Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробный метаболизм неионогенных поверхностно-активных веществ: ацил- и алкилпроизводных полиэтиленгликоля

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробный метаболизм неионогенных поверхностно-активных веществ: ацил- и алкилпроизводных полиэтиленгликоля"

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В.И.УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

& ОН На правах рукописи

УДК 579.222:677.042.2

СКИПИНА Ирина Михайловна

МИКРОБНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ НЕИОЮГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ: АЦИЛ- И АЛКИЛПЮИЗЮДНЫХ ПОЛИЗТИЛЕНГЛИКОЛЯ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата йюлогических наук

КАЗАНЬ - 1993

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории "Биотрансформация органических соединений" Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Научные руководители: доктор химических наук,

доцент E.H. Офицеров; доктор биологических наук, профессор Р. П. Наумова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

.зав. лабораторией В. И. Дуда; кандидат биологических каук, старший научный сотрудник А.З. Гарейшина

Ведущая организация: Институт биологии Казанского науч-

на заседании специализированного Совета К. 053.29. 19 в Казанском государственном университете но адресу: 420008, Казанъ, ул. Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Ленина, 35. Автореферат разослан <-£¿-¿¿¿^/[¿/19Э4 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

ного центра АН РФ Защита состоится " tlt/ 1994 г. в

;00

часов

Аскарова

Актуальность проблемы. Одной из -наиболее Еажных задач современной науки является обоснование и разработка мер защиты биосферы от негативного воздействия химических'загрязнений промышленного, сельскохозяйственного и бытового происхождения.

К числу наиболее опасных в экологическом отношении ксенобиотиков принадлежат поверхностно-активные вещества СПАВ). Масштабы мирового производства ПАВ составляют десятки миллионов тонн в год, а интенсивное применение детергентов во многих областях обуславливает присутствие ПАВ в качестве постоянного компонента отходов и выбросов различных отраслей промышленности и коммунального хозяйства. Попадая в окружающую среду, ПАВ оказывают токсическое действие на представителей флоры и фауны СУегта, 1978), особенно в связи со способностью детергентов увеличивать токсичность других ксенобиотиков Сфенол, пестициды), а также активировать канцерогенез, индуцированный полициклическими ароматическими углеводородами СМо-жаев, 1976; Бидап, 1967). Этим определяется значение изучения биодеградации данных соединений для охраны окружающей среды и здоровья людей. Кроме того, фундаментальные закономерности биодеструкции ПАВ приобретают самостоятельный интерес в свете взаимодействия биологических - объектов с чужеродными соединениями, исследование которых позволяет углубить наши знания об эволюционных связях и адаптационных механизмах в живой природе."

Ориентация производства ПАВ на препараты с высокой степенью биораспада привлекает внимание исследователей к группе неионоген-ных поверхностно-активных веществ СНПАЕ) и, в частности, оксиэтили-рованных кислот и спиртов (ацил- и алкилполиэтиленгликолей). Практическая направленность работ по изучению биоразложения НПАЗ определяет выбор в качестве объектов биоценозов природных вод или активного ила, а не индивидуальных культур микроорганизмов, .что существенно сужает возможности установления метаболических путей превращения ксенобиотиков. В силу этого, по-видимому, до сих пор нет единого мнения о ключевом этапе деструкции оксиэтилированных спиртов, а также отсутствуют данные о характере ферментов, осуществляющих зто превращение. Между тем, простая эфирная связь, соединяющая гидрофобную и гидрофильную части молекул алкилгликолей СО-ал-кильная связь), может служить объектом самостоятельного интереса, как не имеющая аналогов в нормальном метаболизме микробной клетки.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение деградации НПАВ на примере препаратов лаурокс-9 СЛР) и синтанол АЛМ-10 (СИЮ под воздействием индивидуальных культур микроорганизмов, установление

механизма первичной деструкции, а также путей вовлечения в нормальный метаболизм микробной клетки.

Решались следующие экспериментальные задачи:

1. Выделение чистой культуры микроорганизмов, способной Использовать НЛАВ из категории оксиэтилированных алифатических спиртов (синтанол) и кислот (лауроксЭ в качестве единственных источников углерода и энергии в концентрациях свыше 1 г/л.

2. Характеристика воздействия НПАВ на микроорганизмы: влияние на рост и дыхательную активность, определение литического действия.

3. Разработка методов анализа НПАВ для выявления физиолого- ■ биохимических закономерностей биодеструкции в связи с особенностями состава технических препаратов НПАВ.

. 4. Установление ключевых этапов деструкции синтанола и лауро-кса, а также ряда Конкретных механизмов вовлечения НПАВ в нормальный, метаболизм клетки.

Научная новизна. Получен штамм Pseudomonas mendocina В-1729, способный утилизировать НПАВ синтанол И лаурокс как единственные источники углерода и энергии в концентрациях до 10 г/л.

Исследовано влияние НПАВ на микроорганизм-деструктор, его ростовые характеристики и окислительную активность.

Разработан новый метод селективного определения НПАВ и их метаболитов в процессе биодеградации.

Исследованы условия разложения НПАВ выделенным штаммом, определены основные закономерности роста микроорганизма и динамики ин-термёдиатов в процессе деструкции.

Установлено, что ключевой этап метаболизма оксиэтилированных ..алифатических кислот у Pseudomonas mendocina представляет собой гидролитическое, а оксиэтилированных спиртов .- окислительное расщепление молекул НПАВ. Продуктами указанных реакций в обоих случаях являются полиэтиленгликоль (ПЭГ) и алифатический фрагмент, который утилизируется микроорганизмом.

Показано, что скорость потребления полимергомологов в препарате синтанола снижается по мере увеличения количества оксиэтиль-ных групп. ~

Обнаружена и охарактеризована активность фермента Pseudomonas mendocina, ответственная за расщепление 0-алкильной связи в синта-ноле.

Установлены схемы метаболизма лаурокса и синтанола у Pseudomonas mendocina.

Практическая значимость. Полученный штамм Pseudomonas mendo-cina в сочетании с данными о его метаболической активности и устойчивости к воздействию НПАВ является реальной основой для создания научно обоснованных биотехнологий очистки высококонцентрированных локальных стоков соответствующих производств.

Выявленные ферменты первичной деструкции НПАВ после определенной модификации могут быть применены в.устройствах для ферментативного разрушения НПАВ, а также при создании сенсорных систем для селективного контроля загрязнений..

Апробация работы. Диссертация доложена на совместном заседании НИЛ БОС, НИЛ ЛЭБ и кафедры микробиологии (1993). Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ (1990, 1991-, 19923, конференциях молодых ученых СПущино, 1988-19903, VII съезде ВМО С Алма-Ата, 1985), конференциях молодых ученых-биологов "Актуальные проблемы современной биологии"СКазань, 1988) и "Молекулярные аспекты функционирования организмов" (Казань, 19893, II Всесоюзной конференции "Микробиологические методы защиты окружающей среды" (Пущино, 1988), XV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Минск, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа содержит 16 таблиц, 31 рисунок. Список литературы включает 238 наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

При изучении биодеградации синтанола и лаурокса объектом исследования служил штамм Pseudomonas mendocina В-1729 , выделенный нами из микробного сообщества активного ила. Изучение литической активности синтанола проводили с использованием, указанного штамма, а также штаммов Esherichia coli и Bacillus subtilis, выделенных из природных источников. В качестве основной питательной среды 1 использовали синтетическую среду, которая включала (г/л): глюкоза -1-3; дрожжевой экстракт - 5; (NH^gSO^ - 1,0; KHgPO^ - 2,77; микроэлементы (Герхардт, 19833; pH 7,0-7,5. Для изучения роста Ps. mendocina, потребления НПАВ и образования метаболитов использовали среды 2, 3, 4, которые получали из среды 1 путем замены источников углерода, соответственно, на: синтанол (0,5-10 г/лЗ, лаурокс (3

г/л), полиэтиленгликоль СПЭГ)-400 СЗ г/л). Рост микроорганизма на фоне различных углеродных источников оценивали в средах,полученных путем замены источников углерода в среде 1 на гликоли различной полимерности, глиоксилат, Triton Х-100, Brij-30, Brij- 35, гексаде-каан, додециловый спирт. Во всех опытах соблюдали стандартное количество посевного материала, исходная плотность составляла 0,200,25. Литическую активность синтанола оценивали по выходу внутриклеточного материала, поглощающего при.260 нм (Maguire, 1985),

Для получения клеточных экстрактов биомассу организмов, выращенных в соответствующих средах, суспендировали в буфере и разрушали с помощью механического пресса при давлении 5 т/сы^ при 0°С или ультразвуковым дезинтегрированием при 4°С и рабочей частоте 22 кГц. Активность оксигеназ определяли спектрофотометрически, ис-. пользуя доноры электронов:. НАДС40Н, аскорбат, 0Ь-6-метил-5,6,7,8-тетрагидроптерин CKotting, 1987). Цитохром Р-450 выявляли с использованием целых клеток, регистрируя СО-дифференциальные спектры СМа-уэрсбергер, 1980). Дегидрогеназные активности определяли спектрофотометрически с НАД(Ф)+ (Kemp, 1988) л 2,6-дихлорфенолиндофенолом СДХФИФ) в качестве акцедторов электронов CKawai,1986). Аналогичные реакционные смеси с ДХФИФ использовали для определения активности синтанолрасщеплявдего фермента в сочетании с ТСХ-анализом продуктов реакции. Оксидазы тестировали с 0-дианизидинсм, а также поля-рографически - по потреблению кислорода СШилова, 1989) . Каталазу оценивали спектрофотометрически (Haywood, Larg, 1981). Изоцитрат-лиазную активность определяли спектрофотометрически при 324 нм, а малатсинтазную активность - с АцКоА CDixon, Kornberg, 1959). Активность липазы анализировали в реакционных смесях с п-нитрофенилла-уратом (Fisher, 1986). Лаурокс-гидролизующую активность определяли титрованием по количеству свободных жирных кислот. Активность реду-ктазы тартронового полуальдегида и глиоксилатредуктазы определяли по поглощению НАДФН (Boronát.,1983).

Для определения концентрации, а также идентификации НПАВ и их метаболитов црименяли последовательную экстракцию образцов культу-ральной жидкости (ЮЮ трехкратными порциями органических растворителей: CCl^ (для извлечения НПАВ), хлороформа (для извлечения ПЭГ), и хлороформа+НС1 (для извлечения карбокси-ПЭГ). Анализ концентрации НПАВ и ПЭГ проводили с помощью ИК спектроскопии по интенсивности полосы поглощения в области валентных колебаний vcoc 1100 см"1 и уС(0)0С 1720 см"1. Идентификацию метаболитов НПАВ осуществляли методом ТСХ на пластинках "Silufol UV-254" и "Polyester silica gel

Т-6154": глиоксилат в виде гидразонпроизводных - в системе растворителей 6; алифатические спирты, альдегиды и кислоты - в системах 3, 4, 8, 9; синтанол - в системе 1; ПЭГ и его карбоксипроизводные - в системах 2, 5 СTadл 1). Лауриновую кислоту идентифицировали

Таблица 1

Системы растворителей

Система Состав Соотношение растворителей (об/об)

1 хлороформ: диэтиловый эфир: метанол 10:10:3

2 2-бутанон:метанол:вода:аммиак 13:4: 1:2

3 гексан:диэтиловый эфир: уксусная

кислота 60:40:1

4 петролейный эфир: диэтиловый эфир:

уксусная кислота 40: 10: 1

5 ацетон:вода 49:1

6 бензол:диоксан:уксусная кислота 60: 36: 4

7 бутакол:ацетон: вода 10:10:5

8 бензол:метанол:уксусная кислота 45: 8: 4

9 толуол:ацетон 40:1

также по ИК спектрам и температуре плавления. Разделение препарата синтанола на фракции по степеням оксиэтилирования проводили на колонке 45x5 см с силикагелем I 5/40; элвент - хлороформ-метанол. Анализ соотношения протонов гидрофобной и гидрофильной групп в полученных фракциях проводили методом спектроскопии ПМР. Молекулярно-массовое распределение гомологов в препаратах синтанола и,ПЭГ определяли методом ВЭЖХ на колонке CGC 150x3 мм с привитой фазой Sepa-ron SGX NHg. Нейтральные и карбоксилированные ПЭГ разделяли с помощью гельпроникающей хроматографии на колонке 80x8 см с носителем Toyopearl HW-40F. Карбоксипроизводные ПЭГ получали в реакции с би-хроматом калия (Steber,1985).

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми .методами СПлохинский, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение микроорганизма-деструктора.

Для выделения микроорганизма, способного утилизировать НПАВ в высоких концентрациях, использовали сообщество микроорганизмов активного ила.очистных сооружений ПО "Оргсинтез", которое культивировали в средах с возрастающими концентрациями синтанола (0,5-5 г/л) в качестве источника питания в течение 12 суток. Из полученной ассоциации микроорганизмов выделен бактериальный штамм, способный утилизировать как синтанол, так и лаурокс в качестве единственного источника углерода и энергии. На основании культуральных, морфологических и физиолого-биохимических признаков согласно определи-телсмикроорганизмо!в(3егдеу, 1984) исследуемый микроорганизм был отнесен к виду.Pseudomonas mendocina, штамм S-86, впоследствии зарегистрированный во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером В-1.729 Д.

2. Разработка методов анализа НПАВ и их метаболитов.

Для определения концентрации исследуемых НПАЗ и одного из их основных метаболитов (ПЭГ) был подобран растворитель - C0Lпозволяющий проводить избирательную экстракцию НПАВ из водных раство-. ров, при которой ПЭГ оставался в водной фазе. Для полного извлечения НПАВ из водных растворов было достаточно трехкратной эктракции растворов НПАВ-ьПЭГ эквивалентами объемами после чего ПЭГ извлекали трехкратной экстракцией хлороформом. Концентрацию НПАВ и . ПЭГ определяли методом ИК-спектроскопии.

3. Превращение лаурокса (ЛР).

За 18 ч культивирования ютамм Ps. mendocina разлагал ЛР на 99% с экономическим коэффициентом 35%. В среде культивирования накапливался ПЭГ.-Несоответствие кривых потребления СИН и накопления ПЭГ (Рис. 1) свидетельствовало с трансформации последнего. Обнаружение в КЖ и идентификация гидрофобной части ЛР - лауриновой кислоты, наряду с ПЭГ, позволили предположить гидролитический механизм расщепления сложноэфирной связи лаурокса. Наличие активностей липазы в экстрактах клеток Ps. mendocina (6,2 нмоль/мин/ мг белка) и лаурокс-гидролазы (11,8 нмоль/мин/мг белка), а также их согласованная индукция в средах с ЛР (16,0 и 33,3 нмоль/мин/ мг белка, соответственно) указывали на то, что гидролиз ЛР происходит при участии внутриклеточных липаз с образованием лауриновой кислоты и ПЭГ. Внеклеточная липазная активность (50 нмоль/мин/мг белка) не зависела от условий индукции, однако.резкое снижение концентрации

ЛР в период лаг-фазы (Рис. 1) указывало на участие внеклеточных ферментов в гидролизе ЛР.

Биокасса, отн. ед., 2.0 1 ЛР, ПЭГ, г/л

Бясм&сса, отн.ед 1.2

СИИ, ПЭГ, г/л

гЗ

10 15 20 Время, ч

О

I м 1111111111111111111111111

5 10 15 20 25 30

Время, ч

Рис. 1 Рост Рэ.тепс1ос:1па в среде Рис.2. Рост Ps.mendoci.na в среде с лауроксом. 1- рост; 2- потре- с синтанолом. 1 - рост; 2 - пот-бление ЛР; накопление ПЭГ: 3- в ребление СИН; накопление ПЭГ: 3 -эксперименте, 4- теоретическое. в эксперименте,4 - теоретическое.

4. Динамика превращения синтанола ССИН).

Рост штамма Рз. mendocina в средах с СИН (3 г/л) завершался за 28-30 ч культивирования при снижении исходной концентрации 1ШАВ на 98,5%. В КЖ отмечено появление ПЭГ С Рис. 2), а также продуктов его трансформации - моно- и дикарбоксияроизводных СМК-ПЭГ и ДК-ПЭГ), характер и динамика накопления которых были установлены методами ТСХ, ВЭЖХ и ЙК-спектроскопии. ПЭГ и его карбоксипроизводные не поддерживали роста микроорганизма. Вместе с обнаружением алифатической кислоты при культивировании Рэ. mendocina на твердых средах с СИН полученные результаты указывали на реализацию пути расщепления О-алкильной связи синтанола. В отличие от ЛР,расщепление СИН происходило негидролитически, поскольку в реакционных смесях с экстрактом клеток Рэ. raendocina и СИН не были обнаружены продукты расщепления НПАВ С ПЭГ, К-ПЭГ или Ж).

5. Скорость деструкции гомологов в препарате синтанола.

Технический препарат СИН представляет собой смесь индивидуальных оксиэгилированных спиртов, степень оксиэтилирования которых

80

Скорость разложения гомологов СИН, икыоль/ч

20

40

Степень оксиэгнлирования

Рис.3. Скорости разложения

60

о

3 4 5 6 7 8 9 101112)31415

- 10 -

варьирует от 1 до 18. 'ГСХ-анализ изменений в препарате СИН в процессе культивирования Рэ, тепс1ос1-па, а также ВЭЖХ-определение степеней полимеризации образующихся в результате расщепления СИН ПЭГ-гомологов показало, что микроорганизм потребляет преимущественно, гомологи СИН с низкими степенями оксиэтилиро-вания. С помощью ВЭЖХ установили, что скорость разложения индивидуальных составляющих препарата СИН повышается с уменьшением числа оксиэти-льных групп и для гомологов со степенями оксиэтилирования 3-7 является наибольшей С75-65 мкмоль/ч) СРис.

гомологов СИН у Ps. mendocina. 3)'. Полученные результаты согласу-

лительной активности клеточных суспензий при использовании узких фракций детергента в присутствии Triton Х-100. Показано, что присутствие Triton Х-100 (или другого солюбилизирующего агента) является обязательным при определении скоростей превращения отдельных гомологов СИН для исключения артефактов, связанных с нерастворимостью в воде низкооксиэтилированных гомологов НПАВ.

6. Механизм расщепления О-алкильной связи синтанола.

Для выяснения механизма расщепления О-алкильной связи синтанола устанавливали характер гидрофобных метаболитов - предшественников обнаруженной жирной кислоты (соотвегствуюцегоспирта и/или альдегида ) путем определения активностей ферментов, ответственных за их превращение. Рост микроорганизма в средах с СИН сопровождался 8-кратной индукцией НАД+-альдегиддегидрогеназы и повышением уровня активности альдегиддегидрогеназы с ДХФИФ в качестве акцептора ё в 1,9 раза, тогда как уровни активностей ферментов превращения алифатического спирта были незначительными и не зависели от условий индукции (Табл.2). Это свидетельствовало в пользу того, что алифатический альдегид так же, как и ПЭГ, являлся первичным метаболитом расщепления О-алкильной связи СИН. Очевидно, что механизм реакции аналогичен таковому при расщеплении О-алкильной.связи алкилглицери-на (природны* аналог алкил-ПЭГ) (Kotting, 1987) и алккгатиленгли-коля (Snyder, 1974) у высших эукариот с участием птеридинзависимой

ются с данными по определению окис-

- и -

алкилглицеринмонооксигеназн С АГМОЗ - гидроксилирование а-углеродно-го атома алифатического фрагмента с образованием нестабильного по-пуальдегида, который спонтанно распадается на альдегид и глицерин Св нашем случае - альдегид и ПЭГ - Рис. 4).

Таблица 2

Активности предполагаемых ферментов превращения углеводородного фрагмента синтанола в клеточных экстрактах Pseudomonas men-docina.

Ферментативные активности Акцэптор ё Удельная активность, нмоль/мин/мг белка

рост в среде 1 рост в среде а

Алкоголь- дг НАД(Ф)+ 0 0 •

ДХФИФ 27,2 ± 1,1 31,4 ± 2,3

Алкоголь-оксидаза - 2,9 ± 0,7 -

Альдегид- дг НАДФ+ 35,1 - 1.2 34,8 ± 0,6

НАД+ 36,7 i 1,2 290,4 - 1,4

ДХФИФ 163,2 ± 1,8 320,9 1 1,7

7. Ферменты расщепления О-алкильной связи синтанола.

Поскольку предполагаемый механизм реакции расцепления 0-алки-льной связи синтанола (гидроксилирование а-углеродкого атома) мог осуществляться с участием ряда оксигеназ, проводили определение соответствующих активностей в клеточных экстрактах Рэ. mendocina. В результате не было выявлено активностей АГМО, НАД(Ф)Н- и аскорбат-за^висимых монооксигеназ, а также цитохрома Р-450. Расщепление СИН целыми клетками Рб. mendocina Скак и гидролиз ЛР) не зависело от кислорода воздуха и так же как и его окисление,, ингибировалось 2,2- бипиридилом (БП) - хелатором Ге2+.

Известно, что расщепление простой эфирной связи ПЭГ может происходить с участием фермента, активность которого проявляется с ДХФИФ в качестве акцептора ё (Ка«а1, 1985). С ДХФИФ проявляется также ряд активностей дегидрогеназ,. содержащих двухвалентное железо, которые осуществляют гидроксилирование субстрата с включением кислорода воды (Меуег,1983, МеЬга,1989). В реакционных смесях с экстрактом клеток Р5. тепс!ос1па и СИН обнаружена активность ферме-

нта, который осуществляет расщепление СИН с образованием алифатического альдегида и ПЭГ Сданные ТСХ) и одновременным восстановлением ДХФИФ. Феназинметасульфат СФМС), метиленовая синь, феррициа-нид и НАД(Ф) + не могли служить акцепторами электронов. Скорость реакции линейно возрастала с увеличением концентрации белка в реакционной смеси до 1,5 мг. Оптимум рН реакции составил 6,5-7,5. Для проявления активности необходимоприсутсгвие КСИ и ФМС. БП (2мМ) ингибировал активность фермента на 20%.. В качестве субстратов использовались только соединения с О-аякильной группой: СИН, Вг^-ЗО, гексадецилглицерин и гексадецилполиэтиленгликоль. Использование в качестве субстратов узких фракций СИН с возрастающей степенью ок-сиэтилирования приводило к снижению скорости реакции, аналогично вышеуказанной тенденции при деструкции гомологов препарата СИН це- • лыми клетками СРазд. Б). Уровень активности обнаруженного фермента повышался в 3 раза в условиях роста микроорганизма в среде с СИН и составил 115 нмоль/мин/мг белка. Полученные результаты свидетельствуют о расщеплении 0-алкильной связи синтанола через гидрокси-силирование а-.углеродного атома при участии кислорода воды с образованием полуальдегида, который распадается на алифатический альдегид и ПЭГ (Рис.4). Альдегид утилизируется микроорганизмом, а ПЭГ трансформируется в карбоксипроизводные.

8. Ферменты превращения метаболитов синтанола.

Трансформация ПЭГ в карбоксипроизводные осуществлялась Ре. тепс!ос}.па с участием феррицианид-зависимых ПЭГ-дегидрогеназ С Табл.

3). Алифатический альдегид окислялся с участием НАД+- и ДХФИФ-за-висимых дегидрогеназ (Разд. 6) с образованием соответствующей кислоты, которая метаболизировалась через /3-окисление и через индуцируемый-путь - со-окисление. Нз функционирование «-окисления указывали: с одной стороны, сама способность микроорганизма расти на. алифатических углеводородах; с другой стороны, у клеток, выращенных в средах с СИН и ЛР, окисление Ж ингибировалось БП - хелатором Тег* что свидетельствовало в пользу индукции ферментной системы и-окисления жирных кислот, зависящей от двухвалентного железа. Примером такой системы является рубредоксинзависимый гидроксилазный комплекс Рз. о1еоуогапз, осуществляющий ш-окисление алканов и жирных кислот (УНЬоН, 1990).

Превращение двууглеродных фрагментов осуществлялось в основном через глиоксилатный шунт при участии изоцитратлиазы и малатсин-тазы (Табл. 3), и в меньшей степени - по глицератному пути (при участии редуктазы тартронового полуальдегида).

Таблица 3

Активности ферментов метаболических путей превращения глиок-силата в клеточных экстрактах Pseudomonas mendocina.

Ферментативные активности Удельная активность, нмоль/мин/мг белка

Рост в среде 1 Рост в среде 2

Изоцитраглиаза 58,3 ± 1,2 316,8 - 0,9

Малатсинтаза 102,2 ± 2,7 103,5 ± 2,1

Глиоксилат-дегидрогеназа 0 0

Редуктаза тартроно-вого полуальдегида 18,7 ± 0,7 17,3 ± 1,1

Таким образом, выявление метаболитов деструкции синтанола, а также изучение ферментативных активностей в клеточных экстрактах позволило предложить схему метаболизма алкилполизтияенгликоля у Pseudomonas mendocina В-1729 Д (Рис. 4?.

9. Биологическая активность СИН.

Увеличение концентрации СИН до 10 г/л в безуглеродной среде и в среде с глюкозой не приводило к изменении удельной скорости роста Ps. mendocina, так же как и окислительной активности клеточных суспензий микроорганизма. Отсутствовала литическая активность СИН С1-10 мЮ по отношению к клеткам Г~ Ps. mendocina и Е. coli, при наличии таковой по отношению к Г+ В. subtilis. Снижение экономического коэффициента (от 16,2 до 12,7%) и увеличение длины лаг-фазы (от 15 до 45 мин) с повышением концентрации СИН в среде (от 1 до 10 г/л) свидетельствовало о незначительной токсичности детергента, которая, в частности, может объясняться токсичностью продуктов метаболизма, а именно, карбоксипроизводных ПЭГ, изначальное присутствие которых в средах с СИН приводило к снижению урожая биомассы Ps. mendocina на 15Я. Другие экзогенные метаболиты СИН (гли-оксилат, лауриновая кислота, ПЭГ) не влияли на ростовые характеристики микроорганизма.

СН3ССН2)пСН2-0-ССН2СН20)дН Сп=8-10)

СИН

ОН

даиФСок-) + н2о

ДКФИФ,

( +Н2' дащ

Свосст.)

[сн3с сн2) ,^н-о-с сн2сн2о)дНЗ

О

сн3ссн2)п$н

альдегид

носсн2сн2о)дн

ПЭГ

сн3ссн2)псон

кислота

■ (3-окис-ление

\ со-окисле-

^Х ние ✓ ч

Ч

.АцКоА

оксало эдетат

малат

носсн2сн2о)8сон

МК-ПЭГ

О

О

Н0С(СН2СН20)7С0Н-ДК-ПЭГ

тартроновый -полуальдегид

глицерат•

Рис. 4. Схема метаболизма синтанола у Рб.шеЫосапа. Е|- дегидроге-наза Сгидроксилирусщая); Е2~ альдегиддегидрогеназа; Е3~ ПЭГ-дегид-рогеназа; Е^- изоцитратлиаза; Ед- малатсинтаза; Е§ - редуктаза тар-тронового полуальдегида.

+

- 15 -ВЫВОДЫ

1. Выделен штамм Pseudomonas mendocina В-1729 Д, способный использовать неионогенные поверхностно-активные вещества синтанол АЛМ-10 и лаурокс-9,представляющие собой, соответственно, алкил- и ацилпроизводные пояиэтиленгликоля, в качестве единственных источников углерода и энергии в концентрациях до 10 г/л.

5. Показано, что ключевой этап подготовительного обмена лауро-кса включает гидролитическое, а синтанола - окислительное расщепление эфирных связей в молекулах НПАВ с•последующей утилизацией алифатических фрагментов.

3. Впервые у микроорганизмов обнаружена и частично охарактеризована активность фермента, ответственного за расщепление О-алкильной связи в молекулах алкилгликолей.

4. Предложена схема метаболизма синтанола у Pseudomonas mendocina, согласно которой окислительное расщепление О-алкильноп сзгтп:т происходит путем гидроксилирования а-угяеродкого атома алифатнч^с- ■ кого фрагмента алкилгликоля с образованием нестабильного полуальдегида, который распадается на полиэтиленгликоль и длинноцепочэч-ный альдегид. Альдегид утилизируется микроорганизмом, а ПЭГ трансформируется в карбоксипроизводные.

. 5. Впервые проведенная оценка скорости разложения гомологов в техническом препарате НПАВ на примере синтанола показала, что ста скорость у Pseudomonas ßendocina снижается с увеличением степени ок-сиэтилирования индивидуальных компонентов препарата, принимая минимальные значения, нач:;нчя с п=15.

6. Разработан новый метод определения НПАВ и их метаболитов в процессе биодеградации с использованием йК-спектроскспии в сочетании с селективной экстракцией органическими растворителями.

7. Синтанол в концентрациях до 10 г/л проявляет елгбую токсичность в отношении Pseudomonas mendocina, определяемую литической активностью НПАВ, его влиянием на ростовые характеристики микроорганизма, утилизацию органических субстратов и клеточное дыхание.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свиридов С. И. , .Наумова Р. П. , Офицеров E.H. , Ассадуллин А. 3., Скипика И. М. Исследование биологической очистки промышленных стоков, содержащих продукты на основе окиси этилена.//Науч.-тех-нич. конф. "Пути улучшения очистки сточных вод к внедрение оборотных систем водоснабжения", Казань, 1984. - С. 31 -32.

2. Наумова Р. П., Усманов?. Л. П., Зарипова С. К. , Селивановская-

С..Ю., Фаттахова А. Н., Захарова Н. Г., -Статика И. М. Пути интенсификации окисления и детоксхкации ксенобиотиков микроорганизмами. //Тез. докл. VII съезда Всес.микр.общ.."Наука" Каз.ССР, Алма-Ата, 1985.т. 6, - С. 132.

3. Наумова Р.П. , Офицеров E.H. , Черепиева И.Е., Свиридов С.И., Кирсанов В.В., Лисин Г.Р., Гинниатуллин И.М., Скипина И.М. Способ биологической очистки сточных вод от НПАВ.' // Авт. свид. СССР N 1232649, БИ, 1986. - N 19. - С. 102. •

4. Скипина И.М., Хамитов Б.Р. , Офицеров E.H. К определении " технических препаратов НПАВ при их биологическом распаде.//Деп. в ВИНИТИ 25.02.87, N 1336-В 87. - 15 с.

5. Скипина И. М., Хамитов Б. Р. , Чирко Е. П. Особенности деструкции синтанола АЛМ-10 у Pseudomonas mendocina, // Матер, зональ.конф. мол. ученых-биологов "Актуаль.проблемы совр.биологии". Деп. в ВИНИТИ 05.12.89, N 7214 В--89. - С. 113-138.

ß. Скикина И. М. Особенности изучения микробного метаболизма НПАВ. //Матер.науч.-прак. кокф. мол.ученых-биологов "Молек. аспекты функц-я организмов".Деп. в ВИНИТИ 04.07.88, К5373 В-88.-С.106-114.

7. Скипина И. М., Офицеров Е.Н. Сравнительное.изучение микробного метаболизма НПАВ на основе окиси этилена.//Тез.докл. II Всес.. конф. "Микробиол. методы защиты окр. среды", Пущино, 1988. - С. 56.

8. Дьяконова Р. Р. , Чирко Е. П., Скипина И. М., Езрец В. А. Определение молекулярной неоднородности неионогенных НПАВ на основе окиси этилена методом ВЭЯК.// Заводск. лаб., 1991. - Т.5, N3 - С.5-7.

9. Иванченко 0. Б., Ильинская С. Н., Фаттахова А. Н., Скипина И. М., Черепнева И.Е. Оценка гентоксичности неионогенных поверхностно-активных веществ.// Биол. науки, 1991, - Nil. - С. 75-80.

10. Чирко Е. П., Скипина И. М., Офицеров Е. Н. Нетрадиционные подходы к контроля загрязнений и процессов биологической очистки сточных вод от СПАВ.// Тез. докл. XV Менделеевск. съезда по общ. и прикл. химии, Минск, 1993. - Т.З - С. 381-382. __

Сдано в набор 28.12.93 г. Подписано в пеодть 29.12.93 г. Форм, бум. 60 х 84 1/16. Печ.л. I. Тираж 80. Заказ 542.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420006 Казань, Ленина, Л/5