Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мобильные элементы DROSOPHILA MELANOGASTER: анализ геномного полиморфизма в родственных линиях

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мобильные элементы DROSOPHILA MELANOGASTER: анализ геномного полиморфизма в родственных линиях"

а

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

на правах рукописи УДК 575.113 : 595.773.4

НУЖДИН Сергей Викторович

МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ОВОБОРНИА МЕиМОСАЭТЕВ: АНАЛИЗ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА В РОДСТВЕННЫХ ЛИНИЯХ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1992

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН Научные руководители: доктор биологических наук, проф. •

ЕА. Гвоздев

кандидат биологических наук Б. Г. Пасшова Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ЕГ. Митрофанов кандидат биологических наук А. Г. Идадава

Вэдущая организация: Институт биологии Санкт-Штербургского

Университета

Защита состоится 1в92г. в. ¿¡с час

на ааседании Специализированного ученого совета при Институте биологии развития РАЕ

С диссертацией южно ознакошггься в библиотеке Института молекулярной генетики РАН.

Автореферат разослан "4Ц" ¿/.^уПЛи&'ИЖг

Ученый секретарь совета Протопопова Е. Ц. /

I й'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность теш. Мобильные генетические элементы ( рет-ротранспозоны, транспозоны, элементы тит.а ?В ) ОгозорЬ'Ла тэ1&по&азЬег состав ляот существенную часть генома - примерно 1СХ Значительная часть мутаций и реверсий вызывается их транспозициями. Поэтому велики внимание к изучению »/обильных элементов ( Ю ) и разнообразие работ, посвященных им. Одно из направлений работ связано с исследованием генетических систем, в которых Ю перемещается с достаточно высокой частотой. Однако изучение множественных единовременных перемещений УЗ, а тага® постоянных перемещений ретротранспозонов отдельных семейств пока далеко от завершения. Датьнейшее исследование соответствующих генетических систем может пролить свет на причины и механизмы активации Ю.

Другое направление исследований 10 йгсзорЬИа т1апоеазЬвг связано с изучением последствий перемещений ЬЭ. Так предполагается, что перенесения Ю способны модифицировать работу полигенных систем, контролирующих количественные признаки. Изучение этих проблем мояет приблизить нас к пониманию процессов, происходящих при селекции, а такте к оценке значения 1£Э для эволюции природных популяций.

Цель и задачи исследования. Ранее была описана система адаптивных транспозиций в линии НА йгозорЬИа тэ1аподгаз1ег ( Пасшсва и др. 1934, Гвоздев и Кайдаяоз 1986, Бедяеза и др., 1989 ). Спонтанные или индуцированные

скрещиваниями транспозиции 13 в этой линии сопровождались повышением индекса конкурентоспособности линии НА или ее производных. При этом изменеши сайтов локализации были описаны

липа, для ноокольких ИЭ типа рвтрогралопооокоп. ГЬрвап 5гуючп

- г -

данной работы состояла в сравнении локализации 11 семейств Ш разных типов в измененной при адаптивных транспозициях хромосоме 11 линии НА ( хромосома б ). и в хромосоме 11 исходной линии НЛ. Такое сравнение позволяло оценить масштабы генетической изменчивости, обусловленной транспозициями в линии НА.

Было показано ( Беляева и др., 1989 ), что хромосома б контролирует повышенное по сравнению с хромосомой II линии НА значение индекса конкурентоспособности. Вторая задача нашего исследования состояла в выявлении района ( или районов ) хромосомы б, отвечающего эа повышенное значение индекса конкурентоспособности.

Наконец, было обнаружено, что вслед ва стабилизацией мобильных элементов после "адаптивных транспозиций" в некоторых сублиниях активировались транспозиции отдельных мобильных элементов. Исследование этой системы транспозиций составляло последнюю задачу работы.

Научная новизна результатов исследования. Впервые описана локализация большого набора семейств ИЭ разных типов в линии НА и ее производной. Показано, что в ходе адаптивных транспо-виций произошло изменение сайтов локализации всех 11 исследованных семейств Ю. Апробирован новый подход к картированию генов, контролирующих количественные признаки, основанный на явлении попутного транспорта молекулярных маркеров при селекции по вначению количественного признака Показано, что количественный признак - повышенная конкурентоспособность ( возникшая при адаптивных транспозициях ) контролируется несколькими районами хромосомы II. Открыта и охарактеризована но-

ват система нестабильности двух ретротранспозоноз copta и Doc, перемещения этих ретротранспозонов происходят на фоне стабильной локализации других исследованных Ю.

Практическая ценность работа Апробированный в работе метод картирован™ полигенов может применяться в прикладных селекционных программах. Созданные в ходе работы компьютерные программы, предназначенные для удобного ввода, хранения и обработки дачных о локализации Ю, могут применяться другим исследователями. Они использовались в ходе реализации проекта " Генетический мониторинг мобильных элементов в популяциях D. üwlanogastor из зоны аварии на Чернобыльской АЭС ".

Апрсбшотя работы. Материалы диссертащэт были до лоте пи на 1-Й Всесоюзной школе " Генетические основы эволюции и селекции" ( Звенигород, 1990 ), 1-й Всесоюзной конференции по генетике насекомых ( Москва, 1991 ), представлены на 12-й Европейской конференции по дрозофиле ( Mainz, 1991 ).

Публикации. Ib теме диссертации опубликовано пять работ.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав ( обзор литературы, материал и методы, результаты исследований ( в трех частях ) и их обсуждение ), заключения, выводов и списка литература В диссертации приведено _ таблиц и _ рисунков. Работа изложена на на _

страницах малзшописного текста Список литературы включает _

наименования, из них _ отечественных.

МАТЕРИАЛ И UET0£J В работе испольэоваяись близкородственные линии

- í -

D, irolancgaster : инбредная низкоадалтивная НА ( Кайданов, 1979 ), Б ( Пасюкоза и др., 1987), 2Б ( Беляева и др., 1989 ). Родословная этих линий приведена на рисунке 1.

^ FacyiioK 1.

Родословная линий Б и 2Б ( пояснения в тексте ). Исходные ' Отводки

линии Линия Б Линия 2В линии 2Б

НА Sw ( хр.

-----> НА ( хр.

5V НА ( хр.

X ) SV НА ¡I ) —> б —> б III) НА НА

--> 2Б1 --> 2Е2 —> 2S3

Ранее ( Psyukova et al, 1089 ) была получена линия, со-Д0р;,'Л2Дй X - хромосому линии Swedish b, вторую и третью пару хромосом линии НА ( генотип S*;HA;HA ). В такой линии локализация ретротранспозонов МДР1, ЫДГЗ и copla во второй хромосоме была частично изменена в результате транспозиций по сравнении с исходной ( измененная хромосома названа б, линия Sw;6;IIA названа Б ). Хромосому Еторой пары с измененной локализацией ретротраиспозоноз возвратили в исходный геном НА, в результате чего была стгаезировала линия НА; б; НА ( линия 2Б ), обладавшая повышенной ¡сонкуренгоспособностью по сравнеии/ • линией НА С Беляева и др., 1990 ) . В 198G году линия 2Б была разделена ка отводки ?.Б1, 2Е2, 2БЗ, которые вели независимо.

В процессе генетических экспериментов использовались хро-

г ... vi «>.с

мосомы с маркерами и мнозтестЕенными инверсиями - InCDsc se,

í -V. 2 2 <30 iX>

sd se vВ;Iri2LR)SM1,al Cy crispf In(2LR)Pm; Iri.3 U?)Ubx ,Ubx

es; Sb ( Lindsley & Grell, 1968). Для определения индекса конкуренции по методу Хартла и Хаймера ( Hartl & Наугег, 1983 ) использовали линию C(2L)RM,dp; C(2R) RM,px.

Стандартные молекулярно-генетические методы применяли согласно Маниатису и др. (1984) с модификациями. Гибридизация in situ выполнялась, как описано в ( Pasyukova et al, 1988 ), данные по гибридизации in situ были получены совместно с Е. Г. Пасгковой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДЕШЕ

Часть I. Изменения сайтов локализации Ю разной природы, при адаптивных транспозициях.

Ранее, в результате длительной селекции на снижение половой активности самцов, в лаборатории Л. 3. Кайданова была получена линия НА ( низкоадаптивная ). Эта линия характеризуется резким снижением характеристик: жизнеспособности, плодовитости, конкурентоспособности, термостабильности и. т. д. В лабораториях R А. Гвоздева и 13. Кайданова было обнаружено, что в линии НА происходят спонтанные акты транспозиций, сопровождающиеся увеличением конкурентоспособности линий ( "адаптивные транспозиции" ). Эти транспозиции в хромосоме линии НА могут также индуцироваться в результате скрещиваний линии НА, т. е. при изменении генетического фона ( Pasyukova et. al., 1989 ). Однако во всех случаях адаптивные транспозиции были охарактеризованы лишь по сайтам 2-3 семейств ретротранс--позонов. Оставалось невыясненным, перемещаются ли при адаптив-

ных транспозициях U3 других типов, т.е. каковы масштабы генетической изменчивости, обусловленной транспозициями 1В в этом процессе. Для ответа на этот вопрос было решено исследовать изменения сайтов локализации широкого спектра ИЭ. Для анализа была выбрана хромосома 0 ( см. материал и методы ), которую исследовали в составе линии Б или 2В. Во второй хромосоме исходной линии НА и в хромосоме б были определены сайты локализации ретротранспоэонов ЦЦП, ЦДГ2, ЫДГЗ, кДГ4, В104, 297 и copia-, LINE - элементов Jockey и Doc ; транспозона hobo; элемента FB. Бе учитывали сайты, по которым наблюдалась внутрили-нейная гетерогенность ( 2 X от всех сайтов ).

Сайты локализации всех проанализированных Ю в хромосоме б отличались от сайтов локализации хромосомы II линии НА. Следовательно. при адаптивных транспозициях происходят перемещения Ю всех типов ( ретротранспозонов, транспо8онов, инвертированных повторов ). Всего в 40 секциях хромосомы II отмечены 71 инсерция, 72 эксцдаии ЫЭ, 52 сайта локализации не изменились при адаптивных транспозициях. Транспозиционные события произошли по крайней мере в 68 подсекциях хромосомы II.

На рис. 2 представлено распределение доли изменившихся сайтов по длине хромосомы II. Видно, что левое плечо хромосомы II практически полностью изменилось, хотя в течаюгся и зоны ( например секции 34,35 ) в которых сохранились отдельные сайты локализации Ю. характерные для линии НА. В прицентромерной области хромосомы II большая часть сайтов локалиаации ИЭ такаю изменена, однако в пяти секциях подряд ( секции 38 - 43 ) встречаются и сайты линии НА. В двух зонах 2R - плеча ( секции

44,45 и 61, 62 ) не сохраняется ни одного срайта л^нии НА. Наконец, в двух зонах 2R - плеча сохраняются.все ( секции 46-49

) или почти все ( секции 53 - 60 ) сайты линии НА.

i i i

Аргументы в пользу чистоты эксперимента приведены в ( Pasyükova et al, 1988 ): так, например локализация отдельных копий мобильных элементов не изменилась ( в изменчивых зонах ) согласно гибридизации in situ. Однако представлялось важным показать идентичность таких сайтов локализации общи для хромосомы б и хромосомы II линии НА более точно - молекулярными методами. С использованием космидной техники был клонирован такой сайт локализации МЭ copla - 42R Мэтодом Southern - блот анализа было показано, что ближайшее окружение copia в сайте 42В в линии НА и в хромосоме б одинаково ( данные не приведены ).

Ржупок г.

Распределение доли изменившихся сайтов по длине хрокюсош б.

Доля сайтов

1 8,8 8,6 М 8,2 8

» » • ПНИ »♦. «I м

м

ШТШШШШШ!

Секции хромосомы II

Зарегистрированная неравномерность распределения доли изменившихся сайтов по длине хромосомы II дала возможность предположить, что транспозиции происходили избирательно, в определенные районы хромосом ( рис. 2 ). Однако существует более вероятное и тривиальное объяснение, согласно которому эта неравномерность отражает лишь процессы рекомбинации между исходной хромосомой НА и хромосомой, в которой изменилась локализация Ю в результате адаптивных транспозиций.

Таким образом, охарактеризованы изменения сайтов локализации 11 Ю в хромосоме б относительно II хромосомы линии НА. Игтересно, что при зарегистрированном вначительном количестве актов транспозиции конкурентоспособность особей не снижается, а повышается ( Беляева и др., 1989 ). Вероятно, моста встраивания Ю - с;:сгс^:о адаптивных транспозиций неслучайны ( Гвоздев ЕА. и Кайданов Л.З., 1990 ).

Часть II. Новый подход к картированию полигенов; выявление фрагментов хромосом, контролирующих межлинейные различия по уровню конкурентоспособности.

Напомним, что изменение сайтов локализации Ю во II хромосоме линии НА ( часть I ) сопровождало повышение конкурентоспособности линии 2Б, содержащей эту изме' шуюся хромосому (б ), по сравнению с исходной линией НА ( табл. 1 ). Была поставлена задача картирования участков хромосомы б, контролирующих признак повышенная конкурентоспособность - ПК. Однако для картирования необходимы генетические маркеры, а линии На, Б и 2Б не содержат видимых мутаций ( кроме того, видимые мутации трудно испольвовать для этих целей, так как они сш.:и ели-

яюг на приспособленность ).

Таблпцъ 1.

Индекс конкуренции линий 2Б2, НА и их гибридов.

Линии/ I Общее число I Индекс

гибрида I потомков I конкуренции (X)

НА I 1297 I 4.1 ¿1,5

2Б2 (1988)* I 1008 I 20,0 ±3,5

2Б2 I 797 I 17,9 ¿2,3

п НАХ2Б2 I 1195 I 36,0 ±5,8

Р15 НАх2Б2 N8 I 1037 I 41,8 ±7,1

П5 НАх2Б2 N3 I 2503 I 10,3 ± 2,4

П5 НАх2Б2 П31 I 851 I 5,1 ±2,1

Анализ проведен в 1991 году, * данные цитируются по ( Беляева и др., 1989 ), в скобках - год анализа. Гибридны? линии описаны киле.

В качестве паркеров для картирования локусов, контролирующих ПК ( равно как и произвольных количественных признакоз, в том числе контролируемых полигенно ) было предлогено использовать Ю. Известно, что Ю обычно наследуется ¡сак ыенделевские гены, а их перенесения представляет собой достаточно редкие события ( Ильин, 1082 ). В то ли время каждая линия характеризуется определенным набором сайтов локализации мобильных элементов ( Ананьев, 1979; Беляева, 1984 ). Таким образом, мобильные элементы могут быть использованы в ¡сачестве

молекулярных маркеров хромосомных сегментов сравниваемых линий. Сравниваемые нами хромосома б и хромосома II линии НА различаются по сайтам локализации КЭ и практически гомогенны по ним ( часть I ). Для картирования бьши испольБованы сайты локализации ретротранспозонов ЫДГ1 и copia.

Для картирования генов, контролирующих количественные признаки ( в том числе полигенов ), был предложен следующий экспериментальный подход. В результате скрещивания двух линий, различающихся как по значению исследуемого признака, так и по молекулярным маркерам, и последующей свободной рекомбинации в течение нескольких поколений создается гетерогенная популяция. В этой популяции проводится отбор по значению исследуемого признака. В результате отбора частоты аллелей полигенных локу-сов, контролирующих признак, по значению которого проводится селекция, и тесно сцепленных с ними маркеров будут изменяться координирование. Сравнив частоты маркеров до и после селекиии, южно определить, как тот или иной сегмент хромосомы вовлечен в процесс отбора, и, следовательно, судить о локализации изу-с-'х'шх полигенов. Такой принцип локализации базируется на явлении попутного транспорта ( Thomson, 1977 ), и был теоретически обоснозан в работе Lebovitz и др. ( 1987 ). Сксперимонтально, с целью картирования, подход был апробирован впервые. Важно отметить, что в отличие от приведенной общэй схемы, специальной селекции не проводилось, отбор в сторону ПК был естественным.

Цель эксперимента заключалась в том, чтобы оценить изменения частот молекулярных маркеров в процессе естественного

отбора в гетерогенной популяции, содерзкацей хромосомы линии IIA и хромосому б ( в одной из повторностей в качестве источника О хромосомы была использована линия 2Б, ь другой - линия Б ). Поскольку в процессе естественного отбора частоты сегментов О - хромосом должны повыиаться, а частоты сегментов хромосомы И КА понижаться, то целесообразно было начинать эксперимент л; :: низких частотах б - хромосом и высоких частотах HA-xpc:.ioc'.v. Для г,ос?!':мта1 соотгегствуюпзос частот проводили "разбавлеш: геномов линии 2Б2 и Б геномом линии ИЛ. Одного самца 212 или • скресивали с тремя самками линии НА. Самцов F1 скрещивали ии-дизидуалыю с самками НА, заложив 8 и 10 отводок соответствен но при использовании линий 2Б2 и Б. Самок в потомстве кгддоя отводки скрещизади в F2-F4 с самцами линии НА.

Для того, чтобы оценить частоты сайтов локализации в начале эксперимента, пользовались данными о распределении МДГ1 и ropia в исходных линиях. Хромосома II линии на имеет следующие сайты локализации: 23А, ЗОА, ЗЗС, 34DE, 35CD, 56F, 57Л, 59DE для МДП и 23А, 26С, 33А, ЗбАВ, 39CD, 42В, 47В, 53Е для copia. Хромосома б, сохраняя часть сайтов локализации, характерных для НА ( сайты 23А, 56F, 57А, Б9ЭЕ ВДГ-1; сайты 47В, 5ЯЕccple ), приобрела ряд новых сайтов. Сайты локализации ЫДГ1 ( 25А, 26С, 39CD, 41 А, 42А ) И copia ( 33F, 34F, 35CD, 38А, 41А, 42А. 52D ) в хромосоме б, которые отсутствуют в линии НА, были названы Ы ( маркерными ) сайтами. Отметим, что все проанализированные особи линий 2Б2 и Б не различались по Ы - сайтам. Учитывал sto, можно Сою считать, что начальные частоты U -сайтов совпадают с частотой б хромосом в популяции.

- 12 -

Согласно схеме эксперимента, следовало ожидать ( беа учета отбора ), что в F5 частоты встречаемости U -сайтов будут составлять (1/2)" . Начиная с F5 отводки вели массово. Естественный отбор мог подхватывать как доминантные ( признак ПК является доминантным, табл. 1 ), так и рецессивные аллели, повышающие уровень конкурентоспособности. В результате естественного отбора приспособленность гетерогенной популяции должна была стать высокой, что и было подтверждено на примере одной из полученных отводок в конце эксперимента ( отводка N8, подученная от линий НА и 2Б2, табл. 1. ).

Конечный анализ частот маркеров проводили в опыте с 2Б2 в F15 ( всего проанализировано 82 особи ), а в опыте с В в F17 и F21 ( всего проанализировано 36 особей ). Набор сайтов локализации ИДИ и copia не изменился за врою., прошедшее с начала эксперимента, то есть в процессе опыта не происходили перемещения ретротранспозонов ЫДР1 и copla, следовательно их сайты действительно могут использоваться как маркерные. Значения усредненных по отводкам частот встречаемости особей с данным Ы -сайтом относительно расположения сайта на генетической карте представлены на рисунке 3.

Видно, что в опытах с обеиьг: линиями 2Б2 и Б получены сходные распределения частот встречаемости сай'0'j локализации КПП и copla. Частоты сайтов ЩЦЧ. и copla, находящихся в одних и тех же сегментах второй хромосомы, практически одинаковы. Частоты M - сайтов варьируют от 0,2 до 0,95, достоверно изменяясь от низких в дистальной части левого плеча ( сайты 25 А, 260 ВДП ) к высоким в проксимальных районах ( сайты 39CD,

41 л 12а ЦДГ1; 33F, 34F, 35CD, 38А, 41А, 42А copia ) и К низким в дистальной части правого плеча ( сайт 52D copia).

Рисунок 3.

Распределение частот У - сайтов по длине хроюсош П. Частота Ы-сайта

ltJ 20 33 40 59 (£3 73 83 93 ICO

иорганиди

1 - частота M - сайтов отводки 2B2N3 в F15;a- copia, ■ -МДГ1. 2 - частота tí - сайтов отводки 2Б2 в F15;°~ pia, ■ -UJiri. 3 - частота U - сайтов линии Б в F17,21;ÏZ- copia, » tiJWl. 4 - иинииальтв и шкс:шальное стандартные отклонение от среднего значения частот M - сайтов.

Можно сделать вывод, что отбором подхватываются прицент-ромерные сегменты б хромосомы. Таким образом, мозпю предположить, что аллели, контролирующие повышенную приспособленность, располагаются в прицентромерных областях второй хромосомы.

Нельзя было исключить, что интенсивный отбор по прицент-ромерным районам хромосомы б маскирует результат вс. мохяого

менее интенсивного отбора по районам, вносящим меньший вклад в повышенную приспособленность 2Б2 линии. Дополнительная информация была получена при исследовании отводки ( N3 ), где при-центромерный р 1он и 2 R плечо были представлены участком хромосомы низкоадаптивной линии НА. В F15 в отводке КЗ индекс конкуренции, как и ожидалось, приближался к значению в линии НА ( 10,5é 2,6Х в отводке N3 • 4,1 ± 1,0 для НА табл.1 ) по сравнению с отводкой N8 ( 41,8 ±7,1Z табл. 1 ) в которой б -хромосома сохранилась полностью. Тем не менее, индекс конкуренции отводки N3 достоверно превышал индекс конкуренции линии НА ( 4,1±1,9Х ). Следовательно, сохранившиеся районы 2L. плеча хромосомы б также вносили небольшой, но значимый вклад в повышенный уровень приспособленности 2Б2 линии. В отвод:се N3 были проанализированны сайты локализации ретротронсиоаонов у 30 особей ( рис. 3 ), что дало возможность предполагать, что повышенная приспособленность этой отводки по сравнении с НА обусловлена районом секций 30-33 хромосомы б или их окрестностями ( дополнительно рассматривались частоты сайтов линии НА, не встречающихся в хромосоме б, данные не приводятся ). Из отводки N3 была выделена инбредная суботводка, не содержащая U -сайтов. В полной соответствии с ожидаемым, индекс кокк; ^енцки в этой суСотводке ( 5,1*2,1Z отводаса N3HA в табл.1.) не отличался от индекса конкуренции линии НА. Таким образом, доказано, что признак ПК контролируется несколькими районами хромосомы б.

Пэлуччтые результаты привлекают внимание к прицентромерному району б хромосомы как к месту локализации генов, в ос-

новном обуславливающих повышенный уровень приспособленности, контролируемый хромосомой б. Ранее было показано, что в при-центромерных районах второй хромосомы локализована существенная часть " горячих точек " транспозиций МЭ, сопровождающихся увеличением адаптивной ценности особей линии НА ( Беляева и др., 1989 ). Известно такие, что в прицентромерных районах второй хромосомы линии НА локализуется большая часть спонтанно возникающих летальных мутаций ( Кайданов и др., 1979 ). Таким образом, можно предполагать, что в этой части генома концентрируются локусы, обеспечивающие жизненноважные функции и обладающие повышенной изменчивостью.

Часть IIГ. Системы нестабильности элементов' copia и Рос.

Проведенный анализ локализащш Ю ЫДГ1, КДГЗ, copia, ВДГ2. ЦЛГ4, 207, В104, H. M. S. Beagle, BS, I, FB , Doc в отводках линии 2В ( и частично линии Б ) показал, что локализация ВДГ1 и МДГЗ в отводках 2Б1, 2Е2 и 2БЗ практически одинакова у всех проанализированных особей и не отличается от описанной в линии 2Б непосредственно после синтеза ( Беляева Е.С. и Др., 1989 ) ; локализация ЫЭ ВДГ2, ВДГ4, 297, В104, К U. S. Beaglo, BS, I, FB ( данные не представлены ) также г уогенна ( или гетерогенность незначительна ) и одинакова в проанализированных отводках ( 251 и 2БЗ ); пршстически полная гомогек ность локализации обнаруживается для ретротранспозона copia в отводках 2Б1 и 2Б2 ( рис. 4 ) ; наконец локализшпи Doc практически одинакова у всех проаналиэириаашых особей в линии В

( данные не представлены ). Таким образом показано, что после транспозиционных событий, произошедших в хромосоме б, МЭ стабилизировались.

Совершенно иная картина локализации copla наблюдается в отводке 2БЗ ( рис. 4, для примера приведены данные по третьей хромосоме ). Все сайты, характерные для отводок 2В1 и 2Б2 сохранились в отводке 2БЗ, следов „'ельно, эксцизий Ю copia в ней не происходит. Однако особи этой отводки имеют в среднем 10 дополнительных сайтов локализации copla рассеянных по всему геному. Подчеркнем, что стабильная локализация ЫДГ1 в отводке 2ВЗ была обнаружена и у тех же личинок, для которых менялась локализация copla. Кроме того, новые сайты локализации ретрот-ранспозона copia появляются на фоне гомогенности по целому ряду УЗ ( см. выше ). Таким образом, необычную локализацию copla в отводке 2ВЗ невозможно объяснить васором.

Неожиданная картина локализации наблюдается также для •ютротракспоэона типа LINE ( не содержащего ДКП ) - Doc ( рис. 4, для примера приведены данные по третьей хромосоме). Несмотря на то, что в линиях НА и В сайты локализации Doc практически одинаковы у всех проанализированных особей , во всех отводках линии 2Б выявляется значительная гетерогенность по сайтам его локализации. 20-50 дополнительных инсерций Doc на особь обнаруживается в среднем в отводках 2Б1, 2 Б2 и 2БЗ. Еажно подчеркнуть, что Doc не всегда сохраняется в старых - характерных для линии НА и Б сайтах локализации.

Рисунок 4.

СаГгы локализации в хромосоме III отводок 2Б1, 2ВЗ и линии НА.

Ретрстранспозоч - copia

2НГ

KEfôC 71С 73С

82С

87F

ЯЕ 9S9 923 83

2В Г

1 ;—.-;---— : : : : :

! ® • ! ' ! I * s»; * • i s » •• i « ■ ; i .. i • . i i 1 !

! t î • ! 1 ! ! ! ! i i : i ■ !■ • : i i : •! i ;

; :. : : :. : « • ■ _i

I :

Doc ( LINE )

ЕЯ 2S1 2Q

6БА б?ГЗ 67? 7Й TSC 77Е Ш BGA

86А

92F53F

: ; ; ; ■ ; - ; ; ; ; i

i i i : ! î :i E : 5 î 'i 4 5 i * î î î 1 !

i ( ! *i ï. i : 1 . •• —: s. : ■ ll.ll •Ï- il î S i ..( ï i i : ::: : : i i! ii

На одной строка нанесены данные для одной особи ( например в отводке 2Б1 сайты локализации copia определены у 5 особей, особи идентичны по сайтам локализации и каждая 1пчет10 сайтов). Укапаны цитологические сайты С стаи ильные ) по длине хромосот.

- 18 -

Для выявления транспозиций copia в отводке 2БЗ по пять самцов этой отводки индивидуально скреддоали с самками отводки 2Е2 со стабильной, хорошо охарактеризованной локализацией copta. У гибри, ,:в первого поколения на личиночной стадии определяли локализацию copla. Пэтомство каждого самца анализировали отдельно.

Хромосомы гибридной особ F1 должны иметь ( при использовании метода гибридизации in situ регистрируются вместе сайты обоих гомологов ):

-"старые" сайты локализации copla, характерные для стабильной ( 2Б2 ) и нестабильной ( 2БЗ ) отводок;

-"новые" сайты локализации copia, характеризующие хромосомы гамет самцов отводки 2БЗ, вз..тых в опыт.

Поскольку рекомбинация между гомологичными хромосомами у самцов не происходит, у каждой особи в Fi должен был присутствовать набор "новых" сайтов локализации copla, характеризующих только один из гомологов исходного самца Удавалось выявить tía гомолога каждой аутосомы и сайты единственной Х-хромосомы самца и таким образом полностью охарактеризовать у негр локализацию copla. На фоне "старых" и "новых" сайтов локализации copia регистрировались возникшие в результате транслозиций в генеративных тканях самца дополнительные сайты.

Транспозиции copia были выявлены у всех пяти проанализированных самцов. Взего среди 97 проанализированных потомков F1 15 имели сайты локализации ( обычно один ) copla, возникшие в результате, транспсзиций. В трех случаях были зарегистрированы небольшие "пучки" транспозиций (один и тот же сайт появлялся у

- ia -

двух особей). Этот фат свидетельствует о том, транспозиции могут происходить на премейотичесю« стадиях. С учетом "пучков" частота транспозиций составила сколо 122 на гаплоидный геном на поколение. В результате транспозиций новые сайты появились во всех группах сцепления. Был зарегистрирован случай одновременного появления двух инсерций copia у одной особи.

Транспозиции Doc ( совместно с Пахомовой А. Е ) выявляли в изогенной семье отводки 2БЗ ( 2БЗ iso ). У особей этой семьи в F2 после проведения через балансеры ( запиратели кроссинго-вера ) были определены сайты локализации copia и Сое. 'Различия в распределении copla и Doc ( рис. Б ) можно интерпр-тировать как результат перемещений Ю, произошедших в процессе ияогени-зации или в первом поколении после нее. Разлкия обнаруживались на фоне сохранения всех старых сайтов локализации copla. Таким образом было показано, что не только транспозиции copia, но и Doc происходят и в настоядее время.

Рипунок 5.

Сайты локализации copla и Doc в п^воч плече хроуосо'ун II изогенной семьи.

4ÍA42A42B 476 520 53£

4M 44С45А

I • I и* Ml • • IM law* i ■ tai Г«« 11 IMI

ппПа Doc

На одной е..-же ;.»иведены данные, полученные для одной особи.

• 1 Важной особенностью описанной системы явилось отсутствие эксцизий copla, по крайней мере, из "старых" сайтов локализации ( во Есех ранее описанных случаях транспозиций Ю частоты эксцизий и инсрций оказывались близки ). Следовательно, ин-серционная активность Ю шжет проявляться независимо от акс-цизионной активности. В отличие от copla, Doc обладает способностью к эксцкзиям ( рис. ~ ). Следовательно, отсутствие эксцизионний активности copla является свойством не генетической системы, а самого этого Ю. Однако можно было бы предполагать, что перемещающийся элемент copla в отличие от других -стабильных копий этого семейства в "старых" сайтах инсертиро-вал в Doc и перемешается в составе последнего. Однако новые сайты Doc и copla, проанализированные у одной и той же особи, практически не совпадает ( например на рис. 5. данные для copla и Doc , расположенные на одной строке ). Гипотеза о перемещении copla в составе другого активного Ю можвт быть отброшена на следующих основаниях. В среднем каждый гаплоидный геном сводки 2БЗ накопил 5 дополнительных сайтов copia. Если размножение copla произошло в составе ближайшего окружения ( другого 1В ), соответствующая структура copias-окружение должна быть в среднем амплифицирована до 5 копий на гаплоидный геном. Саузерн - блот анализ с использованием мелко - и крупнощепящих рестриктаз ( данкуе не приведены ) не выявил амплификации какого -либо варианта окружения copia в отводке 2БЗ по сравнению с 2Б1.

Особь-i интер-to представляет сравнение распределения ин-серций мобильных элементов по хромосомам, что позволяет выска-оать пред;-сложения о биологических зффеГлах иноорций. При оцг-

чайной распределении инсерций по геному в Х-хромосоме должно содержаться около 19Х всех геномных инсерций. Если яз большая часть инсерций приводит к появлению вредных для организма рецессивных мутаций, то доля в Х-хромосомэ должна быть существенно меньшей ( ~ 122 ) вследствие элиминации их в гемиэигот-ном состоянии под действием отбора ( Charlesworth et al, 1989).

X - хромосома отводки 2БЗ существенно обогащена новыми инсерциями copia ( 31X ) по сравнению с аутосомами ( II - 37Z, III - 32Z ). Это распределение не соответствует ни одной из вышеописанных моделей. Возможно инсерции copia приводят к появлению рецессивных селективно выгодных мутаций ( " линия 2Б происходит от линии НА, в которой открыта система ецаптивных транспозиций ). С другой стороны, более ве-юятным и-ажется предположение, что селективно нейтральные инсерции copia происходят преимущественно в Х-хромосому.

Сайты Doc распределяются по хромосомам в следующих про- -порциях: X - HZ, II - 45Z, III - 44Х; что соответствует селективной модели с вредным рецессивным эффектом инсершш. В то же время, несмотря на значительное накопление инсерций Doc индекс конкурентоспособности линии ( данные 1988 и 1991 гсчов для отводки 2В2 приведены в табл. 1 ) не изменился. ?!ким образом, естественный отбор эффективно выбраковывает вредные инсерции Doc и заметного снижения приспособленности популяции s целом при накоплении копий МЭ не происходит.

В подавляющем большинстве лабораторных лшп^й Drosophila количество копий на геном IS любого семейства поддерживается на достаточно постоянном, характерном для данного 1Г уровне.

Предполагается, что одним из механизмов поддержания этого уровня является резкое падение приспособленности особи при повышении представительства в геноме любого 1В. С учетом приведенных выше, данг.^а это предположение может бьггь отброшено.

i »

i

ВЫВОДЫ

1. Проъ&ден анализ локализации 11 семейств ИЭ во второй хромосоме, ведущей свое происхождение от инбредной низкоадап-тивкой линии НА и обусловливающей повышенный по сравнению с НА уровень приспособленности ( хромосома 0 ). Показано, чго изменение свойств хромосомы сопровождалось перемещениями по крайней мере 11 семейств ИЭ, относящихся к разлзгчныа типам ( рет-ротранепозоны, транспозоны, FB - элементы ).

2. Разработан новый подход к локализации полигенов, определяющих количественные признаки. Подход основан на изучении "опутного транспорта сцепленных с полигенными локусака; молекулярных маркеров. Метод использован для выявления районов второй хромосомы б, контролирующих значение количественного признака - повышенная конкурентоспособность с использованием рет-ротранспозонов ВДГ1 и copia в качестве молекулярных мар:,еров. Показано, что признак контролируется несколькими районами хромосомы б; основной вклад б гначение признака вносит црицентро-мерный район хромосомы II, дополнительный - проксимальная часть левого плеча хромосомы II.

3. Шк^зано, что после транспозиционных событий, произошедших в хромосоме б, мобильные элементы 13 исследованных се-

мейств стабилизировались. Описана последующая активация транспозиций Doc и copia на фоне стабильной локализации И семейств мобильных элементов. Транспозиции Doc и copla зарегистрированы в ходе экспериментов, частота транспоэитШ copla составляет примерно 0,1 инсерции на гаплоидный геном на поколение. Для мобильного элемента Doc характерны и эксцизионная, и инсерци-онная активности; эксцизий copla не зарегистрировано.

4. Продолжающиеся транспозиции Doc и copla привели к высокой гетерогенности по сайтам локализации этих мобильных элементов. Распределение инсерций по хромосомам отличается от случайного: X хромосома обогащена инсерциями copla , to обеднена инсерциями Doc. Число копий ретротранспогона Doc возросло в несколько раз по сравнению со стабильными линиями, ч^о не привело к изменению приспособленности особей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нуждин С. В., Пасюкова Е. Г. Новый подход к кэшированию полигенов. Локализация генов, контролирующих уровень приспособленности близкородственных линий D. mlanogaster// Геге-тика. - 1991. - Т. 27. N. 5. - С. 849-860.

2. Nuzhdln S. V., Pasyukova Е. a New approach to polygene trapping: location of penes controlling fitness levei in related Drosophlla rmlano^aster stocks // 12th European Drosophila Conference. Mainz. - 1991. - Abstract, book. - P. 146.

3. Пасюкова В. Г., Нуждии С. E Мобилизация ретро: танспо-

вопа copla в генода Drosophlla mlaragaster// Генетика. -1992. - T. 23. N. 4. - С. S - 14 .

4. Цуждии С. В., Еасюкова Е. Г. Генетические последствия дестабилизации уетротранспозона copia Drosophlla rmlanopaster/ / Первая всесоюзная конференция по генетике насекомых. - 1931.

- Тезисы докладов. - С. 82.

Б. ЛаЛбович Б. А., Нувдш: С. Е , Глушкова И. Е , Куравлева Т. О., Шсшова Е. Г., Беляева Е. Сл., Гвоздев Е А. Геномная изменчивость и ретротранспозоны в процессах видообразования на призере видов-двойников дро8Сф:1ЛЫ. // Нзрвая всесоюзная конференция по генетике насекомых. - 1991. - Тезисы докладов.

- С. 63.

Подп. в печ. 01.04.02 г. Тираж 100 лкз. Заказ № IJ641

Централизованная типография ГА "СоюэстроР.мауериалоь"