Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека

Комарова, Марина Валериевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека"

РГБ ОД - 1 МАР 2000

На правах рукописи

КОМАРОВА. МАРИНА ВАЛЕРИЕВНА

ХАРАКТЕРИСГИКАЭЯКУЛЯТАВ ОЦЕНКЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа, 2000

Работа выполнена на кафедре биологической и клинической химии Самарского государственного медицинского университета

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор В.М. Радомская

Официалы шсоппонеиты:

заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор В.А.Вахитов

кандидат медицинских наук, доцент Ш.Н.Гал имов

Ведущая организация

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится "_"_2000 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д084.35.01 при Башкирском государственном медицинском университете по адресу: 450000 г. Уфа,

ул. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "//" ^реё^д/и^ 2000 г.

Ученый секретарьдиссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Х.МЛасыров

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. В современных условиях при снижении рождаемости возможность иметь ребенка каждой семьей является важной как для общества в целом, так и для благополучия отдельного человека.

Известно что, около 15% супружеских пар страдает бесплодием, причем треть случаев обусловлена мужским бесплодием (Nieslchlag Е. et al., 1997). Идиопатические нарушения функции гонад достигают 21% причин бесплодия у мужчин (Филатов О.С. с соавт., 1997). По наблюдениям ряда авторов, качество спермы за последние десятилетия меняется, что заключается в уменьшении концентрации и подвижности сперматозоидов (CarlsenE. et al., 1992; Jacques А., 1995).

Спермограмма является распространенным лабораторным исследованием состояния репродуктивной системы мужчин (Тиктинский O.JL, 1990; Пшеничникова Т.Я., 1991; Карпищенко А.И., 1998), однако существует большой межлабораторный разброс в получаемых результатах (Matson P.L., 1995), что снижает диагностическую ценность исследования (Barrait C.L., 1995).

Экспертами ВОЗ разработаны четкие стандарты для исследования эякулята (WHO, 1992), затрагивающие вопросы подготовки пациента, преданалитаческой подготовки пробы и референтные значения показателей спермограммы.

В литературе имеются сведения о влиянии биохимического состава спермальной плазмы на оплодотворяющую способность сперматозоидов (Николаев А. А. с соавт. 1992,1997,1998;НеймаркА.И.ссоавт. 1998; Липатова Н.А., 1997,1998; Lewin L.M. et al., 1993;PovoaH.J.etal.,1986;GarciaL.C.etal, 1992; Noguera J.A. et al., 1993; RolfC. et al., 1998; Sidhu R.S. et al., 1998), однако спектр веществ, изученных в спермальной плазме ограничен.

Исследования генетического материала сперматозоидов методически недостаточно разработаны, что делает данные трудно сопоставимыми (Мелещенко А.Б. с соавгт., 1991; Филатов М.В. с соавт, 1999; ЕпцЬ Е. & а1., 1993; Огис1у Ь. а а!., 1996; Наскег-К1ош и .В. е1 а1., 1999).

Сведения о биохимическом составе эякулята и состоянии хроматина сперматозоидов носят фрагментарный характер, что не позволяет использовать их для оценки оплодотворяющей способности спермы и судить о причинах расстройства гаметогенной функции гонад у значительного числа инфертильных мужчин.

Цель настоящего исследования заключается в изучении метаболических и морфологических показателей спермы у мужчин с бесплодием.

Задачи исследования.

1 .Изучить клеточный состав эякулята с оценкой количества сперматозоидов, их двигательной способности и морфологических особенностей.

2.Провести изучение соотношения клеток спермы по плоидности и качеству хроматина.

3 .Определить некоторые параметры углеводного, белкового обменов в сперматозоидах и провести сравнительную оценку показателей метаболизма в сперматозоидах и спермальной плазме.

4.Провести корреляционный анализ между отдельными показателями обмена в сперматозоидах, спермальной плазме и морфологическими, функциональными характеристиками сперматозоидов.

5.Проследить и выявить закономерности взаимоотношений между качеством и количеством хроматина в клетках сперматогенеза различной степени зрелости и метаболическими характеристиками спермальной плазмы.

Научная новизна. Новым явилось исследование генетического материала сперматозоидов у фертильных и инфертильных мужчин модифицированным методом лазерной проточной цитофлуориметрии. При этом у мужчин с бесплодием обнаружены существенные отклонения в распределении и степени конденсации хроматина в сперматозоидах, имеющие корреляционную связь с концентрацией сперматозоидов в эякуляте, что отражает глубину нарушений сперматогенеза.

Впервые изучен метаболический статус сперматозоидов по определению в них содержания глюкозы, общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрансферазы, креатинкиназы. щелочной фосфатазы, холинэстеразы, а-амилазы.

Получены новые сведения о составе спермальной жидкости. Проведен сравнительный анализ состояния обмена в спермальной плазме и мужских гаметах. Обнаружены корреляционные связи между отдельными параметрами метаболизма, а также морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов, их концентрацией.

Установлено, что при этиологически различных заболеваниях, приведших к бесплодию, характерным является снижение содержания кальция в спермальной плазме, увеличение вариабельности активности ферментов (креатинкиназы, холинэстеразы, щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы) и изменение формы распределения показателей, в связи с чем использованы непараметрические методы статистической обработки.

Научно-практическая значимость. Предложен новый алгоритм лабораторной диагностики мужской инфертильности. Помимо детальной спермограммы он включает анализ распределения и степени конденсации хроматина в сперматозоидах для оценки полноценности их

генетического материала с помощью модифицированной методики лазерной проточной цитофлуориметрии. Для оценки выраженности обменных нарушений в самих сперматозоидах отработана методика их разрушения с помощью детергента тритона Х-100. Для выявления метаболических изменений в спермальной плазме адаптированы методики ее преданалитической подготовки.

Выделены лабораторные синдромы для оценки тяжести и прогноза мужского бесплодия, а именно:

• сочетание сниженной концентрации сперматозоидов в эякуляте с изменением их морфологии и низкой подвижностью;

• появление сперматозоидов с измененным содержанием хроматина и недостаточной его конденсацией, увеличение доли незрелых сперматозоидов, а также сперматозоидов с низким содержанием ДНК;

• значительные отклонения уровней активности ферментов и снижение концентрации кальция в спермальной плазме.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для оценки состояния мужской репродуктивной системы недостаточны сведения о количественном и качественном составе сперматозоидов. Целесообразно изучение показателей метаболизма в спермальной плазме и сперматозоидах. К числу перспективных направлений диагностики мужской фертильности относятся дополнительные исследования состояния хроматина сперматозоидов как носителя генетической информации и компонентов семенной плазмы, отражающих состояние спермато- и спермиогенеза.

аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамил-трасферазы. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

3. Наличие существенных взаимосвязей между показателями метаболизма спермальной плазмы и функциональными, морфологическими характеристиками сперматозоидов.

4. Характер специфических метаболических сдвигов в спермальной плазме при различной картине спермограммы у инфертильных мужчин.

5. Изменение распределения хроматина в клетках эякулята, снижение конденсации хроматина, уменьшение концентрации мужских гамет, снижение концентрации общего белка, креатинина и снижение активности щелочной фосфатазы как проявления нарушения сперматогенеза.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на научно-практической конференции, посвященной 5-летию Самарского диагностического центра (Самара, 1995), научно-практической конференции "Современные диагностические технологии на службе здравоохранения" (Омск, 1998), научно-практической конференции "Факультету последипломной подготовки СамГУ - 15 лет" (Самара, 1998), научно-практической конференции, посвященной 75-летию кожвендиспансера (Самара, 1999), научно-практической конференции: "Самарскому государственному медицинскому университету 80 лет" (Самара, 1999), на заседании кафедры биологической и клинической химии совместно с Самарским отделением биохимического общества (Самара, 1999).

Внедрение результатов работы в практику. Материалы диссертации используются в лекционном курсе на цикле по клинической

лабораторной диагностике на кафедре биологической и клинической химии Самарского государственного медицинского университета в рамках факультета последипломного образования. Модифицированные методы исследования эякулята используются в работе лаборатории клинической химии и иммунологии ОАО "Самарский диагностический центр".

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 28 таблиц. Библиография включает 190 источников, из которых 22 отечественных и 168 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования В Самарском диагностическом центре обследовано 580 мужчин, из которых 550 обратились по поводу бесплодия в браке. Контрольную группу составили 30 мужчине доказанной фертильностью. В среднем бесплодный брак продолжался 3±2,3 года. На момент обследования признаков соматической патологии, в том числе эндокринной, а также заболеваний, передающихся половым путем, не было. Возраст контрольной и обследованной групп в среднем составил 27,6±5,9 и 29,7+6,3 лет, соответственно. Обследованные представляли разнородный профессиональный и социальный контингент.

Взятие материала и исследование спермы проводили согласно стандартизованным методикам, предложенным экспертами ВОЗ (Карпищенко А.И., 1998; WHO, 1992). Объектом исследования были клетки эякулята и спермальная плазма.

Исследование состояния хроматина клеток спермы проводили по методу Z. Darzynkiewicz(1990), адаптированному нами д ля клеток эякулята с набором реагентов "DNA-prep" на лазерном проточном цитометре Epics XL фирмы Coulter (США). В основе метода лежит способность флюоресцентного красителя - пропидиум йодида стехиометрически связываться с ДНК. В каждой пробе регистрируется 5000 клеток.

Исследование показателей обмена в спермальной плазме и в сперматозоидах проводили на автоматическом биохимическом анализаторе "Synchron 4" фирмы "Вескшап"(США). Изучали содержание общего белка, альбумина, глюкозы, мочевины, креатинина, кальция, фосфора, активность ферментов: лактатдегидрогеназы, аланинамикотрансферазы,

аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, а-амилазы, креатинкиназы, холинэстеразы. Рассчитывали удельную активность ферментов на грамм общего белка.

Состояние метаболизма сперматозоидов оценивали после разрушение их плазматических мембран с помощью лизирующего реагента, в состав которого входит неионный детергент тритон-Х 100. Биохимическое исследование проводили в пробе, содержащей 100 тыс. клеток.

Статистическую обработку результатов исследований производили с помощью компьютерных программ SPSS 6.1 и Statistica 5.0. При анализе вариационных рядов ряда параметров, для которых характерна нормальная форма распределения, использовали критерий Стьюдента t. Для оценки 18 из 48 изученных параметров спермы (концентрация сперматозоидов, активность а-амилазы, лактатдегидрогеназы и др.), которые характеризовались отличной от нормальной формой распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни-Вилкоксона U (рис.1) (Гублер Е.В., 1978) с указанием значений медианы, отражающей значение показателя, выше и ниже которого выявляют равное число наблюдений. Корреляционный анализ проводили по методам Пирсона и Кендалла(ГлассДж. Стенли Дж., 1976).

09 1« 27 3.6 45 54 6.3 7.2

Содержат« альбумина, т/л

200 400 6С0 800 1С00 1200 1400 1608 1500 2000 Содержание креатиника, мкмоль/л

/ шк\

'Ш И

'■А X ' р

ш, ж Щ ш

Ш ж г '

О 0.5 1 1.8 2 2.5 3 3.5 4

Содержание глкжеиы, ям оль/л

Концентрация сперматозоидов, м.ян/мя

0 1300 2«00 3900 520С 6500 7800 9100 104С0

Активность латггатдегйдрогеназы, МЕ/л

6 12 18 2* 30 36 42 48 $4

Активиость а-амилази, МЕ/л

Рис. 1. Гистограммы распределения некоторых показателей обмена в спермалытой плазме мужчин, обследованных по поводу бесплодия

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование эякулята фертильных и инфертильных мужчин начинали с анализа спермограммы, результаты которой служили основанием для деления обследованных на подгруппы. Показатели спермограммы 90% мужчин контрольной группы соответствовали критериям нормы, сформулированными экспертами ВОЗ: объем эякулята составил от 2 до 5,0 мл, концентраты сперматозоидов - от 34 до 190 млн/мл (у половины мужчин свыше 90 млн/мл), среди них подвижные сперматозоиды - от 41 до 68%, в среднем 52,2±9,9 %. Необходимо отметить, что в небольшом числе случаев у фертильных мужчин имела место незначительная олигоспермия 3,3% или гипокиноспермия -7,7 %.

У обследованных по поводу бесплодия встречали объем эякулята, как сниженный (менее 1,5 мл - в 7,2% случаев), так и увеличенный (свыше 5 мл - в 12% случаев). В спермограмме мужчин с бесплодием концентрации сперматозоидов была различной: в пределах нормы (более 20 млн/мл) - в 68 %, снижена - в 24%, полное отсутствие сперматозоидов -в 5% случаев, свыше 200 млн/мл - в 8% случаев. По показателю концентрации сперматозоидов медианы составили 90 и 57 млн/мл (р<0,05) у фертильных и инфертильных мужчин, соответственно, общее количество сперматозоидов во всем эякуляте - 308 и 164 млн (р<0,05), соответственно, общее количество подвижных сперматозоидов во всем эякуляте - 152 и 62 млн (р<0,05), соответственно. У пациентов с бесплодием встречались как случаи со сниженной подвижностью сперматозоидов - 47%, так и с сохраненной подвижностью - 53% (доля подвижных сперматозоидов более 40%).

У обследованных по поводу бесплодия мужчин в 24% случаев наблюдали сочетание снижения концентрации сперматозоидов с

% случаев

Концентрация

> 20 мпн/мл

<20 млн/мл

Подвижность >40 % подвижных < 40 % подвижных

Рис. 2. Концентрация и подвижность сперматозоидов в эякулятах инфертильных мужчин

% случаев

84 70 £5 42 28 14

Концентрация

< 20 млн/мл

Подвижность >40 % подвижных

< 40 % подвижных

Рис. 3. Концентрация и подвижность сперматозоидов в эякулятах фертилышх мужчин

> 20 млн/мл

нарушением их подвижности, что не наблюдалось у фертильных доноров (рис. 2,3).

Изменения морфологии головок сперматозоидов в виде уменьшения или увеличения их размера, деформации илиудвоения имели место в группе обследованных по поводу бесплодия в 63 % случаев. Морфологически измененные сперматозоиды обнаружены и у фертильных мужчин, но реже.

Обращает внимание большая вариабельность показателей спермограммы у мужчин с бесплодием. Наряду с азооспермией, астеноспермией, астено-олигоспермией, у 76% пациентов с нарушенной фертильностью показатели спермограммы были в пределах нормы, что заставило нас более углубленно изучать состояние генетического материала сперматозоидов и метаболический статус в них.

Изучение генетического материала в сперматозоидах и других клетках эякулята с помощью метода лазерной проточной цитофлуориметрии у фертильных мужчин выявило следующее. На гистограмме, отражающей распределение хроматина в клетках эякулята у фертильных мужчин, имеется, в основном, один пик с узкой симметричной формой в области 29,6±1,б у.е (рис. 4). Это показывает, что основная масса клеток имеет гаплоидный набор набор хромосом. Смещение пика, отличное от теоретически ожидаемого (100 у.е.), отражает определенную степень конденсации хроматина, характерную дня зрелых сперматозоидов. На долю пика приходится 79,1 ±3,9% от всех клеток пробы. У фертильных мужчин в небольшом количестве -15,1±1,0% - присутствуют гаплоидные клетки с низконденсированным хроматином - созревающие сперматиды. Положение их пика составляет 53,1±4,3у.е.

У мужчин с бесплодием отмечено изменение профиля распределения ДНК в клетках эякулята в виде иного числа пиков на гистограмме, иной площади и расположении. Дополнительные пики отражали появление

1° йа

Рис. 4. Профиль распределения клеток эякулята по количеству и степени конденсации хроматина у фертильного донора

Рис. 5. Профиль распределения клеток эякулята по количеству и степени конденсации хроматина у инфертильного мужчины

диплоидных, анеуплоидных и тетраплоидных клеток эякулята. Эти пики составляют у фергильных мужчин не более чем 3% от всех клеток эякулята, тогда как у обследованных по поводу бесплодия мужчин составляют до 40% от клеток спермы, что может свидетельствовать о нарушении процессов сперматогенеза. Появление пика, предшествующего основному, можно расценить как патологическое снижение количества ДНК в сперматозоидах в связи с нарушением созревания, либо как признак разрушения клеток (рис. 5).

Особенно существенные изменения характера распределения хроматина зарегистрированы у мужчин с олигоспермией (табл.1). Пик дефектных сперматозоидов и разрушенных клеток возрастал вдвое (медианы: 3,2 и 5,0 %, р<0,05). Основной пик сперматозоидов с высококонденсированным хроматином смещался на 8,8% вправо (р<0,01),

что отражает недостаточную конденсацию хроматина при спермиогенезе.

Таблица 1

Показатель гистограммы М±т Медиана Уровень достоверности различий по критериям

1 2 1 2 1 и

Размер пика В - по л- ноцешшх сперматозоидов 79,1±3,9 59,4±5,2 79,8 64,8 ** **

Положение пика В -полноценных сперматозоидов 29,6±1,б 33,7±4,4 30 34 ** **

Размер пика С - спср-матяд 15,1±1,0 20,8±1,8 14,9 19,5 - *

Положение пика С -сперматид 53,1±4,3 63,4±7,2 52 59 * #

Положение пика И -диплоидных клеток 155+19,6 187±24,7 147 182 *** ***

Размер пика Е - анеуплоидных клеток 0,68±0,03 1,8±0,3 0,3 1,3 - *

* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001

Мы отдельно проанализировали распределение хроматина в клетках эякулята у мужчин с бесплодием, в которых имелся повышенный уровень лейкоцитов. Согласно полученным результатам, особенностью гистограмм явилось увеличение пика А (медианы: 3,2 и 5,9%, р<0,01) и уменьшение пика В (медианы: 79,8 и 67,2%, р<0,05), отражающее полноценные сперматозоиды. На наш взгляд, увеличение клеток с низким содержанием ДНК связано с разрушением клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наличие даже умеренно выраженного воспалительного процесса, проявляющееся только лейкоцитозом в эякуляте, без клинических признаков, приводит к нарушению распределения генетического материала в клетках эякулята.

Обращает внимание, что у пациентов с нормальными показателями спермограммы изучение состояния хроматина выявило в ряде случаев (5,5%) появление аномальных пиков и снижение степени конденсации хроматина. Хотелось бы подчеркнуть, что у 48% обследованных с бесплодием картина распределения ДНК в сперматозоидах была практически нормальная.

Следовательно, для получения полной информации о состоянии генетического материала сперматозоидов необходимо наряду с несомненно значимыми сведениями о концентрации и подвижности сперматозоидов, сохранности их морфологии по данным спермограммы, получить информацию о распределении и степени конденсации хроматина в клетках эякулята.

Поскольку оплодотворяющая способность мужских гамет зависит не только от сохранности их генетического материала, были выполнены исследования ключевых параметров обмена в сперматозоидах после разрушения в них мембранных структур. Результаты исследования метаболического статуса сперматозоидов и спермальной плазмы представлены в таблице 2.

В сперматозоидах уровень общего белка составил 82,7+7,4 г/л, альбумина - 27,0±4,3 г/л, что составляет 33% от уровня общего белка. При этом в спермальной плазме уровень этих веществ существенно ниже (р<0,01), доля альбумина в спермальной плазме не превышает 10% от уровня общего белка. Продукты катаболизма белков - мочевина и креатинин - присутствуют в сперматозоидах в концентрациях на порядок меньших, чем в спермальной плазме. Концентрация мочевины в сперматозоидах составляет 1,7±0,07 ммоль/л, креатинина- 29,7±1,8 мкмоль/л. Концентрация глюкозы составляет 0,25±0,03 ммоль/л, тогда как в спермальной плазме - 1,65+0,18 ммоль/л (р<0,05). Известно, что основным энергетическим субстратом сперматозоидов является фруктоза, уровень которой, по данным литературы, в 10 раз выше и составляет 6,7 - 33,3 ммоль/л (Пашков A.B., 1997). Следует отметить, что при низком значении глюкозы достаточно высок уровень активности лакгатдегидрогеназы (медиана: 3200 Е/л), что заставляет предполагать, что на завершающем этапе анаэробного распада моносахаридов используется либо фруктоза, либо продукты неуглеводного происхождения.

Таблица 2

Показатели метаболизма Сперматозоиды Спермальная плазма

Общий белок, г/л 82,7+7,4 35,0+5,2**

Альбумин, г/л 27,0±4,3 3,0+0,27***

Мочевина, ммоль/л 1,7+0,07 21,0+3,5***

Креатинин, мкмоль/л 29,7±1,8 583±87***

Глюкоза, ммольЛт 0,25+0,03 !,65±0,18*

Аланинамииотрансфераза, Е/л 11,4+1,1 94,1±11,5*

Аспартатаминотрансфераза, Е/л 78,9+7,8 335±25*

у-пиотамилтрансфераза, Е/л 115+8,3 39001496*

* р<0,05, ** р<(),01, ***р<0,001

Сравнительная оценка активности ферментов в сперматозоидах и спермальной плазме показала следующее. Активность а-амилазы в сперматозоидах выше (медианы: 15,4 и 3,4, р<0,01), чем в спермальной плазме, активность ферментов: креатинкиназы (медианы: 15,4 и 68,3 р<0,05), аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамил-трансферазы ниже в сперматозоидах, чем в спермальной плазме. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

Корреляционный анализ выявил положительную связь между внутриклеточной и внеклеточной активностью креатинкиназы (г = 0,51 р<0,05). Возможно, внутри- и внеклеточные фермменты образуют единую систему преобразования макроэргов, аналогичную сердечной мышце.

Прослеживается корреляционная связь между показателями обмена в сперматозоидах и их концентрацией. Концентрация сперматозоидов связана прямой зависимостью с активностью аланинаминотрансферазы сперматозоидов (г= 0,80, р<0,05) и обратной - с концентрацией общего белка (г= - 0,81, р<0,05) и с активностью креатинкиназы (г = - 0,60, р<0,05). Полученные данные о взаимосвязи концентрации сперматозоидов и активности креатинкиназы соответствуют результатам работ 11.8.81(11111 е1 а1. (1998) и А.Сег§е1у е1 а1. (1999), выявивших повышенный уровень активности креатинкиназы в сперматозоидах субфертильных мужчин и отрицательную корреляцию активности данного фермента и концентрации сперматозоидов. Можно предположить, что при снижении количества сперматозоидов повышение в них активности креатинкиназы, обеспечивающей энергией движение хвоста сперматозоидов, является компенсаторным механизмом.

Для оценки роли различных звеньев метаболизма сперматозоидов в обеспечении их двигательной активности был проведен корреляционный анализ между показателями обмена в сперматозоидах и долей подвижных

сперматозоидов в эякуляте. При этом связи изученных параметров обмена с двигательной способностью сперматозоидов выявить не удалось. Тогда как доля морфологически измененных шеек и хвостов сперматозоидов, с повышением которой снижается подвижность сперматозоидов, связана обратной зависимостью с активностью креатинкиназы (г = - 0,77 р<0,05,), уровнем мочевины (г = - 0,91, р<0,05,), креагинина(х=-0,74, р<0,05), глюкозы (г = - 0,61, р<0,05,). Полученные результаты отражают взаимосвязь структурных и метаболических нарушений.

Подвижность сперматозоидов в группе фертильных доноров имела положительную связь с концентрацией альбумина, креатинина и щелочной фосфатазы (г= 0,58, р<0,01, г= 0,56, р<0,01, г= 0,58, р<0,05) спермальной плазмы.

Нами было проанализировано, в какой степени состояние генетического материала клеток эякулята связано с метаболическим статусом спермальной плазмы и как эта связь нарушается при бесплодии. По данным проточной цитометрии, положение пика сперматозоидов фертильных доноров имеет обратную связь с уровнем общего белка спермальной плазмы (г = - 0,63, р<0,05), что отражает зависимость степени конденсации хроматина сперматозоидов, а следовательно, и степени зрелости мужских гамет от уровня белка.

Анализ метаболических сдвигов в спермальной плазме мужчин, обследованных по поводу бесплодия, при различных вариантах картины спермограммы представлен в таблице 3. Наиболее характерным отклонением во всей группе мужчин, обследованных по поводу бесплодия, было почти двукратное снижение уровня кальция, а также значительные индивидуальные колебания в значениях активности креатинкиназы, холинэстеразы, щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы, что возможно, связано как с природой основного заболевания, так и со стадийностью процесса.

Таблица 3

Показатели метаболизма спермальной плазмы фертильных доноров и шгфертильных мужчин при различных вариантах спермограммы

[Нока1атель Фертпльныс мужчины Бе) Сперматозоидов Со сниженной ппдвижностыо сперматозоидов Со сниженной кончептрацнсй И подвижностью сперматозоидов Со сниженной полезностью м ПОрмальНОЛ концентрацией спер-матомнлов С нормальной кониентрацнсй н ПОДВИЖНОСТЬЮ сперматозоидов

Мочевина, ммоль/л 20,9б±3,5 19,1 ±4,2 18,0±3,8 13,9±2,0* 20.2±3,6 20,7±3,2

Глюкоза, ммоль/л 1,65+0.18 1,64±0,25 1,54*0,23 0,7110.13** 2,67+0.3* 1,6140,34

Общий белок, г/л 35,0±5,2 38,5+3,0 39,2±6,7 27,4±3,8* 45.6±5,7** 37,4±6.0

Альбумин, г/л 3,0+0,27 2.6±03 3,1 ±0,37 2,7+0,6 3,4±0,82 2,7+0,35

Крсатянни, мкмоль/л 843±87 873±125 866±% 822±91 1016+132 855±122

Кальций, ммояь/л П,5±1,08 6,2+0,7** 5,1+0,5** 3,1±0,21** 5,7+0,52** 7,6+0,9**

у-глютамшггрансфераза, Ё/л 3900±496 2965±193* 5385±578 4300±561 5621+570* 5804±574*

/-глгатамн.тгранофераза, Е/г 136,3+20,6 147,2±20,0 121,2±21,4 143±18 120±17 141,9±1б,4

Алатшамниотрансферача, Е/л 94,Ш1,5 90,9±13 65,5±5,6* 84,4±8,1 66,2±5.2* 79,1+7,1

Аланинаминотрансфераза, Е/г 3,03±0,4 2,02±0,35 1.7Ш.24+ 2,34+0,38 1,51+0,22** 2,31 ±0,32

Аспартагашшотраксфераза, Е/л 335±25 201+30** 318142 239+27* 378±43 371 ±24

Аспартатамшотрансфераза, Е/г 10,<Й1,6 4,4±0,7** , 8,211,2* 8,6±1,1 7,0±0,87* ¡0,5+1,1

Холииэстераза, Е/л 300±51,5 388±58 . 376АН6 329±47 392±55 375±38

Холинэстсраза, Е/г 8.1510.82 10,!±1,2 ши 7,9±1,0 9,б±1,3 10,9±1,2

* р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001

В подгруппах с различной концентрацией сперматозоидов выявлены следующие метаболические изменения в спермалъной плазме. У мужчин с азооспермией выявлено снижение уровней кальция (11,5+1,08 и 6,2+0,7 ммоль/л, р<0,01), активности аспартатаминотрансферазы {335+25 и 201±30 Е/ л - общая активность, 10,6±1,6 и 4,4±0,7 Е/л-удельная активность, р<0,05), удельной акгивиости лактагдегидрогеназы (медианы: 100 и 45,7 Е/г, р<0,05), удельной активности креатинкиназы (медианы: 0,96 и 0,22 Е/г, р<0,05), повышение уровня общей активности а-амилазы (медианы: 0,52 и 9,1 Е/л, р<0,05)(рис.б).

У мужчин со сниженной концентрацией сперматозоидов, сопровождавшейся и снижением подвижности сперматозоидов, снижена концентрация общего белка спермалыюй плазмы (35,0±5,2 и 27,4±3,8 г/л, р<0,05), глюкозы (1,65±0,18 и 0,71+0,13 ммоль/л, р<0,01), мочевины (20,96±3,5 и 13,9±2,0 ммоль/л, р<0,05), кальция (11,5+1,08 и 3,1±0,21 ммоль/л, р<0,01), активность аспартатаминотрансферазы (335125 и 239±27 Е/л, р<0,05), лактатдегндрогеназы (медианы: 2229 и 726 Е/л общая активность, 100 и 21,5 Е/ г - удельная активность, р<0,01) по сравнению с фертильными мужчинами (рис.7). Установлена слабая корреляция между активностью данных ферментов и концентрацией сперматозоидов в группе обследованных по поводу бесплодия мужчин. Следовательно, при нарушениях сперматогенеза нарушается состав спермальной жидкости.

В группе мужчин с гипокиноспермией без снижения концентрации сперматозоидов выявили достоверное снижение уровня кальция (11,5± 1,08 и 5,7±0,52 ммоль/л, р<0,01), удельной активности аланинаминотрансферазы (3,03+0,4 и 1,51 ±0,22 Е/г, р<0,05), удельной активности аспартатаминотрансферазы (10,6±1,6 и 7,0+0,87 Е/г, р<0,05). Выявили повышение уровня общего белка (35,0±5,2 и 45,6+5,7 г/л, р<0,01), глюкозы (1,65+0,18 и 2,67±0,3 ммоль/л, р<0,05), активности а-амилазы (медианы: 0,52 и 6,0 Е/л - общая

Альбумин 150

Холинэстераээ л ,Мочевина

Га ктзгдеги дроген^ аа, ^ Ч .Глюкоза

Аспартатамино-. трансфераза

Аланинамина-'-. трансфераза Гаымап

Общий белок

аымагпютамил-трансфераза

• Креатинин Кальций

Рис. 6. Показатели обмена спермальной плазмы мужчин, обследованных по поводу бесплодия, с азооспермией в процентах по отношению к показателям фертильных доноров

Альбумин 100 ,

Креатинкиназа

Холинэстеразэ ■50**^4 \ Глюкоза

Лзктат- / Хй?«1^ дегидрогеназа \ ' ;0е^И1,6елок

Аспартатамино-' < ■

трансфераза Ч VI \ /Креатинин

трансфераза ™ Кальчий Гаммаглютамил-трансферааа

Рис. 7. Показатели обмена спермальной плазмы мужчин, обследованных по поводу бесплодия, со сниженной концентрацией сперматозоидов в процентах по отношению к показателям фертильных доноров

активность, 0,015 и 0,16 ЕУг - удельная активность, р<0,05), общей активности у-ппотамилтрансферазы (3900±496 и 5621±570 Е/л,р<0,05) (рис. 8).

У пациентов с бесплодием даже при нормальной концентрации и подвижности сперматозоидов в эякуляте выявлены отклонения показателей обмена: снижена концентрация кальция (11,5±1,08 и7,6±0,9 м моль/л, р<0,01), повышен уровень общей активности у-глютамшггрансферазы (3900±496 и 5 804±574 Е/л, р<0,05), общей и удельной активности а-амилазы (медианы: 0,52 и 5,0 Е/л - общая активность, 0,015 и 0,14 Е/г-удельная активность, р<0,05), отмечена тенденция к повышению общей активности холинэстеразы (медианы: 222 и 308,5 Е/л, р<0,05) (рис. 9). Этот факт свидетельствует о том, что в ряде случаев оплодотворяющая способность сперматозоидов в известной степени зависит от характера окружающей их среды.

В группе пациентов с бесплодием с повышенной долей морфологически измененных головок сперматозоидов по сравнению с обследованными с нормальной морфологией головок выявлено снижение концентрациикреаганина( 1052+97и724,5+69,5 ммкмоль/л, р<0,01), общей и удельной активности щелочной фосфатазы (медианы: 982 и 340 Е/л - общая активность, 17,8 и 8,1 Е/г—удельная активность, р<0,05), общей и удельной активности холинэстеразы (497±48,5 и 279+42,1 Е/л - общая активность, 13,5±1,83 и 7,4±1,18 Е/г-удельная активность, р<0,05). Корреляционный анализ выявил обратную связь между долей патологически измененных головок сперматозоидов и содержанием креатинина (г = - 0,50, р<0,01) и уровнем активности холинэстеразы (г= - 0,63, р<0,001) спермальной плазмы как в группе фертильных доноров, так и среди обследованных по поводу бесплодия мужчин.

Факторы, нарушающие сперматогенез, оказывают влияние как на количество продуцируемых мужских гамет, так и на состав спермальной плазмы. Обращает внимание, что при снижении конденсации хроматина

Альбумин Креатинкиназа .. .Мочевина

Холинэстераза .Глюкоза

• Общий белок

Лактат-

дегидрогеназа

Аспартатамино-

трансфераза \ Аланинаминоч

Креатинин Кальций

трансфераза

Гаммагпютамил-трансфераза

Рис. 8. Показатели обмена спсрмапьной плазмы мужчин, обследованных по поводу бесплодия, со сниженной подвижностью сперматозоидов при нормальной концентрации сперматозоидов в процентах по отношению к показателям фертильных доноров

Альбумин 150

Креатинкиназа Холинэстераза

Лакгат-дешдрогеназа

Аспартатамино-1 трансфераза

Аланинамино'-\; трансфераза

Гаммаглютамил-трансфераза

. Мочевина ' .Глюкоза

' Общий белок •

/ Креатинин 'Кальций

Рис. 9. Показатели обмена спермальной плазмы мужчин, обследованных по поводу бесплодия, с нормальной концентрацией и подвижностью сперматозоидов в процентах по отношению к показателям фертильных доноров

сперматозоидов, выразившимся в изменении положения основного пика на гистограмме распределения клеток эякулята по количеству ДНК, в спермалыгой плазме снижается содержание общего белка (39,4±6,3 и 30,1±5,3 г/л, р<0,05) и повышается активность холинэстеразы (медианы: 6,5 и 18,2 Е/г, р<0,05). В спермограммах таких мужчин снижена концентрация сперматозоидов (медианы: 61 и 34 млн/мл, р<0,01) и чаще встречаются морфологические изменения их головок (медианы: 9 и 10, р<0,05). Выявленные изменения, по нашему мнению, могут быть обусловлены единством этиологических факторов, влияющих как на сперматогенез, гак и на метаболизм спермальной плазмы.

На наш взгляд, перспективным является исследование клеточного состава эякулята и метаболического статуса сперматозоидов и спермальной плазмы. Предложен диагностический алгоритм для оценки состояния мужской репродуктивной системы. Он включает детальный анализ спермограммы с оценкой количества сперматозоидов, их подвижности и сохранности морфологии головок, шеек и хвостов. Наряду с этим проводится анализ распределения и степени конденсации хроматина в клетках эякулята с помощью проточной цитометрии, что позволяет выявить нарушения в генетическом материале. При отсутствии видимых изменений клеточного состава эякулята мужчин с бесплодием целесообразно провести оценку метаболического статуса сперматозоидов и спермальной плазмы с помощью параметров углеводного и белкового обменов и уровня кальция. Прогностически неблагоприятными являются следующие метаболические сдвиги в спермальной плазме: снижение концентрации кальция, резкие отклонения в активности ферментов лактатдегидрогеназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глутамил-трансферазы. Проведенные нами исследования являются фактическим материалом, свидетельствующим о том, что для реализации репродуктивной функции значимы и структурно-функциональные параметры гамет, и метаболические показатели спермальной плазмы.

ВЫВОДЫ

1.По данным спермограммы мужчин с бесплодием концентрация сперматозоидов в пределах нормы - у 68 %, снижена - у 24 %, свыше 200 млн/ мл - в 8% случаев.

2.Содержание хроматина в клетках эякулята, степень его конденсации колеблются в пределах нормы у 48% мужчин с инфертильностью. При бесплодии встречаются нарушения конденсации хроматина сперматозоидов и появление дополнительных пиков на гистограмме распределения ДНК клеток спермы.

3.Сравнительная оценка показателей метаболизма в сперматозоидах и спермальной плазме показала, что содержание общего белка, альбумина, активность а-амилазы в сперматозоидах выше, чем в спермальной плазме; тоща как содержание мочевины, креатинина, глюкозы, активность ферментов: креатинкиназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у -глютам шгтран сф ер азы ниже в сперматозоидах, чем в спермальной плазме. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

4.Активность лактатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы спермальной плазмы связаны положительной коррелятивной связью с концентрацией сперматозоидов.

5.Двигательная способность сперматозоидов имеет положительную корреляционную связь с содержанием альбумина и креатинина спермальной плазмы у фертильных доноров, при бесплодии эта связь отсутствует.

6.Изменения морфологии головок сперматозоидов сочетаются с отклонениями в метаболизме спермальной плазмы у мужчин с бесплодием, а именно: снижением концентрации креатинина, активности щелочной фосфатазы и холинэстеразы спермальной плазмы.

7. Эффективность диагностики инфертильности у мужчин при нормальном количестве сперматозоидов базируется на определении

характера распределения хроматина в сперматозоидах и оценке содержания белка, кальция, активности лактатдегидрогеназы, у-пхютамилтрансферазы, аспартатаминотрансферазы в спермальной плазме.

ПРАКТИЧОЕСЖИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Диагностическими критериями в оценки тяжести и прогноза мужского бесплодия являются следующие изменения характеристик эякулята:

• сочетание сниженной концентрации сперматозоидов в эякуляте с изменением морфологии их головок, шеек, хвостов и низкой подвижностью;

• обнаружение сперматозоидов с измененным содержанием хроматина и недостаточной его конденсацией, увеличение доли незрелых сперматозоидов, а также сперматозоидов с низким содержанием ДНК;

• значительные отклонения уровней активности ферментов лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, у-щутамилтрансферазы, аспартатаминотрансферазы и концентрации кальция в спермальной плазме.

2. Для оптимизации диагностики различных форм мужской инфертильности в целях выработки патогенетически обоснованной тактики лечения и оценки возможности использования собственного генетического материала для экстракорпорального оплодотворения предлагается:

• детальное изучение спермограммы для выявления неблагоприятных признаков: снижения концентрации сперматозоидов, подвижности и доли морфологически полноценных сперматозоидов;

• анализ распределения и степени конденсации хроматина в сперматозоидах для оценки полноценности их генетического материала с помощью проточной цитометрии ДНК клеток эякулята;

• изучение метаболических показателей спермальной плазмы: уровня общего белка, креатинина, кальция, активностей лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы, у-глутамилтрансферазы, изменение которых сочетаются со снижением оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Определение спермограммы при бесплодном браке // Современная диагностика в практике здравоохранения. - Самара, 1995. - С.104 -106. (Соавтор: Торопова Н.Е.)

2 Плацентарные белки сыворотки крови в диагностике патологии беременности // Современная диагностика в практике здравоохранения. -Самара, 1995. - С. 106 -109. (Соавтор: Торопова Н.Е.)

3. Проточная лазерная цитофлуориметрия спермы человека // Современные диагностические технологии на службе здравоохранения. -Омск, 1998. - С. 234 - 236. (Соавторы: КоломинаС.В., Торопова Н.Е.)

4. Взаимосвязи некоторых показателей спермограммы у мужчин с нарушенной фертильностью// Факультету последипломной подготовки СамГМУ 15 лет: Тез. докл. - Самара, 1998. - С. 224-226. (Соавторы Торопова Н.Е., Корякина В. А.)

5. Влияние воспалительных заболеваний урогенитальной сферы на генетичский материал сперматозоидов // Материалы научно-практической конференции, посвященной 75-летию дерматовенерологической службы Самарской области. - Самара, 1999. -С. 132. (Соавтор: Козляткин А.Ю.)

6. Оценка семенной жидкости в диагностике мужского бесплодия // Самарскому государственному медицинскому университету 80 лет. -Самара, 1999.-С. 121. (Соавтор: Козляткин А.Ю.)

7. Нарушения белкового обмена у жителей экологически неблагополучного региона // Материалы VI Международ-ного Конгресса "Экология и здоровье человека". - Самара, 1999. - С.100-101. (Соавторы: Казаков В.Ф., Серебряков В.Г., Козляткин А.Ю., Долгова Г.Ю., Панфилов И.И.,Крутикова В.В., Пономарева А.А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комарова, Марина Валериевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Особенности метаболизма сперматозоидов на разных этапах сперматогенеза

1.2.Роль спермальной плазмы в фертилизации эякулята

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика обследованной группы

2.2. Общеклиническое исследование эякулята

2.3. Исследование количества и степени конденсации хроматина клеток эякулята методом лазерной проточной цитофлуориметрии

2.4. Исследование показателей обмена спермальной плазмы и сперматозоидов

2.5. Статистическая обработка результатов исследований

ГЛАВА 3. Характеристика клеточного состава эякулята

3.1. Сравнение показателей спермограммы у фертильных мужчин и обследованных по поводу бесплодия

3.2. Содержание ДНК в клетках эякулята у мужчин с различной фер-тильностью

ГЛАВА 4. Показатели метаболизма эякулята

4.1. Показатели обмена в спермальной плазме и сперматозоидах фертильных доноров

4.2. Метаболичекские характеристики спермальной плазмы у мужчин с различными нарушениями репродуктивной функции

ГЛАВА 5. Взаимосвязи между характеристиками эякулята

5.1. Корреляционные связи между показателями обмена спермальной плазмы и спермограммы

5.2. Взаимосвязи между показателями количества и степени конденса

5.2. Взаимосвязи между показателями количества и степени конденсации хроматина и показателями обмена спермальной плазмы. 96 5.3.Оценка состояния хроматина сперматозоидов в зависимости от метаболических особенностей спермальной плазмы 104 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108 ВЫВОДЫ 124 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 125 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека"

Известно что, около 15% супружеских пар страдает бесплодием, причем треть случаев приходится на мужское бесплодие (Nieslchlag Е. et al., 1997). Идиопатические нарушения функции гонад достигают 21% причин бесплодия у мужчин (Филатов О.С. с соавт., 1997). По наблюдениям ряда авторов, качество спермы за последние десятилетия падает, что заключается в уменьшении концентрации и подвижности сперматозоидов (Carlsen Е. et al., 1992; Jacques А., 1995).

Спермограмма является распространенным лабораторным исследованием состояния репродуктивной системы мужчин (Тиктинский О.Л., 1990; Пшеничникова Т.Я., 1991; Карпигценко А.И., 1998), однако существует большой межлабораторный разброс в получаемых результатах (Maison P.L., 1995), что снижает диагностическую ценность исследования (Barratt C.L., 1995).

Экспертами ВОЗ разработаны четкие стандарты для исследования эякулята (WHO, 1992), затрагивающие вопросы подготовки пациента, преданали-таческой подготовки пробы и референтные значения показателей спермо-граммы.

В литературе имеются сведения о влиянии биохимического состава спермальной плазмы на оплодотворяющую способность сперматозоидов (Николаев А.А. с соавт. 1992, 1997, 1998; Неймарк А.И. с соавт. 1998; Липатова Н.А., 1997, 1998; Lewin L.M. et al., 1993; Povoa H.J. et al.,1986; Garcia L.C. et al., 1992; Noguera J.A. et al., 1993; Rolf С. et al., 1998; Sidhu R.S. et al., 1998), однако спектр веществ, изученных в спермальной плазме ограничен.

Исследования генетического материала сперматозоидов методически недостаточно разработаны, что делает данные трудно сопоставимыми (Меле5 щенко А.Б. с соавт., 1991; Филатов М.В. с соавт., 1999; Ег^Ь Е. е! а1., 1993; Вгибу Ь. ег а!., 1996; Наскег-К1от и.В. ег а1., 1999).

Задачи исследования.

1. Изучить клеточный состав эякулята с оценкой количества сперматозоидов, их двигательной способности и морфологических особенностей.

2. Провести изучение соотношения клеток спермы по плоидности и качеству хроматина.

3. Определить некоторые параметры углеводного, белкового обменов в сперматозоидах и провести сравнительную оценку показателей метаболизма в сперматозоидах и спермальной плазме.

4. Провести корреляционный анализ между отдельными показателями обмена в сперматозоидах, спермальной плазме и морфологическими, функциональными характеристиками сперматозоидов.

5. Проследить и выявить закономерности взаимоотношений между качеством и количеством хроматина в клетках сперматогенеза различной степени зрелости и метаболическими характеристиками спермальной плазмы.

Научная новизна. Новым явилось исследование генетического материала сперматозоидов у фертильных и инфертильных мужчин модифицированным методом лазерной проточной цитофлуориметрии. При этом у мужчин с бесплодием обнаружены существенные отклонения в распределении и степени конденсации хроматина в сперматозоидах, имеющие корреляционную 6 связь с концентрацией сперматозоидов в эякуляте, что отражает глубину нарушений сперматогенеза.

Впервые изучен метаболический статус сперматозоидов по определению в них содержания глюкозы, общего белка, альбумина, мочевины, креати-нина, активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрансферазы, креатинкиназы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, а-амилазы.

Научно-практическая значимость. Предложен новый алгоритм лабораторной диагностики мужской инфертильности. Помимо детальной спермо-граммы он включает анализ распределения и степени конденсации хроматина в сперматозоидах для оценки полноценности их генетического материала с помощью модифицированной методики лазерной проточной цитофлуоримет-рии. Для оценки выраженности обменных нарушений в самих сперматозоидах отработана методика их разрушения с помощью детергента тритона Х-100. Для выявления метаболических изменений в спермальной плазме адаптированы методики ее пред аналитической подготовки. 7

Выделены лабораторные синдромы для оценки тяжести и прогноза мужского бесплодия, а именно:

•сочетание сниженной концентрации сперматозоидов в эякуляте с изменением их морфологии и низкой подвижностью;

•появление сперматозоидов с измененным содержанием хроматина и недостаточной его конденсацией, увеличение доли незрелых сперматозоидов, а также сперматозоидов с низким содержанием ДНК;

•значительные отклонения уровней активности ферментов и снижение концентрации кальция в спермальной плазме.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Сравнительная оценка метаболизма сперматозоидов и спермальной плазмы, выявившая более высокий уровень в сперматозоидах общего белка, альбумина, активностей ферментов а-амилазы и более низкий уровень мочевины, креатинина, глюкозы, активностей ферментов: креатинкиназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрасферазы. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

3. Наличие существенных взаимосвязей между показателями метаболизма спермальной плазмы и функциональными, морфологическими характеристиками сперматозоидов. 8

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на научно-практической конференции, посвященной 5-летию Самарского диагностического центра (Самара, 1995), научно-практической конференции "Современные диагностические технологии на службе здравоохранения" (Омск, 1998), научно-практической конференции "Факультету последипломной подготовки СамГУ - 15 лет" (Самара, 1998), научно-практической конференции, посвященной 75-летию КВД (Самара, 1999), научно-практической конференции: "Самарскому государственному медицинскому университету 80 лет" (Самара, 1999), на заседании кафедры биологической и клинической химии совместно с Самарским отделением биохимического общества (Самара, 1999).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и содержит 28 таблиц. Библиография включает 190 источников, из которых 22 отечественных и 168 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Комарова, Марина Валериевна

ВЫВОДЫ

1. По данным спермограммы мужчин с бесплодием концентрация сперматозоидов и пределах нормы - у 68 %, снижена - у 24 %, свыше 200 млн/мл - в 8% случаев.

2. Содержание хроматина в клетках эякулята, степень его конденсации колеблются 15 пределах нормы у 48% мужчин с инфертильностью. При бесплодии встречаются нарушения конденсации хроматина сперматозоидов и появление дополнительных пиков на гистограмме распределения ДНК клеток спермы.

3. Сравнительная оценка показателей метаболизма в сперматозоидах и спермальной плазме показала, что содержание общего белка, альбумина, активность а-амилазы в сперматозоидах выше, чем в спермальной плазме; тогда как содержание мочевины, креатинина, глюкозы, активность ферментов: креа-тинкиназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрансферазы ниже в сперматозоидах, чем в спермальной плазме. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

4. Активность лактатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы спермальной плазмы связаны положительной коррелятивной связью с концентрацией сперматозоидов.

5. Двигательная способность сперматозоидов имеет положительную корреляционную связь с содержанием альбумина и креатинина спермальной плазмы у фертильных доноров, при бесплодии эта связь отсутствует.

6. И вменения морфологии головок сперматозоидов сочетаются с отклонениями в метаболизме спермальной плазмы у мужчин с бесплодием, а именно: снижением концентрации креатинина, активности щелочной фосфатазы и холинэстеразы спермальной плазмы.

125

7. Эффективность диагностики инфертильности у мужчин при нормальном количестве сперматозоидов базируется на определении характера распределения хроматина в сперматозоидах и оценке содержания белка, кальция, активности лактатдегидрогеназы, у-глютамилтрансферазы, аспартатаминотранс-феразы в спермальной плазме.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

• значительные отклонения уровней активности ферментов лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, у-глутамилтрансферазы, аспартатаминотранс-феразы и концентрации кальция в спермальной плазме.

126

• изучение метаболических показателей спермальной плазмы: уровня общего белка, креатин и на, кальция, активностей лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы, у-глутамилтрансферазы, изменение которых сочетаются со снижением оплодотворяющей способности сперматозоидов.

127

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комарова, Марина Валериевна, Самара

1.Активность ферментов спермоплазмы в эякулятах различной фертиль-ности / A.A. Николоаев, Д.Л. Луцкий, В.А. Бочановский, Л.В. Ложкина // Урол. нефрол. 1997. - N5. - С.35 - 39.

2. Артифексов С.Б. Андрологические аспекты бесплодного брака // Урол. нефрол. 1996. - N4. - С.39-41.

3. Биология развития млекопитающих. Методы: Пер с англ./ Под ред. М. Манк. М.: Мир. 1990. 406 с.

4. Гласс Дж., Стенли Дж. Статистические методы в педагогике и психологии (пер. с англ. Л.И. Хайрусовой под ред. Ю.П. Адлера). М.: Прогресс, 1976.-496 с.

5. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.: Медицина, 1978. - 296 с.

6. Евдокимов В.В., Фыонг В.Т., Орлова Е.В., Ерасова В.И. Антигены эякулята при патологических процессах в репродуктивной системе и нарушениях сперматогенеза // Материалы IV Всесоюзного съезда урологов. Москва, 1990. - С. 361.

7. Кендалл М. Методы ранговой корреляции. М.: Статистика, 1974.168с.

8. Липатова H.A., Раков С.С., Морозова В.Т. Белковые маркеры спермоплазмы в лабораторной диагностике бесплодия при воспалительных и невоспалительных заболеваниях мужской репродуктивной системы // Клиническая лабораторная диагностика. 1997.- №5. - С.40 -41.

9. Липатова H.A., Раков С.С., Морозова В.Т. Исследование белков спермоплазмы у больных с воспалительными заболеваниями мужской репродуктивной системы // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - №9. -С.40.128

10. Ю.Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. А.И. Карпищенко. Санкт-Петербург: Интермедика, 1998. - 408 с.

11. П.Мелещенко А.Б., Кравцов A.JL, Ледванов М.Ю. Проточная цитоф-люориметрия сперматозоидов человека// Лабораторное дело. 1991. - N2. - С. 25 -27.

12. Неймарк А.И., Фидркин A.B., Алиев Р.Т. Изменение уровня энзимов спермы у мужчин с бесплодием // Урол. нефрол. 1998. - №2. - С.44 — 45.

13. Николаев A.A., Луцкий Д.Л., Ложкина Л.В. Белковый спектр эякуля-тов различной фертильности // Урол. нефрол. 1992. - №2. - С.48 - 51.

14. И.Николаев A.A., Луцкий Д.Л., Николаева H.H. Обмен железа и неге-миновых ферропротеинов в эякулятах различной фертильности // Урол. нефрол., 1998 №5. - С.27 - 31.

15. Пашков A.B. Ультрамикрометод определения фруктозы в сперме // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - N9. - С.38.

16. Пчелкина З.М., Фыонг И.Т., Евдокимов В.В. Определение слюнос-пермального глобулина при нарушениях сперматогенеза // Материалы IV Всесоюзного симпозиума с международным участием "Иммунология репродукции" .- Киев, 1990.-С. 81.

17. Пшеничникова Т.Я. Бесплодие в браке. М. Медицина. 1991. 320 с.

18. Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике. Под ред. М.А. Базарновой. К.: Выща школа, 1988. - 318 с.

19. Руководство по андрологии / Под ред. О.Л.Тиктинского. Л.: Медицина, 1990.-416 с.

20. Сексопатология: Справочник / Под ред. Г.С. Васильченко. М.: Медицина, 1990. - 576с.

21. Татаринов Ю.С., Олиференко Г.А., Петрунин Д.Д. Альфа 2- микроглобулин фертильности // Успехи совр. биологии. 1985. - Т. 100, вып. 3. - С.129465 472.

22. Afzelius B. A. Genetical and ultrastructural aspects of the immotile-cilia syndrome // Am. J. Hum. Genet. -1981. Y. 33. - P. 852-864.

23. Afzelius B. A., Eliasson R. Male and female infertility problems in the immotile-cilia syndrome // Eur. J. Respir. Dis. Suppl. 1983. - V. 127. - P. 144-147.

24. Ahmad K., Naz R. K. Effects of human antisperm antibodies on development of preimplantation embryos // Arch. Androl. 1992. - V.29. - P.9-20.

25. Aitken R.J., Clarkson J.S. Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques // Journal of An-drology. 1988. V. 9. - N6. - P.367-376.

26. Alkaline phosphatase in human semen: an investigation using enzyme inhibitors and gel electrophoresis / L.M. Lewin, R. Golan, Y. Soffer et al. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1993. -N12. - P.811-814.

27. J.S.Armstrong, M.Rajasekaran, W.J.Hellstrom, S.C. Sikka // J. Androl. 1998. -V.19, N4. - P.412-419.

28. Apparent doubling in the frequency of undescended testes in England and Wales / C. P. Chilvers, M.C. Forman, D. Fogelman, K. Wadsworth // Lancet. -1984. N2. - P. 330-332.

29. Ascorbic acid protects against endogenous oxidative DNA damage in human sperm / C.G. Fraga, P.A. Motchnik, M.K. Shigenaga et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1991. - V.88. - P. 11003-11006.

30. Ballachey B.E., Hohenboken W.D., Evenson D.P. Sperm head morphology and nuclear chromatin structure evaluated by flow cytometry in a diallel cross in mice // Can. J. Genet. Cytol. 1986. - V.28. - P.954-966.

31. Barratt C.L.R. On the accuracy and clinical value of semen laboratory tests // Hum. Reprod. 1995. - N 10. - P. 250-252.

32. Buitrago J.M., Diez L.C., Battaner E. Human semen aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase activity in male fertility studies // Andrologia.1981. V. 13, N4. P. 335-341.

33. Buonaguidi A., Mondina R., Polvani F. Prospectives of the study of seminal fluid in the diagnosis of infertility // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P.32159-32167.

34. Calvin H. I., Bedford J. M. Formation of disulfide bonds in the nucleus and accessory structures of mammalian spermatozoa during maturation in the epididymis // J. Reprod. Fertil. 1971. V. 13. -P.65-75.

35. Characterization of a sperm-specific monoclonal antibody and isolation of 95-kilodalton fertilization antigen-2 from human sperm / R.K. Naz, C. Morte, V. Garcia-Framis et al. //Biol. Reprod. 1993. - V.49. - P. 1236-1244.

36. Cicero T.J., Bell R.D. Ethanol induced reductions in testicular steroidogenesis: Major differences between in vivo and in vitro approaches // Steroids.1982.-V. 40. -N5.-P. 561-568.131

37. Correlation of sperm motility with mitochondrial enzymatic activities / E. Ruiz-Pesini, C. Diez, A.C. Lapena, et al. // Clin. Chem. 1998. - V.44, N8. - P. 16161620.

38. Creatine kinase activity in human spermatozoa and seminal plasma lacks predictive value for male fertility in in vitro fertilization / C. Rolf, H.M. Behre, T.G. Cooper et al. // Fertil. Steril. 1998. - V.69, N4. - P.727-734.

39. Dadoune J.P. The nuclear status of human sperm cells // Micron 1995. -V. 26 -N4. P. 323-345.

40. Daltero S., Badre F. Cannabinoids in mice: effects on fertility and spermatogenesis // Science. 1982. - V. 216, P. 315-316.

41. Daltero S., Bartke A., Mayfield D. D9-tetrahydrocannabinol increases plasma testosterone concentration in male mice // Science. -1981. -V. 213. P. 581583.

42. Darzynkiewicz Z., Crissman H. Methods in cell biology // Flow Cytometry. University of California, 1990. V.33.

43. Decline in Semen Quality among Fertile Men in Paris during the Past 20 Years / J. Auger, J.M. Kunstmann, F. Czyglik, P. Jouannet // New Engl. J. Med. -1995. -V. 332, N. 5. P. 281-285.

44. Demonstration of antispermatozoal antibodies in varicocele related infertility with an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) / J. Golomb, N. Vardi-non, Z.T. Homonnai et al. // Fertil. Steril. 1986. - V. 45. P. 397 -401.

45. DNA flow cytometry of left and right testes in normospermic patients affected by left varicocele / G. Bonanni, A. Calcagno, G. Mammana et al. // Hum. Reprod. 1997. -Nl. - P. 64-67.132

46. DNA organization in human spermatozoa / J.G. Barone, J. De Lara, K.B. Cummings, W.S. Ward//J. Androl. 1994. - V.15, N2. - P. 139-144.

47. Drudy L., McCaffrey M., Mallon E. Spermatozoal DNA flow cytometry and recurrent miscarriage // Arch. Androl. 1996. - V.37, N3. -P.143-147.

48. Dubin L., Amelar R.D. Etiologic factors in 1294 consecutive cases of male infertility// Fertil. Steril. 1971. - Y. 22. - P. 469.

49. Effect of lipid peroxidation on beating frequency of human sperm tail / C.Y. Hong, M.F. Lee, L.J. Lai, C.P. Wang // Andrologia. 1994. - V.26, P.61-65.

50. Eliasson R., Virji N. LDH-C4 in human seminal plasma and its relationship to testicular function. II. Clinical aspects // Int. J. Androl. 1985. —N1 - P. 201214.

51. Engh E., Scholberg A., Clausen O.P. DNA flow cytometry of sperm from normozoospermic men in barren couples and men of proven fertility. Int. J. Fertil. Menopausal Stud. 1993. - Y.38, N5. - P. 305-310.

52. Enzyme and hormonal markers in the differential diagnosis of human azoospermia / L.C. Garcia Diez, P.F. Esteban Ruiz, E. Villar // Arch. Androl. 1992. -V. 28, N3. - P. 181-194.

53. Evenson D.P., Baer R.K., Jost L.K. Flow cytometric analysis of rodent epididymal spermatozoal chromatin condensation and loss of free sulfhydryl groups // Mol. Reprod. Dev. 1989. - V. 1. - N4. - P.283-288.

54. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years / E. Carlsen, A. Giwercman, N. Keiding, N.E. Skakkebaek // B.M.J 1992. - N9. - P.609-613.

55. Experience with the determination of LDH-X in seminal plasma as diagnostic and prognostic factor in varicocele / A. Buonaguidi, M. Grasso, C. Lania et al. // Arch. Esp. Urol. 1993. - V. 46, N1. - P. 35-39.

56. Farghali H., Williams D.S., Gavaler J. Effect of short-term ethanol feeding on rat testes as assessed by 31P NMR spectroscopy, 1H NMR imaging, and biochemical methods //Alcohol. Clin. Exp. Res. 1991. - N15. - P. 1018-1023.

57. Forejtek P., Navratil S. Relation between aspartate aminotransferase (AST) activity in the seminal fluid and indicators of boar ejaculate quality // Vet. Med. (Praha) 1984. - V.29. - N4. - P. 217-222.

58. Fraser L. R., Mclntyre K. Calcium channel antagonists modulate the acro-some reaction but not capacitation in mouse spermatozoa // J. Reprod. Fertil. 1989 - V. 86. - P. 223-233.

59. Fraser L.R. Fertilization promoting peptide: an important regulator of sperm function in vivo? // Rev. Reprod. 1998. - N3. - P. 151-154.

60. Gagnon C., Iwasaki, A., Lamirande, E.D. Reactive oxygen species and human spermatozoa // Annals of the New York Academy of Sciences. 1991. -V.637. - P. 436-444.

61. Garner D.L., Johnson L.A. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and propidium iodide // Biol. Reprod. 1995. - V.53, N2. - P.276-284.

62. Garner D.L., Thomas C.A., Allen C.H. Effect of semen dilution on bovine sperm viability as determined by dual-DNA staining and flow cytometry // J. An-drol. 1997. -V.18, N3. - P.324-331.

63. Gender-specific glycosylation of human glycodelin affects its contraceptive activity / H.R. Morris, A. Dell, R.L. Easton et al. // Minerva Ginecol. 1991. -V.43, N11. -P.499-503.

64. Gershbein L.L., Thielen D.R. Enzymatic and electrolytic profiles of human semen // Prostate. 1988. -V.12, N3. - P. 263-269.

65. Glander H.J., Kratzsch J., Weisbrich C. Insulin-like growth factor-I and alpha.2-macroglobulin in seminal plasma correlate with semen quality // Hum. Reprod. 1996. - V.ll. -Nil. - P.2454-2460.134

66. Glucose in human semen/ H. J. Povoa, J.J. Bastos, M.E. Silva et al. // Biomed. Biochim. Acta. 1986. - V.45, N5. - P.685-686.

67. Glycodelin from seminal plasma is a differentially glycosylated form of contraceptive glycodelin-A / H. Koistinen, R. Koistinen, A. Dell et al. // Mol. Hum. Reprod. 1996. - V.2, N10. - P.759-765.

68. Gonzales G.F., Garcia-Hjarles M.A., Guitierrez R. The secretor activity of seminal vesicles and its relationship with sperm motility: effects of infections in the male reproductive tract // Int. J. Androl. 1989. - N 12. - P. 286-294.

69. Gonzales G.F., Kortebani G., Mazzolli A.B. Hyperviscosity and hypo-function of the seminal vesicles // Arch. Androl. 1993. - V. 30. - N1. - P.63-68.

70. Gopalkrishnan K., Hinduja I.N., Kumar T.C. Volume of semen as a parameter of its quality // Indian J. Med. Res. 1992. - V. 96. - P.361-365.

71. Gopalkrishnan K., Padwal V., D'Souza S., Shah R. Severe asthenozoo-spermia: a structural and functional study // Int. J.Androl. 1995. - V.18. - N1. -P.67-74.

72. Hacker-Klom U.B., Gohde W., Nieschlag E. DNA flow cytometry of human semen //Hum. Reprod. 1999. - V.14. - N10. - P.2506-2512.

73. Halliwell B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry, and role in human diseases // Amer. J. Med. 1991. - V.9. - P. 14-22.

74. Haugan T.B., Grotmol T. PH of human semen // Int. J. Androl. 1998. -N2. - P. 105 - 108.

75. Hershlag A., Cooper G. W., Benoff S. Pregnancy following discontinuation of a calcium channel blocker in the male partner // Hum. Reprod. 1995 -N10. -P. 599-606.

76. Huaijin C., Junyan Z., Naiguan C. Prostatic fluid and sperm examination: 106 cases. Preliminary study on infertility // Acta. Urol. Belg. 1998. - V. 66, N1. -P. 19-21.

77. Hull M.G.R. Infertility treatment: relative effectiveness of conventional135and assisted conception methods // Hum. Reprod. 1992. - N7. - 785-796.

78. Human male infertility may be due to a decrease of protamine P2 content of sperm chromatin / I.A. Belokopitova, E.I. Kostyleva, A.N. Tomilin, V.I. Vorobev // Mol. Reprod. Dev. 1993. -V34. - P.53-57.

79. Jager S., Wijchman J., Kremer J. Studies on the decondensation of human, mouse, and bull sperm nuclei by heparin and other polyanions // J. Exp. Zool. -1990. V.256, N3. - P.315-322.

80. Javed A. A., Naz R. K. Human cleavage signal-1 protein: Molecular cloning, transcription and immunological analysis of in vitro translated protein // Gene.- 1992. V.112. - P. 205-211.

81. Jeulin C., Lewin L.M. Role of free L-carnitine and acetyl-L-carnitine in post-gonadal maturation of mammalian spermatozoa // Hum. Reprod. Update.1361996. -N2. -P.87-102.

82. Jones R.C., Murdoch R.N. Regulation of the motility and metabolism of spermatozoa for storage in the epididymis of eutherian and marsupial mammals // Reprod. Fertil. Dev. 1996. - V.8. - N4. - P.553-568.

83. Keltimlidis K., Papadimas J., Bontis J. LDH isoenzymes in semen of infertile men // Arch. Androl. 1989. - V.22, N1. - P. 77-84.

84. Kulikauskas V., Blaustein D., Ablin R.J. Cigarette smoking and its possible effects on sperm // Fertil. Steril. 1985. - V. 44 - P. 526-528.

85. Kumar G.P. Lipid phase transitions and a possible lipid-protein lattice structure as an activity regulator in maturing spermatozoa. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993.-V.29, N6. - P.1029-1038.

86. Kung A.W., Ho P.C. ,Wang C. Seminal leucocyte subpopulations and sperm function in fertile and infertile Chinese men // Int. J. Androl. 1993.- V. 16.-N3. - P. 189- 194.

87. OO.Labby D.H. / Current obstetric and gynaecologic diagnosis and treatment //Lang. California, 1982. - P. 486-501.

88. Lactic dehydrogenase-C4 activity in seminal plasma and male infertility / J.A. Noguera Velasco, I. Tovar Zapata, P. Martinez Hernandez et al. // Fertil. Steril. 1993. -V. 60, N2. - P. 331-335.

89. Laudat A., Foucault P., Palluel A.M. Relationship between seminal LDH-C4 and spermatozoa with acrosome anomalies // Clin. Chim. Acta. 1997. - V. 265, N2. - P. 219-224.

90. Leiva S., Loyola M., Agar A.M. Evaluation of DNA/protein status and nuclear maturity of human sperm // Cytobios. 1994. V.78. - P.7-18.

91. Leyton L., Saling P. 94 kD sperm proteins bind ZP3 and serve as tyrosine kinase substrates in response to zona binding// Cell. 1989. - V.57. - P. 1123-1130.

92. Liu D. Y., Baker H. W. inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida // Biol. Reprod. -1993. N48.-P. 340-348.

93. MacLeod J. Seminal Cytology in the presence of varicocele // Fértil. Steril. 1965. - V.16. - P.735 -740.

94. MacLeod J. Further observations on the role of varicocele in human male infertility// Fértil. Steril. 1969. - V. 20. - P. 545 - 548.

95. Male reproductive tract sensitivity to ethanol: A critical overview /R.A. Anderson, B.R. Willis, C. Oswald, L.J.D. Zaneveld // Pharmacol. Biochem. Behaviour. 1983. -V.18. - P. 305-310.

96. Male reproductive toxity of lead in animals and human. ASCLEPIOS study group / P. Apostoli, P. Kiss, S. Porra et al. // Occup. Environ. Med. 1998. -V.55, №6-P. 364-374.

97. Matson P.L. External quality assessment for semen analysis and sperm antibody detection: results of a pilot scheme // Hum. Reprod. 1995. N10. - P. 620625.

98. Maxwell W.M., Welch G.R., Johnson L.A. Viability and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma // Reprod. Fértil. Dev. -1996. N8. - P.l 165-1178.

99. McLean D.J., Jones L.G., Froman D.P. Reduced glucose transport in138sperm from roosters (Gallus domesticus) with heritable subfertility // Biol. Reprod. -1997. V.57, N4. - P.791-795.

100. Measurement of seminal LDH-X and transferrin in normal and infertile men / C. Orlando, R. Casano, A.L. Caldini et al. // J. Androl. 1988. -N3. - P. 220-223.

101. Mendelson J.H., Mello N.K., Ellignbee E.J. Effects of acute alcohol intake on pituitary-gonadal hormones in normal human males // J. Pharmacol. Exp. Therap. 1976. - V. 202. - P. 676-682.

102. Moilanen J., Hovatta O., Lindroth L. Vitamin E levels in seminal plasma can be elevated by oral administration of vitamin E in subfertile men // Int. J. Androl. 1993. - V.16. -P.165-166.

103. Mortimer D. Practical Laboratory Andrology // Oxford University Press. -New York, 1994. 120 p.

104. Mortimer D. The male factor in infertility. Part I. Semen analisis // Curr. Probl. Obstet. Gynecol. Fertil. 1985. - N 8. - P.3-87.

105. Mortimer D., Bramley T.A. Glutamic-oxalacetic transaminase leakage from human spermatozoa as an indicator of cryodamage // Arch. Androl. 1981. -N6. - P. 337-341.

106. Mortimer D., Johnson A.V., Long-Simpson L.K. Glutamic-oxaloacetic transaminase isozymes in human seminal plasma and sperm extracts // Int. J. Fertil. -1988. V.33, N4. - P. 291-295.

107. Mortimer S.T., Swan M.A., Mortimer D. Effect of seminal plasma on ca-pacitation and hyperactivation in human spermatozoa // Hum. Reprod. 1998. - N8. - P.2139-2146.

108. Moser W, Pratt W. National Center for Health Statistics: fecundity and infertility in the United States, 1965-1988. Advance data from vital and health statistics. No. 192. Hyattsville, Md.: Public Health Service, 1990. P.121-126.

109. Mundy A.J., Ryder T.A., Edmonds D.K. Asthenozoospermia and the hu139man sperm mid-piece // Hum. Reprod. 1995. - V.10, N1. - P. 116-119.

110. Nakamura M., Okinaga S., Arai K. Studies of metabolism of round spermatids: glucose as unfavorable substrate // Biol. Reprod. 1986. - V.35, N4. -P.927-935.

111. Naz R. K. Effects of antisperm antibodies on early cleavage of fertilized ova//Biol. Reprod. 1992. - V.46. - P.130-139.

112. Naz R. K., Brazil C., Overstreet J. Effects of antibodies to sperm surface fertilization antigen-1 on human sperm-zona pellucida interaction // Fertil. Steril. -1992. V.57. - P.1304-1310.

113. Naz R. K., Sacco A. G., Yurewicz E. C. Human spermatozoal FA-1 binds with ZP3 of procine zona pellucida // J. Reprod. Immunol. 1991. - V.20. - P. 43-58.

114. Neischlag E., Behre H. Andrology: Male reproductive health fnd disfunction. Springer. Berlin 1997.

115. Organization of SCP1 protein molecules within synaptonemal complexes of the rat / K. Schmekel, R.L. Meuwissen, A.J. Dietrich et al. // Exp. Cell Research. 1996.-V. 226.-P. 20-30.

116. Oscillations in intracellular free calcium induced by spermatozoa in human oocytes at fertilization / C.T. Taylor, Y. M. Lawrence, C.R. Kingsland et al. // Hum. Reprod. 1993. - N8. - P.2174-2179.

117. Palmblad J., Mossberg B., Afzelius B. A. Ultrastructural, cellular, and clinical features of the immotile cilia syndrome // Annu. Rev. Med. - 1984. - V.35. -P. 481-492.

118. Patel S.M., Skandhan K.P., Mehta Y.B. Seminal plasma fructose and glucose in normal and pathological conditions // Acta Eur Fertil. 1988. - N6. - P.329-332.

119. Pedron N. Cholinesterase activity of seminal plasma and human spermatozoa in normal and infertile subjects // Arch. Androl. 1983. - V.10, N3. - P. 249-251.140

120. Perreault S. D., Wolff, R.A., Zirkin, B. R. The role of disulfide bond reduction during mammalian "sperm decondensation in vivo // Devel. Biol. 1984. -V.125. - P.181 - 186.

121. Perreault S.D., Barbee R.R., Elstein K.H. Interspecies differences in the stability of mammalian sperm nuclei assessed in vivo by sperm microinjection and in vitro by flow cytometry // Biol. Reprod. 1988. - V.39. - P. 157-167.

122. Perreault, S. D., Barbee R. R., Slott V. L. Importance of glutathione in the acquisition and maintainance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes//Devel. Biol. 1988. - V.125. - P. 181 - 186.

123. Population study of causes, treatment and outcome of infertility / M.G.R. Hull, C.M.A. Glazener, N.J. Kelly et al. // Br. Med.J. 1985. P. 1693-1697.

124. Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility / G.C. Manicardi, P.G. Bian-chi, S. Pantano et al. // Biol. Reprod. 1995. - V.52, N4. - P.864-867.

125. Purification of an acrosomal antigen recognized by a monoclonal antibody and antifertility effects on isoimmune serum / M.S. Liu, Y. Yang, J. Pan et al. // Int. J. Androl. 1989. - N12. - P.451- 463.

126. Raber N.M. , Barloge R. DNA Flow Cytometry of Human Solid Tumors // Flow Cytometry and Sorting. 2nd ed, New York: Wiley-Liss, Inc, 1990. P. 745 - 754.141

127. Recombinant human zona pellucida protein ZP3 produced by Chinese hamster ovary cells induces the human sperm acrosome reaction and promotes sperm-egg fusion / M. Duin, J. E. Polman, I. T. De Breet et al. // Biol. Reprod. -1994. -V.51. P.607-617.

128. Relationship between abnormal sperm chromatin packing and IVF results / M.V. Filatov, E.V. Semenova, O.A. Vorob'eva et al. // Mol. Hum. Reprod. 1999. - N9. - P.825-830.

129. Relationship between creatine kinase levels and clinical diagnosis of infertility / R.S. Sidhu, J. Hallak, R.K. Sharma et al. // J. Assist. Reprod. Genet. -1998. V.15, N4. - P.188-192.

130. Riley R.S., Mahin E.J. DNA analisis // Flow Cytometry. Clinical applications. ASCP National Workshop N9072. ASCP National Meeting, Washington, D.C. 1989. - P. 63 -108.

131. Rodriguez H., Ohanian C., Bustos-Obregon E. Nuclear chromatin decondensation of spermatozoa in vitro: a method for evaluating the fertilizing ability of ovine semen // Int. J. Androl. 1985. - V.8. - N2. - P.147-158.

132. Rodriguez H., Ohanian C., Bustos-Obregon E. Nuclear chromatin decondensation of spermatozoa in vitro: a method for evaluating the fertilizing ability of ovine semen // Int. J. Androl. 1985. - N2. - P.147-158.

133. Sakkas D., Manicardi G., Bianchi P.G. Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa//Biol. Reprod. 1995.-V.52, N5. - P.1149-1155.

134. Saypol D.C. Varicocele//J. Androl. 1981. - N 2. - P. 61 - 65.

135. Schoysmn R., Gerris J. Twelve-year-up study of pregnancy rates in 1291 couples wiht idiopathically impathically impaired male fertility // Acta Eur. Fertil. -1983.-N14.-P. 51-56.

136. Shapiro H.M. Practical Flow Cytometry: parameters and probes. Second edition. New York: AlanLiss, 1988. P. 133 - 164.142

137. Sidhu R.S., Sharma R.K., Agarwal A. Relationship between creatine kinase activity and semen characteristics in subfertile men // Int. J. Fertil. Womens Med. 1998. - V. 43. - N4. - P. 192-197.

138. Sikka S., Rajasekaran M., Hellstorm W. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility // J. Androl. 1995. - N16. - P. 464 - 468.

139. Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors / A. Cohen-Dayag, I. Tur-Kaspa, J. Dor et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. - V.92. - P.l 1039-11043.

140. Sperm creatine kinase activity in normospermic and oligozospermic Hungarian men / A. Gergely, J. Szollosi, G. Falkai et al. // J. Assist. Reprod. Genet. -1999. V.16, N1,-P. 35-40.

141. Sperm motility and AFP content in seminal hyperviscosity / G.R. Men-deluk, M.J. Munuce, C. Carizza et al. // Arch Androl. 1997. -V.39, N3. - P.223-227.

142. Speroff L., Glass R.H., Kase N.G. Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility. Williams & Wilkins, Baltimore, 1989. 345 p.

143. Stewart B.H. Varicocele in infertility: incidence and results of surgical therapy // J. Urol. 1974. - V. l 12 - P. 222 -228.

144. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycodelin, a human glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activities / A. Dell, H.R. Morris, R.L. Easton et al. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N41. - P. 24116-24126.

145. Studies on the origin of redox enzymes in seminal plasma and their relationship with results of in-vitro fertilization / C.H. Yeung, T.G. Cooper, M. De143

146. Geyter et al. // Mol. Hum. Reprod. 1998. - N9. - P. 835-839.

147. Tesarik J. Appropriate timing of the acrosome reaction is a major requirement for the fertilizing spermatozoon // Hum. Reprod. 1989. - N4. - P. 957961.

148. Tesarik J. Oocyte activation after intracytoplasmic injection of mature and immature sperm cells. Hum. Reprod. - 1998. - N13. - Suppl. 1 - P.117-127.

149. Tesarik J., Sousa M., Testart J. Human oocyteactivation after intracytoplasmic sperm injection // Hum. Reprod. 1994. - N9 - P.5 11-518.

150. The effect of calcium ion channel blockers on sperm fertilization potential / S.G. Benoff, W. Cooper, I. Hurley et al. // Fertil. Steril. 1994. - V. - 62. - P. 606617.

151. The removal of morfologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? / M.J. Tomlinson, A. White, C.L. Barratt et al. // Hum. Reprod. 1992. - N4. - P. 517-522.

152. The routine assessment of sperm motility at room temperature and 37°C / A.G. Birks, H. Izzard, D.R. Morroll et al. // Int. J. Androl. 1994. - V. 17, P. 289291.

153. Thiele J.J., Freisleben H.J., Fuchs J Ascorbic acid and urate in human seminal plasma: determination and interrelationships with chemiluminescence in washed semen//Hum. Repr. 1995. V. 10, N1. - P. 110-115.

154. Total antioxidant capacity of seminal plasma is different in fertile and infertile men / S. Lewis, P.M. Boyle, K.A. McKinney // Fertility and Sterility. 1995. V.64, N4. - P. 868-870.

155. Treatment of human spermatozoa with seminal plasma inhibits protein tyrosine phosphorylation / C.N. Tomes, R. Carballada, D.F. Moses et al. // Mol. Hum. Reprod. 1998. - V.4,N1.-P.17-25.

156. Tyler J.P., Crockett N.G., Driscoll G.L. Studies of human seminal para-netries with frequent ejaculationl. Clinical characteristics // Clin. Reprod. Fertil.1441982. -N 1. P.273-285.

157. Urch U. A., Wardrip N. J., Hedrick J. L. Proteolysis of the zona pellucida by acrosin: the nature of the hydrolysis products // J. Exp. Zool. -1985. V. 236. - P. 239-243.

158. Viability assessment of turkey sperm using fluorescent staining and flow cytometry / A.M. Donoghue, D.L. Garner, D.J. Donoghue, L.A. Johnson // Poult. Sci. 1995. - V.74, N7. - P.1191-1200.

159. Virji N. LDH-C4 in human seminal plasma and its relationship to testicular function. I. Methodological aspects // Int. J. Androl. 1985. - N1. - P. 193200.

160. Virji N., Eliasson R. LDH-C4 in human seminal plasma and testicular function. III. Relationship to other semen variables // Int. J. Androl. 1985. - N10. -P. 376-384.

161. Ward W. S., Coffey D. S. DNA packaging and organization in the mammalian spermatozoa: comparison with somatic cells // Biol. Reprod. 1991. - V.44. -P.569 - 574.

162. Ward W.S. Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa // Biol. Reprod. 1993. - V.48. - P. 1193 - 1201.

163. Watanabe Y., Okuda M. Ultrastructural study of immotile cilia syndrome // Rhinology. 1984. - V. 22. - P. 193-199.

164. Weissenberg R., Bella R., Yossefi S. Changes during puberty in chromatin condensation, morphology and fertilizing ability of epididymal spermatozoa of the golden hamster // Andrologia. 1995. - V.27, N6. - P.341-344.

165. WHO Laboratory mannual for the examination of Human semen and semen-cervical mucus interaction. Cabridge University Press, 1987. - 55 p.

166. WHO Laboratory manual for the examination of Human semen and semen-cervical mucus interaction.3ld ed. The Press Syndicate of the University of Cambridge, 1992. 60 p.

167. Wittmaack F.M., Shapiro S.S. Longitudinal study of semen quality in145

168. Wisconsin men over one decade // Wis. Med. J. 1992. -№ 91. - P. 477 - 479.

169. Yen S.C., Jaffe R.B. Reproductive Endocrinology. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1991. - 560 p.

170. Zalata A., Hafez T., Comhaire F. Evaluation of the role of reactive oxygen species in male infertility // Hum. Reprod. 1995. - V.10, N6. - P. 1444-1451.

171. Zinc, magnesium and calcium in human seminal fluid: relations to other semen parameters and fertility / M.B. Sorensen, I.A. Bergdahl, N. Henrik et al. // Mol. Hum. Reprod. 1999. - N4. - P.331-337.

172. Zirkin B. R., Perreault S. D., Naish S.J. Formation and function of the pronucleus during mammalian fertilization // In The Molecular Biology of Fertilization. Academic Press, San Diego, 1989. - P.91 - 114.

Информация о работе

Комарова, Марина Валериевна
кандидата биологических наук
Самара, 1999
ВАК 03.00.04

Диссертация

Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно