Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиология природной ассоциации "Тибетский рис"

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиология природной ассоциации "Тибетский рис""

/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

МИКРОБИОЛОГИЯ ПРИРОДНОЙ АССОЦИАЦИИ «ТИБЕТСКИЙ РИС»

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2000 г.

На правах рукописи

ЛАРИНА Ольга Геннадьевна

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии

Научный руководитель -доктор биологических наук, З.Д.Н. РФ, профессор Н. П. Блинов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.Е. Аркадьева доктор медицинских наук, лауреат гос. премии РФ, профессор A.M. Королюк

Ведущее учреждение - Университет низкотемпературных и пищевых технологий.

Зашита состоится <М<< 2000 г. в гз часов минут на

заседании диссертационного совета К 084.63.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Саша-Петербург, ул. Проф. Попова, 14 ' - ;-

/о —- ; П/О^// V

h /,' у'"

Автореферат разослан

Ж Ж

2000 г.

fin.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.В. Кириллова

Актуальность исследований.

С давних пор известно благоприягаое воздействие на организм человека молочнокислых продуктов (ацидофилин, йогурт, кефир, простокваша) Лактобиота участвует в обеспечении так называемой "колонизационной резистенции", то есть устойчивости пищеварительного тракта макроорганизма к заселению аллохтонными микробами. В качестве средств коррекции микроэкологии полости рта, желудочно-кишечного тракта, влагалища применяются препараты-эубиотики и продукты лечебно-диетического питания, в состав которых входят молочнокислые микроорганизмы.

На территории России получили широкое распространение молочнокислые продукты, производимые на предприятиях молочной промышленности. Некоторые из них, например кефир, изготавливают и в домашних условиях, чтобы ежедневно располагать свежим однодневным напитком. К числу таких продуктов относят так называемый "Тибетский рис". Точное время и место его происхождения остаются неизвестными, хотя само название с большой долей вероятности локализует географическую привязку продукта.

В научной и народной медицине молочнокислые продукты употребляют не только в качестве пищевых, но и лечебно-профилактических средств, назначаемых по специальным показаниям. Например, кефир усиливает секреторные функции слюнных желез, поджелудочной железы, моторно-эвакуаторную функцию тонкой кишки, способствует лучшему желчеотделению, повышает аппетит. Он благотворно действует на обмен веществ (белковый, витаминный) и физическое развитие детей, повышает их сопротивляемость неблагоприятным факторам внешней среды. Кефир применяют при лечении колжнтерита, при обострении хронических холецистита и холангита. Другой молочнокислый продукт - кумыс способствует восстановлению истощенного организма, повышает жизненный тонус, стимулирует пищеварительный аппарат, интенсифицирует оккслетельпо-восстановетельные процессы, тонизирует сердечно-сосудистую систему, возбуждает дыхательный центр, регулирует секреторную и двигательную функции желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), способствует этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

По некоторым разрозненным наблюдениям - лица употреблявшие "Тибетский рис" хорошо оценивали его действие на организм, однако специальных исследований по изучению мюеробиоты и самого продукта "Тибетский рис" ранее не проводилось.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении состава микробиоты и некоторых морфолого-фнзиологических особенностей в природной ассоциации "Тибетский рис. В этой связи были определены следующие задачи исследования:

1. Выделение и идентификация микроорганизмов, составляю щи природную ассоциацию "Тибетский рис";

2. Определение соотношения выделенных микроорганизмов-ассоциантов;

3. Изучение структуры зерен "Тибетского риса";

4. Оценка биологической активности нативной ассоциации;

5. Оптимизация питательной среды и условий культивирования природно ассоциации;

6. Выбор возможных методов длительного хранения зерен "Тибетског риса";

7. Разработка технологических параметров для получения напитк "Тибетский рис" в домашних и производственных условиях;

8. Создание биологически активной добавки к пище на основе природно ассоциации "Тибетский рис".

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Природная ассоциация "Тибетский рис" состоит из 11-и различны микроорганизмов, принадлежащих к 8 видам и находящихся в симбиотическ взаимовыгодных отношениях.

2. Основной частью ассоциации являются лакгобациллы, обладающп умеренно выраженной антимикробной активностью, адгезивностьк устойчивостью к ряду анхибиотиков; минорной частью являются дрожжевы организмы, среди которых обнаружен новый вид, названный Сенеке2з иЬвисз

3. Обнаружено, что "Тибетский рис" благотворно влияет на иммунную мочевыделитель-ную системы организма.

4. Разработана питательная среда МСВ для культивирования зере "Тибетский рис" и получения напитка, обладающего кислотностью 30-35 * Т содержащего 12±0,2 мг/мл редуцирующих Сахаров, 1,5±0,3 мг/мд общего белка: 0,15±0,03% молочной кислоты. Из углеводов в налшке обнаружены глюкоз; фруктоза, лактоза, сахароза.

Зт К ШСмлС&иИ риО) Си^хОи! <!

углеводов - 64% ( от сухого веса), основным компонентом которого являете а-глюкан.

6. Длительное хранение зерен "Тибетского риса" в лиофнльно Бысушенно! состоянии в присутствии протектора является наилучшим из всех проверенны нами способов.

Научная новизна работы:

В результате проведенных исследований показано, что микробиот природной ^ассоциации "Тибетский рис" состоит из 11-та микроорганизмов симбионтов, принадлежащих к 8-и различным видам.

Установлено, что основная часть микробиоты представлена лактобациллами; к минорным ассоциантам относятся дрожжевые организмы, из которых Candida tlbetica н&ш описана впервые.

Б опытах на экспериментальных животных показано, что пероральное применение напитка, полученного на основе жизнедеятельности ассоциации, положительно влияет на функцию мочевыделительной системы и на гуморальный иммунитет, а внутрибрюншнное введение напитка - на неспецифическую резистентность организма.

Показана возможность длительного хранения зерен "Тибетского риса" в лиофильно высушенном состоянии в течение 2-х лет.

Практическая ценность работы:

Разработаны питательная среда МСВ, условия культивирования зерен и получения напитка на основе природной ассоциации "Тибетский рис".

На основе ассоциации "Тибетский рис" разработана биологически активная добавка, из которой в домашних или производственных условиях можно получать напиток, способствующий выведению фосфатов и оксалатов из мочевых путей, обладающий общеукрепляющим действием и нормализующий микробиоценоз кишечника.

Лзкгобнота природной ассоциации "Тибетский рис" перспективна для использования в качестве биопрепарата, нормализующего автохтонную йикробиоту пищеварительного тракта человека.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на заседаниях сотрудников кафедры микробиологии СПХФА (1996, 1997, 1998) и на Всероссийской научной сонференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" Санкт-Петербург, 1996) и в НИИ Мед. Микологии СПб МАПО (2000).

Публикации.

По материалам диссертации имеются четыре публикации.

Объем и структура работы:

Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит а введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения ¡слученных результатов, выводов, указателя литературы, включающего 222 [сточников. Работа нллюстрирозаяа 16 таблицами, 15 pHCj HKw мк.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали зерна "Тибетского риса" ГР) и напиток, получаемый на его основе. Первый образец зерен был передан ам доктором химических наук JI.K. ИГатаевой, полученный ею из района оссийского Дальнего Востока.

Тибетский рис представляет собой округлые или овальные желеобразные гранулы плотной консистенции размером 3-10 мм, с мелкобугристой поверхностью белого цвета, без специфического запаха. Биомассу зерен TP и напиток (или 3-х суточную культуральная жидкость - к.ж.) получали в процессе выращивания первоначальной порции зерен в питательной среде, содержащей по 2-4 столовых ложки молока и сахара на 1 л воды, в которую вносили 1 столовую ложку нативных зерен. Культивирование вели в течение 3-х суток в закрытых флаконах при комнатной температуре.

Определение выхода биомассы зерен в процессе культивирования проводили гравиметрически. Способность зерен закислятъ питательную среду определяли по значению pH потенциометрически или по кислотности в градусах Тернера (°Т) (Геппер Е.З. и др., 1979).

Морфологию микроорганизмов, составляющих ассоциацию (TP), изучали с помощью световой, фазово-хонграстной микроскопии окрашенных и нативных мазков отдельных микробов-ассоциантов, зерен и культуральной жидкости TP, а также, использовали электронно-микроскопическое (трансмиссионное н сканирующее) исследование.

Для выделения и изучения молочнокислых бактерий использовали питательные среды MPC (MRS - Man, Rogosa, Sharps, 1960) и ее варианты, модифицированные A.A. Ленцнером (Бдохина H.H., 1986),* СИБ-Л (Лихачева А.Ю. и др., 1995). Для уксуснокислых бактерий готовили питательные среды, содержащие в качестве источника углерода глюкозу, этанол или маннкт (Берги, Î9S6; Лойцянская м.С., 1977). Для выращивания дрожжевых культур использовали жидкое сусло (7,5 % СБ), сусло-агар с дрожжевым автолизатом (2 %), среду Сабуро, картофельно-глюкозный агар (Бабьева, Голубев, 1982).

Выделение чистых культур и определение их соотношения в TP проводили методом прямого посева последовательных десятикратных -разведений гомогенизата зерен и к. ж. на плотные питательные среды поверхностным или глубинным способами минимум в трех повторностях.

Видовую принадлежность выделенных бактерий определяли по Берджи (1986,1S97), а также используя дня идентификации лактобацилл диагностические тесты из работы Блохиной (1986) и микрокультуральные тест-системы (Лихачева А.Ю. и др., 1995), а для уксуснокислых бактерий - работу Лойцянской М.С,, и др. (1979). Идентификацию дрожжевых культур осуществляли по определителю Kreeger-van Rij N.I.W. (1984), а также - по Бабьевой, Голубеву ( 1982).

Антагонистическую активность определяли методом штрихового подсева, методами диффузии в агар и агаровых блоков, с использованием следующих тест-культур: Bacillus subiüis АТСС 6633, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Staphylococcus aureus АТСС 6538-P, Candida albicans ATCC 885-653.

Чувствительность микроорганизмов к антимикробным препаратам определяли методом дисков. Адгезивные свойства оценивали по способности прикрипляться к поверхности формалиннзированных эритроцитов человека 00) группы КЬ(+) (Бриллис Б.II. и др., 1986).

Активность сывороточного лизоцима определяли на белых беспородных мышах-самцах (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974). Определение лизоцимсинтезирующей способности микроорганизмов проводили чашечным методом (Бухарин О.В. и др., 1985).

Влияние природной ассоциации на антигелообразование в ответ на стандартный Т-зависимьш антиген - эритроциты барана, введенные за сутки, изучали на белых мышах-самцах, которым внутрибрншшнно вводили ТР или. кормили ТР. Определение гемолизинов проводили общепринятым методом, полученные данные обрабатывали по Сергееву.

Мочегонный эффект напитка ТР изучали на 30 крысах-самцах в два этапа. На первом этапе животным вводили через зонд ежедневно по 0,75% от массы тела питательную среду для получения напитка (контрольные -1) или напиток ТР (опытные - 2). На втором этапе изучали диурез на крысах-самцах, которые без принуждения пили напиток ТР из поилок (опытные - 3), в сравнении с контрольными (4), употреблявших воду. Раз в неделю измеряли количество мочи, выделяемое каждым жнвотным за сутки после введения контрольным группа?/ -водную нагрузку (5% от массы животного), а опытным группам - водную нагрузку, содержащую суточную дозу напитка ТР.

Лиофшшзацию зерен осуществляли на сублимационной установке ЗЕСРИОШ фирмы УШТК, используя защитные среды (Дмитриченко М.Й., 1971).

Результаты и их обсуждение

В гомогенизате зерен ТР при микроскопическом исследовании были обнаружены три основные группы микроорганизмов: дрожжи, грамположнтельные и грамотрицателыше бактерии. Методом прямого посева десятикратных разведений на плотные питательные среды (МРС-4, ацетатный агар Рогозы, сусло-агар с мелом, Сабуро, ОУР, МУР, этанольная среда Фратера) гомогенизата зерен были выявлены два вида дрожжевых культур, молочнокислые и уксуснокислые палочки. Предполагая, что взаимосвязь микроорганизмов в природной ассоциации могла повлиять на биохимические процессы и культурально-морфологические свойства отдельных симбионтов, каждый выделенный юолят, до его идентификации, подвергали многократному рассеву с отбором характерных колоний.

Одна из дрожжевых культур на агаризованных средах через трое суток роста при температуре 24°С образовывала круглые гладкие, равномерно выпуклые матовые колонии белого цвета диаметром 3-5 мм, с ровным краем; на

жадких - формировала белый осадок, пленки не было, надосадочная жидкость прозрачная. В окрашенных мазках - это почкующиеся овальные клетки размером 3-5x6-9 мкм. На среде Городковой образовывала 2-4 1фуглые аскоспоры. Культура ферментировала глюкозу, галактозу, сахарозу и ассимилировала трегалозу, из азотсодержащих соединений - натрия нитрат, мочевину, аланин. Крахмалоподобных веществ не синтезировала. Кислотообразование на меловом агаре отсутствовало. Желатин не разжижала, мочевину не гидролизовала. Данная культура была отнесена нами к виду Saccharomyces cerevisiae Hansen 1883.

Вторая культура дрожжей была определена нами как новый вид Candida abética. Культура. (1 мес., 25°С) на сусло-агаре образовывала белые или бледно-кремовые складчатые пастообразные матовые колонии с волнистым краем. Через 3-е суток (25°С) роста в глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом давала полярно- шш односторонне почкующиеся овоидные или удлиненные клетки, 3.5-5.0x8.0-12.0 мкм, некоторые до 18 мкм. Ультраструктура клеточной стенки двухслойная (аскомицеговый тип). Культура через месяц роста на жидкой среде формировала пленку и осадок. На глюкозо-картофельном агаре образовывала рудиментарный псевдомицелий (тип Candida). Аскоспоры, балистоспоры, хламидоспоры не образовывала.

Культура не сбраживала сахара; ассимилировала: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, маннозу; трегалозу, этанол и салицин (слабо), нагрия ншрат, не ассимилировала - сорбозу, лактозу, мепибиозу, растворимый крахмал, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, ыаннитол, шюзитол, D.L-молочную кислоту, натрия нитрит. Росла в безвитамнкной среде. Максимальные для роста (сусло-агар): температура - 30°С , концентрация хлорида натрия в среде - 6%. Крахмалоподобных веществ не синтезировала. Кислотообразование на меловом агаре отсутствовало. Желатин не разжижала, мочевину не гидролизовала.

На первом этапе исследования лактобиоты зерен TP было выделено три вида лактобацилл, обозначенные для удобства работы с ними I, 2, 3. Выделенные культуск рассевзяи истощающим посевом на среде MPC-în. В рассевах кулыур 1-го и 2-го типов вырастали колонии характерные для каждого тала: 1 - прозрачные с шероховатой поверхностью и волнистым краем, округлые, диаметром 2-3 мм; 2 - прозрачные округлые колонии, диаметром 1-2 мм и с волнистым краем, врастающим в агар.

Лактобациллы 3-го типа при рассеве образовывали три вида колоний, отличающихся по своей морфологии. Одни из них были аналогичны первоначально выделенным: белые, гладкие, выпуклые, круглые, диаметром 1,52,5 мм. Второй вариант колоний отличался от исходного сильно выпуклым, куполообразным центром, диаметром 2,5-3,0 мм. Культура этого типа была обозначена как 3-1 тип. Третий вариант отличался от исходного слизистой

консистенцией, колониикак бы растекались от выпуклого центра к периферии, а изоляты 3 и 3-1 типа были пастообразными. Третий вариант был обозначен как 3-2 тип. В окрашенных мазках бактерии 3, 3-1 и 3-2 типов почти не отличались между собой, имели вид палочек с прямыми концами, размером (0,6-1,0)х (2,04,5) мкм, расположенные единично или в коротких цепочках.

Таблица 1.

Идентификация лакгобацилл_

Признаки И золяты

1 2 3 3-1 3-2 3-5

Наличие каталазы - - - - - -

Предел кислото-

образования,0 Т - 88±5 154±7 163±5 - -

Рост при 15° С + - + + + +

Рост при 45° С - - - + - -

NHj из аргинина + - - - - +

Сбраживание

углеводов:

арабинозы + + - - - +

галактозы + + + + + -

глюкозы + + + + + +

т^о ттх тттжсг гттглт^лттото & ^UVAWUМ X U j- - л. .1. л.

ксилозы + - - - - -

крахмала - - - - - -

лактозы + + + - -

мальтозы + + + + + +

маннитола - - + + + -

маннозы - + + + + +

мелецитозы . - - + + + -

мелибиозы + + - - - +

раффинозы + - - - - -

рамнозы - - - + - -

рНООЗЫ -ь ± -ь -j- +

салицина - + + + + +

сорбитола - - + 4 + -

сахарозы - + + + + +

трегалозы - + + + + -

фруктозы + + + + + +

эскулина ± + + + + +

этанола - - + - -

Видовая bre\is acido- casei casei subsp. casei subsp. divergens

принадлежность philus subsp. rhamnosus casei var.

Lactobacillus casei alactosus

Примечание: + - всегда положительный тест; — - всегда отрицательный

тест; ± - 80 % из всех опытов положительные.

Используя предварительное подращивание гомогенизированных зерен в жидкой МРС-1, удалось выявить еще один вид лактобащшл - 3-5. Данная культура формирует слизистые круглые плоские колонии молочного цвета, диаметром 1,0-1,5 мм. При микроскопии окрашенных мазков лактобактерии 3-5 типа наблюдали цепочки из палочек, как бы «склеенные» между собой, с образованием блоков.

Грамположительные, неспорообразующие, каталазо-отрицательные изолягы (1, 2, 3, 3-1, 3-2, 3-5) были отнесены к роду Lactobacillus Beijerinck 1901; они продуцировали молочную кислоту на среде с глюкозой по гомо- или гетероферментативному типу. Характеристика и идентификация молочнокислы* бактерий приведены в таблице 1. Только два типа культур 1 и 3-5 окисляли глюкозу с выделением СО2 и являлись облигатно-гетероферментативными. Данные культуры не росли при температуре 45°С, образовывали аммиак из аргинина, но по разному сбраживали углеводы. Изолят 1-го типа был определен как Lactobacillus brevis (Orla-Jensen 1919) Bergey, Breed, Hammer, Huntoon Murray and Harrison 1934. Ассоцианг 3-5 был отнесен к L divergens Holzapfel and Gerber 1984, он, в отличие от представителей этого вида сбраживал арабинозу к не ферментировал трегалозу.

Бактерии 3-го, 3-1-го и 3-2-го типов имели сходные морфологически« характеристики, проявляли одинаково высокую ферментативную активность í все были отнесены к виду L casei (Orla-Jensen 1916) Hansen and Le 1971. ( двумя подвидами. Ассоцианг 3-1-го типа сбраживал рамнозу, рос npi температуре 45°Си был выделен в подвид L, casei subsp. rhamnosus Hansen 1968, г лактобацилпа 3-2-го типа - в подвид L casei subsp. casei var. alactosus Mills anc Lessei 1973, так как не ферментировал лактозу.

Изолят 2-го типа определен нами как L acidophilus (Moro 1900) Hansen anc Mocquot 1970 , хотя являлся нехарактерным представителем этого вида, так Kai не ферментировал крахмал, не рос при температуре. 45°С, медленно створажива;

---------/..1 4 -----„ ____------т-1 ПМ!Т\

Y>h З-т VJÍ ísja; v í—luyJ íj. ■

Грамо1рицательные каталазоположительные бактерии были отнесены i группе уксуснокислых. Ассоциакты 4-го и 4-1-го типов по свое! макрсмсрфолсгнн представляли слизистые слабсвыпуклые круглые колонии размером 2,5-4,5 мы, отличавшиеся между собой только цветом (оранжевые i розовые). В окрашенных мазках - это эллипсоидные палочки, размером (0,8 1,2)х(1,2-2,6) мкм. Данные ассоцианты сверхокнсляли этанол и были определень нами как Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens Beijerinck 1898 (Табл. 2.).

Изолят 5-го тала на агаризованных средах формировал плоские блестящи! колонии молочного цвета, диаметром 1,5-2,0 мм. По микроморфологии - эт< короткие сдвоенные палочки, размером (1,0-1,2)х(1,1-1,4) мкм. Культура 5-п типа образовывал коричневый пигмент, пщроксиацетон из глицерола i

кристаллы 5-кетоглугаровой кислоты (через 4-5 недель культивирования на сусло-агаре) и был идентифицирован как Gluconobacter oxydons (Henneberg) De Ley 1961, Asai, Iizuka et Komagata 1964 (Табл. 2.).

Таблица 2.

Видовая характеристака уксуснокислых бактерий

Признаки Изоляты

4 4-1 5

Окраска по Граму - - -

Подвижность + + +

Рост на МПА - - -

Разжижение желатина - - -

Рост при рН 3,2 + +

Рост при рН 8,2 - - -

Рост при 0,25 М КаС1 - - -

Сверхокисление этанола + + -

Наличие каталазы + + +

Рост на среде Хойера - - -

Ассимиляция: глюкозы - - +

фруктозы - - +

уксусной кислоты + + -

молочной кислоты + + -

этанола + i "Г -

маннитола - +

Образование кислоты из: глюкозы - +

маннитола - +

глицерола - +

Гидрокснацетон из глицерола - +

Синтез целлюлозы - -

Коричневый пигмент a.

Видовая принадлежность Acewbacier pasieurianus Gluconobacte

subsp, ascendens r oxydans

Методом прямого посева гомогенизата зерен ТР и напитка было установлено, что основную часть микробиоты ассоциации ТР образовывали лактобациллы, но их соотношение в напитке и в зернах несколько различно (Табл. 3.). Большая часть лактобиоты напитка была представлена двумя лактобациллами - гомоферыентатавяьш видом Ь. са$ет и гетероферментативным видом Ь. ¿п^епз, на их долю приходилось 90 % от общего числа микроорганизмов, а количество других молочнокислых бактерий не превышало

3 %. Основу зерен изучаемой природной ассоциации составляли ране< перечисленные виды лакгобацилл и L acidophilus. Число уксуснокислых бактерт в напитке составляло 6,8 %, а в зерне их количество - 0,045 %. Самым! малочисленными представителями ассоциации в напитке являлись дрожжевые культуры - 0,5 %.

Таблица 3.

Процентное соотношение микроорганизмов в ассоциащш TP

Виды микрооганизмов-ассоциантов в зерне в напитке

Lactobacillus brevis 4,5 0,9

Lactobacillus acidophilus 40,0 1,8

Lactobacillus casei 40,0 70,0

Lactobacillus divergens 15,0 20,0

Acetobacter ptfsteurianus subsp. ascenders 0,04 6,2

Ghtconobacter oxydans 0,005 0,6

Saccharomyces cerevisiae 0,45 0,45

Candida libetica 0,005 0,05

nnninlii^rtт—гTilirT^iTTrci iif'tm^tnn л лл/>гтпт>лп I П

p^unvvinvuvaxui мшриич/о'омл^Дпашио i jl

осуществлялись по типу синтрофии, т.е. обеспечивали друг другу взаимовыгодное питание, что н позволяло развиваться всем симбионтам па простой по своему составу питательной среде МСВ при температуре 24-25 °С. Из представителей лакгобиоты природной ассоциащш в данных условиях быстро росли представители вида L. divergens (3-5), которые через 16 ч формировали осадок. Другие молочнокислые палочки могли расти на среде МСВ, но очень медленно. Скорость их роста увеличивалась при повышение температуры культивирования до 30 - 37 °С. При этом было замечено, что лактобациллы, принадлежащие к виду L. casei, на среде МСВ через 5-7 суток роста формировали слизистый осадок углеводного состава. Культура L casei subsp. rhmnosus образовывала слизистые комочкц похожие по внешнему виду на натизны& зерна 1 ir*. на основание чего мы предположили, что эта культура является мнкрииом-продуцентом стромы зерна, объединяющей симбионтов ассоциации ТР. Другие молочнокислые палочки на среде МСВ образовывали хлопьевидный осадок, за включением лакгобацилл вида L. brevis, которые не росли на МСВ.

Из дрожжевых культур на МСВ среде хорошо развивались представители вида Saccharorriyces cerevisiae, образуя осадок. Дрожжи принадлежащие к новому виду Candida libetica, хотя и способны ассимилировать сахарозу в качестве единственного источника углерода, но на среде МСВ развивались, образуя слабую пленку.

Ацето- и ппоконобактерии не росли на среде, подходящей для всей ассоциации, так как среда МСВ не содержит необходимых для их

культивирования источников углерода. Рост и развитие ацетобактерий полностью зависело от жизнедеятельности дрожжей и лактобациля, так как продуцируемые ими этанол и молочная кислота являлись субстанцией для уксуснокислых бактерий. Глюконобактерии для своего роста использовали глюкозу или фруктозу, которые образовывались в результате расщепления сахарозы и лактозы другими микроорганизмами ассоциации ТР.

По сканирующим микрофотографиям сколов и поверхности зерен ТР можно судить о их рыхлой ячеистрй структуре, в которой много пор, заполненных дрожжами и бактериями. Поверхность зерен покрыта кратерами, образованными газообразными веществами, выходящими наружу. Газообразные вещества, в основном углекислый газ, образовывались в результате брожения микробов-ассоциантов внутри зерен.

Зерна очень влажные, их влажность, в среднем составляла 82 %. Через поры в зерно поступали питательные вещества и вода, а наружу - в культуральную жидкость происходило проникновение микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

Точное распределение микроорганизмов-симбионтов с помощью электронной микрофотографии установить не удалось. Образцы микротомных срезов зерен ТР получались хрупкими и неоднородными по своей структуре, они рассыпались на две составные Части. Зто может свидетельствовать о том, что строма зерна состоит из двух отличных друг от друга по природе веществ, связанных непрочной связью. Можно лишь предположить, что распределение микроорганизмов в зерне зависит от их отношения к кислород}'. Внутри зерен находятся анаэробные молочнокислые палочки, а ближе к поверхности дрожжевые культуры, ацего- и глюконобактерии.

Нами было установлено, что в одном грамме исследуемого натазного зерна природной ассоциации находилось 4-6x103 кояониеобразующих клеток, из которых 99% являлись кислотообразующими (о чем свидетельствует формирование зоя просветления вокруг колоний па сусло-агаре с мелом). После 72 часов культивирования зерен на МСВ значение рН среды достигало 3,35±0,1, биомасса зерен возрастала на 40-60 % (рис. I). При этом, в процессе культивирования количество микроорганизмов в пересчете на I г зерна оставалось одинаковым.

Представляло интерес определить основное вещество, образующее строму зерна ТР. По количеству редуцирующих Сахаров было установлено, что 64 % от массы абсолютно сухих зерен составляли углеводы. С помощью качественного анализа Сахаров методом бумажной хроматографии было определено, что основным компонентом стромы являлся гдюкан. Данный полисахарид был устойчив в кислой и нейтральной среде и легко растворялся в щелочной. Водной

экстракцией при кипячении было получено лишь 0,4 % полисахарида ох общего количества, полученного при растворении зерен в щелочной среде.

По удельному углу" оптического вращения выделенного полисахарида (+175±2) можно сделать вывод о преобладании в нем а-гликозидных связей в полимере.

время, ч

Рис. 1. Изменение прироста биомассы зерен та, % (1) и

рН среды (2) при культивировании природной ассоциации "Тибетский рис" на МСВ за 120 ч.

Нами были подобраны условия культивирования зерен ТР, одновременно пригодные н для производства напитка. Выращивание зерен ТР проводили в модочно-сахарной воде (МСВ), для стандартизации которой в ее состав было включено сухое молоко в концентрации 0,65% (по сух. весу) и сахароза - 6%. Многократное выращивание в такой среде привело к измельчению и вымыванию зерен. Поэтому вместо сухого молока в дальнейшей работе использовали цельное пастеризованное молоко (1,5% жирность), которое добавляли в концентрации 4%. Затем для улучшения вкусовых качеств напитка в экономических соображений концентрацию молока в питательной сред? МСВ уменьшили до 2%. а сахарозы - до 4%.

Компонентный состав питательной среды влиял на выход биомассы зерен ТР и на кислотность напитка. Изменяя соотношение питательных веществ в МСВ, можно было изменять процесс культивирования природной ассоциации. Для наработки большого количества биомассы зерен достаточно увеличил, концентрацию сахара до 5 % и молока - до 4 % в питательной среде (Табл. 4.). Но при этом ухудшались органолептические показатели напилка, он становился менее кислым (10-120 Т).

При культивировании ассоциации ТР в МСВ основная масса зерен располагалась на дне флакона, лишь некоторые всплывали вверх за счет пузырька газа, находящегося внутри зерна. Количество газообразных веществ

постепенно увеличивалось и разрывало зерно на 2-3 части, которые опускались вниз. Такое движение зерен в толще питательной среды продолжалось в течение всего процесса культивирования, обеспечивая тем самым перемешивание и равномерное распределение питательных веществ. Через 7-9 часов от начала культивирования наблюдали образование взвеси белых хлопьев из сгаороженного молока, входящего в состав МСВ. Основная часть створоженного молока оседала на дно флакона, и содержала большое количество лактобацилл. Еще через 14-16 часов на поверхности культуральнон жидкости образовывалась белая неплотная пленка, в которой обнаруживались уксуснокислые бактерии и дрожжи вида С. г¡Ьегка.

Таблица 4.

Изменние относительного прироста биомассы зерен (Дт) и рН напитка при _выращивании "Тибетского риса"__

Компоненты питательной среды, % Дга, % рН

молоко сахароза

- 6,0 4,67 ±2,13 3,72 ±0,05

0,65 (сухое) 6,0 21,55 ±4,31 3,50 ±0,12

0,65 (сухое, витаминизированное) 6,0 32,66 + 3,99 3,49 ± 0,08

4,0 (цельное, жирность-2,5%) 6,0 53,30 + 4,52 3,76 ±0,05

2,0 (цельное, жирность-1,5%) 6,0 55,36 ± 2,32 3,62 ±0,10

4,0 (цельное, жирность-1.5%) 5.0 66,30 + 3,63 4.25 + 0;06

2,0 (цельное, жирность-1,5%) 4.0 52,36 ± 4,5! 3,40 + 0,08

Напиток, получаемый через 3-е суток, имел слабо кислый вкус, приятный запах и был слегка газированным. Количество жизнеспособных клеток в культуралькоп жидкости достигало максимального уровня - (2-3)х108 кл/мл (Рис. 2). В процессе кулыивирозаяия в первые сутки увеличивалось количество клеток б среде, з затем возрастала ономассз зерен.

Проанализировав состав нативного раствора, полученного при центрифугировании трехсуточной культуральной жидкости, мы установили, что в нем находится молочная кислота, остаточные сахара (10,0+0,2 мг/мл), белок (1,5±0,3 мг/мл), полисахарид - глкжан (1,8 мг/мл). Изменение концентрации молочной кислоты в процессе выращивания зерен ТР на МСВ приведено на рисунке 2, ее содержание в напитке возрастало до 0,15±0,03 %. С помощью качественного анализа углеводов нашпка ТР было установлено, что основными компонентами являются глюкоза и фруктоза, в следовых количествах обнаруживаются сахароза и лактоза.

время,ч

Рис. 2. Изменение количества жизнеспособных клеток, LgN (1) и концентрации молочной кислоты, % (2) в налитке при культивировании зерен "Тибетского риса" на МСВ за 120 ч.

В работе была оценена биологическая активность некоторых микроорганизмов изучаемой ассоциация. Все выделенные лакгобациллы обладали антагонистической активностью к бактериальным тест-культурам, но в различной степени. Наименьшую активность проявляли бактерии вида L divergens, а культуры принадлежащие к видам L. acidophilus и L casei обладали высокими антибактериальными свойствами (зоны - 2,5-8,0 мм). Выделенные лакгобациллы не обладали антигрибковой активностью (Табл. 5.).

Таблица 5.

__Антагонистическая активность молочнокислых бактерий

Лакгобациллы lp Зона отсутствия роста тест-микроба, d мм

В. subtüis St. aureus Е. coli Ps. aeruginosa С. albicans

L brevis 1 А,15 3,0 - 1,25 -

L acidophilus 2 5,0 2,5 1,25 2,75 . -

L casei subsp. casei 3 6,0 3,0 - 2,25 -

L casei subsp. fhutTuiOSUS 3-i 8,0 4,5 3,25 3,0 -

L casei subsp. casei sar. clcctosus 3-2 6,5 5,0 1,25 4,25 -

L. diver gens 3-5 3.0 1,5 - 1.0 -

Антагонистическая активность лактобацилл может зависеть не только от синтеза молочной кислоты, но и от других биологически активных соединений, например лизоцима. Поэтому был проведен эксперимент по выявлению лизоцим-синтезирующих штаммов, изолированных из природной ассоциации ТР. В результате было установлено, что продуцировать лизоцим могли молочнокислые бактерии, принадлежащие к видам L. casei и L. brevis. Культуры видов L. casei sub.

casei 3 и L. casei sub. rhamnosus 3-1 обладали средней лизоцим-синтезирующей активностью, а лактобапиллы видов L. brevis и L. casei vor. alactosus 3-2 - низкой.

Другие микроорганизмы-ассоцианты не обладали выраженным антагонисткчесхим действием в отношении тест-микробов. Дрожжевые культуры, так же как и натггок TP, наоборот, усиливали их рост. Это можно объяснить слабой кислотностью напитка (30-40 ° Т), а так же присутствием в напитке остаточных Сахаров и факторов роста.

На основе молочнокислых микроорганизмов природной ассоциации TP возможно создание препаратов-эубиотижов. Такой препарат может содержать все микрооргангомы-ассоцианга или некоторые лактобациллы, обладающие наилучшими показателями, влияющими на качество биопрепаратов. Одним из таких показателей является широкий спектр антагонистической активности к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Как было показано выше, лактобациллы TP проявляют антагонистическую активность к условно-патогенным бактериям (P. aeruginosa, Е. coli, S. aureus), и поэтому возможна экстраполяция этих данных на патогенные нигеллы, рекомендованные для исследования производственных штаммов эубиотиков.

Другим немаловажным показателем для биопрепаратов является степень адгезивности к слизистой оболочке кишечника человека. Молочнокислые бактерии были проверены на возможность адгезпроваться в кишечнике человека по среднему показателю адгезивности (СПА) in vitro к форыалиннзированным эритроцитам человека. Лучшими показателями адгезивности обладали культуры принадлежащие к виду I- c.nsei, Щтамм U casei subsp. cesei 3 имеет высокую степень адгезии (СПА - 4.05), а два других штамма этого вида 3-1 и 3-2 - среднюю (СПА - 3,4 и 2,69). Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные культуры могут задерживаться в организме человека благодаря своим адгезивным свойствам и способности активно развиваться при температуре 37 с С. Другие лактобациллы, выделенные из природной ассоциации TP, имели умеренную или пониженную способность адгезировать к формазянизированным эритроцитам, поэтому вероятность их прикрепления к слизистой кишечника очень незначительна.

Третьим показателем для разработки перспективных препаратов-эубиотиков является устойчивость микроорганизмов к лекарственным препаратам, обладающим антимикробной активностью. Лактобациллы 'Тибетского риса" проявляли устойчивость к ряду антибактериальных веществ, в том числе к аминогликозидам, ванкомицину, полимиксину, ристомицину, фузидану, а некоторые - также к оксацилину, тетрациклину, цефалоспоринам. Все изучаемые молочнокислые микроорганизмы были чувствительны к антибиотикам пенициллинового ряда, а также к эритромицину, олеацдомицину,

линкомицину, юпшдамицину, левомидетину. Наиболее устойчивыми к антибиотикам являлись культуры видов L casein L. diver gens.

В настоящее время большое внимание уделяют биопрепаратам, состоящим из двух и более культур, которые дополняют действие друг друга (Бифаццд, Бификол, Бифилакт, Ацилакт и др.), а также эубиотакам, основанным на использовании симбиотических искусственных систем (Витафлор - 2 штамма L. acidophilus). В нашем случае, культуры уже находились в симбиотических взаимовыгодных условиях, созданных природой за многие годы, и поэтому идеально подходили друг к другу.

По разрозненным данным известно, что применение напитка "Тибетский рис" повышает сопротивляемость организма человека к простудным заболеваниям, нормализует функцию кишечника, обладает мочегонным эффектом. Поэтому было интересно исследовать шшяние напипса на функциональную активность некоторых систем организма.

Мы изучили влияние TP на активность сывороточного лизоцима (неспецифический фактор защиты) и интенсивность антителообразования в ответ на стандартный Т-зависимый антиген - эритроциты барана (гуморальный иммунный ответ).

Однократное внутрйбрюшшное введение напитка TP белым иьппам-c*iM цам иоьшдало активность сывороточного лизоцкма через сутки во всех испытанных дозах (103, 105, I07 кл/мышь), а при введение зерен эффект наблюдали только в наименьшей дозе (103 кл/мышь). Через неделю от введения стиыулврующее действие снижалось (Табл. 6).

Таблица 6.

Активность сывороточного лизоцима после внутрибрюшинного введения мышам зерен или напитка "Тибетского риса" (мкг/мл).

Вводимый препарат Учет через Доза, кл/мышь Контроль, ЙЖ. P-D

105 105 10'

Напиток TP 1 сутки 4-1,2± 1,7 " 43,3±2,0 " 36,6±2,0 * 29,4±2,3

• 7 суток 30,1±1,9 30,2+2,1 . 25,7±1,9

Гомогени-зат зерен TP ! сутки 59,2+3,5' 53,9+1,7 51,0+1,6 49,5+3,1

7 суток 38,0±2,1 31,б±1,9 - Зб,7±2,0

««-р <0,001 *-р <0,01

Кормление зернами или напитком ТР в течение 2-х месяцев не отразилось на активности лизоцима. Однако, прием напитка усиливал ответ гемагглютининов (с 27,1±8,3 усл. ед. до 70,8+29,2 усл. Ед.) в ответ на эритроциты

барана, т.е. влиял на возрастание синтеза иммуноглобулинов. Зерно не обладало адыовантным эффектом.

Внутрибрюшинное введение мышам-самцам зерен в малых дозах повышало титр гемолизинов в ответ на эритроциты барана, введенные зз сутки до инъекции, а введение культуральной жидкости снижало их (Табл. 7.).

Таблица 7.

Влияние "Тибетского риса" на иммунный ответ к эритроцитам

Вводимый Доза, кл/мышь Контроль,

препарат Юз 105 10' фгоиол. р-р

Гомогенгоат 1,6+1,0 19,5+5,7

зерен ТР 39,4+18,3 * 11,1±5,2 5,1±3,2

Напиток ТР 6,6±4,2 19,5±5,7

2,8±0,9 ** 12,6+5,9 5,1+3.2 •

**-р 5 0,001 *-р <0,01

Таким образом, внутрибрюшинное введение напитка ТР оказывало положительное влияние на неспецифаческие факторы защиты организма, а кормление им усиливает гуморальный иыыушшн ответ.

Установлено, что напиток "Тибетского риса" обладал слабым диуретическим эффектом, который проявлялся через 4 недели от начала эксперимента у животных, которым вводили напиток ТР через зонд ежедневно, и через 3 недели - в группе животных, получавших напиток, без принуждения, вместо воды (Табл. 8).

Таблица 8.

Диуретический эффект нагппна "Тибетский рис" в опыпе на белых крыцах-___самцах___

Группа Среднее количество мочи за сутки, после введения

5 % нагрузки, в % от массы животных (по неделям)

животных до опыта первая вторая третья четвер. шестая

№ 1, получали МСВ 5,95±0,33 1,78± 4,59± 6,03± 5,41± 4,08±

по 0,75% 0,51 0,68 0,72 0,38 0,63

Ш 2, получали 6,О9±0,53 2,94± 5,51+ 7,18± 7,36+ 4,31±

напиток по 0,75 % 0,73 0,66 0,45 0,60 0,50

№ 3, пили воду 6,55+0,40 6,18± 5,75± 6,10± 5,94± 6,39±

0,33 0,42 0,06 0,51 0,38

№ 4, пили напиток 6,49+0,26 6,71+ 7,45± 8,18± 6,17± 6,27±

вместо воды 0,51 0,34 0,26 0,42 0,40

Последующий прием напитка приводил к привыканию и мочегонный эффект исчезал. Изменения значений рН мочи у контрольных животных варьировало в пределах 6,5-8,2, во 2-ой группе - 6,4-7,2 , в 4-ой - 6,3-6,7. Данные о содержании в моче кристаллов фосфатов и оксалатов у животных 2-ой группы были неоднозначными, а в 4-ой группе имело место соответствие между максимальным количеством выделяемой мочи и максимальным количеством кристаллов в ней. При микроскопическом исследование мочи от животных 4-ой группы мы наблюдали как крупные, сросшиеся между собой кристаллы, распадались на более мелкие. Эта данные свидетельствуют о способности напитка TP растворять кристаллы фосфатов и оксалатов, а следовательно, может быть применим как средство для лечения гипероксалурии.

Одним из ферментов, используемых в качестве критерия нормальной работы печени, является аланинаминотрансфераза (ALT). Увеличение концентрации этого фермента происходит при повышенной нагрузке печени и при несбалансированном питании или при употреблении трудноиериваримых ' пищевых продуктов. При определении ALT в груше животных, принимавших напиток TP без ограничения, в сравнение с контрольной группой не выявлено значимых различий (Табл. 9).

Б эксперименте на крысах-самцах было установлено, что ежедневное пероральное введение напитка TP практически не отразилось на лейкоцитарном составе крови животных (Табл. 9.). Жизнеспособные клетки, введенные в высоких дозах (10s кл/ыл), не расценивались организмом животных как антигенные структуры и поэтому не вызывали активацию лейкоцитов крови.

Таблица 9.

Концентрация лейкоцитов и алаяипаминотрансферазы (ALT) Б сыворотке

крови белых крыс-самцов

Показатель Животные До опыта 1 день 3 дня 10 дней 13 дней 23 день

Группа 18,24± -17,35± 13,53+ S,58± 12,88+ 12,28+

Лейкоциты, №1 1,65 2,25 1,87 2,23 2,64 1,90

v 1 АУ цд/д Группа 15,57+ Т7+ 10 6Л-1-* 9,13+ IfiOi-i- 12,39+

»<• А J№ JL 1,28 2,15 3,66 1,69 2,54 1,57

Алании Группа 0,171+ 0,456± 0,477+ 0,44б± 0,333± 0,305±

аминотранс- №3 0,011 0,043 0,030 0,047 0,032 0,021

феразы, Группа 0,287± 0,375± 0,359+ 0,302± 0,323± 0,432±

мкм(с • л) №4 0,031 0,022 0,031 0,040 0,013 0,024

На кафедре фармакологии СПХФА было изучено общеукрепляющее действие напитка ТР при ежедневном однократном введение белым крысам-

самкам. Контрольные и опытные крысы содержались в одинаковых условиях и получали одинаковый пищевой рацион. Динамика изменения массы тела у животных опытной группы по сравнению с контрольной свидетельствует о положительном общеукрепляющем эффекте напихка ТР.

Проведенные клинические исследования напитка "Тибетский рис" на базе клиник JIOMO и BMA им. Кирова показали хорошую эффективность его применения в комплексной терапии больных с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которая проявилась в уменьшении степени дисбактериоза толстого кишечника, улучшения общего самочувствия и уменьшения как общих, так и специфических жалоб, характерных для заболеваний ЖКТ. В результате лечения наблюдалась положительная динамика показателей состояния иммунной системы, опосредованная улучшением качественных и количественных параметров кишечного микробоценоза.

Были изучены способы длительного хранения природной ассоциации ТР. Простое замораживание не дало желаемого результата, в процессе культивирования зерен после замораживания наблюдали вначале уменьшение прироста биомассы, а затем измельчение зерен. В культуральной жидкости резко уменьшалось количество дрожжевых клеток - до 103 кл/мл, уменьшалась кислотность напитка (9-10 « Т) и он не был газированным. Простое замораживание плохо влияло на жизнеспособность отдельных видов микроорганизмов в ассоциации TP, что в свою очередь нарушало соотношение симбионтов я приводило к гибели всей ассоциации.

Было целесообразно применить для хранения природной ассоциации сублимацию зерен ТР. Предполагая, что строма зерна могла служить защитой для микроорганизмов TP, первоначально проводили лиофилизацию отмытых нативных зерен. Но высушенные таким способом зерна не сохраняли свою биологическую активность. Поэтому в последующей работе для сублимации природной ассоциация использовали специальные защитные среды.

Биологическая активность зерен TP оставалась на уровне контроля при использовании в качестве захшпной соеды Ю/'с-ого раствора сахарозы в воде* идн в обезжиренном молоке, МСВ (Рнс. 3, 4).

При использовании в качестве протектора при сублимации обезжиренного молока зерна сохраняли способность быстро развиваться в питательной среде и накапливать биомассу, в 1,3-1,5 раза превышающую прирост биомассы контрольных нативных зерен (Рис. 3). Однако, вкусовые качества. напитка, полученного из таких зерен, не соответствовали норме, его кислотность в 1,5 раза была выше таковой в напитке из нативных зерен (Рис. 4.). Содержание лактобацилл в напитке увеличивалось почти в 2 раза по сравнению с контрольной фермевггацией нативных зерен. Свойства напитка восстанавливались до нормы только к третьей ферментации в МСВ.

К I II III IV V VI VII VIII IX

Рис. 3. Зависимость прироста биомассы "Тибетского риса" от качества протектора при яиофилизации зерен: I - МСВ; II - 10 % раствор сахарозы; III - 20 % раствор сахарозы; IV - 25 "А раствор сахарозы; V - 20 % раствор глицерола; VI - 10 % раствор сахарозы в обезжиренном молоке; VII - 5 % раствор глюкозы в обезжиренном молоке; VIII - обезжиренное молоко; IX - раствор сахарозы и желатина в обезжиренном молоке; К - контроль, зерна без лиофилизадаи. 1 - первая ферментация; 2 - вторая ферментация; 3 - третья ферментация.

К . I

II

III IV

VI VII VIII IX

Рис, 4. Завискмоть кислотности напитка "Тибетский рис" от его лиофилизащш в различных протекторах: I - МСВ; II - Í0 % раствор сахарозы; III - 20 % раствор сахарозы; IV - 25 % раствор сахарозы; V - 20 % раствор глицерина; VI -10 % раствор сахарозы в обезжиренном молоке; VII - 5 % раствор глюкозы в обезжиренном молоке; VIII - обезжиренное молоко; IX - раствор сахарозы и желатина в обезжиренном молоке; К - контроль, зерна безлиофшшзации.

I - первая ферментация; 2 - вторая ферментация; 3 - третья ферментация.

Напиток, получаемый из зерен лиофилизированных в МСВ при первой ферментации, по своим характеристикам соответствовал напитку, образованному натавными зернами. Полностью восстанавливались

органолептичесхие свойства напитка, его кислотность и способность зерен накапливать биомассу, данные показатели сохранялись при последующем культивировании (Рис. 4). Активность зерен ТР в течение длительного срока сохранялась при использовании в качестве защитной среды обезжиренного молока (до 2 лет) или МСВ ( до 1,5 лет).

Приготовление напитка в домашних условиях из натавных зерен ТР рассчитано на емкость объемом 1 литр, но эти данные можно легко пересчитать на любой другой объем, не превышающий 5 л, в пропорциональной зависимости.

Для получения напитка необходимо внести 3 столовые ложки нативных зерен ТР в 1 литровую емкость, затем добавить 3 столовые ложки сахара и 4 чайные ложки молока (жирностью не более 2 %). Емкость следует наполнить водопроводной водой, очищенной бытовым фильтром, перемешать и закрыть плотно крышкой. Емкость должна быть заполнена водой таким образом, чтобы от уровня жидкости до крышки оставалось около 1 см. Через трое суток полученный напиток отфильтровывают через мелкое сито или марлю в 4 слоя. Напиток должен обладать приятным кисло-сладким вкусом, с характерным кисловатым запахом, по внешнему виду - опалесцирующая жидкость, слабо газированная. Образовавшиеся зерна ТР в результате выращивания необходимо отмыть очищенной водой и вновь использовать или хранить в холодильнике з

|»итл«т ргл?» гтгп»V1«I1 тто ^пттаА 1 +\£%чг моттатгт ршлил \iaiAWxn ^Л^У Ж 4//х •

Следующий способ приготовления напитка ТР в домашних условиях возможен из биологически активной добавки (БАД), созданной на основе природной ассоциации "Тибетский рис" на кафедре микробиологии СПХФА. БАД "Тибетский рис" представляет собой белые гранулы размером 2-7 см, без вкуса и запаха, полученный путем лиофилизации нативных зерен ТР в защитной среде.

Для приготовления напитка из БАД ТР зерна необходимо залить очищенной водой и дать им набухнуть в течение 2-х часов при комнатной температуре. Затем зерна отделить от жидкости и перенести з емкость на 250 мл, добавить 1 десертную ложку сахараи! чайную ложку молока (жирностью 1,5-1,8 %) и провести культивирование как описано выше для нативных зерен.

Для получения БАД вначале нарабатывали нативные зерна ТР в стерильной питательной среде МСВ в емкости на 5 л при температуре 24 0 С. Через трое суток выделенные фильтрованием через мелкое сито (<1 < 0,5) зерна ТР равномерно распределяли на поддоне слоем толщиной 1 - 1,5 см, заливали защитной средой так, чтобы полностью закрыть поверхность зерен. Сублимацию зерен ТР проводили на установке БЕСРЯОЮ фирмы \TRTIS. Лиофилизнрованные зерна фасовали по 2,5 г в стеклянные флаконы на 50 мл, герметично укупоривали резиновыми пробками, обжатые алюминиевыми

колпачками. Возможна также упаковка в двойные полиэтиленовые пакеты из "пищевой" пленки.

Разработанный нами технологический процесс получения напитка на основе природной ассоциации "Тибетский рис" схематично представлен на рисунке 5.

Рис. 5 Технологическая схема производства напитка "Тибетский рис"

Обобщая результаты изучения природной ассоциации ТР, следует отметить ее лечебно-профилактическое значение для здоровья человека, за счет активации иммунитета и нормализации работы почек и мочевыводящих путей. Приготовление напитка на основе ТР достаточно простое и может быть осуществлено в домашних условиях. Для этого необходимо иметь нативные или лиофилизированные зерна ТР.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изолированы и идентифицированы 11 микроорганизмов, составляющие. природную ассоциацию "Тибетский рис" и принадлежащие к восьми видам.

2. Основная часть микробиоты представлена лактобацнллами. К минорным ассоциантам относятся дрожжевые организмы, один из которых определен как новый вид Candida tibeiica.

3. Зерна изучаемой природной ассоциации содержат до 64 % углеводов, около 22 % белков. Основой полимерной структуры зерен является а-ппокан.

4. В опытах на животных установлено благотворное влияние природной ассоциации на иммунную и мочевыделитедьную системы. Показана эффективность применения нагапка "Тибетский рис" в комплексной терапии больных с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

5. Результаты изучения биологической активности нашпка и возможность длительного хранения зерен ассоциации в лиофилизированном виде послужили основой для разработки биологически активной добавки на основе "Тибетского риса"

6. Разработан технологический процесс получения напитка на основе изучаемой природной ассоциации в производственных и домашних условиях; составлена инструкция по приготовлению напитка из наганных или лиофилизирсваппых зерен "Тибетского риса"

Слисок работ по теме диссертации

1. Микроорганизмы природной ассоциации "Тибетский рис". - В сб. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" СПб, 1996, С. 21.

2. Биологические свойства природной ассоциации "Тибетский рис". - В сб. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" СПб, 1996, С.

его ¡м/™™ а т> ** а

1 jii'lj? 'хСуаа:. Avci^jaijcivac!, -ivi.-n .»».»...n»!,

3. Биологическая активность природной ассоциации "Тибетский рис'7/Материалы Второго Международного Съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения", СПб.,. 1998. - С. 161-164 (соавт. А.В. Караваева).

4. Мякробиота природной ассоциации "Тибетский рис"//Проблемы медицинской микологии. -1999. - т.1. - № 1. - С. 51-56 (соавт. Н.П. Блинов).