Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая деградация пиридиновых соединений представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая деградация пиридиновых соединений представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus"

qu

всесошш шэтпа-1юощ0вательс10й

пройшючюпотрэтсториий институт пгашдшй игохзаш

па правах рукописи

Лгшкша Своглана Рвшадоша

УД1С 576.809.53

ШШШШ0ОТШШ1 ДЕГГАДЩЯ пшшшощ СОЕДИНЕНИИ!

ПЕВДСТАВНТЕЛЯЫ!! ГОДОВ ЛШДИЮЗЛ0ТЕД И IHTODOCOOOTJS

03.00.23. - 6ИОГОЗШЛОГШ1 03.00.07. - шжроСиодогнл

Автореферат даосергацзн па сопскашэ ученой стопанн кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена на кафодре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени U.Б.Ломоносова.

Научный руководитель - доктор биологически наук, про&зссор Воробьева л.И.

Научный консультант - доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Терентьов П.Б.

Официальные оппонент: доктор биологических наук, ведущий научный: сотрудник Позмогова И.Н. кандидат биологических наук, старший научниП сотрудник Яненко A.C.

Ведущэе учреждение - Институт микробиологии и вирусологии Л!

Казахстана

Защита диссертации сосотоится " п Л^ё^О-^ 1992 года час^^мин. на заседании .специализированного совета Д 098.09. го Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторско институте прикладной биохимии по адресу: 125299, Москва, ул К.Цеткин, д.4/6. -

библиотеке

И.И.

С диссертацией можно ознакомиться в ВШПШ прикладной биохимии.

Автореферат разослан " /ß IS9I г.

Учений сезфетарь специализированного совета кандидат биологических наук ' L / Гусева

Общая характеристика работа

Актуальность проблемы. Широкое использование синтетических органических соединений в промышленности п сельском хозяйство привело к загрязнению окружающей среди и остро поставило вопрос о разработке эффективных методов борьба с аптршогоппнм загрязнеш-' ом. Среда различных катодов очистки промышленных сточных вод микробиологические катода имеют ряд преимуществ, связанных с воз-ыоиностыо обезвреживания большого спектра загрязнений, отсутствием дефицитных материалов и реагентов, высокой производительностью и рентабельностью процессов, экологической безопасностью. С целы) интенсификации микробиологической очистки большое значение имоот 'на только поиск активных культур микроорганизмов с повыЕентмя деотруктнвшмл способностяш, по п всестороннее их иэученнэ, исследование путей и направленна химических реакций, лекацих в основе ферментативной деструкция ксенобиотиков, а тагов гопетических детерминант биодеградации. Повышенный интерес к плазмлдам, контро- • лярущим деградации того или иного соединения, обусловлен цреаде всего эволюционной пластичностью генома плазшд и их екологической нодвишостьз сроки различных груш шпсроорганизмов.

Пиридин и алгашшридшш, явллсь компонентами сточных вод коксохимической и зошщсо-фарыацевтической отраслей промышленности, вследствие своей высокой токсичности представляет серьезную опасность для жвнх'организмов.

Выяснение путай катаболизма этих соединений (дашшэ о которых немногочисленны и противоречивы), а тагсга изучение их генетических детерминант позволило би более целенаправленно подойти к подбору и конструировании эффективных систем биодаградации пиридиновых соединений.

Цель работа: выделенная характеристика новых штатов микроорганизмов-деструкторов пиридина и алкшпшридпнов; изучение их утилизпррщэй активности; выяснение генетических детерминант био-деградативпых способностей; установление путей катаболизма исследуемых субстратов представителями РОДОВ Arthrobaotsr и Bhodoooooua.

Научная новизна. Выделены и идентифицированы штаммы бактерий Arthrobaoter oryetallopoieteo KW-4a (БКМ АС-1334Д) И Rhodoooooua

орасив ГСМ-9 (ЕКМ Ас-1333Д), активно утилизирующие шсокотокслшшй незамещенный пиридин и итамы Аг111гоЬао1:ег вр. КЫ-46, разлагающий 2,4-дшеттшриднн. Указанные вещества используется данными микроорганизмами в качество единственных источников углерода, азота и вноргин.

Показано, что синтез ферментов дэградации пиридина у А.огув-tallopotetes КМ-4а и П.ораош 1Ш-9 является ипдуцибблышм.

Впервые обнаружены плазшды биодеградации пиридина, 2,4- и 2,6-диме тшширидикоз с молекулярными массами 80 и 100 Мд, контролирующие деградацию дашшх соединений у представителей рода АгЙ1гоЬа<^аг.

Изучены пути катаболизма пиридина А.огув1аПоро1сЬеБ 1Ш-4а и П.ораоиз Ш-9 И 2,4-ДИКетилпиридица АгЬПгоЬао1ог вр. КМ-46; установлено, что раскрытию пиридинового кольца предшествует его гидр-оксилированне во 2-ое и (или) 3-е положение. Впервые доказано, что первичными процессами метаболизма пиридина является гидратация и гидроксшшровашо гетероароматического кольца с образованием 2-гидрокси-, 2,3- и 2,6-дигндроксипиридинов.

Практическая ценность. Выделенные и изученные активные шгамщ микроорганизмов-дострукторов рекомондованы для.очистки сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности от высокотоксичшх пиридина и алкилпнрвдинов. Кроме того, поскольку данные штаммы осуществляет1 гидроксилирование пиридинового ядра, то они%могут быть использованы для препаративного ьшкробиологичес-кого синтеза различных замещепшх пиридинов с гидроксигруппами в а- или р-пологениш, обладающих высокой физиологической активностью.

Обнаруженные .в клетках представителей рода Агйо-оЪас^аг конызгатинныо плаз>,ады, контролирующие деградацию пиридина и ал-килшридинов, представляют интерес для конструирования новых штаммов артробактеров с более широкой субстратной специфичность».

Апробация. Основные положения диссертационной работы домалывались на 20 конференции молодых ученых биологического факультет« МГУ (Москва, 1988 н 1989); международной конференции молодых ученых "Человек в биосфера" (Москва, 1988), на заседании кафэдрь микробиологии биологического факультета МГУ (1991) и на семинаре лаборатории органического синтеза химического факультета МП) (1991).

Публикации. По маториолвм диссертация опубликовано 2 тезисов, 1 статья находятся в почата, подана заявка па авторское свидетельство.

Объем п структура работа. Диссертация состоит из введопил, обзора литературы «акспориноптальпой части (6 таблиц, 12 рисунков), заключения, выводов и описка цитируомой литературы (171' наименований). Диссертация излогопа па страницах машинописного текста.

ЭКСТГОМШГАЛЫ1АЯ ЧАСТЬ

Материалы и мотода исслодовапия .

Объектами асслодоваиля служили микроорганизмы, выделенные с ' помощью метода накопительных культур из различию, образцов почв, отобранных с территорий: прошплвпшх предприятий, в сточных водах которых присутствует; производные пиридина.

Кромо того в работе использованы бактериальные итам,щ, ( полученные из коллекции ВНГГС "Метаболизм неприродных соединений11 КБ5М ¿И СССР (Г.Пуципо-на-Ско): ЕооПег1оЬ1п оо!1 ¿53, РиешХотопаа аеги5±пова 2Д.4262 (РАО), Р.авги^1пова РАОЗ, АлЧйгоЬас^ог oгyэtallopoiвtea В1Ш Ас-1103 (В-495), A.oгyatallopoioteQ ВКЫ ЛС-1107 (В-655), А.огуаЬ&Порс^ев ВКМ Ас-1098 (КМ-4).

Для выделения и роста ишроорганкзков-двструкторов использовали синтетическую среду. Шуклы (зьизаа, 1974), модифицированную Коростелевой (1981). Источником углерода и азота служили соединения ряда пиридина: 2,б-даэтсшшрвдпн добавляли в количество 0,3)6 в дидкую п 0,2Ж в агаризованнув среда, 2,4-дшэтилпирпдин и пиридин 0,12% и 0,15% - в ггадкув и 0,1% в агаризованнрз, гидрокешгари-данн и ацетамид по 0,1£ в жидкую и: 0,055« в агаризованнув среди. В качестве полноценной среда • использовали мясо-пептошый булъон.агар.

Таксономическое положение выделенных мшфоорганизмов устанавливали по определителю Берги (В8геву°в et ах., 1986) и Нэстеренко с соавт. (1985).

• Исследование путей деградации пиридиновых субстратов проводили как в динамике роста культур, так и в суспензии отмытых клеток. Концентрацию пиридина и его производных определяли спактрофотометрически с использованием калибровочной кривой.

Продукты деградации извлекали из культуральной жидкости путем

экстракции горячим хлороформом при разных значениях рВ. Полученную смэсь продуктов деградации разделяли с помощью тонкослойной препаративной хроматографии на силикагеле (pso Fertigplatten Kleselgel 6of254 ¡ierok). Хроматограмш просматривали в УФ-свето, отдельные хроматографические вош вцрозали, и индивидуальные вещеотва с сорбента элшровали метанолом.

Строение шделэшшх продуктов деградации устанавливали с помощь» масс-, хршато-масс-спектрометрии, УО-, ик-спектров, высоко-вффективной жидкостной хроматографии (1ШХ), встрвчним синтезом. Анализу подвергались непосредственно выделенные соединения, либо их трлмэталсшшльнкв (ТШ) производные (гидроксалсодерггащиэ соединения) или ев 2,4-динитрофенилгидразош (карбонилсодерхащие соединения).

Гримэтилоилшшрование получении образцов проводили то методу, описанному (Gehrke, bakings, 1971). 2,4-дашитрофошлгидразош; квтокислот получали, как описано (Ноет, 1965).

УФ-спектры снимали на спектрофотометре "Bitaohi-200-20", ИК-спектры - на приборе "UE-20M. Масс-спектры регистрировали ш хромато-ыасс-спектрометре "Varlan-JIAT-212". ВЭ8Х вшолняли н£ приборе Милихром.

Изучение вддуциОельности ферментов деградации пиридаш проводили как описано (Haitkamp et al., 1988).

Наличие в штаммах плазмидной ДНК регистрировали по метод (Eokhardt St., 197а). Молекулярную массу плазмидной ДНК определял! цо калибровочной кривой, построенной в соответствии с данным! электрофоретической подвикноста плазмвд известной молекулярной uaccu: R222 (64 Ни), R40a (96 Цд), RP4 (39 Цц), R6K (24 ВД (Меуегв et al., 1974).

Наделение плазмвдной ДНИ из пташов Arthrobaotar проводили го модифицированной методике Портнова, Уайте (1984).

Рестрикции плазмидной ДНК и электрофорез в агарозном гел проводили по Маниатису с соавт. (1984). '

Коньюгациошшй перенос плаамид проводили по методу (Sagai в ' al., 1975).

Результата и обсуждение

1. Выделение и свойства микроорганизмов-деструкторов пиридин

Из образцов почв, взятых о территории химико-формввдвтпчэспого завода "Акрихин", Хасаевой (1988) была получена накопительная культура микроорганизмов-деструкторов пиридиновых оснований. Из этой накопительной культуры наш путем многократных поросевов па спнтотичоской средо Щукш с возрастающими концентрация?,!!! пезамоцепного пиридина была выделеш в чистом виде ' два штамма микроорганизмов, кагдай из которых мог утилизировать пиридин в качестве единственного источника углерода, азота и энергии.

:л основании изучения' культурально-морфологичзских н фпзиолого-бкохимических свойств, а также химического состава клеточных стенок один га штаммов был идентифицирован как • 'Arthrobaoter oryatallopoietea 1Ш-4о и депонирован во Все сошной коллекцпи микроорганизмов КВЕЛ Ali СССР под номером ВКМ Ас-1334Д. Другой штамм был отнесен к Rliodoooooua opaoua КМ-9 (BICM Ас-1333Д).

Актптпо культуры .'артробактера п родонокка, которые поддеряшались па синтетической среде с пиридином в течение 1,5 ' лет, утилизировали субстрат без лаг-пэриода в концентрации до 1,5 г/л за 44-48 часов. 2£ультуры хорошо росли и на богатой среде, однако, при увеличении времени культивирования на !Я1В (до 3-х месяцев) бактериям поело перенесения на сштетическуп среду с пиридином требовался достаточно длятэлышй лаг-период (до 24-30 часов) для утилизации этого соединения в качестве ростового субстрата. Этот факт позволил предполокнть, что синтез ферментов деградации пиридина у данных шздюорганизмов является шдуцабелышм.

Для проверки этого прэдгологэния ш исследовали зависимость . пиридин утилизирующей: активности культур A.orystallopoietes КМ-4а п R. opaoua КМ-9 от предварительного инкубирования их с субстратом и без него (индуцированная и неиндуцировашая культуры) и от присутствия ингибитора синтеза болса - хлорагфэнихола.

Как видно из рисунка 1 (a,ö), кривнэ потребления пиридина нэиндуцированшши культурами и артробактера и родококка (предварительно выращенными в течение 2-х недель на МПБ) тлеют в первые 20 часов более пологоэ плечо,'но в послэдувдие часы пиридин утилизи-рущая активность становится такой see, как и у индуцированных культур (кривые 1 и 2). Добавленный в нулевой точке хлорам$еникол полностью ингибировал потребление пиридина ¿еиндуцированннш куль-

6 ¿Г ГЗ ?! зо 36 й ияТрепаМ 6 ^ 18 ¿V ¿о АЬ «2. 6рам(цьс)

Рис.1. Потребление пиридина А.сгуз1а11оро1еЪев КМ-4а (а) И Я.орасш КМ-9 (<5): 1- звдуцированная культура; 2- веиндущрованная культура; 3- индуцированная и 4- неиндуцированная культуры с хлораьфзшколом; 5- концентрация пиридина в стерильной среде (контроль).

турами А.огзпНа11оро1в1ев КМ-4В я н.ораоив КМ-9 и их утштаируодая активность была практически равна абиотическому исчезновению пиридина в контроле (контролем служила стерильная среда с пиридином). Что касается индуцированных культур, то в присутствии хлоралу пи-кола клетки ертроОактора и родококка в точонко некоторого времени довольно активно утилизируют пиридин, но потом эта активность падает (рис.1). Возможно, ота начальная высокая активность обязана некоему запасу (пулу) ферментов, синтезированных ранее во время преинкубации на среде с пиридянон.

¡Гсходя из выше'сказанного, можно сделать вывод, что пиридин индуцирует у А..огу:^а11оро1о'£оз КМ-4а И Н.ораоив КМ-9 синтез фэрментов, необходима для его утилизации, кок и у большинство •пиридиа-деградирущих иикроорганизмов (т?а1воп,Са!п, 1975; Коростелева и др., 1981; В1яв о* а1., 1986).

2.Генетические доторгйнадгы биодэградацгга пиридина, 2,6- п 2,4-дяиетилииридинов

Известно, что пндуцнбельшэ ферментные системы, отвечающие за деградацию ароматических соединений микроорганизмами, иногда кодируются плазмздшш гонаш (ГГогпоу ot а!., 1978). Поэтому, штаммы Ах^1»оЬа<^аг oгyзtallopoiatвa 1Ш-4, A.oгyвtallopoi0taв 101-4 а, п.ораоиз КМ-9, а таза» вще один птамм, выделенный наш на синтетической среде с 2,4—дпме тилшрядипом и идентифицированный. как Агйн-оЪаогег вр. КУ-46 шагашровзлзсь на присутствие в них плаз-гадпой ДНГС-

Оказалось, что птамл Ю1-4, утилизирующий. 2,б-дншталпиридин (2,6-ШР) п 1Ш-40, использующий 2,4-даетилппридин (г,4-шр), содержат шазмида с одинаковой молекулярной массой 100 )Лд, обозначенные соответственно рвззго л рвэзгг. Штаги КМ-4о, способный к росту на пиридине (руг) и 2,В-димвтшшридЕш, содергит две плаз-1Шда, одна из которых по молекулярной массе идентична шгазмидам, обнаруженный в штаммах НМ-4 и КМ-46, а другая, обозначенная рВЭ321, шоет меньшув молекулярную массу около 80 Мд. В мотках родококка нлазмщщой ДНК не было обнаружено.

Для дальнейшей работы штаммы А..ог^а11оро1е1;ов маркировали устойчивостью к антибиотику рпЕампициву . ¿йтибиотикоустойчивые варианты содеркали плазмида той Ев далекуля^й мзссы. Для опытов

по коньюгациошому переносу получали стрзптомшщнусгойчивцй вариант штамма А..огуЕ^а11оро1е*ез в-655 п квнамицинустойчивий вариант шташа А,о1^в1;а11оро1е1ев в-495. Данные итамш плазмидной ДНК не содержали (табл. 1).

. Таблица 1.

Штамш артробактеров, отобранные для работа V • . - .

Штамм

Плазмида

Характеристика

oryвtallopoiateв КМ-4 КЫ-4а В-495 .В-655 . АгкйгоЬаокаг вр.

КЫ-40

рВ3320

рвэзго.рвззгг

рВЗЭ22

г1ГЯ2,6-ЕШ>+ г1ГИг,&-БШ>+Рут+ • На* • :,' ваИ

я12,4-ШО>+

*) Принятые обозначения устойчивости к антибиотикам: г1Г -

__о __п _ . _

рифашицину, кш - канамшщну, сш г стрептомицину, як- дикий пш,

Обработка клеток штамма А.отувга11о1ро1е1ев НЫ-4а г!Г цитомшданоы С в концентрации 0,1 шг/ыл, так Ев как I додецилсулъфатоы натрия (БЕЗ) в концентрации 0,0022 приводила ] появлению клонов (с частотой в первом случае 22%, а во второ] 7,5%). утративших способность утилизировать пиридин; в то га врем, способность к росту на минимальной среде с 2,6-даметилпиридано; сохранялась. Анализ шшзвддиой. ДНК в клонах, даещих фенош г1£йг,б-выр+руг", выявил отсутствие плазмидо рвзэ21. таким образа ыошо предположить, что способность к деградации пиридина у иташ А.огув1а11оро1еквв КЫ-4а определяется присутствующей в клетка плазмидой рвзз21.

Хотя обработка клеток штощщтаи с, без, шфлдишвыы орашэ вым не приводила к потере плазиида рвззго, у шташа А.огувка11оро iвteв Ю1-4г11н путем многократных пассааей на 1ШБ были получен клоны, утративше способность утилизировать 2,б-дтвтилпиридшз Частота спонтанной элиминации составляла примерно 0,043 на генера цшо. При елактрофорэгичвском анализе данных елиышшпов с фвнотн

гам гИ^г.б-БЫР'плазмвда ршэго не обнаруживалась.

Получении бесшгазмидаыо iuiohh были проверены на способность к росту, на интермедаатах путл метаболизма 2,Б-диметилпиридина (Хасаева, 1983). Спонтанные мутанты не росли на синтетической среде с 3-гидрокси- и 3,4-дигидрокси-2,6-дшлетилпиридш1ом, по использовали ацетампд. На основании полученных данных можно' прэдгологлтьt что фэрмэны окисления 2,6-дпм9тгоширвдина до стадии раскрытия . ароматического кольца с образованием ацетилпировипоградной кислоты и ацэтамида кодируются плазмпдными генам:.

Потеря 'клетками способности к деградации 2,6-даметилпиридина (с частотой 1СЯ имела шсто и при выращивании их в условиях -* субшгябпрукцой температура 42°С. Анализ шшзмидной ДНК одного из температурных мутантов с фенотипом гИ^.бшр" показал значительное отличие ее по молекулярной ивссе от плвзшда PBS320 походного птакла ldi-4riiR. Размер делецни в плазмидо рвззго составил порядка 2S Мд. Делещюнпый вариант плазмида был обозначен ' PBS323.

О целью выяснения природа генетического' контроля деградации пиридина, 2,6- я 2,¿-дакэтгшшрлдишв штаммы артробактеров, упшгзпруЕща эти создавшая, били нсшльзоввш в качестве доноров в опытах по кольпгащганному порвносу. В качестве реципиентов ЦССЛЭДОВЗЛКСЬ 0ТШЭД Paeudomonas aeruginosa ML4S62, РАО -a, E.ooli J53, A.orystallopototea В-655 и B-495, нэ способные к росту па сяптотпчоcitoft среде с пиридиновыми основаншши.

Оказалось, что коньсгационнчй перенос плазмид возможен только в клетки артробакторов. Как видао из таблицы 2, частота переноса признака деградации 2,е-диметилпиридина в штамм в-4951шй составляет 10~6, а в штамм в-б55втк ю-7 на клетку донора. Коньвгацшшшй шзронос признака катаболизма пиридина происходил только в рецшшентный штамм в-4Э51ш>н (Ю-7 на клетку донора); то ев можно сказать, по с частотой 10~6, и о фенотипе 2,4ШР+. Анализ плазмидной ДНК во всех получонншс трансконьвгантах обнаружил щзисутстниэ в их клетках соответствующих плазмид.

На основании полученных результатов моано сделать вывод, что плазмида рвзэго отвечает за деградацию 2,6-диадтшширадппа у штаммов A. oiyutallopoieteB КМ-4 и КМ-4а; плазмида рВЗЭ21 - за утилизации незамещенного пиридина штаммом KlJ-4a, а плазмида pBS322

ТйСШца г.

КонъигаЦЕОшый перенос признаков деградации 2,6-дш*8тилпириднна (2,6ШР+), пиридина (Руг+) и 2,4-диметиляирадина (2,4БМ?+) кегду штаммами артробактерв.

Донор Реципиент Частота конъ-игационного-пербноса (на клетку донора) Трансконьвганты и их характеристики

А.огуе^аПо-ро1в1;ев А.огувЬаНо-ро!е*ев -

КЫ-4 И^.бШР* В-4Э5 кш^е.бвмр" 10~б Б-495-1 ЬПКГ1Г32,6ВШ>+

В-655 811^2,6Ш>~ 10-7 В-655-2 в -ьЛ-^Г^а, 6БЫР+

КМ-4а г!{?2,6ШР+ Руг Б-495 Юп^.бШР" Руг" 10~б В-495-3 ьЛ^г.бШР4 Рут

КМ-4а г11?2,бИ£Р+ Руг В-495 Ьп^.бШР" Руг ю-7 В-495-4 кнРг^г.бШР" Рут

км-4а г1г^г,б1>мр+ рут В-655 ВЪ^2,6ШР-Рут <10"9 —

АтйдаЛас^ег ер.

ХШ_А« ¿тигр4" в-дяч ьм^г^ШР- ю-6 В-495-5 ЬпКг,4К£Р+

одярует гены ферментов деградация 2,4-дш?8тиширидпна у штамма rthrobaoter вр. КМ-46.

3.Катаболизм пиридина у штамма Arthrobaotsr orystallopoiotea 1Ш-4а

Немногочисленные даннно по метаболизму незамещенного пиридина вщроорганизмаш свидетельствуют о яеодояозначном протокаши этого фоцесса в зависимости от используемого штамма.

В ряде работ, посвященных изучению деградации пиридина штам-18ми Corynebaoteriun вр. (shukla, Kaul, 1974), Kooardia sp.Z1, iaoillus 4 (Watson, Cain, 1374), Mioroooocus luteus (Girr.o ot al., 1936) предполагается восстановительный путь утилизации пиридшз. )даако, прямых доказательств такого процесса получено не было, так сак не были выделены первичные продукты восстановительной реакции.

С другой стороны, Коростелевой с соавт. (Коростелона и др., I931) был выделен и идентифицирован З-гидроксигшридин в качество штермедиата пути метаболизма пиридина Kooardia вр. КМ-2, и тагам образом показано, что начальной стадией катаболизма является жисление пиридинового кольца. К сожалению, дальнейшие превращения 3-гидроксипиридана продемонстрировать на удалось . Летальное выяснение процесса катаболизма этого широко распространенного ксенобиотика имеет как теоретическое, так и прикладное значение.

Исследование путей катаболизма пиридина культурами l.orystallopoietea КМ-4а и R.opaous КМ-9 МЫ проводили В динамике их роста. Все выделенные образцы, состоящие, как правило, из смеси веществ, либо индивидуальные соединения, хоть и извлекались из больших объемов культуральной ¡етдкости (1-^л) были получены 'в крайне малых количествах (доли мг). Поэтому идентифгкациа шгагкх из них удалось осуществить (чаще в виде ГНС-производных) лишь при использовании хромато-масс-спактрометрии (прибор ■ с высоки : разрешением).

При хроматографировании нейтральных. экстрактов культуральной -жидкости A. orystaiiopoietea KfJ-4a, растущего на сйвтетаческой среде с пиридином, методом ТСГХ был выделен ряд образцов, в которнх ' удалось идентифицировать его гидроксипроизводше: 3-щпроксипиридан, 2,3- . и 2,6-дагидроксшяриданы, . а такхе . моногидрат 2-гидроксипиридиаа - 2,е-дигидрокси-1,2-даидростридин. . Таким, образом, на начальном этапе метаболизма пиридина данным

штаммом происходит его гщфоксшщрование во 2-оЬ 'я" 3-ье полога ния цикла. Крою того, хромато-масс-спектрашшй Л анализ , ' гримаиисЕшищрованЕых-/'' образцов/; ' показал ' ^налита 5-аШНО-2-ОКСО-4-П95ТеНОВОЭ ,' кислоты, , свздогольствудао о гидролитическом разрыва г.З-дагидошширпдана до 0-и сзязи. Данный Процесс раифытия ароматического. кольца отличается от обычного, осуществляемого дпохсигетазами. Обнарукенный г { хлорофэркешшх_ . кислых экстрактах . культуральной ¿идкостж ' ; артробактера'янтарный полуальдещц является, ijsk -ш полагаем, i продуктом ., дальнейшего ■ проврадония атоЗ спощфпеско! ! ■ котоаминокислаты. Появление этого соединения являатся, такт . | ., образом, результатом деструкции гвдроксшщровашого. паридановогс j , кольца, в вовсе "не .. свидетельствует о его ; первоначально! I .восстановлении, как считалось ранее (VTatBon, Cain, 1975; Sbukla, . :;< Haul, 1986). / •■:"..,'',■-."' .:„ / -' ' ..

• " | ; 2-гидроксшпфрол, сбнаруЕешшй: в покоторйх триматспшлыш

. i ' образцах является, как t,2i установили, результатом химического прэ-! ; вращения 5-адашо-2-оксо-4-п0НТЭЕовоа кислом при обработке .се си-

• ' .) • лидирующим агентом. Образованна данного соединения служит еце од

j ' ним подтвераденисм установленной структуры этой кислоты, ■ j \ . fö . пкзкомол&куляршсс- соединений при изучении катаболизм ./ i 1 пиридина A.crystaiiopoietes КМ-4а были идентифицирована 3-амино | З-тадроксшропионовый альдегид и 2-гидроксималоновнй полуальдегид , • . Оба етн вещества ыогут быть результатом деструкции 2,В-дагидрокси , ! • 1,2~дигадрот1ридана, хотя их присутствие моает носить ' j . иеспещфпеский характер. . :' . ■■= \ .. :

,Полагая, что 2- и 3-гидроксшшридиш являются ' одними в ^ j начальных внгермэдаатов . деградации пиридина _ штамме A.oryctaiiopoietae км-4а мы проверили способность иташа к poci : ' на данных субстратах. Оказалось, что для роста культуры за сче »тих веществ необходимо присутствие в культуральной гадкое: . ■ ; вебольлш. количеств пиридина (0,2г/л).

: j . i . Было обнаружено, что во время роста на синтетической среде j 2-гидрокситрвдином A. orystallopoieteo КЫ-4а образует внеклэточн] ; , [ пигмент интенсивно голубой окраски. Идентифицированная наш азах: ■ ноновая структура этого пигмента ыоает образовываться только в р аультате конденсации 3-х молекул 2,3,6-тригидроксипиридина. И хо ' ; последний не был обнаружен в культуральной жидкости (возможно и

за своей нестабильности), ого промэяуточноо образование в процессе метаболизма шдтварвдается выделением п идентификацией продукта • присоединения вода к г.З-дигвдроксширпдапу, -а. тшшэ полуамида виллой кислоты. Появление последнего в культуральной кздкости moi:-по представить как результат раскрытия 2,3,6-трпгидроксишфидипа с последущпм дагпдроксзтлироБанЕем полуаг.ыда малоиновой кислота. Кроме того, образование данного трттдроккшяридшт мозют происхо- ■ дить п за счет р-гидроксшшровЕШЯ г.б-дигадроксиппрадша. , •

При изучеши промезуточных продуктов, обра'зунщшзя в процессе роста A. oryataiiosoioteo КМ-4а на среде о 2-гидроксшшрадиаом были идентифицированы твкео г.б-дшщтиширидип, 5-емйпо-2-оксо-4-пентеновая кислота, 2-гпдроксишррол; на среде с З-гадрэксипириди-по1Л - 2,3-дигидроксиниридин, та по кетоадинокислота и 2-гидрокси-шррол. Присутствие этих соединений подтверждает интермэдиатный характер 2- п.З-гидроксшшрлдипов в катаболизме парздкпа у данного штамма. •'

Обобщая все выше сказанное, предполагаемый путь метаболизма пиридина штаммом A.orystaiiopoietàs 1Ш-4а представляется изобра-генным на схеме 1.

4.Катаболизм пиридина Rhodooooous ораоии 1Ш-9.

Из кулътуральяой ¡здкостп щтаыма R.opaoua 1Ш-9, растущего на синтетической среде с пиридином, в качестве первичных интермедиа-тов были видвлэвы соединения, идентифицированные, как 2-гвдрокси-, 2,&-дигидроксипиридаш, продукты гидратации пиридина и '2-ГОДроксширидана, а такта дигидрат пиридина. Это означает, что у . R.opacua 1Ш-9 как и у A.orystallopoietes КМ-4а, функционирует окислительный путь метаболизма пиридина, а наличие продуктов присоединения воды свидетельствуют, о том, что атом кислорода в гидр-оксильных группах в а-поло*:енпи пиридинового кольца гидроксшшри-дагов у обоих иташов, по всей вероятности, происходит из вода. Однако, опыт с Н^о, доказывающий такой пэдшсялазний механизм ' реакции, оказался невозможным, поскольку бескшточные шсстракты не i были способны окислять.пиридш,. а отштая клеточная суспензия образовывала пршэжу точные продукты в количествах, недостаточных для идентификации.

При изучении метаболизма пиридина' родококком было установла- . но, что пиридиновое кольцо раскрывается, как и у A.oryataiiopole- ■

jT

COOH

HO

OH

il^AMi

' (9)

COOK

n ^

I- "

H20

¡Tr°

([ COOH

V \

(S)

COOH

AM,

cooh

(40)

CxßMQ 1

HpaatmarasMHß KQTaöororeM HHpuijraa" (1) A.oryetallopoietes KM-4a: (2)-N-okhcb mipagHHa; (3)-3-nvgx>KcmmpnjHH; (4)-2f3-snrn5POKCKnnpHÄHH» (5)-2,ß-innytpoKCiI-1,2-№TWpoiEp!Wim; (6)-2,6-OT-m^pokimnpsvmi (7)-2,3,6-tp!inmpokch-5,6-jajtrn^mipi® <h; (8}-5-£mhho-2-okco 4-nohrehobaa kecjiotq; (so-nojiyax&m ehhhoh khcjjote; (io)-fih*papHHii wjiybjibxbnui; Mn-TJimnra: iizi-3-a^0-2(3)-nwp0KCHnp0iiK0H0BHli a^arm» (l3)~2-ra^poKCii-

CHO-CHOH-COOH 02.)

го НМ-4а - в результате гидролиза по с-и связи, но субстратом для шой реакции здесь является 2,б-дигидроксипз1ридин. Образующаяся результата гидролиза и обнаруженная в кислых экстрактах культу- • эльноЯ жидкости родококка 4-нарбонилашно-З-бутеиовая кислота, >-видшгому, в дальнейшем претерпэваот расщепление по зфаткой сзя-I. Последующее декарбоксшированке 2-х углеродного фрагмента при- I здит к образованию карбачиповой кислота, которая и была идентифя-¡грована хромато-масс-спекгромэгрзггески в виде ТМС-производного.. зализ хлороформэлшх экстрактов культуральной нидкости, подкис-энной до рн 2-3, выявил также'наличие амида р-гидрокашропионовой яслотц и полуакшаля щавелевого полуальдегида, которое могут об-азовнваться из 2,6-дигидрокси-1,2-дагадропиридана, или ке могут ыть результатом неспецифячесшпс реакций.

' Проверка способности штамма. н.ораоиз КМ-9 к росту на миндальной среде с 2-гидроксйпирэдином показала, что потребление энного субстрата и накопление биомассы происходило как к в анало-ичном опыте с л.oгystalXopoiotea КМ-4а - только после добавления придана (0,2г/л). Обнаруженные в экстрактах культуральной гмдкос-и 2,6-дащдроксштрвдин, специфическая кетоаминоккслота и амид -гидроксипропионовой кислоты подтверждают-роль 2-гидроксишгридина :ак интермедиата в катаболизме пиридина штаммом к.ораоиз КМ-9 схема 2).

При сравнении путей метаболизма пиридина у А.огуз4а11оро1>^ез :и-4а и н.ораоив Ш-9 можно заметить, что способность к гидрокси-вгрованию в р-голокевш пиридинового кольца является казной отлк-отельной особенностью ферментной системы А.сгу^аПоро^ев КМ-,а. Нами было установлено, что штата АзМЛггоЬа^Ьег ер. КМ-46, рас-:ущий на синтетической среде с 2,4-даметилпиридином, тшсеэ начинает катаболизм этого субстрата о гидроксплирования в р-полокениэ с »бразованием З-гидрокси-4,6- дтееташиридана. Хасаегой (1588) было >бнаруяено, что аналогичная реакция имеет место при утилизации аеааюи a.orystailopoietea 1ш-4 З.б-даетлгофЗДина. Таким обра-' юм, все выше упомянутые штаммы артробакторов, растущие па пириди-й и алкилпириданах и содержание плазмиды оиодеградащш этих соединений, начинают их деструкцию с гидроксилирования пиридзнового сольца в р-таложение. Босплазющшй штаял н.орасиз КЫ-Э такой способностью не обладает.

Схема 2. Предполагаемый путь катаболизма пиридина (1) й.ораош КМ-9: (2)-

2-гидрат пиридина*, (3)- 2-гидроксипири-дан; (4)-дшщрат пиридина; (5)- 2,6-ди-гидрокси-1,2-дигадропирид5Ш; (6)- 2,6-до шдаоксшшридин; (7)- 4-карбоншшшо-

3-бутеновая кислота; (8)- ачвд р-гадр-оксшропионовоП кислоты; (9)- полуами-наль щавелевого голу альдегида; (10)— карбаминовая кислота.

но~ен2~снг<

выводы

1 .Виделена штаммы бактерий - деструкторов пиридиновых соодк-. эний и утилизирующие их в качестве единственных источников угле--эда, азота и энергии: незамещенного пиридина' -ЛтЧЫоЬас^ег агуз-а11оро1вЬеа КМ~4а и Югойоооосия ораоиз КМ-Э и 2,4-дпметплгпфОДИЯа

Лг1ЬгоЬао1сг ср. 1Ш-46

2.Ферментные системы, осуществляющие деградацию пиридина у татаов A.orystallopoi8teз КМ-4а и Н.ораоиз КМ-Э, иэдуцкббльны, пдуктором является сам субстрат - пиридин.

3.В клетках артробекторов, утилнзкррпих пиридая и алкшшпри-даы, обнаружены коньюгативные плвзмиды, детершзируадао дегрэда-зго этих соединений.

¿.Катаболизм пиридина А.ог5^а11оро1э4еа КМ—1а и Л.ораоиз КМ-I идет по окислительному пути. Первой стадией является гидроксилк-гавание во 2-ое и 3-ье положение цикла, причем прожнуточныш гродукташ метаболизма пиридина является 2-тадрокси-, 3-гидрокск-, 2,3- и 2,6-дихт1дроксшириданн.

5.Впервые обнаружены продукты гидратации пиридина, 2-гид-эоксипириднна и 2,3-дагидротатлрпдан, что позволяет сделать вк-зод, что атом кислорода в гидроксильных грушах у 0-2 и С-6 проис-гадат из вода.

6.Раскрытие шгридааового кольца на уровне дягщюксипиргдашов происходит путем гидролиза по счт связи с образованием кетогмвно-

слот специфического строения.

7.Всем плаэмадсодержащим штаммам артро5г"чтэра, утилизиругада! . пиридин, 2,4- и 2,6-дшататиридины, свойственна реакция гздрсксл-лирования в ^-положение пиридинового кольца. Бесплаамидный штамм и.ораоиз КМ-Э.такой способностью ш обладает.

• 8. Данные новые штага« бактерий, утилизирующие пиридин и 2,4~даэтаппнридан, могут бнть рекомендованы для очистки сточных, вод коксохимической химико-фармацевтической отраслей промшзленное- • ти, а также для получения физиологически активных пвдроксипроиз-воднше пиридина - преда ствешшков фармакологически ваг-ках препа- ' ратов.

По материалам диссертации' опубликованы следующие работы:

1-. Хасаева Ф.Ы., Базарова И.Н., Агапова С.Р. Разработка

га с«---?

биотехЕологкчеишх • методов дотоксикащш промышленных сточи вод. // Человек в биосфере: Тез докл. конф. кол. ученых,- Ыоски 14-16 дек. 1988.- 0.86. ''

2. Агапова ■ O.P., Андреева к.Л., Ауишйн 0. - Изучен: плазмвдного . состава микроорганизмов-деструкторов шридиновз оснований. // Проблема современпой баолопш; Тр. 20 науч. кой мол. ученых сиол. фак. МРУ, Москва, 24-28 апр. 1989./ МГУ.-Н 198Э.-ч.2.-0.93-9б. Деп. в ВИНКТИ Б.02.90.

3. Зефиров Н.С., Тер&нтьев П.В., Кодянова ,Л.В., Довгилэ-Bït4 Е.Б., Агапова O.P., Булахова И.М. Штамм Arthrobaoti crystallopoiotes EEî.! ЛС-1334Д в качества деструктора щрадпн; Ззявка на авторское свидетельство от 25 гаия 1991г. £4949214/1: 53237.

4. Агапова O.P., Андреева АЛ,, Воробьева Л.И., Стс.-:эвойг ИЛ1., Теревгьез П.Б. Плазьида биодеградации 2,6-дшелшщридш 2,4-да«.е.т;«шрид1ша и пиридина у штаммов Arthrobaofcer spp. , Молекулярная генетика, шкробиология. и вирусология.- 19Э2 печати).

Гг