Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная очистка фенолсодержащих сточных вод

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная очистка фенолсодержащих сточных вод"

На правах рукописи

КОРЖЕНЕВИЧ Вячеслав Исаевич

МИКРОБНАЯ ОЧИСТКА ФЕНОЛСОДЕРЖАЩИХ СТОЧНЫХ ВОД

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2003

Работа выполнена в Саратовском государственном медицинском университете, Саратовском филиале ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, действительный член РАЕН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ

Шуб Геннадий Маркович

Щербаков Анатолий Анисимович

Игнатов Владимир Владимирович

Самойлова Любовь Владимировна

Ведущая организация:

Волгоградский государственный медицинский университет

Защита состоится « 9» 2003г. в // часов на заседании диссертационного

совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005 г. Саратов ул. Соколовая, 335

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005 г.Саратов ул. Соколовая, 335

Автореферат разослан » А&^сУя. 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Л.В. Карпунина

Актуальность проблемы

К настоящему моменту во всех странах мира, в том числе и в России, антропогенное загрязнение окружающей среды достигло громадных масштабов и постоянно продолжается. Этот вопрос специально обсуждался в проходившем вначале июня 2003 года заседании Совета Безопасности России.

Биосфера обладает определенным потенциалом самоочищения от токсических соединений, но эти возможности не безграничны (Кирсо и др., 1988). Меры по защите окружающей среды от загрязнения различными химическими соединениями, в том числе и фенольными производными, должны постоянно усиливаться. Осуществление этих мер может идти различными путями (Экологическая биотехнология, 1990).

Наиболее эффективным из них является комплекс мероприятий, направленных на предотвращение (уменьшение или полное прекращение) попадания таких соединений в объекты окружающей среды. Это может быть достигнуто путем постоянного совершенствования технологических процессов, переходом на современные безотходные технологии, повышением культуры производства.

К сожалению, в настоящее время этот путь осуществим только в малой степени. Продолжающееся использование устаревших оборудования и технологий приводит к тому, что все большее и большее количество сырья, промежуточных и конечных продуктов предприятий различных отраслей промышленности, в первую очередь химической, попадают в сточные воды, а с ними и в объекты окружающей среды.

Второй путь - использование мероприятий и устройств, предотвращающих поступление в окружающую среду загрязнителей со сточными водами, твердыми отходами и газовыми выбросами, эффективен, но, к сожалению, также мало используется. Причина этого в достаточно больших капиталовложениях, необходимых для его реализации через разработку новых физико-химических методов очистки производственных сточных вод, создание очистных установок и сооружений, восстановление природных объектов уже загрязненных ксенобиотиками.

Среди этих методов часто невозможно выделить отдельно физико-химические и биологические, поскольку в целях повышения эффективности их постоянно комбинируют (Ковалева, Ковалев, 1987). Тем не менее, общепризнанно, что наиболее экологически целесообразными являются биоремедиация объектов окружающей среды и биологическая очистка сточных вод, которые основаны на использовании штаммов микроорганизмов, способных разрушать соответствующие соединения (Алиева, Илялетдинов, 1986; Бельков, 1995; Вербина, 1978; Головлева, 1992; Головлева и др., 1995; Попов, Безбородое, 1999; Вюгепкяйайоп..., 2000).

В связи с этим одним из путей повышения эффективности очистки фенолсодержащих объектов окружающей среды, и в первую очередь, сточных вод, является использование штаммов бактерий высокоактивных деструкторов фенола и основных компонентов его производства.

Для дальнейшего использования такие микроорганизмы могут быть рекомендованы только после селекции среди них штаммов, обладающих наиболее высокой специфической активностью, не образующих (накапливающих) в процессе метаболизма интермедиатов, более токсичных, чем исходное соединение, и, конечно, же, непатогенных для человека и животных.

Изучение генетической природы детерминирования признака биодеградации является одним из существенных аспектов проблемы утилизации микроорганизмами

различных чужеродных соединений (Боронин, Скрябин, 1985). Эуа стлани ^р'Д'^д^дц I

библиотека I 1

при выявлении внехромосомной природы признаков биодеструкции кодирование признака разложения какого-либо соединения плазмидными генами обеспечивает возможность горизонтального распространения этого признака среди клеток бактериальных популяций (Воронин, Цой, 1989), связанную с происходящей передачей генетического материала штамма-деструктора представителям аутохтонной микрофлоры (Fulthorpe, Wyhdham, 1991; Focht, Searles, Koh, 1996), а также создаются предпосылки для создания мультиплазмидных штаммов бактерий, способных разлагать сразу несколько компонентов-загрязнителей (Friello, Mylroie, Chakrabarty, 1976; Chakrabarty, Brown, 1979; Chakrabarty, 1980).

Для очистки сточных вод различных производств микроорганизмы-деструкторы в настоящее время чаще используются в иммобилизованном состоянии (Илялетдинов, Алиева, 1990; Никовская, 1989; Могилевич, 1995; Селивановская и др., 1996; Удод, 1986; Haculinen, Salkinoja-Salonen, 1991).

Создание лабораторных модельных установок для очистки сточных вод с иммобилизованными клетками штаммов-деструкторов является заключительным этапом перед проектированием и сооружением пилотных промышленных установок, а выбор метода иммобилизации может оказаться решающим не только при их проектировании, но и при дальнейшем использовании. По данным литературы для проведения биохимической очистки сточных вод в аэробных условиях чаще всего используют капельные биофильтры - биореакгоры с неподвижной биопленкой (Экологическая биотехнология, 1990; Biological degradation..., 1994). Среди них существуют реакторы или с псевдоожиженным слоем (частицы суспендированы в восходящем потоке жидкости) или с неподвижным слоем носителя (собственно биофильтры) (Биологическая очистка..., 1985; Яковлев, Воронов, 1982).

Таким образом, подводя итог вышесказанному, можно отметить, что в результате плодотворных многолетних исследований отечественных и зарубежных ученых по теоретическим и прикладным аспектам микробных методов борьбы с загрязнением окружающей среды сформировалась новая отрасль науки - экологическая биотехнология. Несмотря на это, проблемы, связанные с необходимостью изучения закономерностей биологических процессов при очистке сточных вод от различных ксенобиотиков, и, в частности, от фенола и его производных, не теряют своей значимости и актуальности, и в настоящее время.

Это связано с тем, что алгоритм разработки эффективной биотехнологии очистки сточных вод какого-либо конкретного производства всегда требует дополнительных исследований по целому комплексу проблем. Это - поиск и выделение наиболее активных штаммов-деструкторов, их характеристика, изучение специфической активности свободных и иммобилизованных клеток ранее селекционированных микроорганизмов, разработка лабораторных модельных установок и их испытание на пробах соответствующих сточных вод в зависимости от выбранного метода иммобилизации.

Цель работы - научное обоснование и разработка технологии локальной микробной очистки реальных сточных вод от фенола и его производных, позволяющей повысить ее эффективность.

Для ее достижения предстояло решить следующие задачи: 1. Разработать принципы поиска и выделения штаммов-деструкторов ароматических соединений - компонентов фенольных сточных вод среди микроорганизмов различных биоценозов окружающей среды, отобрать среди них наиболее активные;

2. Создать коллекцию активных штаммов-деструкторов фенола и его производных, изучить их биологические свойства;

3. Подобрать оптимальные условия проявления селекционированными штаммами бактерий деструктивной активности, определить ее зависимость, как от химической структуры загрязнителя, так и связь с таксономической принадлежности бактерий;

4. Определить основные пути микробного метаболизма изучаемых соединений -компонентов фенолсодержащих сточных вод и природу генетического детерминирования признаков биодеградации у некоторых из выделенных штаммов;

5. Разработать эффективные биокатализаторы, содержащие свободные или иммобилизованные бактериальные клетки штаммов-деструкторов, для очистки реальных сточных вод различных производств от фенола и его производных (методы наработки биомассы, подбор оптимального метода иммобилизации);

6. Разработать методические подходы практического использования бактерий для локальной микробной очистки реальных сточных вод различных производств от фенола и его производных (тип биореактора соответствующий подобранному носителю для иммобилизации, оценка эффективности очистки фенолсодержащих сточных вод, оптимальные условия работы лабораторных модельных установок).

Научная новизна

Выделены и селекционированы новые штаммы - активные деструкторы фенола и его производных. Приоритет 5 наиболее активных штаммов-деструкторов защищен авторскими свидетельствами СССР (№№1198118, 1597346, 1759794, 1792925) и патентом РФ №2061752.

Доказано влияние на проявление специфической метаболической активности штаммов-деструкторов биологических свойств микроорганизма, химической структуры разрушаемого соединения и условий культивирования.

Впервые описаны и охарактеризованы выделенные из наших штаммов-деструкторов новые трансмиссивные плазмиды биодеградации: фенола (pKS, около 43 Мд, из штамма Alcaligenes faecalis KSV21), фенола и ацетофенона (р8, около 80Мд, из штамма Pseudomonas putida GFS-8), ацетофенона (р9, около 34 Мд, из штамма Pseudomonas putida GFS-9, р139, около 36 Мд, из штамма Azomonas macrocytogenes GFS-139), диметилфенилкарбинола (р93, около 70 Мд, из штамма Pseudomonas putida GFS-93; р106, более 100 Мд, из штамма Pseudomonas putida GFS-106; pl 13, около 100 Мд, из штамма Pseudomonas putida GFS-113). Наличие в составе данных плазмид генов трансмиссивности позволило предположить и доказать возможность их распространения среди представителей собственной микрофлоры активного ила очистных сооружений.

Создан рекомбинантный штамм Pseudomonas putida, несущий плазмидные гены деструкции фенола и гены термотолерантности (Т42° С) (плазмида pKS из штамма A.faecalis KSV21). Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва).

Впервые разработан способ получения иммобилизованных микроорганизмов, разрушающих ароматические соединения, методом включения в полисахаридный гель (агар-агар) (Авторское свидетельство №1705345 СССР) и способ получения биокатализатора в полисахаридном носителе (фурцелларан) (Авторское свидетельство №1742330 СССР). Показано, что иммобилизованные разработанными методами

бактерии сохраняют не только жизнеспособность, но и деструктивную активность на уровне свободных клеток.

Практическая значимость

Разработанная селективная питательная среда для отбора микроорганизмов-деструкторов ароматических соединений (Авторское свидетельство №1306112 СССР) может быть использована для реализации экспресс-метода поиска и выделения из объектов окружающей среды штаммов, способных утилизировать фенол и его производные, значительно оптимизирует и упрощает этот процесс.

Созданная коллекция содержит свыше 100 штаммов бактерий - деструкторов ряда ароматических соединений, изолированных из объектов окружающей среды (почва, пробы сточных вод, активный ил). Некоторые из них использованы для разработки биотехнологий очистки сточных вод различных производств, применяющих фенольные соединения как непосредственные компоненты технологического процесса (например, производство фенола и ацетона кумольным способом) или содержащих их в составе сточных вод (например, гидролизное производство, производство нитросодержащего инсектицида метафоса/паратиона, хлорнитробензола, процесс термической переработки сланцев), а также для улучшения работы уже существующих систем. Кроме того, они могут быть использованы как банк микроорганизмов, обладающих специфической генетической информацией.

Из этой коллекции 10 наиболее активных штаммов, способных разрушать фенол и некоторые его производные, не накапливая интермедиатов, были подробно охарактеризованы и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва). Максимальные деструктивные возможности селекционированных штаммов, их субстратная поливалентность превышают таковые для многих известных ранее штаммов.

Наиболее активные штаммы бактерий-деструкторов ароматических соединений из созданной коллекции испытаны для очистки реальных сточных вод гидролизного производства, производства фенола и ацетона кумольным способом, производства нитросодержащего инсектицида метафоса/паратиона, хлорнитробензола, процесса термической обработки сланцев. Разработаны способы компенсации негативного действия отдельных компонентов сточных вод этих производств, оптимизированы параметры процесса их микробной очистки.

Предложены методы иммобилизации клеток штаммов-деструкторов включением в полисахаридные гелн агара-агара и фурцелларана, что позволило получить биокатализаторы, содержащие жизнеспособные бактериальные клетки, сохраняющие деструктивную активность на уровне свободных. На примере биокатализатора, представляющего собой высушенные агаровые гранулы, содержащие бактериальные клетки штамма-деструктора фенола А./аесаШ КБУ21 показано, что он может достаточно эффективно использоваться для очистки фенолсодержащих сточных вод после длительного периода хранения (7 месяцев).

Разработана лабораторная технология микробной очистки локальных сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом. Она состоит из двух стадий: физико-химической предподготовки сточных вод и последующей их биологической очистки отдельными штаммами селекционированных культур бактерий или их ассоциацией, иммобилизованными различными способами. В режиме периодического и проточного культивирования испытаны лабораторные модели установок -

аэрлифтного биореактора с псевдоожиженным слоем (с циркуляцией слоя носителя) на основе клеток, иммобилизованных методом включения в полисахаридный гель, и биореактора противоточного типа с погружной насадкой (реактор с неподвижным слоем) на основе клеток, иммобилизованных методом адсорбции на волокнистых носителях. Лабораторная модель биореактора, аналогичная последней, на основе иммобилизованных методом адсорбции на волокнистых носителях клеток штаммов-деструкторов нитрофенолов испытана как в режиме периодического, так и проточного культивирования для локальной микробной очистки реальных сточных вод производства нитросодержащего инсектицида метафоса/паратиона, хлорнитробензола.

Для локальной микробной очистки сточных вод процесса термической обработки сланцев Поволжья использованы штаммы-деструкторы фенола и его производных, иммобилизованные методом адсорбции на твердых носителях. Разработана и на реальных сточных водах испытана как в режиме периодического, так и проточного культивирования лабораторная модель биореактора противоточного типа с погружной насадкой (реактор с неподвижным слоем). Эта технология рекомендована к масштабированию.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Создана коллекция микроорганизмов-деструкторов ароматических соединений, выделенных из объектов окружающей среды (почва, пробы сточных вод, активный ил);

2. Оптимизированы условия культивирования для проявления деструктивной активности по отношению к фенолу и некоторым его производным, основным компонентам сточных вод различных производств, пути их разрушения, описать новые трансмиссивные плазмиды биодеградации;

3. Показано, что биокатализаторы, содержащие иммобилизованные включением в полисахаридные гели агара-агара и фурцелларана жизнеспособные бактериальные клетки штаммов-деструкторов фенола и его производных, сохраняют деструктивную активность на уровне свободных;

4. Разработана технология и лабораторный регламент локальной микробной очистки фенолсодержащих сточных вод;

5. Испытаны лабораторные модельные установки типа аэрлифтного биореактора с псевдоожиженным слоем на основе клеток, иммобилизованных методом включения в полисахаридный гель, или биореактора противоточного типа с погружной насадкой на основе клеток, иммобилизованных методом адсорбции на волокнистых или твердых носителях на реальных сточных водах.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены:

- на международных симпозиумах и конференциях:

"Metabolie plasmids" - Conf. (Tallinn, Estonian SSR, USSR, 1982), 8th Biodeterioration & Biodegradation Symp. (Windsor, Canada, 1990), 20th FEBS Meeting (Budapest, Hungary, 1990) "EUROCARB VI" - 6th European Symp. Carbohydrate Chemistry, (Edinburgh, Scotland, 1991), ENVIROTECH VIENNA 1992, (Vienna, Austria, 1992), XVII Intern. Carbohydrate Symp (Paris, France, 1992), "Биология и биотехнология очистки воды" - междунар. конф. (Киев, 1993), 6th European Congr. on Biotechnology (ECB6) (Firenze, Italy, 1993), Intern. Symp./Workshop Environmental Biotechnology

(Waterloo, Ontario, Canada, 1994), Междунар. конф. памяти акад. А.А.Баева (Москва,

1996), 8th Intern. Congr. of Bacteriology (Jerusalem, Israel, 1996), "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (ICOMID'96)

- Междунар. конф. (Пермь, 1996), ISEB'97 - Bioremediation Meeting (Leipzig, Germany,

1997), "Экология и здоровье в XXI веке" междунар. конф. (Ульяновск, 2001). - на всесоюзных и всероссийских конференциях и совещаниях: "Микробиология очистки воды) - 1 Всесоюзн. конф. (Киев, 1982), "Проблемы

изучения, охраны и рационального использования водных ресурсов" - Всесоюзн. конф. (Москва, 1983), "Биологический фактор-производственная и окружающая среда-здоровье человека" - Всесоюзн. конф. (Новополоцк, 1984), "Достижения микробиологии - практике" - 7-ой съезд всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), "Проблемы переноса генетической информации" - X Всесоюзн. совет, по программе "Плазмида" (Пущино, 1985), "Молодые ученые - биотехнологии"

- Всесоюзн. конф. (Москва, 1989), "Новые направления биотехнологии" - Всесоюзн. конф. (Пущино, 1990), "Химические превращения пищевых полимеров" - Всесоюзн. конф. (Калининград, 1991), "Новые направления биотехнологии" - V конф. РФ Пущино, 1992), "Новые направления биотехнологии" - VI конф. РФ (Пущино, 1994)

Достижения экспонировались на выставках: ВДНХ (павильон "Микробиологическая промышленность", 1985), ТЕСН-90 (Пловдив, Болгария, 1990), ENVIROTECH VIENNA 1992 (Вена, Австрия, 1992).

Публикации

По теме диссертации получено 7 авторских свидетельств СССР и один патент Российской Федерации, опубликовано 24 статьи (в том числе 14 в центральных журналах и 6 в зарубежной печати) и 38 тезисов (Всесоюзные, российские и международные конференции и симпозиумы).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 563 источника, и приложений. Диссертация изложена на 364 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 таблицами и 25 рисунками.

Собственные исследования

Материалы и методы. Микроорганизмы. В работе использовали штаммы бактерий, выделенные из объектов окружающей среды, подвергавшихся антропогенному воздействию и загрязненных ароматическими соединениями (природные воды, пробы почвы, сточных вод, активного ила очистных сооружений предприятий различного профиля, производящих и/или использующих в производстве ароматические соединения), а также штаммы грамотрицательных бактерий из коллекции кафедр микробиологии Саратовского государственной медицинского университета, Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского, Чехословацкой национальной коллекции (ССМ) (г.Брно, Чехословакия).

В генетических экспериментах использованы стандартные генетически маркированные штаммы кишечных папочек и псевдомонад из коллекций Кубанского медицинского университета (г. Краснодар), Тартусского университета (Эстония),

Института молекулярной генетики АН РФ (г. Москва), Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН РФ (г. Пущино), Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН РФ (г. Саратов), ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва).

Все использованные микроорганизмы хранили на столбиках с 0,4 % агаризованной L-средой при 4° С с пересевами 2 раза в год.

Микроорганизмы - активные деструкторы того или иного соединения хранили на столбиках с агаризованной средой М9 (см. ниже), содержавшей утилизируемый штаммом субстрат в концентрации 0,5 г/л, при 4° С с пересевами 2 раза в год.

Субстраты. В качестве субстратов при изучении процессов микробного метаболизма фенола и его производных использовали ароматические соединения (класс "хч" или "чда") промышленного отечественного или зарубежного производства, кроме диметилфенилкарбинола и гипериза.

Гипериз (гидропероксид изопропилбензола) был получен на n/о "Нитрон" (г.Саратов) и очищен путем выделения в виде натриевой соли с последующим насыщением углекислым газом и разделением на две фазы - гипериза и солевого раствора.

Диметилфенилкарбинол получали восстановлением гипериза по оригинальной методике, разработанной коллективом аналитической лаборатории Саратовского филиала ВНИИгенетика (к.х.н. А.П. Гуменюк).

Фенол во всех экспериментах использовался свежеперегнанным (171,1°С).

Исходные концентрированные (до 5 %) растворы ароматических соединений готовили на дистиллированной воде и не стерилизовали.

Среды, методы выделения культур и идентификация изолированных штаммов. В работе использованы разнообразные питательные среды: -полноценные -мясо-пептонный агар (МПА), бульон Хоттингера (МПБ), бульон LB (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984, Миллер, 1976); - синтетическая минеральная среда М9 (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984, Миллер, 1976); - безазотная синтетическая минеральная среда (CMC) (г/л): Na2HP04 - 6,26; КН2Р04 - 0,9; NaCl - 0,5; рН - 7,6-7,8; - синтетическая минеральная безуглеродная среда (СМС-1) (г/л): Na2HP04 - 6,26; КН2РО4 - 0,9; NaCl -0,5; рН 7,7 + 0,1; синтетическая минеральная безуглеродная среда (СМС-2) (г/л): Na2HP04 - 7,01; КН2Р04 - 0,2; КС1 - 0,5; рН 8,2±0,1; - индикаторная среда (г/л): NaHC03 - 0,125-0,13; КН2Р04 - 0,1-0,15; NI^Cl - 0,05-0,07; дрожжевой экстракт - 0,020,01, сточные воды предприятий (мл) - 180,0-200,0; бромтимоловый синий - 0,035-0,04; рН 7,0±0,2 (А. с. №1306112 СССР);

При работе с ауксотрофными микроорганизмами синтетические минеральные среды дополняли витаминами до конечной концентрации 0,001 г/л и аминокислотами -до 0,02-0,04 г/л (в зависимости от формы используемой аминокислоты) (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984, Миллер, 1976). В качестве необходимых добавок в соответствующих экспериментах применяли дрожжевой экстракт, триптон, гидролизат казеина фирмы "Difco".

Для получения больших количеств биомассы штаммов-деструкторов, обладающей специфической активностью, культуры выращивали или на полноценной питательной среде (МПБ) или на соответствующей синтетической минеральной среде с добавлением 0,1-0,5 г/л ароматического соединения в качестве субстрата-индуктора. В случае нитрофенолов культивирование штаммов-деструкторов проводили на

указанных выше средах М9, СМС-1 и СМС-2 с добавлением 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 0,1 г/л соответствующего нитрофенола в качестве индуктора.

Культуры штаммов-деструкторов различных фенольных производных изолировали стандартными методами - путем прямого высева или методом накопительных культур (Бабьева, Зенова, 1989, Добровольская, Скворцова, Лысак, 1989, Методы ..., 1991).

При использовании метода прямого высева почвенную суспензию, сточные воды и взвешенный активный ил высевали методом серийных разведений на плотную селективную среду - агаризованную среду М9, содержавшую в качестве единственного источника углерода тот или иной ароматический субстрат в концентрации 0,1-0,5 г/л.

Оценку деструктивной активности выделенных таким путем штаммов проводили после пересева в жидкую среду культивирования по динамике изменения содержания в ней ароматического субстрата.

Селекцию проводили путем многократных пассажей биомассы выделенных культур через плотные и жидкие среды М9, содержащие постепенно повышающиеся концентрации субстрата вплоть до достижения максимальной, при которой гибель клеток наступала раньше, чем происходило разложение субстрата.

Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании изучения совокупности морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков общепринятыми бактериологическими методами (Шендеров, Серкова, 1980; Смайберт, Криг, 1984, Вегду'в ..., 1974, 1994; Непёле, 8Ье\уап, 1979; 81атег, РаНегош, Оои<1огой; 1966).

Патогенность выделенных штаммов определяли в острых опытах путем внутрибрюшинного заражения беспородных белых мышей массой 18-20 г взвесью суточной культуры (1 млрд. клеток/мл), 0,5 мл на животное. Наблюдение проводили в течение 10 суток, после чего животных забивали и делали высевы из крови и отпечатки внутренних органов на мясо-пептонный агар (МПА).

Динамику развития микробной популяции штаммов-деструкторов ароматических соединений (прирост биомассы, рост микроорганизмов) изучали по изменению оптической плотности культуральной жидкости при 540-600 нм с периодическим контролем метс?дом высева серийных разведений ее на чашки с мясо-пептонным агаром и последующим подсчетом числа выросших колоний (КОЕ). Количество клеток определяли по предварительно построенной калибровочной кривой, выражающей соотношение их количества с оптической плотностью взвеси бактерий, определяемой на спектрофотометре при соответствующей длине волны - 540-600 нм, в зависимости от эксперимента. Начальная (исходная) концентрация клеток (посевная доза) во всех экспериментах, кроме особо оговоренных в ряде исследований, составляла 1-10 млн. (106-107) клеток/мл.

При изучении способности селекционированных штаммов использовать нитрофенолы и влияния на этот процесс различных условий культивирования применяли различные среды:

- 2,4,6-тринитрофенола - на среде М9 без добавления хлорида аммония;

- 2,4-динитрофенола, м- и о-нитрофенолов на синтетической минеральной безуглеродной среде (СМС-1);

- п-нитрофенола на синтетической минеральной безуглеродной среде (СМС-2);

или на той же среде, что и при выделении, но при рН 6,0-8,5.

Для изучения деструктивной активности остальных штаммов по отношению к фенолу и его производным использовали среду М9 с соответствующим ароматическим соединением в качестве источника углерода или проба подготовленных сточных вод (рН 7,0 ±0,2).

Все эксперименты, кроме указанных отдельно, проводили при температуре культивирования 28-30°С.

Периодическое культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 0,250,3 л, содержавших 0,1 мл среды, в термостате (в условиях ограниченной аэрации) или при перемешивании на круговой качалке - 130-170 об/мин (в условиях усиленной аэрации).

При изучении процесса разложения ароматических соединений в лабораторных моделях биореакторов оригинальной конструкции (собственного производства) аэрацию осуществляли с помощью микрокомпрессора АЭН-3. При переходе к режиму непрерывного культивирования подачу сред и растворов с заданной скоростью осуществляли перистальтическим насосом.

Определение влияния рН среды на процесс утилизации нитрофенолов проводили в колбах Эрленмейера объемом 0,25 л, содержащих 0,1 л 0,05М Ыа-К-фосфатного буфера с различными значениями рН и 0,2 г/л соответствующего нитрофенола. Все эксперименты проводили в условиях ограниченной аэрации при 30° С. Время наблюдения составляло 72 часа.

Изучение процессов разложения ароматических субстратов выделенными штаммами проводили следующим образом.

Количественно процесс биодеградации изучали по изменению концентрации субстрата в среде культивирования, освобожденной от клеток центрифугированием (11000 g, 30 мин, +10° С). Концентрации субстрата в среде культивирования определяли спектрофотометрически по изменению пика оптической плотности в УФ-спектре в диапазоне длин волн 200-500 нм (Авдеенко, 1962) с использованием спектрофотометров СФ-26, "Бресок! иУ-У18" (ГДР), Бресогс! М-40 (Германия) и выражались следующими величинами - 270 нм (фенол), 354 нм (2,4,6-тринитрофенол), 362 нм (2,4-динитрофенол), 400 нм (п-нитрофенол), 415 нм (о-нитрофенол), 256 нм (м-нитрофенол). В пределах использованных нами концентраций зависимость оптической плотности раствора от содержания исследуемых ароматических соединений имеет линейный характер.

Для количественной оценки концентрации субстрата в среде культивирования использовался также и метод газовой хроматографии на хроматографе Цвет-3700: колонки 3x2000 мм с 5 % БЕ-ЗО на инергон-супер (0,16-0,20 мм) в режиме программированного изменения температуры (исходная температура колонки 50° С конечная 150° С, скорость изменения 12 град/мин). В качестве газа-носителя использовался гелий. Помимо газовой проводили высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с использованием хроматографа Милихром-4 (СССР): колонка 64x2 мм, неподвижная фаза - сепарон С-18, элюент - 30 %-ный ацетонитрил в дистиллированной воде, детектор фотометрический (220 нм и 246 нм).

Концентрацию фенола определяли также с помощью колориметрической реакции с 4-аминоантипирином (Коренман, 1975).

Концентрацию гидропероксид изопропилбензола (гипериза) определяли йодометрически по методике Б.Д. Кружалова, Б.И. Голованенко (1963).

Изучение биохимических путей разложения ароматических соединений проводили качественным (на целых покоящихся клетках) и количественным (на целых покоящихся клетках и бесклеточных экстрактах) методами.

Клетки соответствующих штаммов выращивали в жидкой среде М9 с исследуемым субстратом в оптимальной концентрации до середины логарифмической фазы развития, отделяли центрифугированием при 11 000g и трижды отмывали 0,5 М фосфатным буфером (pH 7,0). Отмытые клетки использовали в качестве инокулята при плотности засева 106 клеток/мл.

Для получения бесклеточных экстрактов исследуемых штаммов суточные культуры бактерий, выращенных на синтетической минеральной среде с соответствующим субстратом в оптимальной концентрации в условиях аэрации, осаждали центрифугированием, затем ресуспендировали и подвергали разрушению ультразвуком на аппарате УЗДН-1 (Карасевич, 19756; Карасевич и др., 1976) или на ультразвуковом дезинтеграторе UD-11 (Польша) в режиме хЗ троекратно по 30 сек при 0'С. Полученную суспензию центрифугировали 30 мин при 30 000 g и надосадочную жидкость использовали в ферментных системах.

Предварительное изучение пути расщепления ароматического кольца проводили качественным методом (Ottow, Zolg, 1974).

Определение активности ферментов, участвующих в разложении фенола, идентификацию метаболитов проводили спектрофотометрически после 24-х часового культивирования бактерий на синтетической минеральной среде М9, содержащей 0,5 г/л фенола.

Об активности пирокатехин- 1,2-оксигеиазы судили по изменению оптической плотности (максимума поглощения) при 260 нм, то есть превращения пирокатехина в цис.цис-муконовую кислоту через орто-путь (Neujahr, Varga, 1970).

Активность пирокатехин-2,3-оксигеназы, катализирующей окисление пирокатехина по мета-пути расщепления ароматических соединений, определяли по накоплению 2-гидроксимуконового полуальдегида с пиком оптической плотности при 375 нм (Feist, Hegeman, 1969 а).

Единицей ферментативной активности считали количество фермента, необходимого для превращения 1 микромоля субстрата в продукт в 1 мин. при исследуемых условиях.

Содержание 3-кетоадипиновой кислоты определяли реакцией Ротера с нитропруссидом натрия (Stanier, Ornston, 1973).

Определение аммиака в культуральной жидкости осуществляли фотоколориметрическим методом с помощью реактива Несслера, а нитритов по реакции с сульфаниловой кислотой и а-нафтиламином (Лурье, 1984).

Определение белка в грубых клеточных экстрактах осуществляли биуретовым методом (Кочетов, 1980), в бесклеточных экстрактах - методом Lowry et al. (1951).

Возможное накопление интермедиатов при культивировании всех штаммов определяли не только спектрофотометрически, но и методом тонкослойной хроматографии.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах силуфол (Silufol) UF-254 (Чехия). Экстракцию из культуральной жидкости, освобожденной от клеток центрифугированием (11 000 g, 10°С, 15 мин), осуществляли путем добавления к 10 мл ее равного объема диэтилового эфира (после подкисления пробы до pH 2,0). Экстракцию проводили трижды, эфирные слои объединяли, высушивали безводным

сульфатом натрия и упаривали до 100-200 мкл. Хроматографию проводили в следующих системах: хлороформ (40) : этилацетат (1) или хлороформ (10): уксусная кислота (1) или хлороформ (12) : этилацетат (1) : диэтиловый эфир (0,5) : гексан (12). Идентификацию компонентов проводили по величине Rf, характеру поглощения пятнами УФ-лучей и характеру УФ-спектров после элюирования пятен средой М9.

Окрашивание на фенолы осуществляли диазотированной сульфаниловой кислотой по методу Брея.

Определение токсичности неидентифицированных интермедиатов, образующихся в процессе разложения диметилфенилкарбинола штаммом P.putida GFS-106 или ацетофенона штаммом P.putida GFS-8, проводили на тест-культурах из созданной коллекции. Интенсивность роста тест-микроорганизмов оценивали через 72 часа культивирования при 30° С спектрофотометрически при 560-600нм.

Изучение природы детерминирования признака утилизации ароматических соединений у выделенных штаммов-деструкторов

Стабильность признака утилизации ароматических соединений у исходных и рекомбинантных культур определяли в неселективных условиях (спонтанная элиминация) и под действием элиминирующих агентов додецилсульфата натрия (SDS), акридинового оранжевого, митомицина С (индуцированная элиминация). Частоту элиминации определяли как отношение клонов, утративших изучаемый признак, к общему числу исследованных клонов (Миллер, 1976; Chakrabarty, 1972,1980).

Трансмиссивность признака биодеградации исследовали по стандартной методике (Chakrabarty, 1972,1980).

Частота конъюгации определялась отношением числа рекомбинантных клонов к числу донорских клеток, взятых в опыт.

После 4-5 пересевов на селективной среде отбирали стабильные рекомбинантные культуры, которые и использовали в дальнейшей работе.

Реципиентами в опытах конъюгации и трансформации служили следующие штаммы: P.putida АС340 Trp St/, E.coli j53 Met Pro St/ Rif, E.coli C600 Thr Leu thi St/, E.coli j62 col В Trp His Pro St/

С целью определения ауксограммы трансконъюгантов, последние рассевали на твердой минеральной среде М9, содержащей фенол, какое-либо другое ароматическое соединение или глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии и аминокислоты в различных комбинациях.

Выделение плазмидной ДНК из штаммов-деструкторов проводили по стандартным методикам (Кроса, Фалкоу, 1984; Bimboim, Doly, 1979; Currier, Nester, 1976), а выявляли ее методом электрофореза в трис-боратном буфере в горизонтальном 0,7 %-ном агарозном геле (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984; Hansen, Olsen, 1978; Kado, Liu, 1981).

Молекулярную массу плазмидной ДНК определяли по формуле линейного многочлена Лагранта и путем сравнения их электрофоретической подвижности с подвижностью плазмидной ДНК известной молекулярной массы. В качестве таких эталонов использовали плазмиды RGK (26Мд), RP4 (ЗбМд), R386 (78Мд), Rts-1 (120Мд).

Молекулярную массу плазмиды pKS, детерминирующей деградацию фенола, определяли с помощью электронного микроскопа "Philips" при увеличении от 4600 до 6000 (Davis, Simon, Davidson, 1971). В качестве маркера использовали репликативную форму фага М13мр8 с молекулярной массой 7,2 тысяч пар оснований (4,6 Мд).

Плазмидную ДНК предварительно центрифугировали в градиенте хлористого цезия в течение 40 часов при 36000 об/мин на центрифуге К-32 (ГДР) (средняя удельная плотность раствора хлористого цезия составляла 1,5).

Трансформирующую активность плазмидной ДНК изучали в опытах с компетентными клетками E.coli С600 Thr Leu thi Str1, E.coli K802 met Str'. Контролем служила ДНК эталонной плазмиды pBR325, выделенная из штамма кишечной палочки. Частоту трансформации определяли отношением числа полученных трансформантов на единицу массы плазмидной ДНК (мкг), взятой в опыт (Гнедой и др., 1977).

Методы иммобилизации, изучение биологической активности иммобилизованных штаммов-деструкторов ароматических соединений.

Иммобилизацию микроорганизмов-деструкторов ароматических соединений методами включения в гранулы геля полиакриламида, альгината кальция, каппа-каррагенана проводили по известным методикам (Кирстен, Кафлен, 1988), в гранулы агар-агара и фурцелларана по оригинальным методикам, разработанными нами (A.c. №1705345 СССР и A.c. №1742330 СССР, соответственно).

Механическую прочность получаемых гранУл определяли величиной массы груза, необходимого для деформации одной гранулы (Бартенев, Зеленев, 1979).

Скорость диффузии ароматических соединений в агар определяли следующим образом. В пластинке 2 %-ного агара делали лунку, в которую помещали раствор изучаемого соединения (0,5 г/л). Скорость диффузии измеряли растоянием перемещения фронта вещества за 1 час.

Физико-химическое взаимодействие агара с моноароматическими соединениями изучали следующим образом. 100 г агаровых гранул смешивали со 0,1 л жидкой среды М9, содержащей 0,5 г/л субстрата (фенола, диметилфенилкарбинола, ацетофеиона, гидропероксида изопропилбензола (гипериза), п-нитрофенола или 2,4-динитрофенола). Через 24 часа измеряли объем жидкости и агара, а также концентрацию ароматических соединений в жидкой фазе и производили расчет их содержания в жидкости и агаре. Агар затем отделяли от жидкости фильтрованием и помещали в 0,1 л чистой свежей среды М9 на 2-8 часов до стабилизации концентрации субстрата в жидкости.

При изучении деструктивной активности иммобилизованных включением в гель микробных клрток при периодическом культивировании в колбах Эрленмейера объемом 0,25-0,3 л объем частиц носителя составлял 10 г на 0,1 л среды (соотношение биокатализатор: объем использованной среды 1:10 оказалось оптимальным).

Для определения возможности сохранения деструктивной. активности иммобилизованных включением в гель микробных клеток после длительного хранения использовали высушенные частицы. Высушивание биокатализатора проводили до постоянного веса при комнатной температуре. Высушенный биокатализатор запаивали в полиэтиленовые пакеты по 100-300 г и хранили в холодильнике при 4-10° С или при комнатной температуре.

Определение числа жизнеспособных клеток в гранулах биокатализатора осуществляли методом высева из серийных разведений суспензии, полученной растиранием нативного или регидратированного высушенного биокатализатора в стерильной сгупке с равным объемом физиологического раствора, на чашки с полноценной питательной средой (МПА), а для определения их деструктивной активности - на минеральную среду М9, содержащую соответствующее ароматическое соединение в качестве единственного источника углерода.

При использовании в качестве биокатализатора иммобилизованных адсорбцией клеток штаммов-деструкторов в качестве волокнистых носителей применяли синтетические волокна капрона и жгуты нитрона. Последние были более технологичны, поскольку не требуют предварительного прядения, а, кроме того, достаточно доступны (их производство осуществляется на Саратовском ПО "Нитрон").

Для закрепления микроорганизмов на поверхности волокнистого носителя (обрастания волокон носителя биомассой) 2-3 г стерильного носителя помещали в колбу с суспензией исследуемой культуры-деструктора (1,5-2,0 П560) или ассоциации изучаемых штаммов в соотношении 1:1.

Изучение возможности полупромышленного накопления биомассы штаммов-деструкторов ароматических соединений проводили на модели штамма-деструктора фенола A.faecalis KSV21 при периодическом культивировании следующим образом.

Для определения максимально возможного накопления биомассы этого штамма культивирование проводили при 30° С на полноценной питательной среде (МПБ) в лабораторном ферментере с рабочим объемом 3 л (объем среды - 2 л, скорость подачи воздуха - 2 л/мин, скорость перемешивания - 600 об/мин).

При изучении возможности накопления биомассы штамма A.faecalis KSV21, обладающей специфической деструктивной активностью, культивирование проводили при 30° С на синтетической минеральной среде М9, содержащей фенол (хч) в концентрации 0,5 - 0,77 г/л в качестве единственного источника углерода и энергии, в условиях усиленной аэрации в ферментерах МФ-114 и МА-114 (New Brunswik, США) (ВНИИгенетика, г.Москва). Рабочий объем каждого ферментера составлял 14 л, а начальный объем среды культивирования в них - 6 л.

После достижения микробной популяцией стационарной фазы развития биомассу отделяли от культуральной жидкости на сепараторе, вес сырой биомассы определяли взвешиванием.

Возможность приготовления бактериальных препаратов для биоремедиации объектов окружающей среды была изучена на модели того же штамма-деструктора A.faecalis KSV21. В качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов использовали частицы торфа (стерильные торфяные пакеты но 500-1000 г производства Несвижского биохимического завода).

Изучение специфической биологической активности штаммов-деструкторов ароматических соединений в сточных водах.

Изучение деструктивной активности клеток изолированных штаммов в нативных (исходных) и подготовленных пробах сточных вод проводили как при периодическом режиме культивирования в колбах аналогично методу, описанному выше, так и в лабораторной установке (биореакторе) (при периодическом или проточном режиме культивирования), как в свободном, так и в иммобилизованном различными методами состоянии.

Химическое (ХПК) и биологическое (БПК5) потребление кислорода сточными водами определяли общепринятыми методами (Емельянова, 1976, Лурье, 1984, Лобачева, Вишняков, 1975).

Содержание фенола и других компонентов в исследуемых пробах сточных вод различных предприятий определяли спектрофотометрически по изменению пика оптической плотности в УФ-спектре в диапазоне длин волн 200-500 нм и методами газовой хроматографии (Вредные вещества ..., 1976, Лурье, Рыбникова, 1974).

В случае необходимости рН сточных вод доводили до нейтральных значений рН (7,0 ± 0,2) 0,1 н. растворами едкого натра или соляной кислоты. Температура культивирования - 30° С.

Изучение длительности сохранения фенолутилизирующих культур бактерий в сточных водах Саратовского биохимического завода проводили по следующей методике.

Стандартные поролоновые диски диаметром 60 мм и высотой 15 мм, пропитанные 16-18 часовой культурой штамма-деструктора (108 микробных клеток/диск), промывали водопроводной водой и помещали в сточные воды основного коллектора Саратовского биохимического завода.

Количество жизнеспособных клеток бактерий-деструкторов - исходное и на различных этапах эксперимента (10 и 20 день), определяли следующим образом. Диски извлекали из сточных вод, тщательно отжимали, полученную жидкость и ее 10 кратные серийные разведения высевали на синтетическую минеральную среду- М9, содержащую 0,5 г/л фенола в качестве единственного источника углерода и энергии.

Общее микробное число сточных вод определяли методом серийных разведений проб и последующего высева 0,05-0,1 мл их на полноценные твердые питательные среды (ЬВ-среда, содержащая 2 500000 Ед/мл нистатина).

Предподготовка сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом (Саратовского производственного объединения "Нитрон", Уфимского и Самарского заводов синтетического спирта) к микробной очистке включала: удаление грубых взвешенных частиц, нейтрализацию рН, разбавление средой М9, дехлорированной водопроводной водой или сточными водами других цехов, а также оригинальную физико-химическую обработку, направленную на каталитическое разложение гипериза с образованием диметилфенилкарбинола с примесями фенола, ацетофенона и бензоатов. Последняя была разработана с нашим участием коллективом аналитической лаборатории Саратовского филиала ВНИИгенетика (к.х.н. А.П.Гуменюк) (Патент №2 048454 РФ, Рео<1огоу, КоггЬепешсЬ, Мпопоу е! а!., 1992).

Для изучения способности штаммов-деструкторов ароматических соединений из созданной нами коллекции разрушать компоненты фенольных сточных вод использовали лабораторную установку (биореактор) оригинальной конструкции.

Биореактор представлял собой систему из З-х-4-х соединенных последовательно стеклянных колонок высотой 450 мм, с внутренним диаметром 25 мм и рабочим объемом около 0,22 л каждая.

Аэрацию сред культивирования, включая сточные воды, осуществляли с помощью микрокомпрессора АЭН-3. Воздух подавали снизу отдельно в каждую колонку со скоростью 0,2-0,15 л/мин (примерно 1:1 об/об).

Все эксперименты по изучению возможности микробной обработки фенольных сточных вод иммобилизованными клетками штаммов нашей коллекции проводили при температуре 30° С в периодическом или проточном режиме культивирования.

Скорость разбавления определяли стандартным биотехнологическим методом как отношение скорости потока жидкости, поступающей в биореактор, к общему объему реактора.

Для изучения специфической активности селекционированных штаммов-деструкторов нитрофенолов при периодическом культивировании использовали пробы сточных вод производства инсектицида метафоса (аналог паратиона) (рН 7,0, основной компонент - п-нитрофенол в концентрации до 8,5 г/л, ХПК до 9 г/л) или производства

хлорнитробензола (рН 1,6-2,0, общее содержание 2,4-динитро- и 2,4,6-тринитрофенола до 0,3 г/л). Предподготовка проб этих сточных вод состояла в доведении рН до 7,5-8,0 и разведении их дехлорированной водопроводной водой до необходимого содержания в среде нитрофенолов.

Изучение активности иммобилизованных клеток этих же штаммов-деструкторов нитрофенолов в пробах сточных вод при периодическом и проточном культивировании проводили в лабораторных биореакторах, противоточного типа с погружным носителем.

Иммобилизация клеток штаммов-деструкторов нитрофенолов (общее количество 1 млн. клеток/мл, соотношение штаммов 1:1) осуществлялась путем обрастания синтетических волокон при периодическом культивировании в синтетической минеральной среде СМС-2, содержащей 0,2-0,4 г/л соответствующего нитрофенола в качестве единственного источника углерода и азота.

Микробная очистка фенольных сточных вод процесса термической переработки сланцев.

Методы микробной очистки фенольных сточных вод, образующихся в процессе термической переработки сланцев, несмотря на возможное повторение с вышеизложенными, мы сочли возможным изложить отдельно, поскольку они имеют определенное своеобразие.

В данных исследованиях были использованы грамотрицательные аэробные непатогенные бактерии из созданной нами коллекции, способные утилизировать фенол и его производные в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации до 1 г/л, и их ассоциация.

Суточную культуру соответствующих штаммов вносили в среду культивирования в виде взвеси микроорганизмов в физиологическом растворе.

При изучении тех или иных ассоциаций бактерий биомассу всех используемых штаммов смешивали в равных количествах.

Наращивание биомассы селекционированных штаммов для получения ее максимального выхода проводили на жидкой полноценной питательной среде (мясо-пептонный бульон). Получение биомассы с меньшим выходом, но с более высокой специфической фенолутилизирующей активностью проводили путем культивирования каждого штамма на синтетической минеральной среде М9, содержащей фенол в качестве единственного источника углерода (0,5 г/л). Биомассу от среды культивирования в обоих случаях отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.

Культивирование проводили при температуре 26-30°С.

Концентрацию фенола в сточной воде определяли стандартным методом с 4-аминоантипирином (чувствительность метода - 0,01 мг/л) (Жиряков и др., 1989).

Для освобождения от взвешенных частиц все образцы сточных вод процесса термической переработки сланцев предварительно центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин..

При необходимости сточные воды разводили в соотношении 1:1 стандартной синтетической минеральной средой М9 или дехлорированной водопроводной водой с добавлением аммония хлорида (0,5-1,0 г/л) и/или фосфата калия однозамещенный (0,5-1,0 г/л).

Для анализа эффективности процессов деградации фенола во всех опытах в качестве контроля использовались среды аналогичного состава, не содержащие микроорганизмы.

При изучении процессов биодеградации фенола, как свободными, так и иммобилизованными клетками культивирование проводили в условиях усиленной аэрации (на круговой качалке - 100-160 об/мин).

При анализе процесса утилизации фенола иммобилизованными клетками в условиях периодического культивирования в колбах на круговой качалке использовали навеску 10 г носителя на 0,1 л среды. В качестве контроля служили свободные клетки этих же штаммов или стерильный носитель в тех же условиях культивирования.

В качестве инертных носителей для иммобилизации микроорганизмов методом адсорбции были использованы сланцевый кокс, полукокс, сланец, сланцевая плитка (15%, 90x42x24 мм), керамзит (8x16 мм).

Сравнение деструктивной активности иммобилизованных на керамзите и сланцевой плитке клеток обоих ассоциаций было проведено в сточной воде, разведенной водопроводной водой, с добавлением аммонийного азота и фосфата калия однозамещенного (0,5 г/л) при культивировании на круговой качалке.

В качестве контроля в этих экспериментах изучали фенолутилизирующую активность свободных клеток тех же ассоциаций и адсорбирующую емкость используемого стерильного носителя.

В качестве лабораторного биореактора для очистки сточных вод процесса термической переработки сланцев использовали лабораторную установку (объем 0,32 л) с погружной насадкой противоточного типа (реактор с неподвижным слоем). Объем подаваемого воздуха в единицу времени был равен общему объему биореактора.

Отработку основных параметров процесса биологической очистки сточных вод процесса термической переработки сланцев проводили, варьируя состав исходной среды (степень разбавления проб, введение дополнительного источника фосфора, азота) и скорость ее подачи в лабораторную установку (0,165 ~ 0,26 л/сутки). При этом для расчета скорости разбавления свободный объем использованного биореактора составлял 0,14 л (40 % от общего).

Критерием для замены исходной среды культивирования на новую служила концентрация фенола в выходящей пробе сточных вод при данных параметрах процесса очистки.

В эксперименте с ингибированием процесса фенолутилизации токсичной пробой сточных вод рекультивацию иммобилизованных клеток осуществляли путем периодического, а затем проточного культивирования в синтетической минеральной среде М9, содержащей фенол в качестве единственного источника углерода (0,5 г/л).

Некоторые детали использованных методик приводятся в соответствующих разделах работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нами были разработаны принципы поиска и выделения штаммов-деструкторов ароматических соединений - компонентов фенольных сточных вод.

В число соединений, в отношении которых велся поиск бактериальных штаммов-деструкторов помимо фенола, бензойной кислоты и их окси-, хлор-, нитро-производных были включены и соединения, образующиеся в ходе технологического

процесса производства фенола (Кружалов, Голованенко, 1963) - гидроперекись изопропилбензола (гипериз), диметилфенилкарбинол, ацетофенон, а-метилстирол.

Поиск штаммов, обладающих специфической деструктивной активностью по отношению к интересующим нас ароматическим соединениям, проводился среди микроорганизмов — представителей биоценозов различных объектов окружающей среды. Это были как не подвергавшиеся интенсивному антропогенному воздействию (почвы лесов, лугов, лесостепей) (35 проб), так и в большей или меньшей степени химически загрязненные объекты. Последние расценивались как предположительно потенциально обогащенные соответствующими микроорганизмами-деструкторами в результате происходящих процессов самоочищения.

Использовали отбираемые в теплое время года в течение 5-7 лет пробы почв различных типов (118 проб), в том числе с территории химических предприятий различного профиля, производящих и/или использующих в производстве ароматические соединения (80 проб), и с полей, обработанных инсектицидами или 1 гербицидами различных групп (метафос, производные феноксиуксусных кислот)

(38 проб), пробы сточных вод (46 проб), активного ила очистных сооружений (16 проб) этих же предприятий, загрязненные природные воды (5 проб), вода прудов-• накопителей очистных сооружений ПО "Нитрон" (г.Саратоа) и ПО "Химпром" (г.Волгоград) (7 проб).

Выделение штаммов-деструкторов из биоценозов изучаемых объектов вели методом накопительных культур (Карасевич, 1982, Шлегель, 1987) и методом прямого высева из исследуемых объектов окружающей среды на агаризованную синтетическую минеральную среду, содержащую то или иное ароматическое соединение в качестве единственного источника углерода и энергии, т.е. на среду, работающую по принципу элективной (Бабьева, Зенова, 1989, Stieber et al., 1994), или на специальную индикаторную среду, работающую по принципу дифференциально-диагностической (Bochner, Savageau, 1977, Loos, 1975, Ralston, Vela, 1974).

Критериями для отбора наиболее активных штаммов-деструкторов служили интенсивность роста на синтетических минеральных средах, содержащих фенол или другие ароматические соединения в качестве единственного источника углерода, и/или изменение цвета индикаторной среды.

В ходе проведения исследований по поиску и селекции штаммов-деструкторов фенола и его производных нами была разработана и использована индикаторная среда (А. с. 1 306112 СССР) для отбора таких культур. Содержание в ней стерильного фильтрата сточных вод различных производств, делает предлагаемую среду более удобной для экспресс-выделения культур микроорганизмов, способных утилизировать фенол и другие ароматические соединения, методом прямого высева из проб фенольных сточных вод любого происхождения. Помимо этого использование разработанной индикаторной среды одновременно позволяет не только судить об ' истинной распространенности таких микроорганизмов в окружающей среде, но и

может существенно дополнить селекционные методы, т.к. позволяет целенаправленно отбирать колонии микроорганизмов, активно использующих высокие концентрации ароматического субстрата, вопреки его действию как селективного фактора. Аналогичный принцип был положен в основу среды, разработанной позднее немецкими учеными для быстрого обнаружения и дифференциации псевдомонад, по их способности использовать субстраты с различными физико-химическими свойствами (Schopp, Toaspem, Tauchert, 1985).

Всего указанными методами были выделены чистые культуры 1514 штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, отличающихся друг от друга морфологией колоний, и способных к росту на соответствующей индикаторной среде и/или на синтетических минеральных средах, содержащих какое-либо из изучаемых ароматических соединений в качестве единственного источника углерода (0,1 г/л).

Таблица

Распространенность штаммов-деструкторов ароматических соединений в

исследованных объектах окружающей среды.

Кол-во Общее число Число штаммов- Частота

Изучаемый объект проб выделенных деструкторов встречаемости

штаммов бактерий ароматических соединений (0,1 г/л) (%)

Почвы обрабатывае- 38 360 48 13,33

мых полей

Почвы промышленных предприятий 80 402 81 20,15

Активный ил 16 68 1 1,47

Вода из прудов-накопителей, 12 28 3 10,71

загрязненные

природные воды

Сточные воды 46 136 20 14,7

Итого 192 994 153 15,39

Почвы лесов и лугов 35 520 19 3,65

Всего 227 1514 172 11,36

Среди них по широте спектра утилизируемых соединений, длительности сохранения специфической активности при пассировании через среды, содержащие субстраты на уровне или немного выше исходной концентрации (0,1 - 0,5 г/л), нами было отобрано 119 штаммов (69,18% исходного количества) аэробных грамотрицательных и грамположительных бактерий. При этом штаммов-деструкторов таких высокотоксичных соединений как хлорбензол, гидропероксид изопропилбензола (гипериз) нам выделить не удалось.

На основании определения стандартными бактериологическими методами комплекса морфолого-культуральных, тинкториальных и физиолого-биохимических свойств (Добровольская, Скворцова. Лысак, 1989, тендеров, Серкова, 1980, Bergey's ..., 1974, 1994, Смайберт, Криг, 1984) большинство культур микроорганизмов, входящих в созданную коллекцию были идентифицированы до рода, а наиболее активные и до вида (по возможности).

По итогам проведенной идентификации установлено, что большая часть созданной коллекции - 93 штамма (78,81%) представлена грамотрицательными бактерииями, относящимися к родам Pseudomonas (49 штаммов - 41,52%), Alcaligenes (30 штаммов - 25,42%), Acinetobacter (9 штаммов - 7,63%), Klebsiella (5 штаммов -4,23%). Из грамположительных - чаще род Corynebacterium (7 штаммов - 5,93%).

Полученные результаты свидетельствуют, что, несмотря на преимущественное положение псевдомонад среди культур-деструкторов, изолированных нами из

различных объектов окружающей среды, таксономический спектр бактерий, способных к утилизации фенола и его производных достаточно широк, и нельзя принижать роль представителей родов Ака^епез, АЫпеШЬас'.ег и СогупеЪаШпит.

При дальнейшем изучении деструктивной активности отобранных 119 штаммов было установлено, что некоторые из них способны к росту на более высоких концентрациях ароматических субстратов - до 1,0 г/л по отдельным соединениям (диметилфенилкарбинол, фенол, бензойная кислота и их наиболее простые производные). Это позволило отобрать из созданной коллекции 25 наиболее активных штаммов-деструкторов. Остальные неиспользованные в дальнейших исследованиях чистые культуры штаммов-деструкторов всех соединений были нами сохранены для возможного последующего применения, поскольку не исключено, что они обладают способностью более активно разрушать какие-либо другие соединения близкие по химической структуре тем, на которых они были выделены. Кроме того, эти бактерии в случае необходимости могут быть использованы как банк специфической генетической информации.

Из 25 селекционированных бактериальных штаммов, входящих в созданную коллекцию, по интенсивности роста и скорости утилизации субстрата было отобрано 10 наиболее активных. После определения и характеристики их деструктивной активности по основному субстрату, спектра утилизируемых ими ароматических соединений, а также вирулентности (при внутрибрюшинном заражении белых мышей массой 18-20 г ЛДэд составила более 1 млрд. микробных тел, т.е. они оказались невирулентными) эти штаммы были депонированы во Всесоюзной (ныне Всероссийской) коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва) в качестве деструкторов соответствующих соединений.

При изучении генетических аспектов утилизации ароматических соединений выделенными штаммами-деструкторами было установлено следующее.

В штамме А^аесаШ КЗV?. 1 (В-2841) - деструкторе фенола, нами обнаружена и описана новая трансмиссивная плазмида биодеградации, обозначенная рКБ, с молекулярной массой 43,3 Мд (65 тысяч пар оснований). Она детерминирует синтез ферментов разложения фенола по орто-пути расщепления ароматических соединений и несет гены термотолерантности (рост при 42° С). Покачано, что при совместном культивировании признак утилизации фенола передается в эталонные бесплазмидные штаммы кишечной палочки и псевдомонад, причем в последние вместе с признаком термотолерантности - способности к росту при температуре 41-42° С, не характерной для этого вида бактерий (рекомбинантный штамм Р.риМа АС340 рК8 Р11е+ Тгр+ Т420+ депонирован в ВКПМ - В-2840).

В штамме Р.риМа ОРБ-8 (В-5248) - деструкторе фенола и ацетофенона, нами обнаружена и описана новая трансмиссивная плазмида биодеградации, обозначенная р8, с молекулярной массой примерно 80Мд, относящаяся к 1пс Р-1 группе несовместимости. Она детерминирует процесс метаболизма ацетофенона и фенола, но только начальный этап микробной утилизации фенола - гидроксилирование его молекулы, тогда как дальнейшее расщепление пирокатехина по орто-пути расщепления ароматических соединений кодируется, скорее всего, хромосомными генами. При конъюгационном скрещивании детерминируемые плазмидой р8 оба признака (утилизации фенола и ацетофенона) совместно передаются в эталонные бесплазмидные штаммы кишечной палочки и псевдомонад.

Основываясь на внехромосомной природе детерминирования признаков у выделенных штаммов-деструкторов псевдомонад, нами была предпринята попытка конструирования методом совместного культивирования (Kellogg, Chatteijee, Chakrabarty, 1981) мультиплазмидных штаммов, способных осуществлять деградацию основных компонентов сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом (фенол, диметилфенилкарбинол, ацетофенон). Однако полученные трансконъюганты оказались бесперспективны по сравнению с исходными штаммами, поскольку имели более длительную лаг-фазу (14 дней) и очень низкую деструктивную активность по отношению ко всем исследованным субстратам - по диметилфенилкарбинолу (0,25 г/л), ацетофенону (0,25 г/л) и фенолу (0,15 г/л).

Основными лимитирующими факторами, оказывающими влияние на процесс микробного метаболизма любых соединений являются: температура культивирования, степень насыщения среды культивирования кислородом (аэрация среды), рН среды, исходное количество микробных клеток (посевная доза), исходная концентрация органического субстрата (Бейли, Оллис, 1989; Экологическая биотехнология, 1990; Яковлев, Карюхина, 1980). Для фенола и его производных при их микробном метаболизме из-за их токсичности решающее значение имеют исходная концентрация ароматического субстрата и возможность образования в процессе разложения промежуточных продуктов более токсичных для микроорганизмов, чем исходное соединение (Карасевич, 1982; Наумова, 1985).

Помимо этого, одной из важнейших характеристик штаммов при их возможном практическом использовании в процессах очистки сточных вод является спектр их деструктивной активности (субстратная специфичность), то есть способность штаммов утилизировать помимо фенола, как его производные, так и другие природные и неприродные трудноокисляемые соединения различной химической структуры. Круг изучаемых субстратов в наших исследованиях формировался из наиболее экологически значимых ароматических соединений — загрязнителей окружающей среды, а также из вероятных интермедиатов их микробного метаболизма.

При исследовании влияния температуры культивирования на деструктивную активность всех изученных штаммов из созданной нами коллекции независимо от разлагаемого субстрата были получены сходные результаты. Оптимальным оказался диапазон температур 25-30° С. Снижение этого параметра до 20° С, равно как и его повышение до 35-37° С существенно угнетало специфическую активность изученных штаммов (до 20-30 % и 10-20 % от исходного уровня, соответственно). Однако после изменения температуры культивирования и доведения ее до оптимальной уровень деструктивной активности восстанавливался до исходного достаточно быстро (в течение 12-24 часов в зависимости от таксономической принадлежности штамма-деструктора). Исходя из этого, при проведении всех последующих экспериментов по изучению процесса биодеградации фенола и его производных использовали температуру культивирования равную 30 С.

Для всех штаммов, которые являются аэробными или факультативно-анаэробными микроорганизмами, метаболизм ароматических субстратов идет окислительным путем (Карасевич, 1982; Наумова, 1985; Cerniglia, 1981; Gibson, 1971). При изучении штаммов-деструкторов из созданной нами коллекции время полного разложения субстрата значительно сокращалось при культивировании в условиях принудительной (усиленной) аэрации. На примере штамма A.faecalis KSV21 -деструктора фенола, и P.putida GFS-106 - деструктора диметилфенилкарСинола,

установлено, что немаловажную роль играют и методы осуществления принудительной аэрации, обуславливающие различную степень насыщения среды культивирования ра-.творенным кислородом - культивирование на круговой качалке, в ферментере и биореакторе.

Изучение влияния интенсивности аэрации на процессы утилизации нитрофенолов представляло особый интерес, поскольку нитрофеиолы являются хорошо известными разобщителями процессов дыхания и окислительного фосфорилирования (Spain, Wyss, Gibson, 1979), с чем и связано их ингибирующее действие на микробные клетки. Установлено, что деструкция различных нитрофенолов и рост клеток изученных штаммов P.putida БА-11, A.calcoaceticus МН-21, Corynebacterium sp. 0-31, Corynebacterium sp. ПНК-2, Corynebacterium sp. T-2 невозможен даже в мягких анаэробных условиях. Однако интенсивная аэрация существенно ускоряет деструкцию только п-нитрофенола, в то время как скорость утилизации м-нитрофенола, о-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола остается практически одинаковой как в условиях ограниченной, так и интенсивной аэрации.

Помимо концентрации растворенного кислорода в среде (аэрации), другим достаточно важным фактором, определяющим условия существования микроорганизмов в сточных водах, и всегда коррелирующим с их составом является рН. При изучении процессов утилизации ароматических соединений селекционированными нами бактериальными штаммами было установлено, что зависимость микробного метаболизма от рН среды проявилась наиболее выражено в связи с химической природой субстрата. Так, для фенола и большинства его окисленных производных, в том числе бензойной кислоты и ее производных, оптимальным рН среды являлось нейтральное значение - 7,0+0,2 (штаммы A.faecalls KSV21, P.putida GFS-8 - деструкторы фенола, P.pseudoalcaligenes MV-11 - деструктор 2-нитробензойной кислоты, P.putida GFS-106 - деструктор диметилфенилкарбинола).

При микробной деградации нитрофенолов значение рН среды имеет решающее значение, поскольку их токсическое воздействие на бактериальные клетки в значительной степени зависит от соотношения диссоциированных и недиссоциированных молекул этих слабых кислот (Наумова, 1985). Однако выраженной зависимости установленных оптимальных для процессов разложения нитрофенолов изученными штаммами слабощелочных значений рН среды (м-нитрофенол, о-нитрофенол, 2,4-динитрофенол - 7,7 ± 0,1, п-нитрофенол - 8,3 ± 0,1) от химического строения субстрата (положения замес гителей) выявить не удалось.

Все штаммы-деструкторы нитрофенолов нашей коллекции были способны использовать соответствующие субстраты как источники и углерода, и азота. При этом максимальная деструктивная активность проявлялась на безазотистых средах. Исходя из этого, для этих штаммов в ходе проведения экспериментов по оптимизации процесса биодеградации, кроме влияния рН среды, нами было изучено влияние различных источников неорганического азота (аммонийного азота и азота нитратов) на процесс утилизации субстратов.

Показано, что добавление азота нитратов практически не сказывалось ни на утилизации п-нитрофенола штаммом P.putida БА-11, ни м-нитрофенола штаммом A.calcoaceticus МН-21, ни о-нитрофенола штаммом Corynebacterium sp. 0-31, ни 2,4-динитрофенола или 2,4,6-тринитрофенола штаммами Corynebacterium sp. ПНК-2 и Cotynebacterium sp. Т-2, соответственно. В то же время, добавление аммонийного азота

в виде аммония хлорида ингибировало утилизацию п-нитрофенола штаммом Р.риМа БА-11 и м-нитрофенола штаммом А.сакоасеНсих МН-21, но не оказывало влияния на процесс метаболизма 2,4,6-тринитрофенола штаммом СогупеЬааегтт зр. Т-2, а процесс утилизации 2,4-динитрофенола штаммом СогупеЬа&епит яр. ПНК-2 в концентрации 0,2 г/л под влиянием ионов аммония даже несколько ускорялся.

После подбора оптимальных условий проявления деструктивной активности отобранных штаммов нами было проведено изучение их способности к утилизации более высоких концентраций ароматических соединений, максимально разлагаемых в этих условиях, т.е. выявлялись максимальные деструктивные возможности штаммов. С этой целью штаммы при ранее подобранных оптимальных условиях (температура, аэрация, рН среды) культивировали на соответствующих жидких средах с повышающимися концентрациями субстратов. В ходе этих экспериментов концентрацию утилизируемою субстрата удалось повысить - для штаммов А./аесаШ К8У21, Р.а1са1щепеи КО) и Р.ршШа ¿РЭ-в по фенолу с 0,1 до 1,0 г/л. Для последнего, кроме того, по ацетофенону с 0,2 до 1,25 г/л, окиси мезитила - с 0,2 до 1,0 г/л, по а-метилстиролу - с 0,1 до 0,5 г/л. Для штаммов Р.риИйа ОЕБ-Юб и Р.риИ<1а ОР8-93 по диметилфенилкарбинолу с 0,1 до 0,75 г/л. Для штамма Аготопаз тасгосуЩепеэ ОР8-139 по ацетофенону с 0,2 до 0,625 г/л. Для штамма Р.рзеийоака^епез МУ-11 по 2-нитробензойной кислоте с 0,1 до 3,0 г/л, по 4-аминобензойной кислоте с 0,1 до 2,0 г/л, по бензойной и 2-оксибеизойной кислоте - с 0,1 до 0,5 г/л. Для штамма СогупеЬааепит яр. ПНК-2 по 2,4-динитрофенолу с 0,1 до 0,6 г/л, по 2,4,6-тринитрофенолу с 0,1 до 0,2 г/л. Для штаммов Р.риНйа БА-11 и Р.риНйа С-11 по п-нитрофенолу с 0,1 до 0,8 г/л.

Именно по этому критерию все указанные штаммы как активные деструкторы соответствующих соединений были депонированы в ВКПМ. В то же время среди остальных представителей созданной нами коллекции также удалось селекционировать штаммы с достаточно высокой деструктивной активностью. Например, в отличие от депонированного штамма СогупеЬааепит хр. ПНК-2 утилизирующего 0,2 г/л 2,4,6-тринитрофенола за 18 суток на 60%, изолированный и селекционированный позднее штамм СогупеЬааепит вр. Т-2 оказался способен разрушать это соединение в более высокой, концентрации (0,2-0,4-0,9 г/л) и с гораздо большей интенсивностью (3-5-9 суток, соответственно).

При изучении процесса утилизации ароматического соединения как субстрата всегда необходимо охарактеризовать его пути и учитывать возможность образования в ходе метаболизма интермедиатов или накопления в среде культивирования его конечных продуктов, более токсичных, чем исходное соединение (Карасевич, 1982; Наумова, 1985; Наумов и др., 1999; Н%£Ыот, Janke, М1(1с1е1<к>1р, 8а11ашуа-8а1опеп, 1989; Де^ег, СЬуштеЛ, 1976; БеШипаЛап, УовЫсЬ», 1972).

Нами проведено изучение путей метаболизма фенола и его производных штаммами нашей коллекции.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что у штаммов А/аесаШ К8У21, Р.а1са1щепеБ КОь Р.а1саИ%епе$ ССМ2655, Р.ри1Ша ОРБ-в разложение фенола идет по орто-пути расщепления ароматических соединений (фенол —> пирокатехин —► цис, цис-муконовая кислота —<• 3-кетоадипиновая кислота —► янтарная кислота и ацетил-КоА).

Штамм Р.риН(Ь ОРЙ-Юб процесс микробного метаболизма фенола осуществлял через пирокатехин, но по мета-пути расщепления ароматического кольца (пирокатехин

—» полуальдегид 2-оксимуконовой кислоты —♦ пировиноградная кислота —♦ ацетальдегид), что отличает его от известного штамма-биодеструктора Alcaligenes eutrophus АТСС17697, утилизирующего фенол по мета-пути, но одновременно обладающего и ферментами орто-пути расщепления ароматического кольца, функционирующими только в тех случаях, когда в качестве субстрата используется бензойная кислота (Johnson, Stanier, 1971а, 1971b). Кроме того, даже адаптированные свободные клетки штамма P.putida GFS-106 были способны разрушать фенол в значительно меньшей концентрации (0,2-0,35 г/л), чем другие штаммы, медленнее и не полностью (через 120 часов культивирования остаточные количества фенола составляли 40-50 %). Только иммобилизация клеток этого штамма в агаровые гранулы позволила активизировать процесс утилизации фенола (концентрацию используемого субстрата удалось повысить до 0,5 г/л, а срок его полного разложения сократить до 72 часов, причем 49,4 % от исходного количества - в течение первых 24 часов). Этот эффект можно объяснить тем, что агаровые гранулы, создавая дополнительный полисахаридный слой защищают клетки от ингибирующего токсичного воздействия субстрата, обеспечивая его более медленное поступление внутрь гранул. Кроме того, дополнительный агаровый слой обеспечивает адсорбцию образующихся в процессе разложения метаболитов, что позволяет клеткам избежать их ингибирующего влияния и функционировать в условиях накопления продуктов метаболизма, тормозящих специфическую активность бактерий (Синицин и др., 1994).

Изучение метаболизма другого компонента сточных вод производства фенола ацетоно-кумольным способом - ацетофенона штаммом P.putida GFS-8 показало, что при оптимальных условиях в диапазоне концентраций от 0,125 г/л до 1,25 г/л субстрат используется полностью и накопления промежуточных продуктов не происходит. При этом путь метаболизма ацетофенона (ацетофонон —► фенол —► пирокатехин -> расщепление ароматического кольца по орто- или мета- пути) соответствует ранее описанному в литературе для бактерий рода Arthrobacter, Nocardia (Cripps, 1975; Cripps, Trudgill, Whateley, 1978).

Метаболизм 2-нитробензойной кислоты штаммом P.pseudoalcaligenes MV-11 представляется следующим образом: 2-нитробензойная кислота -» 2-аминобензойная (антраниловая) кислота —> 3-оксиантраниловая кислота —> 3,4-диоксибензойная (протокатеховая) кислота -> цис.цис-муконовая кислота, и не сопровождается накоплением каких-либо интермедиатов. Ключевым интермедиатом утилизации бензойной кислоты этим штаммом также является 3,4-диоксибензойная (протокатеховая) кислота, а дальнейший путь ее разложения аналогичен пути, изложенному выше.

Путь метаболизма п-нитрофенола штаммами P.putida БА-11 (В-6707) и P.putida С-11 (В-6708) отличается от пути его разложения штаммом A.calcoaceticus А-122 лишь на начальном этапе до образования оксигидрохинона. В дальнейшем эти пути совпадают. В соответствии с полученными результатами нам представляется, что деструкция п-нитрофенола, связанная с прямой элиминацией нитрогруппы и образованием гидрохинона, является энергетически более выгодной. Это подтверждается тем, что штаммы P.putida БА-11 и P.putida С-11, разрушающие субстрат по этому пути, могут утилизировать его в более высоких концентрациях, чем штамм A.calcoaceticus А-122, у которого начальный метаболизм п-нитрофенола связан с окислением в 4-нитропирокатехин.

При изучении микробного метаболизма о-нитрофенола (0,2 - 0,9 г/л) штаммом Corynebacterium sp. 0-31 было показано, что он начинается с гидролитической элиминации нитрогруппы (выход нитритов при этом является стехиометрическим и составляет 85 % от возможного), а образующийся пирокатехин утилизируется полностью с разрывом ароматического кольца по орто-пути. Это соответствует единственно возможному по данным литературы пути подготовительного метаболизма о-нитрофенола (Dimkov, Topalova, 1993; Janeczko, Gomolka, 1988; Zeyer, Philip, 1984).

Для штамма Corynebacterium sp. ПНК-2 было показано, что 2,4-динитрофенол (0,2 - 0,6 г/л), метаболизируется по единственно возможному по данным литературы пути - через прямое раскрытие ароматического кольца и образование 4,6-динитрогексановой кислоты, как это было описано для штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 (Lenke et al., 1992). Накопления интермедиатов, включая 4-нитропирокатехин или нитрогидрохинон (соединения, образующиеся при реализации чисто теоретической возможности начала метаболизма 2,4-диниггрофенола с элиминации одной из нитрогрупп) не происходило.

Утилизация 2,4-динитрофенола другим штаммом - Corynebacterium sp. Т-2 осуществлялась аналогичным образом, с той лишь разницей, что при концентрации субстрата 0,6 г/л его полное разрушение происходило за 8 суток.

В отличие от микробного метаболизма п-нитрофеиола и о-нитрофенола, метаболизм 2,4,6-тринитрофенола штаммами Corynebacterium sp. ПНК-2 (В-5439) и Corynebacterium sp. Т-2 начинается с нуклеофильиой атаки ароматического кольца и образования гидрид-Мейзенхеймер комплекса 2,4,6-тринитрофенола с его последующей трансформацией в 2,4-динитрофенол, который обоими штаммами не накапливался, а через окисление в 4,6-динитрогексановую кислоту, полностью утилизировался. Это путь совпадет с описанным Н. Lenke, H.-J. Knackmuss (1992) для штамма Rhodococcus erythropolis HL-PM-1.

Считаем необходимым отметить, что оба выделенных и селекционированных нами штамма, способные разлагать полинитрофенолы, относились к коринебактериям. Примечательно, что ни тот, ни другой не могли использовать как ростовой субстрат мононитрофенолы, что уже было описано ранее для штамма Arthrobacter (Jensen, Lautrup-Larsen, 1967). Это факт убедительно свидетельствует о том, что последние не являются обязательными промежуточными продуктами расщепления полинитрозамещенных фенолов.

Таким образом, наиболее эффективными деструкторами нитрофенолов оказались представители рода Pseudomonas. Это подтверждает данные литературы о быстрой способности бактерий рода Pseudomonas приспосабливаться к изменяющимся условиям среды обитания. Штаммы рода Acinetobacter были менее активны и не способны к деградации высоких концентраций субстратов. Штаммы рода Corynebacterium хотя и были способны утилизировать высокие концентрации соответствующих нитрофенолов, но при этом существенно возрастало время деструкции. Вероятно, это связано с тем, что микроорганизмы этого рода характеризуются относительно высоким временем генерации даже при росте на полноценных средах.

Подводя итог вышесказанному, можно считать доказанным, что разложение практически всех изученных нами ароматических соединений выделенными штаммами-деструкторами, происходит без накопления интермедиатов по

традиционным для них метаболическим путям полностью до продуктов, способных включаться в конструктивный обмен микроорганизмов.

Применение микробных методов очистки сточных вод от фенолькых соединений без предварительной физико-химической обработки, позволяющей снизить содержание их наиболее токсичных компонентов, довольно ограничено. Это положение связано с тем, что многие ароматические соединения, в первую очередь, нитро- или галоген-замещенные производные фенола и полициклические углеводороды являются высокотоксичными субстратами по отношению к микробным клеткам, в том числе и для штаммов-деструкторов. Увеличение концентрации субстрата до максимально утилизируемой даже в оптимальных условиях чаще всего приводит к удлинению срока его разрушения вплоть до полного ингибирования. Это достаточно четко видно на примере таких соединений как 2,4-динитрофенол, 2,4-дихлорфенол, для которых изменение концентрации на десятки-сотни мг/л оказывается избирательным.

В настоящее время помимо физико-химической предобработки самих сточных вод для биологической очистки объектов окружающей среды от такого рода загрязнителей достаточно широко используют иммобилизованные клетки микроорганизмов, способных их разлагать.

Для повышения устойчивости микроорганизмов, используемых для очистки сточных вод, к их токсичным компонентам, и частичного устранения ингибирования их активности, лучше всего использовать методы включения в гель, поскольку полисахаридные гели создают дополнительную «клеточную стенку» для формирующихся внутри микроколоний, обеспечивая более надежную защиту от токсичных компонентов сточных вод, чем иммобилизация адсорбцией.

С другой стороны, иммобилизация микроорганизмов методами адсорбции на различных носителях является гораздо более простым и соответственно, дешевым способом использования иммобилизованных микробных клеток.

Для решения поставленной задачи нами были разработаны способы получения микробных клеток штаммов-деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гель агар-агара (А. с. №1705345 СССР) и фурцелларана (А. с. №1742330 СССР), включая определение механической прочности биокатализаторов и их функциональной стабильности в процессе использования.

Деструктивная активность бактериальных клеток штамма А./аесаШ КЭ\'21 иммобилизованных в агар-агар, была на уровне свободных клеток; биокатализатор на основе фурцелларана превышал, а на основе каппа-каррагенана уступал деструктивной активности свободных клеток. При этом культивирование иммобилизованных в гель агар-агара и фурцелларана клеток штаммов-деструкторов в условиях усиленной аэрации может увеличивать их деструктивную активность по отношению к фенолу и даже способствовать восстановлению специфической активности иммобилизованных клеток некоторых штаммов после их включения в полиакриламидный гель.

На примере штамма А./аесаШ К8У21 показано, что при использовании клеток штаммов-деструкторов фенола иммобилизованных в гель агар-агара, фурцелларана или каппа-каррагенана, происходит их рост и размножение, сопровождающееся выходом бактерий из гранул геля. При этом максимальная деструктивная активность биокатализатора совпадает по времени с максимальным выходом клеток из гранул.

На примере клеток штамма Р.рийда ОРБ-8, включенных в фурцелларановый гель, было показано, что скорость утилизации субстрата (деструктивная активность биокатализатора) находится в прямой зависимости от количества биомассы,

используемой при формировании биокатализаторов. Время полной утилизации субстрата биокатализатором, содержащим 0,05 г/л биомассы, существенно возрастало, в то время как содержание количества биомассы в биокатализаторе выше 0,4 г/л не приводило к заметному увеличению его деструктивной активности. Это свидетельствует о том, что процесс приготовления биокатализатора методом включения в гель фурцелларана клеток штамма Р.риНйа СБЗ-в не требует слишком большого насыщения гранул геля клетками штамма-деструктора. Это может быть важно при практическом использовании этого метода иммобилизации, поскольку, таким образом, может быть обоснована нецелесообразность наработки большого количества биомассы штамма-деструктора.

Проведенное определение возможности проявления деструктивной активности иммобилизованных клеток при культивировании в средах, содержащих фенол в высоких сублетальных и летальных для свободных клеток концентрациях, показало, что протективный эффект лолисахаридного носителя был описан в отношении клеток штамма Р.риШа ОРЭ-106 и штамма А./аесаИя КБУ21, но не для штамма Р.риййа ОР8-8, иммобилизованных включением в гель агар-агара. Это свидетельствовало о штаммовой специфичности защитного действия этого носителя.

Биокатализаторы, содержащие клетки штаммов-деструкторов фенола из нашей коллекции, иммобилизованные путем включения в гранулы агарового геля, стабильно сохраняют свою деструктивную активность не только при длительном пассировании через среды, содержащие фенол в качестве единственного источника углерода и энергии, и при хранении при 4° С в жидкой среде без субстрата, но и в высушенном состоянии. Это создает более широкие возможности их хранения и транспортировки при последующем использовании в очистных сооружениях или при ремедиации загрязненных природных обьетов.

Одним из способов использования иммобилизованных микроорганизмов для очистки объектов окружающей среды от загрязнения фенольными соединениями может являться хранение соответствующих бактерий в стерильных торфяных пакетах, что было показано на примере штамма-деструктора фенола А./аесаИз КБУ21.

Суммируя результаты проведенных исследований с иммобилизованными клетками штаммов-деструкторов можно констатировать, что:

- наиболее перспективными для конструирования биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток штаммов-деструкторов путем включения их в гранулы являются гели агар-агара и фурцелларана. Гелевая матрица биокатализаторов обладает протективным эффектом в отношении включенных в нее клеток;

- деструктивная активность биокатализаторов находится в прямой зависимости от количества биомассы, включенной в гель;

- применение биокатализаторов в условиях усиленной аэрации позволяет повысить их активность и тем самым ускорить процесс биодеструкции фенола;

- культивирование в условиях усиленной аэрации может способствовать восстановлению деструктивной активности клеток штаммов-деструкторов включенных в полиакриламидный гель;

- биокатализаторы способны длительно сохранять не только жизнеспособность, но и деструктивную активность, как при пассажах через жидкие среды, содержащие соответствующий субстрат, так и после высушивания, а также и при хранении в различных условиях при 4° С и при комнатной температуре.

Несмотря на все, казалось бы, неоспоримые преимущества иммобилизации микроорганизмов методом включения в полисахаридные гели, указанные выше, в настоящее время при разработке технологий очистки сточных вод в странах Западной Европы и США отдается предпочтение реакторам с псевдоожиженным слоем (твердые носители), а в СНГ - биореакторам со стационарной плоскостной или волокнистой насадкой (Могилевич, 1995). Закрепление штаммов на различных носителях путем адсорбции (Никовская, 1989), хотя и не обеспечивает такого значительного протективного эффекта как методы включения в гель, но предотвращает вынос биомассы из реактора, обеспечивает более стабильный режим его функционирования и, в конечном счете, повышает эффективность микробной очистки сточных вод различных производств (Вебб, 1990). В связи с этим, на примере процессов микробной деструкции нитрофенолов нами была испытана возможность использования наиболее простого и дешевого способа иммобилизации - метода адсорбции.

Сравнительное изучение в качестве носителей двух типов синтетических волокон (нитрона, капрона) показало, что штаммы А.сакоасеНсш МН-21, СогупеЬас(епит зр. 0-31 и СогупеЬШепит зр. ПНК-2 (В-5439) проявляют большую активность при адсорбции на волокнах капрона, в то время как штаммы Р.риШа БА-11 (В-6707), Р.риМа С-11 (В-6708) и СогупеЬас/епит яр. Т-2 одинаково активны и в свободном состоянии, и при иммобилизации на обоих типах носителей. В ряде случаев штаммы, иммобилизованные на волокнах капрона, могли утилизировать более высокие концентрации субстрата (штамм А.сакоасеИсиз МН-21), или же иммобилизация приводила к сокращению сроков полного разрушения вещества (штаммы СогупеЪшепит лр. О-31 и СогупеЬааепит 5/>. ПНК-2). Для утилизации таких трудно разлагаемых соединений, как нитрозамещенные фенолы, эти преимущества использования иммобилизованных клеток являются довольно существенными, так как позволяют гарантировать более успешную и/или эффективную работу штаммов-деструкторов в условиях очистки реальных сточных вод.

В дальнейшем для изучения деструктивной активности свободных и иммобилизованных клеток выделенных культур в условиях, близких к реальному производству, были взяты образцы локальных сточных вод цехов предприятий, производящих фенол и ацетон кумольным способом - Саратовского производственного объединения "Нитрон", Уфимского и Самарского заводов синтетического спирта. В их состав входили различные высокотоксичные для микробных клеток соединения (ароматические и неароматические): гидроперекись изопропилбензола, диметилфенилкарбинол, фенол, ацетофенон, окись мезитила и др.. Содержание этих соединений, т.е. соотношение их концентраций, в различных пробах сточных вод варьировало в достаточно широких пределах (разность содержания того или иного, в основном ароматического, компонента, могла составлять до нескольких сотен мг/л в зависимости от пробы).

Для нормального культивирования микробных клеток и сохранения их деструктивной активности сточные воды, как правило, необходимо перед биологической очисткой подвергнуть определенной обработке, которая чаще всего включает их нейтрализацию до нейтральных значений рН - 7,0-7,2, внесение по мере необходимости минеральных солей, в первую очередь ионов азота (аммоний) и фосфора (фосфатов натрия или калия), удаление из сточных вод грубых взвешенных частиц, а также наиболее токсичных соединений (Экологическая биотехнология, 1990).

В сточных водах производства фенола и ацетона кумольным методом наиболее токсичным соединением является гидроперекись изопропилбензола (гипериз). Необходимо отметить, что заводскими контролирующими службами уделяется внимание только содержанию фенола (3,0 - 8,0 г/л) и показателю ХПК, а наличие гипериза в сточных водах не учитывается, хотя его концентрация может составлять до 10,0 - 20,0 г/л, и такие сточные воды могут считаться условно чистыми. Разработанная с нашим участием оригинальная методика физико-химической обработки, основанная на каталитическом разложении гипериза путем его восстановления до диметилфенилкарбинола (Патент 2 048454 РФ), позволяла сводить его концентрацию в сточных водах практически к нулю. В обработанных таким образом пробах сточных вод возрастало содержание фенола, ацетофенона, бензоатов и, особенно, диметилфенилкарбинола. Вследствие этого возникала необходимость их разбавления. Для нормального функционирования в них штаммов бактерий-деструкторов из нашей коллекции достаточно было разбавления их всего в 10-15 раз. При этом показано, что для разбавления можно использовать не только среду М9 или дехлорированную водопроводную воду, но и сточные воды других цехов фенольного производства.

При изучении процессов микробной очистки подготовленных таким образом реальных сточных вод нами были использованы штаммы А./аесаШ К8У21 и Р.а1саИ%епеБ КО| (деструкторы фенола и бензойной кислоты, некоторых ее окси-, диокси- производных), Р.риМа ОР8-8 - деструктор фенола и ацетофенона, но не диметилфенилкарбинола, Р.риИс1а ОБЗ-Юб - деструктор диметилфенилкарбинола и фенола, не способный утилизировать ацетофенон. Фенолутилизирующая активность всех этих штаммов была примерно одинаковой, но спектр деструктивной активности Р.риМа ОР8-8 и Р.риМа 0рв-106 наиболее полно соответствовал составу сточных вод производства фенола ацетоно-кумольным способом.

В результате проведенных исследований показано, что свободные и иммобилизованные включением в гель клетки изученных штаммов способны полностью очищать реальные сточные воды различных фенольных производств при различном соотношении компонентов. Количественный и качественный состав сточных вод варьировал в широких пределах, что давало возможность всесторонне изучить активность испытуемых штаммов. Максимальные концентраций фенола, встречавшиеся в пробах сточных вод, составляли 0,53 г/л, ацетофенона - 0,2 г/л, диметилфенилкарбинола - 0,84 г/л, окиси мезитила - около 0,05 г/л, бензойной кислоты - 0,07г/л, п-оксибензойной кислоты - 0,02 г/л в присутствии 0,025 г/л гипериза и небольших количеств ацетона.

С целью разработки эффективной системы микробной очистки фенольных сточных вод деструктивная активность штаммов А./аесаШ К8У21, Р.а1са1щепе$ КО], Р.риМа СР8-8, Р.риМа СРБ-Юб, Р.риМа БА-11 и Р.риМа С-11 изучалась в условиях максимально приближенных к производственным - условия периодического и/или проточного культивирования в подготовленных пробах сточных вод в лабораторных биореакторах (система из 1-3-х колонок) различных типов (в зависимости от используемого метода иммобилизации и типа носителя).

Штаммы-деструкторы фенола А./аесаШ К8У21 и Р.ака^епея КО), иммобилизованные в агаровые гранулы, в условиях проточного культивирования в биореакторе с псевдоожиженным слоем носителя благодаря протекгивному эффекту носителя разлагали фенол в концентрации до 1,75 г/л и 1,6 г/л, соответственно, при скорости разбавления 0,15 ч"1. Это значительно превышает деструктивную активность

свободных клеток этих штаммов. Оба штамма нуждаются в добавлении 0,8-1,0 г/л аммония хлорида как источника азота. Лаг-фаза при культивировании этих штаммов на пробе фенольных сточных вод составляла 12 часов. Однако при замене минеральной среды, содержащей фенол, на фенольные сточные воды или при использовании включенных в гель агар-агара микробных клеток после хранения в среде, изначально содержавшей фенол, дальнейший рост обоих штаммов происходил без лаг-фазы.

В пробе подготовленных каталитической переработкой гипериза в диметилфенилкарбинол сточных вод, разведенных водопроводной водой 1:10 и содержащих фенол (0,28 г/л), диметилфенилкарбинол (0,62 г/л), ацетофенон (0,05 г/л), следовые количества бензойной кислоты и п-оксибензойной кислоты, клетки обоих штаммов, иммобилизованные в агаровые гранулы, разлагали только фенол, бензоат и п-оксибензойную кислоту, но не метаболизировали остальные компоненты.

Протективный эффект носителя проявлялся в том, что при дальнейшем культивировании полная очистка этих сточных вод, поступающих в биореактор, была достигнута и при понижении разведения исходной пробы с 1:10 до 1:4. При использовании более концентрированных сточных вод в культуральной жидкости на выходе из биореактора регистрировались остаточные количества фенола.

При использовании в течение 1 месяца культивирования иммобилизованных в агаровые гранулы клеток штаммов Р.ршШа СР8-8 и Р.риШа вРЭ-Юб прошедшие предобработку реальные сточные воды, содержавшие на входе в биореактор 1,6 г/л диметилфенилкарбинола, 0,8 г/л фенола, 0,18 г/л ацетофенона, 0,14 г/л бензойной кислоты и 0,056 г/л п-оксибензойной кислоты, на входе во вторую и третью колонку содержали только фенол (0,1 г/л и 0,04 г/л, соответственно) и диметилфенилкарбинол (0,25 г/л и 0,02 г/л, соответственно). На выходе из системы очищенные сточные воды не содержали ни одного из указанных компонентов. При этом за 1 месяц работы биореактора разрушилось 7 % гранул по объему, а концентрация иммобилизованной биомассы оставалась неизменной и также как при пуске составляла 108 клеток/мл.

Четырехмесячная консервация системы с биокатализатором без аэрации и протока при комнатной температуре не оказала отрицательного влияния на его деструктивную активность при повторном запуске.

Ассоциация этих же двух штаммов псевдомонад - ОББ-в и вРБ-Юб (в соотношении 1:1), адсорбированная на синтетических волокнах, при проточном культивировании в лабораторном биореакторе противоточного типа с погружным носителем оказалась способной полностью без накопления промежуточных продуктов очищать реальные сточные воды производства фенола ацетоно-кумольным способом, содержащие фенол (0,4 г/л), диметилфенилкарбинол (1,4 г/л), ацетофенон (0,18 г/л) и бензоаты (до 0,15 г/л), при скорости разбавления 0,02-0,05 ч'1.

Таким образом, по результатам наших исследований разработана технология и лабораторный регламент очистки локальных сточных вод производства фенола ацетоно-кумольным способом, состоящая из двух стадий: физико-химической предподготовки сточных вод и последующей микробной обработки отдельными штаммами селекционированных нами культур бактерий или их ассоциацией, иммобилизованных различными способами.

Изучение активности штаммов-деструкторов п-нитрофенола Р.ршШа БА-11 и Р.риМа С-11, иммобилизованных адсорбцией на волокнах капрона и нитрона, проводилось на пробах реальных сточных вод производства пестицида метафоса (аналога паратиона) (г. Волгоград), содержащих до 8,0 г/л п-нитрофенола (это

соединение применяется и в качестве сырья, и постоянно образуется при физико-химическом гидролизе метафоса). Показано, что скорость утилизации в образцах подготовленных (разбавленных) реальных сточных вод производства метафоса независимо от материала носителя оказалась примерно одинакова. Субстрат (п-нитрофенол) в концентрации 0,3 г/л клетками обоих штаммов псевдомонад полностью утилизировался за двое суток без накопления каких-либо промежуточных продуктов в культуральной жидкости.

При использовании иммобилизованных адсорбцией на волокнах ассоциации этих же штаммов псевдомонад-деструкторов п-нитрофенола (в соотношении 1:1) в лабораторном биореакторе противоточного типа с погружным носителем было показано, что при проточном культивировании (скорость разбавления 0,04 ч'1) происходит полная утилизация п-нитрофенола без накопления промежуточных продуктов при содержании субстрата в подающихся на очистку сточных водах производства метафоса до 1,4 г/л.

Ассоциация двух описанных ранее штаммов коринебактерий-деструкторов полинитрофенолов, иммобилизованных на синтетических волокнах, в аналогичных условиях (проточное культивирование с той же скоростью разбавления в аналогичном биореакторе) полностью и без накопления промежуточных продуктов очищала подготовленные пробы сточных вод производства хлорнитробензола при общем содержании 2,4-динитрофенола и 2,4,6-тринитрофенола до 0,3 г/л. Это несколько ниже ранее выявленных деструктивных возможностей этих штаммов по отношению к этим соединениям, но такое снижение может быть связано с взаимным ингибирующим эффектом этих высокотоксичных соединений.

Основываясь на разработанных методических подходах нами в сотрудничестве с учеными Саратовского технического университета была разработана биотехнология очисткй фенольных сточных вод процесса термической переработки сланцев.

Среди имевшихся в нашей коллекции ранее выделенных, подробно изученных и описанных штаммов-деструкторов ароматических соединений были отобраны 15 наиболее активных, способных утилизировать фенол (0,17 г/л) в сточных водах процесса термической переработки сланцев, разведенных в соотношении 1:1 минеральной средой М9, на 43 % - 23 % за 72 часа. По скорости утилизации фенола среди них было селекционировано 8 штаммов, способных снижать его концентрацию на 64-80% за 48 часов в этих же пробах сточных вод и в этих же условиях.

Эти 8 штаммов сохраняли свою активность и при разведении фенольных сточных вод процесса термической переработки сланцев (0,35 - 0,48 г/л фенола) не минеральной средой М9, а водопроводной водой (1:1). Дополнительно как источники азота и фосфора в сточные воды вносили 0,5 - 1,0 г/л хлорида аммония и фосфата калия однозамещенного.

По месту и времени первоначального выделения из этих 8 штаммов были сгруппированы 2 ассоциации (консорциума) - из 5 (I) и 3 (И) штаммов. Первая ассоциация оказалась более активной и снижала концентрацию фенола до 30 % от исходной уже на 2 сутки культивирования. Для данного консорциума было установлено, что процессы утилизации фенола, хотя и менее эффективно, происходят при его культивировании и на усредненной пробе сточных вод, разбавленных водопроводной водой (1:1) и в результате содержащих 0,22 г/л фенола без добавления дополнительных источников азота и фосфора. Добавление только одного источника фосфора стимулирует процесс очистки сточных вод этим консорциумом в большей

степени, чем добавление только одного источника азота. Однако оптимальным при разведении сточных вод процесса термической переработки сланцев водопроводной водой все-таки следует считать добавление обоих компонентов - аммония хлорида и фосфата калия однозамещенного в концентрации 0,5 г/л.

Эта же 1-я ассоциация из 5 штаммов оказалась более активной и в иммобилизованном состоянии. При этом на основании сравнительного изучения деструктивной активности иммобилизованных клеток среди носителей (кокс, полукокс, сланцевая плитка, керамзит) для биологической очистки фенольных сточных вод процесса термической переработки сланцев как оптимальный по многим параметрам (хорошая адсорбция микроорганизмов, механическая прочность, дешевизна) в качесгве носителя был выбран керамзит.

Свойства частиц этого носителя и достаточно высокая активность бактерий, закрепленных на них, предопределили выбор типа биореактора для очистки фенольных сточных вод процесса термической переработки горючих сланцев Поволжья. Это реактор с погружной насадкой противоточного типа.

При запуске биореактора для более полной адсорбции бактериальных клеток ассоциации на частицах носителя культивирование проводили в периодическом режиме в течение 3 суток. В целях более плавной адаптации микроорганизмов к компонентам реальных сточных вод использовали их разведение. С другой стороны об активности биокатализатора свидетельствовала полная или близкая к полной утилизация фенола в очищаемых сточных водах, что служило основанием для их замены на новые. Таким образом, общий период подготовки биореактора к работе в режиме проточного культивирования ("период запуска") составил 4 суток.

Показано, что в целях предотвращения или снижения негативных эффектов на биокатализатор и более эффективной очистки сточных вод наиболее целесообразно проведение их предобработки, предусматривающей:

1.по возможности полное осаждение взвешенных частиц, в первую очередь, исходного сырья - сланцевой смолы;

2.разбавление сточных вод или доведение их рН до нейтральных величин в случае необходимости;

3.добавление аммония хлорида ("ч") и калия фосфата однозамещенного ("ч") в количестве не менее 0,05 г/л.

Определение различных параметров функционирования биореактора с иммобилизованными на частицах керамзита клетками штаммов-деструкторов позволило установить, что после предобработки концентрация фенолов в сточных водах (0,51 г/л) снижается до необходимого уровня при достаточно высокой скорости разбавления - оптимальная 0,05 ч"1, максимальная - 0,077ч'1.

На примере высокотоксичных сточных вод процесса термической переработки сланцев (концентрация фенолов - 0,59 г/л, взвешенные частицы сланцевой смолы) была показана возможность рекультивации биокатализатора и возобновления его эффективной работы без замены на новый, т.е. надежность используемого метода очистки.

Таким образом, предложенный для полного осуществления этого процесса лабораторный аэробный биореактор (0,32 л) с иммобилизованными на частицах керамзита клетками в комплексе с рекомендованной предобработкой сточных вод в

режиме стационарного использования может

биотехнологии очистки сточных вод процесса термической переработки сланцев в

более крупных - полупромышленных или промышленных масштабах.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция микроорганизмов-деструкторов фенола и его производных, включающая 119 идентифицированных штаммов. 10 наиболее активных подробно изучены по основным физиолого-биохимическим свойствам, специфической метаболической активности и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва): Alcaligenes faecalis KSV21 (В-2841) и Pseudomonas alcaligenes КО| (В-5658) - как активные деструкторы фенола, Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11 (В-4347) - как активный деструктор бензойной кислоты и ее производных, в первую очередь, 2-нитробензойной кислоты, Pseudomonas putida GFS-8 (В-5248) - как активный деструктор фенола и его производных, в первую очередь, ацетофенона, Pseudomonas putida GFS-106 (В-5249) и Pseudomonas putida GFS-93 (B-5437) - как активные деструкторы диметилфенилкарбинола, Azomonas macrocytogenes GFS-139 (В-5438) - как активный деструктор ацетофенона, Corynebacterium sp. ПНК-2 (В-5439) - как активный деструктор 2,4-динитрофенола и 2,4,6-тринитрофенола, Pseudomonas putida БА-11 (В-6707) и Pseudomonas putida С-11 (В-6708) - как активные деструкторы п-нитрофенола. Приоритет 5 из них защищен авторскими свидетельствами (№1198118 - Alcaligenes faecalis KSV21, №1597346 - Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11, №1759794 - Pseudomonas putida GFS-106, №1792925 -Pseudomonas putida GFS-8) и патентом РФ №2061752 (Corynebacterium sp. ПНК-2).

2. Определены оптимальные условия проявления деструктивной активности изученных штаммов. Показано влияние на этот процесс биологических особенностей микроорганизма, химического строения разрушаемого соединения, концентрации субстрата, аэрации, pH среды и температуры культивирования.

3. В некоторых выделенных штаммах-деструкторах впервые обнаружены и частично охарактеризованы новые трансмиссивные плазмиды биодеградации: фенола (pKS, около 43 Мд, из штамма A.faecalis KSV21), фенола и ацетофенона (р8, около 80Мд, из штамма P.putida GFS-8), ацетофенона (р9, около 34 Мд, из штамма P.putida GFS-9, р136, около 36 Мд, из штамма A.macrocytogenes GFS-139), диметилфенилкарбинола (р93, около 70 Мд, из штамма P.putida GFS-93, р106, более 100 Мд, из штамма P.putida GFS-106, р113, около 100 Мд, из штамма P.putida GFS-113). Рекомбинантный штамм Pseudomonas putida, несущий плазмидные гены деструкции фенола и гены термотолерантности (Т42° С) (плазмида pKS из штамма A.faecalis KSV21) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва).

4. Для получения биокатализаторов для очистки фенольных сточных вод разработан новый способ иммобилизации бактерий путем включения в полисахаридный агаровый гель (приоритет защищен авторским свидетельством №1705345), новый полисахаридный носитель - фурцелларан и способ получения биокатализатора в этом полисахаридном носителе (приоритет защищен авторским свидетельством №1742330). Иммобилизованные методами включения в эти полисахаридные гели бактерии сохраняют не только жизнеспособность, ко и специфическую деструктивную активность на уровне свободных микробных клеток.

5. Показано, что иммобилизация методами включения в полисахаридные гели обеспечивает бактериальным клеткам штаммов-деструкторов ароматических соединений достаточно высокую толерантность к токсичным компонентам фенолсодержащих сточных вод. На пробах реальных сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом показана более высокая эффективность работы этих штаммов в иммобилизованном состоянии, чем в свободном.

6. Для локальной микробной очистки фенолсодержащих сточных вод производства нитросодержащего инсектицида метафоса/паратиоиа, а также формирующихся в процессе термической обработки сланцев, возможно применение штаммов бактерий-деструкторов из созданной коллекции, иммобилизованных методами адсорбции на различных носителях (волокнистые или твердые, имеющие определенный размер частиц);

7. Разработана технология и лабораторный регламент микробной очистки локальных реальных сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом, включающие физико-химическую предподготовку сточных вод и последующую их очистку отдельными штаммами селекционированных культур бактерий или их ассоциациями, иммобилизованными различными способами;

8. Для очистки реальных фенольных сточных вод созданы и испытаны в режиме периодического и проточного культивирования лабораторные модели установок -аэрлифтного биореактора с псевдоожиженным слоем (с циркуляцией слоя носителя) на основе клеток штаммов-деструкторов, иммобилизованных методом включения в полисахаридный гель, и биореактора противоточного типа с погружной насадкой (реактор с неподвижным слоем) на основе этих клеток, иммобилизованных методом адсорбции на волокнистых носителях;

9. Разработана и испытана в режиме периодического и проточного культивирования лабораторная биотехнология микробной очистки сточных вод процесса термической обработки сланцев Поволжья, состоящая из двух стадий: физико-химической предподготовки и последующей локальной их микробной очистки в биореакторе противоточного типа с погружной насадкой (реактор с неподвижным слоем) на основе штаммов-деструкторов фенола и его производных, иммобилизованных методом адсорбции на твердых носителях с определенным размером частиц.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Барковский A.JI., Иосипенко А.Д., Корженевич В.И., Кнороз М.Ю., Пацевич М.Э., Турковская О.В., Шуб Г.М. Применение бактерий для биодеструкции ксенобиотиков. //Микробиология. - 1982. -Т.51, N3. - С.506-509.

2. Барковский А.Л., Иосипенко А.Д., Кнороз М.Ю., Козлова М.Э., Корженевич В.И., Турковская О.В., Шуб Г.М. О биодеградации трудноокисляемых органических соединений. //Метаболические плазмиды бактерий: Тез. Всесоюзн. конф. Таллин, 19-23 октября 1982. - Таллин, 1982. - С.27-28 - Barkovsky A.L., Iosipenko A.D., Knoroz M.Yu., Kozlova M.E., Korzhenevich V.I., Turkovskaya O.V., Shub G.M. Biodégradation of organic compounds difficult to oxidize. //Metabolic plasmids: Abstrs. Intern. Conf. Tallinn, Estonian SSR, USSR, Oct. 19-23,1982. - Tallinn, 1982 - P.29-30.

3. Барковский АЛ., Иосипенко А.Д., Кнороз М.Ю., Корженевич В.И., Пацевич М.Э., Турковская О.В., Шуб Г.М. Микробиологическая деструкция ксенобиотиков. //Микробиология очистки воды: Тез. 1 Всесоюзн. конф. Киев, 7-10 декабря 1982. -Наукова думка, Киев, 1982. -С.65-66.

4. Барковский А.Л., Корженевич В.И., Кнороз М.Ю., Турковская О.В., Шуб Г.М. Использование бактерий для деградации ксенобиотиков. //Проблемы изучения, охраны и рационал. использования водных ресурсов: Тез. Всесоюзн. конф. - М.,

1983.-С.188-189.

5. Корженевич В.И., Шендеров Б.А. Деградация фенола аэробными грамнегативными микроорганизмами. //Акт. вопросы иммунологии, аллергологии и мол. биологии: Тез. VII Северо-Кавказ. конф. Краснодар, 27-28 сентября 1983. - Краснодар, 1983. -С.231.

6. Корженевич В.И., Шуб Г.М. Микробиологическая деструкция фенола, детерминируемая внехромосомной ДНК. //Биол. фактор - произвол, и окруж. среда -здоровье человека: Тез. Всесоюзн. конф., Новополоцк, 9-11 октября 1984. - М.,

1984.-С.188-189.

7. Корженевич В.И. Микробиологическая деградация фенола, детерминируемая внехромосомной ДНК. //Достижения микробиологии практике: Материалы VII съезда Всесоюзн. микробиол. об-ва. Т.6. - Изд-во Наука Казах. ССР, Алма-Ата,

1985.-С.92.

8. Корженевич В.И., Шендеров Б.А., Шуб Г.М. Изучение генетической природы детерминирования фенолутилизации у грамотрицательных бактерий. //Проблемы переноса генетической информации: Тез. X Всесоюзн. совещ. по программе "Плазмида". - М., 1985. - С.85.

9. Корженевич В.И., Шуб Г.М. Микробиологическая деградация фенола, детерминируемая внехромосомной ДНК. //Микробиология. - 1985. - Т.54, N6. -С.910-913.

10. Корженевич В.И. К экологии фенолутилизирукнцих грамнегативных микроорганизмов. - В кн.: Вопросы биохимии и физиологии микроорганизмов -(Экология и биохимия микроорганизмов). - Изд-во СГУ, Саратов, 1986. - С.41-43.

11. Барковский А.Л., Корженевич В.И. Деградация фенола и резорцина микроорганизмами. - В кн.: Медицинские аспекты охраны здоровья работников соврем, пром. производства. - Изд-во СМИ, Саратов, 1986. - С.186-189.

12. Барковский А.Л., Горелик Э.В., Корженевич В.И., Турковская О.В. Деградация различных ксенобиотиков антропогенного происхождения микроорганизмами природных биоценозов //Актуальные вопросы гигиены в производстве. Межвуз. сельскохоз. научн. сб. - Изд-во СГУ, Саратов, 1987. - С.18-23.

13. Корженевич В.И., Игнатов О.В. Деградация фенола иммобилизованными клетками штамма Alcaligenes faecalis KSV21. //Молодые ученые - биотехнологии: Тез. Всесоюз. конф., Москва, апрель 1989. - М., 1989. - С.108-109.

Н.Горелик Э.В., Корженевич В.И., Шуб Г.М., Шендеров Б.А. Выделение штаммов-деструкторов сульфонола и характеристика их биологической активности. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1989. - Т.25, N6. - С.843-846.

15.Feodorov A.Ju., Korgzenevitch V.l., Mironov A.D., Kresfjaninov V.Ju., Gumenyuk A.P. Bacterial utilization of components of phenolic wastes. //Abstrs. 8th Intern. Biodeter. Biodegr. Symp., Univer. Windsor, Canada, August 26-31, 1990. - Windsor, 1990. -Ps-23.

16. Korgzenevitch V.l., Feodorov A.Yu., Krest'janinov V.Yu., Ignatov O.V. Utilization of aromatic compounds by entrapped bacteria. //Abstrs. 8th Intern. Biodeter. Biodegr. Symp., Univer. Windsor, Canada, August 26-31, 1990. - Windsor, 1990. - Ps-24.

17.Mironov A.D., Krest'janinov V.Ju., Korgzenevitch V.I., Feodorov AJu. Microbial degradation of benzoic acid and its derivatives by soil bacteria. //Abstrs. 8th Intern. Biodeter. Biodegr. Symp., Univer. Windsor, Canada, August 26-31, 1990 - Windsor,

1990. - Ps-25.

18.Mironov A.D., Krestjaninov V.Ju., Korgzenevitch V.I. Metabolism of aromatic compounds by soil bacteria. //Abstrs. 20th FEBS Meeting Budapest, Hungary, August 19-24, 1990.-Budapest, 1990. - P-Th398.

19. Korgzenevitch V.I., Dyatlov I.A., Ignatov O.V. The detection of viability of immobilized bacterial cells. //Abstrs. 20th FEBS Meeting Budapest, Hungary, August 19-24, 1990. -Budapest, 1990. - P-Th649.

20.Корженевич В.И., Игнатов O.B. Утилизация фенола микроорганизмами, иммобилизованными в гель. //Биотехника и биотехнология (БиБ-90): Материалы заочн. научно-техн. конф. март-июнь 1990. - Тамбов: ТОО СНИО СССР, 1990. -С. 102.

21.Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Миронов А.Д., Крестьянинов В.Ю., Гуменюк А.П. Утилизация компонентов фенольных сточных вод бактериями. //Обезвреживание и регенерация твердых органических отходов и растворителей: Тез. зонал. конф., Пенза, 29-30 ноября 1990 - Пенза, 1990. - С.10-11.

22.Корженевич В.И., Игнатов О.В., Федоров А.Ю. Иммобилизация бактерий -деструкторов фенола. //Новые направления биотехнологии: Тез. Всесоюзн. конф., Пущино, 2-4 октября 1990. - Пущино, 1990. - С.41.

23.Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Крестьянинов В.Ю., Волченко Е.В. Получение высокоактивных штаммов-деструкторов ксенобиотиков. //Новые направления биотехнологии: Тез. Всесоюзн. конф. Пущино, 2-4 октября 1990. - Пущино, 1990. -С.51-52.

24.Игнатов О.В., Сорокин А.В., Корженевич В.И., Птичкина Н.М. Использование К-формы фурцелларана для иммобилизации бактериальных клеток. //Химические превращения пищевых полимеров: Тез. Всесоюзн. конф. Светлогорск, 21-23 апреля

1991. -Калининград, 1991. - С.72.

25.Корженевич В.И., Игнатов О.В., Миронов А.Д., Кривопалов Б.В., Барковский А.Л. Активность штаммов-деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гранулы агарового геля. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1991. - Т.27, N3. - С.365-369.

26.Миронов А.Д., Крестьянинов В.Ю., Корженевич В.И., Евтушенко И.Я., Барковский А.Л. Деструкция 2-нитробензойной кислоты и других ароматических соединений штаммом Pseudomonas pseudoalcaligenes. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1991. - Т.27, N4. - С.571-576.

27. Ignatov О.V., Sorokin A.V., Korzhenevich V.I., Ptitchkina N.M. The use of a furcellaran K-form for immobilization of bacterial cells. //EUROCARB VI Abstrs. 6th European Symp. on Carbohydrate Chemistry, Heriott-Watt Univer., Edinburgh, Scotland, Sept. 8-13, 1991. - The Royal Soc.of Chemistry. Perkin Division, Edinburgh, 1991. - C43.

28.Feodorov A.Yu., Korzhenevich V.I., Mironov A.D., Krestyaninov V.Yu., Gumenyuk A.P. Bacterial utilization of phenolic wastewater components. //International Biodeterioration & Biodegradation - 1992. - V.30, N1. - P.9-16.

29. Korzhenevich V.I. The usage of agar entrapped bacterial cells in phenolic wastewater treatment bioreactor. //Proc. of ENVIROTECH VIENNA 1992, Vienna, Austria, April 22-24,1992.-ISEP, 1992.-P.802-806.

30.Гуменюк А.П., Федоров А.Ю., Крестьянинов В.Ю., Корженевич В.И. Вариант комплексной очистки сточных вод производства фенола. //Новые направления биотехнологии: Тез V конф. РФ, Пущино, 18-22 мая 1992. -Пущино, 1992. - С.147.

31. Капранова О. И., Волченко Е.В., Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Крестьянинов В.И. Генетическое детерминирование и стабильность признака биодеградации фенола и ацетофенона. //Новые направления биотехнологии: Тез. V конф. РФ, Пущино, 18-22 мая 1992.-Пущино, 1992.-С.157.

32. Крестьянинов В.И., Сингирцев И.Н., Федоров А.Ю., Корженевич В.И. Исследование процессов самоочищения водоемов-накопителей фенольных отходов. //Новые направления биотехнологии: Тез. V конф. РФ, Пущино, 18-22 мая 1992. - Пущино, 1992.-С. 159.

33.Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Шеенсон В.А., Волченко Е.В., Щербакова С.А. Оптимизация процессов микробной деградации ксенобиотиков. //Новые направления биотехнологии: Тез. V конф. РФ, Пущино, 18-22 мая 1992. - Пущино,

1992.-С.184.

34.Ignatov О.V., Ptitchkina N.M., Komarova N.N., Korzhenevich V.I. The use of polysaccharide gels for entrapped of bacterial cells-destructors. //Abstrs. XVII Intern. Carbohydrate Symp., Paris, France, July 5-10, 1992. - Paris, 1992. D052. - P696.

35.Федоров А.Ю., Крестьянинов В.Ю., Волченко E.B., Корженевич В.И. Выделение штаммов-деструкторов диметилфенилкарбииола и характеристика их биодеструктивной активности. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. Т.28, N5. - С.720-725.

36. Сингирцев И.Н., Волченко Е.В., Корженевич В.И., Федоров А.Ю. Бактериальные штаммы для аэробной очистки сточных вод. //Биология и биотехнология очистки воды: Тез. междунар. конф. - Киев, 1993. - С.47.

37. Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Крестьянинов В.Ю., Корженевич В.И Биодеградация ацетофенона почвенными бактериями. //Прикладная биохимия и микробиология. -

1993. - Т.29, N2. - С.218-222.

38.Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Корженевич В.И., Сингирцев И.Н., Крестьянинов

B.Ю. Полисубстратный штамм-деструктор компонентов сточных вод производства фенола. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т.29, N5. - С.716-722.

39. Feodorov A. Yu., Ignatov О. V., Korzhenevich V. I., Shub G. M. Effect of immobilization in agar gel on the microbial degradation of xenobiotics. //6th European Congr. Biotechnology (ECB6), Firenze, Italy, June 13-17,1993. - Firenze, 1993. - Abstrs. Books, V.2. -TU2I2.

40.Gumenyuk A.P., Feodorov A.Yu., Voltchenko E.V., Korzhenevich V.I. (1993) The complex treatment of phenolic wastewaters. //6th Eur. Congr. Biotechnology (ECB6), Firenze, Italy, June 13-17,1993. - Firenze, 1993. - Abstrs. Books, V.4. - TU263.

41.Feodorov A.Yu., Singircev I.N., Voltchenko E.V., Korzhenevich V.I. Bacterial strains for aerobic wastewater treatment. //6th Eur. Congr. Biotechnology (ECB6). Firenze, Italy, June 13-17, 1993.-Firenze, 1993. - Abstrs. Books, V.4.-TH258.

42. Сингирцев И.Н., Крестьянинов В.Ю., Корженевич В.И. Биологическая деструкция 2,4-динитрофенола. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1994. - Т.ЗО, N2. -

C.250-254.

43. Федоров А.Ю., Гуменюк А.П., Волченко Е.В., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Комплексная очистка сточных вод при производстве фенола. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1994. - Т.ЗО, N4-5. - С.728-732.

44.Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Утилизация нигрофенолов различными микроорганизмами. //Новые направления биотехнологии: Тез. VI конф. РФ, Пущино, 24-26 мая 1994. - Пущине, 1994. - С.46.

45. Федоров А.Ю., Сингирцев И.Н., Корженевич В.И. О природе протективного эффекта полисахаридных гелей - носителей для микроорганизмов. //Новые направления биотехнологии: Тез. VI конф. РФ Пущино, 24-26 мая 1994. - Пущино, 1994. - С.50.

46.Singircev I.N., Korzhenevich V.I., Shoob G.M. Microbial waste purification from nitrosubstituted phenols. //Intern. Symp./Workshop Environ. Biotechnology, Univer. Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada, July 4-8, 1994. - Waterloo, 1994. - Abstrs. Papers. -WP6.

47.Korzhenevich V.I., Volchenko E.V., Singircev I.N., Feodorov A. Yu., Shoob G.M. Microbial treatment of phenolic wastes. //Intern. Symp./Workshop Environ. Biotechnology, Univer. Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada, July 4-8, 1994. - Waterloo, 1994 - Abstrs. Papers. - WP7.

48. Korzhenevich V.I, Feodorov A.Yu. Aerobic microbial degradation of aromatic compounds

- a review of investigations performed in the former Soviet Union //Biodeterioration Abstracts. - 1994. - V.8, N4. - P.255-267.

49.Шуб Г.М., Шендеров Б.А., Барковский A.JI., Горелик Э.В., Игнатов О.В., Корженевич В.И., Турковская О.В., Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Муратова А.Ю., Панченко Л.В., Сингирцев И.Н. Экологическая микробиология (Итоги и перспективы). //Соврем, проблемы мед. науки: Материалы научн. практич. конф. по законченным научным исследованиям. - Изд-во СГМУ, Саратов, 1994. - Ч.Ш. -С.3-4.

50.Korzhenevich V.I., Volchenko E.V., Singircev I.N., Feodorov A.Yu., Shoob G.M. Microbial treatment of phenolic wastes. - In: Environmental Biotechnol.: Principles and Applications. - M. Moo-Young et al. (eds.), Kluwer Academic Publishers, 1995. -P.498-503.

51.Korzhenevich V.I., Singircev I.N., Shoob G.M. Microbial degradation of nitrosubstituted phenols in wastes. - In: Environmental Biotechnol.: Principles and Applications - M.Moo-Young et al. (eds.), Kluwer Academic Publishers, 1995. - P.504-510

52. Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Бактерии, разрушающие п-нитрофенол, в сточных водах производства метафоса. //Химия и технология воды.

- 1996. - Т.18, N2. - С.198-201.

53. Сингирцев И.Н., Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Микробная деструкция нитрофенолов в сточных и природных водах. - Междунар. конф. памяти акад. А.А.Баева: Материалы Москва, 20-22 мая 1996. - М., 1996. - С.164.

54. Korzhenevich V.I., Singircev I.N., Shoob G.M Bacterial metabolism of various nitrophenols. //Abstrs. 8th Intern. Congr. of Bacteriology, Jerusalem, Israel, August 18-23, 1996. - Jerusalem, 1996 - P.67

55.Korzhenevich V.I., Feodorov A.Yu., Singircev I.N., Shoob G.M. Microbial method of phenolic oil shale treatment wastes refining. //Abstrs. 8th Intern. Congr. of Bacteriology, Jerusalem, Israel, August 18-23,1996. - Jerusalem, 1996 . - P.67

56. Федоров А.Ю., Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Микробный метод очистки стоков переработки горючих сланцев. //Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологич. проблемы (ICOMID'96): Тез. междунар. конф. Пермь, 8-11 октября1996. - Пермь, 1996. - С.50.

57.Fedorov A.Yu., Singircev I.N., Volchenko E.V., Korzhenevich V.I., Shoob G.M. Potentialities of nitrophenols-degrading microorganisms in bioremediation processes. //Bioremediation. - ISEB'97 Meeting: Abstrs Leipzig, Germany, September 24-27, 1997. -Leipzig, 1997-P. 75.

58.Singirtsev I.N., Fedorov A.Yu., Volchenko E.V., Romanova T.A., Korzhenevich V.I., Shoob G.M. Potentialities of nitrophenols-degrading microorganisms. - In: Global Environmental Biotechnology. - D.L. Wise (ed.), Kluwer Academic Publishers, 1997. -P.567-571

59.Федоров А.Ю., Волченко E.B., Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Защитное действие агара при Иммобилизации штаммов-деструкторов ароматических соединений. //Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. -Т.35, N2. - С.165-172.

60.Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Хранение штаммов промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы. //Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т.36, N1. - С.59-67.

61.Сингирцев И.Н., Волченко Е.В., Корженевич В.И., Гуменюк А.П., Федоров А.Ю. Микробная деградация компонентов сточных вод производства фенола. //Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т.36, N2. - С.178-188.

62. Корженевич В.И. Микроорганизмы в борьбе с загрязнением окружающей среды. //Экология и здоровье в XXI веке: Тез. междунар. конф. УлГУ, Ульяновск, 4-6 октября 2001 г. - Ульяновск, 2001. - С.80-81.

63. Авторское свидетельство №1198118 СССР C12N15/00 Штамм бактерий Alcaligenes faecalis KSV21, способный к деградации фенола /Шендеров Б.А., Корженевич В.И. -Бюл. N46, 1985.

64. Авторское свидетельство №1306112 СССР C12N1/20, C12Q1/04 Среда для отбора микроорганизмов-деструкторов ароматических соединений /Барковский А.Л., Корженевич В.И.

65. Авторское свидетельство №1597346 СССР C02F3/34, C12N1/20 Штамм бактерий Pseudomonas pseudoalcaligenes, используемый для очистки сточных вод от ароматических соединений /Миронов А.Д., Корженевич В.И., Барковский АЛ. -Бюл. N37,1990.

66. Авторское свидетельство №1705345 СССР C12N11/00, C12N11/10 Способ получения .иммобилизованных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики /Барковский АЛ., Миронов А.Д., Корженевич В.И., Игнатов О.В., Кривопалов Ю.В. -Бюл. N2, 1992.

67. Авторское свидетельство №1742330 СССР C12N11/00 Способ получения биокатализатора в полисахаридном носителе /Игнатов О.В., Птичкина Н.М., Сорокин А.В., Корженевич В.И. -Бюл. N23,1992.

68.Авторское свидетельство №1759794 СССР C02F3/34, C12N1/20 Штамм бактерий Pseudomonas putida 106 - деструктор диметилфенилкарбинола и фенола /Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Сингирцев И.Н., Крестьянинов В.Ю. -Бюл. N33,1992.

69. Авторское свидетельство №1792925 СССР C02F3/34, C12N1/20 Штамм бактерий Pseudomonas putida - деструктор ароматических соединений и окиси мезитила /Федоров А.Ю, Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Крестьянинов В.Ю., Волченко Е.В. -Бюл. N5,1993.

70. Патент РФ N2061752 Штамм бактерий Corynebacterium species - деструктор ароматических соединений /Сингирцев И.Н., Крестъянинов В.Ю., Корженевич В.И. -Бюл. N16, 1996.

Считаю своим долгом принести глубокую благодарность и признательность моим учителям и наставникам:

действительному члену АМН РФ, д-ру мед. наук, д-ру биол. наук, профессору

Игорю Валериановичу Домарадскому

д-ру мед. наук, профессору

Борису Аркадьевичу Шендерову

действительному члену РАЕН, д-ру мед. наук, профессору

Геннадию Марковичу Шубу

за вклад в становление и развитие в г.Саратове научного направления -«Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды».

Формат 60x90 1/16. Печать трафаретная. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 1808. Подписано в печать 19.08.2003 г. Отпечатано в типографии ООО «0риент-2000» Лиц. ПД № 7-0072 от 23.И.2000 г. Г. Саратов, ул. Б. Садовая, 158, оф. 105, тел.: (8452) 50-81-36,50-59-41

P14264

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробная очистка фенолсодержащих сточных вод"

Литературный обзор.16

Глава 1. Микробная трансформация фенола и его производных.22

Глава 1.1. Штаммы-деструкторы фенола и его производных.22

Глава 1.2. Биохимические механизмы и пути расщепления фенола и его производных.40

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Корженевич, Вячеслав Исаевич

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция микроорганизмов-деструкторов фенола и его производных, включающая 119 идентифицированных штаммов. 10 наиболее активных подробно изучены по основным физиолого-биохимическим свойствам, специфической метаболической активности и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва): Alcaligenes faecalis KSV21 (В-2841) и Pseudomonas alcaligenes KOi (В-5658) — как активные деструкторы фенола, Pseudomonas pseudoalcoligenes MV-11 (В-4347) - как активный деструктор бензойной кислоты и ее производных, в первую очередь, 2-нитробензойной кислоты, Pseudomonas putida GFS-8 (В-5248) — как активный деструктор фенола и его производных, в первую очередь, ацетофенона, Pseudomonas putida GFS-106 (В-5249) и Pseudomonas putida GFS-93 (B-5437) - как активные деструкторы диметилфенилкарбинола, Azomonas macrocytogenes GFS-139 (В-5438) - как активный деструктор ацетофенона, Corynebacterium sp. ПНК-2 (В-5439) - как активный деструктор 2,4-динитрофенола и 2,4,6-тринитрофенола, Pseudomonas putida БА-11 (В-6707) и Pseudonjonas putida C-l 1 (В-6708) — как активные деструкторы п-нитрофенола. Приоритет 5 из них защищен авторскими свидетельствами (№1198118 - Alcaligenes faecalis KSV21, №1597346 -Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11, №1759794 — Pseudomonas putida GFS-106, №1792925 - Pseudomonas putida GFS-8) и патентом РФ №2061752 {Corynebacterium sp. ПНК-2).

2. Определены оптимальные условия проявления деструктивной активности изученных штаммов. Показано влияние на этот процесс биологических особенностей микроорганизма, химического строения разрушаемого соединения, концентрации субстрата, аэрации, рН среды и температуры культивирования.

3. В некоторых выделенных штаммах-деструкторах впервые обнаружены и частично охарактеризованы новые трансмиссивные плазмиды биодеградации: фенола (pKS, около 43 Мд, из штамма A.faecalis KSV21), фенола и ацетофенона (р8, около 80Мд, из штамма P.putida GFS-8), ацетофенона (р9, около 34 Мд, из штамма P.putida GFS-9, р136, около 36 Мд, из штамма A.macrocytogenes GFS-139), диметилфенилкарбинола (р93, около 70 Мд, из штамма P.putida GFS-93, р106, более 100 Мд, из штамма P.putida GFS-106, pi 13, около 100 Мд, из штамма P.putida GFS-113). Рекомбинантный штамм Pseudomonas putida, несущий плазмидные гены деструкции фенола и гены термотолерантности (Т42°С) (плазмида pKS из штамма A.faecalis KSV21) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г.Москва).

4. Для получения биокатализаторов для очистки фенольных сточных вод разработан новый способ иммобилизации бактерий путем включения в полисахаридный агаровый гель (приоритет защищен авторским свидетельством №1705345), новый полисахаридный носитель — фурцелларан и способ получения биокатализатора в этом полисахаридном носителе (приоритет защищен авторским свидетельством №1742330). Иммобилизованные методами включения в эти полисахаридные гели бактерии сохраняют не только жизнеспособность, но и специфическую деструктивную активность на уровне свободных микробных клеток.

5. Показано, что иммобилизация методами включения в полисахаридные гели обеспечивает бактериальным клеткам штаммов-деструкторов ароматических соединений достаточно высокую толерантность к токсичным компонентам фенолсодержащих сточных вод. На пробах реальных сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом показана более высокая эффективность работы этих штаммов в иммобилизованном состоянии, чем в свободном.

6. Для локальной микробной очистки фенолсодержащих сточных вод производства нитросодержащего инсектицида метафоса/паратиона, а также формирующихся в процессе термической обработки сланцев, 40 возможно применение штаммов бактерий-деструкторов из созданной коллекции, иммобилизованных методами адсорбции на различных носителях (волокнистые или твердые, имеющие определенный размер частиц);

7. Разработана технология и лабораторный регламент микробной очистки t локальных реальных сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом, включающие физико-химическую предподготовку сточных вод и последующую их очистку отдельными штаммами селекционированных культур бактерий или их ассоциациями, иммобилизованными различными способами;

8. Для очистки реальных фенольных сточных вод созданы и испытаны в # режиме периодического и проточного культивирования лабораторные модели установок — аэрлифтного биореактора с псевдоожиженным слоем с циркуляцией слоя носителя) на основе клеток штаммов-деструкторов, иммобилизованных методом включения в полисахаридный гель, и биореактора противоточного типа с погружной насадкой (реактор с неподвижным слоем) на основе этих клеток, иммобилизованных методом адсорбции на волокнистых носителях;

9. Разработана и испытана в режиме периодического и проточного культивирования лабораторная биотехнология микробной очистки сточных вод процесса термической обработки сланцев Поволжья, состоящая из двух стадий: физико-химической предподготовки и последующей локальной их микробной очистки в биореакторе I противоточного типа с погружной насадкой (реактор с неподвижным слоем) на основе штаммов-деструкторов фенола и его производных, иммобилизованных методом адсорбции на твердых носителях с определенным размером частиц. т

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Корженевич, Вячеслав Исаевич, Саратов

1. Авдеенко В.П., Колосова Л.П., Оборина З.И., Моисеева А.Г. Определение фенолов в воде по ультрафиолетовым спектрам поглощения. //Кокс и химия. 1962. - N3. - С.49-50.

2. Алещенкова З.М., Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф. Интенсификация биологической очистки сточных вод производства лавсана микроорганизмами-деструкторами,( внесенными в активный ил. //Биотехнология. 1997. -N3. - С.48-52.

3. Алиева P.M., Джусупова Д.Б. Локальная очистка а-метилстирола бактериальными культурами. //Микробиология очистки воды: Тез. докл. I Всесоюз. конф. 7-10 декабря 1982 г. Киев, 1982. - С.60.

4. Алиева P.M., Илялетдинов А.Н. Реализация экологического принципа в микробиологической очистке промышленных сточных вод. //Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. - N4. - С.517-527.

5. Алимджанова М.И., Кутлиев Дж. Деструкция нефтепродуктов и фенола сточных вод ФНПЗ. //Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия: Тез. докл. Всесоюз. симп. Оренбург, 1991. -С.6-7.

6. Амерханова Н.Н., Наумова Р.П. 2,4,6-тринитротолуол как источник питания для бактерий. //Микробиология. 1978. - Т.47, N3. — С.393-395.

7. Аристархова В.И. Нокардиоподобные микроорганизмы. М.: Наука, 1989.-248с.

8. Аристархова В.И. Использование ароматических веществ микроорганизмами рода Nocardia. //Изв. АН СССР. Сер. биол. 1975. — N3. — С.443^146.

9. А. с. 467037 СССР С02С 5/10 Способ биохимической очистки4сточных вод от паранитроанилина. /Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Удод В.М., Подорван Н.И. Опубл. 15.04,75. бюл. №14.

10. А. с. 499227 СССР С02С 5/10; С12К 1/02 Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa N228, окисляющий фенолы в промышленных сточных водах/Юровская Е.М. Опубл. 15.01.76. бюл.№2.

11. А. с. 612958 СССР С12К 1/02, С 02В 9/02 Штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий ОСТ1", САМ+, NAFT плазмиды, используемый при биологической очистке воды от нефти и нефтепродуктов /Воронин A.M., Пориц АЛ., Скрябин Г.К. Опубл. 29.06.78.

12. А. с. 899647 СССР C12N 11/00; C02F 3/34 Наполнитель для иммобилизации бактерий при микробной очистке вод от загрязнений /Тульчинская В.П., Кожанова Г.А.

13. А. с. 975588 СССР C02F 3/32 Способ биохимической очистки сточных вод от органических соединений /Гринберг И.В., Дацюк Н.М., Штейнберг Б.И., Фильц Д.И.- Опубл. 10.03.82. бюл.№43.

14. А. с. 1 130540 СССР C02F 3/32. Способ биохимической очистки сточных вод от фенольных соединений.

15. А. с. 1 306112 СССР C12N1/20, C12Q1/04 Среда для отбора микроорганизмов-деструкторов ароматических соединений /Барковский А.Л., Корженевич В.И. Опубл. 10.09.86.

16. А. с. 1 386589 СССР C02F 3/34 Способ биохимической очистки фенольных сточных вод.

17. А. с. 1 479515 СССР C12N 11/08 Способ получения иммобилизованных бактериальных клеток /Лобова А.Б., Шамолина И.И., Ставская С.С., Таранова Л.А., Радченко О.С. опубл. 15.05.89. бюл. №18.

18. А. с. 1 597384 СССР C12N 1/20. Способ очистки сточных вод от фенольных соединений.

19. А. с. 1 686799 СССР C02F 3/34 Способ предварительной очисткисточных вод, содержащих фенол и другие ароматические углеводороды.t

20. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 1989. -С. 102-104в

21. Балашов С.В., Воронин A.M. Бактерии деструкторы сульфоароматических соединений • из активного ила. //Микробиология. -1996. - Т.65, N5. - С.627-631.

22. Бартенев Г.М., Зеленев Ю.В. Курс физики полимеров. JL: Химия, 1979.-288с.

23. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. — М.: Медицина, 1992. 192с.

24. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии: В 2ч. — М.: Мир, 1989.-4.1.-692с.I

25. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии: В 2ч. — М.: Мир, 1989.-4.2.-590с.

26. Бекер М.Е., Лиепинып Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. - 334с.

27. Бидей С.П. Использование иммобилизованных клеток млекопитающих для количественного и качественного определения гормонов. //Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. /Под ред. Дж.Вудворда.: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. - С. 177-205.

28. Биологическая очистка производственных сточных вод. Процессы, аппараты и сооружения. /Под ред. С.В. Яковлева. — М.: Стройиздат, 1985.

29. Биотехнологическая очистка промышленных сточных вод. -//Экспресс-информация. Микробиологическая промышленность за рубежом.- 1988.-N24.-С.2-3.

30. Боронин A.M., Скрябин Г.К. Генетические аспекты деградациибактериями ксенобиотиков. //Успехи микробиологии. М.: Наука, 19851. Вып.20. С.39-60.

31. Боронин A.M., Цой Т.В. Генетические системы биодеградации: организация и регуляция экспрессии. //Генетика. 1989. - Т.25, N4-С.581-594.

32. Брода П. Плазмиды. М.: Мир, 1982. - 224с.

33. Броделиус П. Иммобилизованные растительные клетки: методы получения и способность к биосинтезу. //Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. /Под ред.Дж. Вудворда: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. -С. 154-176.

34. Булыгин А.Н., Рощин С.А., Самарцев Т.А., Беляков Н.В. Проточные биокаталитические реакторы с иммобилизованными ферментами и клетками.- М.: ВНИИСЭНТИ, 1987. С.29-35.

35. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г. Распространенность специфической микрофлоры, утилизирующей хлоранилины в почве и природных водах. //Микробиология. 1988. - Т.57, N3. - С.464-^71.

36. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г. Разработка микробиологического способа очистки почвы от загрязнения пропанидом и 3,4-дихлоранилином. //Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: Тез. докл. конф. М., 1994. - С.20-21.

37. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Сидорова Т.Н. Основные условия приживаемости микроорганизмов-деструкторов в почве. //Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: Тез. докл. конф. — М., 1994. С.21-22.

38. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г., Семенюк Н.Н., Глаголев М.В.,ф Паников Н.С. Метод определения количества микроорганизмовдеструкторов хлоранилинов в почве по периоду полуразложения субстрата. //Микробиология. 1995. - Т.64, N4. - С.564-573.

39. Вебб К. Иммобилизованные клетки. //Экологическая биотехнология. /Под ред. К.Ф. Форстера, Д.А.Дж. Вейза.: Пер. с англ. Л.: Химия, 1990. -С.166-189.

40. Велицкий С. Загрязненность и перспектива очистки сточных вод сланцевого бассейна. //Горючие сланцы. — 1970. N4. - С. 19-23.

41. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы.4

42. Биотехнология. 1995. - N3-4. - С.20-27.

43. Вербина Н.М. Деградация микроорганизмами неприродных 0 органических соединений в окружающей среде. //Микробиология /ВИНИТИ.1978.— Т.7. -С.65-107.

44. Вредные вещества в промышленности. /Под ред. Н.В. Лазарева, Э.Н.Левиной. Л.: Химия, 1976. - Т. 1. - С.402^06.

45. Галактионов С.Г., Егоров В.М., Романова Л.В. Клеточные биодатчики для мониторинга окружающей среды. //Новые направления биотехнологии: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. Пущино, 2-4 октября 1990. — Пущино, 1990.-С.81-82.

46. Гвоздяк П.И. Иммобилизованные микроорганизмы в очистке Ш сточных вод от ксенобиотиков. //Иммобилизованные клетки вбиотехнологии. Сб. науч. трудов. — Пущино, 1987. — С.56-62.

47. Гвоздяк П.И., Дмитриенко Г.Н., Куликов Н.И. Очистка промышленных сточных вод прикрепленными микроорганизмами. //Химия и технология воды. 1985. - Т.7, N1. - С.64-68.

48. Гвоздяк П.И., Могилевич Н.Ф., Куликов Н.И., Романова Е.А., Нездойминов В.И. Очистка фенолсодержащих сточных вод закрепленнымиIмикроорганизмами. //Химия и технология воды. 1989. - Т. 11, N1. - С.73-75.

49. Гнедой С.Н., Бабушкина JI.M., Фролов В.Н., Левашев B.C. Трансформация энтеробактерий ДНК плазмиды R6K. //Ж. микробиол. эпидемиол., иммунол. — 1977. — N1. — С.99-104.

50. Головачева Р.С., Орешкин А.Е. Окисление фенола некоторымиштаммами Bacillus stearothermophilus. //Микробиология. — 1975. -Т.44, N3. -С.47СМ75.

51. Головлева Л.А. Микробные методы деконтаминации почв и грунтовых вод. //Биотехнология. 1992. -N5. - С.60-64.

52. Головлева Л.А., Алиева P.M., Рустемов С.А. Изучение стабильности штамма Pseudomonas aeruginosa DC 13 в условиях биологической очистки промышленнных сточных вод от а-метилстирола. //Микробиология. — 1988. — Т.57, N6. — С. 1044-1045.

53. Головлева Л.А., Воронин A.M., Рустемов С.А. ДеградацияIа-метилстирола и толуола плазмидосодержащими штаммами бактерий рода Pseudomonas. //Изв. АН СССР. Сер.биол. 1988. - N4. - С.558-565.

54. Головлева Л.А., Финкелыптейн З.И., Баскунов Б.П. и др. Микробная детоксикация коксохимического производства. //Микробиология. 1995. — Т.64, N2. — С. 197-200.

55. Горлатов С.Н., Мальцева О.В., Шевченко В.И., Головлева Л.А. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis. //Микробиология. 1989. - Т.58, N5. - С.802-806.

56. Грищенков В.Г., Шкидченко А.Н., Воронин A.M. и др.

57. Биоремедиация почв, загрязненных нефтепродуктами: биопрепараты и технологии. //Современные методы очистки территории от нефтяных загрязнений. Матер, конф. Москва, 1996. - С114-125.

58. Громов Б.В., Павленко Г.Д. Экология бактерий. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1989. — 248с.

59. Грушников О.П., Елкин В.В. Достижения и проблемы химии лигнина. М.: Наука, 1973. - 296с.

60. Гуревич Ю.Л., Теремова М.И. Деградация фенольных соединений непрерывной культурой микроорганизмов. //Микробиология очистки воды: Тез. докл. I Всесоюз. конф., Киев, 7-10 декабря 1982 г. -Киев, 1982. — С. 101102.

61. Давиденко Т.И., Бондаренко Г.И. Использование иммобилизованных в каррагинан микроорганизмов для получения органических веществ. //Успехи химии. 1990а. - Т.59, Вып.З. - С.509-521.г

62. Давиденко Т.И., Бондаренко Г.И. Восстановление нитропроизводных бензойных кислот, фенолов и анилинов клетками E.coli. //Химико-фармацевтический журнал. — 19906. Т.24, N4. - С.54-57.

63. Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Лысак Л.В. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий. М.: Изд-во МГУ, 1989. - 72с.

64. Дрожалина Н.Д., Булгакова Н.А., Горький Ю.И. Получение адсорбентов из горючего сланца. //Горючие сланцы. — 1985. — N2/4. — С.423-427.

65. Дуган И.Н., Головлев Е.Л. Пути катаболизма ароматических4субстратов у родококков. //Микробиология. 1985. -Т.54, N1. - С.128-135.

66. Емельянова И.З. Химико-технический контроль гидролизных производств. М.: Химия, 1976. - 280с.

67. Ефимов В.М., Иоонас Р.Э., Пурре Т.А. Термическая переработка горючих сланцев. //Горючие сланцы. 1987. - N4/4. - С.334-339.

68. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во МГУ, 1987.256с.

69. Илялетдинов А.Н., Алиева P.M. Микробиология и биотехнология очистки промышленных сточных вод. Алма-Ата: Гылым, 1990. - 223с.

70. Имшенецкий А.А., Перова К.З. Активность дрожжей, адаптированных к антисептикам. //Микробиология. — 1954. Т.23, N1. -С.55-56.

71. Карасевич Ю.Н. Экспериментальная адаптация микроорганизмов. -М.: Наука, 1975а.-179с.

72. Карасевич Ю.Н. Параоксибензойная кислота как источник углерода и энергии для дрожжей Candida tropicalis. //Докл. АН СССР. — 19756. — Т.222, N3. — С.723—725.

73. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. - 144с.

74. Карасевич Ю.Н., Ивойлов B.C., Орешкин А.Е., Суровцева Э.Г. Оксигидрохинон промежуточное соединение подготовительного метаболизма параоксибензойной кислоты у дрожжей Candida tropicalis. //Докл. АН СССР. - 1976. - Т.229, N4. - С.735-737.

75. Касак JL, Хейнару A.JI. Генетическая и биохимическая нестабильность штаммов бактерий с плазмидами биодеградации,контролирующими окисление нафталина и салициловой кислоты. //Уч. зап. Тарт. ун-та. 1982. - N624. - С.80-85.

76. Каширский В.Г., Варнакова Г.В. Получение тиофено-ароматического концентрата путем пиролиза сернистых сланцев Поволжья. //Горючие сланцы 1985. N2/3. - С.300-303.

77. Ковалева Н.Г., Ковалев В.Г. Биохимическая очистка сточных вод предприятий химической промышленности. — М.:Химия, 1987. — 160с.

78. Кирсо У.Э., Берновская Н.А., Губергриц М.Я. Реакционная способность фенолов в процессе биохимического окисления в моделях сточных вод. //Химия твердых топлив. 1973, N2. - С. 100-105.

79. Кирсо У.Э., Стом Д.И., Белых Л.И., Ирха Н.И. Превращение канцерогенных и токсических веществ в гидросфере. Таллин.: Валгус, 1988. - С.125-271.

80. Кирстен М.П.Дж., Кафлен М.П. Иммобилизация клеток и ферментов путем включения их в гель. //Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы /Под ред. Дж. Вудворда: Пер. с англ. М.: Мир. 1988. - С.53-64.

81. Ковалева Н.Г., Ковалев В.Г. Биохимическая очистка сточных вод предприятий химической промышленности. М.: Химия, 1987. — 160с.

82. Когановский A.M. Очистка промышленных сточных вод. — Киев.: Техника, 1974.-256с.

83. Коренева А.И., Миронова И.С., Лосикова Л.С. Ферментативное окисление ароматических соединений с разрывом бензольного кольца. //Микробиол. пром-ть. 1977. - N6. - С.11-18.

84. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определенияорганических соединений. -М.: Химия, 1975. 359с.

85. Королев А.А., Кореньков В.Н., Абиндер А.А. и др. О гигиенической эффективности озонирования воды и сточных вод, содержащих нитросоединения.//Гигиенаи санитария.- 1974.- Nil. — С.13-17.

86. Костенко В.Г., Румянцева В.А., Корольков И.И., Саркисова E.JI. Свободные одноатомные фенолы в гидролизном лигнине. //Гидролизн. лесохим. пром-ть. 1984. - N1. - С. 16-17.

87. Костяев В.Я. Некоторые закономерности разрушения фенола вр.Волге и ее притоках. //Влияние фенола на гидробионтов. — JL: Наука, 1973 —i1. С.205-211

88. Кочетков В.В., Старовойтов И.И., Воронин A.M., Скрябин Г.К. Плазмида pBS241 Pseudomonas putida, контролирующая деградацию бифенила. //Докл. Ан СССР. 1982. -Т.266, N1. - С.241-143.

89. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980. - 272с.

90. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и ихприменение. //Промышленная микробиология /Под ред. Е.С. Егорова. М.:

91. Высшая школа. 1989. - С.216-235.1

92. Кощеенко К.А., Суходольская Г.В. Иммобилизованные клетки: трансформация стероидов. //Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы /Под ред.Дж. Вудворда: Пер. с англ. М.: Мир. - 1988. - С.115-153.

93. Кроса Дж., Фалкоу С. Плазмиды. //Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф. Герхардта и др. : Пер. с англ. глава 15. - Часть III. Генетика. -М.: Мир, 1984. -Т.З. - С.128-165.

94. ЮО.Кружалов Б.Д., Голованенко Б.И. Совместное получение фенола и ацетона. М.: Госхимиздат, 1963. — 200с.

95. Лаптева Н.А. Изменение бактериального перифитона при$разрушении фенола в садках. //Влияние фенола на гидробионтов. Л.: Наука, 1973а.-С.167-171.

96. Лилле Ю.Э., Кундель Х.А. Изучение состава водорастворимых фенолов сланцевых смол. //Добыча и переработка горючих сланцев. Труды НИИсланцев. - Л.: Недра, 1967. - Вып. 16. - С. 186-206.

97. Лобачева Л.Ф., Вишняков В.Г. Биохимическое потреблениекислорода сточных вод. //Современные проблемы химии и химическойпромышленности. М., 1975. - вып. II (23). - С.57-94.t

98. Об.Луйга П.О., Паальме Г.П. Охрана окружающей среды при добыче и использовании эстонских горючих сланцев. //Горючие сланцы 1985. N2/2.1. С.206-213.

99. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. — М.: Химия, 1984.-447с.

100. Ю8.Лурье Ю.Ю., Рыбникова А.И. Химический анализ производственных сточных вод. М.: Химия, 1974. - 336с.

101. Ю9.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. — 480с.

102. Методы почвенной микробиологии и биохимии. /Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304с.

103. Ш.Малявина Г.И., Кожевников А.В., Ястребова Н.В. Кокс сланцевой смолы как сорбент коллоидных продуктов коррозии из водного раствора. //Горючие сланцы. 1986. 3/2. - С.200-204.

104. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ.- М.: Мир, 1976.-440с.

105. ПЗ.Минеева Н.М., Лаптева Н.А. Окисление фенола культурами Azotobacter agile и Pseudomonas denitrificans. //Биол. внутр. вод. — Информ. бюл. 1974. -N23. - С. 10-23.

106. Н.Миронова Н.С., Степанова Н.М. Свойства микроорганизма, окисляющего фенол. //Микробиол. пром-ть. Реф. сб. 1974. - вып. II (119). -С.18-19.

107. Могилевич Н.Ф. Иммобилизованные микроорганизмы и очисткавводы. //Микробиол. журнал. 1995 - Т.57, N5. - С.90-105.

108. Пб.Наумов А.В., Суворова- Е.С., Воронин A.M., Зарипова С.К., Наумова Р.П. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобациллами с образованием токсичных гидроксиламинопроизводных. //Микробиология. -1999. -Т.68, N1. -С.56-62.

109. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. -Казань: Изд-во КГУ. 1985. - 240с.

110. Наумова Р.П., Амерханова Н.Н., Белоусова Т.О. Бактериальная восстановительная трансформация ароматических нитросоединений.I

111. Микробиология. 1982. -Т.51, N5. - С.735-739.

112. Наумова Р.П., Амерханова Н.Н., Шайхутдинов В.А. Изучение первого этапа превращения тринитротолуола под действием Pseudomonas denitrificans. //Прикл. биохимия и микробиол. 1973. - Т.15, N1. — С.45-50.

113. Наумова Р.П., Белоусова Т.О., Гилязова P.M. Превращение 2,4,6-тринитротолуола под действием микроорганизмов. //Прикл. биохимия и микробиол. 1982. - Т. 18, N1. - С.85-90.

114. Наумова Р.П., Селивановская С.Ю., Мингатина Ф.А. Изучение возможности глубокой бактериальной деструкции 2,4,6-тринитротолуола. //Микробиология. 1988. - Т.57, N2. - С.218-222.

115. С.Ю., Хисамутдинова Л.Ф. Пути биотрансформации 2,4,6-тринитротолуола. //Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. - N3. - С.448^49.

116. Никифоров М.М. Основные аспекты, организации процесса микробиологической очистки промышленных сточных вод. //Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды: Тез. докл. Всесоюз. конф. Пущино, 1979. - С.29.

117. Никовская Г.Н. Адгезионная иммобилизация микроорганизмов в очистке воды. //Химия и технология воды. 1989. - Т. 11, N2. - С. 158-169.

118. Никовская Г.Н., Гордиенко А.С., Глоба А.И. Сорбциямикроорганизмов волокнистыми материалами в зависимости от заряда клеток и волокон. //Микробиология,. 1986. — Т.55, N4. - С.691-694.

119. Павленко Н.И., Бега З.Г., Изжеурова В.В., Гвоздяк В.Д. Деструкция нефтепродуктов иммобилизованным активным илом. //Микробиологические методы защиты окружающей среды: Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. Пущино, 5-7 апреля 1988.-Пущино, 1988. -С.108-109.

120. Павлова М.Р., Новаковский Е.М., Буравцова Т.А. Биохимическая очистка сточных вод, содержащих ПАВ различных классов, с использованием иммобилизованных микроорганизмов.4

121. Микробиологические методы защиты окружающей среды: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. - С. 109.

122. Панченко Н.П., Дашдиев Р.А., Клименко Н.А. Биоокисление поверхностно-активных веществ, адсорбированных активным углем. //Химия и технология воды. 1980. - Т.2, N3. - С.262-264.

123. Патент 2 048454 РФ Способ очистки сточных вод от органических пероксидов. /Гуменюк А.П., Ильина Н.В., Якубенок Э.Ф., Сухов B.C., Ширина Е.Б. опубл. 20.11.95. Бюл. N32.

124. Петров A.M., Якушева О.И., Наумова Р.П. Биологическая очисткасточных вод нефтехимического производства. //Химия и технология воды. -1992. Т. 14, N3. - С.221-225.

125. Петров A.M., Якушева О.И., Маслов А.П., Наумова Р.П. Моделирование процессов очистки промышленных сточных вод микроорганизмами. //Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия: Тез. докл. Всесоюз. симп. Оренбург, 1991. - С.100.4

126. Поконова Ю.В., Нахина JI.A. Высокоэффективные углеродные адсорбенты из сланцевой смолы. //Горючие сланцы. 1986. - N3/1. — С.101— 105.

127. Попов В.О., Безбородов A.M. Опыт создания промышленной технологии микробиологической очистки газо-воздушных выбросов. //Прикл. биохим. и микробиол. 1999. - Т.35, N5. - С.570-577.

128. Попов А.И., Шупарский А.И., Ерофеева В.И., Артемьев С.В. Вредные выбросы в атмосферу при сжигании поволжских горючих сланцев. //Горючие сланцы. 1986. - N3/2. - С.205-209.4

129. Райнина Е.И., Махлис Т. А., Бачурина Г.П. Определение жизнеспособности иммобилизованных микроорганизмов //Иммобилизованные клетки в биотехнологии. — Сб. науч. трудов. Пущино, 1987. - С.140-149.

130. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука, 1986. - 200с.

131. Рыбникова В.И., Закиева М.И. Очистка фенолсодержащих геотермальных вод иммобилизованными микроорганизмами. //Химия и технология воды. 1990. - Т. 12, N9. - С.857-858.4

132. Саламатова Т.С., Зауралов О.А. Физиология выделения веществ растениями. JL: Изд-во Ленинград, ун-та, 1991. - 152с.

133. Селивановская С.Ю., Петров A.M., Егорова К.В. и др. Формирование иммобилизованного биоценоза, очищающего сточные воды от комплекса ароматических загрязнений. //Химия и технология воды. -1996. Т. 12, N9. - С.328-336.

134. Синицин А.П., Райнина Е.И., Ефремов А.Б. Иммобилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae на алюмоборосиликатных стекловолокнах. //Биотехнология. 1986. - N3. - С.66-69.

135. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. — М.: Изд-во МГУ, 1994. -288с.

136. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов вIорганическом синтезе. М.: Наука. - 1976. - 336с.

137. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Биотехнология защиты окружающей среды. //Изв. АН СССР Сер. биол. 1986. - N6. - С.805-813.

138. Скрябин Г.К., Кочетков В.В., Еремин А.А., Перебитюк А.Н., Старовойтов И.И., Воронин A.M. pBS4 Новая плазмида биодеградации нафталина. //Докл. АН СССР. - 1980. -Т.250, N1. -С.212-215.

139. Смайберт Р., Криг Н. Общая характеристика. //Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф.Герхардта и др. : Пер. с англ. — глава 20. — Часть

140. V. Систематика. М.: Мир, 1984. - Т.З. - С.8-98.

141. Ставская С.С., Удод В.М., Таранова Л. А., Кривец И. А. Микробиологическая очистка воды от поверхностно-активных веществ. -Киев: Наукова думка, 1988. — 184с.

142. Ставская С.С., Никовская Г.Н., Шамолина И.И., Самойленко Л.С., Григорьева Т.Ю., Луста К.А. Разрушение алкилсульфатов культурой Pseudomonas aeruginosa, иммобилизованной на поливинилспиртовом волокне. //Микробиология. 1989. - Т.58, N4. - С.607-610.

143. Строганов Н.С. Химизация и вопросы водной токсикологии. //Зоол.журнал. 1964. - Т43, N12. - С. 1737-1753.t

144. Сумароков В.П., Терентьева В.В. Сточные воды лесохимических предприятий и их очистка. М.: ЦНИЛХИ, 1959. - 28с.

145. Суржко Л.Ф., Финкелыптейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев В.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками. //Микробиология 1995. - Т.64, N3. - С.393-398.

146. Суровцева Э.Г., Васильева Г.К., Вольнова А.И., Баскунов Б.П.0

147. Разрушение монохлоранилинов по мета-пути Alcaligenes faecalis. //Докл. АН СССР. 1980. - Т.254, N1. - С.226-230.

148. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Васильева Г.К., Беляев С.С. Способность к деструкции хлорированных анилинов у некоторых представителей родов Aquaspirillum и Paracoccus. //Микробиология. — 1996. -Т.65, N5. — С.632-638.

149. Трунова О.Н. Биологические факторы самоочищения водоемов и сточных вод. JI.: Наука, 1979. - 109с.

150. Удод В.М. Биосорбционная очистка сточных вод. //Химия иtтехнология воды 1986. - Т.8, N3. — С.66-68.

151. Удод В.М., Ротмистров В.М., Роговская Ц.И. и др. Микроорганизмы, разрушающие пара-нитроанилин. //Микробиология. -1972. Т.41, N2. -С.213-216.

152. Уткин И.Б., Якимов М.М., Васильева Н.В., Козляк Е.И., Рогожин И.С., Безбородов A.M. Сосуществующие системы катаболизма нафталина и метилбензолов Pseudomonas fluorescens 16N2. //Докл. АН СССР. — 1990. — T.311,N5. — С.1251-1254.

153. Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Ильина Н.В., Крестьянинов В.Ю., Воронин С.П. Токсическое действие гидропероксида изопропилбензола на микроорганизмы активного ила. //Химия и технология воды 1993. - Т. 15, N2. - С.151—155.

154. Феофанов Ю.А. Опыт применения и перспективы развития0биофильтров для очистки сточных вод. Киев: Знание, 1984. - 16с.

155. Форстер К.Ф., Джонстон Д.В.М. Аэробные процессы очистки сточных вод. //Экологическая биотехнология. /Под ред. К.Ф. Форстера, Д.А.Дж. Вейза: Пер. с англ. J1. Химия, 1990. - С.7-36.

156. Хамер Г. Непрерывное культивирование бактерий применительнок очистке сточных вод активным илом в аэротенке. //Экологическая биотехнология. /Под ред. К.Ф.Форстера, Д.А.Дж. Вейза: Пер с англ. JL: Химия, 1990. -С.90-116.

157. Ханнус М., Кирсо У., Лээсмент Л. Влияние неорганических примесей на скорость биоокисления фенолов. //Изв. АН ЭстССР. Химия, геология. 1973. - Т.22, N1. - С.82-84.

158. Хейнару А.Л., Кивисаар М., Хабихт Я., Мяэ А., Касак Л. Плазмиды, кодирующие деградацию фенола. //Метабол, плазмиды бактерий: Тез. докл. Всес. конф. Таллин, 19-23 окт. 1982. Таллин, 1982. - С.204-205.I

159. Хрусталева Г.К., Внуков А.В., Старокожева М.В., Самородов А.В., Тростинцева А.А. Характеристика горючих сланцев основных рабочих пластов перспективных месторождений Поволжья. //Горючие сланцы. — 1986. — N3/1.-C.29-40.

160. Шаронова Н.Ф. Очистка сточных вод сланцеперерабатывающих предприятий. //Разработка и использование запасов горючих сланцев. — Таллин, Валгус. 1970. - С.550.

161. Шевченко М.А., Таран П.Н., Гончарук В.В. Очистка природных источных вод от пестицидов. Л.: Химия, 1989. - 183с.t

162. Шендеров Б.А., Серкова Г.П. Простые схемы идентификации неферментирующих грамотрицательных бактерий. //Вопросы биохимии и физиол. микроорганизмов. Изд-во СГУ, Саратов, 1980. - Вып. 8. - С.60-71.

163. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987.567с.

164. Шмидт Л. Очистка от смол фенольных вод газосланцевых заводов. //Горючие сланцы. 1971. - N6. - С.37-39.

165. Экологическая биотехнология. /Под ред. К.Ф. Форстера, Д.А.Дж. Вейза.: Пер. с англ. JL: Химия, 1990. - 384с.

166. Юровская Е.М. Микробиологическая очистка промышленных сточных вод. Киев, Здоровье. — 1984. - 160с.

167. Яковлев С.В., Воронов Ю.В. Биологические фильтры. — М.: Стройиздат, 1982. 287с.

168. Яковлев С.В., Карюхина Т.А. Биохимические процессы в очисткесточных вод. М.: Стройиздат, 1980. - 200с.

169. Яковлев С.В., Скирдов И.В. Проблемы биологической очистки сточных вод. //Биоценоз в природе и промышленных условиях. /Под ред. Г.А. Заварзина, E.JI. Головлева. Пущино, 1987. — С.39-47.

170. Яковлева Г.Ю., Зарипова С.К., Наумова Р.П. Микробная трансформация п-нитрофенола в условиях лимита кислорода. //Новые направления биотехнологии: Тез. докл. VI конф. РФ Пущино, 24-26 мая 1994. -Пущино, 1994.-С.57.

171. Anderson B.N., Ribbons D.W. 4-Methylphthalate utilisation plasmid-encoded functions in soil pseudomonads. //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1980. Washington D.C., 1980. - P. 137.

172. Anselmo A.M., Novais J.M. Isolation and selection of phenoldegrading microorganisms from an industrial effluent. //Biotechnol. Letters. 1984. — V.6, N9. -P.601-606.

173. Anselmo A.M., Cabral J.M.S., Novais J.M. The adsorption of Fusarium flocciferum spores on celite particles and their use in the degradation of phenol. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V.31, N2. - P.200-211.

174. Anselmo A.M., Mateus M., Cabral J.M.S., Novais J.M. Degradation of phenol by immobilized cells of Fusarium flocciferum. //Biotech. Letters. 1985. — V.7, N12. - P.889-894.

175. Antai S.P., Crawford D.L. Degradation of phenol by Streptomyces setonii. //Can. J. Microbiol. 1983. - V.29, N1. - P. 142-143.

176. Arai H., Ohishi Т., Chang M.Y., Kudo Т. Arrangement and regulation of the genes for meta-pathway enzymes required for degradation of phenol in Comamonas testosteroni TA441. //Microbiology 2000. - V.146, Pt.7 - P.1707-1715.

177. Arensdorf J.J., Focht D.D. Formation of chlorocatechol meta cleavage products by a Pseudomonad during metabolism of monochlorobiphenyls. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60, N8. - P.2884-2889.

178. Armenante P.M.; Pal N., Lewandowski G. Role of mycelium and extracellular protein in the biodegradation of 2,4,6-trichlorophenol by Phanerochaete chiysosporium. //Appl. Environ. Microbiol. — 1994. — V.60, N6. — P.1711-1718.

179. Arunakumari A., Mahadevan A. Utilisation of aromatic substances by Pseudomonas solanacearum. //Indian. J. Exp. Biol. 1984. - V.22, N1. - P.32-36.

180. Austen R.A., Dunn N.W. 'Isolation of mutant with altered metabolic control of the NAH plasmid-encoded catechol meta-cleavage pathway. //Austr. J. Biol. Sci. 1977. - V.30, N6. - P.583-592.

181. Baker M.D., Mayfield C.I. Microbial and non-biological decomposition of chlorophenols and phenol in soil. //Water, Air and Soil Pollution. 1980. -V.13, N4. - P.411-424.

182. Balba M.T., Evans W.C. The methanogenic biodegradation of cathechol by a microbial consortium: evidence for the production of phenol through cis-benzenediol. //Biochem. Soc. Trans. 1980. - V.8, N4. - P.452-453.

183. Bausum H.T., Mitchell W.R., Major M.A. Biodegradation of 2,4- and 2,6-dinitrotoluene by freshwater microorganisms. //J. Environ. Sci. Health. 1992.- V.27, N3. — P.663-695.

184. Bayly R.C., Wigmore G.J. Metabolism of phenol and cresols by mutants of Pseudomonas putida. //J. Bacterid.'- 1973. V.l 13, N 3. - P.l 112-1120.

185. Bayly R.C., Wigmore G.J., McKenzie D.I. Regulation of the meta-cleavage pathway of Pseudomonas putida: the regulon is composed of two operons. //J. Gen. Microbiol. 1977. - V. 100. N1. - P.71-79.

186. Bechard G., Bisaillon J.G., Beaudet R., Sylvestre M Degradation of phenol by bacterial consortium under methanogenic conditions. //Can. J. Microbiol. 1990. - V.36, N8. - P.537-578.

187. Benson S., Shapiro J. TOL is a broad-host-range plasmid. //J. Bacteriol.- 1978. V. 135, N1. - P.278-280.

188. Bergey's mannual of determinative bacteriology. 8th ed. Buchanan, Gibbons (eds.). - The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1974. - 1246p.

189. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th ed. Kreig N.R., Holt J.R. (eds.). - The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1994. - 787p.

190. Bestetti G., Galli E. Plasmid coded degradation of ethylbenzene and 1-phenylethanol in Pseudomonas fluorescens. //FEMS Microbiol. Letters. — 1984.- V.21, N2. — P.165-168.

191. Bestetti G., Barbieri P., Galli E. Evidence for catabolic plasmids in fluorescent Pseudomonas degrading styrene and ethylbenzene. //Ann. microbiol. ed. enzimol. — 1981,- V.31 -P.35-42.

192. Bestetti G., Galli E., Benigni C., Orsini F., Pelizzoni D. Biotransformation of styrenes by a Pseudomonas putida. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V.30, N3. - P.252-256.

193. Bettmann H., Rehm H.-J. Degradation of phenol by polymer entrapped microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984. - V.20, N5. - P.285-290.

194. Bettmann H., Rehm H.-J. Continuous degradation of phenol(s) by Pseudomonas putida P8 entrapped in polyacrylamide-hydrazide. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. - V.22, N6. - P.389-393.

195. Bettmann H., Ehrhardt H.M., Rehm H.-J. Degradation of phenol by immobilized microorganisms. //3 Eur. Congr. Biotechnol., Munchen, Sept. 10-14, 1984. Weinheim, 1984. - V.3. - P.27-33.

196. Beveridge E.G., Tall D. The metabolic availability of phenol analogues to Bacterium NCIB8250. //J. Appl. B^cteriol. 1969. - V. 32, N3. - P. 304-311.

197. Biological degradation and bioremediation of toxic chemicals. — (G.R.Chaudhry ed.). Dioscorides Press, Oregon, USA, 1994. - 515p.

198. Bioremediation of contaminated soils (D.L.Wise et al. eds.) — Marcel Dekker Inc., New York, 2000. 903p.

199. Black G.M. Characteristics and performance of immobilised cell reactors //Process engineers aspects of immobilized cell system. /Webb C., Black G.M., Atkinson B. (eds.) Rudby: Institution Cmemical Engineers Publications. — 1986. -P.75-86.

200. В1аке C.K., Hegeman G.D: Plasmid pCBl carriers genes for anaerobic benzoate catabollism in Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans PN-1. //J. Bacteriol. 1987. - V.169, N12. - P.4878-4883.

201. Bochner B.R., Savageau M.A. Generalized indicator plate for genetic, metabolic and taxonomic studies with'microorganisms. //Appl. Environ. Microbiol.- 1977. V. 33, N2. - P.434-444.

202. Boldrin В.; Tiehm A.; Fritzsche C. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoranthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V59, N6. - P.l 927-1930.

203. Boyd S.A., Shelton D.R., Beny D., Tiedje J.M. Anaerobic biodegradation in digested sludge. //Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V.46, N1.1. P.50-54.

204. Bringmann G., Kuhn R. Biologischer Abbau von Nitrotoluolen und Nitrobenzolen mittels Azotobacter agilis. //Gesundh. Ind. 1971. - Bd.92, N9. -S.273-276.

205. Brodelius P. Immobilized microbial cells and plant cells: techniques and application //Biotech'85 (Europe) Online Publication. 1985. - P. 573-585.

206. Bruhn C., Lenke H., Knackmuss H.J. Nitrosubstituted aromatic compounds as nitrogen source for bacteria. //Appl. Environ. Microbiol. 1987. -V.53, N1. - P.208-210.

207. Brunsbach F.R., Reineke W. Degradation of chlorobenzenes in soil slurry by a specialized organism. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. — V.42, N2-3. - P.415—420.

208. Bucke C. Methods in immobilizing cells //Process engineers aspects of immobilized cell system. /Webb C., Black G.M., Atkinson B. (eds). Rudby: Institution Chemical Engineers Publications 1986. - P.20-34.

209. Buswell J.A. Metabolism of phenol and cresols by Bacillus stearothermophilus. //J. Bacteriol. 1975. - V.124, N3. - P.l077-1083.

210. Buswell J.A, Twomey D.G. Utilization of phenol and cresols by Bacillus stearothermophilus, strain PH24. //J. Gen. Microbiol. 1975. - V.87, N2. -P.377-379.

211. Byrnes M.E. Field sampling methods for remedial investigations. -Lewis Publishers Boca Raton, Fl., USA, 1994. 272p.

212. Cacciari E. Biotecnologia anaerobica per if trattamento delle acgue di scarico. /ЛСР. 1990. - V.l 8, N4. - P.59-65.

213. Cain R.B. Induction of an anthranilate oxidation system during the metabolism of ortho-nitrobenzoate by certain bacteria. //J. Gen. Microbiol. — 1966a. V.42, N2. - P. 197-217.

214. Cain R.B. Utilisation of anthranilic and nitrobenzoic acids by Nocardia opaca and Flavobacterium. //J. Gen. Mycrobiol. 1966b. - V.42, N2. - P.219-235.

215. Cain R.B. Xenobiotics breakdown by mixed cultures. //Biochem. Soc. Trans. 1984. - V. 12, N6. - P. 1146-1148.

216. Cartwright N.J., Cain R.B. Bacterial degradation of nitrobenzoic acids. //Biochem. J. 1959a. - V.71, N2. - P.248-261.

217. Cartwright N.J., Cain R.B. Bacterial degradation of nitrobenzoic acids. 2.Reduction of the nitrogroups. //Biochem. J. 1959b. - V.73, N2. - P.305-314.

218. Castillo F.R.B. Characterization of a nitrophenol reductase from the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus El Fl. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N6. - P.1774-1778.

219. Castillo- F.R.B., Roldan M.D., Caballero F.J. Bacterial degradation of nitrophenols. //6th European Congr. Biotechnology (ECB6), Firenze, Italy, June 13-17, 1993. Firenze, 1993. - Abstrs. Books, V.4. - TH096.

220. Cerniglia C.E. Aromatic hydrocarbons: metabolism by bacteria, fungi and algae. //Rev. Biochem. Toxicol. New-York, e.a. - 1981. - V.3, N2. - P.321-361.

221. Chakrabarty A.M. Genetic-basis of the biodegradation of salicylate in Pseudomonas. //J. Bacteriol. 1972. - V.l 12, N2. - P.815-823.

222. Chakrabarty A.M. Genetic engineering applied aspects. //Indian J. Microbiol. - 1980. - V.20, N1. - P. 103-108.

223. Chakrabarty A.M., Brown J.F. Microbiol genetic engineering by natural plasmid transfer. Some representative benefits and biohazards. //Genet. Eng. -Boca Raton, FL, USA, 1979. Chapter 10. - P.l85-193.

224. Chatterjee D.K., Chakrabarty A.M. Genetic homology between independently isolated chlorobenzoate degradative plasmids. //J. Bacteriol. 1983. — V.153, N1. — P.532-534.

225. Chatterjee D.K., Furukawa K., Chakrabarty A.M. Interaction of plasmids in the total degradation of synthetic environmental pollutants. //Indian Biol. 1981. - V.13, N1-2. - P.l-11.

226. Chatterjee D.K., Kellogg S.T., Hamada S., Chakrabarty A.M. Plasmid specifying total degradation of 3-chlorobenzoate by a modified ortho pathway. //J. Bacteriol. 1981 - V.146, N2. - P.639-646.

227. Chun G.-T., Agathos S.N. Immobilization of Tolypocladium inflatum spores into celite beads for cyclosporine prodaction. //J. Biotechnol. — 1989. — V.9, N4. -P.237-253.

228. Collins L.D., Daugulis A.J. Characterization and optimization of a two-phase partitioning bioreactor for the biodegradation of phenol. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V.48, N1. - P. 18-22.

229. Connors M.A., Barnsley E.A. Naphthalene plasmids in Pseudomonas. //J. Bacteriol. 1982. - V.149, N3. - P.1096-1101.

230. Cook A.M., Grossenbacher H., Hutter R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. //Experientia. 1983. — V.39, N11. — P.l 191-1198.

231. Cripps R.E. Microbial metabolism of acetophenone. Metabolism of acetophenone and some chloroacetophenones by an Arthrobacter species. //Biochem. J. 1975. - V.152, N2. - P.23 3-241.

232. Cripps R.E., Trudgill P.V., Whateley J.G. The metabolism of 1-phenylethanol and acetophenone by Nocardia T5 and an Arthrobacter species. //Eur. J. Biochem. 1978. - V.86, N1. - P. 175-186.

233. Currier T.C., Nester E.W. Isolation of covalently closed circular DNA of high molecular weight from bacteria. //Anal. Biochem. 1976. - V.76, N2. -P.431-441.

234. Czekalowski J.W., Skarzynski B. The breakdown of phenols and related compounds by bacteria. //J. Gen. Microbiol. 1948. - V.2, N3. - P.231-238.

235. Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms. //Adv. Microb. Physiol. 1971. - V.6* N1. -P.l-46.

236. Dagley S., Evans W.C., Ribbons D.W. New pathways in the oxidative metabolism of aromatic compounds by microorganisms. //Nature (London) — 1960. V. 188, N4750. - P.560-566.

237. Darby J.M., Taylor D.G., Hopper D.J. Hydroquinone as the ringfission substrate in the catabolism of 4-ethylphenol and 4-hydroxyacetophenone by Pseudomonas putida JD1. //J. Gen. Microbiol. 1987. - V.133, N11. - P.2137-2146.

238. Davey B.B., Turner M. Some phenol decomposing strains of Pseudomonas. //J. Appl. Bacteriol. L961. - V.24, N1. - P.78-82.

239. Davey J.F., Gibson D.T. Bacterial metabolism of para- and meta-xylene: oxidation of a methyl substituent. //J. Bacteriol. 1974 - V.l 19, N3. - P.923-929.

240. Davis E.M., Murray H.E., Liehr J.G., Powers E.L. Basic microbial degradation rates and chemical byproducts of selected organic compounds. //Water Res. 1981. - V.15, N9. - P.l 125-1127.

241. Davis R.W., Simon M., Davidson N. Electron microscope heteroduplex methods for mapping regions of base siquence homology in nucleic acids. //Methods in enzymology (Grossman L., Moldav K., eds.). N.-Y. Acad. Press, 1971. - V.21. — P.413-428.

242. Daughton C.G., Hsieh D.P. Paration utilization by bacterial symbionts in a chemostat. //Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V.34, N2. - P. 175-184.

243. Daugulis A.J., Krug T.A., Choma C.E.T. Filament formation and ethanol production by Zymomonas mobilis in adsorbed cell bioreators. //Biotechnol. Bioeng. 1985. - V.27,-N5. - P.626-631.

244. Denac M., Dunn I.J. Paced- and fluidized-bed biofilm reactor performance for anaerobic wastewater treatment. //Biotechnol. Bioeng. 1988. -V.32, N2. — P. 159-174.

245. Dervakos G.A., Webb C. Building a database to take a critical look at immobilized cell fermentation technology for improved research strategy development. //Trends Biotechnol. 1988. - V.6, N2. - P.29-32.

246. Dey Sabita, Godbole S.H. Biotransformation of m-dinitrobenzene by Candida pulcherrima. //Indian J. Exp. Biol. 1986. - V.24, N1. - P.29-33.

247. Dickel O., Knackmuss H.J. Catabolism of 1,3-dinitrobenzene by Rhodococcus sp. QT-1. //Arch. Microbiol. 1991. - V.l57, N1. - P.76-79.

248. DiGeronimo M.J., Nikaido M., Alexander M. Utilization of chlorobenzoates by microbial populations in sewage. //Appl. Environ. Microbiol. — 1979. V.37, N1. - P.619-625.

249. Dimkov R., Topalova Y. Bacterial detoxication of nitrophenols by pure and binari culture. //6th Eur. Congr. Biotechnology (ECB6). Firenze, Italy, June 13-17, 1993.-Firenze, 1993.-Abstrs. Books, V.4.-TH103.

250. Don R.H., Pemberton J.M. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes .paradoxus and Alcaligenes eutrophus. //J. Bacteriol. 1981 - V.l45, N2. - P.681-686.

251. Dorn E., Hellwig M., Reineke W., Knackmuss H.-J. Isolation and characterization of a 3-chlorobenzoate degrading pseudomonad. //Arch. Microbiol. 1974. - V.99, N1. -P.61-70.

252. Downing R., Broda P. A. Cleavage map of the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt2. //Molec. Gen. Genet. 1979. - V. 177, N1. - P. 189-191.

253. D'Souza S.F., Melo J.S. Immobilization of yeast cells by adhesion to glass surface using polyethylenimine. //Biothechnol. Letters. — 1986. V.8, N9. -P.645-648.

254. Duggleby C.J., Bayley S.A., Worsey M.J., Williams P.A., Broda P. Molecular sizes and relationships of TOL plasmids in Pseudomonas. //J. Bacteriol. 1977. - V.130, N3. - P.1274-1280.

255. Dunn N.W., Gunsalus I.C. A transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida. //J. Bacteriol. 1973. — V.l 14, N3. - P.974-979.

256. Durham N.N. Studies on the metabolism of p-nitrobenzoic acids. //Canad. J. Microbiol. 1958. - V.4, N2. - P.141-148.

257. Dwyer D.F., Krumme M.L., Boyd S.A., Tiedje J.M. Kinetics of phenol biodegradation by an immobilized methanogenic consortium. //Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V.52, N2. - P.345-351.

258. Eaton R.W., Ribbons D.W. Plasmid encoded degradation of aromatic acids by Micrococcus strain 12B. //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1980. Washington D.C., 1980. - P. 137.

259. Eaton R.W., Ribbons D.W. Metabolism of dibutylphthalate and phthalate by Micrococcus strain 12B. //J. Bacteriol. 1982. - V.151, N1. -P.48-57.

260. Ehrhardt H.M., Rehm H.-J. Phenol degradation by microorganisms adsorbed on activated carbon. //Appl. Biochem. Biotechnol. 1985. - V.21, N.l-2. -P.32-36.

261. Ehrhardt H.M., Rehm H.-J. Semicontinuous and continuous degradation of phenol by Pseudomonas putida P8 adsorbed on activated carbon. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V.30, N3. - P.312-317.

262. E1-Aassar S.A., Omar S.H., Rehm H.-J. Oxidation of n-tetradecane by Candida parapsilosis KSh 21 adsorbed on different glass rings. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. - V.29, N5. - P.442-446.

263. Etzensperger M., Thoma S., Petrozzi S., Dunn I.S. Phenol degradationin a three-phase biofilm fluidized sand bed reactor. //Bioprocess. Eng. — 1989. — V.4, N4. P. 175-181.

264. Evans W.C. Oxidation of phenol and benzoic acid by some soil bacteria. //Biochem. J. 1947. - V.41, N3. - P.373-382.

265. Evans W.C. Biochemistry of the oxidative metabolism of aromatic compounds by microorganisms. //Ann. Rept. Chem. Soc. — London, 1956. — V.53. P.279—294.

266. Evans W.C. The microbiological degradation of aromatic compounds. //J. Gen. Microbiol. 1963. - V.32, N2. - P. 177-184.

267. Farrel R., Gunsalus I.C., Crawford I.P. Johnston J.B., Ito J. Restriction endonucleases sites and aromatic metabolic plasmid structure. //Biochem. Biophys.• Res. Commun. 1978. - V.82, N2. - P.411-416.

268. Fava F., Armenante P.M., Kafkewitz D. Aerobic degradation and dechlorination of 2-chlorophenol, 3-chlorophenol and 4-chlorophenol by a Pseudomonas pickettii strain. //Letters Appl. Microbiol. 1995. - V.21, N5. -P.307-312

269. Feist C.F., Hegeman G.D. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida: regulation of tangential pathways. //J. Bacteriol. — 1969a. -V. 100, N2. — P.869-877.

270. Feist C.F., Hegeman G.D. Regulation of the meta-cleavage pathway for # benzoate oxidation by Pseudomonas putida. //J. Bacteriol. 1969b. - V. 100, N2.1. P.l 121-1123.

271. Fisher P.R., Appleton J., Pemberton J.M. Isolation and characterization of the pesticide-degrading plasmid pJPl from Alcaligenes paradoxus. //J. Bacteriol. 1978. - V.l35, N3. - P.798-804.

272. Flathman P.E., Jerger D.E., Exner J.H. Bioremediation. Lewis Publishers, Boca Raton, Fl., USA, 1994. - 560p.m

273. Focht D., Searles D., Koh S-Ch. Genetic exchange in soil introduced

274. Ф chlorobenzoate degraders and indigenous biphenyl degraders. //Appl. Environ.

275. Microbiol. 1996. - V.62, N10. - P.3910-3913.0

276. Franklin F.C.H., Lehrbach P.R., Lurz R., Rueckert В., Bagdasarian M., Timmis K.N. Localization and functional analysis of transposon mutations in regulatory genes of the TOL catabolic pathway. //J. Bacteriol. 1983. — V.154, N2. — P.676-685.4

277. Ф 287.Friello D.A., Mylroie J.R., Chakrabarty A.M. Use of geneticallyengineered multi-plasmid microorganisms for rapid degradation of fuel hydrocarbons. //Proc. 3rd Int. Biodegrad. Symp., Kingston, R.I., 1975. — London, 1976. -P.205-214.

278. Friello D.A., Mylroie J.R., Gibson D.T., Rogers J.E., Chakrabarty A.M. XYL, a nonconjugative xylene degradative plasmid in Pseudomonas Pxy. //J. Bacteriol. 1976. - V. 127, N3. - P.l217-1224.

279. Fujii Т., Takeo M., Maeda Y. Plasmid-encoded genes specifying aniline oxidation from Acinetobacter sp. strain YAA. //Microbiology. — 1997. — V.143,0 N1. -P.93-99.

280. Fulthorpe R., Wyhdham R. Transfer and expression of the catabolic plasmid pBRC60 in wild bacterial recipients in a fresh ecosystem. //Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V.57, N5. - P. 1546-1553.

281. Furukawa K., Chakrabarty A.M. Involvement of plasmids in total degradation of chlorinated biphenyls. //Appl. Environ. Microbiol. 1982. — V.44, N3. -P.619-626.

282. Furukawa К., Matsumura F., Tonomura K. Alcaligenes and Acinetobacter strains capable of degrading polychlorinated biphenyls. //Agr. Biol.

283. Gaal A., Neujahr H. Metabolism of phenol and resorcinol in Trichosporon cutaneum. //J. Bacteriol. 1979. - V.137, N1. - P.13-21.

284. Gerardi M.H. Bacteria for wastewater treatment plants. //Public Works. 1982. - V. 113, N12. - P.37-38.

285. Germanier R., Wuhrmann K. Uber den aeroben microbiellen abbau aromatischer nitroverbindungen. //Path. Microbiol. — 1963. — V.26, N5. — P.569— 578.

286. Ghadi S.C., Sangodkar U.M. Identification of a meta-cleavage pathway for metabolism of phenoxyacetic acid and phenol in Pseudomonas cepacia AC1100. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V.204, N2. - P.983-993.

287. Ghisalba O. Chemical wastes and their biodegradation, an overview. //Experientia. -1983. -V.39, N11. P.1247-1257.

288. Gibson D.T. Microbial degradation of aromatic compounds. //Science. — 1968. V. 161, N3846. - P. 1093-1097.

289. Gibson D.T. Assay of enzymes of aromatic metabolism. //Methods in

290. Microbiology. Academic Press, London, 1971. - V.6a. -P.463^177.

291. Grady C.P.L. Biodegradation: its measurment and microbial basis. //Biotechnol. Bioeng. 1985. - V.27, N5. - P.660-674.

292. Grund A.D., Gunsalus I.C. Cloning of genes for naphthalene metabolism in Pseudomonas putida. //J. Bacteriol. 1983. - V.156, N1. - P.89-94.

293. Grundmann R., Rehm H.-J. Biodegradation of some phenols with microorganisms adsorbed on activated carbon + alginate phenol degradation, cresol degradation and dimethylphenol degradation by Pseudomonas putida and

294. Cryptococcus elinovii on a support. //DECHEMA Biotechnol. Conf. (1988) 5th ф Meet. Munchen, 1988. — V.l. -P.415-417.

295. Gundersen K., Jensen H.L. A soil bacterium decomposing aromatic nitrocompounds. //Acta Agric. Scand. 1956. - V.6. - P. 100-114.

296. Hackel U., Klein J., Megnet R., Wagner F. Immobilisation of microbial cells in polymeric matrices. //Eur. J. Appl. Microbiol. 1975. -V.l, N4. - P.291-293.

297. Haggblom M. Microbial breakdown of halogenated aromatic pesticides • and related compounds. //FEMS Microbiol. Rev. 1992. - V.l 03, N1. - P.29-72.

298. Haggblom M., Janke D., Salkinoja-Salonen M.S.Transformation of chlorinated phenolic compounds in the genus Rhodococcus. //Microb. Ecol. — 1989.-V.18, N1.-147-159.

299. Haggblom M., Janke D.,. Middeldorp P., Salkinoja-Salonen M.S. O-methylation of chlorinated phenols in genus Rhodococcus. //Arch. Microbiol. -1989. V.152, N1. -P.6-9.

300. Haggblom M.M., Rivera M.D., Young L.Y. Influence of alternative electron acceptors on the anaerobic biodegradability of chlorinated phenols andbenzoic acids. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N4. - P. 1162-1167.

301. Haigler B.E., Spain J.C. Biotransformation of nitrobenzene by bacteria containing toluene degradative pathways. //Appl. Environ Mycrobiol. 1991. — V.57, N11. - P.3156-3162.

302. Haigler B.E.; Spain J.C. Biodegradation of 4-nitrotoluene by Pseudomonas sp. strain 4NT. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N7. -P.2239-2243.m

303. Halama D., Augustin J. Degradation of aromatic hydrocarbons and derivatives by microorganisms. I. Metabolic pattern of a new isolated bacterial strain Pseudomonas putida. //Biologia (CSSR). 1980. - V.35, N12. - P.889-896.

304. Hale D.D., Reineke W., Wiegel J. Chlorophenol degradation. //Biological degradation and bioremediation of toxic chemicals (Chaudhry G.R. ed.) Dioscorides Press, USA, 1994. - Chapter 4. - P.74-91.

305. Hallas L., Alexander M. Microbial transformation of nitroaromatic compounds in sewade effluent. //Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V.45, N4. — P. 1234-1241.

306. Haller H.D., Finn R.K. Kinetic of biodegradation of p-nitrobenzoate and inhibition by benzoate in a Pseudomonas. //Appl. Environ. Microbiol. — 1978. V.35, N5. — P.890-896.

307. Hamd Y.A., Tewfik M.S. Degradation of 3,5-dinitro-o-cresol by Rhizobium and Azotobacter spp. //Soil. Biol. Biochem. 1970. - V.2, N3. — P. 163-166.

308. Hamoda M.F., Al-Haddad A.A., Abot-El-Bary M.F. Treatment of phenolic wastes in an aerated submerged fixed-film (ASFF) bioreactor. //J. Biotechnol. 1987. - V.5, N4. - P.279-292.

309. Hanne L.F.; Kirk L.L; Appel S.M.; Narayan A.D.; Bains K.K. Degradation and induction specificity in actinomycetes that degrade p-nitrophenol. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N10. - P.3505-3508.

310. Haribabu В., Kamath A.V.,'Vaidyanathan C.S. Microbial degradation of substituted benzoic acids. //J. Ind. Inst. Sci. 1984. - V.65 (С). - P.69-107.

311. Harms H.; Zehnder A.J. Influence of substrate diffusion on degradation ф of dibenzofuran and 3-chlorodibenzofuran by attached and suspended bacteria.

312. Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60, N8. - P.2736-2745.

313. Harris G., Ricketts R.W. Metabolism of phenolic compounds by yeasts. //Nature, London. 1962. - V.195, N4840. - P.473-474.

314. Harayma S., Rekik M. The meta cleavage operon of TOL degradative plasmid pWWO comprises 13 genes. //Mol. Gen. Genet. 1990. - V.221, N1. -P.l 13-120.

315. Hasegawa S., Vandercook C.E., Choi G.Y., Herman Z., Ou P. Limonoid debittering of citrus juice sera by immobilized cells Corynebacterium fascians. //J. Food Science 1991. - V.50, N2. - P.330-332.

316. Havel J., Reineke W. Microbial degradation of chlorinated • acetophenones. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N8. P.2706-2712.

317. Healy J.BJr., Young L.Y. Catechol and phenol degradation by a methanogenic population of bacteria. //Appl. Environ. Microbiol. — 1978. — V.35, N1. -P.216—218.

318. Heesche-Wagner K., Schwarz Т., Kaufmann M. Phenol degradation by an enterobacterium: a Klebsiella strain carries a TOL-like plasmid and a gene encoding a novel phenol hydroxylase. //Can. J. Microbiol. 1999. - V.45, N2. -P.l 62-171.

319. Heitkamp M.A., Camel V., Reuter Т., Adams W.J. Biodegradation of # p-nitrophenol in an aqueous waste stream by immobilized bacteria. //Appl.

320. Environ. Microbiol. 1990. - V.56, N10. - P. 2967-2973.

321. Hendrie M.S., Shewan J.M. The identification of Pseudomonas. //Identif. Methods Microbiol. London e.a., 1979. - P. 1-14.

322. Herrmann H., Janke D., Kreiza S., Kunze I. Involvement of plasmid pPGHl in the phenol degradation of Pseudomonas putida strain H. //FEMS Microbiol. Letters. 1987. -V.43, N1. - P. 133-136.m

323. Неггшапп Н., Muller С., Schmidt I., Mahnke J., Petruschka L., Hahnke

324. K. Localization and organization of phenol degradation genes of Pseudomonasiputida strain H. //Mol. Gen. Genet. 1995. - V.247, N2. - P.240-246.

325. Hess T.F., Schmidt S.K., Silverstein J. et al. Supplemental substrate enhancement of 2,4-dinitrophenol mineralization by a bacterial consortium. //Appl. Environ. Microbiol.- 1990.-V.56, N6.-P.1551-1558.

326. Hewetson L., Dunn H.M., Dunn N.W. Evidence for a transmissible catabolic plasmid in Pseudomonas putida encoding the degradation of p-cresol via the protocatechuate ortho-cleavage pathway. //Genet. Res. 1978. - V.32, N3. -P.249-255.

327. Hinteregger C., Loidl M., Streichesbier F. Pseudomonas acidovorans: atbacterium capable of mineralizing 2-chloroaniline. //J. Basic Microbiol. — 1994 -V.34, N2. P.77-85.

328. Hirata A., Hosaka Y., Umeszawa H. Biological treatment of water and wastewater in three-phase fluidised-bed bioreactor. //World Congr. Ill Chem. Eng., Tokyo, Sept. 21-25, 1986, Tokyo, 1986. - V.3, S.l. - P.556-559.

329. Hoffman K.H., Kruger A.K. Induction and inactivation of phenol hydrolase and catechol oxigenase in Candida maltosa L4 in dependence on the carbon source. //J. Basic Microbiol. 1985. - V.25, N6. - P.373-379.

330. Hogrefe W., Grossenbacher H., Cook A.M. Biotreatment of s-triasinetcontaining wastewater in a fluidized bed reactor. //Biotechnol. Bioeng. — 1986. -V.27,N10. — P.1577-1581.

331. Holladay D.W., Huncher C.W., Scott C.D., Chilcote D.D. Biodegradation of phenolic waste liquors in stirred-tank, packed-bed and fluidized-bed bioreactors //J. Water Pollut. Control Fed. 1978. - V.50, N11. - P.2573-2589.

332. Hollender J., Dott W., Hopp J. Regulation of chloro- and methylphenol degradation in Comamonas testosteroni JH5. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V.60, N7. — P.2330-2338.

333. Hughes E.J.L., Bayly R.C. Control of catechol meta-cleavage pathway 0 in Alcaligenes eutrophus. //J. Bacteriol. 1983. - V.154, N3. - P.1363-1370.

334. Hu Lin Z., Shieh W.K. Anoxic biofilm degradation of monocyclic aromatic compounds. //Biotechnol. Bioeng. 1987. - V.30, N9. - P.l077-1083.

335. Ichijo H., Nagasawa J., Yamashi A. Immobilization of biocatalists with poly (vinyl alcogol) supports. //J. Biotechnol. 1990. - V.l4, N2. - P. 169-179.

336. Inouye S., Nakazawa A., Nakazawa T. Molecular cloning of TOL genes xylB and xylE in Escherichia coli. //J. Bacteriol. 1981. - V.145, N3. -P.l 137-1143.

337. Jayasankar N.P., Bhat J.V. Mode of attack on phenol by a Micrococcus sp. isolated from coir rets. //Can. J. Microbiol. 1966. - V.12, N5. - P.1031-1039.

338. Johnson B.F., Stanier R.Y. Regulation of the р-ketoadipate pathway in Alcaligenes eutrophus. //J. Bacteriol. 1971b. - V.107, N2. - P.476-485.

339. Jones G.L., Jansen F., McKay A.J. Substrate inhibition of the growth of Bacterium ncib 8250 by phenol. //J. Gen. Microbiol. 1973. -V.74, N1. - P. 139148.

340. Kachy A.N., Modi V.V. Catechol metabolism in Pseudomonas aeruginosa: regulation of meta-fission pathway. //Indian J. Exp. Biol. — 1976. — V.14, N2. — P.163-165.

341. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. //J. Bacteriol. 1981. - V.145, N3. - P. 1365-1373.

342. Karns J.S., Duttagupta S., Chakrabarty A.M. Regulation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid and chrophenol metabolism in Pseudomonas cepacia AC 1100. //Appl Environ. Microbiol. 1983. - V.46, N5. - P. 1182-1186.

343. Karube I., Kuriyama S., Matsunaga Т., Susuki S. Methane production from wastewater by immobilized methanogenic bacteria. //Biotechnol. Bioeng. — 1980. V.22, N4. - P.847-857.

344. Kastner M., Breuer M., Mahro E. Isolation and characterization of polyaromatichydrocarbon (PAH) degrading microorganisms. //Forum Microbiol. — 1990.-V.13, N1-2.-P.79.

345. Katulova H., Linko Y-Y. Fumaric acid production from xylose by immobilized Rhizopus arrhizus cells. //Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1989. — V.31, N5/6. — P.448-452.

346. Kelley I.; Freeman J.P., Evans F.E., Cerniglia C.E. Identification of metabolites from the degradation of fluoranthene by Mycobacterium sp. strain PYR-1. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N3. - P.800-806.

347. Kellogg S.T., Chatterjee 'D.K., Chakrabarty A.M. Plasmid-assisted molecular breeding: new technique for enhanced biodegradation of persistent toxic chemicals. //Science. 1981. - V.214, N4525. - P.l 133-1135.

348. Kemp M.B., Hegeman G.D. Genetic control of the p-ketoadipate pathway in Pseudomonas aeruginosa. //J. Bacteriol. 1968. - V.96, N5. - P. 14881499.

349. Keweloh H., Heipieper H.H., Rehm H.-J. Protection of bacteria against toxicity of phenol by immobilization in calcium alginate. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V.31, N4. - P.383-390.

350. Ке Yang-Hsien, Gee Lynn L., Durham N.N. Mechanism involved in the metabolism of nitrophenylcarboxylic acid compounds by microorganism. //J. Bacteriol. 1959. - V.77, N5. - P.593-598.

351. Khamma P., Balajee S., Jothikumar N., Manivannam Т., Mahadevan A.

352. Dissimilatory versatility of Pseudomonas pseudoalcaligenes. //All-Indian Seminar on microbial degradation of aromatic compounds: University of Madras, March 27-28, 1991.-Madras, 1991.-P.7.

353. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T., Chakrabarty A.M. Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia. //Appl Environ. Microbiol. 1982. - V.44, N1. - P.72-78.

354. Kirsch E.J., Etzel J.E. Microbial decomposition of pentachlorophenol. //J. WPCF 1973. - V.45, N2. - P.359-364.

355. Kirso U. Structure-activity relationships of phenols in microbial oxidation //Oxid. commun. 1985/86*. - V.8. - P.87-106.

356. Kiyohara H., Nagao K., Yano K. Plasmid involvement in bacterial degradation of phenantrene. //Adv. Biotechnol. 1981. - V. 1. - P. 161-166.

357. Kiyohara H., Sugiyama M., Mondello F.J., Gibson D.T., Yano K. Plasmid involvement in the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a Beijerinckia species. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. - V.l 11, N3. -P.939-945.

358. Klages U., Lingens F. Degradation of 4-chlorobenzoic acid by a Pseudomonas sp. //Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. С 1980. -Nl. -P.215-223.

359. Klein J., Wagner F. Methods for the immobilization of microbial cells //Appl. Biochem. Bioeng. (Winard L.B., Goldstein L., Katcholski-Katrir E. eds.)

360. V.4 Immobilized microbial cells /Edited by I.Chibata, L.B.Winard. New-York : Ф Academic Press, 1983. - P.l2-51.

361. Kloosterman J., Lilly M.D. An airlift loop reactor for the transformationof steroids by immobilized cells. //Biotech. Letters 1985. -V.7, N1. - P.25-30.i

362. Kojima Y., Itada N., Hayaishi O. Metapyrocatechase: a new catechol-cleaving enzyme. J. Biol. Chem. - 1961. - V.236, N8. - P.2223-2228.

363. Kojima Y., Fujisawa N., Nakazawa A., Kanetsuna F., Taniuchi N., Nozaki M., Hayaishi O. Studies on pyrocatechase. I.Purification and spectral properties. //J. Biol. Chem. 1967. - V.242, N14. - P.3270-3278.

364. Korzhenevich V.I. The usage of agar entrapped bacterial cells inphenolic wastewater treatment bioreactor. //Proc. ENVIROTECH VIENNA 1992,

365. April 22-24, 1992, Vienna, Austria. 1992, ISEP. - P.802-806.

366. Korzhenevich V.I., Feodorov A.Yu. Aerobic microbial degradation oftaromatic compounds — a review of investigations performed in the former Soviet Union. //Biodeterioration Abstracts. -1994. V.8, N4. - P.255-267.

367. Kramer N., Doetsch R.N. The growth of phenol-utilizing bacteria on aromatic carbon sources. //Arch. Biochem. 1950. - V.26, N3. - P.401^05.

368. Krumme M.L., Boyd S.A. Reductive dechlorination of chlorinated phenols in anaerobic upflow bioreactor. //Water Res. 1988. - N.22. - P. 171-177.

369. Krug M., Ziegler H., Straube G. Degradation of phenolic compounds bythe yeast Candida tropicalis HP15. I.Physiology of growth and substrate• utilization. //J. Basic Microbiol. 1985. - V.25, N2. - P. 103-110.t

370. Krzemieniewski M. Electrobiological wastewater treatment. //Biological Wastes. 1989.-N.28.-P.127-132.

371. Kuenen J.G. The role of specialists and generalists in microbial population interactions. //Found. Biochem. Eng.: Kinet. Thermodyn. Biol. Syst., Winter Symp. ACS Div. Ind. Eng. Chem. Washington, 1983. - P.229-251.

372. Kunz D.A., Chapman P.J. Catabolism of pseudocumene and 3-ethyltoluene by Pseudomonas putida (arvilla) mt-2: evidence for new function

373. Щ of the TOL (pWWO) plasmid. //J. Bacteriol. 1981. - V. 146, N1. - P. 179-191.

374. Kumar P.K.R., Schugerl К. Immobilization of genetically engineering cells: a new strategy for higher stability. //J. Biotechnol. 1990. - V.14, N.3. -P.255-273.

375. Kuritz Т., Wolk C.P. Use of filamentous cyanobacteria for biodegradation of organic pollutants. //Appl. Environ. Microbiol. 1995. — V.61, N1. -P.234—238.

376. Larbig G., Rehm H.-J. Degradation of 1-naphtol by immobilized bacteria — 1-naphtol degradation by Aurobacterium sp. on a PAAH-calcium alginate bead support. //DECHEMA Biotechnol. Conf.; Meet., Munchen, 1988. -Munchen, 1988.-V.l. -P.419—424.

377. Lee Y.H., Lee C.W., Chang H.N. Citric production by Aspergillus niger immobilized on poliuretane foam. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V.30, N2. -P.141—143.

378. Lehrbach P.R., McGregor I., Ward J.M., Broda P. Molecular relationships between INC P-9 degradative plasmids TOL, NAH and SAL.

379. Plasmid. 1983. - V. 10, N2. - P. 164-174.<

380. Lenke H. Microbiellen abbau von Nitrophenolen: 2,4-dinitrophenole und 2,4,6-trinitrophenol. //Diss. Dokt. Naturwiss. Fak. Geo- und Biowiss. Univ. Shtuttgart, 1990. -274p.

381. Lenke H., Knackmuss H.J. Initial hydrogenation during catabolism of picric acid by Rhodococcus erythropolis HL 24-2. //Appl. Environ. Microbiol. -1992. V.58, N9. - P.2933-2937.

382. Lenke H., Pieper D.H., Bruhn C. et al. Degradation of 2,4-dinitrophenol by two Rhodococcus erythropolis strains HL-24-1 and HL-24-2. //Appl. Environ.

383. Microbiol. 1992. - V.58, N9. - P.2928-2932.

384. Loos M.A. Indicator media for microorganisms degrading chlorinated pesticides. //Can. J. Microbiol. 1975". - V.21, N1. - P. 104-107.

385. Loos M.A., Roberts R.N., Alexander M. Phenols as intermediates in the decomposition of phenoxyacetates by an Arthrobacter sp. //Can. J. Microbiol. -1967. V. 13, N6. - P.679-690.

386. Loper J.C. Bioremediatiom Cent. Eur. J. Public Health - 1994. - 2nd Suppl:-P. 70-73.

387. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. - V. 193, N1.1. P.265-275.

388. Lund F.A., Cabrera M. Introved phenol oxidation in activated sludge by addition of phenol-adapted Pseudomonas sp. //Zbl. Microbiol. 1986. — V.141, N2.-P.l 15-119.

389. Lund F.A., Rodriguez D.S. Acclimation of activated sludge to monosubstituted derivatives of phenol and benzoic acid. //J. Gen. Appl. Microbiol.- 1984. V.30, N1. - P.53-61.

390. MacGillivray A.R.; Shiaris M.P. Biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons by yeasts isolated from coastal sediments. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N5. - P. 1613-1618.

391. Madhosingh C. The metabolic detoxication of 2,4-dinitrophenol by Fusarium oxysporum. //Canad. J. Microbiol. 1961. - V.7, N4. - P.553-567.

392. Martinsen A., Skjak-Braek G., Smidsrod O. Alginate as immobilization material. I.Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads. //Biotechnol. Bioeng. 1989. -r V.33, N.l. - P.79-89.

393. Masque C., Nola M., Bordons A. Selection and adaptation of phenoldegrading strain of pseudomonas. //Biotech. Letters. 1987. - V.9, N9. — P.656-660.

394. Meagher R.B., Ornston L.N. Relationships among enzymes of the P-ketoadipate pathway. //Biochemistry. 1973. -V. 12, N18. - P.3523-3530.

395. Meyer J.S., Marcus N.D., Bergman H.L. Inhibitory interactions of aromatic organics during microbial degradation. //Environ. Toxicol. Chem. — 1984. — V.3, N4. — P.583-587.

396. Moersen A., Rehm H.-J. Degradation of phenol by a mixed culture of Pseudomonas putida and Cryptococcus elinovii adsorbed on activated carbon. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - V.26, N1. - P.283-288.

397. Motosugi K., Soda K. Microbial degradation of synthetic organochlorine compounds. //Experientia. 1983. - V.39, N11.- P.1214-1220.

398. Mozes N., Rouxhet P.G. Metabolic activity of yeast immobilized as support monolayer. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. - V.22, N2. - P.92-97.

399. Mozes N., Marchal F., Hermesse M.P., van Haecht J.L., Reuliaux L. Immobilization of microorganisms by adhesion: interplay of electrostatic and nonelectrostatic interactions. //Biotechnol. Bioeng. 1987. - V.30, N.3. — P.439-450.

400. Mueller J.G., Chapman P.J., Blattman B.O., Pritchard P.H. Isolation and characterization of a fluoranthene-utilizing strain of Pseudomonas paucimobilis. //Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V.56, N3. - P.1079-1086.

401. Munnecke D.M., Hsieh D.P. Microbial decontamination of paration and p-nitrophenol in aqueous media. //Appl. Microbiol. 1974. - V.28, N2. - P.212-217.

402. Murray К., Williams P.A. Role of catechol and the methylcatechols as 0 inducers of aromatic metabolism in Pseudomonas putida. //J. Bacteriol. — 1974. —1. V.l 17, N3.-P.1155-1157.

403. Nail G., Mc.Cormick F., Feeherry E. Microbial transformation of 2,4,6-trinitrotoluene and other nitroaromatic compounds. //Appl. Environ. Microbiol. 1976. - V.31, N6. - P.949-958.

404. Nakai C., Hori K., Kagamiyama N., Nakazawa Т., Nozaki M. Purification, subunit structure and partial amino acid sequence of metapyrocatechase. J. Biol. Chem. - 1983. - V.258, N5. - P.2916-2922.

405. Nehes M., Daldy A., Selypes A. Some data on the decomposition of dinitro-o-cresol by microorganisms. //Acta phytopathol. acad. sci. hung. — 1977. -V.l 2, N1 -2. — P.73-79.• 419.Neilson J.W., Josephson K.L., Pepper I.L., Arnold R.B., Di-Giovanni

406. G.D., Sinclair N.A. Frequency of horizontal gene transfer of a large catabolic plasmid (pJP4) in soil. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60, N11.- P.4053-4058.

407. Neujahr H.Y., Varga J.M. Degradation of phenols by intact cells and cell-free preparations of Trichosporon cutaneum. //Eur. J.Biochem. 1970. — V.13,N1. —P.37-44.

408. Neujahr H.Y., Linsjo S., Varga J.M. Oxidation of phenols by cells and cell-free enzymes from Candida tropicalis. //Antonie van Leeuwenhoek J.

409. Ф Microbiol. Serol. 1974. - V.40, N2. - P.209-216.

410. V.241, N16. P.3 800-3 810.428.0rnston L.N., Stanier R.Y. The convertion of catechol andprotocatechuate to Р-ketoadipate by Pseudomonas putida. I.Biochemistry. //J. Biol.

411. Paris D.F., Wolfe N.L., Steen W.C. Structure-activity relationships in4microbial transformation of phenols. //Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V.44, N1. -P.153-158.

412. Parke D., Meagher R.B., Ornston L.N. Relationships among enzymes of the р-ketoadipate pathway. //Biochemistiy. 1973. - V.12, N18. - P.3537-3542.

413. Pascik I. Modified polyuretane carriers for biochemical waste water treatment. //Water Sci. Tech. 1990. - V.22, N1-2. - P.33-42.

414. Patel J.C., Grant D.J.W. The formation of phenol in the degradation of p-hydroxybenzoic acid by Klebsiella aerogenes (Aerobacter aerogenes). //Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 1969. - V.35, N1. - P.53-64.

415. Patent 0270805 A2 European C12N 1/20; C02F 3/34; C12N 15/00 Bacterial method and compositions for degrading hydrocarbons/ Vandenbergh P.A.-Опубл. 15.06.88.

416. Patent 1 554868 Great Britain, Int. C1.4 C02 F3/34. Aerobic oxidationof waste material. /Smith K.C., Garrett M.E. 1979.7 i

417. Patent 2 311759 France C02C 5/10 C12B 1/00 Procede de degradation biologique de solutions contenant des'phenols /Pilon R., Pons B.J., Sechet N., Due N.G.C.- Опубл. 17.12.76 N51.

418. Patent 3 813316 USA Multiple compatible degradative energy-generating plasmids and preparation there of /Chakrabarty A.M. — Опубл. 28.05.74.

419. Patent 3 900932.7 DE Int. C1.4 C02F 1/78; C07C 201/06 Verfahren zur reinigund von nitroaromaten enthaltenden abwassern. /Schuster L., Stechi H.-H., WolffD.t

420. Patent 4 138292 USA C07G 7/02; C12B 1/00 Immobilized catalytically active substance and method of preparing the same. /I.Chibata, T.Tosa, I.Takata (Japan).-P. 19.

421. Patent 4 356268 USA Microorganism for treating waste water /Shimizu N., Odawara Y. Masaki Y. Опубл. 26.10.82.443 .Patent 4 447539 USA Microorganism capable of degrading phenolics /Pillis L.J., Davis L.T. Опубл. 8.05.84.

422. Patent 5 085998 USA Int. C1.4 C12 Pl/02 // C12 Rl/625 Ф Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene by whiterot fungi. /Tudor F., Bumpus J.A.-1991.

423. Pemberton J.M., Don R.H. Bacterial plasmids of agricultural and environmental importance. //Agr. Environ. — 1981. V.6, N1. — P.23-32.

424. Pemberton J.M., Fisher P.R. 2,4D plasmids and persistence. //Nature. -1977. V.268, N5622. - P.732-733.

425. Polnisch E., Kneifel H., Franzke H., Hofmann K.H. Degradation and dehalogenation of monochlorophenols by the phenol-assimilating yeast Candida maltosa. //Biodegradation. 1991. - V.92, N2 (3). - P. 193-199.

426. Portier R.L., Nelson J.A., Christianson J.C., Wilkerson J.M., Bogt R.C. Biotreatment of dilute contaminated ground water using an immobilized microbe packed bed reactor. //Environ. Prog. 1989. - V.8, N2. - P.120-125.

427. Powlowski J., Shingler V. Genetics and biochemistry of phenol Ф degradation by Pseudomonas sp. CF600. //Biodegradation. — 1994. V.5, N3-4. —1. P.219-236.

428. Puhakka J.A., Herwig R.P., Кого P.M., Wolfe G.V., Ferguson J.F. Biodegradation of chlorophenols by mixed and pure cultures from a fluidized-bed reactor. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V.42, N6. - P.951-957.

429. Quentmeier A., Friedrich C.G. Transfer and expression of degradative and antibiotic resistance plasmids in acidophilic bacteria. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60, N3. - P.973-978.

430. Raffeiner L., Oltmann R.H., Schinner F. Microbial degradation of the isomeric mononitrobenzoic acid by Actinomyces sp. RH051. //6th Eur. Congr. Biotechnology (ECB6). Firenze, Italy, June 13-17,1993.-Firenze, 1993. Abstrs. Books, V.4. — TH134.

431. Ralston J.R., Vela G.R. A medium for detecting phenoldegrading bacteria. //J. Appl. Bacteriol. 1974. - V.37, N3. - P.347-351.

432. Raymond D.G., Alexander M. Microbial metabolism and cometabolism of nitrophenols. //Pest. Biochem. Physiol. 1971. -V.l, N1. - P. 123-130.

433. Reardon K.F., Mosteller D.C., Bull Rogers J.D. Biodegradation kinetics of benzene, toluene, and phenol as single and mixed substrates for Pseudomonas putida Fl. //Biotechnol. Bioeng. 2000. - V.69, N4. - P.385-400.

434. Reber H.H., Kaiser P. Regulation of the utilization of glucose and aromatic substrates in four strains of Pseudomonas putida. //Arch. Microbiol. -1981. V. 13 0, N3. - P.243-247.

435. Reineke W. Development of hybrid strains for the mineralization of chloroaromatics by patchwork assembly. //Annu. Rev. Microbiol. 1998. - V.52. -P.287-331.

436. Reineke W., Knackmuss H.-J. Construction of haloaromatics utilising bacteria. //Nature. 1979. - V.277, N5695. - P.385-386.

437. Reineke W., Knackmuss H.-J. Hybrid pathway for chlorobenzoate metabolism in Pseudomonas sp. B13 derivatives. //J. Bacteriol. 1980. - V.l42, N2. — P.467—473.

438. Reineke W., Jeenes D.J., Williams P.A., Knackmuss H.-J. TOL plasmid pWWO in constructed halobenzoate-degrading Pseudomonas strains: prevention of meta pathway. //J. Bacteriol. 1982a. - V.l50, N1. - P. 195-201.

439. Ribbons D.W. The microbiological degradation of aromatic compounds. //Ann. Rept. Chem. Soc. London, 1965. - V.62. - P.445-468.

440. Ribbons D.W. Specificity of monohydric phenol oxidations by meta cleavage pathway in Pseudomonas aeruginosa Tl. //Arch. Microbiol. — 1970. — V.74, N2. — P. 103-115.

441. Robinson G.K., Lenn M.J. The bioremediation of polychlorinated biphenyls (PCBs): problems and perspectives. //Biotechnol. Genet. Eng. Rev. -1994. -N12. -P.139-188.

442. Rochkind-Dubinsky M.L., Sayler G.S., Blackburn J.W. Microbiological decomposition of chlorinated aromatic compounds. //Microbiology series V. 18. -Marcel Dekker Inc. N.Y., 1987.-315p.

443. Rogoff M.H. Oxidation of aromatic compounds by bacteria. //Adv. Appl. Microbiol. 1961. -V.3, N1. - P.193-219.

444. Rogoff M.H., Wender J. Oxidation of aromatic compounds by bacteria. -Washington, 1962. 14p.

445. Rokesh J.K., Dreisbach J.H., Spain J.C. Biodegradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzenetriol by an Arthrobacter sp. //Appl. Environ. Microbiol. — 1994. — V.60, N8. — P.3030-3032.

446. Rosenberg S.L., Hegeman G.D. Clustering of functionally related genes in Pseudomonas aeruginosa. //J. Bacteriol. 1969. - V.99, N1. - P.353-355.

447. Rothenburger S.; Atlas-R.M. Hydroxylation and biodegradation of 6-methylquinoline by pseudomonads in aqueous and nonaqueous immobilized-cell bioreactors. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N7. -P.2139-2144.

448. Sahasrabudhe S.R., Amin A.R., Modi V.V. Transformation of chlorinated benzoates and other benzene derivates by Aspergillus niger and

449. Aspergillus japonicus. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. - V.21, N6. —1. P.365-367.

450. Sala-Trepat J.M., Murray K., Williams P.A. The metabolic divergence in the meta cleavage of catechols by Pseudomonas putida NCIB 10015. Physiological significance and evolutionary implications. //Eur. J. Biochem. — 1972. V.28, N3. - P.347-356.

451. Salkinoja-Salonen M.S., Hukulinen R., Vale R. Biodegradation of recalcitrant organochlorine compounds in fixed-film reactors. //Water Sci. Technol. 1983. - V. 15, N4. - P.359-367.

452. Salkinoja-Salonen M.S., Hukulinen R., Vale R. et al. Biodegradation of4recalcitrant organochlorine compounds in fixed-film reactors. //Water Sci. Technol. 1983. - V.l5, N8-9. - P.309-313.

453. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene, and anthracene. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N6. -P.1931-1937.

454. Saunders F.J. Biotechnology and waste treatment. //Effluent Water Treat. J. 1984. - V.24, N11.- P.421-425.

455. Sayama N., Itokawa Y. Treatment of cresol, phenol and formalin usingfixed-film reactors. //J. Appl. Bacteriol. 1980. - V.49, N3. - P.395-403.$

456. Sayler J.S., Hooper S.W., Laiton A.C., King J.M.H. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance. //Microbial Ecol. 1990. — V.l9, N1.-P. 1-20.

457. Schell M.A. Cloning and expression in Escherichia coli of the naphthalene degradation genes from plasmid NAH7. //J. Bacteriol. 1983. -V.l 53, N2. — P.822-829.

458. Schmidt E., Knackmus H.-J. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Conversion of chlorinated muconic acids into maleoylacetic acid. //Biochem. J. 1980. - V.192, N1. - P.339-347.

459. Schmidt E., Hellwig M., Knackmus H.-J. Degradation of chlorophenols by a defined mixed microbial community. //Appl. Environ. Microbiol. 1983. — V.46, N5.-P. 1038-1044.

460. Schmidt E., Remberg G., Knackmus H.-J. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Halogenated muconic acids as intermediates. //Biochem. J. 1980'. - V. 192, N1. - P.331-337.

461. Schmidt S.K., Scow K.M., Alexander M. Kinetics of p-nitrophenol mineralization by Pseudomonas sp.: Effects of second substrates. //Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V.53, N11.- P.2617-2623.

462. Schopp W., Toaspern C., Tauchert H. Charakterisierung und differenzierung fluoreszieren der pseudomonaden mit hilfe von substratverwertungsstudien. //J. Basic Microbiol. 1985. - V.25, N3. - P.l 87-195.

463. Scott H.D., Wolf D.C., Lqvy T.L. Apparent adsorption and microbial degradation of phenol by soil. //J. Environ. Qual. 1982. - V. 11, N1. - P. 107-112.

464. Seidman M.M., Toms A., Wood J.M. Influence of side chain substitutents on the position of cleavage of the benzene ring by Ps. fluorescens. //J. Bacteriol. 1969. - V.97, N3. - P.l 192-1197.

465. Semprini L. In situ bioremediation of chlorinated solvents. //Environ. Health Perspect. 1995. - V. 103, Suppl.5. - P. 101-105.

466. Sethunathan N., Yoshida T. Conversion of paration to para-nitrophenol by diazinon-degrading Flavobacterium sp. //Proc. Inst. Environ. Sci. N.Y. Meet., 1972. V.18. -P.255-357.

467. Sharma S., Ramakrishna C., Desai I.D., Bhatt N.M. Anaerobic biodegradation of a petrochemical wastewater using biomass support particles. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V.40, N5. - P.768-771.

468. Shields M.S., Reagin M.J., Gerger R.R., Campbell R., Somerville C. TOM, a new aromatic degradative plasmid from Burkholderia (Pseudomonas) cepacia G4. //Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V.61, N4. - P.1352-1356.

469. Shim H., Yang S.T. Biodegradation of benzene, toluene, ethylbenzene, and o-xylene by a coculture of Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescensimmobilized in a fibrous-bed bioreactor. //J. Biotechnol. 1999. - V.67, N2-3. -P.99-112.

470. Shimizu Т., Uno Т., Dan Y. Continuous treatment of sewage waterscontaning phenol by Candida tropicalis. //J. Ferment. Technol. 1973. — V.51,1. N11. —P.809-812.

471. Shoda N., Maruta K., Udaka S. Isolation and properties of phenol utilizing microorganisms with special reference to catechol-1,2-oxygenase. //Agr. Biol. Chem.- 1980.-V.44,N8.-P. 1841-1846.4

472. Siddaramappa R., Rajaram K.P., Sethunathan N. Degradation of paration by bacteria izolated from flooded soil. //Appl. Microbiol. 1973. - V.26, N6. -P.846-849.

473. Siddaramappa S.-B.R., Wahid P.A., Sethunathan N. Conversion of p-nitrophenol to 4-nitrocatechoI by a Pseudomonas sp. //J. Microbiol. Serol. — 1978. V.44, N2. -P.l71 -176.

474. Skjak-Braek G., Murano E., Paoletti S. Alginate as immobilization material. II. Determination of polyphenol contaminants by fluorescens spectroscopy, and evalution of methods for their removal. //Biotechnol. Bioeng. -1989. V.33, N1. - P.90-95.

475. Slater J.H., Lovatt D. Biodegradation and significance of microbial communities. //Microbial degradation of organic compounds. N.Y. and Basel: Marcel Deccer, 1984. -P.439-485.

476. Smidsrod O., Skjak-Braek G. Alginate as immobilization matrix for cells //Trends in Biotechnology. 1990. - V.8, N3. - P.71-78.

477. Somerville H.J., Mason J.R., Ruffell R.N. Benzene degradation by bacterial cells immobilized in polyacrylamide gel. //Eur. J. Appl. Microbiol. -1977. V.4, N2. - P.75-85.

478. Spain J.C., Gibson D.T. Oxidation of substituted phenols by Pseudomonas putida F1 and Pseudomonas sp. strain JS6. //Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V.54, N6. - P. 1399-1404.

479. Spain J.C., Gibson D.T. Pathway for biodegradation of p-nitrophenol in a Moraxella sp. //Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V.57, N3. - P.812-819.

480. Spain J.C., Van Veld P.A. Adaptation of natural microbial communities to degradation of xenobiotic compounds: effects of concentration, exposure time, inoculum and chemical structure. //Appl. Environ. Microbiol. 1983. — V.45, N2. —P.428-435.

481. Spain J.C., Van Veld P.A., Monti C.A. et al. Comparison of p-nitrophenol biodegradation in field and laboratory test systems. //Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V.48, N5. - P.944-950.

482. Spain J.C., Wyss O., Gibson D.T. Enzymatic oxidation of p-nitrophenol. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. - V.88, N2. - P.634-641.

483. Speltel G.E., Lu C.-J., Turakhla M., Zhu X.-J. Biodegradation of trace concentrations of substituted phenols in granular activated carbon columns //Environ. Sci. Techn. 1989. - V.23, N1. - P.68-74.

484. Spokes J.R., Walker N. Chlorophenol and chlorobenzoic acid cometabolism by different genera of soil bacteria. //Arch. Mikrobiol. — 1974. -V.96, N2. P. 125-134.

485. Springael D., Diels L., Hooyberghs L., Kreps S., Mergeay M. Construction and characterization of heavy metal-resistant haloaromatic-degrading Alcaligenes eutrophus strains. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59, N1. -P.334-339.

486. Stanier R.Y., Ornston L.N. The р-ketoadipate pathway. //Adv. Microbiol. Physiol. -London, e.a., 1973. V.9. -P.89-151.

487. Stanier R.Y., Palleroni N.J:, Doudoroff M. The aerobic pseudomonads:a taxonomic study. //J. Gen. Microbiol. 1966. - V.43, N2. - P. 159-271.

488. Steenson L.R., Ulaenhammer T.R., Swaisgood H.E. Calcium alginateimmobilized cultures of lactic Streptococci are protected from bacteriophages. //J.

489. Dairy Science. 1987. - V.70, N6. - P.l 121-1127.

490. Stieber M., Haesebr F., Werner P., Hartmann F. A rapid screeningmethod for microorganisms degrading polycyclic aromatic hydrocarbons inmicroplates. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V.40, N5. - P.753-755.t

491. Stormo K.E., Crawford R.L. Preparation of encapsulated microbial cells for environmental application. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V.58, N2. -P.727-730.

492. Stringfellow W.T., Aitken M.D. Comparative physiology of phenantrene degradation by two dissimilar Pseudomonas isolated from creosote-contaminated soil. //Can. J. Microbiol. 1994. - V.40, N6. - P.432-438.

493. Stucki G., Alexander M. Role of dissolution rate and solubility in biodegradation of aromatic compounds. //Appl. Environ. Microbiol. 1987. -V.53, N2. — P.292-297.t

494. Sudhakar В., Siddaramappa R., Sethunathan N. Metabolism of nitrophenols by bacteria isolated from paration-amended flooded soil. //J. Microbiol. Serol. 1976. - V.42, N4. - P.461-470.

495. Tabak H.H., Chambers C.W., Kabler P.W. Microbial metabolism of aromatic compounds. I. Decomposition of phenolic compounds and aromatic hydrocarbons by phenol-adapted bacteria. //J. Bacteriol. 1964. - V.87, N4. -P.910-919.

496. Takahashi S., Iton M., Koncho Y. Treatment of phenolic wastes by

497. Aureobasidium pullulans adhered to the fibrous support. //Eur. J. Appl. Microbiol.i- 1981. V.l3, N3. - P. 175-178.

498. Tewfik M.S., Evans W.C. The metabolism of 3,5-dinitro-o-cresol (DNOC) by soil microorganisms. //Biochem. J. 1966. - V.99, N2. - P.31-32.

499. Tiedje J.M., Duxbury J.M., Alexander M., Dawson J.E. 2,4D Ф Metabolism: pathway of degradation, of chlorocatechols by Arthrobacter sp. //J.

500. Agr. Food Chem. 1969. - V.l7, N5. - P. 1021-1026.

501. Tramper J. Immobilizing biocatalysis for use in syntheses. //Trends Biotechnol. 1985. - V.3, N2. - P.45-50.

502. Tudor F., Bumpus J.A., Aust S.D. Biodegradation of TNT (2,4,6-trinitrotoluene) by Phanerochaete chrysosporium. /Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V.56, N6. - P.l666-1671.

503. Utkin I.B., Yakimov M.M, Matveeva L.N. et ah Degradation of stereneiand ethylbenzene by Pseudomonas species Y2. //FEMS Microbiol. Letters. — 1991. V.77, N2-3. - P.237-241.

504. Valo R., Haggblom M., Salkinoja-Salonen M.S. Bioremediation ofmchlorophenol-containing simulated groundwater by immobilized bacteria. //Water Res. 1990a. -V.24, N1. -P.253-258.

505. Varga J.M., Neujahr H.Y. Isolation from soil of phenol utilizingorganisms and metabolic studies on the pathway of phenol degradation. //Plant

506. Soil. 1970. - V.33, N3. -P.565-571.t

507. Vorreck C., Lenke H., Fischer P. et al. Identification of hydride-Meisenheimer complex as a metabolite of 2,4,6-trinitrotoluene by a

508. Mycobacterium strain. //J. Bacteriol. 1994. - V.176, N3. - P.932-934.

509. Wagner К., Hempel D.C. Biodegradation by immobilized bacteria in an airlift-loop reactor influence of biofilm diffusion limitation. //Biotechnol. Bioeng. - 1988. - V.31, N6. - P.559-567.

510. Wang Y.T., Suidan M.T., Pfeffer J.T., Najm I. Effects of some alkylphenols on methanogenic degradation of phenol. //Appl. Environ. Microbiol.- 1988.-V.54, N5. -P.1277-1279.

511. Wang Yi-Zin Effect of chemical pretreatment on anaerobic biodegradation of reactory organic compounds. //Environ. Progr. 1992. — V.l 1, N3. -P.210—215.

512. Warhurst A.M., Clarke K.F., Hill R.A., Holt R.A., Fewson C.A. Metabolism of styrene by Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259. //Appl.

513. Environ. Microbiol. 1994. - V.60, N4. - P.l 137-1145.7 «

514. Wase D.AJ., Hough J.S. Continuous culture of yeast on phenol. //J. Gen. Microbiol. 1966. - V.42, N1. - P. 13-23.

515. Weissenfels W.D., Beyer M., Klein J. Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by pure bacterial cultures. //Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1990. V.32, N4. - P.479-484.

516. Westmeier F., Rehm H.-J. Biodegradation of 4-chlorophenol by entrapped Alcaligenes sp. A7-2 //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. - V.22, N5.- P.301-305.

517. Westmeier F., Rehm H.-J. Degradation of 4-chlorophenol in municipal wastewater by adsorptiv immobilized Alcaligenes sp. A7-2. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - V.26, N1. - P.78-83.

518. Wigmore G.J., DiBerardino D., Bayly R.C. Regulation of the enzymes of the meta-cleavage pathway of Pseudomonas putida: a regulatory model. //J. Gen. Microbiol. 1977. - V.l00, N1. -P.81-87.

519. Williams P.A., Worsey M.J. Ubiquity of plasmids in coding for toluene and xylene metabolism in soil bacteria: evidence for the existence of new TOL plasmids. //J. Bacteriol. 1976. - V.125, N3. - P.818-828.

520. Williams P.A., Jeenes D.J., Wheatcroft R. Structural changes of the TOL plasmid pWWO. //Adv. Biotechnol. 1981. - V.l. - P. 171-176.

521. Wilson S.C., Jones K.C. Bioremediation of soil contaminated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs): A review. //Environ. Pollut. — 1993. — V.81. — P.229-249.

522. Winstanley C., Taylor S.C., Williams P.A. pWW174: a large plasmid from Acinetobacter calcoaceticus encoding benzene catabolism by the beta-ketoadipate pathway. //Mol. Microbiol. 1987. - V.l, N2. - P.219-227.

523. Wisecarwer K.D., Fan L.-S. Biological phenol degradation in a gas-liquid-solid fluidized bed reactor. //Biotechnol. Bioeng. 1989. - V.33, N8. — P. 1029-1039.

524. Wong C.L., Dunn N.W. Transmissible plasmid coding for the degradation of benzoate and m-toluate in Pseudomonas arvilla mt2. //Genet. Res. -1974. V.23, N2. - P.227-232.

525. Wong C.L., Dunn N.W. Combined chromosomal and plasmid encoded control for the degradation of phenol in Pseudomonas putida. //Genet. Res. — 1976. -V.27, N3. — P.405-412.

526. Wong C.L., Leong R.W., Dunn N.W. Mutation to increased resistance to phenol in Pseudomonas putida. //Biotechnol. Bioeng. 1978. - V.20, N6. -P.917-920.

527. Worden R.M., Donaldson T.L. Dynamics of a biological fixed film for phenol degradation in a fluidized-bed bioreactor. //Biotechnol. Bioeng. 1987-V.30, N3. — P.398-412.

528. Worsey M.J., Williams P.A. Metabolism of toluene and xylenes by Pseudomonas putida (arvilla) mt2: evidence for a new function of the TOL plasmid. //J. Bacteriol. 1975. - V.l24, N1. -P.7-13.

529. Wyman J.F., Guard H.E., Won W.D. et al. Conversion of 2,4,6-trinitrophenol to a mutagen by Pseudomonas aeruginosa. //Appl. Environ. Mirobiol. 1979. -V.37, N2. - P.222-226.

530. Yen K.-M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organisation: naphthalene/salicylate oxidation. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79, N3. - P.874-878.

531. Zache G., Rehm H.-J. Degradation of phenol by a coimmobilized entrapped mixed culture. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V.30, N4. — P.426-432.

532. Zeyer J., Kocher H.P. Purification and characterization of a bacterial nitrophenol oxygenase which converts ortho-nitrophenol to catechol and nitrite. //J. Bacteriol. 1988. - V. 170, N4. - P. 1789-1794.

533. Zeyer J., Philip C.K. Degradation of o-nitrophenol and m-nitrophenol by a Pseudomonas putida. //J. Agric. Food Chem. 1984. - V.32, N1. -P.238-242.

534. Zeyer J., Kocher H.P., Timmis K.N. Influence of para-substituents onthe oxidative metabolism of o-nitrophenols by Pseudomonas putida B2. //Appl.в

535. Environ. Microbiol. 1986. - V.52, N2. - P.334-339.

536. Zuniga M.C. Durham D.R., Welch R.A. Plasmid- and chromosome-mediated dissimilation of naphthalene and salicylate in Pseudomonas putida PMD-I. //J. Bacteriol. 1981. - V.147, N3. - P.836-843.

537. Центральный Музей -промышленных'микроорганизмов •Iинститута "ВНИИгенетика" принял на депонирование " 17 " твт19ВЗг.культуру Рдеус/утоиал putt Ж АС-340 рк£h е+ Trp I4Zпредложенную коллективом авторов.

538. В.И.Корженевич,Б.А,Дандеров'Л

539. Саратовский медицинский институт■наименование организации и фамилии авторов) в качестве тамма, несущего шшамидные гены деструкциифенола• ( производственной назначение штамма) •t

540. Принятая культура получила в Центральном Музее промышленных микроорганизмов коллекционны?, номер: ЦМПМ В-28401™:У/// -.1 >-у." Зав.ЦМГЩда^ ■ >■Т.А.Тренинаv 15 июля /1983 г#1. СПРАВКА

541. Центральный Музей промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" принял на депонирование "17 " ирня 19 63 г.культуру ,9Мгяб'^енлл J!>Seo M^l/-*1 предложенную коллективом авторов В.И.Корженевич, Б.А.Шендеров уN

542. Саратовский медицинский институтнаименование организации и фамилии авторов) в качестве тамма-активного деструктора фенолапроизводственное назначение штамма)

543. Принятая культура получила в Центральном Музее промышленных микроорганизмов коллекционный номер: B-284I1. Tvtt1. Зав.ЦМП15 " имя19'ез гт3441. Справка

544. Нейтральный Музей промышленных микроорганнзмои института „ВНИИгенетика принял на депонирование , Т/4 ,**—.-ШфбЛЯ-19$ г.Ыедлижеииую коллективом «второйирнплл на лсниппсичаппv Щ ■ ■ ■ ■ чщшч»» iуп,' Р-леис/оымил РbLUCtoQtecJi^^м^п

545. А.Д.Миронов,В.И.Корженевич,А.Л.Бврковский

546. Ьратовс.кий филиал "ВНИИгенетика"качестве.наименование организация и фамилии авторов)штамма-деструктора бензойной кислоты и её производныхпроизводственное назначение штамма)

547. Принятая культура получила в Центральном Музее промышленных микроорганизмов кол-гкинонный нпи^р (»1мпы) БКПМ В-4Э47t -t» ■г*' «Г. !<•■' у/1. JЗав. (ЦМПЛф ВКПМ'i!\f/yC1.ts*-—•26 v I988r<

548. М-Ярося. типография 2*01-6000

549. Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов инсти»тута „ВНИИгенетика* приняла на^^онирование1. МврТа198 г.'*культуру Paeudomonaa putida GFS-81. А.Ю.Федоров,И.Н.Синпредложенную коллективом авторовгирцев, В. И. Корженевич, В. Ю. Крестьянино в

550. Саратордкий Филиал "ВНИИгонвтика"» г.Саратов,.в качестве штамма-деструктора фенола и его производныхименование организации и фамилия авторов) Принятая культура получила во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов коллекцноннийЛкэцбрг*v

551. RlmM В-6248 ' Ч ВКПМ--А'; и .* \.Д' |М . *• I. \ »* \

552. J; ' j . • .141 1 г •• 1 н?к Ч | ^1. Зав.

553. М-Яросл. тшографки 68!S6—3000'

554. Вс«сот*** коплч•клин промышленных микроорганизмов институте „ШШИгснцтикя" принял» ивллсгшнировамие 1Ь. марта

555. Peeudomonas putida GFS-106культурупредложенную коллективом авторов А«Ю«Федоров tИ.Н,СИНГИР— це в, В. И. Корженевич, В. Ю. Крестьянинов

556. Саратовский филиал "ВНИИгенетика"» г.Саратовв качестве ВТРММР-J иолаэаименование организации и фамилия авторов) Принятая культура получила во Всесоюзной коллекции про» юшлениых микроорганизмов коллекционный номер:

557. Саратовский филиал "ВНИИгенетика"в качестве штамма-деструктора диметилфенилкарбинола i • . < • !i j * . ; i ; * ;1. I- ' * . -it . ( M .i J . ■ t .i • i * ' ■ 1 ,t ! J ■ i • •. ;; ■ • i I• г f jнаименование организации и фамилия авторов)I