Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов"

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

003493618

Смирнов Иван Алексеевич

«Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов»

Специальность 03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 4 2010

Москва

2010

003493618

Диссертационная работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Е. С. Лобакова

доктор биологических наук,

профессор

Г. М. Зенова

доктор биологических наук,

доцент

Е. Э. Мучник

Ведущая организация: Полярно-альпийский ботанический сад-институт КНЦ РАН им. Н. А. Аврорина

Защита состоится «12» марта 2010 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу-. 119991, г. Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет. Факс: (495) 939-43-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «11» февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н.

М. А. Гусаковская

Актуальность проблемы. Лишайники - классический пример многокомпонентной симбиотической системы, состоящий из гетеротрофного грибного (микобионта) и фото-трофного (циано- и/или фикобионта) компонентов, а также ассоциативных бактерий (Ahmadjian, 1973, Ahmadjian, Paracer, 1986; Paracer, Ahmadjian, 2000).

Наименее изученной группой лишайников являются базидиолишайники, прежде всего из-за их меньшей представленности в природных биоценозах (Окснер, 1974; Lutzoni et al., 2004). В качестве микобионтов в них выступают кардициевые, телефоровые или агариковые грибы, а фимобионтами являются те же роды микроводорослей, что входят в состав асколишайников (Lutzoni et al., 2001). Базидиолишайники, обладающие более быстрым ростом, чем асколишайники, могут являться интересным объектом биотехнологии и экспериментальной лихенологии, позволяющим конструировать (создавать) модельные ассоциации доминантных симбионтов в парах в сочетаниях не встречающихся в природе (Gusev et al., 2002). Перспективным направлением таких исследований является создание модельных ассоциаций на основе широко распространенных и легко культивируемых ба-зидиальных агариковых грибов, обладающих ценными пищевыми и лекарственными свойствами, и микроводорослей и/ или цианобакгерий, выделенных из асколишайников. До настоящего времени аналогичные работы проводились только на основе асколишайников (Ahmadjian, 1961; Ahmadjian, 1973, Ahmadjian, Paracer, 1986; Ahmadjian, 1989; Stocker-Worgotter, Turk, 1989; Ahmadjian, 1990; Yoshimura, Yamamoto, 1991; Yoshimura et al., 1993; Yamamoto et al., 1993; Paracer, Ahmadjian, 2000).

Экспериментальные работы по созданию базидиолишайников могут; с одной стороны, раскрыть новые аспекты взаимодействия партнеров, изучить процессы морфогенеза талломов, селективного узнавания и специфического взаимодействия партнеров, с другой стороны, служить основой для изыскания новых биологически активных веществ.

Целью работы явилось создание модельных ассоциаций на основе базидиалышх грибов и фототрофных микроорганизмов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить особенности распределения микроорганизмов, сопутствующих мико- и фотобионту, внутри и на поверхности талломов лишайников для отработки условий получения монокультур симбионтов;

2) подобрать условия выделения фико- и цианобионтов из талломов лишайников, создать коллекцию фототрофных компонентов лишайников;

3) изучить условия, необходимые для создания модельных ассоциаций на основе бази-диальных грибов и фотобионтов лишайника;

4) исследовать физиолого-биохимические особенности полученных модельных ассоциаций.

Научная новизна. Впервые показано, что ассоциативные микроорганизмы в талломе лишайников локализованы на поверхности верхней и нижней коры в слизистом матриксе преимущественно в виде микроколоний. Во внутренних частях слоевища лишайника ассоциативные микроорганизмы не обнаружены. Отработаны методы стерилизации лишайниковых эксплантов, позволяющие снизить процент поражения ассоциативными микроорганизмами. Впервые созданы модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов (фикобионтов лишайников и свободноживущих азотфик-сируюших цианобакгерий). Установлено, что в полученных модельных ассоциациях наблюдаются штаммо- и видоспецифичные взаимодействия партнеров. Показано, что для ряда сочетаний в парах компонентов модельных систем отмечены: индукция взаимного роста партнеров, стимуляция плодообразования, препятствие возрастному лизису микоби-онта и деградации фотобионта.

В модельных ассоциациях на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов обнаружено: 1) расширение спектра антибиотической активности экстрактов из культуральной жидкости; 2) возрастание целлюлозолитической активности в смешанных культурах симбионтов; 3) увеличение в смешанных культурах числа формирующихся примордиев и плодовых тел по сравнению с монокультурой гриба В модельной ассоциации на основе фотобионта лишайника Cetraria islandica зеленой водоросли Trebouxia sp. и гриба Pleurotus ostreatus НК-35 отмечено изменение спектра синтезируемых фе-нольных соединений.

Практическое значение. Предложен метод стерилизации лишайниковых эксплантов, значительно снижающий контаминацию их микроорганизмами, который может быть использован в биотехнологии при получении культур симбионтов лишайников. В модельной системе Pleurotus ostreatus НК-35 — Trebouxia sp. (при диализном сокультивировании) отмечено увеличение целлюлозолитической активности партнеров и расширение спектра антибиотической активности в экстрактах культуральной жидкости, что может найти применение в биотехнологическом производстве лекарств и ферментов.

Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по «Лихенологии» и «Симбиологии» для студентов 5 курса кафедры Микологии и альгологии биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены и обсуждены на заседании кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ, 8 молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (2004), Международной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), конференции «Грибы и водоросли в биоценозах — 2006» (Москва), ХШ Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006» (Москва), XV Европейском микологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской конференции с международным участием

«Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), юбилейной конференции, посвященной 100-летаю со дня рождения М. В. Горлен-ко «Высшие базадиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества» (Москва, 2008), П Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Бисгтехнологической высггавки-ярмарки «РосБиоТех-2008».

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 10 работ, среди них 1 статья в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук, 1 патент, 3 статьи, опубликованные в материалах международных конференций. Экспериментальные данные, представленные в диссертации получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного кета, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка цитированной литерату-ы, включающего 108 источников (из них 67 на иностранных языках). Работа содержит 13 таблиц и иллюстрирована 62 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы. Обзор посвящен анализу специфики лишайников, как бъектов экспериментальной биологии, особенностям используемой в данной области сследований терминологии, истории и классификации основных экспериментальных одходов в лихенологии, выяснению биотехнологического потенциала «культур тканей ишайников».

Проведенный анализ литературных данных показал (рис. 1), что экспериментальные одходы («микроклональное размножение лишайников», «суспензионные культуры», <каллусные культуры») применимы для исследования морфогенеза лишайников, изучения лияния на их рост различных экологических факторов, поддержания в культуре in vitro реинтродукции в природу редких и исчезающих видов, а также перспективны для созда-ия модельных систем с целью получения биологически активных веществ.

Глава 2. Материалы и методы.

Объекты исследования. Объектами исследования служили 10 видов лишайников раз-ичных экологических и морфологических групп (см. табл. 1). Материал для исследований обирали в 2004 - 09 гг.

Для синтеза модельных ассоциаций использовали моноспоровые культуры базиди-ьных грибов Pleurotus ostreatus L. (НК-35), Pleurotus citrino-pileatus Singer (3040), leurotus djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn (штамм фирмы Sylvan), Pleurotuspulmonarius (Fr.) el., Agaricus bisporus L. (U3) — из коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ. качестве фотобионтов при синтезе модельных ассоциаций использовали свободножи-

вущие азотофиксирующие цианобактерии Anabaena variabilis АТСС 29413 и Nostoc sp. С ALU 526 (из коллекции кафедры физиологии микроорганизмов МГУ) и фикобионты, выделенные из лишайников Cladonia coniocraea, Cetraria islándica, Nephroma arcticum и Peltigera aphthosa.

Табл. 1. Характеристика лишайников — объектов исследования.

Вид лишайника Экологическая группа Фотобионг место сбора

Cladonia coniocraea (Florke) Sprengel эпифит зеленая водоросль Московская обл.

Lecanora symmicta (Ach.) Ach. эпифит зеленая водоросль Московская обл.

Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. эпифит зеленая водоросль Московская обл.

Alectoria sarmentosa (Ach.) Ach. эпифнгг зеленая водоросль Карелия, ББС

Physcla stellaris (L.) Nyl. эпифит зеленая водоросль Московская обл.

Nephroma arcticum (L.) Torss эпигеоид зеленая водоросль и цианобактерия Карелия, ББС

Bryoria fuscescens (Gyeln.) Brodo & D. Hawksw. эпифит зеленая водоросль Карелия, ББС

Cetraria islándico (L.) Ach. эпигеоид зеленая водоросль Карелия, ББС , Московская обл. Тверская обл.

Parmelia saxatilis (L.) Ach. эпилит зеленая водоросль Карелия, ББС

Peltigera aphthosa (L.) Wilid эпигеиод зеленая водоросль и цианобактерия Карелия, ББС

Микроскопические методы. Изучение шггактных лишайников и модельных ассоциаций проводили на световом микроскопе Axioskop 40FL (Carl Zeiss, Германия) с ртутной лампой НВО-50АС методами «светлого поля» (при увеличениях * 10, х40, *90), люминесцентной микроскопии и методом «фазового контраста» (х40). Для фильтрации возбужденного света использовался интерференционный фильтр с максимумом пропускания при 546 нм и полушириной полосы 12 нм, эмиссию флуоресценции регистрировали через граничный фильтр, блокирующий излучение с длиной волны менее 590 нм. Подготовка препаратов к сканирующей электронной микроскопии включала фиксацию образцов 0,5% гаутаровым альдегидом на кокадилатном буфере, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, высушивание в атмосфере углекислого газа в аппарате LPB 4800 и изучение в микроскопе Hitachi 405S при ускоряющем напряжении 75 КВ.

еконструирование лишайников

диссоциация

получение монокультуры микобионта из фрагментов гиф, спор,конидий

Свободно-живущий фототрофный микроорганизм или фотобионт из другого лишайника

модельная ассоциация на основе микобионта

ультивирование лишайников

изучение влияния условии на рост лишайников

микроклональное размножение лишайников

Рис. 1. Экспериментальные подходы в лихенологии.

В качестве стерилизующих агентов в экспериментах использовали 0,05% водный раствор биптюконага хлоргексидина. 70% и 98% этиловый спирт и перекись водорода в концентрации 3. 10, 15,20, 30.33% и их сочетания, а также усниновую кислоту (концентрация - 100 мкг/мл).

Выделение симбионтов проводили методом талломного обрастания в жидких средах (Ahmadjian, 1961). Цианобноиты выделяли на твердой среде BG-II (Stainer et al., 1971), используя их способность к формированию гормоыитов (Пеневич, 2006). Мнкобнонт выделяли из апотешш лишайников по стандартной методике (Ahmadjian, 1967).

Культивирование цзолятов фотобионтов и базндиальных грибов проводили на следующих средах: Чапека (СЧ), сусло-агаре (CA), голодным агаре (ГА) (Семенов, 1990), Мурасиге и Скуга (MS) (Бутенко, 1999), крахмало-глюкозо-пешонной среде (R) (Лысак и др., 2003), «С» (Kratz, Myers, 1955) и BG-11. Последняя среда была также использована в следующих модификациях: с 50% (ВО'Л-Н), 25% (BG'/i-ll) содержанием солей азота и в безазотной модификации (BG0-11 ).

Для иммобилизации фикобионтов в жидких питательных средах использовали клеточно-структурированный материал (КСМ), полученный из ряски мелковатой (Lemna minuscula L), выращенной в стерильных условиях (Echwald, Titel, 1999).

Синтез молельных ассоциаций проводили: 1) в жидких питательных средах «С», BG-11, BGÖ-11 и сусле 50 мл/л; 2) на агаризованных средах СЧ, CA, ГА, MS, BG-11, BG0-11, BG14-11 и BG'/4-l 1 (с концентрацией агара 1 - 2%); 3) на стерильном предметном стекле, один конец которого был помещен в жидкую питательную среду СЧ (Ahmadjian, 1967). В случае жидких сред культивирование проводили в конических колбах объемом 150 - 200 мл (количество среды — 50 - 60 мл) и качалочных колбах объемом 750 мл (количество среды 150 - 250 мл) при температуре +20 "С в нескольких вариантах: качалочная культура на свету (освещенность 2000 Лк), стационарная культура на свету (освещенность 2000 Лк), стационарная культура световой режим с чередованием день/ночь- 12/12 часов (освещенность 600 Лк).

Диализное сокультивирование проводили по стандартной методике (Лебедева и др., 2002). Фотобионты (микроводоросли и цианобактерии) помещали в диализный мешок (пленка Orange Scientific производства Биомед с диаметром пор 12-14 кДа), который помешали в качалочную колбу с жидкой питательной средой (CA, BG 'Л-11, стерильная вода) ино-кулированной грибом. Культивирование проводили в стационарных условиях в люмииостате (освещенность 2000 Лк, температура +25 'С).

Изучение состояния фототрофиых микроорганизмов в модельных системах проводили на основании оценки пигментных систем по сравнению с монокультурами. Экстракцию пигментов из биомассы модельных ассоциаций и монокультур фототрофиых организмов осуществляли смесью хлороформ:метанол (Соловченко и др., 2001), Изучение пигментов проводили в хлороформной фазе на спектрофотометре Hitachi 150-20 с интегрирующей сферой (Merzlyak, 2000).

Фенольные соединения определяли спекгрофотометрически в экстрактах (водно-метанольная фаза) на спектрофотометре Hitachi 150-20 (Marcham, 1989).

Восстанавливающие сахара в питательных средах определяли с антроновым реактивом (Методы химии углеводов, 1971).

Целлюлозолитическуц) активность монокультур симбионтов и модельных ассоциаций определяли с карбоксиметилцеллюлозой - КМЦ (Вассер и др., 1981)

Определение антимикробной активности проводили на базе НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН двумя методами: из кулыуральной жидкости и из мета-ноловых экстрактов концентрата кулыуральной жидкости. Тест-объектами служили 10 культур микроорганизмов (Bacillus subtilis АТСС 6633 (=RIA 445), Bacillus pumilis NCTC 8241, Micrococcus luteus NCTC 8340, Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA), S. aureus INA 00761 (MRSA), Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ВКПМ-7571 =ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Aspergillus niger INA 00760, Saccharomyces cerevisiae RIA 259).

Статистическая обработка. Результаты морфометрических измерений подвергались статистической обработке в пакете программ Statistica 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Особенности распределения ассоциативных микроорганизмов в талломе интактных лишайников.

Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что ассоциативные микроорганизмы в талломе лишайников Nephroma arcticum с внутриталломными цефа-лодиями и Peltigera aphthosa с поверхностными цефалодиями, в основном, находятся на поверхности верхней и нижней коры (рис. 2). Во внутренних частях слоевища микроорганизмы не выявлены (рис. 3).

В апикальных частях талломов изученных лишайников бактерии распределяются на поверхности достаточно равномерно, тогда как в медиальной и базальной зонах - в виде микроколоний частично или полностью погруженных в гомогенный поверхностный матрикс.

При помещении нестерилизованных фрагментов талломов (эксплантов) разных видов лишайников на твердые питательные среды СА, СЧ, MS, R наблюдалась 100% их контаминация различными группами микроорганизмов. Наибольшая контаминация эксплантов микроорганизмами была характерна для поверхностных цефалодий (включающих циано-и микобионт) и гомогенатов талломов (содержащих фото- и микобионт), а наименьшая -для извдий (фико- и микобионт) и апотеций (микобионт).

а б

Рис. 2. Особенности поверхности лишайника Р. aphthosa в апикальной (а) и медиальной (б) частях таллома. Б — бактерии различных морфологических групп, МК — микроколонии (микрозональный рост колоний сопутствующих микроорганизмов). СМ - слизистый матрпкс Стрелками указаны места погружения ассоциативных бактерий в слизистый матрпкс.

Рис, 3. Фрагмент среза медиальной части таллома лишайника Р. aphthosa (ЦФ — цефалодий, К — коровый слой. ЗФ—зона фикобионта, С — сердцевина. Г' — гифы микобионта, СМ - слизистый матрикс. Цб - цианобактерии).

4"

10°/

1%

2%

80%

□ дейтеромицеты И аскомицеты Шзигомицеты

□ базидиомицеты Шактиномицеты ■ бактерии

а

б

Рис, 4. Соотношение различных групп сопутствующих микроорганизмов в талломах лишайников Cetraria islándico (а) и Р. aphthosa (б).

Минимальная относительная контаминация микроорганизмами фрагментов таллома среди изученных видов лишайников была у двухкомпонентных (фикобионт - зеленая водоросль), а максимальная у трехкомпонектных лишайников. Эпифитные лишайники были менее подвержены контаминации, чем эпилитные и эпигейные виды. Кустистые формы контаминировались меньше, чем листоватые, а листоватые меньше, чем накипные. ! Преобладающей группой сопутствующих организмов как у двухкомпонентных (фикобионт - зеленая водоросль, рис. 4а), так и трехкомпонентных (рис. 46) лишайников были рейтеромицеты. Среди бактерий доминировали окрашенные грамположительные формы, по совокупности признаков определенные (совместно с Т. Г. Добровольской, ф-т почвоведения МГУ, каф. Биологии почв) как представители рода Rhodococcus.

Основная часть микроорганизмов, выделяемых из талломов нестерилизованных лишайников, — это несовершенные и сумчатые грибы, доля бактериального заражения относительно невелика (рис. 4), поэтому применение фунгицидных антибиотиков не эффективно вследствие воздействия на микобионты, которые также принадлежат к аскомицетам.

Последовательная обработка фрагментов талломов лишайников разных видов 70% этанолом в течение 5 минут и перекисью водорода различных концентраций (3 — 35%) Ь течение 15-30 минут позволяла снизить контаминацию эксплантов микроорганизмами

Глава 4. Отработка методов стерилизации эксплантов лишайников.

i

И

некоторых видов лишайников в 5 раз. Процент контаминации образцов микроорганизмами убывал линейно при увеличении времени обработки (рис. 5).

Аналогичные результаты можно было получить, используя в качестве стерилизующего агента перекись водорода возрастающей концентрации. Более того, процент контаминации образцов микроорганизмами при этом убывал по гиперболе, а потому данный

)( * жизнеспособность фотобионта (%)при стерилизации спиртом (98%, 5 мин.) и перекисью водорода (3%)

Рис. 5. Эффективность стерилизации фрагментов таллома лишайника С. ЫапсИса.

я £

1 н п К К о Я 8

,3 \о

а £

Й 5

о-ей

и й

% 8

2 о

X

■ъ

о о а ч

Ё

10 20 30

концентрация перекиси водорода,%

—•—контаминация экспланта микроорганизмами(%) 8 * —А—жизнеспособность фотобмокта (%)

Рис. 6. Влияние концентрации перекиси водорода на эффективность стерилизации фрагментов таллома лишайника С. м1апсИса (время обработки 20 минут). 12

путь представлялся более эффективным по сравнению с увеличением времени воздействия агента (рис. 6). Жизнеспособность симбионтов контролировали по автофлуоресценции хлорофилла у фикобиопта и по сохранению целостности гиф и ядер у микобионта при выбранном режиме стерилизации.

Стерилизация фрагментов таллома Р. aphthosa биппоконатом хлоргексидина в течение 5-15 минут не давала положительных результатов: процент контаминированных ассоциативными микроорганизмами эксплантов на СЧ был 100%. Увеличение времени стерилизации (до 20 - 40 мин.) снижало контаминацию эксплантов С. islándico до ВО - 94 %. Оптимальные результаты были получены при комплексной обработке образцов биппоконатом хлоргексидина с этанолом: при одновременном воздействии агентов на фрагменты таллома С. islándico в течение 20 минут контаминация снижалась до 75%, а при последовательном (5 минут этанолом, а потом 15 минут биппоконатом хлоргексидина) — до 55%.

Попытки использования в качестве стерилизующих агентов лишайникового вещества - усниновой кислоты, которая обладает выраженным антибактериальным действием, показали, что во всех случаях (апикальные и базальные участки) фрагменты таллома С. islándico, обработанные усниновой кислотой (концентрация 100 мкг/мл, время обработки - 20 мин.), поражались сильнее, чем образцы без обработки, что проявлялось в усиленном развитии микромицетов. Основными сопутствующими мнкромицетами во всех образцах были грибы рода Trichoderma. Большинство микобионтов лишайников относится к аскомицетам (рис. 4), возможно поэтому преобладающей группой ассоциативных микроорганизмов в составе лишайников и являются аскомицеты.

Помимо бактерицидного действия усниновая кислота в лишайниках регулирует отношения между мико- и фикобионтом, существенно изменяющем физиологию последнего (Вайниггейн и др., 1991). Воздействие усниновой кислоты выбранной концентрации на полученную монокультуру фотобионта Trebouxia с. f. cladonii приводило к ее постепенному обесцвечиванию, связанному с уменьшением числа жизнеспособных клеток водоросли. Таким образом, усниновая кислота, с одной стороны, не подавляла роста сопутствующих микромицетов, а, с другой, угнетала рост монокультуры изолятов Trebouxia с. f. cladonii. Это позволило предположить, что использование лишайниковых веществ в качестве стерилизующего агента не эффективно.

Глава 5. Выделение и культивирование симбионтов лишайника.

Проведено сравнение двух подходов по выделению микобионта из таллома лшпайни-ов Lecanora symmicta, Xanthoria parietina, Physcia stellaris, Nephroma arciicum, Cetraria slandica и Peltigera aphthosa: 1) из апотеций Lecanora symmicta, Xanthoria parietina, hyseia stellaris, Nephroma arciicum, Cetraria islándico на агаризовшшую среду (ГА, СА, ÍS) в чашки Петри (по стандартной методике В. Ахмаджана (Ahmadjian, 1973)) и 2) ме-

■годом талломного обрастания (Cetraria islandica и Peltigera aphthosa) в жидких средах BG 11, «С» (Stocker-Worgotter, Turk, 1989; Yoshimura, Yamamoto, 1991; Yoshimuraetal., 1993; Yamamoto et al., 1993). Несмотря на многочисленные попытки, использование выбранных методов не позволило получить монокультуры микобионтов указанных видов лишайников.

Используя метод талломного обрастания, удалось выделить фикобионты из лишайников С. coniocraea, С. islandica, Р. aphthosa и N. arcticum, которые по совокупности признаков (морфологических - особенности строения клеток и физиологических - набор пигментов, а также по видовой принадлежности лишайника, из которого выделен фикобионт) относятся к Trebouxia с. f. cladonii — из С. coniocraea и Соссотуха с. f. peltegerinae — из Р. aphthosa и N. arcticum. Кроме того, из Р. aphthosa получено 4 штамма цианобион-тов — трихомных гетероцистобразующих цианобактерий, которые по совокупности морфологических и физиологических признаков можно отнести к роду Nostoc.

При помещении фрагментов талломов различных видов лишайников на питательные среды Чапека, BG-11, BGVi-ll, BG0-11, MS первичный рост циано- и фикобионтов не наблюдали в течении 2 месяцев. Т. е. как для про-, так и для эукариотных фотобионтов характерен длительный период адаптации к апосимбиотическому росту. Оптимальной средой для выделения и культивирования фикобиотов являлась среда ВО'/г-И.

Кондиционирование сред культивирования фикобионтов метаболитами выделенных ассоциативных бактерий стимулировало рост фикобионтов лишайников, сокращало лаг-фазу роста и делало возможным их рост на безазотных средах (BG0-11).

i чт

Рис. 7. Культивирование ТгеЬоихяа с. Г. сШопи в жидкой среде («С») с КСМ. А — опыт, Б — контроль. 4 мес. культивирования.

Интенсивный рост изолятов водорослей отмечен на полужидких средах, содержащих 0,5% - 0,7% агара. Жидкие, а также твердые среды с высоким содержанием агара были неблагоприятны для роста полученных культур фотобионтов. Известно, что фотобионт в со-

ставе таллома лишайника иммобилизован в гифах мпкобионта и межклеточном матрнкее. Перенесение фогобионтов в жидкую среду с фрагментами агаризованной среды приводило к активизации их роста. В таких условиях уже на 2-10 сутки наблюдалось окрашивание бесцветных фрагментов агаризованпои среды в зеленый цвет.

Для подтверждения данного предположения в культуральные среды в качестве нм-мобнлизнруюшего субстрата добавляли клеточно-структурированный материал (КСМ) Ьетпа пипизеи/а 1.. Скорость роста изолятов фпкобиоптов, оцененная по числу клеток, в данных условиях увеличивалась по сравнению с контролем в 14 раз (рис. 7).

Используя отработанные методы стерилизации фрагментов талломов лишайников и подобранные условия выделения н культивирования фотобноншв, удалось создать коллекцию альгологически чистых культур фико- и циапобионтов из 8 штаммов.

Глава 6. Создание модельных ассоциаций на основе свободиожмвуших базнди-альных г рибов и фоюгрофных микроорганизмов.

В наших экспериментах создание модельных ассоциаций проводили на полужидких агаризованных средах (с пониженным содержанием агара — 0,7%), что отличается от использованных ранее методов экспериментальной лихенологии в школах Ахмаджана (АИгтЫрап, 1993), Галун (Оа1ип, 1986) и Ямамото (УашатоГО с( а1., 1993).

Синтез модельных ассоциаций лучше всего проходил на обедненных по азоту средах (ПСА-11, СЧ'Л, ГА) и на СА, после продолжительного (от 2 до 4 недель) прекультивирова-Ш1Я грибного компонента.

Табл. 2. Характер взаимодействия базидиальных грибов и цианобактерин ЛпаЬаепа \ariabilis А'ГСС 29413 в смешанных культурах.

потенциальный фотобионт потенциальный микобионт

Р1еиго1н.ч охШ'аГм (все штаммы) Р1еиго1ш фа тог Р1енго1ш р«1топаг1Ш Р1ечго!т сИгто-рИеа1ю Арапам Ызрогиз (все штаммы)

ЛпаЬаепа \anabiiis АГСС 29413 + + / + + /0 0 / 0 -/ — — / —

— /— — слева от косой черты указано воздействие на грибном компонент, справа - на

фотогрофпыи компонент

— — сильное негативное воздействие (лизис культуры)

- — слабое негативное воздействие (угнетение роста) 0 — отсутствие влияния

+ — слабое положительное воздействие (индукция роста)

+ + — сильное положительное воздействие (индукция образования плодовых тел,

примордиев и др.)

В модельных системах базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов рост и взаимодействие партнеров в парах ввдо- и штаммоспецифичны (табл. 2). Показано, что в смешанных культурах грибов A. bisporus и P. citrino-pileatus и азотофиксирующей циано-бактерии A. variabilis АТСС 29413 на жидкой и твердых средах формирования ассоциации не происходило, так как рост обоих партнеров отсутствовал (табл. 2).

Табл. 3. Штаммоспецифическое взаимодействие грибов Р1еигоШ зрр. с различными видами фотобионтов в модельных ассоциациях.

мико-бионт штамм Anabaena variabilis АТСС 29413 Nostoc sp. CALU 526 Trebouxia c.f. cladonii ТгеЬошга ер. (из С. islandica) Соссотуха c.f. peltegerina

Pleurotus ostreatus НК-35 Препятствует лизису гриба, индукция плодообразования гриба «в vo § >> u в 0 fe a В 0 a. 1 it & 8 1. индукция плодообразования гриба; 2. появление антибиотической активности в экстрактах КЖ; 3. изменение спектра биохимической продукции; 4. усиление целлюло-золитичеекой активности ассоциации а ю 1 & s 5 ч 6

тканевые изо-ляты Взаимная g 5 a. С s m я Взаимная индукция ¡~ ж с и

споровые изо-ляш роста роста С

Pleurotus pulmo-narius тканевые изо-ляты Препятствует лизису гриба He проводилось He проводилось Индукция плодообразования гриба

В течении 10 дней после начала совместного культивирования наблюдалась постепенная деградация, как мико-, так и фотобионта: нити цианобакгерий укорачивались, а их клетки обесцвечивались. В экстрактах из клеток цианобакгерий по спектрам поглощения наблюдали возрастание доли каротиноидов и уменьшение содержания хлорофил-лов и фикобиллинов, что свидетельствует о деградации их фотосинтетического аппарата (Merzlyak, 2000). На агаризованных средах в местах контакта партнеров наблюдали лизис грибного компонента и деградацию клеток цианобакгерий.

В смешанных культурах разных штаммов P. ostreatus с A. variabilis АТСС 29413 на жидких (BG'/i-ll) и твердых (СА, ГА) средах цианобакгерии сохраняли свою жизнеспособность, и наблюдалась взаимная стимуляция роста партнеров, которая носила штаммо-специфический характер (табл. 2,3).

а б в

Рис. 8. Фрагменты молельной ассоциации РкигоШ оигеашх НК-35 —АпаЬаепа гапаЫШ: а - начальная стадия развития ассоциации (заметны пряжки (П) и головчатые выросты (Г)), б - формирование примордий (Пр) в зоне контакта, в - формирование слизистого матрикса (стрелками показаны клетки цианобактерий (Цб). заключенные в слизистый матрикс (СМ)).

При изучении модельной ассоциации P. ostreatus шт. НК-35 и A. variabilis в сканирующем электронном микроскопе в зонах роста монокультур партнеров каждый из компонентов сохранял особенности, свойственные монокультурам: на клетках толстого мицелия P. ostreatus выявлялись пряжки и головчатые выросты, отмечено формирование тонкого мицелия (рис. 8а). Цианобактерия A. variabilis представлена длинными нитями, в которых выявлялись гетероцисты.

В местах смешанного роста партнеров отмечено интенсивное образование слизистого матрикса и изменение морфологии партнеров. Укороченные трихомы цианобактерий наблюдались не только на поверхности мицелия, но и внутри скоплений гиф триба (рис. 8в). Размеры клеток цианобактерий значительно увеличивались. В местах контакта гиф гриба с клетками цианобактерий гифы уплощались, отсутствовало образование на клетках толстого мицелия головчатых выростов. В местах роста культур и контакта клеток обоих партнеров у гриба образовывались светлые вертикальные приподнимающиеся над поверхностью субстрата гифы. У основания этих гиф обнаруживались клетки и укороченные трихомы цианобактерий. В зонах смешанного роста P. ostreatus и A. variabilis установлено формирование примордиев (рис. 86). Следует отметить, что пианобактерии всегда располагались в центре формирующихся примордий и/или у их основания.

В смешанных культурах Trebouxia sp. (выделенной из С. islandica) с P. ostreatus и P. piilmonarius на среде СА (концентрация сусла 50 г/л) было отмечено увеличение числа образующихся у грибов примордий в 2 и 3 раза, соответственно.

Для изучения физиолого-биохимичееких особенностей взаимодействия партнеров в модельных ассоциаций проводили диализное сокультивирование Р. ostreaíus НК-35 — Trebouxia sp. В полученной системе при отсутствии прямого контакта между клетками партнеров и обмена низкомолекулярными экзометаболитами наблюдали изменение размеров клеток обоих партнеров фикобионта Trebouxia sp. (выделенного из С. islándico) и гриба Р. ostreatus НК-35: клетки микроводоросли становились более вытянутыми (около 6^4 мкм, а в контроле 5><5,5 мкм), а средний диаметр гиф - толще. Изменение размеров клеток наблюдали как у Trebouxia (выделенных из С. islándico и С. coniocraea), так и у Соссотуха с. f. peltigerinae в системах с различными видами грибов (P. ostreatus, P. pulmonarius) на разных средах (СА, BG-11, ГА).

В модельной ассоциации P. ostreatus НК-35 — Trebouxia sp. (выделенной из С. islándico) при диализном сокультивировании отмечено изменение спектров антибиотической активности экстрактов из кулыуральной жидкости. Культуральная жидкость (КЖ) из монокультур требуксии и вешенки и экстракты из нее не проявляли антибиотической активности. Экстракты из КЖ диализной культуры после двух недель сокультивиро-вания также не проявляли антибиотическую активность. В экстрактах КЖ из трехнедельного диализного сокультивирования была выявлена антибиотическая активность против тест-культуры Micrococcus luteus.

i.RJ

Поглощение» (Е)

i.-J • ..

и]

: 03

J

ПВ1

0 53 0.« 0.23

^ 2

\

OJO

\

Экстракты из: 1 - чистой культура гриия, 2 - диализной культуры

зк.оо

даэде «я»

Длина волны, нм

Рис. 10. Спектры-поглощения водно-метанольной фазы экстрактов по Фолчу из монокультуры Ркигошз озй-еатз НК-35 и диализной культуры модельной ассоциации Р1еигош /хггеайя НК-35 - ТгеЬоих1а

На спектрах поглощения водно-метанольной фазы экстрактов по Фолчу (Соловченко и др., 2001) биомассы 4-неяельной диализной культуры модельной ассоциации Р. ostreatus НК-35 - Trebouxia sp. (выделенной из С. islándico) присутствовали полосы поглощения при -280, 310, 330 нм, которые могут быть предположительно отнесены на счет феноль-

ных соединений, скорее всего фенольных кислот и фенилпропаноидов (Markham, 1989; Dixon, Paiva, 1995). В спектрах экстрактов монокультуры P. ostreatus НК-35 присутствовала только 1 полоса с максимумом поглощения при 280 им, амплитуда которой была в 3 раза ниже, чем в модельной ассоциации (рис. 10).

Сравнение целлюлозолитической активности модельной ассоциации и монокультур Trebouxia sp. и P. ostreatus НК-35 показало, что ЦА в модельной ассоциации была в 1,5 раза выше, чем в монокультурах (в монокультуре гриба - 37,8 ± 12,2 мм, в модельной ассоциации - 54,2 ± 5,8 мм).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ литературных данных позволил выделить 2 группы экспериментальных подходов в лихенологии - реконструирование и культивирование лишайников (рис. 1). Проблемой каждого подхода является высокая контаминация «эксплантов» лишайников сопутствующими микроорганизмами.

В нашей работе методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что ассоциативные микроорганизмы в талломах изученных видов лишайников Nephroma arcticum и Peltigera aphthosa находятся, в основном, на поверхности верхней и нижней коры в слизистом магриксе, в виде микроколоний. Во внутренних частях слоевища микроорганизмы не выявлены. При помещении нестерилизованных фрагментов талломов разных видов лишайников на твердые питательные среды наблюдали 100% контаминацию эксплантов различными микроорганизмами. Нами проведен анализ величины контаминации микроорганизмами талломов лишайников разных экологических групп, морфологических типов, состоящих из двух или трех доминантных компонентов. Для разных экологических групп можно выстроить следующий ряд в сторону уменьшения контаминации: эпилипы > эпигеоиды > эпифиты; для разных морфотипов: накипные > листоватые > кустистые. Минимальная контаминация микроорганизмами фрагментов таллома была у двухшмпоненгаых, а максимальная у трехкомпонентных лишайников. Наибольшая контаминация была характерна для наружных цефалодий и гомогенатов талломов, а наименьшая - для изидий и апотеций. Установлено, что преобладающей труппой сопутствующих организмов как двухкомпонентных, так и трехкомпонентных лишайников были дейтеромицеты.

Решением проблемы контаминации микроорганизмами фрагментов талломов лишайников может стать их поверхностная стерилизация. Последовательная обработка фрагментов талломов лишайников разных видов 70% этанолом в течение 5 минут и перекисью водорода различных концентраций (3 - 35 %) в течение 15-30 минут позволяет снизить контаминацию эксплантов микроорганизмами в 5 раз. Аналогичные результаты можно было получить, используя в качестве стерилизующего агента перекись водорода 20% и более высокой кон-

центрашш при меньшем времени обработки, поэтому данный путь представлялся более эффективным по сравнению с увеличением времени воздействия агентов. Указанные условия стерилизации обеспечивают сохранение жизнеспособности симбионтов лишайника.

Попытки использования в качестве стерилизующих агентов лишайниковых веществ оказались не эффективными. Ассоциативные микроорганизмы лишайников не восприимчивы к их действию.

Используя предварительную поверхностную стерилизацию и метод талломнош обрастания, удалось выделить фикобионты из лишайников С. coniocraea, С. islándico, P. aphthosa и N. arcticum (2 штамма Trebouxia sp. и 2 штамма Соссотуха sp.) и 4 штамма цианобион-тов {Nostoc spp. из P. aphthosa). Кондиционирование сред культивирования фикобионтов метаболитами выделенных ассоциативных бактерий рода Rhodococcus стимулировало рост фикобионтов лишайников, сокращало лаг-фазу роста и делало возможным их развитие на безазотных средах (BGC-11). Интенсивный рост изолятов фотобионтов отмечен на полужидких средах, содержащих 0,5% - 0,7% агара, а также в жидких средах с добавлением клеточно-структурированного материала из растений L. minuscula.

В наших экспериментах впервые для создания модельных ассоциаций были использованы полужидкие агаризованные среды. Использованные нами варианты сред обладают рядом преимуществ: позволяют долго сохранять влажность и создавать периодические циклы увлажнения/осушения и обеспечивают возможность создания неоптимальных условий роста для каждого из партнеров, что является одним из важнейших условий ассоциативного роста (Емцев, Чумаков, 1988; Корженевская, 1991).

В полученных модельных системах на основе базвдиальных грибов и фототрофных микроорганизмов рост и взаимодействие партнеров в парах видо- и штаммоспецифичны. В смешанных культурах разных штаммов P. ostreatus с A. variabilis АТСС 29413 на жидких и твердых средах цианобактерии сохраняли свою жизнеспособность, наблюдалась взаимная стимуляция роста партнеров, которая носила штаммоспецифический характер, проявлявшийся в индукции взаимного роста, стимуляций плодообразования у грибного компонента и препятствии возрастному лизису гриба.

В модельных ассоциациях базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов обнаружено появление антибиотической активности экстрактов из культуральной жидкости, увеличение целлюлозолитической активности смешанных культур, увеличение числа примордий и плодовых тел гриба по сравнению с контролем. В модельной ассоциации P. ostreatus НК-35 — Trebouxia sp. (выделенной из С. islándico) отмечено изменение спектра биохимической продукции предположительно фенольной природы, возможно, обусловленное синтезом фенольных кислот и фенилпропаноидов.

выводы

1. Изучены особенности морфосгруктурной организации трехкомпонентных лишайников Nephroma arcticum и Peltigera aphthosa. Установлено, что ассоциативные микроорганизмы располагаются в поверхностном матриксе верхней и нижней коры таллома в виде микроколоний. Во внутренних частях слоевища ассоциативные микроорганизмы не обнаружены.

2. Предложенные методы стерилизации талломов лишайников позволяют снизить процент контаминации «эксплантов» микроорганизмами. Смешанный вариант обработки этиловым спиртом в течение 5 минут, затем 30% перекисью водорода или хлоргексиди-ом в течение 20 - 30 минут) является оптимальным для изученных видов лишайников, спользование лишайниковых веществ (усниновой кислоты) в качестве стерилизующих гейтов не является эффективным.

3. Отработаны методы выделения фотобионтов из талломов лишайников, и создана х коллекция, насчитывающая 8 штаммов. Селективной средой для выделения и куль-ивирования фотобионтов лишайников является полужидкая модифицированная среда GV2-W.

4. Установлено, что в полученных модельных ассоциациях базидиальных грибов и фо-1огрофных микроорганизмов взаимодействие партнеров в парах видо- и штаммоспеци-

ично. Для ряда сочетаний партнеров в парах отмечено положительное взаимовлияние: здукция роста, увеличите плодообразования у грибного компонента, замедление воз-астного лизиса гриба.

5. В модельных ассоциациях базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов гмечен синтез новых видоспецифических продуктов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук

1. Лобакова Е. С., Смирнов И. А., 2008. Экспериментальная лихенология // Журнал бщей биологии. Т. 69, №5. С. 364 - 378.

Патенты и изобретения

2. Лобакова Е. С., Смирнов И. А., 2008. Метод стерилизации эксплантов лишай-ика исландский мох (Cetraria islándico). Per. номер, заявки 2008111282/13(012197) от 6.03.2008

В статьях, опубликованных в материалах международных конференций

3. Смирнов И. А., Лобанова Е. С., 2006а. Способы стерилизации талломов лишайников // Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы. Матер. Междунар. науч. конф., посвященной 200-летию Казанской ботан. шк. Казань: Графити-групп. С. 220 - 222.

4. Смирнов И. А., Лобакова Е. С., 20066. Эффективность действия стерилизующих агентов на ассоциативные микроорганизмы лишайников // Грибы и водоросли в биоценозах — 2006: Матер. Междунар. науч. конф., посвященной 75-летию Биол. ф-та МГУ им. М. В. Ломоносова. М.: МАКС Пресс. С. 149 -150.

5. Lobakova Е. S., Smimov I. А., 2007. Synthesis of the model associations on the base of agaricoid basidiomycetes and cyanobacteria II Abstracto of the XV Congress of European Mycologists. St Petersburg: TREEART LLC. P. 231.

Прочие публикации

6. Смирнов И. А., Лобакова Е. С., 2004. «Культуры тканей» лишайников. Тезисы 8 молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. С. 121 - 122.

7. Смирнов И. А., 2006. Комплексы микромицетов, ассоциированные с лишайником Cetraria islandica //Тез. докл. XIII Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006». Секция Биология. М.: МАКС пресс. С. 211.

8. Смирнов И. А., Лобакова Е. С., 2007. Особенности культивирования фотобионтов лишайников // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». Саратов: Научная книга. С. 32.

9. Смирнов И. А., Лобакова Е. С., 2008. Морфофизиологическая характеристика смешанной культуры Pleurotus ostreatus и азотофикирующей цианобактерии Anabaena variabilts /I Матер, юбилейной конференции, посвященной 100-летаю со дня рождения М. В. Горленко «Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества». М.: Восток-Запад. С. 198 -199.

10. Савельева Д. Н., Смирнов И. А., 2008. Культивирование съедобных грибов Pleurotus spp. совместно с дрожжами и цианобакгериями // Перспективы развитая инноваций в биологии: Материалы II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008». М.: Инноватика С. 80-83.

Подписано в печать 9.02.2010 Тираж 100 экз. Отпечатано на ризографе Издательство «Экопресс»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнов, Иван Алексеевич

Содержание.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы Создание модельных ассоциаций на основе грибов и фототрофных микроорганизмов. Экспериментальная лихенология

1.1. Специфика лишайников как экспериментальных объектов. Особенности терминологии.

1.2. История и классификация основных экспериментальных подходов в лихенологии.

1.2.1. История конструирования лишайников и создания модельных ассоциаций.

1.2.2. Методы конструирования лишайников.

1.2.3. Создание искусственных (модельных) ассоциаций.

1.3. «Культуры тканей» лишайников. Культуральные подходы.

1.3.1. «Каллусные культуры тканей» лишайников.\.

1.3.2. «Суспензионные культуры тканей» лишайников.

1.4. Использование экспериментальных подходов в лихенологии.

1.4.1. Влияние условий культивирования — изучение экологических особенностей лишайников.

1.4.2. Изучение морфогенеза лишайников.

1.4.3. Внедрение экспериментальных подходов в генетические исследования лишайников.

1.4.4. Получение вторичных метаболитов.

1.4.5. Сохранение редких видов лишайников и их реинтродукция в природу.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Микроскопические методы.

2.2.2. Методы получения и стерилизации эксплантов лишайников.

2.2.3. Методы выделения и культивирования объектов исследования.

2.2.4. Методика диализного сокультивирования.

2.2.5. Методы синтеза модельных ассоциаций.

2.2.5. Методы изучения модельных ассоциаций.

2.2.6. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Особенности распределения ассоциативных микроорганизмов в талломе интактных лишайников.

3.1. Результаты, полученные методом сканирующей электронной микроскопии.

3.2. Ассоциативные микроорганизмы талломов интактных лишайников.

3.2.1. Влияние экологических и морфологических особенностей лишайников на развитие ассоциативных организмов.

3.2.2. Общая характеристика микроорганизмов, ассоциированных с талломами лишайников.

Глава 4. Отработка методов стерилизации эксплантов лишайников.

4.1. Выбор методики стерилизации.

4.2. Факторы, влияющие на эффективность стерилизации.

4.3. Использование лишайниковых веществ для стерилизации эксплантов лишайников.

4.4. Жизнеспособность симбионтов лишайника после стерилизации.

Глава 5. Выделение симбионтов лишайника.

5.1. Выделение микобионта.

5.2. Получение монокультур фотобионта.

5.3. Кондиционирование сред культивирования метаболитами ассоциативных микроорганизмов.

Глава 6 Создание модельных ассоциаций на основе свободноживущих базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов.

6.1. Выбор грибного компонента.

6.2. Модельные ассоциации на основе агарикоидных базидиомицетов.

6.3. Особенности микроструктурной организации модельных ассоциаций агариокоидных базидиомицетов и фототрофных микроорганизмов.

6.4. Физиолого-биохимические особенности модельных ассоциаций агариокоидных базидиомицетов и фототрофных микроорганизмов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов"

Актуальность проблемы. Лишайники - классический пример многокомпонентной симбиотической системы, состоящий из гетеротрофного грибного (микобионта) и фототрофного (циано- и/или фикобионта) компонентов, а также ассоциативных бактерий (Ahmadjian, 1973, Ahmadjian, Paracer, 1986; Paracer, Ahmadjian, 2000).

Наименее изученной группой лишайников являются базидиолишайннки, прежде всего из-за их меньшей представленности в природных биоценозах (Окснер, 1974; Lutzoni et al., 2004). В качестве микобиоптов в них выступают кардициевые, телефоровые или агариковые грибы, а фикобионтами являются те же роды микроводорослей, что входят в состав асколишайников (Lutzoni et al., 2001). Базидиолишайннки. обладающие более быстрым ростом, чем асколишайники, могут являться интересным объектом биотехнологии и экспериментальном лихенологии, позволяющим конструировать (создавать) модельные ассоциации доминантных симбионтов в парах в сочетаниях не встречающихся в природе (Gusev et al., 2002). Перспективным направлением таких исследовании является создание модельных ассоциаций на основе широко распространенных и легко культивируемых базидиальных агариковых грибов, обладающих ценными пищевыми и лекарственными свойствами, и микроводорослей и/ или цианобактерий, выделенных из асколишайников. До настоящего времени аналогичные работы проводились только на основе асколишайников (Ahmadjian, 1961; Ahmadjian, 1973, Ahmadjian, Paracer, 1986: Ahmadjian, 1989; Stocker-Worgotter, Turk, 1989; Ahmadjian, 1990; Yoshimura. Yamamoto, 1991; Yoshimura et al., 1993; Yamamoto et al., 1993; Paracer. Ahmadjian, 2000).

Экспериментальные работы по созданию базидиолишайников могут, с одной стороны, раскрыть новые аспекты взаимодействия партнеров, изучить процессы морфогенеза талломов, селективного узнавания и специфического взаимодействия партнеров, с другой стороны, служить основой для изыскания новых биологически активных веществ.

Целью работы явилось создание модельных ассоциаций на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить особенности распределения микроорганизмов, сопутствующих мико- и фотобионту, внутри и на поверхности талломов лишайников для отработки условий получения монокультур симбионтов;

2) подобрать условия выделения фико- и цианобионтов из талломов лишайников, создать коллекцию фототрофных компонентов лишайников;

3) изучить условия, необходимые для создания модельных ассоциаций на основе базидиальных грибов и фотобионтов лишайника;

4) исследовать физиолого-биохимические особенности полученных модельных ассоциаций.

Научная новизна. Впервые показано, что . ассоциативные микроорганизмы в талломе лишайников локализованы на поверхности верхней и нижней коры в слизистом матриксе преимущественно в виде микроколопий. Во внутренних частях слоевища лишайника ассоциативные микроорганизмы не обнаружены. Отработаны методы стерилизации лишайниковых эксплантов, позволяющие снизить процент контаминации ассоциативными микроорганизмами. Впервые созданы модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и ■ фототрофных микроорганизмов (фикобионтов лишайников и свободпоживущих азотфиксирующих цианобактерий). Установлено, что в полученных модельных ассоциациях наблюдаются штаммо- и видоспецифичные взаимодействия партнеров. Показано, что для ряда сочетаний в парах компонентов модельных систем отмечены: индукция взаимного роста партнеров, стимуляция плодообразования, препятствие возрастному лизису микобионта и деградации фотобионта.

В модельных ассоциациях на основе базидиальных грибов и фототрофпых микроорганизмов обнаружено: 1) расширение спектра антибиотической активности экстрактов из культуральной жидкости; 2) возрастание целлюлозолитической активности в смешанных культурах симбионтов; 3) увеличение в смешанных культурах числа формирующихся приморднев и плодовых тел по сравнению с монокультурой гриба. В модельной ассоциации на основе фотобионта лишайника Cetraria islándico зеленой водоросли Trebouxia sp. и гриба Pleurotus ostreatus НК-35 отмечено изменение спектра синтезируемых фенольных соединений. .

Практическое значение. Предложен метод стерилизации лишайниковых эксплантов, значительно снижающий контаминацию их микроорганизмами, который может быть использован в биотехнологии при получении культур симбионтов лишайников. В модельной системе Pleurotus ostreatus НК-35 — Trebouxia sp. (при диализном сокультивировании) отмечено увеличение целлюлозолитической активности партнеров п расширение спектра антибиотической активности в экстрактах культуральной жидкости, что может найти применение в биотехнологичсском производстве лекарств и ферментов.

Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по «Лихенологии» и «Симбпологии» для студентов 5 курса кафедры Микологии и альгологии биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены и обсуждены на заседании кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ, 8 молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге

2004), Международной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), конференции «Грибы и водоросли в биоценозах — 2006» (Москва), XIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006» (Москва), XV

Европейском микологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 2007).

Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и 7 прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Сараюв, 2007), юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М. В. Горленко «Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества» (Москва, 2008), II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической высевки-ярмарки «РосБпоТех-2008».

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 10 работ, среди них 1 статья в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук, 1 патент, 3 статьи, опубликованные в материалах международных конференций. Экспериментальные данные, представленные в диссертации получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Смирнов, Иван Алексеевич

1. Изучены особенности морфоструктурной организации трехкомпонентных лишайников Nephroma arcticum и Peltigera aphthosa.Установлено, что ассоциативные микроорганизмы располагаются в поверхностном матриксе верхней и нижней коры таллома в виде микроколоний. Во внутренних частях слоевища ассоциативные микроорганизмы не обнаружены.2. Предложенные методы стерилизации талломов лишайников позволяют снизить процент контаминации «эксплантов» микроорганизмами.Смешанный вариант обработки (этиловым спиртом в течение 5 минут, затем

30% перекисью водорода или хлоргексидином в течение 2 0 - 3 0 минут) является оптимальным для изученных видов лишайников. Использование лишайниковых веществ (усниновой кислоты) в качестве стерилизующих агентов не является эффективным.3. Отработаны методы выделения фотобионтов из талломов лишайников, и создана их коллекция, насчитывающая 8 штаммов.Селективной средой для выделения и культивирования фотобионтов лишайников является полужидкая модифицированная среда BG'/2-11.4. Установлено, что в полученных модельных ассоциациях базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов 'взаимодействие партнеров в парах видо- и штаммоспецифично. Для ряда сочетаний партнеров в парах отмечено положительное взаимовлияние: индукция роста, увеличение плодообразования у грибного компонента, замедление возрастного лизиса гриба.5. В модельных ассоциациях базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов отмечен синтез новых видоспецифических продуктов.Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность И. Д. Инсаровой, О. В. Камзолкиной, Т. А. Федоренко, О. А. Кокшаровой за помощь на различных этапах работы А. В. Александровой и Е. Ю. Ворониной за помощь в определении грибов, Т. Г. Добровольской за определение бактерий, А. В. Киташову за обсуждение полученных результатов, а также Д. Новоселовой, А. К. Еськовой и Д. К. Нургазиевой за помощь на различных этапах работы.Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук

1. Лобакова Е. С , Смирнов И. А., 2008. Экспериментальная лихенология // Журнал общей биологии. Т. 69, №5. 364 - 378.Патенты и изобретения

2. Лобакова Е. С , Смирнов И. А., 2008. Метод стерилизации эксплантов лишайника исландский мох {Cetraria islandica). Per. номер, заявки 2008111282/13(012197) от 26.03.2008 В статьях, опубликованных в материалах международных конференций

3. Смирнов И. А., Лобакова Е. С , 2006а. Способы стерилизации талломов лишайников // Вопросы общей ботаники: традиции .и перспективы.Матер. Междунар. науч. конф., посвященной 200-летию Казанской ботан. шк. Казань: Графити-групп. 220 - 222.4. Смирнов И. А., Лобакова Е. С , 20066. Эффективность действия стерилизующих агентов на ассоциативные микроорганизмы лишайников // Грибы и водоросли в биоценозах — 2006: Матер.Междунар. науч. конф., посвященной 75-летию Биол. ф-та МГУ им. М. В. Ломоносова. М.: МАКС Пресс. 149 - 150.5. Lobakova Е. S., Smirnov I. А., 2007. Synthesis of the model associations on the base of agaricoid basidiomycetes and cyanobacteria // Abstracts of the XV Congress of European Mycologists. St Petersburg: TREEART LLC. P.Прочие публикации

6. Смирнов И. А., Лобакова Е. С, 2004. «Культуры тканей» лишайников.Тезисы 8 молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге.

7. Смирнов И. А., 2006. Комплексы микромицетов, ассоциированные с лишайником Cetraria islandica II Тез. докл. XIII Междунар. науч. конф.студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006». Секция Биология. М.: МАКС пресс. 211.8. Смирнов И. А., Лобакова Е. С, 2007. Особенности культивирования фотобионтов лишайников // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». Саратов: Научная книга. 32.9. Смирнов И. А., Лобакова Е. С , 2008. Морфофизиологпческая характеристика смешанной культуры Pleurotus ostreahis и азотофикирующей цианобактерии АпаЪаепа variabilis II Матер, юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М. В. Горленко «Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества». М.: Восток-Запад. 198 - 199.Ю.Савельева Д. Н., Смирнов И. А., 2008. Культивирование съедобных грибов Pleurotus spp. совместно с дрожжами и цианобактериями // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы II Научно практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех 2008». М.: Инноватика, 80 - 83.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнов, Иван Алексеевич, Москва

1. Баулина О.И. Ультраструктурная пластичность цианобактерий: Автореф. дисс. .. докт. биол. наук. М. 2005. 48 с.

2. Бутенко Р. Г. (ред.), 1986. Культура клеток растений и биотехнология.— М: Наука, 285 с.

3. Бутенко Р. Г., 1999. Биология клеток растений in vitro и биотехнологиина их основе. — М: ФБК-пресс, 159 с.

4. Бутенко Р. Г., Гусев М. В., Киркин А. Ф., Корженевская Т. Г.,Маркарова Е. Н., 1987. Биотехнология. Кн. № 3. — М: Высшая школа, 127 с.

5. Бязров Л. Г., 2002. Лишайники в экологическом мониторинге, —г М.:Научный мир. 336 с.

6. Вайнштейн Е. А., 1982. Лишайниковые вещества вторичногопроисхождения. Ч. 1. — Л . : Деп. ВИНИТИ №210-83. 1-238.

7. Вайнштейн Е. А., 1982. Лишайниковые вещества вторичногопроисхождения. Ч. 2. — Л.: Деп. ВИНИТИ №210-83. 239485.

8. Вайнштейн Е. А., 1982. Лишайниковые вещества вторичногопроисхождения. Ч. 3. — Л.: Деп. ВИНИТИ №210-83. 486717.

9. Вайнштейн Е. А., 1988. Лишайниковый симбиоз* и физиологобиохимическая регуляция взаимоотношений грибного и водорослего компонентов. Автореф. дис. на соискание ученой степени доктора биологических наук. — Л., 45 с.

10. Вайнштейн Е. А., Толпышева Т. Ю. Действие экстракта из лишайникаHypogynmia physodes (L.) Nyl. и чистых лишайниковых кислот на древоразрушающие грибы // Ботанический журнал. 1992. Т.

12. Вассер П., Кондратьева Н. В. и др., 1981. Водоросли.Справочник. Киев: «Наукова думка», 608 с.

13. Великанов Л. Л., Гарибова Л. В., Горбунова Н. П., Горленко М. В. и др.,1981. — М: Высшая школа, 477 с.

14. Возняковская Ю. М., Рыбакова 3. П., Дуалбаев Э. А. , Попов В. И.,Хотянович А. В., Шкляр М. С , Шуб Т. М (ред.), 1972. Влияние микроорганизмов и протравителей на семена. — М: Колос, 285 с.

15. Голубкова Н. С, 1966. Определитель лишайников средней полосыевропейской части СССР. М - Л.: Наука, 256 с.

16. Гусев М. В., Минеева Л. А., 1992. Микробиология. — М: МГУ, 448 с.

17. Домбровская А. В., 1996. Род Sterocaulon на территории бывшегоСССР. — СПб.: Мир и семья-95, 266 с.

18. Дьяков, Ю. Т. (2000) Введение в альгологию и микологию. Учебник.Издательство Московского университета.

19. Качусова М. В., 1986 Изучение взаимодействия водорослей и грибов влишайниках. Автореф. дис. на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — М, 24 с.

20. Корженевская Т.Г., Бутенко Р.Г., Гусев М.В. Ассоциациицианобактерий с культивируемыми клетками и тканями высших растений. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1990. 225 - 242.

21. Кочетков Н. К., Бочков А .Ф., Дмитриев Б. А., Усов А. И., Чижов О. С ,Шибаев В. Н. «Химия углеводов» М.: Химия 1966, 674 с.

22. Красильников Н. А., 1949. Микрофлора лишайников. Микробиология,18,3.

23. Кронтовский А., 1917. Метод тканевых культур. Общий очерк итехника. Киев. (Цит. по Бутенко, 1999).

24. Лебедева А. Ф., Сованина Я. В., Борсет Е. Л., 2002. // Вестник МГУ,Сер. Биология, №2. 24-29.

25. Лысак Л. В., Добровольская Т. Г., 2003. Методы оценки бактериальногоразнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. — М: Макс-пресс, 120 с.

26. Мережковский К. С , 1907. Законы эндохрома. Докт«. Дисс. Казань:Казанский Имп. ун-т. 402 с.

27. Мережковский К. С , 1909. Теория двух плазм как основа теориисимбиогенеза, нового учения о происхождении организмов // Уч. зап. Казанского ун-та. Т. 76. 97 с.

28. Методы экспериментальной микологии / под ред. И. А. Дудка, П.Вассер и др. - Киев: Наукова думка, 1981.

29. Моисеева Е. Л., 1961. Биохимические свойства лишайников и ихпрактическое значение. -— М — Л.: АН СССР, 82 с.

30. Окснер, А. Н. 1974. Определитель лишайников СССР, выпуск 2.Морфология систематика и географическое распространение. — Л.: Наука, 283 с. 3 1. Определителя лишайников СССР ( 1 - 8 выпуски): Л. •—• СПб., Наука.

31. Плюснин Н., 2002. Внутриталломная изменчивость лишайников //Вестник Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Вып. 53., 15-16.

32. Семенов М., 1990. Лабораторные среды для актиномицетов игрибов. Справочник. -— М: Агропромиздат, 240 с.

33. Соловченко А. и др., 2001. Спетрофотометрический анализ пигментов вплодах яблони. // Физиология растений, 48 (5): 801-808.

34. Толпышева Т. Ю. Влияние экстрактов из лишайников на грибы. 1.Действие водных вытяжек из Cladina stellaris и rangiferina на рост почвенных грибов // Микология и фитопатология, 1984а. Т. 18, вып. 4, 287-293.

35. Толпышева Т. Ю. Влияние экстрактов из лишайников на грибы. 2.Действие суммарных препаратов из Cladina stellaris и rangiferina на рост почвенных грибов // Микология и фитопатология, 19846. Т. 18, вып. 5, 384 - 388.

36. Толпышева Т. Ю. Влияние экстрактов из лишайников на грибы. 3.Действие усниновой кислоты и атранорина на рост почвенных грибов // Микология и фитопатология, 1985. Т. 19, вып. 6, 482-489.

37. Толпышева Т. Ю., 1998. Красная книга Московской области(лишайники). — М: Аргус; Русский университет, 501 - 514.

38. Томин М. Н., 1937. Определитель кустистых и листоватых лишайниковСССР. — Минск: АН БССР, 311с.

39. Фаминцин А. С , 1907. О роли симбиоза в эволюции организмов // Зап.Императорской академии наук. Сер. 8. Т. 20. №3. 15-39.

40. Ahmadjian V, 1989. Studies on the isolation and synthesis of bionts of thecyanolichen Peltigeria canina (Peltigeraceae) // PL Syst. Evol. 165: 2 9 - 3 8 .

41. Ahmadjian V. 1961. Studies on lichenized fungi. // The Bryologist 64: 168179.

42. Ahmadjian V. 1967. The Lichen Symbiosis. Blaisdell, Waltham, MA. 152pp.

43. Ahmadjian V. Jacobs J. B. 1985. Artificial reestablishment of lichens IV.Comparison between natural and synthetic thalli of Usnea strigosa. // 1.chenologist 17: 149- 165.

44. Ahmadjian V., 1973b. Resynthesis of lichens, pp. 565 - 579. In V.Ahmadjian & M. E. Hale (eds.), The Lichens. New York and 1.ndon.

45. Ahmadjian V., 1973a Methods of isolation and culturing lichen symbiontsand thalli (pp. 653 - 660). In: Ahmadjian V, Hale M. E. (eds) The 1.chens. Academic Press, New York,.

46. Ahmadjian V., 1990 What have synthetic lichens told us about real lichens?//Bibl. Lichenol. 38: 3 - 12.

47. Ahmadjian V., 1991. Molecular biology of lichens: a look to the future. //Symbiosis. 11: P. 249-254.

48. Ahmadjian V., Jacobs, J. В., 1983: Algal-fungal relationships in lichens:recognition, synthesis, and development. — In Goff. L. J., (Ed.): Algal symbiosis, pp. 147 - 172. — Cambridge: Cambridge University Press.

49. Ahmadjian V., Paracer, 1986. Symbiosis in introduction in biologicalassociation. Clark University Press.

50. Armaleo D., 1991. Experimental microbiology of lichen. // Symbiosis. 1 1: P.163-178.

51. Berbee M. L. 1995. Phylogenetic diversity.// Can. J. Bot, V. 73, P. 11151119.

52. Berbee M. L., Taylor J., 1993. Dating the evolutionary radiations of the truefungi.// Can. J. Bot., V. 71, P. 1114 - 1121.

53. Bertsch, Butin, 1967. Die Kultur der Erdflechte Endocarpon pusillum im1.bor. Planta72: 29-42. (Цит. no Ahmadjian V., 1973b).

54. Binder M., Hibbit D. S., 2002. Higher-Level Relationships ofHomobasidiomycetes (mushroom-Forming Fungi) Inferred from Four rDNA Regions. // Moll. Phylogen. and Evol. V. 22, I. 1, P. 76 90.

55. Bonnier, G. 1888. Germination des spores des lichens sur les protonemas desmousses et sur des algues differentes des gonidies du lichen. Compt. Rend. Soc. Biol. Paris 40:541-543.

56. Bornet J.-B.-E., 1873. Recherches sur les gonidies des Lichens. // Annal, d.se. nat., 5 c, V. XVII. Цит. По Окснер, 1974.

58. Cuny D., van Haluvin C , Caron B. 1997. Stimulation of ascosporegermination by fumaroprotocetraric acid in Diploschistis muscorum. // Nova Hedwigia. 64: 1 - 2, pp. 103 - 110

59. Czech H., 1927. Kultur von pflanziichen Gevebezellen. // Arch. Expti.Zeilforsch. Bd. 3. S. 176 - 200. (Цит. по Бутенко, 1999).

60. Dixon R., Paiva N. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. // The plantcell. 7(7): 1085-1097/

61. Eriksson O.E., Baral H.-O., Currah R.S., Hansen K., Kurtzman C.P.,Rambold G. and Laessie T. (Eds). 2001. Outline of Ascomycota 2001.-Myconet7: 1-88.

62. Galun M., 1989a. CRC Handbook of Lichenology / M. Galun (ed.). - Vol.1.- CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1989. - 297 p.

63. Galun M., 1989b. 12. CRC Handbook of Lichenology / M. Galun (ed.).Vol. 2. - CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1989. - 181 p.

64. Galun M., 1989c. 13. CRC Handbook of Lichenology / M. Galun (ed.).Vol. 3. - CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1989. - 147 p.

65. Gautheret R., 1932. Sur la culture d'extremites de racines. Compt. // RendSoc. Biol. t. 109, P. 1236 - 1238. (Цит. по Бутенко, 1999).

66. Gusev M.V., Baulina O.I., Gorelova O.A., Lobakova E.S., KorzhenevskayaT.G. 2002. Artificial Cyanobacterium-Plant. Symbioses // Cyanobacteria symbiosis/ A.N. Rai, BBergman, U.Rasmussen (eds.). Kluwer Acad. Publ: Dortmoot. P. 253—313.

67. Harrison R., 1907. Observation on the living developing nerve fiber. Proc.Soc. Expit. Biol. Mag. v. 4, P. 140 - 143. (Цит. по Бутенко, 1999).

68. Kinoshito Y., Yamamoto Y., Kurokawa Т., Yoshimura 1., 2001 Influence ofnitrogen source on usnic acid production in a cultured mycobiont of lichen Usnea hirta (L.) Wigg. // Bioscience, biotechnology, biochemistry. 65 (8): 1900- 1902.

69. Komine, M., Iwasaki, Y., Yamamoto, Y. & Нага, K., 2004 Developing asuitable growth substrate for lichen forced cultivation under an artificial environment. Lichens in focus — IAL 6. *

70. Kratz W.A., Myers J., Kratz, Myers, 1955. Photosynthesis and respiration ofthree blue-green algae. Plant Physiology 30: 275-280.

71. Lutzoni et al., 2004. Assembling the fungal tree of lifeA progress,classification, and evolution of subcellular traits.// Am. J. Bot., V. 91 (10), P. 1446-1480.

72. Lutzoni, F., Pagel, M., Reeb, V. 2001. Major fungal lineages are derivedfrom lichen symbiotic ancestors. Nature 411:937-940.

74. Markham K, 1989. Flavones, flavonols and their glycosides. Methods inplant biochemistry. J. Harborne and P. Dey, Acad. Press. 1: 197-235.

75. Nash Т. H. (ed.), 2008. Lichen biology. Cambridge univ. press. 486 p.

76. Ooi V., Fang L., 2004. Immunomodulation and anticancer activity ofpolysaccharide-protein complexes. // CMC. Vol. 7, № 7.

77. Ott, S., 1988. Photosymbiodemes and their development in Peltigera venosa.1.chenologist 20: 361-368. //PI. Syst Evol 165:29-38.

78. Paracer S., Ahmadjian V., 2000. Symbiosis: An Introduction to BiologicalAssociations (Oxford Univ. Press, Oxford, 2nd ed.). M. R. Smith, Am.

79. Prat S., 1927. The toxity of tissue juices for cells of the tissue. Amer. .1. Bot.14: 121.

80. Rai, A. N., 1990. Cyanobacterial-fungal symbioses: the eyanolichens. In:Handbook of symbiotic cyanobacteria (Rai, A.N., ed.), 9-41. CRC Press, Inc., Boca Raton.

81. Rai, A. N., Bergman, В., 2002. Cyanolichens. Biology and Enviromant:Proceedings of the Royal Irish Academy, 102 (1): 19-22.

82. Rippka, R., 1988. Isolation and Purification of Cyanobacteria. // Method inenzymology, 167, 3-27

83. Rosen et al., 1997. A cytoplasmic lectin produced.. // Microbiology, v. 143:P. 2593-2604.

84. Schlosser U. G., 1982 List of strains. Sammlung fon Algenculturen. Bd. 95,S. 181-276.

85. Staineretal, 1971. Phys. Lett. B. V. 36. P. 521.4.

86. Stocker-Worgotter E., Turk R., 1988. Culture of the cyanobacterial lichenfrom soredia under laboratory conditions. Lichenologist 20: 369375.

87. Stocker-Worgotter, Turk, 1989. Artificial cultures of lichen Peltigeradidactyla in natural environment.

88. Vochting H., 1892. Uber transplantation am Pflanzenkorper.Untersuchungen zur Physiologic und Pathologie. Tubingen. (Цит. по Бутеико, 1999).

89. Wasser S. P., 2002. Medical mushrooms as a source of antitumor andimunomodulatings polysaccharides // Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: p. 258-274.

90. White Ph., 1932. Influence of some environmental condition on the growthof excised root tips of wheat seedlings of liquid media. // Plant Physiolol. v. 4, P. 613 - 628. (Цит. по Бутенко, 1999). 140 •

91. Yamamoto Y., Miura Y., Higuchi M., Kinoshita Y., Yoshimura I., 1993.Using lichen tissue cultures in modem biology. // The Bryologist 96: 384 393.

92. Yamamoto Y., Mizuguchi R., Yamada Y. 1985 Tissue cultures of Usnearubescens and Ramalina yasudae and production of usnic acid in their cultures. // Agricultural Biological Chemistry 49: 3347 - 3348.

93. Yoshimura I., Kurokawa Т., Yamamoto Y., Kinoshita Y., 1993.Development of lichen thalli in vitro. // Bryologist 9.6: 412 - 421

94. Yoshimura I., Yamamoto Y. 1991. Development of Peltigera praetextatalichen thalli in culture. // Symbiosis. 11: P. 109-117.