Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический статус и уровень спермальных полиаминов у мужчин с бесплодием

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический статус и уровень спермальных полиаминов у мужчин с бесплодием"

На правах рукописи

Богданов Юрий Аркадьевич

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ СТАТУС И УРОВЕНЬ СПЕРМАЛЬНЫХ ПОЛИАМИНОВ У МУЖЧИН С БЕСПЛОДИЕМ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005567898

г 9 АПР 2015

Пермь-2015

005567898

Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент, заведующий лабораторией по изучению механизмов микробиоценозов человека, директор Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Черкасов Сергей Викторович

кандидат медицинских наук, Главный внештатный специалист эндокринолог-онколог Министерства здравоохранения Пермского края, заведующая отделением ГБУЗ ПК «Пермский краевой онкологический диспансер» Коломейцева Татьяна Николаевна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64)

Защита состоится «5» июня 2015 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ai) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ni).

Автореферат разослан С/У 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. За последние годы состояние репродуктивного здоровья мужчин приобрело особую медицинскую и социальную значимость. Демографические показатели указывают на рост числа бесплодных браков в России, достигшего в некоторых регионах 17-30% (Поляков, 2002; Хлякина, 2010; Алиева и др., 2011), при этом доля мужской инфертильности близка к 40-50% (Анохин, 2002; Сагалов, 2006; Гамидов, 2008; Осадчук, 2013). Мужское бесплодие может быть обусловлено широким набором различных факторов, среди которых инфекционно-токсический является одним из ведущих (Тер-Аванесов и др., 2005; Евдокимов, 2005; Clad et al., 2005; Motrich et al., 2005; Fraczek et al., 2007). Характерным для воспалительных заболеваний в мужской половой сфере стало малосимптомное или бессимптомное течение, а также доминирование среди этиопатогенов представителей условно патогенных микроорганизмов (УПМ) (Кунгуров, 2010; Чемезов и др., 2010; Онопко др., 2013). Если механизмы, ответственные за участие специфических возбудителей инфекций, передающихся половым путем (ИППП), в возникновении и развитии репродуктивных проблем в значительной степени расшифрованы, видовой спектр и значимость УПМ изучены недостаточно, а накопленная информация служит предметом дискуссий (Бухарин и др., 2000; Кузьмин, 2002; Тер-Аванесов, Анкирская, 2005; Коган и др., 2006; Cottell et al., 2000; Hua et al., 2005; Askienazy-Elbhar, 2005). Так, длительное время ведущими возбудителями признавались грамотрицательные бактерии (Nieschlag, Behre, 2005; Prabha, 2010) со значительным преобладанием кишечной палочки, а роль грамположительных кокков считалась недоказанной. В последние годы их участие в развитии воспалительных процессов в половых органах не вызывает сомнения (Долгов и др., 2010; Кунгуров и др., 2010). Общемировые тенденции ухудшения показателей фертильности, снижения оплодотворяющей способности спермы (Brown, 2004; Holm et al., 2005; Harbottle et al., 2006), характерные, в том числе, для отдельных регионов России (Тер-Аванесов и др., 2006), прослеживаются на фоне расширения спектра возбудителей, формирования полимикробных ассоциаций. Однако, значение бактериоспермии до конца не определено, поскольку у многих мужчин отсутствуют симптомы, связанные с такой бактериальной инфекцией репродуктивного тракта (Акопян, 2009; Хромов, 2012). Согласно статистике, бессимптомная бактериоспермия встречается у 10-15% всех мужчин, являясь скрытой угрозой контаминации половых путей женщины, уязвимых для

различных инфекций (Савельева, 2011; Черкасов, 2011). В этой связи выявление скрыто протекающих воспалительных процессов в половых путях мужчины, ассоциированных с условно патогенной флорой, приобретает особую актуальность. Необходимо учитывать, что УПМ могут присутствовать в составе нормальной микрофлоры здоровых людей в качестве комменсалов, а могут выступать как этиопатогены при местных и генерализованных процессах (Олина, 2009; Кремлева, Черкасов, Константинова, 2012), что существенно затрудняет интерпретацию результатов обследования.

Многие авторы отмечают, что для диагностики воспалительных заболеваний репродуктивных органов, исследование спермы человека является актуальным и перспективным научным направлением (Липатова, 2004; Петрунин и др., 2003; Евдокимов и др., 2005; Komatsu et al., 2005; Krawetz. et al., 2005; BjSmdahl et al., 2006; Boe-Hansen et al., 2006), поскольку спермальная жидкость имеет богатейший биохимический состав. В то же время, весь этот огромный диагностический потенциал используется лишь в малой степени из-за отсутствия данных о физиологической роли, которую играют различные компоненты эякулята при воспалении органов мужской репродуктивной системы (Терентьев и др., 2002; Аль-Шукри и др., 2003; Евдокимов, 2004; MacDonald et al., 2006). В последние время возрастает интерес к оценке значимости уровня спермальных полиаминов в эякуляте, поскольку известно, что спермин и спермидин могут обладать антибактериальным и антиоксидантным действием (Николаев, Плосконос, 2010; Shah, Swiatlo 2008; Martini et al., 2015). Однако в доступной литературе имеются единичные сведения о подобных исследованиях, а их результаты достаточно противоречивы (Выборное, 2006; Луцкий, 2007; Бойко, Терентьев, Николаев, 2010; Fernandes,1995; Calandra et al., 1996; Gerner et al., 2004; Chandra, 2006; Simoneau et al., 2009; Wallace, 2009; Babbar, 2011; Shah et al., 2011; Pavine et al., 2011).

Таким образом, существует насущная потребность в клинико-микробиологическом и экспериментальном изучении особенностей тех показателей, которые характеризуют состояние эякулята при бессимптомной бактериоспермии и при наличии признаков воспаления органов мочеполовой системы у инфертильных мужчин.

Цель исследования: сравнительная оценка видового состава микробиоты и уровня спермальных полиаминов в эякуляте при различных проявлениях

патоспермии у инфертильных мужчин, с определением их регулирующего влияния

на ростовые характеристики Enlerococcus faecalis in vitro.

Основные задачи исследования:

1. Провести оценку распространенности и причин мужского бесплодия в г. Перми.

2. Изучить видовой спектр УПМ, изолируемых от мужчин при бесплодном браке.

3. Оценить связь различных форм патоспермии с наличием и таксономической принадлежностью УПМ, обнаруженных в спермальной жидкости и соке простаты.

4. Определить уровень спермальных полиаминов в эякуляте с лейкоцитоспермией и без нее.

5. Установить влияние спермальных полиаминов на рост и пленкообразующую способность Е. faecalis различного происхождения.

6. Разработать рекомендации для усовершенствования обследования мужчин, состоящих в бесплодном браке.

Научная новизна. Впервые дана оценка распространенности и причин мужского бесплодия на фоне демографических процессов, происходивших в г. Перми с 1991 по 2012 гг. Показана ведущая роль в его формировании инфекционно-воспапительных заболеваний мочеполовой системы. Впервые с использованием комплекса современных лабораторных тестов, изучен видовой спектр и антибиотикорезистентность УПМ выявляемых у мужчин с бесплодием при наличии/отсутствии признаков воспаления в эякуляте. Изучена связь между присутствием и таксономической принадлежностью УПМ с различными формами патоспермии. Впервые проведена сравнительная оценка концентрации спермальных полиаминов у мужчин с пиоспермией и без нее, изучено влияние спермина и спермидина на рост и пленкообразующую способность различных штаммов Е. faecalis, преобладающих в структуре УПМ при бактериоспермии у инфертильных мужчин. Установлена возможность и определены параметры использования спермальных полиаминов в качестве дополнительного критерия для выявления малосимптомных неспецифических инфекционных процессов и оценки этиологической значимости изолируемых при этом бактериальных культур.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные вносят вклад в изучение проблемы мужского бесплодия и расширяют представления

об этиологии неспецифических инфекционных заболеваний репродуктивной сферы, в частности, о связи микробного фактора с развитием патозооспермии.

Впервые определен спектр УПМ, наиболее часто выделяемых из эякулята и секрета предстательной железы инфертильных мужчин, изучена корреляция между бактериоспермией, наличием патоспермии и воспалительного процесса в предстательной железе. Выявлена связь между инфицированием Е. /аесаИя и появлением астенозооспермии; показано, что детекция 5. ер'и1егт\с1'щ сопровождалась более тяжелыми формами патологии: астенозооспермией и олигоастенотератозооспермией.

Показано, что между составом микрофлоры, изолированной из секрета простаты и эякулята, отсутствовала достоверная корреляция, что указывает на необходимость их раздельного бактериологического исследования.

Впервые установлено, что концентрация спермальных полиаминов в эякуляте при воспалительных процессах значимо отличается от соответствующих показателей при выявлении УПМ без признаков воспаления, что может служить дополнительным диагностическим критерием при неспецифических инфекционных заболеваниях. Показана целесообразность изучения влияния спермина и спермидина на ростовые характеристики и пленкообразующую способность УПМ, в частности Е. /аесаНя различного происхождения, для оценки их этиологической значимости.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Медико-демографическая ситуация в г. Перми характеризуется снижением численности и старением мужского населения, ростом распространенности бесплодия у мужчин детородного возраста, формирующегося за счет инфекционно-воспалительных заболеваний.

2. Микробиота эякулята инфертильных мужчин имеет количественные и качественные отличия в сравнении с условно здоровыми: достоверно чаще регистрируется кокковая флора с преобладанием Е. /аесаИя, которые доминируют как при отсутствии, так и при наличии признаков воспаления в эякуляте. Обнаружение гемолизирующих Б.ер1с1егт'1сИ.ч сопровождается манифестацией воспалительной реакции.

3. Уровень спермальных полиаминов (спермина и спермидина) является интегральным показателем, позволяющим, с одной стороны, детектировать воспалительный процесс в репродуктивных органах, с другой - дифференцировать изолируемые при бесплодии УПМ по их этиологической значимости.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом КЛД ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ, в работу врачей-урологов Диагностического городского центра при ГБУЗ ПК «МСЧ №9 им. М.А. Тверье» и медицинского центра «ЛАБДИАГНОСТ и К» г. Перми.

Апробация работы и публикации. Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры микробиологии и вирусологии с циклом КЛД ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. ак. Е.А. Вагнера>> МЗ РФ 6 февраля 2015 года (протокол № 2), межкафедральном научном координационном совете по проблемам общественного здоровья и санитарно-эпидемиологического обеспечения населения ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. ак. Е.А. Вагнера>> МЗ РФ 13 февраля 2015 года (протокол № 4). Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на I Национальном форуме «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизацию) (Ростов, 2012), первом российско-азиатском уро-андрологическом конгрессе (С-Петербург, 2014), на заседаниях Пермского краевого общества урологов с секцией андрологии (Пермь, 2012,2013 гг.).

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 35 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, 3-х глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель включает 246 литературных источников, в том числе 116 отечественных и 130 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. ак. Е.А. Вагнера>> МЗ РФ на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики (номер государственной регистрации темы 01.2.00709668).

Личный вклад автора в исследование.

Автором самостоятельно разработан дизайн исследования, определены критерии включения и исключения, с учетом которых сформированы группы наблюдения. Личный вклад автора состоял в анализе данных литературы по теме диссертации, в сборе, систематизации и выполнении ретроспективного анализа

статистических данных, планировании и проведении экспериментов, заборе материала для бактериологического исследования, обобщении полученных результатов. Автор участвовал в подготовке материалов к публикации и их представлении на научных конференциях. Ряд экспериментальных исследований выполнен на базе Лаборатории адаптации микроорганизмов ФГБУН ИЭГМ УрО РАН. Автор благодарит заведующего лабораторией д.м.н., профессора А.Г.Ткаченко, к.б.н. Л.Ю. Нестерову, к.б.н. A.B. Ахову, а также заведующую бактериологической лабораторией ООО «ПРО-МЕД» C.B. Проворову за сотрудничество.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Ретроспективный анализ демографических показателей в г. Перми проводили на основании официальной статистики отдела переписи населения и демографической статистики РОССТАТа Территориального органа Федеральной государственной службы государственной статистики по Пермскому краю (ПЕРМЬСТАТ) за период с 1990 по 2012 г. Уровень заболеваемости оценивали, используя официальную статистическую форму 12 "Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения в период с 2007 по 2011 гг., а также формы отчетности, принятые Управлением здравоохранения г. Перми (2007 -2011гг.). Обращаемость по поводу бесплодия изучали по данным клинико-лабораторного обследования мужчин, обратившихся в отделение планирования семьи ГКДЦ с 2007 по 2011 гг. (форма № 025/у-04). Проанализировано 10489 амбулаторных карт первичных пациентов, обратившихся за данный период, из них по поводу бесплодия - 2343 человека.

Структура микробиоты мужской половой сферы и частота встречаемости отдельных таксонов изучены по результатам микробиологического анализа 1337 и 232 образцов эякулята и секрета предстательной железы (соответственно) жителей г. Перми за 2011-2012 гг., представленных в отчетной документации бактериологической лаборатории ООО «ПРО-МЕД» на базе МУЗ «Городская клиническая больница №4».

Проведено расширенное микробиологическое исследование образцов эякулята и секрета простаты 60 пациентов, обратившихся в ГКДЦ по поводу бесплодия. В первую основную группу наблюдения вошел 31 мужчина, у которых, помимо бактериоспермии, в эякуляте были признаки воспалительного процесса — пиоспермия. Во вторую основную группу сравнения включено 29 пациентов, у которых при бактериологическом исследовании эякулята высевалась микрофлора в диагностически значимых количествах, но не было признаков воспалительного процесса. В контрольную группу вошли 17 мужчин, проходивших обследование в связи с планированием семьи, у которых при исследовании эякулята численность УПМ не превышалаЮ3 КОЕ/мл и не было признаков воспаления.

Экспериментальные исследования выполнены с использованием наиболее часто выделяемых штаммов E.faecalis, изолированных от больных с лейкоцитоспермией и наиболее тяжелыми формами патоспермии, в дальнейшем рассматриваемые нами как этиопатогены. Для сравнения были отобраны культуры, изолированные от пациентов с бактериоспермией, но без признаков воспаления в эякуляте, нормозооспермией и минимальной степенью обсемененности (103-104 КОЕ/мл), в дальнейшем условно обозначенные нами как комменсалы, а также штамм E.faecalis АТСС 29212, полученный из ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздрава РФ (Москва).

Методы исследования. Клинические методы включали сбор анамнеза, анализ жалоб, оценку общесоматического статуса. При объективном обследовании выполняли традиционные урологические и специальные исследования.

Микробиологическое исследование основывалось на рутинном микроскопическом изучении образцов эякулята и секрета простаты (мазков-препаратов, окрашенных по Граму). Бактериологический анализ проводили на основе количественного сегментированного исследования мочи и секрета предстательной железы (Е.М. Meares и Т.A. Stamey, 1968 г.). Дополнительно проводили бактериологическое исследование эякулята. Для оценки степени обсемененности исследуемых образцов готовили десятикратное разведение исходного материала, считая значимым для дальнейшего анализа количество бактерий, превышающее 103 КОЕ /мл. Стрепто- и энтерококки изолировали на кровяном агаре, стафилококки выделяли на манит- и желточно-солевом (ЖСА)

агаре, грибы рода Candida - на среде Сабуро и хромогенном агаре, энтеробактерии определяли при высеве на агар Эндо, анаэробы - на обогащенной среде для контроля стерильности, разлитой «высоким столбиком» по пробиркам, для выявления клостридиальных форм посев проводили уколом в столбик висмут-сульфит агара.

Для идентификации микроорганизмов и оценки их антибиотикорезистентности использовали бактериологический анализатор Vitek (Biomerieux, Франция). Спектр антибактериальных препаратов подбирали в соответствии с МУК 4.2.1890-04.

Определение уровня спермапьных полиаминов проводили на базе Лаборатории адаптации микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) с помощью метода тонкослойной хроматографии (Ткаченко А.Г. и др., 2003). Оценивали концентрацию спермина и спермидина в спермоплазме обследуемых мужчин с пиоспермией (14 образцов) и без признаков воспаления (16 образцов). Контролем послужили 7 образцов от условно здоровых мужчин с нормоспермией.

Влияние полиаминов и рН среды на ростовые характеристики штаммов E.faecalis, наиболее часто выделяемых из эякулята при пиоспермии и/или бактериоспермии, а также штамма E.faecalis АТСС 29212 оценивали путем измерения оптической плотности (ОП) суспензий в опытных и контрольных лунках 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетов на мультимодальном планшетном ридере (Tecan infinite М 200) через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 21 и 22 часа. Ночные культуры Е. faecalis, выращенные на бульоне Луриа-Бертани (LB-бульон), стандартизованные до 0,5 по МакФарленду и разведенные в 100 раз, количественно засевали в лунки планшета, содержащие компоненты, соответствующие задачам эксперимента: для контроля — чистый LB-бульон; LB-бульон с добавлением спермина и солянокислого спермидина, используя их двукратные разведения (от исходного раствора до разведения 1:32). Исходная концентрация соответствовала содержанию полиаминов в спермоплазме, установленному нами ранее в эякуляте условно здоровых мужчин: 0,04 мг/мл для спермидина и 0,5 мг/мл для спермина.

Определение концентрации живых бактериальных клеток (количества КОЕ/мл) проводили микрометодом точечных высевов (Herigstad В., Hamilton М.,

Heersink J., 2001). Биопленкообразование изучали, взяв за основу методику O'Toole G.F. et al. (2000).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась средствами пакета программ STATISTIC А 6.0 и EXCEL 7.0.

Для анализа динамики показателей вычислялась средняя арифметическая величина (М), стандартная ошибка (т), стандартное отклонение (о) и производилась проверка статистических гипотез по t-критерию Стьюдента. Для сравнения количественных признаков двух несвязанных групп использовались непараметрические критерии х2 и Манна-Уитни (test M-U). Различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ многолетней динамики показателей численности и репродуктивного здоровья мужского населения г. Перми. Как показали наши исследования, в последние десятилетия в г. Перми - крупном промышленном центре Западного Урала, демографическая ситуация складывалась весьма неблагоприятно. Пермь - единственный мегаполис в России, потерявший в 2005 году статус «миллионного города» и вернувший его лишь в 2012 году. Впервые за последние 20 лет родившихся стало больше умерших лишь в 2011 году, что исследователи связывают со вступлением в репродуктивный период поколения, родившегося в 80-е годы, когда рождаемость была высокой, стабилизацией экономической ситуации и появлением в стране программ, направленных на улучшение демографической ситуации, таких как диспансеризация населения, «материнский капитала. Однако, в г. Перми нашли свое подтверждение негативные последствия депопуляции, отмеченные О.П. Щепиным и соавт. (2007), Г.Э. Улумбековой (2011).

Годы наблюдений

Рисунок 1 - Динамика численности мужчин 1845 лет в г. Перми за 20052012 гг.

Это не только численные потери населения, но и ухудшение его качественных параметров, речь идет, прежде всего, о демографическом «старении» населения, нарастающих диспропорциях в численном составе количества мужчин и женщин, городских и сельских жителей. Нами показано, что ситуация усугубляется таким негативным для воспроизводства населения фактором, как снижение числа мужчин наиболее активного детородного возраста (18-45 лет), особенно за счет мужчин 1825 лет, которых с 2000 по 2012 гг. в г. Перми стало меньше на 8,7%. (рисунок 1).

Как и в целом по России, на изучаемой территории среди причин, приводящих к снижению репродуктивного потенциала, возрастает значимость инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовой сферы. За период 2001-2011 гг. показатель заболеваемости БМПС в г. Перми увеличился в 1,7 раза и составил 116,6 на 1000 населения. Темп ее роста составил 196,3±4,26%, темп прироста — 127,3±3,84%.

Рост общей заболеваемости сопоставим с ростом первичной заболеваемости, которая увеличилась в 1,8 раза. Важно подчеркнуть, что представленные данные характеризуют этот фактор не в полной мере, поскольку официальная региональная статистика из патологии, имеющей отношение к мужской репродукции, в соответствии с разделом заболевания мочеполовой системы МКБ-10, регистрирует только заболевания предстательной железы (N40—N42) и мужское бесплодие (N-46). Имеющиеся данные по болезням предстательной железы (БПЖ) подтверждают негативные тенденции, характеризующие репродуктивное здоровье мужчин

Рисунок 2 - Динамика заболеваемости болезнями предстательной железы у мужчин г. Перми в 20012011 гг.

Установленное нами снижение уровня первичной заболеваемости БПЖ (за 10 лет - в 8,1 раза) свидетельствует о преобладании хронических форм,

несвоевременности обращения за медицинской помощью и значительном «накоплении» этой патологии среди взрослого населения.

Оценить многолетнюю динамику распространенность мужского бесплодия в г. Перми не удалось, поскольку по данным официальной статистики с 2007 по 2011 гг. не зарегистрировано ни одного случая этого заболевания. Анализ работы отделения планирования семьи ГКДЦ за аналогичный период выявил, что бесплодие, напротив, является одной из ведущих причин обращений к врачу-андрологу. За 5 лет с этой проблемой обратилось 2346 первичных пациентов, что явно отличается от данных официальной статистики. За период проводимых наблюдений среднемноголетний показатель обращаемости составил 225,7±32,2 на 1000 обратившихся мужчин. Выявлена выраженная тенденция к росту со среднегодовым темпом прироста 18,2±9,7% (рисунок 3).

Рисунок 3 - Доля пациен-

% обратившихся

по поводу тов с бесплодием в обшей

бесплодия

линейный тренд структуре обращений.

Среди выявленной патологии у 49,8% зарегистрированы хронические воспалительные заболевания мужской половой сферы (простатит, везикулит, эпидидимит), что практически вдвое превышает показатели, приводимые в специальной литературе (рисунок 4).

. IИI

2007 2008 2009 2010 2011

Рисунок 4 — Структура выявленной патологии у мужчин, обратившихся по поводу бесплодия.

Спектр и частота встречаемости различных видов УПМ в образцах эякулята и сока простаты. Учитывая, что особенно часто у мужчин с бесплодием встречались воспалительные заболевания, в контексте нашей работы интерес представляли результаты микробиологических исследований: видовая структура и степень обсемененности образцов спермы и секрета предстательной железы условно патогенными бактериями. Если значимость ряда специфических процессов в формировании инфертильности хорошо известна, роль неспецифических инфекций еще предстоит определить.

Таблица 1 - Спектр микроорганизмов, наиболее часто изолируемых из эякулята и секрета предстательной железы

Виды микроорганизмов Эякулят Секрет простаты Индекс встречаемости С (%)

Абс. % Абс % Эякулят Секрет простаты

Enterococcus faecalis 238 21,0 58 25,1 28,7 36,7

Staphylococcus epidermidis гемолизирующий 165 14,6 28 12,1 19,9 17,7

Staphylococcus haemolyticus 95 8,4 31 13,4 11,5 19,6

Streptococcus agalactiae 66 5,8 15 6,5 8 9,5

Escherichia coli 68 6,0 20 8,7 8,2 12,7

Corynebacterium minutissiiruim 64 5,7 13 5,6 7,7 8,2

Streptococcus spp. 113 10,0 11 4,8 13,7 7,0

Streptococcus pyogenes 14 1,2 4 1,7 1,7 2,5

Прочие 308 27,2 51 22,1 37,1 32,3

На первом этапе был проведен анализ результатов микробиологического исследования образцов спермы и секрета предстательной железы. И ретроспективное изучение отчетной документации бактериологической

лаборатории ООО «ПРО-МЕД» за 2011-2012 гг., и результаты собственных исследований микрофлоры обследованных пациентов подтвердили общероссийские тенденции преобладания в структуре микробиоты гениталий грампсшожительных видов (таблица 1).

Наибольшие индексы встречаемости отмечены для Е. /аесаИя, 5. ер'к1егт'кИ$ (гемолизирующий) и £ Иавто1уИсих. Среди грамотрицательной флоры самой значимой была Е. соН, которая единственная входила в десятку наиболее часто изолируемых микроорганизмов с индексом встречаемости 8,2% в эякуляте и 12,7% в секрете простаты. С одной стороны, это подтверждает мнение исследователей о периодической смене преобладающих в той или иной сфере различных по грампринадлежности этиопатогенов, с другой - указывает на все еще существенную роль кишечной палочки в инфицировании репродуктивных органов. При определении чувствительности выделенных культур микроорганизмов к антибиотикам обращала на себя внимание высокая резистентность Е. /аесаИя к фторхинолонам, традиционным препаратам выбора при лечении БПЖ.

Неожиданным оказалось сохранение чувствительности большинства штаммов 5. ер1с1егт1сИ.^ практически ко всему взятому спектру антибактериальных препаратов. В отношении каждого пятого штамма Е. соН исследованные антибиотики оказались неэффективными с максимальной резистентностью к ципрофлоксацину, гентамицину и амикацину.

Корреляционный анализ микробиологических и андрологических показателей. На втором этапе исследования важно было установить, есть ли связь между микробиологическими показателями, признаками патоспермии и различной степенью выраженности воспаления в генитальном тракте инфертильных мужчин. Нами был проведен сравнительный анализ некоторых андрологических и микробиологических показателей у пациентов с наличием или отсутствием признаков воспалительного процесса в эякуляте в сравнении с мужчинами, у которых при исследовании эякулята не наблюдалось признаков воспаления и не высевалась УПМ в значимых количествах (КОЕ>Ю3/мл). Результаты анализа спермограмм выявили различия в группах сравнения. При пиоспермии наблюдалось самое низкое число спермограмм с нормальными параметрами: в 3,5 раза меньше чем у пациентов только с бактериоспермией (х2= 7,52, р=0,0061) и в 5 раз меньше, чем в контрольной группе (х2= 13,71, р=0,0002), а преобладали формы патоспермии с наиболее выраженными изменениями. Проведенный анализ вероятности воспалительного процесса в простате при наличии мазка,

фиксирующего признаки воспаления в эякуляте, выявил различия в группах сравнения. Для первой и второй групп эта связь оказалась недостоверной. Следует отметить, что при бактериологическом исследовании эякулята и секрета простаты мужчин первой и второй группы, чаще высевались одни и те же виды УПМ, с наиболыцим индексом встречаемости Е. /аесаИэ, при этом в группе с пиоспермией он был несколько выше (38,74% против 34,48%). Встречаемость 5. ер'к1егт'к1'щ с гемолизирующей активностью в 1-й группе превышала 25% и была в 7,5 раза выше, чем в группе с бактериоспермией. Корреляция между выявлением Е. /аесаНя и наличием пиоспермии оказалась недостоверной (%2=0,12, р=0,7342), а обнаружение 5. ер\(1егт\(1Ь с гемолизирующей активностью было достоверно связано с лейкоцитоспермией (%2 = 5,87, р=0,0154). При этом в 1 группе доля образцов, содержащих ассоциации из 2-х микроорганизмов и более, значительно превышала аналогичную долю в группе с бактериоспермией (р<0,05), что увеличивало способность слабовирулентных бактерий вызывать заболевание.

Для изучения влияния различных бактерий на качество спермы, рассматривались наиболее часто встречающиеся в пробах микроорганизмы во взаимосвязи с результатами исследования эякулята. Влияние Е. /аесаП.ч имело значение лишь при развитии астенозооспермии (х2=4,7, р=0,0302), с появлением астенотератозооспермии и олигоастенотератозооспермии высеваемость энтерококка достоверно не коррелировала. Напротив, 5. ер'к1егт\с1'т обусловливал развитие более тяжелых форм патоспермии. Его связь с астенотератозооспермией и олигоастено-тератозооспермией была значимой и достоверной. Поскольку инфицирование эпидермальным стафилококком, как правило, сочеталось с признаками воспаления в эякуляте и ассоциировалось с наиболее существенными изменениями качества сперматозоидов, их этиологическая роль, как возбудителей неспецифических воспалительных процессов, выглядела вполне определенно. В то же время, присутствие энтерококков далеко не всегда сопровождалось пато- и/или лейкоцитоспермией, а на возможную этиологическую значимость Е. /аесаИв, помимо пиоспермии, изредка указывала лишь более высокая степень обсемененности исследуемого материала. В этой связи потребовался поиск дополнительных критериев для дифференцировки их как этиопатогенов, либо как комменсалов - транзиторных представителей микробиоты генитального тракта.

Определение уровня спермальных полиаминов при бактериоспермии и/или пиоспермии. В настоящее время известно, что снижение фертильности может быть обусловлено не только патоспермией. Многие составные компоненты

семенной жидкости создают необходимые условия для нормального функционирования сперматозоидов и обеспечения их жизнеспособности. Влияние биологически активных веществ может быть и опосредованным, благодаря бактерицидной активности, за счет которой снижается риск развития инфекционно-воспалительных процессов в гениталиях. В то же время, их концентрация может изменяться при различных заболеваниях органов половой сферы и приводить к снижению фертильности. Поэтому изменения ряда показателей семенной жидкости в сторону снижения или повышения могут служить самостоятельными критериями в оценке состояния репродуктивного здоровья мужчин. К таким показателям, в частности, относятся полиамины, содержащиеся в значительном количестве в секретах органов мочеполового тракта.

Нами установлено, что содержание и соотношение спермина и спермидина в эякуляте без признаков воспаления и при пиоспермии достоверно различалось (таблица 2).

Таблица 2 - Уровень полиаминов в спермоплазме обследованных

пациентов

Группы сравнения Средняя концентрация спермидина мкмоль/ мл (Спд) Средняя концентрация спермина мкмоль/мл (Сп) Сп/Спд

1 группа 0,14±0,05 2,01±0,43 13,8±2,05

2 группа 0,42± 0,12* 3,36±0,41* 8,04±1,81*

норма 0,46±0,11 3,52±0,32 7,65±2,89

*Р1,2- достоверность отличия р<0,05

Важно подчеркнуть, что при всех вариантах патоспермии отмечали снижение концентрации спермальных полиаминов в эякуляте. С одной стороны, это можно объяснить их способностью активно связываться со свободными радикалами, образующимися при воспалении. Как считают многие исследователи, именно эти соединения могут оказывать повреждающее действие на сперматозоиды. В то же время, нарушения сперматогенеза и ухудшение показателей, характеризующих основные свойства сперматозоидов, в сочетании с падением уровня полиаминов, может быть связано со снижением функциональной активности половых желез, обусловленным другими факторами. Тем не менее, нами установлено, что, как правило, колонизация репродуктивных органов УПМ, происходящая на фоне физиологических концентраций полиаминов, не сопровождается воспалительной

реакцией. Напротив, «бактериоспермия + пиоспермия» ассоциируются со значительными изменениями содержания и соотношения уровня этих поликатионов. Полагаем, что динамическое наблюдение за концентрацией спермина и спермидина в эякуляте может способствовать выявлению воспалительных процессов в мужской репродуктивной системе, в том числе латентных, и быть критерием их излеченности.

Влияние спермальных полиаминов на ростовые характеристики штаммов Е./аесаИв. Экспериментальное изучение особенностей воздействия спермальных полиаминов на штаммы Е./аесаИя позволило установить следующее. Отклик штаммов, изолированных от условно здоровых и инфертильных мужчин, отличался заметным своеобразием. Внесение по отдельности спермина или спермидина вызывало разнонаправленные эффекты в «стратегии выживания» исследуемых бактерий. Однако в присутствии в среде культивирования и спермина, и спермидина наблюдались однотипные и наиболее выраженные изменения

Рисунок 8 - Кривые роста Е. /аесаП.ъ в присутствии спермина и спермидина при различных рН а среды (разведение / рН):

а — штамм Е. /аееаН.ч №8 (комменсал); б - штамм Е. /аесаШ №11 (этиопатоген).

б

Кривые роста Е^аесаИь №8, выделенного от условно здорового пациента, были практически идентичны росту референтного штамма за исключением увеличения ОП при физиологической концентрации полиаминов. Е. /аесаНз №11, признанного этиопатогеном, отличала длительная фаза адаптации, и к концу первых суток показатели оптической плотности были практически вдвое ниже соответствующих

(рисунок 8).

1,200 1,000 0,800 . 0,600 0,400 0,200

0,000

НИИ и

1ч 2ч Зч 4ч 5ч 6ч 20ч 21ч 22ч

-исходи /10 -1:2/9

- 1:8/7,5

- 1:32/7

1,200 1,000 0,800 9 о.боо

* 0,400 0,200 0,000

1ч 2ч Зч 4ч 5ч 6ч 20ч 21ч 22ч

- исходи /10 -1:2/9

1:8/7,5

- 1:32/7

величин, характеризующих рост соименного штамма-комменсала. При физиологической концентрации спермина и спермидина увеличение ОП было минимальным, а при разведении 1:2, соответствующему рН9, их действие было губительным, притом, что именно в таких условиях штаммы, изолированные от условно здоровых мужчин, «чувствовали» себя наиболее комфортно. Помимо оценки ростовых характеристик проверяли жизнеспособность разных по происхождению штаммов Е. /аесаИз, подвергшихся влиянию рН среды и/или полиаминов (рисунок 9). При физиологической концентрации полиаминов и рНЮ происходила гибель штамма-патогена, при рН9 число живых бактерий было минимальным и достоверно отличалось как от непатогенных штаммов, так и от

Рисунок 9 - Выживаемость различных по происхождению штаммов Е. /аесаИь (№8 и №11) в условиях эксперимента.

показателей роста в среде без полиаминов. Более того, даже малозначимое содержание спермина и спермидина в нейтральной среде угнетало рост предполагаемых патогенов. На штаммы, выделенные от условно здоровых пациентов, эффект был прямо противоположным. Заметным своеобразием характеризовался отклик энтерококков на присутствие спермальных полиаминов в условиях рН7, когда нейтрализация среды достигалась прибавлением дополнительных реагентов (соляной кислоты и гидроокиси натрия). В таких условиях изменение концентрации полиаминов практически не оказывало влияния на штаммы-комменсалы, в то время как выживаемость предполагаемых этиопатогенов была низкой и зависела от их содержания.

Сравнительное изучение пленкообразующей способности в среде со скомпенсированной рН показало снижение массивности биопленок, формируемых

2,50Е +08

2,00Е +08 1.50Е +08 1.00Е +08 5,ООЕ +07

I

1Й1

II

•5> ^ ^ **

<У <У <У

№

цц

л .л Л Л

культурами, выделенными от условно здоровых мужчин (рисунок 10). При этом отмечали дозозависимый эффект: минимальная пленкообразующая способность проявлялась при максимальном разведении спермина. Аналогичный отклик таких штаммов прослеживался и при добавлении спермидина. Однако их совокупное действие в значительной степени стимулировало процесс пленкообразования. Культуры, изолированные от пациентов с патоспермией, отзывались на внесение в среду культивирования спермина прямо противоположным образом. Сформированные ими биопленки были в несколько раз

00580

2,500 « -—---------

™ |||||з —

1:1 12 1;4 ..... ' -

Концентрация 16 1:16 132

Е. ГаесаИя №8 Е. 1аеса1в №11

■ Спермидин ■ Спермин 1 Спермин + спермидин

массивней по сравнению с образованными в ЬВ-бульоне, что в наибольшей степени проявлялось при разведениях этого полиамина 1:4-1:8. Добавление различных концентраций спермидина практически никак не сказывалось на пленкообразующей способности изолятов.

Совместное присутствие обоих поликатионов стимулировало процесс пленкообразования. Оценка пленкообразования при одновременном воздействии двух факторов: различных концентраций полиаминов и изменяющегося уровня рН среды, а также совместном влиянии обоих полиаминов в аналогичных условиях позволило установить следующее (рисунок 11). Пленкообразующая способность штаммов, изолированных от условно здоровых пациентов, снижалась в присутствии спермина, однако степень выраженности его влияния в значительной мере зависела от показателя рН. Минимальный уровень пленкообразования был отмечен при резко щелочной реакции среды. Подобным образом культуры реагировали и на одновременное присутствие обоих поликатионов, хотя достоверно активнее пленки

Рисунок 10 - Интенсивность пленкообразования Е./аеса№ в присутствии полиаминов в разных разведениях (рН7).

образовывались при показателе рН7-7,5, что соответствовало максимальному разведению спермина и спермидина.

Эффект воздействия спермина при соответствующих рН на штаммы-этиопатогены и культуры, выделенные от условно здоровых пациентов, значительно различался. Этиопатогены формировали самые массивные пленки при высоких концентрациях спермина и обусловленной им щелочной реакции среды. Важно подчеркнуть, что при добавлении обоих полиаминов, как и в предыдущих экспериментах, скорее всего, спермин играл решающую роль.

Проведенное нами изучение содержания спермина и спермидина в эякуляте с признаками воспалительного процесса (пиоспермией) и без, а также экспериментальное исследование их влияния на ростовые характеристики и биопленкообразующую способность энтерококков, доминирующих, по нашим наблюдениям, при бактериоспермии, позволяет рассматривать уровень этих поликатионов в качестве интегрального диагностического критерия при обследовании, в том числе инфертильных мужчин с неспецифическими инфекциями.

1. Показано, что вследствие депопуляции в г. Перми произошло снижение численности мужского населения, наиболее существенное в раннем репродуктивном возрасте. При этом установлен значимый рост распространенности мужского бесплодия, формирующегося за счет инфекционно-воспалительных процессов в репродуктивных органах.

разведениях и при различных рН.

Рисунок 11 — Интенсивность пленкообразования Е. /аесаШ в присутствии полиаминов в разных

ВЫВОДЫ

2. В структуре преобладающих видов микробиоты гениталий инфертильных мужчин доминируют Е. faecalis, S. epidermidis (гемолизирующий) и S. haemolyticus. Из грамотрицательных бактерий наиболее часто изолируется Е. coli.

3. Установлено, что при сочетании бактериоспермии с выраженной воспалительной реакцией (пиоспермия) в эякуляте значимо чаще регистрируются ассоциации из 2-х микроорганизмов, а также штаммы S. epidermidis с гемолизирующей активностью, детекция которых коррелирует с более тяжелыми формами патозооспермии.

4. Показано, что между составом микрофлоры, изолированной из секрета простаты и эякулята, отсутствует достоверная корреляция, что указывает на необходимость их раздельного бактериологического исследования.

5. Установлено, что при пиоспермии уровень спермальных полиаминов в эякуляте достоверно ниже по сравнению с их содержанием в спермоплазме без признаков воспаления.

6. Экспериментально доказано, что спермальные полиамины оказывают разноплановое действие на ростовые характеристики штаммов Е. faecalis различного происхождения. Их физиологические концентрации угнетают, вплоть до полной гибели, штаммы-этиопатогены в планктоне, интенсифицируя процесс биопленкообразования. Штаммы-комменсапы, адаптированные к физиологическим, т.е. достаточно высоким концентрациям полиаминов в спермоплазме, в значительно меньшей степени зависят от их содержания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Отсутствие официальных данных о распространенности и, как следствие, причинах мужской инфертильности создает необходимость систематизации имеющейся информации в специализированных ЛПО, для оценки состояния репродуктивного здоровья мужского населения г. Перми.

2. Учитывая, что клиническая картина неспецифических заболеваний репродуктивных органов часто бессимптомна или малосимптомна, пациенты с бесплодием нуждаются в расширенном клинико-лабораторном обследовании, с привлечением современных микробиологических тестов.

3. При выявлении бактериоспермии и/или пиоспермии необходимо углубленное бактериологическое исследование, с обязательным проведением количественного сегментированного бактериологического исследования мочи и

индуцированной простатической секреции («4-х стаканная проба»), позволяющих установить локализацию очага инфекции.

4. Для диагностики вялотекущих воспалительных процессов в мочеполовом тракте мужчин с бесплодием, целесообразно, в качестве дополнительного критерия наличия воспалительных процессов в гениталиях, оценивать содержание спермина и спермидина в эякуляте. Разнонаправленное действие спермальных полиаминов на различные по происхождению штаммы позволит их дифференцировать по этиологической значимости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Касимова, Т.В. Микрофлора эякулята как потенциальная причина репродуктивных проблем / Т.В. Касимова, Ю.А. Богданов, И.Д. Кузнецов, Т.И. Карпунина // Фундаментальные исследования. - 2012. — № 2 (часть 2). - С. 308-310.

2. Богданов, Ю.А. Эпидемиологическая оценка заболеваемости болезнями предстательной железы на территории г. Перми / Ю.А. Богданов, Т.В. Зуева, Т.И. Карпунина // Медицинский альманах. - 2013. -№ 2. - С. 120 -122.

3. Богданов, Ю.А. К вопросу о распространенности мужского бесплодия / Ю.А. Богданов, Т.И. Карпунина, Т.В. Зуева // Медицина и образование в Сибири. -2013,-№5.-С. 54-60.

4. Богданов, Ю.А. О диагностической значимости содержания полиаминов в эякуляте инфертильных мужчин при асимптомных воспалительных процессах / Ю.А. Богданов, Т.И. Карпунина, Л.Ю. Нестерова, A.B. Ахова // Андрология и генитальная хирургия. - 2013.- № 3. - С. 19-22.

Публикации в других журналах и сборниках

5. Касимова, Т.В. Клинико-лабораторные критерии воспаления при скрининговом обследовании пациентов с хроническим простатитом / Т.В. Касимова, Ю.В. Беда, Ю.А. Богданов. // Российский иммунологический журнал. - 2010. -№ 4. - С. 433.

6. Богданов, Ю.А. Микрофлора эякулята и секрета предстательной железы мужчин с репродуктивными проблемами / Ю.А. Богданов, Т.И. Карпунина // Инфекция и иммунитет. -2012.- Т.2, № 1- 2. - С. 244.

7. Зуева, Т.В. Микробиота секрета предстательной железы / Ю.А. Богданов, Т.В. Зуева, Т.Б. Филатова // Материалы 1 национального форума Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации. — Ростов на Дону.-2012.-С. 164.

8. Карпунина, Т.И. Стратегия выживания Eníerococcus faecalis в присутствии спермальных полиаминов / Т.И. Карпунина, Ю.А. Богданов, Н.В. Николаева, A.B. Перова // Сборник, науч. трудов «Современные проблемы инфекционной патологии человека». - Минск. — 2013. — Вып. 6. — С. 306-310.

9. Богданов, Ю.А. О диагностической значимости содержания полиаминов в эякуляте / Ю.А. Богданов, Т.И. Карпунина // Тезисы VII Международного конгресса по репродуктивной медицине. - Москва. - 2013. - С. 497.

10. Карпунина, Т.И. Опыт ошибочной идентификации стрептококков в клинической практике. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. / Т.И. Карпунина, Ю.А. Богданов, М.А. Муртазина [и др.] // Тезисы XV Международного конгресса по антимикробной терапии - Москва. - 2013. - С. 22.

11. Карпунина, Т.И. Негативные тенденции в эволюции или ошибки фенотипической идентификации Streptococcus mitis? / Т.И. Карпунина, Ю.А. Богданов, М.А. Муртазина, Е.С. Корсакова // Проблемы медицинской микологии. -2013,-№2.-С. 83.

12. Богданов, Ю.А. Особенности клинико-микробиологических показателей у мужчин при бесплодии / Ю.А. Богданов, Т.И. Карпунина // Первый российско-азиатский уро-андрологический конгресс. Сборник тезисов. - С-Петербург. - 2014. -С. 34-36.

13. Николаева, Н.В. Изменение пленкообразующей способности Е. faecalis под влиянием спермальных полиаминов / Н.В. Николаева, Т.И. Карпунина, Ю.А.

Богданов, A.B. Перова // Сборник науч. трудов «Теоретические и прикладные успехи современной науки». - Белгород. - 2014. - С. 225-232.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБР - антибиотикорезистентность

БМПС - болезни мочеполовой системы

БПЖ - болезни предстательной железы

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ГКДЦ - Городской консультативно-диагностический центр

ИППП - инфекции, передающиеся половым путем

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПО - лечебно-профилактическая организация

ОДК - орнитиндекарбоксилаза

ОП - оптическая плотность

ПА - полиамины

Сп — спермин

Спд - спермидин

УПБ - условно патогенные бактерии УПМ-условно патогенные микроорганизмы

Богданов Юрий Аркадьевич

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И УРОВЕНЬ СПЕРМАЛЬНЫХ ПОЛИАМИНОВ У МУЖЧИН С БЕСПЛОДИЕМ

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 03.04.2015. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Набор компьютерный

Отпечатано в ФГБУН ИЭГМ УрО РАН 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13