сыктывкар, ул. Первомайская, 50.

Автореферат разослан « ноября 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.Г. Варламова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Регуляция иммунного ответа на пищевые белки является актуальной проблемой иммунофизиологии. Иммунный ответ на антигены пищи зависит от барьерной функции кишечника, которая является важнейшим механизмом, препятствующим проникновению в кровь макромолекул пищевых белков (Kraehenbuhl et al., 1997). В последние десятилетия получены данные, свидетельствующие о том, что небольшие количества белков проникают из просвета кишки в кровь в непереваренном виде путем эндоцитоза (Udall et al., 1981; Bendayan et al., 1990; Ziv, Banyana, 2000; Bruneau et al., 2003 ; Cloutier et al., 2006; Cammisotto et al., 2007). Показано, что проникновение в кровь овальбумина (OVA) в высокомолекулярном виде в количестве, составляющем 0.001 - 0.01% от введенного белка, не препятствует развитию оральной толерантности к этому белку (Bruce, Ferguson, 1986; Friedman, 1996). Известно, что повышение проникновения белковых антигенов в кровь стимулирует иммунный ответ на эти антигены. Так, адьювантное действие бактериальных токсинов обусловлено увеличением транспорта антигенов в кровь (Kosecka et al., 1994; Rappuoli et al., 1999), a аллергические реакции на сою связывают с повышением проникновения белков соевого боба в кровоток (Weangsripanavaly et al., 2005). Повышение проницаемости кишечной стенки наблюдается при различных патологических состояниях (Hollander et al., 1986;Benardetal., 1996;Kiliaanetal., 1998; Jlycc, 2003). При этом модулировать кишечную проницаемость могут медиаторы воспаления, выделяемые активированной тучной клеткой (гистамин, брадикинин) (Stein et aL, 1998), цитокины (фактор некроза опухоли а - ФНО-а, у интерферон - ИФН-у, интерлейкины ljj и 4 - ИЛ-ip и ИЛ-4) (Berin et al., 1999; Perdue 1999; Ma et al., 2004; Al-Sadi, Ma, 2007).

Однако в литературе отсутствуют данные об изменении проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на пищевые белки при их совместном поступлении с компонентами питания. Известно, что пектины, входящие в состав продуктов питания и широко применяемые в пищевой промышленности, присутствуют в пищевом рационе человека наряду с белками (Скальный и др., 2005) и обладают иммуномодулирующим действием (Sakurai et al., 1999; Inagaki et al., 2001; Kiyohara et al., 2002; Vos et al., 2007; Оводов и др., 2009). Способность пектинов модулировать активность тучных клеток (Sawabe et al., 1992; Kobayashi et al., 2004) и секрецию цитокинов иммунными клетками (Inngjerdingen et al., 20076; Guo et al., 2000), a также взаимодействовать со слизистой кишечника (Liu et al., 2005) определяет их возможность изменять проницаемость кишечной стенки для белковых антигенов. Однако до сих пор не изучена проницаемость стенки кишки и развитие иммунного ответа на белковый антиген, поступающий с пектинами. Не исследована секреция цитокинов, модулирующих кишечную

проницаемость, у животных, получающих белок с пектиновыми полисахаридами. Слабо охарактеризовано действие пектинов на протеолиз белков, между тем расщепление белка в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) влияет на его молекулярные характеристики и тем самым может изменить его способность проникать через кишечный барьер.

Выяснение механизмов действия пектинов на проницаемость кишечной стенки и иммунный ответ на белковые антигены важно для регулирования барьерной функции и иммунитета кишечника.

Цель исследования - изучить проницаемость кишечной стенки для OVA и иммунный ответ на белок, поступающий с пектиновыми полисахаридами. Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:

1. Изучить проницаемость кишечной стенки для OVA, введенного перорально с пектиновыми полисахаридами.

2. Определить содержание цитокинов в слизистой тонкой кишки мышей после введения OVA с пектинами.

3. Изучить способность макрофагов секретировать цитокины у мышей, получивших OVA с пектинами.

4. Установить действие пектинов на протеолиз белка in vitro.

5. Исследовать развитие иммунного ответа на белковый антиген у мышей, получивших OVA с пектинами.

Научная новизна. Получены новые данные об иммуностимулирующем действии пектиновых полисахаридов. Впервые установлено, что проницаемость стенки кишечника для белкового антигена изменяется при поступлении белка с пектинами. Выявлены пектиновые полисахариды как повышающие (лемнаны, цирсиуман и цитрусовый пектин), так и снижающие (бадан, комаруман, гераклеуман) проницаемость кишечной стенки для OVA. Установлено, что модулирование пектинами проникновения белка обусловлено их влиянием на секрецию цитокинов и протеолиз белковой макромолекулы. Впервые показано, что пектины, повышающие проникновение OVA в кровь, стимулируют иммунный ответ на белок и ингибируют оральную толерантность к OVA. Показано, что фрагменты разветвленной области макромолекулы лемнана и цирсиумана обладают иммуностимулирующим действием.

Научно-практическая значимость. Расширены представления о модуляции проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на пищевые белки, а также о связи между структурой и иммуностимулирующей активностью пектинов. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что иммуностимулирующее действие пектинов может быть обусловлено повышением проницаемости кишечной стенки для антигенов. Эти результаты могут быть использованы для быстрого тестирования растительных полисахаридов с целью выяснения их иммуностимулирующей активности. Способность пектинов повышать проникновение совместно вводимого с ними

белка необходимо учитывать при составлении диет для пациентов, страдающих пищевыми аллергиями. Пектины, стимулирующие иммунный ответ на совместно вводимый с ними антиген, могут представлять интерес при создании пероральных вакцин.

Положения, выносимые на защиту:

1. Проницаемость кишечной стенки для белкового антигена изменяется при поступлении белка с пектиновыми полисахаридами.

2. Увеличение проникновения белка, вызванное пектинами, приводит к повышению иммунного ответа на антиген.

3. Модулирование пектинами проницаемости кишечной стенки для белка связано с изменением секреции цитокинов и протеолиза белковой макромолекулы.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н.Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), XIII Молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2006), VI Молодежной научной конференции Института физиологии «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2007), 14-ом Европейском симпозиуме по углеводам "Eurocarb 14", (Любек, Германия, 2007), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на севере» (Сыктывкар, 2008), V Всероссийской школе-конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы в соавторстве опубликовано девять печатных работ (из них четыре опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы (192 источника). Диссертация содержит 20 таблиц и шесть рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа выполнена на белых лабораторных мышах обоего пола массой 20-25 г, животные содержались в стандартных условиях вивария на лишенной животного белка диете. Доступ к корму и воде ad libitum. Проведение экспериментов на животных выполняли в соответствии с рекомендациями Комитета по биоэтике Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН.

Характеристика пектинов, используемых в работе. В работе использованы коммерческие препараты цитрусового (PC, MP Biomedicals) и яблочного (PA, Sigma) пектинов, а также пектины, выделенные из следующего растительного сырья: ряски малой Lemna minor L., (лемнан LM), каллуса ряски малой (лемнан LMC), стеблей бодяка съедобного Cirsium esqulentum Siev. (цирсиуман СЕ), бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (бергенан ВС), борщевика сибирского Heracleum sibiricum L. (гераклеуман HS), сабельника болотного Comarum palustre L. (комаруман CP). Выделение пектиновых полисахаридов и установление их химической структуры проведено в лаборатории ппикологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. Пектины растворяли в фосфатно-буферном растворе (PBS) непосредственно перед введением животным. В работе исследовали пектины, имеющие разный тип построения углеводной цепи. Бергенан ВС, значительная часть макромолекулы которого представлена метилэтерифицированным линейным галактуронаном; цирсиуман СЕ, в состав макромолекулы которого входят линейный галактуронан и разветвленный рамногалактуронан I; гераклеуман HS, главным компонентом макромолекулы которого является линейный галактуронан; комаруман CP, в состав которого входят разветвленный и линейный галактуронан, а также разветвленный рамногалактуронан I; лемнаны LM и LMC, в состав которых входят линейный галактуронан, апиогалактуронан и разветвленный рамногалактуронан I.

Определение концентрации белка в крови. Для определения количества OVA (Appli Chem), проникающего через стенку кишки, мышам перорально при помощи полиэтиленового зонда вводили белокв дозах 50,250,500 и 1000 мг/кг. Содержание белка определяли через полчаса, один, три, шесть часов и спустя сутки после введения OVA. При помощи кардиопункции у мышей забирали кровь, центрифугированием (4000 об/мин, 20 мин) отделяли сыворотку крови, в которой измеряли концентрацию OVA. Для изучения проникновения в кровь белка, поступающего с пектинами, мышам перорально вводили смесь OVA (доза 1000 мг/кг) и пектинов (доза 50 мг/кг). Контрольные животные получали только белок (доза 1000 мг/кг). Концентрацию OVA в крови измеряли с помощью конкурентного иммуно-ферментного анализа (ИФА), используя политональные анти-ОУА-антитела (Кэтти, Райкундалиа, 1991).

Определение концентрации цитокинов в слизистой тонкой кишки. Через три часа после введения белка или белка с пектинами у мышей изолировали тонкую кишку. Содержимое тонкой кишки и слизистую соскабливали и собирали в пробирки, взвешивали, гомогенизировали в 1 мл PBS и перемешивали в течение 30 минут. Гомогенат слизистой центрифугировали 10 минут при lOOOxg. Надосадочную жидкость делили на

аликвоты и замораживали для дальнейшего определения в них цитокинов: ФНО-а, ИЛ-1 (3 и ИФН-у. Измерение концентрации цитокинов проводили при помощи сэндвич ИФА, используя моноклональные и биотилированные анти-ФНО-а-, анти-ИЛ-ip- и анти-ИФН-у-антитела (Кэтти, Райкундалиа, 1991).

Оценка продукции цитокинов перитонеальными макрофагами. Для определения секреции цитокинов (ФНО-а и ИФН-у) макрофагами перитонеального смыва использовали общепринятый способ активации лейкоцитов и получения смыва брюшной полости (Клаус, 1990). Суспензию лейкоцитов (100 мкл), содержащую 2x106 клеток в питательной среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, вносили в лунки плоскодонных микрокулыуральных планшетов и инкубировали в С02-инкубаторе в течение 2 часов при 37 °С. Неадгезированные лейкоциты удаляли, трижды отмывая планшеты питательной средой. Микроскопическим путем было установлено, что монослой клеток, адгезированных на пластике, содержит преимущественно макрофаги. Далее в лунки вносили по 100 мкл свежей питательной среды, содержащей 10% фетальной сыворотки, Р-меркаптоэтанол, антибиотики и липополисахарид грамотрицательных бактерий (1 мг/л), необходимый для стимулирования макрофагов. Образцы инкубировали в С02-инкубаторе в течение 24 часов при 37 °С, после чего планшеты центрифугировали (800xg, 10 мин) и отбирали надосадочную жидкость клеточной суспензии, которую затем делили на аликвоты и замораживали (Petursdottir et al., 2002) для последующего определения в них концентрации цитокинов (ФНО-а и ИФН-у) с помощью сэндвич ИФА, используя моноклональные и биотилированные анти-ФНО-а - и анти-ИФН-у-антитела (Кэтти, Райкундалиа, 1991).

Протеолиз белка в присутствии пектинов in vitro, OVA подвергали протеолизу, используя схему, разработанную ранее (Mouecoucou et al., 2006). Белок обрабатывали пепсином и соляной кислотой, а затем протеолитическими ферментами поджелудочной железы (трипсином и химотрипсином). Смесь белка и пектинов (пектин борщевика - гераклеуман HS, цитрусовый пектин) в отношении 1:1 готовили на фосфатном буфере (рН-7.3) и оставляли на ночь при 4 еС для агрегации молекул. Затем к смеси добавляли пепсин (соотношение фермент/субстрат: 1/125), инкубировали при 37°С. При этом в течение инкубации в раствор добавляли 0.06 н НС1, которая снижала рН с 7.3 до 1.85. После обработки пепсином и НС1 рН раствора доводили до 7.85 добавлением 2н NaOH. Смесь протеолитических ферментов поджелудочной железы (трипсин/химотрипсин 1:2.3) добавляли к белку с пектином в соотношении фермент/субстрат 1/50. Пробы отбирали через 0.5, 1, 2.5,4.5, 6.5 и 8.5 часов протеолиза (Mouecoucou et al., 2004). Исследуемые образцы диализовали (пропускная способность пор диализных мешков: 3-5 кДа) для удаления солей. После диализа образцы были лиофильно высушены. Контрольные пробы белка

подвергали протеолизу в тех же условиях, но без пектинов. Степень протеолиза оценивали, определяя молекулярную массу расщепленных фрагментов, используя электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, Fare, 1979).

Регистрация иммунного ответа у мышей на белковый антиген, введенный с пектиновыми полисахаридами. Для изучения развития иммунного ответа на белок у мышей цирсиуман СЕ, лемнан LMC, лемнан LM, цитрусовый и яблочный пектины вводили перорально при помощи полиэтиленового зонда мышам по 1 мг/день в течение 7 дней до и 7 дней после введения белка. Толерантность индуцировали пероральным введением 20 мг OVA, растворенного в 200 мкл PBS. Контрольные животные получали эквивалентный объем PBS. Через 7 дней мышей сенсибилизировали введением 50 мкл OVA в присутствии полного адъюванта Фрейнда (CFA) (OVA/CFA 2 мг/мл) подкожно в основание хвоста (Leishman et al., 2000). Спустя 14 дней после сенсибилизации регистрировали интенсивность иммунного ответа: у животных измеряли реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и концентрацию антиген-специфичных антител. ГЗТ вызывали с помощью инъекции агрегированного нагреванием OVA (25 мкл раствора 1 мг/мл) в левую лапку. В правую лапку вводили 25 мкл PBS. Через 24 часа измеряли толщину лапок с помощью плетизмометра (Ugo Basil, Comerio, Italy) или микрометра (Россия). Интенсивность ГЗТ определяли как разность толщины между левой и правой лапкой (утолщение) и выражали в микролитрах/ микрометрах. Концентрацию антиген-специфичных антител определяли с помощью непрямого ИФА (Кэтти, Райкундалиа, 1991).

Оценка противоаллергического действия цирсиумана СЕ. Для исследования развития анафилактической реакции на OVA животным, сенсибилизированным к OVA, трижды перорально с интервалом в 5 дней вводили OVA ( 1 мг) с цирсиуманом СЕ ( 1 мг) или только белок. Первое введение OVA или белка с пектином бодяка проводили одновременно с сенсибилизацией животных. Контрольные сенсибилизированные мыши перорально получали PBS. Животных сенсибилизировали введением 50 мкл OVA в присутствии CFA (20 мг/мл) подкожно в основание хвоста. Спустя 15 дней после сенсибилизации мышам перорально вводили разрешающую дозу антигена (50 мг) и в течение 30 минут наблюдали развитие анафилактической реакции (Hiño et al., 2004). Содержание иммуноглобулинов и цитокинов в крови определяли сразу после последнего перорального введения (через 10 дней после сенсибилизации) и после регистрации анафилаксии (через 15 дней после сенсибилизации). Развитие симптомов анафилактической реакции наблюдали в течение 30 минут после введения разрешающей дозы антигена. Интенсивность анафилаксии определяли по баллам: 0 - нет симптомов; 1 - зуд, почесывание носа и головы; 2 - отечность глаз, рта, снижение

активности, повышение частоты дыхания; 3 - свистящее дыхание, цианоз в области носа, хвоста; 4 - продолжительное замедление активности или ее отсутствие после толчка, судороги; 5 - смерть (Li, 2003). Установление структурных особенностей пектиновой макромолекулы, определяющих стимулирование иммунного ответа на овальбумин. С целью выявить активную область макромолекулы пектинов бодяка и ряски, стимулирующую иммунный ответ на OVA, сотрудники лаборатории гликологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН получили фрагменты разветвленной области пектиновой макромолекулы (лемнан LM-P и цирсиуман СЕ-Р). Мышей трижды перорально иммунизировали 1 мг OVA или смесью 1 мг белка и 1 мг пектинов (Kato et al., 2001). Иммунизацию проводили с интервалом в 7 дней, через неделю после последней иммунизации у животных забирали кровь из сердца и в сыворотке определяли титр антиген-специфичного IgG (Кэтги, Райкундалиа, 1991)

Статистическая обработка результатов. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное отклонение. Для оценки различий применяли t-критерий Стьюдента для сравнения выборок с нормальным распределением данных, при ненормальном распределении данных вариационного ряда использовали критерий Манна-Уитни, для анализа качественных признаков применяли критерий х,2- Различия признавали значимыми при р<0.05 (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Концентрация овальбумина в крови у мышей после его перорального введения совместно с пектинами. Установлено, что при введении OVA в крови обнаруживается около 1100 нг/мл OVA, что составляет 10"4 от количества введенного белка. Показано, что через три часа после введения содержание OVA в крови мышей, которым вводили белок с лемнанами LM и LMC, цирсиуманом СЕ и цитрусовым пектином РС, в три раза выше, чем у мышей, получавших только белок (рис. 1). Совместное введение OVA с комаруманом CP, бергенаном ВС и гераклеуманом HS приводит к снижению концентрации белка в крови (рис. 1). Проникновение OVA не изменяется в присутствии яблочного пектина РА (рис. 1).

Изучение динамики проникновения OVA показало, что белок обнаруживается в крови через полчаса, один, три и шесть часов после введения. Содержание белка в сыворотке мышей достигает максимума через шесть часов после введения, в дальнейшем его концентрация постепенно уменьшается (рис. 2). Установлено, что количество белка в сыворотке мышей, получавших OVA с цитрусовым пектином РС, не отличается от контроля через полчаса или час после поступления белка, а в дальнейшем повышается.

Цитрусовый пектин не только повышает проникновение OVA в кровь (количество белка у мышей, получавших цитрусовый пектин РС, в три раза выше, чем у животных, получавших только OVA), но и увеличивает длительность нахождения белка в крови. Показано, что О VA обнаруживается спустя сутки после введения в крови мышей, получавших OVA с цитрусовым пектином РС, тогда как в сыворотке мышей, получавших только белок, через сутки OVA отсутствует (рис. 2).

4500

й 4000 S

\ 3500

5 зооо

6

I 2600 5

g. 2000 t-

| 1500 | 1000 500 0

OVA _ _ OVA+пекгик

Рис. 1 Концентрация OVA в крови мышей, получавших белок с пектинами: PC, LM, CE, LMC, ВС, CP, HS и РА. Контрольные мыши получали только белок. Примечание: количество животных в группе-8; *- р<0,05 по сравнению с OVA.

Рис. 2. Динамика проникновения в кровь OVA, введенного перорально с цитрусовым пектином (gg). Контрольные мыши получали только белок (0). Примечание: количество животных в группе-7; *- р<0.05 по сравнению с OVA.

Полученные нами данные согласуются с результатами, полученными ранее, в которых установлено, что количество OVA, проникшего в кровь после перорального введения, составляет 10~5 - Ю-4 от общего количества введенного

белка (Peng et al., 1990; Fujihashi et al., 2001). Пенг (Peng) и соавторы, определяя содержание иммуногенного OVA, проникшего в кровь, выявили, что иммуногенный белок в крови обнаруживается уже через пять минут после введения, а через час его содержание составляет 10 s от общего количества введенного белка (Peng et al., 1990). Японские исследователи показали, что OVA, перорально введенный мышам, проникает в кровь уже через полчаса после введения, в дальнейшем его концентрация в крови постепенно возрастает и достигает 10"* от общего количества введенного белка (Fujihashi et al., 2001). Вероятнее всего, в основном транспорт белка происходит через энтероциты тонкой кишки, в которую OVA попадает через три часа после введения. Отсутствие OVA в крови через сутки после введения объясняется, вероятнее всего, тем, что весь белок к этому времени переваривается и удаляется из кишечника. Проницаемость кишечной стенки для OVA изменяется, если белок поступает с пектиновыми полисахаридами. Модулирование проникновения белков пектинами ранее не было показано. Известно лишь, что пектины снижают всасывание микронутриентов и глюкозы благодаря их способности образовывать комплексы с другими молекулами (Fuse et al., 1989). Установлено, что пектины по-разному влияют на проникновение OVA. Вероятнее всего, различия в структуре исследованных пектинов определяют их действие на проницаемость кишечной стенки для OVA, вводимого с этими пектинами.

Содержание цитокинов в слизистой оболочке тонкой кишки и продукция цитокинов макрофагами у мышей, получавших пектины перорально. Показано, что концентрация цитокинов в слизистой тонкой кишки мышей, получавших перорально OVA, не отличается от уровня цитокинов, обнаруженного в слизистой животных, которым вводили PBS (контроль). Установлено, что содержание ИФН-у, ИЛ-1 р, ФНО-а в слизистой кишки мышей, получавших OVA с цитрусовым пектином, лемнаном LM и цирсиуманом СЕ, выше, чем у мышей, которым вводили только белок. Совместное пероральное введение OVA с бергенаном ВС и комаруманом CP приводит к снижению уровня цитокинов в слизистой (рис. 3).

Изменение проницаемости кишечной стенки для OVA у мышей, получавших белок с пектинами, может быть обусловлено изменением содержания цитокинов, повышающих проницаемость кишечной стенки. Известно, что увеличение концентрации ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-1р в среде приводит к повышению как парацеллюлярного, так и трансцеллюлярного транспорта белков (Stein et al., 1998; Ma et al., 2005; Berin et al.,1999).

Изучение секреции цитокинов иммунными клетками у мышей, получавших пектины, показало, что продукция ФНО-а и ИФН-у перитонеальными макрофагами выше у мышей, получавших OVA с цитрусовым пектином (табл. 1).

Рис. 3. Содержание ИФН-у (А), ИЛ-1(3 (Б), ФНО-а (В) в слизистой тонкой кишки мышей через три часа после введения OVA или OVA с пектинами. Примечание: количество животных в группе-8; *- р<0.05 по сравнению с OVA.

Таблица 1

Продукция цитокинов неритонеальными макрофагами у мышей, получавших OVA с цитрусовым пектином

п/о введение п концентрация цитокинов, нг/мл

ФНО-а ИФН-у

OVA 7 59±3 138±10

OVA+PC 7 84±8* 184±15*

Примечание: * - р<0.05 по сравнению с OVA; п - количество животных в группе.

Способность пектинов, поступающих перорально, стимулировать секрецию цитокинов макрофагами ранее не была показана. Опубликованы работы, свидетельствующие о способности растительных полисахаридов активировать продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами (Inngjerdingen et al., 20076; Leung et al., 2004). Однако в данных работах полисахариды вводили в перитонеальную полость (Leung et al., 2004) или использовали макрофагальную культуру клеток (Inngjerdingen et al., 20076). Это обеспечивает непосредственный контакт макрофага с полисахаридом. В нашем же исследовании пектин поступает перорально, активация макрофагов перитонеальной полости, по-видимому, является опосредованной.

При определении степени протеолиза белка, гидролизованного в присутствии цитрусового пектина PC и гераклеумана HS, установлено, что

OVA подвергается протеолизу быстрее в присутствии цитрусового пектина. На это указывает наличие фрагмента с молекулярной массой 14.4 кДа через 1 час протеолиза белка. В контрольных пробах подобный фрагмент появляется только через 4.5 часа гидролиза. Более того, даже через 8.5 часов протеолиза в контрольных пробах сохраняется высокомолекулярный фрагмент, а в образцах, гидролизованных с цитрусовым пектином, он отсутствует (рис. 4Б). Показано, что в пробах белка, подвергнутого протеолизу в присутствии гераклеумана HS, фрагмент с молекулярной массой 14.4 кДа через 4.5 часа протеолиза отсутствует, что указывает на ингибирование протеолиза белка пектином борщевика (рис. 4В).

OVA

есгадный 0,5 X 2,5 4,5 6,5 8,5

вДа

" 21,5 ■ 14.4

0,5 1 2,5 4,5 6,5 8,5

ЬШ t"f f i *¡ -45,0

Б

0.5 1 2,5 4,5 6,5 8,5

-21.5 -14,4

• 45,0

В

-21.5

- 14,4

Рис. 4. Электрофореграмма фрагментов OVA, полученных в результате протеолиза белка in vitro в отсутствии (А) и в присутствии цитрусового пектина (Б) или гераклеумана HS (В).

Расщепление белковой макромолекулы в ходе протеолиза приводит к образованию фрагментов различной молекулярной массы. Очевидно, что фрагмент OVA, имеющий молекулярную массу 14 кДа, легче проникает через кишечный барьер, чем нативный OVA, молекулярная масса которого в три раза выше. По-видимому, усиление протеолиза OVA в присутствии цитрусового пектина способствует его проникновению в кровь. В результате протеолиза OVA с гераклеуманом HS, напротив, такого фрагмента с молекулярной массой 14 кДа не образуется, поэтому OVA меньше проникает в кровь.

Характеристика иммунного ответа на овальбумин, введенный перорально с пектиновыми полисахаридами. Установлено, что подкожная иммунизация мышей OVA в присутствии полного адъюванта Фрейнда приводит к развитию иммунного ответа против OVA. В ответ на подкожную инъекцию агрегированного нагреванием OVA в лапку сенсибилизированным мышам (контроль) развивается реакция ГЗТ, что говорит о вовлечении Т-клеточного звена в иммунный ответ (рис. 5А). Кроме того, в сыворотке сенсибилизированных мышей обнаруживается высокий титр антиген-специфичных антител класса IgG (рис. 5Б). Это свидетельствует о выраженном гуморальном ответе на введенный белок. Введение белка (20 мг) мышам за 7 дней до сенсибилизации вызывает толерантность - существенное снижение иммунного ответа. У толерантных мышей (группа «OVA») снижена реакция ГЗТ и продукция IgG (рис. 5А, Б).

Рис. 5 Развитие оральной толерантности к OVA: ГЗТ (А) и продукция анти-OVA-IgG (Б). Примечание: количество животных в группе -7; *- р<0.05 по сравнению контрольными мышами; **- р<0.05 по сравнению с OVA.

У животных, получавших лемнаны LM и LMC, цирсиуман СЕ и цитрусовый пектин с OVA, интенсивность ГЗТ (рис. 5А) и концентрация антител в сыворотке (рис. 5Б) выше, чем у толерантных мышей. Таким образом, пектиновые полисахариды ряски LM и LMC, бодяка СЕ и цитрусовый пектин повышают иммунный ответ на белковый антиген. Яблочный пектин не влияет на развитие толерантности к OVA (рис. 5А, Б).

Определение подклассов иммунноглобулина IgG (IgG, IgG2a) и IgE показало, что контрольные сенсибилизированные мыши имеют высокие титры антител. В сыворотке толерантных мышей концентрация иммуноглобулинов существенно ниже, чем в контроле. Концентрация анти-OVA-IgG, у мышей, получавших цитрусовый пектин, в два раза выше по сравнению с толерантными животными, тогда как концентрация IgG2a существенно не меняется. Введение цирсиумана СЕ приводит к стимуляции продукции IgG2>. В сыворотке мышей, получавших лемнаны LM и LMC, содержание обоих подклассов IgG выше, чем у толерантных животных. Концентрация IgE выше у мышей, получавших цитрусовый пектин и пектиновый полисахарид ряски LMC по сравнению с толерантными. Цирсиуман СЕ и лемнан LM не стимулируют продукцию IgE. Яблочный пектин не влияет на продукцию подклассов иммунноглобулина IgG и IgE (табл. 2).

Таблица 2

Концентрация анти-OVA-IgG, IgG2a и IgE в сыворотке мышей, получавших OVA или OVA с пектинами

п/о введение п титр IgGh log2 титр IgG2а, log2 IgE, мкг/мл

анти-OVA общий

PBS 7 13.0±2.1 10.8±2.0 6.6±1.0 930±159

OVA 7 7.3±2.6* 4.8±1.5* 4.4±0.5" 590±48*

OVA+LMC 7 11.5±1.4" 8.6±1.7" 6.Ш.0" 925±127"

OVA+LM 7 10±1.2" 7.8±1.5" 5.0±1.1 520±88

OVA+CE 7 9.5±1.8 13.0±0.7" 3.2±1.3" 480±32"

OVA+PC 7 13.4±1.7" 7.1±2.7 6.1±0.8** 780±59"

OVA+AP 7 5.6±2.4 5.0±2.4 7.8±1.5 630±150

Примечание: *- р<0.05 по сравнению с контролем; **- р<0.05 по сравнению толерантными мышами; п - количество животных в группе.

Повышение ГЗТ и стимуляция продукции IgGa указывает на активацию Т-хелпер 1 (Th-1) лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток (макрофагов, нейтрофилов), участвующих в генерировании ГЗТ. Активация Th-1 иммунного ответа пектиновыми веществами была показана в ряде работ (Lee, 2004; Vos, 2004; Vos, 2007). В свою очередь, Т-хелпер 2 (Th-2) лимфоциты,

выделяют ряд цитокинов, заставляющих В-лимфоцит секретировать IgG,, IgE (Marinaro et al., 1995). Поэтому стимуляция продукции IgG,, наряду с IgG2j у мышей, получавших лемнаны LM и LMC, свидетельствует об активации также и Th-2 лимфоцитов пектинами. Смешанный (Th-1 и Th-2) тип активации иммунитета характерен и для известных иммуноадьювантов (Su et al., 2004; Richards et al., 2001; Boyaka et al., 2001). Цитрусовый пектин активирует продукцию IgG,, IgE, что свидетельствует о стимуляции Th-2 лимфоцитов. Пероральное введение цирсиумана СЕ не приводит к увеличению IgG, и IgE антител, а, напротив, стимулирует только образование анти-OVA-IgG^ что, по-видимому, указывает на способность пектина бодяка активировать преимущественно Th-1 тип иммунного ответа.

Действие пектина бодяка, цирсиумана СЕ, на развитие аллергической реакции. Установлено, что у сенсибилизированных мышей в ответ на введение разрешающей дозы аллергена развивается сильная анафилактическая реакция (100% контрольных животных имеют высокие баллы: 3 - 4). Подобная интенсивность анафилаксии наблюдается у 75% сенсибилизированных мышей, перорально получивших OVA, тогда как степень анафилаксии в два раза ниже (38%), если животные получают OVA с цирсиуманом СЕ.

Показано, что содержание анти-OVA-IgE в сыворотке контрольных сенсибилизированных животных составляет 40 нг/мл спустя 10 дней после сенсибилизации и увеличивается после введения разрешающей дозы белка. Пероральная иммунизация OVA сенсибилизированных мышей стимулирует продукцию антител: концентрация анти-OVA-IgE выше контрольных значений через 10 дней после сенсибилизации, а после введения разрешающей дозы белка (через 15 дней) уровень IgE сравнивается с контрольными значениями. Введение OVA с цирсиуманом СЕ приводит к уменьшению концентрации анти-OVA-IgE как через 10, так и через 15 дней. Аналогичные результаты получены при определении содержания общего IgE в сыворотках животных (табл. 3).

Таблица 3

Содержание IgE в сыворотке крови у мышей, перорально иммунизированных OVA или OVA с цирсиуманом СЕ

п/о введение п 10 дней 15 дней

анти-OVA, нг/мл общий, мкг/мл анти-OVA, нг/мл общий, мкг/мл

PBS 8 40±4 986±108 60±10 1318±190

OVA 8 68±4* 1678±306* 50±16 1152±185

OVA+CE 8 43±7** 1090±128" 28±8" 756±65"

Примечание: *- р<0.05 по сравнению с контролем; **- р<0.05 по сравнению с мышами, иммунизированными OVA; п - количество животных в группе.

Показано, что цирсиуман ингибнрует анафилаксию, снижая содержание IgE и IgGj, и, напротив, повышает продукцию ИФН-у и IgG2i. Подобный путь противоаллергического действия веществ уже был показан в ряде работ (Hasegawa et al., 1999; Shida et al., 2002; Saito et al., 2003; Marinara et al., 1999). Судя по всему, цирсиуман может снижать аллергическую реакцию на белок на стадии сенсибилизации, ингибируя образование аллерген-специфичного иммуноглобулина IgE. Наиболее вероятной мишенью воздействия пектина бодяка является антиген-презентирующие клетки кишечника, секретируюшие ИЛ-12 (макрофаги, дендритные клетки). В свою очередь, ИЛ-12 стимулирует продукцию ИФН-у Th-1 лимфоцитами, что приводит к ингибированию секреции IgE. Наши данные подтверждают ранее полученные результаты ингибирования аллергии веществами, сдвигающими иммунный ответ с Th-2 пути на Th-1 путь иммунного ответа.

Иммунный ответ на OVA у мышей, иммунизированных OVA или смесью OVA с лемнаном LM-P и цирсиуманом СЕ-Р. Показано, что у животных, перорально иммунизированных только OVA (контроль), содержание антиген-специфичных антител в сыворотке незначительно. Трехкратная пероральная иммунизация OVA как с исходными пектинами бодяка и ряски (цирсиуман СЕ и лемнан LM), так и с лемнаном LM-P и цирсиуманом СЕ-Р, полученными в результате ферментативного гидролиза, приводит к повышению титра анти-OVA-IgG в сыворотке (табл. 4).

Таблица 4

Концентрация антиген-специфичных антител в крови мышей, иммунизированных только OVA или OVA с пектинами

п/о введение л титр анти-OVA-IgG, logr

OVA (контроль) 8 7.3±1,3

OVA+LM 8 11.3±0.5*

OVA+LM-P 8 12.0±1.7*

OVA+CE 8 13.3Ü.2*

OVA+CE-P 8 14.8±1.7*

Примечание: * - р<0.05 по сравнению с ОУА; п - количество животных в группе

Стимуляция иммунного ответа лемнаном ЬМ-Р и цирсиуманом СЕ-Р свидетельствует о том, что именно разветвленный участок пектиновой молекулы определяет иммуностимулирующее действие пектинов. Результаты, согласующиеся с нашими, были получены ранее японскими исследователями (Ма15шпоЮ, Уатаёа, 1995; Ьпщейцщеп е1 а1., 2007а). Более того, установлено, что повышение содержания остатков галактуроновой кислоты в макромолекуле пектина приводит к снижению его иммуностимулирующей активности (КлуоКага е1 а1., 2002).

выводы

1. Овальбумин, введенный перорально, частично проникает в кровь, сохраняя свои антигенные свойства. Проницаемость кишечной стенки для овальбумина увеличивается при его совместном введении с цитрусовым пектином (PC), пектинами ряски (лемнанами LM, LMC) и бодяка (цирсиуманом СЕ).

2. Увеличение проницаемости кишечной стенки обусловлено повышением концентрации цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ip, ИФН-у) в слизистой оболочке кишки, стимуляцией продукции цитокинов макрофагами, а также усилением протеолиза белка под действием пектинов.

3. Повышение концентрации иммуногенного овальбумина в крови, вызванное пектинами, приводит к активации у мышей иммунного ответа на белок: происходит усиление реакции ГЗТ и стимулирование образования антител.

4. Пектин бодяка, цирсиуман СЕ, препятствует развитию аллергической реакции, что обусловлено уменьшением продукции IgE.

5. Активной областью лемнана LM и цирсиумана СЕ является разветвленный фрагмент пектиновой макромолекулы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Храмова Д.С., Гюнгтер Е.А. Действие лемнана, пектина из каллуса ряски малой Lemna minor L. на толерантность к белковому антигену // Вестник уральской медицинской академической науки. Екатеринбург. 2006. №3-1(14). С.324-326.

2. Popov S.V., Gbnter Е.А., Markov Р.А., Smirnov V.V., Khramova D.S., Ovodov Yu.S. Adjuvant effect of lemnan, pectic polysaccharide of callus culture of Lemna minor L. at oral administration // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2006. Vol.28. P.141-152.

3. Popov S.V., Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Smirnov V.V., Khramova D.S., Popova G.Yu., Ovodov Yu.S. Characterisation of the oral adjuvant effect of lemnan, a pectic polysaccharide of Lemna minor L. // Vaccine. 2006. Vol.24. P.5413-5419.

4. Khramova D.S., Popov S.V., Golovchenko V.V., VityazevF.V., Paderin N.M., Ovodov Yu. S. Abrogation of the oral tolerance to ovalbumin in mice by citrus pectin // Nutrition. 2009. Vol. 25. P. 226-232.

Тезисы докладов на конференции:

5. Храмова Д.С. Ингибирующее действие цитрусового пектина на толерантность к белковому антигену // Тезисы докладов VI Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, «Физиология

человека и животных: от эксперимента к клинической практике». Сыктывкар, 2007. С. 128-130.

6. Храмова Д.С., Гюнтер Е.А Выделение и иммуностимулирующая активность лемнана, пектина из каллуса ряски малой Lemna minor L. // Материалы докладов XIII Молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар, 2007. С.294-267.

7. Khramova D.S., Gbnter Е.А. Effects of citrus pectin and lemnan, pectin from callus culture of duckweed Lemna minor (L.) on oral tolerance and intestinal permeability //Abstract of the 14ft European carbohydrate symposium "Eurocarb 14 ", Lbbeck, 2-8 September 2007. Lubeck, 2007. P.383.

8. Храмова Д.С., Головченко B.B. Выделение и иммуностимулирующая активность цирсиумана, пектина из стеблей бодяка съедобного Cirsium esculentum (Siev.), при пероральном введении // Тезисы докладов V Всероссийской школы-конференции «Химия и технология растительных веществ». Уфа, 2008. С.62

9. Khramova D.S., Golovchenko V. V., Otgonbayar D., Chimidsogzol A. Isolation, characterization, immunostimulatory and anti-allergic activities of cirsiuman, pectin from ground thistle Cirsium esculentum Siev. // Abstract of the III International conférence «Chemical investigation and utilization of natural resources». Ulan-Bator, 2008. P. 62

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность своему научному руководителю кандидату биологических наук, доценту Сергею Владимировичу Попову и научному консультанту академику Юрию Семеновичу Оводову за ценные советы и консультации, кандидату химических наук, доценту Виктории Владимировне Головченко, кандидату химических наук, ст.н.с. Раисе Григорьевне Оводовой и кандидату биологических наук, доценту Елене Александровне Гюнтер за предоставленные образцы пектиновых полисахаридов и их структурно-химические характеристики, а также всем сотрудникам Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН за поддержку и помощь в подготовке и выполнении работы.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планами НИР Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН на 2005-2008 гг. (ГР № 01.200107401) и поддержана грантами РФФИ (06-04-48079-а; 07-04-90120_монг_а), Программы ведущих научных школ (№ НШ-5796.2006.4), Программы Президиума РАН, «Молекулярная и клеточная биология», Программы президиума РАН, «Фундаментальные науки - медицине», Фонда содействия отечественной науке по программе "Лучшие аспиранты РАН", научных проектов молодых ученых и аспирантов УрО РАН.

Лицензия № 0025 от 20.06.96

Компьютерный набор. Формат 60x90 1\16 Бум. Куш Lux. Отпечатано на ризографе. Усл.печ.л. 1

Тираж 100 Заказ №95

Информационно-издательский отдел Учреждения Российской академии наук Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Храмова, Дарья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Проницаемость кишечной стенки

1.2 Иммунный ответ на белковые антигены, поступающие в кишечник

1.3 Пектиновые полисахариды и их иммуномодулирующая активность

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследования

2.2 Растворы и реагенты

2.3 Характеристика пектинов, используемых в работе

2.4 Определение концентрации OVA в крови

2.5 Определение концентрации цитокинов в слизистой тонкой кишки

2.6 Оценка продукции цитокинов перитонеальными макрофагами

2.7 Протеолиз OVA в присутствии пектинов in vitro

2.8 Измерение активности протеолитических ферментов

2.9 Регистрация иммунного ответа у мышей на белковый антиген, 44 введенный с пектиновыми полисахаридами

2.10 Оценка противоаллергического действия цирсиумана 47.

2.11 Определение количества кишечной слизи

2.12 Установление структурных особенностей пектиновой 49 макромолекулы, определяющих стимулирование иммунного ответа на овальбумин

2.13 Статистическая обработка результатов

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Концентрация OVA в крови у мышей после его перорального 53 введения с пектинами

3.2 Содержание цитокинов в слизистой оболочке тонкой кишки и продукция* цитокинов макрофагами у. мышей, получивших пектины перорально

3.3 Степень протеолиза OVA, гидролизованного in vitro в присутствии 61 цитрусового пектина и гераклиумана, и активность протеолитичесих ферментов in vitro

3.4 Характеристика иммунного ответа на OVA, введенный перорально 65 с пектиновыми полисахаридами

3.5 Действие пектина бодяка, цирсиумана СЕ, на развитие 69 аллергической реакции

3.6 Иммунный ответ на OVA, введенный с фрагментами 73 макромолекулы цитрусового пектина, лемнана и цирсиумана

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Проницаемость кишечной стенки для белкового антигена, 76 введенного перорально с пектиновыми полисахаридами

4.2 Изменение продукции цитокинов и модулирование протеолиза 84 белка как возможный механизм действия пектинов на проницаемость кишечной стенки для белкового антигена

4.3 Развитие оральной толерантности у мышей, получавших OVA с 94 пектинами

4.4 Особенности иммуностимулирующего действия пектина бодяка 97 съедобного (цирсиумана СЕ)

4.4 Выявление активной области пектиновой макромолекулы, определяющих их иммуностимулирующее действие ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модуляция пектинами проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на овальбумин"

Актуальность исследования. Регуляция иммунного ответа на пищевые белки является актуальной проблемой иммунофизиологии. Иммунный ответ на антигены пищи зависит от барьерной функции кишечника, которая является важнейшим механизмом, препятствующим проникновению в кровь макромолекул пищевых белков (Kraehenbuhl et al., 1997). В последние десятилетия получены данные, свидетельствующие о том, что небольшие количества белков проникают из просвета кишки в кровь в непереваренном виде путем эндоцитоза (Udall et al., 1981; Bendayan et al., 1990; Ziv, Banyana, 2000; Bruneau et al., 2003; Cloutier et al., 2006; Cammisotto et al., 2007). Показано, что проникновение в кровь овальбумина (OVA) в высокомолекулярном виде в количестве, составляющем 0.001 - 0.01% от введенного белка, не препятствует развитию оральной толерантности к этому белку (Bruce, Ferguson, 1986; Friedman, 1996). Известно, что повышение проникновения белковых антигенов в кровь стимулирует иммунный ответ на эти антигены. Так, адъювантное действие бактериальных токсинов обусловлено увеличением транспорта антигенов в кровь (Kosecka et al., 1994; Rappuoli et al., 1999), а аллергические реакции на сою связывают с повышением проникновения белков соевого боба в кровоток (Weangsripanavaly et al., 2005). Повышение проницаемости кишечной стенки наблюдается при различных патологических состояниях (Hollander et al., 1986; Benard et al., 1996; Kiliaan et al., 1998; Лусс, 2003). При этом модулировать, кишечную проницаемость могут медиаторы воспаления, выделяемые активированной тучной- клеткой (гистамин, брадикинин) (Stein et-al.,' 1998), цитокины (фактор, некроза опухоли а (ФНО-а), у интерферон ИФН-у), интерлейкины 1р и 4 (ИЛ-1(3 и ИЛ-4) (Berin et al., 1999; Perdue 1999; Ma et al., 2004; Al-Sadi, Ma, 2007).

Однако в литературе отсутствуют данные об изменении проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на пищевые белки, при их совместном поступлении с компонентами питания. Известно, что пектины, входящие в состав продуктов питания и широко применяемые в пищевой промышленности, присутствуют в пищевом рационе человека наряду с белками (Скальный и др., 2005) и обладают иммуномодулирующим действием (Sakurai et al., 1999; Inagaki et al., 2001; Kiyohara et al., 2002; Vos et al., 2007; Оводов и др., 2009). Способность пектинов модулировать активность тучных клеток (Sawabe et al., 1992; Kobayashi et al., 2004) и секрецию цитокинов иммунными клетками (Inngjerdingen et al., 20076; Guo et al., 2000), а также взаимодействовать со слизистой кишечника (Liu et al., 2005) определяет их возможность изменять проницаемость кишечной стенки для белковых антигенов. Однако до сих пор не изучена проницаемость стенки кишки и развитие иммунного ответа на белковый антиген, поступающий с пектинами. Не исследована секреция цитокинов, модулирующих кишечную проницаемость, у животных, получающих белок с пектиновыми полисахаридами. Слабо охарактеризовано действие пектинов на протеолиз белков, между тем протеолиз белка в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) влияет на его молекулярные характеристики и тем самым может изменить его способность проникать через кишечный барьер.

Выяснение механизмов действия пектинов на проницаемость кишечной стенки и иммунный ответ на белковые антигены важно для регулирования барьерной функции и иммунитета кишечника.

Цель исследования - изучить проницаемость кишечной стенки для OYA и иммунный ответ на белок, поступающий с пектиновыми полисахаридами.

Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:

1. Изучить проницаемость кишечной стенки для OVA, введенного перорально с пектиновыми полисахаридами.

2. Определить содержание цитокинов в слизистой тонкой кишки мышей, после введения OVA с пектинами.

3. Изучить способность макрофагов секретировать цитокины у мышей, получивших OVA с пектинами.

4. Установить действие пектинов на протеолиз белка in vitro.

5. Исследовать развитие иммунного ответа на белковый антиген у мышей, получивших OVA с пектинами.

Научная новизна. Получены новые данные об иммуностимулирующем действии пектиновых полисахаридов. Впервые установлено, что проницаемость стенки кишечника для белкового антигена изменяется при поступлении белка с пектинами. Выявлены пектиновые полисахариды как повышающие (лемнаны, цирсиуман и цитрусовый пектин), так и снижающие (бадан, комаруман, гераклеуман) проницаемость кишечной стенки для OVA. Установлено, что модулирование пектинами проникновения белка обусловлено их влиянием на секрецию цитокинов и протеолиз белковой макромолекулы. Впервые показано, что пектины, повышающие проникновение OVA в кровь (лемнаны, цирсиуман и цитрусовый пектин), стимулируют иммунный ответ на белок. Обнаружено, что лемнаны, цирсиуман и цитрусовый пектин ингибируют оральную толерантность к OVA. Показано, что фрагменты разветвленной области макромолекулы лемнана и црсиумана обладают иммуностимулирующим действием.

Научно-практическая значимость. Расширены представления о модуляции проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на пищевые белки, а также о связи между структурой и иммуностимулирующей активностью пектинов. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что иммуностимулирующее действие пектинов может быть обусловлено повышением проницаемости кишечной стенки для антигенов. Эти результаты могут быть использованы для быстрого тестирования растительных полисахаридов с целью выяснения их иммуностимулирующей активности. Способность пектинов повышать проникновение совместно вводимого с ними белка, необходимо учитывать при составлении диет для пациентов, страдающих пищевыми аллергиями. Пектины, стимулирующие иммунный ответ на совместно вводимый с ними антиген, могут представлять интерес при создании пероральных вакцин.

Положения, выносимые на защиту:

1. Проницаемость кишечной стенки для белкового антигена изменяется при поступлении белка с пектиновыми полисахаридами.

2. Увеличение проникновения белка, вызванное пектинами, приводит к повышению иммунного ответа на антиген.

3. Модулирование пектинами проницаемости кишечной стенки для белка связано с изменением секреции цитокинов и протеолиза белковой макромолекулы.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н.Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), XIII Молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2006), VI Молодежной научной конференции Института физиологии «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2007), 14-ом Европейском симпозиуме по углеводам "Eurocarb 14", (Любек, Германия, 2007), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на севере» (Сыктывкар, 2008), V Всероссийской школе-конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы в соавторстве опубликовано девять печатных работ (из них четыре опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК).

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Храмова, Дарья Сергеевна

107 Выводы

1. Овальбумин, введенный перорально, частично проникает в кровь, сохраняя свои антигенные свойства. Проницаемость кишечной стенки для овальбумина увеличивается при его совместном введении с цитрусовым пектином (PC), пектинами ряски (лемнанами LM, LMC) и бодяка (цирсиуманом СЕ).

2. Увеличение проницаемости кишечной стенки обусловлено повышением концентрации цитокинов (ФНО-а, HJl-ip, ИФН-у) в слизистой оболочке кишки, стимуляцией продукции цитокинов макрофагами, а также усилением протеолиза овальбумина под действием пектинов.

3. Повышение концентрации иммуногенного овальбумина в крови, вызванное пектинами, приводит к активации у мышей иммунного ответа на белок: происходит усиление реакции ГЗТ и стимулирование образования антител.

4. Пектин бодяка цирсиуман СЕ препятствует развитию аллергической реакции, что обусловлено уменьшением продукции IgE.

5. Активной областью лемнана LM и цирсиумана СЕ является разветвленный фрагмент пектиновой макромолекулы.

108

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Храмова, Дарья Сергеевна, Сыктывкар

1. Бурмистрова A.JI. Иммуный гомеостаз и микросимбиоценоз. Метаморфозы и пути развития воспалительных заболеваний кишечника. Челябинск: Челябинский дом печати. 1997. 216 с.

2. Гизингер О.А., Долгушин И.И. Система провоспалительных цитокинов в цервикальном секрете у женщин с урогенитальным хламидиозом // Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5. № 4. С. 13-16.

3. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. М.: Издательство АТНРФ. 1995. 387с.

4. Жерносек В.Ф, Василевский И.В., Дюбкова Т.П. Бронхиальная астма у детей. М.: Полибиг. 1999. 194 с.

5. Камкин А.Г., Каменский А.А. Фундаментальная и клиническая физиология: Учебник для студ. высш. учеб. заведений / под ред. А.Г. Камкина, А.А. Каменского. М.: Издательский центр «Академия». 2004. 1072 с.

6. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы. Пер с англ / под ред. А.Н. Марца. М.: Мир. 1990. 393 с.

7. Кэтти Д., Райкундалиа Ч. Иммуноферментный анализ (ИФА) // Антитела Методы. В 2-х кн. Кн.2: Пер с англ / под ред. Д. Кэтти. М.: Мир. 1991. 384 с.

8. Лакин, Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352с.

9. Лусс Л. Пищевая аллергия: проблемы диагностики и терапии // Врач. 2003. №11. С. 64-68.

10. Мазо В.К., Лоранская И.Д., Зорин С.Н., Гмошинский И.В., Ширина Л.И., Юрков М.Ю., Митрофанова И.П. Оценка проницаемости кишечного барьера для макромолекул у больных с болезнью крона и язвенным колитом. // Клин. мед. 1998. №11. С. 31-33.

11. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. 2000. Т.65. № 4. С. 485-503.

12. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Мир. 1971. 398с.

13. Муравьев Ю.В., Лебедева В.В., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Проницаемость защитного барьера кишечника у больных ревматическими заболеваниями, длительно получающих нестероидные противовоспалительные препараты // Клиническая медицина. 1999. №11. С. 31-33.

14. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорган, химия. 1998. Т. 42. № 7. С. 301-310.

15. Оводов Ю.С. Современные представления о пектиновых веществах // Биоорган, химия. 2009. Т. 35. № 3. С. 293-310.

16. Оводов Ю.С., Головченко В.В., Гюнтер Е.А., Попов С.В. Пектиновые вещества растений Европейского Севера России. Екатеринбург: УрОРАН. 2009. 110с.

17. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина. 1987. 416с.

18. Попов С.В., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю., Никитина И.Р., Оводов Ю.С. Ингибирующее действие пектиновых галактуронанов на адгезию нейтрофилов //Биоорганическая химия. 2007. Т. 33. № 1. С. 187-192.

19. Скальный А.В., Рудаков И.А., Нотова С.В., Бурцева Т.И., Скальный В.В., Баранова О.В. Основы здорового питания: пособие по общей нутрициологии. Оренбург: ГОУ ОГУ. 2005. 117 с.

20. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Ленинград: Наука. 1985. 544 с.

21. Хэм А., Кормак Д. Пищеварительная система // Гистология. В 5-ти томах Т.4: пер с англ / под ред. Ю.И. Афанасьева, Ю.С.Ченцова. М.: Мир. 1983. 245 с.

22. Эве К., Карбах У. Функции желудочно-кишечного тракта // Физиология человека. В 3-х томах. Т.З/ цод ред. Р. Шмидт, Г. Тевс. М: Мир. 1996. 877 с.

23. Ajuebor M.N., Flower R.J., Hannon R., Christie M., Bowers K., Verity A., Perretti M. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model // J. Leukoc. Biol. 1998. Vol. 63. P. 108-116.

24. Allen A., Flemstro G. Gastroduodenal mucus bicarbonate barrier: protection against acid and pepsin // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005. Vol. 288. P. C1-C19.

25. Al-Sadi R.M., Ma T.Y. R.M. IL-ip causes an increase in intestinal epithelial tight junction permeability // J. Immunol. 2007. Vol. 178. P. 4641-4649.

26. Barbeau E. Interactions between dietary proteins and the immune system: implications for oral tolerance and food- related diseases // Food Proteins and Lipids. 1997. Vol. 156. P. 183-193.

27. Benard A., Desreumeaux P., Huglo D., Hoorelbeke A., Tonnel A.B., Wallaert B. Increased intestinal permeability in bronchial asthma // J. Allergy Clin. Immunol. 1996. Vol. 97. P. 1173-1178.

28. Bendayan M., Ziv E., Ben-Sasson R., Bar-On H., Kidron M. Morpho-cytochemical and biochemical evidence for insulin absorption by the rat ileal epithelium//Diabetology. 1990. Vol. 33. P. 197-204.

29. Benjamin M.A., McKay D.M., Yang P.C., Cameron H., Perdue M.H. Glucagonlike peptide-2 enhances intestinal epithelial barrier function of both transcellular and paracellular pathways in the mouse // Gut. 2000. Vol. 47. P. 112— 117.

30. Bergstedt-Lindqvist S., Moon H.B., Persson U., Moller G., Heusser C., Severinson E. Interleukin 4 instructs uncommitted В lymphocytes to switch to IgGl and IgE // Eur. J. Immunol. 1988. Vol. 18. P.: 1073-1077.

31. Berin M.C., Yang P.-Ch., Ciok L., Waserman S., Perdue M.H. Role for IL-4 in macromolecular transport across human intestinal epithelium // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1999. Vol. 276. P. C1046-C1052.

32. Blandizzi C., Gherardi G., Marveggio C., Lazzeri G., Natale G., Carignani D., Colucci R., Tacca M. Suramin enhances ethanol-induced injury to gastric mucosa in rats // Dig. Dis. Sci. 1997. Vol. 42. P. 1233-1241.

33. Boivin M.A., Ye D., Kennedy J.C., Al-Sadi R., Shepela C., Ma T.Y. Mechanism of glucocorticoid regulation of the intestinal tight junction barrier // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2007. Vol. 292. P. G590-G598.

34. Boneberg E.-M., Hartung T. Mistletoe lectin-1 increases tumor necrosis factor-a release in lipopolysaccharide-stimulated whole blood via inhibition of interleukin-10 production // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 298. P. 996-1000.

35. Boyaka P.N., Marinaro M., Jackson R.J., van Ginkel F.W., Cormet-Boyaka E., Kirk K.L., Kensil C.R., McGhee J.R. Oral QS-21 requires early IL-4 help for induction of mucosal and systemic immunity // J. Immunol. 2001. Vol. 166. P. 2283-2290.

36. Bruce M.G., Ferguson A. The influence of intestinal processing on the immunogenicity and molecular size of absorbed, circulating ovalbumin in mice // J. Immunol. 1986. Vol. 59. P. 295-300.

37. Bruneau N., Bendayan M., Gingras D., Ghitescu L., Levy E., Lombardo D. Circulating bile salt-dependent lipase originates from the pancreas via intestinal transcytosis // Gastroenterology. 2003. Vol. 124. P. 470-480.

38. Cameron H.L., Perdue M.H. Stress impairs murine intestinal barrier function: improvement by glucagon-like peptide-2 // J. Pharmacol. Exp. Therapeutics. 2005. Vol. 314. P: 214-220.

39. Cammisotto P.G:, Gingras D., Bendayan M. Transcytosis of gastric leptin through the rat duodenal mucosa // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2007. Vol. 293. P. G773-G779.

40. Chen Y., Song K., Eck S.L., Chen Y. An intra-Peyer's patch gene transfer model for studying mucosal tolerance: distinct role of B7 and IL-12 in mucosal T cell tolerance // J. Immunol. 2000. Vol. 165. P. 3145-3153.

41. Chen Y. Peripheral deletion of antigen-reactive T-cells in oral tolerance//Nature. 1995. Vol. 376. P. 177-180.

42. Chen Y., Kuchroo V.K., Inobe J. Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis // Science. 1994. Vol. 265. P. 1237-1240.

43. Chung Y., Lee S.H., Kim D.H., Kang Ch.Y. Complementary role of CD4+CD25+ regulatory T cells and TGF-a in oral tolerance // J. Leukoc. Biol. 2005. Vol. 77. P. 906-916.

44. Chung Y., Chang S.Y., Chang Y.K. Kinetic analysis of oral tolerance: memory lymphocytes refractory to oral tolerance // J. Immunol. 1999. ol. 163. P. 3692-3698.

45. Cloutier M., Gingras D., Bendayan M. Internalization and transcytosis of pancreatic enzymes by the intestinal mucosa // J. Histochem. Cytochem. 2006. Vol. 54. P. 781-794.

46. Coffman R.L.,'Lebman D.A., Rothman P. Mechanism and regulation of immunoglobulin isotype switching //Adv. Immunol. 1993. Vol. 54. P. 229-270.

47. Collins S.M. Stress and the gastrointestinal tract IV. Modulation of intestinal inflammation by stress: basic mechanisms and clinical relevance // Am. J. Physiol. (Gastrointest. Liver Physiol.). 2001. Vol. 280. P. G315-G318.

48. Comoy E.E., Capron G. Thyphronitis In vivo induction of type 1 and 2 immune responses against protein antigens // Int. Immunol. 1997. Vol. 9. P. 523531.

49. Dubois В., Chapat L., Goubier A., Papiernik M., Nicolas J.F., Kaiserlian D. Innate CD4+CD25+ regulatory T cells are required for oral tolranc and inhibition of CD8+ T cells mediating skin inflammation // Blood. 2003. Vol. 102. P. 3295-3301.

50. Dunaif G.G., Schneeman B.O. Interference of dietaiy fibres with gastrointestinal enzymes in vitro И Am. J. Clin. Nutr. 1981. Vol. 34. P. 1034-1035.

51. Friedman A. Induction of anergy in Thi lymphocytes by oral tolerance. Importance of antigen dosage and frequency of feeding // Ann. NY Acad. Sci. 1996. Vol. 778. P. 103-110.

52. Friedman A., Weiner H.L. Induction of anergy or active suppression following oral tolerance is determined by antigen dosage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 9. P. 6688-6692.

53. Friedman A., Al-Sabbagh A., Santos L., Fishman-Lobell J., Polanki M., Das M., Khoury S., Weiner H: tolerance: a biologically pathway to generate peripheral tolerance against external and self antigens // Chem. Immunol. 1994. Vol. 58. P. 259-290.

54. Fuse K., Bamba Т., Hosoda S. Effects of pectin on fatty acid and glucose absorption and on thickness of unstirred water layer in rat and human intestine // Dig. Dis. Sci. 1989. Vol. 34. P. 1109-1116.

55. Gaboriau-Routhiau V., Moreau M.C. Gut flora allows recovery of oral tolerance to ovalbumin in mice after transient breakdown mediated by cholera toxin or Escherichia coli heat-labile enterotoxin // Pediatr. Res. 1996. Vol. 39. P 625-629.

56. Garcia-Ramallo E., Marques Т., Prats N., Beleta J., Kunkel S.L., Godessart N. Resident cell chemokine expression serves as the major mechanism for leukocyte recruitment during local inflammation// J. Immunol. 2002. Vol. 169. P. 6467-6473.

57. Garg S., Bal V., Rath S., George A. Effect of multiple antigenic exposures in the gut on oral tolerance and induction of antibacterial systemic immunity//Infect. Immunity. 1999. Vol. 67. P. 5917-5924.

58. Garside P., Mowat A.M., Khoruts A. Oral tolerance in disease // Gut. 1999. Vol. 44. P. 137-142.

59. Girard M., Turgeon S.L., Gauthier S.F. Quantification of the interactions between ft- lactoglobulin and pectin through capillary electrophoresis analysis // J. Agric. Food Chem. 2003. Vol. 51. P. 6043-6049.

60. Guarner F. Studies with inulin-type fructans on intestinal infections, permeability and inflammation//J. Nutr. 2007. Vol. 137. P. 2568S-2571S.

61. Hanson D. Ontogeny of orally induced tolerance to soluble proteins in mice. Priming and tolerance in newborns // J. Immunol. 1981. Vol. 127. P. 15181524.

62. Hasegawa Т., Ito K., Ueno S., Kumamoto S., Ando Y., Yamada A., Nomoto K., Yoshikai Y. Oral administration of hot water extracts of Chlorella vulgaris reduces IgE production against milk casein in mice // Int. Immunol. 1999. Vol. 21. P. 311-323.

63. Heater L., Yang P., Perdue M. Glucagon-lake peptide-2-enhanced barrier function reduces pathophysiology in a model of food allergy // Am. J. Physiol. (Gastrointest. Liver Physiol.) 2003. Vol. 284. P. 905-912.

64. Hollander D., Vadheim C.M., Brettholz E., Petersen G.M., Delahunty Т., Rotter J.I. Increased intestinal permeability in patients with Crohn's disease andtheir relatives. A possible etiologic factor 11 Ann. Intern. Med. 1986. Vol. 105. P. 883-885.

65. Inngjerdingen K.T., Kiyohara H., Matsumoto Т., Petersen D., Michaelsen Т.Е., Diallo D., Inngjerdingen M., Yamada H., Paulsen B.S. An immunomodulating pectic polymer from Glinus oppositifolius II Phytochemistry. 2007a. Vol. 68. P. 1046-1058.

66. Kairserlian D., Etchart N. Entry sites for oral vaccines and drugs: role for M-cells, enterocytes and dendritic cells. // Seminars in Immunolgy. 1999. Vol. 11. P. 217-224.

67. Kalergis A.M., Ravetch J.V. Inducing tumor immunity through the selective engagement of activating Fey receptors on dendritic cells. // J. Exp. Med. 2002. Vol. 195. P. 1653-1659.

68. Karpus W.J., Kennedy K.J., Kunkel S.L., Lukacs N.W. Monocyte chemotactic protein 1 regulates oral tolerance induction by inhibition of T helper cell 1-related cytokines // Exp. Med. 1998. Vol. 187. P. 733-741.

69. Kato H., Fujihashi K., Kato R., Yuki Y., MeGhee J. Oral tolerance revisited: prior oral tolerization abrogates Cholera toxin — induced mucosal IgA responses // J. Immunol. 2001. Vol. 166. P. 3114 3121.

70. Kato Т., Owen R.L. Structure and function of intestinal mucosal epithelium//Mucosal Immunol. 1999. Vol. 166. P. 115-121.

71. Kiliaan A.J., Saunders P.R., Bijlsma P.B., Berin M.C., Taminiau J.A., Groot J.A., Perdue M.H. Stress stimulates transepithelial macromolecular uptake in rat jejunum // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1998. Vol. 275. P. G1037-G1044.

72. Kim P.-H., Eckmann L., Lee W.J., Han W., Kagnoff M.F. Cholera toxin and cholera toxin В subunit induce IgA switching through the action of TGF-bll //J. Immunol. 1998. Vol. 160. P. 1198-1203.

73. Kiyohara H., Matsumoto Т., Yamada H. Intestinal immune system modulating polysaccharides in a Japanese herbal (Kampo) medicine, Juzen-Taiho-To. ///Phytomedicine. 2002. Vol. 9. P. 614-624.

74. Kiyohara H., Nagai Т., Munakata K., Nonaka K., Hanawa Т., Kim S. J., Yamada H. Stimulating effect of Japanese herbal (Kampo) medicine,

75. Hochuekkito on upper respiratory mucosal immune system // Evid. Based Complement. Altem. Med. 2006. Vol. 3. P. 459^167.

76. Kobayashi M., Matsushita H., Yoshida K., Tsukiyama R., Sugimura Т., Yamamoto K. In vitro and in vivo anti-allergic activity of soy sauce // Int. J. Mol. Med. 2004. Vol. 14. P. 879-884.

77. Kolaczkowska E., Seljelid R., Plytycz B. Role of mast cells in zymosan-induced peritoneal inflammation in Balb/c and mast cell-deficient WBB6F1 mice // J. Leukoc. Biol. 2001. Vol. 69. P. 33-42.

78. Kongara K., Varilek G., Soffer E.E. Salivary growth factors and cytokines are not deficient in patients. with gastroesophageal reflux disease or Barrett's esophagus //Dig. Dis. Sci. 2001. Vol. 46. P. 606-609.

79. Korotkova M., Telemo E., Hanson L., Strandvik B. Modulation of neonatal immunological tolerance to ovalbumin by maternal essential fatty acid intake // Pediatr. Allerg. Immunol. 2004. Vol. 15. P. 112-122.

80. Kosecka U., Marshall J.S., Crowe S.E., Bienenstock J., Perdue M.H. Pertussis toxin stimulates hypersensitivity and enhances nerve-mediated antigen uptake in rat intestine // Am. J. Physiol. (Gastrointest. Liver Physiol.) 1994. Vol. 267. P. G745-G753.

81. Kraehenbuhl J., Pringault E., Neutra M. Intestinal epithelia and barrier functions / Aliment. Pharmacol. Ther. 1997: Vol. 1.1. P. 3-9.

82. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor II General properties // J. Gen. Physiol. 1946. Vol. 30. P 291-310.

83. Kweon M.N., Fujihashi К., Wakatsuki Y., Koga T. Mucosally induced systemic T cell unresponsiveness to ovalbumin requires CD40 ligand-CD40 interactions // J. Immunol. 1999. Vol. 162. P. 1904-1909.

84. Laemmli U.K., Fare M. Maturation of the head of bacteriophage T4.1. DNA packaging events // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 80. P. 575-599.

85. Lee J.C., Рак S.C., Lee S.H., Na C.S., Lim S.C., Song C.H., Bai Y.H., Jang C.H. Asian pear pectin administration during presensitization inhibits allergic response to ovalbumin in BALB/c mice // J. Altern. Complement. Med. 2004. Vol. 10. P. 527-534.

86. Leishman A., Garside P., Mowat A. Induction of oral tolerance in the primed immune system: influence of antigen persistence and adjuvant form // Cell Immunol. 2000. Vol. 202. P. 71-78.

87. Leng-Peschlow E. The effect of dietary fiber on human pancreatic enzyme activity in vitro I/ Digestion. 1989. Vol. 44. P. 200-210.

88. Leung M.Y.K., Liu C., Zhu L.F., Hui Y.Z., Yu В., Fung K.P. Chemical and biological characterization of a polysaccharide biological response modifier from Aloe vera L. var. chinensis (Haw.) Berg. // Glycobiology. 2004. Vol. 14. P. 501-510.

89. Lim B.O., Yamada K., Nonaka M., Kuramoto Y., Hung P., Sugano M. Dietary fibers modulate indices of intestinal immune function in rats // J. Nutr. 1997. Vol. 127. P. 663-667.

90. Lin T-J., Hirji N., Stenton G.R., Gilchrist M., Grill B.J., Schreiber A.D., Befus A.D. Activation of macrophage CD8: pharmacological studies of TNF and IL-lfi production//J. Immunol. 2000. Vol. 164. P. 1783 1792.

91. Liu L., Fishman M.L., Hicks K.B., Kende M. Interaction of various pectin formulations with porcine colonic tissue // Biomaterials. 2005. Vol. 26. P. 5907-5916.

92. Ma T.Y., Nguyen D., Bui V., Nguyen H., Hoa N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1999. Vol. 276. P. G965-G974.

93. Maggi E. The Thl/Th2 paradigm in allergy // Immunotechnology. 1998. Vol.3. P. 233-244.

94. Majamaa H., Isolauri E. Evaluation of the gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema // J. Allergy. Clin. Immunol. 1996. Vol. 97. P. 985-990.

95. Mayer L. Mucosal immunity and gastrointestinal antigen processing // Pediatr. Gastroenterol. Nutrit. 2000. Vol. 30. P. 4-12.

96. Mayer L. Mucosal immunity // Pediatrics. 2003. Vol. 111. P. 15951600.

97. McGee D.W., Elson C.O., McGhee J.R. Enhancing effect of cholera toxin on interleukin-6 secretion by IEC-6 intestinal epithelial cells: mode of action and augmenting effect of inflammatory cytokines // Infect. Immunity. 1993. Vol. 61. P.:4637-4644.

98. McNeill M., Darvill A.G., Albersheim P. Structure of plant cell walls. X. Rhamnogalacturonan I, a structurally complex pectic polysaccharide in the walls of suspension cultured sycamore cells // Plant Physiol. 1980. Vol. 66. P. 1128-1134.

99. Mohammad A., Ota F., Kassu A., Sorayya K., Sakai T. Modulation of oral tolerance to ovalbumin by dietary protein in mice // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2006. Vol. 52. P. 113-120.

100. Mouecoucou J., Fremont S., Sanchez C., Villaume C., Mejean L. In vitro allergenicity of peanut after hydrolysis in the presence of polysaccharides // Clin. Exp. Allegy. 2004. Vol. 34. P. 1429-1437.

101. Myint A.M., Leonard B.E., Steinbusch H.W., Kim Y.K. Thl, Th2, and Th3 cytokine alterations in major depression // J. Affect. Disord. 2005. Vol. 88. P. 167-173.

102. Nacer A.S., Sanchez C., Villaume C., Mejean L., Mouecoucou J. Interactions between /?- lactoglobulin and pectins during in vitro gastric hydrolysis // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52. P. 355-360.

103. Nieuwenhuizen N., Herbert B.R., Lopata A.L., Brombacher F. CD4+ T cell-specific deletion of IL-4 receptor a prevents ovalbumin-induced anaphylaxis by an IFN-y-dependent mechanism //J. Immunol. 2007. Vol. 179. P. 2758-2765.

104. Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Popov S.V., Popova G.Yu., Paderin N.M., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Chemical composition and antiinflammatory activity of pectic polysaccharide isolated from celery stalks // Food Chem. 2009. Vol. 114. P. 610-615.

105. Paolo W.R., Rollins B.J., Kuziel W., Karpus W.J. CC chemokine ligand 2 and its receptor regulate mucosal production of IL-12 and TGF-a in high dose oral tolerance // J. Immunol. 2003. Vol. 171. P. 3560-3567.

106. Pekiner F.N., Gumru В., Demirel G.Y., Ozbayrak S. Burning mouth syndrome and saliva: detection of salivary trace elements and cytokines // J. Oral Pathol. Med. 2009. Vol. 38. P. 269-275.

107. Peng H., Turner H., Strobel S. The generation of a 'tolerogen' after the ingestion of ovalbumin is time-dependent and unrelated to serum levels of immunoreactive antigen// Clin. Exp. Immunol. 1990. Vol. 81. P. 510-525.

108. Perdue M.H. III. The mucosal antigen barrier: cross talk with mucosal cytokines // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1999. Vol. 277. P. 1-5.

109. Pereyra R., Schmidt K.A., Wicker L. Interaction and stabilization of acidified casein dispersions with low and high metoxyl pectins // J. Agric. Food Chem. 1997. Vol. 45. P. 3448-3451.

110. Petursdottir D.H., Olafsdottir I., Hardardottir I. Dietary fish oil increases tumor necrosis factor secretion but decreases interleukin-10 secretion by murine peritoneal macrophages. // J. Nutr. 2002. Vol. 132. P. 3740-3743.

111. Piel C., Montagne L., Seve В., Lalles J.-P. Increasing digesta viscosity using carboxymethylcellulose in weaned piglets stimulates ileal goblet cell numbers and maturation // J. Nutr. 2005. Vol: 135. P. 86-91.

112. Pierre P., Denis O., Bazin H., Mbongolo E., Vaerman J.P. Modulation of oral tolerance to ovalbumin by cholera toxin and its В subunit // Eur J. Immunol. 1992. Vol. 22. P. 3179-3182.

113. Pitman R., Blumberg R.S. First line of defence: the role of the intestinal epithelium as an active component of the mucosal immune system // J. Gastroenterol. 2000. Vol. 35. P. 805-814.

114. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Antiinflammatory activity of the pectic polysaccharide from- Comarum palustre II Fitoterapia. 2005. Vol. 76. P. 281-287.

115. Popov S.V., Popova G.Y., Paderin N.M., Koval O.A., Ovodova R.G., Ovodov Y.S. Preventativ anti-inflammatory effect of potamogetanan, a pecinfrom the common pondweed Potamogeton natans L. // Phytother. Res. 2007. Vol. 21. P. 609-614.

116. Rappuoli R., Pizza M., Douce G., Dougan G. Structure and mucosal adjuvanticity of cholera and Escherichia coli heat-labile enterotoxins // Immunol. Today. 1999. Vol. 20. P. 493-500.

117. Ravetch J.V., Bolland S. IgG Fc receptors. // Annu Rev. Immunol. 2001. Vol. 19. P. 275-279.

118. Rohan, L.C. Quantitation of cytokines in mucosal secretions / L.C. Rohan, R.P. Edwards, L.A. Kelly, K.A. Colenello, F.P. Bowman, P.A. Crowley-Nowick // Clin. Diagnost. Labor. Immunol. 2000. - Vol. 7. - P. 45-48.

119. Sakurai M.H., Matsumoto Т., Kiyohara H., Yamada H. B-cell proliferation activity of pectic polysaccharide from a medicinal herb, the roots of Bupleurum falcatum L. and its structural requirement // Immunology. 1999. Vol. 97. P. 540-547.

120. Salman H., Bergman M., Djaldetti M., Orlin J., Bessler H. Citrus pectin affects cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells // Biomed. Pharmacother. 2008. Vol. 62. P. 579-82.

121. Samsom J.N., van Berkel L.A., van Helvoort J., Unger W., Jansen W., Thepen Т., Mebius R.E., Verbeek S.S., Kraal G. FcRIIB regulates nasal and oral tolerance: a role for dendritic cells // J. Immunol. 2005. Vol. 174. P. 52795287.

122. Sawabe Y.Y., Nakagomi K., Iwagami S., Suzuki S., Nakazawa H. Inhibitory effects of pectic substances on activated hyaluronidase and histamine release from mast cells // Biochim. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1137. P. 274-278.

123. Schimidgall J., Hensel A. Bioadhesive properties of polygalacturonides against colonic epithelial membranes // Int. J. Biol. Macromol. 2002. Vol. 30. P. 217-225.

124. Schneeman B.O., Gallaher D. Changes in small intestinal digestive enzyme activity and bile acids with dietary cellulose in rats // J. Nutr. 1980. Vol. 110. P. 584-590.

125. Shan N.N., Mahoney R.R., Pellett P.L. Effect of guar gum, lignin and pectin on proteolytic enzyme levels in the gastrointestinal tract of the rat: a time-based study // J. Nutr. 1986. Vol. 116. P. 786-794.

126. Shi H.N., Liu H.Y., Nagler-Anderson C. Enteric infection acts as an adjuvant for the response to a model food antigen // J. Immunol. 2000. Vol. 165. P. 6174-6182.

127. Smith K.M., Eaton A.D., Finlayson L.M., Garside P. Oral tolerance. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. Vol. 162. P. 175-178.

128. Soriani M., Bailey L., Hirst T.R. Contribution of the ADPribosylating and receptor-binding properties of cholera-like enterotoxins in modulating cytokine secretion by human intestinal epithelial cells // Microbiology. 2002. Vol. 148. P. 667-676.

129. Stein J., Ries J., Barrett K.E. Disruption of intestinal barrier function associated with experimental colitis: possible role of mast cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1998. Vol. 274. P. 203-209.

130. Strobel S., Mowat A.Mcl. Immune responses to dietary antigens: oral tolerance // Immunol. Today. 1998. Vol. 19. P. 173-177.

131. Strobel S., Ferguson A. Immune responses to fed protein antigens in mice. Systemic tolerance or priming is related to age at which antigen is first encountered // Pediatr. Res. 1984. Vol. 18. P. 588-593.

132. Su S.-B., Silver P.B., Wang P., Chan C.-C., Caspi R.R. Cholera toxin prevents Thl-mediated autoimmune disease by inducing immune deviation // J. Immunol. 2004. Vol. 173. P. 755-761.

133. Takai T. Roles of Fc receptor in autoimmunity. // Nat. Rev. Immunol. 2002. Vol. 2. P 580-585.

134. Teles R.P., Likhari V., Socransky S.S., Haffajee A.D. Salivary cytokine levels in subjects with chronic periodontitis and in periodontally healthy individuals: a cross-sectional study // J. Periodontal Res. 2009. Voh 44. P. 411417.

135. Thakur B.R., Singh R.K., Handa A.K. Chemistry and uses of pectin-a review // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1997. Vol. 37. P. 47-73.

136. Titus R.G., Chiller J.M. Orally induced tolerance. Definition at cellular level // Int. Archs. Allerg. Immunol. 1981. Vol. 65. P. 323-338.

137. Tolstoguzov V. Some thermodynamic considerations in food formulation//Food Hydrocolloids. 2003. ol. 17. P. 1-23.

138. Troncone R., Ferguson A. In mice, gluten in maternal diet primes systemic immune responses to gliadin in offspring // Immunology. 1988. Vol. 64. P. 533-537.

139. Udall J.N., Pang K., Fritze L., Kleinman R., Walker W.A. Development of gastrointestinal mucosal barrier. I. The effect of age on intestinal permeability to macromolecules // Pediatr. Res. 1981. Vol. 15. P. 241-244.

140. Ventura M.T., Polimeno L., Amoruso A.C., Gatti F., Annoscia E., Marinaro M. Intestinal permeability in patients with adverse reactions to food // Dig. Liver Dis. 2006. Vol. 38. P. 732-736.

141. Vincken J.P., Schols H.A., Oomen R.J.F.J., McCann M.C., Ulvskov P., Voragen A.G.J., Visser R.G.F. If homogalacturonan were a side chain of rhamnogalacturonan I. Implications for cell wall architecture // Plant. Physiol. 2003. Vol. 132. P. 1781-1789.

142. Viney J.L., Mowat A.Mcl., O'Malley J.M., Williamson E., Fanger N.A. Expanding dendritic cells in vivo enhances the induction of oral tolerance // J. Immunol. 1998. Vol. 160. P. 5815-5825.

143. Vos A.P., M'Rabet L., Stahl В., Boehm G., Garssen J. Immune-modulatory effects and potential working mechanisms of orally applied nondigestible carbohydrates // Clin. Rew. Immunol. 2004. Vol. 27. P. 97-140.

144. Weangsripanaval Т., Moriyama Т., Kageura Т., Ogawa Т., Kawada T. Dietary fat and an exogenous emulsifier increase the gastrointestinal absorption of a major soybean allergen, Gly m Bd 30K, in mice // J. Nutr. 2005. Vol. 135. P. 1738-1744

145. Weiner H.L. Oral tolerance // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 10762-10765.

146. Weiner H.L. Oral tolerance: immune mechanisms and treatment of outoimmune diseases // Immunol. Today. 1997. Vol. 18. P. 335-343.

147. Yamada H. Structure and pharmacological activity of pectic polysaccharides from the roots of Bupleurum falcatum L. // Nippon Yakugaku Zasshi. 1995. Vol. 106. P. 229-237.

148. Yang P.Ch., Berin M.C., Yu L.C.H;, Conrad D.H., Perdue M.H. Enhanced intestinal transepithelial antigen transport in allergic rats is mediated' by IgE and CD23 (FcsRII) // J. Clin. Invest. 2000. Vol.106. P. 879-886.

149. Ye D., Ma I., Ma T.Y. Molecular mechanism of tumor necrosis factor-a modulation of intestinal epithelial tight junction barrier // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006. Vol. 290. P. G496-G504.

150. Yu K.W., Kiyohara H., Matsumoto Т., Yang H.C., Yamada H. Intestinal immune system modulating polysaccharides from- rhizomes of Atractylodes lanceaL. //Planta-Med. 1998. Vol. 64. P. 714-719.

151. Yun C., Lillehoj' H., Lillehoj E. Intestinal immune responses to coccidiosis // Devel. Сотр. Immunol. 2000. Vol. 24. P. 303-324.

152. Ziv E., Bendayan M. Intestinal absorption of peptides through the enterocytes // Microsc. Res. Technol. 2000. Vol. 49. P. 346-352.