Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus

Хасаева, Фатимат Машировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ХАСАЕВА Фатимат Машировна

4854654

ДЕГРАДАЦИЯ ПИРИДИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ РОДОВ АШИКОВАСТЕЯ И КИОООСОССиБ

Специальности 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

о л озз 23^1

Москва 2011

4854654

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического и в лаборатории органического анализа химического факультетов МГУ имени М.В. Ломоносова

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор

Нетрусов Александр Иванович

доктор химических наук, профессор Лебедев Альберт Тарасович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

доктор биологических наук Соляникова Инна Петровна

доктор биологических наук, профессор Эль - Регистан Галина Ивановна

Ведущая организация: Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина

Защита состоится 01 марта 2011 года в 15 часов 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корпус 12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 27 февраля 2011 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

'¿ЧгУ Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время практически все природные среды подвергаются антропогенным воздействиям. Интенсивное развитие химической промышленности привело к тому, что в биосферу постоянно и в возрастающих количествах поступают вещества-загрязнители. Попадая в окружающую среду, они широко распространяются в природных ландшафтах, циркулируют в трофических цепях и накапливаются в организмах животных и человека. Это серьезно угрожает здоровью и даже жизни всех живых существ, включая человека, повреждая клетки и вызывая мутации, ведущие к развитию злокачественных процессов или наследственных заболеваний. Особую опасность для природных экосистем представляют сточные воды коксохимических, нефтеперерабатывающих, фармацевтических и других предприятий химической промышленности. Они содержат токсичные и канцерогенные органические вещества первого и второго классов опасности. Данная группа загрязнителей самая многочисленная, в нее входят до 80% контролируемых веществ, интервал допустимых концентраций которых составляет от 10"4 - 10"7 мг/л. В течение года в природные резервуары поступает до 100 тыс различных химических соединений, 60 млн т синтетических материалов и до 5 млн т пестицидов [Кузнецов, Градова, 2006]. Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость ксенобиотиков различных классов, для изучения процессов их деградации были выбраны азотсодержащие ароматические арены, к которым относятся пиридин и его производные [Lettau, 1980; Rogers et al., 1985].

Санитарным законодательством предельно-допустимая концентрация (ПДК) для пиридина в питьевой воде установлена на уровне 0,2 мг/л, пиколинов и лутидинов -0,05мг/л, паров в воздухе - 0,0015 мг/м3 [ГН 2.1.5.2280-07, 2007], а для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение, - 0,01 и 0,001 мг/л, соответственно [Перечень рыбохозяйственных нормативов, 1999]. Такие значения ПДК предполагают глубокую очистку сточных вод. На данный момент предложены различные физико-химические способы очистки: адсорбция [Akita, 1993; Sabah, 2002], озонирование [Stern, 1997], адсорбция с электросорбцией [Niu, 2002], но, ни один из современных методов химической очистки не является экономичным и достаточно эффективным. Биологический метод очистки обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых относится его экологичность: в процессе биологической очистки не образуется чуждых природной среде соединений и происходит деструкция органических загрязнений до С02 и Н20 [Лохова, 2009].

Современный уровень развития промышленного производства и экологическое состояние окружающей среды обусловили повышение требований к качеству сточных вод, сбрасываемых в водные объекты, а традиционные технологии биологической очистки в аэротенках уже не позволяют достичь необходимой степени очистки. Одним из наиболее эффективных и очевидных способов увеличения окислительной мощности и улучшения ряда технологических показателей традиционных биологических очистных сооружений является применение иммобилизованной клеточной биомассы на нерастворимых в воде материалах [Демаков и др., 2009].

В связи с этим первостепенное значение приобретают разработка микробиологических способов очистки, предусматривающая поиск эффективных микроорганизмов-деструкторов, всестороннее их изучение, подбор оптимальных способов хранения, обеспечивающих сохранение как жизнеспособности, так и ферментативной активности, исследование путей превращений ксенобиотиков для использования этих микроорганизмов в процессах очистки промышленных сточных вод и биоремедиации почв.

Состояние вопроса.

К началу настоящей работы было известно, что первичной реакцией микробного метаболизма бензольного кольца является его гидроксилирование с образованием диоксисоединений [Арчаков, 1983; Leslie, 1985; Кулинский, 1999; Соляникова, 2007]. Последующее раскрытие кольца может проходить по одному из путей его окислительного расщепления: орто-, мета- и через образование гентизиновой кислоты.

Реакции раскрытия пиридинового кольца, в отличие от бензольного, не имеют однозначной интерпретации. С одной стороны, это обусловлено тем, что пиридин является электронодефицитным соединением, поскольку замена в кольце бензола одного атома углерода более электроотрицательным атомом азота приводит к резкому перераспределению электронной плотности в ядре так, что в положениях 2- и 4-электронная плотность понижена [Гранберг,1973, Пожарский,1986]. В результате, наряду с повышенной основностью пиридина (за счет свободной пары электронов азота), его электрофильность резко подавлена, а нуклеофильные реагенты атакуюта- и у - положения в ядре. Таким образом, нуклеофильная атака, например, введение ОН-группы, становится более легкой по сравнению с электрофильным замещением (Джилкрист, 1996). С другой стороны, до сих пор не удалось получить бактериальные бесклеточные экстракты, способные трансформировать молекулу пиридина: отсюда многие стадии его деградации остаются неизученными.

Немногочисленные данные о метаболизме пиридина и алкилпиридинов свидетельствуют о различающихся путях их разложения в зависимости от используемых микроорганизмов. Такие бактерии как Bacillus sp. шт. 4 [Watson, Cain, 1972]; Nocardia sp. [Watson, Cain, 1975]; Brevibacterium sp. [Shukla, 1973]; Corynebacterium sp. [Shukla, Kaul, 1974]; Micrococcus luteus [Sims et al., 1985, 1986] могут использовать пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при его концентрации 1,5-2,0 г/л и времени утилизации от 2 до 5 суток. Первыми идентифицированными интермедиатами оказались насыщенные алифатические кислоты, янтарный и глутаровый полуальдегиды, присутствие которых свидетельствует о восстановлении пиридинового кольца [Shukla, 1973; Watson, Cain, 1975]. Вполне вероятно, что интермедиатом при деградации пиридина является 1,4-дигидропиридин [Watson, Cain, 1972], однако прямых доказательств этого процесса нет, первичные продукты восстановительной реакции не выделены. Более поздние исследования дали другие результаты. Бактерия Nocardia sp. КМ-2 [Коростелева, 1982] утилизировала пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при максимально потребляемой концентрации 0,2% за 96 часов. В культуральной жидкости (КЖ) накапливался интермедиат, который был идентифицирован как 3-гидроксипиридин: это предполагает, что окисление кольца пиридина, предшествует его раскрытию. И в этом случае в качестве интермедиата был идентифицирован янтарный полуальдегид.

На данный момент в научной литературе представлены работы по изучению биодеградации небольшого ряда алкилпиридинов, касающихся метил- и этил- производных пиридина. [Bai, 2008; Stobdan, 2008; McCulloch, 2009.] В основном, описаны кинетические зависимости разрушения субстратов ограниченным числом различных видов микроорганизмов, и достаточно скудно представлены материалы по изучению путей метаболизма этих соединений. К настоящему времени нет обоснованных данных о путях деградации пиридина и его производных, а также диагностике штаммов, обладающих высокой деструктивной активностью по отношению к этим сильнейшим токсикантам. Так как до сих пор не удалось получить бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридины, не были определены и охарактеризованы ферменты биодеградации пиридинового кольца.

Цель работы:

Исследовать микробную деградацию пиридиновых загрязнителей; включая выделение высокоактивных штаммов-деструкторов пиридина и его производных, изучение их физиологической активности, а также исследование путей разложения пиридинов для использования выявленных закономерностей и выделенных бактерий в биотехнологических процессах очистки промышленных сточных вод и биоремедиации почв.

Основные задачи исследований.

1. Поиск и выделение высокоактивных бактерий-деструкторов пиридиновых соединений, идентификация выделенных штаммов бактерий.

2. Изучение кинетических параметров и подбор оптимальных условий для утилизации пиридина и пиридиновых производных выделенными штаммами.

3. Оценка выживаемости и сохранения утилизирующей активности бактерий-деструкторов по отношению к исследуемым субстратам при длительном хранении штаммов.

4. Выделение, характеристика и определение структуры индивидуальных продуктов интермедиатов биодеградации пиридинов методами хроматографии и хроматомасс-спектрометрии. Установление путей микробной деградации пиридина и его производных.

5. Масс-спектрометрический анализ белкового профиля бактерий АгЛгоЬаШг эр. КМ-Р и Мос1ососси5 \vratislaviensis КМ-Р, утилизирующие пиридин, методом матрично-активированной лазерной десорбции /ионизации (МАЛДИ).

8. Иммобилизация клеток бактерий Ап11гоЬас1ег Бр. КМ-Р, утилизирующих пиридин, в альгинате кальция для применения в биотехнологических процессах деструкции ксенобиотиков этого класса.

Научная новизна работы.

Выделены бактерии-деструкторы пиридинов из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» и Авдеевского коксохимического завода, производящего чистые фракции легких пиридинов. Выделенные штаммы, обладающие высокой деградирующей активностью и широкой субстратной специфичностью, были идентифицированы на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств и результатам секвенирования 16Б рРНК как представители родов АгЛгоЬас1ег и Шюс1ососси5.

Установлено, что деградация пиридина и его производных выделенными микроорганизмами происходит по окислительному пути через гидроксилирование гетероциклического кольца в С-2 и (или) С-3 положении. Обнаружение в качестве промежуточных продуктов метаболизма пиридина, 2-гидрокси-, 2,3-дигидрокси- и 2,6-дигидроксипроизводных пиридина предполагает происхождение атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-б из воды. На основании анализа продуктов раскрытия дигидроксипроизводных установлено, что пиридиновое кольцо подвергается гидролитическому разрыву по С-Ы связи обоими штаммами бактерий: АнкгоЬаМег §р. КМ-Р и Шгоёососст \vratislaviensis КМ-Р. Впервые при изучении метаболизма 2-метилпиридина (2-МП) показано, что раскрытие кольца гидрокси-2-МП между 2-м и 3-м атомами углерода с последующей реакцией конденсации приводит к образованию Ы-ацетилпиррола. Раскрытие кольца между С-5 и С-6 атомами углерода, аналогично, приводит к образованию М-формил-2-метилпиррола. Таким образом, раскрытие кольца наблюдается и в орто- и в мета-положении. Обнаружено, что метаболизм 4-МП сопровождается образованием розового и голубого пигментов, являющиеся продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-МП и 2,3,6-григидрокси-4-МП,

соответственно, а метаболизм 2,4-ДМП - окислением как кольца гетероцикла, так и метальных групп. Раскрытие кольца у 4-МП, 2,4-ДМП и 2,6-ДМП наблюдается только в мета-положент.

Практическое значение работы.

Из почв, длительное время подвергавшихся воздействию пиридина и его производных, выделены штаммы бактерий родов АгЛгоЬааег и Л/гос/ососсия, способные разлагать устойчивые азотсодержащие поллютанты - пиридин, 2-метил-, 4-метил-, 2,4-диметил- и 2,6-диметилпиридины. Создана коллекция штаммов бактерий, адаптированных к высоким концентрациям токсикантов и характеризующихся высокой скоростью их разложения. Штамм АгЛгоЬааег эр. КМ-4 за 24 часа утилизировал 2,5 г/л пиридина и 2-МП; 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП и депонирован в ВКМ (Ас-1098Д). Штамм ¡Игоёвсоссш -мгаШ1а\!'1ет1з КМ-Р утилизировал за 24 часа 2,5 г/л пиридина; Я егуЛгороИз 2.40МР - 2,0 г/л 2,4-ДМП за 36 часов.

Проведенные испытания по биодеградации пиридиновых оснований, содержащихся в сточных водах коксохимического производства, с помощью бактерий АпкгоЬаМег ер. КМ-4 показали их высокую деструктивную активность: снижение концентрации пиридинов с 7590 мг/л до 8-15 мг/л в течение 6 часов.

Штаммы АпкгоЬас1ег ер. КМ-4, Я \vratislaviensis КМ-Р и Я егуЛгороИх 2АВМР рекомендованы для очистки промышленных сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности.

Материалы диссертационной работы используются в лекционной работе профессорско-преподавательским составом ВУЗов КБР.

Апробация результатов и публикации.

Результаты работы представлены и обсуждались на 4-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Амстердам, Голландия, 1987); на конференции «Охрана окружающей среды» (Братислава, Чехословакия, 1988); на 8-м Международном симпозиуме по биотехнологии (Париж, Франция, 1988); на 3-м симпозиуме актиномицетологов (Будапешт, Венгрия, 1988); на 5-м Международном конгрессе по коллекциям культур (Вашингтон, США, 1988); на 2-м Международном симпозиуме по микробиологии (Киото, Япония, 1989); на 3-м Съезде ВМСО и всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007); на Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ» (Москва, 2008); на 56-ом съезде по масс-спектрометрии (Денвер, США, 2008); на 3-м Европейском конгрессе по микробиологии (Гётеборг, Швеция, 2009); на 18-ой Международной конференции по масс-спектрометрии (Бремен, Германия, 2009), на 3-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений" (Москва, 2010), на 4-ом научном симпозиуме "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2010).

Положения, выносимые па защиту.

• Представители немицелиальных актинобактерий из родов АнкгоЬаМег и Шойососсив обладают высокой утилизирующей способностью в отношении широкого спектра токсичных пиридиновых соединений.

• Широкая субстратная толерантность, свойственная исходному выделенному из природных образцов штамму, может быть восстановлена после его хранения в виде спектра диссоциантов, высокоактивных в отношении отдельных субстратов.

• Первой стадией разложения пиридина и его производных актинобактериями родов Arthrobacter и Rhodococcus могут быть не только восстановление, но и окисление гетероциклического кольца, аналогично начальному этапу окисления ароматического кольца при биодеградации замещенных фенолов.

• Разрыв окисленного кольца пиридина может идти по нескольким путям: орто-, мета-или между C-N, аналогично многочисленным путям разрушения ароматического кольца у замещенных фенолов. Дальнейшие превращения окисленных пиридинов могут осуществляться по нескольким независимым путям.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 34 работы, из них 12 экспериментальных статей в изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент, тезисы 18 докладов.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 216 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы, который включает 350 источников, содержит 12 таблиц и 40 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре описаны основные пути микробной деструкции соединений, содержащих пиридиновое кольцо, обобщены данные о применении метода МАЛДИ для масс-спектральной хараетеристики по белковым профилям микроорганизмов разных таксономических групп. Описаны способы иммобилизации микробных клеток с целью использования их при очистке сточных вод.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Используемые реактивы были аналитической чистоты. В качестве субстратов для деградации использовали свежеперегнанные препараты пиридина; 2- и 4-метилпиридинов; 2,4- и 2,6-диметилпиридинов. Чистота реактивов после перегонки составила 98% (данные ГХ-МС). В качестве соединений «свидетелей» использовали коммерческие препараты 6-гидрокси-2-метилпиридина и 5-гидрокси-2-металпиридина. Соединения: N-окись 2,6-диметилпиридина [Чумаков, 1963]; 3-гидрокси-2,6-диметил-пиридин [Plazek, 1939]; 2-метил-6-гидроксиметилпиридин, 2-гидроксиметилпиридин и 2,6-бис (гидроксиметил) пиридин [Чумаков, Столяров, 1963]; 2-гидроксипиридин [Чумаков, 1965]; 3-гидроксипиридин [Вульфсон, 1959]; 2,3-дигидроксипиридин [Behrman, Pitt, 1958]; 4-гидрокси-2,6-диметилпиридин [Campball et all., 1950]; 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридин [Houghton,Cain, 1972]; янтарный полуальдегид [Jakoby, 1962]; 3-гидрокси-2-метилпиридин [ Williams , Kaufmann, Mosher, 1955]; N-ацетилпиррол [ Drew et all., 1985]-были синтезированы.

Микроорганизмы. Штаммы бактерий выделяли из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» (г. Купавна, Московская обл.) и Авдеевского коксохимического завода (г. Авдеевка, Украина) по синтезу легких пиридинов, длительно подвергавшихся воздействию пиридинов. Выделение бактерий

проводили методом накопительных культур на синтетической среде Шуклы [Shukla, 1973], культивировали в колбах на 750 мл с 200 мл среды, на качалке (200 об/мин) при 28-30°С. Пересевы производили до появления видимого роста микроорганизмов, с каждым разом увеличивая концентрацию вносимого субстрата. После нескольких пересевов, источник азота в виде (NH4)2S04 исключали. Чистые культуры получали по методу Коха [Нетрусов, 2005]. Морфологические особенности штаммов изучали с помощью микроскопии (иммерсионная система, фазово-контрастное устройство) и электронно-микроскопическую технику (Hitachi-S-405A). Идентификацию штаммов проводили согласно Берджи [Bergey's, 1986].

Секвспнрование последовательности гена 16S рРНК. ДНК из клеток бактерий выделяли по методу Булыгина [2002]. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием системы универсальных праймеров [Edwards, 1989]. Состав реакционной смеси для ПЦР: праймеры по 25 пмоль, каждого; 10 х буфер - 2,5 мкл; 2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата - 2,5 мкл; Bio Taq-полимераза 5Е/мкл - 0,2 мкл («Диалат», Москва); ДНК-матрица - 50 нг; Н20 - до 25 мкл. Реакцию проводили по схеме: до 30 циклов амплификации при следующем температурном режиме: денатурация ДНК при 94°С - 0,5 мин; отжиг праймеров при 45°С - 1 мин; элонгация при 72°С - 1 мин; окончательная полимеризация - 7 мин. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% геле агарозы при напряжении электрического поля 6 В/см. Использовали систему видеодокументации BioDocII (Biometra, Германия). Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing, (Promega, США), согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Для секвенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры. Чтение проводили в двух направлениях.

Первичный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью сервера BLASTA, и выравнивание последовательностей - с помощью программы CLUSTAL.W [Thompson, 1994]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий - с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer, 1994].

Количественное определение пиридннов проводили на спектрофотометре «Hitachi-200-20» (Япония) при следующих длинах волн: пиридин (П) - 255 нм; 2-метилпиридин (2-МП) - 262 нм; 4-метилпиридин (4-МП) - 252 нм; 2,4-диметилпиридин (2,4-ДМП) - 260 нм; 2,6-диметилпиридин (2,6-ДМП) - 268 нм. Калибровочные кривые строили по анализируемым субстратам.

Хранение исходного штамма Arthrobacter sp. КМ-4. Лиофилизацию клеток осуществляли на центробежно-сублимационной установке (Edvards High Vacuum Company, Англия). Высушивали 3 часа на первичной сушке ЗОР1 при остаточном вакууме 110 мм рт.ст., температуре рефрижератора - 45°С и температуре сублиматора +22°С. Ампулы с клетками с остаточной влажностью 2,0-3,0 %, запаивали под вакуумом и хранили при 4°С без доступа света [Герна, 1983]. Тест на «ускоренное хранение» проводили по методу [Banno, Sakane, 1981]. Криоконсервацию суспензии клеток -ультрабыстрым способом со скоростью охлаждения ~ 400 град/мин путем непосредственного погружения в жидкий азот и последующим хранением при -196°С.

Для анализа методом матрично-активированнон лазерной десорбции /нонизацни (МАЛДИ) суспензию клеток в матрице в соотношении 1:1 наносили на стальную пластинку-мишень капельным методом не более 1,5 мкл образца и высушивали на воздухе. Спектры регистрировали в линейном режиме на приборе Autoflex II (Компания Bruker, Германия), оборудованном азотным лазером с длиной волны 337нм, диапазон регистрируемых масс: 2-20 кДа в режиме положительных ионов. Результирующий спектр получали суммированием спектров, полученных в нескольких точках образца при 50 ударах лазера.

Определение потребления пиридина суспензией и иммобилизованными клетками Arthrobacter sp. КМ-Р. Скорость утилизации пиридина суспензией свободных или иммобилизованных в альгинате кальция клеток оценивали на среде следующего состава (г/л): КН2Р04- 0,2; MgS04-7H20 - 0,2; FeS04-7H20 - 0,01; СаС12-2Н20 - 0,02; MnS04-H20 - 0,002; Na2Mo04 - 0,001; рН 7,0-7,2. В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях 1,5; 2,5; 3,0 и 3,4 г/л. В каждую из колб вводили по 8,3 мл суспензии клеток или по 25 мл гранул с клетками и культивировали при аэрации и 28-30°С. Пробы на предмет утилизации 1,5 г/л пиридина отбирали через каждые 3 часа и через каждые 6 часов для остальных концентраций пиридина.

Выделение и идентификация индивидуальных продуктов деградации пирндинов. Экстракты 1-3, полученные при рН 8,0-9,0; 7,0-7,5 и 2,0-3,0 из 1-2 л КЖ, упаривали, остаток растворяли в 0,5-1,0 мл этанола и проводили разделительную хроматографию на пластинках "Silufol UV - 254" (DC-Alufolies Kieselgel 60 F2j4, Merck, Германия) и пластинках с целлюлозой (TLC-Ready Plastic Sheets F1440 Merck, Германия). Использовали следующие системы растворителей: 1 - хлороформ-метанол (20:3); 2 -хлороформ-ацетон-этанол (7:2:2); 3 - этанол-аммиак-вода (20:1:4); 4 - петролейный эфир-этилацетат (1:5). Хроматограммы проявляли в УФ-свете или парами йода; фенольные соединения - опрыскивая хроматограммы 2% спиртовым раствором FeCl3; кетокислоты -0,5% раствором 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в 2 и НС1; карбоновые кислоты -0,05% спиртовым раствором бромкрезолового зеленого (рН 7,0-8,0). Для препаративного выделения индивидуальных продуктов использовали тонкослойную и колоночную хроматографию. В первом случае экстракты, растворенные в этаноле, хроматогра-фировали на силикагеле (PSC- Fertigplatten Kieselgel 60 F2S4, Merck, Германия), используя системы растворителей 1, 2 и 3. Хроматографические зоны сорбента вырезали и элюировали этанолом, полученные растворы фильтровали, фильтраты упаривали, осадок анализировали.

Для препаративного выделения карбоновых кислот использовали колоночную хроматографию (30x1,7) на целлюлозе (Silicagel L 40/100, Chemapol, CzSR) в системе растворителей 3, а также тонкослойную препаративную хроматографию в системах растворителей 2, 3 и 4. Структуру выделенных индивидуальных соединений доказывали анализом их масс-, УФ-, ИК- и ЯМР-спектров. 2,4-динитрофенилгидразоны кетокислот получали путем обработки образцов раствором 2,4-ДНФГ в хлорной кислоте с последующим разделением в тонком слое силикагеля, в системе 5 - петролейный эфир-этилацетат-уксусная кислота (26:14:3).

Триметилсилилирование полученных образцов проводили по методу, описанному Gehrke, Laking [1971]: к исследуемому образцу добавляли 25 мкл ацетонитрила, 25 мкл дихлорэтана и 50 мкл бис(триметилсилилтрифтор)-ацетамида (Regisil BSTFA), смесь выдерживали 30 мин при 150-160°С.

Хроматомасс-спектральный анализ проводили на приборе «Varian-MAT-212» со стеклянной капиллярной колонкой (50м х 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-30. Масс-спектры получали на приборе «Finigan МАТ-4615» методом химической ионизации (газ-реагент NH3) при энергии ионизации 70 эВ с прямым вводом вещества в ионный источник. Спектры ЯМР 'Н сняты на спектрометре «Tesla BS-467» в растворе CDC13, внутренний стандарт - тетраметилсилан (ТМС).

Выделение н идентификация продуктов деградации 2-МП. Пробы отбирали в процессе роста культуры в объеме 200 мл, подкисляли до pH 2,0-3,0 HCl, клетки отделяли центрифугированием, 30 мл супернатанта трижды экстрагировали 10 мл свежеперегнанного дихлорметана. Суммарную кислотную дихлорметановую вытяжку (-30 мл) упаривали на роторном испарителе до объема ~3 мл (экстракт 1). Оставшийся водный раствор подщелачивали до pH 8,0-9,0 40% раствором NaOH, после чего трижды экстрагировали 10 мл дихлорметана. Суммарную вытяжку упаривали до объема ~3 мл (экстракт 2). Для получения дериватизированных экстрактов 30 мл КЖ упаривали досуха на роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 2 мл дихлорметана, в полученный раствор добавляли 1 мл раствора BF3 в метаноле, кипятили 2 мин и трижды промывали дистиллированной водой. Конечный объем составлял ~3 мл (экстракт 3). Аналогичным образом была проведена дериватизация кислотного экстракта (экстракта 1), к которому добавляли 1 мл раствора BF3 в метаноле и кипятили 2 мин, после чего экстракт трижды промывали дистиллированной водой, упаривали до конечного объема 3 мл (экстракт 4). Силилирование продуктов деградации 2-МП из экстрактов КЖ проводили М,0-бис(триметилсилил)-ацетамидом, К 1 мл экстракта добавляли 10 мкл силилирующего агента. Процесс проводили в ультразвуковой бане в течение 2 часов при 60°С. Затем аликвоту объемом 100 мкл доводили дихлорметаном до 1 мл. Анализ продуктов, содержащихся в экстрактах, проводили на масс-спектрометре ГХ-МС (LECO Pegasus 4D, Германия), снабженном капиллярной силиконовой колонкой RTX-5MS (30 м), при энергии ионизующих электронов 70 эВ. Диапазон регистрируемых масс - от 29 до 500 Да. Экстракты хроматографировали в температурном режиме: 2 мин при 50°С, 2 мин при 280°С, скорость нагрева - 20°С/мин. Объем вводимой пробы - 0,1 мкл. Компоненты анализируемых смесей идентифицировали с помощью компьютерных библиотек масс-спектров органических соединений: 1) NIST - National Institute of of Standards, библиотека на 130 тысяч соединений; 2) WILEY-библиотека на 275 тысяч соединений, а также вручную с использованием известных направлений распада молекулярных ионов органических соединений [Лебедев, 2003].

Количественный масс-спектрометрический анализ КЖ 2-МП проводили в пробах, отобранных в процессе роста культуры (3; 6; 9; 12; 18; 20 и 22 ч). В качестве внутреннего стандарта использовали пердейтерированный нафталин, в количествах 10100 мкг в зависимости от соотношения аналитических сигналов самого стандарта и определяемых компонентов. Определение проводили по площадям хроматографических пиков по полному ионному току и по отдельным характеристическим ионам в масс-спектрах при использовании метода внутреннего стандарта. Количество определяемого вещества рассчитывали по формуле: mx = S„ х та/85Ь где Sx и Sst - площади хроматографических пиков продукта и внутреннего стандарта соответственно, а шх и ms, - их количество [Золотов, 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение штаммов-деструкторов и оценка утилизации ими пиридина н его производных. Из почв, которые в течение долгого времени подвергались воздействию сточных вод, содержащих пиридин и его производные, были выделены в виде чистых культур штаммы бактерий - деструкторов пиридинов. По результатам идентификации штаммов на основании фенотипических и генетических методов анализа, они были отнесены к родам АгЛгоЬаШг и Шойососсиз. Утилизацию субстратов изучали в динамике роста штаммов на минеральной среде, содержащей пиридины как единственные источники углерода, азота и энергии.

Штамм АпИгоЬаШг ер. КМ-4 обладал широкой субстратной специфичностью по отношению к производным пиридина и исключительно высокой деградирующей активностью: за 24 часа бактерии утилизировали по 2,5 г/л пиридина и 2-МП, 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП (рис. 1-4). Лг1кгоЪас1ег Бр. КМ-4 был способен использовать перечисленные субстраты, как по отдельности, так и в смеси, с общей концентрацией не более 3,0 г/л.

12 15 18 время, ч

Рис. 1. Утилизация субстрата (а) и накопление биомассы (б) при росте штамма АгЛгоЬааег зр. КМ-Р на пиридине.

Изучение влияния температуры на скорость утилизации субстратов с учетом их летучести показало, что для метаболизма пиридинов оптимальной являлась 28-30°С. Однако процесс мог протекать как при более низкой (22-24°С) так и при более высокой (40°С) температурах. Для роста штамма бактерий оптимальной была концентрация пиридина 2,5 г/л, который утилизировался за 24 часа (рис. 1). Аналогичны показатели и для 2-МП (рис.2).

Рлс. 2. Утилизация субстрата (а) и накопление биомассы (б) при росте штамма АгЛгоЬаМег ер. КМ-2МР на 2-МП.

Для 4-МП оптимальной была концентрация 1,5 г/л: утилизировался бактериями за 24ч (рис. 3).

Рис. 3. Утилизация субстрата (а) и накопление биомассы (б) при росте штамма Аг1ИгоЬас1ег Бр. КМ-4МР на 4-МП.

время, ч

Наибольшая деградирующая активность у штамма проявилась относительно 2,6-ДМП: за 24 часа было потреблено 3,0 г/л этого субстрата (рис. 4).

Рис. 4. Утилизация субстрата (а) и накопление биомассы (б) при росте штамма Аг(ИгоЬас1ег ер. КМ-2.6ЭМР на 2,6-ДМП.

время, ч

Перекрестные пересевы каждого из вариантов на другие субстраты показали: варианты, утилизирующие 2-МП и 2,6-ДМП, росли без лаг-фазы и взаимно утилизировали оба субстрата, тогда как варианты, утилизирующие пиридин и 4-МП, росли исключительно на своих субстратах.

Штамм Якос1ососси5 КМ-Р обладал высокой деструктивной

активностью по отношению к пиридину, утилизируя 2,5 г/л субстрата за 24 часа (рис. 5). При этом катаболизм пиридина штаммом проходил без длительного лаг-периода.

время, ч

Рис. 5. Утилизация субстрата (а) и накопление биомассы (б) при росте штамма Я1юс1ососс№ \vratislaviensis КМ-Р на П.

Наиболее интенсивное потребление субстрата (30%) наблюдалось между 18 и 21 часом. Рост штамма на пиридине не сопровождался образованием пигмента.

Штамм ШосЬэсоссш егуЛгороИв 2.4РМР, обладал довольно высокой деструктивной активностью по отношению к 2,4-ДМП: 2,0 г/л субстрата утилизировалось за 36 часов (рис. 6). Для штамма была характерна узкая субстратная специфичность, он утилизировал только 2,4-ДМП, на котором был выделен.

" " Рис. 6. Утилизация субстрата

2. Кинетика утилизации пиридина штаммами Лп/иоЬас/ег ¡р. КМ-Р и Шюс/ососсиь \vratislavieims КМ-Р. Штамм Л \vralislaviensis КМ-Р, в отличие от АгЖгоЬаМег эр. КМ-Р, целенаправленно выделяли, используя в качестве ростового субстрата пиридин. Он обладал узкой субстратной специфичностью. Время утилизации (24 ч) и концентрации пиридина (по 2,5 г/л) для обоих штаммов идентичны. Для более полного описания утилизирующей активности штаммов были рассчитаны следующие кинетические параметры: удельная скорость роста ц культуры, экономический коэффициент и удельная утилизирующая активость биомассы ц. Графики, использованные для расчета удельной скорости роста и экономических коэффициентов К. \vratislaviensis КМ-Р и АгЛгоЬас1ег Бр. КМ-Р приведены на рис. 7, 8 и рис. 9, 10, соответственно.

(а) и накопление биомассы (б) при росте штамма Л егу(ИгороПх 2.40МР на 2,4-ДМП.

О 6 12 18 24 30 36

время, ч

0.4 -

Время, ч

Рис. 7. Зависимость накопления биомассы от времени роста Лтсга/и/ау/еиш КМ-Р в полулогарифмических координатах.

-1.4

Рис. 8. График для расчета экономического коэффициента штамма Л \vratislaviensis КМ-Р.

Рис. 9. Зависимость накопления биомассы от времени роста АпНгоЬас1ег ер. КМ-Р в полулогарифмических координатах.

Рис. 10. График для расчета экономического коэффициента штамма АпкгоЬаЫег ер. КМ-Р.

Анализ полученных зависимостей позволяет сделать вывод, что в исследуемых условиях кинетика роста штаммов адекватно описывается уравнением 1п М = 1п М0 + [Варфоломеев и др., 1990].

Рассчитанные значения кинетических параметров для штаммов приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Кинетические характеристики штаммов-деструкторов пиридина

Штамм Удельная скорость роста, ч"' Экономический коэффициент Удельная активность биомассы, моль[С]/г*ч

Arthrobacter sp. КМ-4 0,0461 0,2634 13,8

Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р 0,0661 0,2884 18,1

Поскольку значения удельной скорости роста связаны со скоростью деления клеток исследуемых культур, можно сделать вывод, что у R. wratislaviensis КМ-Р этот процесс проходил на 40% быстрее, чем у Arthrobacter sp. КМ-Р. Удельная активность биомассы дало наглядное представление о способности культур к деградации. Так, рост R. wratislaviensis КМ-Р был более интенсивен, равно как и удельная активность биомассы была значительно выше: 1 г клеточной массы R. wratislaviensis КМ-Р потреблял на 4,3 моля пиридина больше, чем Arthrobacter sp. КМ-Р, что в пересчете составляет 3,4 г.

3. Хранение штамма Arthrobacter sp. КМ-4, утилизирующего пиридин п его производные. В связи с потенциальной перспективностью использования штаммов-деструкторов в биотехнологии и охране окружающей среды, отдельной практической задачей явилась разработка способов хранения штаммов с сохранением высокого уровня жизнеспособных клеток и их утилизирующей активности.

В доступной литературе отсутствуют сведения, касающиеся сохранности физиологических свойств штаммов, способных к утилизации пиридинов. В связи с этим на примере высокоактивного штамма Arthrobacter sp. КМ-4 были подобраны условия его хранения.

Для длительного хранения штамма использовали несколько методов: лиофилизацию клеток в различных защитных средах и криоконсервацию с криопротекторами. Хорошие результаты были получены при консервации зрелых клеток начала стационарной фазы роста, выращенных на минеральной среде с 2,6-ДМП. Исходная плотность клеток в суспензии для консервации составляла 109 кл/мл. Регидратацию клеток после хранения проводили в той же минеральной среде. Полученные результаты были экстраполированы для консервации бактерий R. wratislaviensis КМ-Р и R. erythropolis 2.4DMP.

3.1. Лиофилизация. Лиофилизация в настоящее время широко используется для длительного хранения коллекционных и многих промышленных штаммов [Ashvvood-Kirsop,1983, Sidyakina et all., 1992, Волков, 1994, Morgan, Vesey, 2009]. Лиофили-зированные культуры могут храниться в течение длительного времени, при условии их содержания без доступа кислорода, влаги и света при пониженных температурах [Heckly, 1978, Ashwood-Smith, Farrat, 1980; Morgan et all., 2006].

В качестве защитных сред при лиофилизации клеток Arthrobacter sp. КМ-4 использовали 5% раствор трегалозы, лошадиную сыворотку с 5% раствором мезо-инозита и сухое молоко. Количество жизнеспособных клеток на использованных защитных средах

оценивали на протяжении 9 месяцев хранения. Наиболее высокий титр жизнеспособных клеток непосредственно после лиофилизации клеток были получены при использовании сухого молока - 30% от исходного, более низкий титр - при лиофилизации в растворе трегалозы ~ 18% и лошадиной сыворотки с мезо-инозитом ~ 14%.

В процессе хранения штамма жизнеспособность клеток на всех использованных защитных средах практически не изменялась.

Анализ результатов определения утилизирующей активности реактивированных клеток показал, что лиофилизированные бактерии АпЪгоЬаЫег ер. КМ-4 в течение 9 месяцев хранения во всех защитных средах не теряли своих свойств (93-96 % от исходного).

Полученные результаты по данным сохранения жизнеспособности клеток и их утилизирующей активности не позволили отдать предпочтение какой-либо из сред для длительного хранения штамма ЛгЛгоЬасгег 8р. КМ-4.

3.2. Тест на «ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма бактерий АШггоЬаШг ер. КМ-4. С целью определения гарантированного времени сохранности штамма при 4°С и быстрой оценки эффективности использованных сред проводили «тест на ускоренное хранение». Для этого ампулы с лиофилизированными клетками в течение месяца хранили при 4°, 28° и 37°С, после чего оценивали как жизнеспособность бактерий, так и их утилизирующую активность.

Динамика титра жизнеспособных клеток представлена на рисунке 11( а, Ь, с).

7,16 7,6

7,15 7,5 — — — л, _

7,4 " -- - ,28°С

7,14 23' С

7,13 7,3

> 7,12 >- 7,2

О! С1 _ 7,1

- 7,11

7,10 7,0

7,09 6,9 ь

7,08 а 6,8 , . , . , . ,

10 15 20 25 Время, дни

10 15 20 Время, дни

Рис. 11. Численность жизнеспособных клеток АгМгоЬас1ег эр. КМ-4 по результатам «теста на ускоренное хранение»при лиофилизации в: а) лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита (46 лет); Ь) 5% растворе трегалозы (4 года); с) сухом молоке (5 лет).

Прогнозирование выживаемости лиофилизированных клеток штамма АгШгоЬас1ег ер. КМ-4, основанное на «тесте ускоренного хранения», базируется на следующих теоретических положениях. Первое состоит в том, что скорость снижения выживаемости лиофилизированных клеток подчиняется уравнению кинетики 1-го порядка. Отсюда зависимость выживаемости от времени хранения при постоянной температуре имеет экспоненциальный характер. Второе теоретическое положение основано на использовании уравнения Аррениуса при описании зависимости константы скорости К от температуры хранения. Результаты расчетов коэффициента К уравнения Аррениуса согласно [Ваппо, Бакапе, 1981; СпГПп сЧ а!., 1981] представлены на рисунке 12.

Как видно из рисунка, экспериментальные значения К=Г (1/Т-103), полученных для каждой из использованных нами температур 4°, 28° и 37°С, легли на прямую линию, что подтверждает применяемость теста для прогнозирования возможного времени хранения лиофилизированной культуры. Из анализа полученных данных следует, что на лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита титр жизнеспособных клеток снизится до ~ 102 кл/мл за 46 лет (а); 5% растворе трегалозы - за 4 года (Ь); на сухом молоке - за 5 лет хранения (с).

Оценка утилизирующей активности реактивированных после лиофилизации клеток штамма АпИгоЬааег Бр. КМ-4, хранившихся при разных температурах (4°, 28° и 37°С) показала, что при использовании всех защитных сред способность утилизировать 2,6-ДМП сохранялась на высоком уровне.

3.3. Криоконсервация. Криоконсервация в настоящее время является наиболее перспективным методом длительного хранения коллекционных штаммов микроорганизмов [Пушкарь и др., 1983; Филиппова и др., 2007].

Для криоконсервации штамма АнЬгоЬаМег йр. КМ-4 в качестве криопротекторов были опробованы: 5% раствор трегалозы; 10% раствор глицерина; 12% раствор сахарозы и лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита (таблица 2).

Наиболее высокий титр жизнеспособных клеток - 40% от исходного, был получен при использовании 10% глицерина: жизнеспособность клеток за 9 месяцев храпения снизилась только на 5% [Аркадьева, 1983]. Эти данные согласуются с имеющимися в литературе сведениями о том, что глицерин является одним из универсальных криопротекторов. Наиболее низкое значение жизнеспособности -10% от исходного, было

получено при использовании 12% сахарозы: за время хранения наблюдалось резкое падение титра жизнеспособных клеток до ~ 0,75%. В вариантах криоконсервации АнИгоЬамег Бр. КМ-4 в 5% трегапозы, а также лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита титр жизнеспособных клеток сразу после консервации был значительно ниже, чем при использовании глицерина. Однако в лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита за 9 месяцев хранения жизнеспособность не снижалась и составила ~ 20%, как и сразу после криоконсервации., а при использовании 5% трегалозы за 6 месяцев хранения наблюдалось снижение жизнеспособности с ~ 27 до - 20%.

Таблица 2.

Численность жизнеспособных клеток штамма АпкгоЬаМег Бр. КМ-4 при криоконсервации

Количество жизнеспособных клеток при хранении , %

Криопротектор У„ 1 сутки 1 месяц 6 месяцев 9 месяцев

V, % Уз % % У5 %

5% трегалоза 8,46 7,90 27 7,84 24 7,78 20 - -

10% глицернн 8,30 7,90 40 7,84 35 7,84 35 7,84 35

12% сахароза 9,60 8,47 10 7,60 1,0 7,47 0,75 7,47 0,75

Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита 8,30 7,60 20 7,60 20 7,60 20 7,60 20

Утилизирующая активность штамма АгАгоЬаМег эр. КМ-4 после криоконсервации сохранялась на высоком уровне при использовании всех защитных сред. Лучшие показатели были на лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита (100%) и глицерином (9698%).

Таким образом, исследования эффективности использованных защитных сред при лиофилизации и криоконсервации как по оценке их жизнеспособности, так и утилизирующей активности по отношению к 2,6-ДМП, подтвержденные «тестом на ускоренное хранение» позволили рекомендовать для длительного хранения штамма АггИгоЬас1ег Бр. КМ-4 лошадиную сыворотку с 5% раствором мезо-инозита в качестве защитной среды.

После длительного хранения штаммов - деструкторов количество жизнеспособных клеток составило 107 кл/мл, что достаточно для восстановления бактериальной популяции [Ившина, 2005].

Активность штамма АпкгоЬаШг Бр. КМ-4 по показателям деструкции 2,6-ДМП после длительного хранения (20 лет) также быстро восстановилась до уровня 3,0 г/л, которым он обладал до лиофилизации (рис.4). Этот штамм пересеяли в жидкую синтетическую среду в трех вариантах: с содержанием по 0,25 г/л 2-метил- и 4-метил-пиридинов и пиридина. Далее все варианты поддерживали исключительно на своих субстратах. На 2-МП бактерии выросли без лаг-периода и течение 5-ти пассажей на свежей среде с постепенным увеличением концентрации вносимого субстрата, получили культуру, способную утилизировать 2,0 г/л, что соответствовало активности до хранения.

Путем постоянных пересевов на синтетической среде, активность штамма была повышена: в настоящее время за 24 часа он утилизирует 2,5 г/л 2-МП (Рис. 2).

Добиться роста штамма Arthrobacter sp. КМ-4 на 4-МП удалось в результате длительной его адаптации (1 год) к этому субстрату. Еще в течение 6 месяцев, путем постоянных пересевов на синтетической среде, активность штамма была повышена только до исходной концентрации - 1,5 г/л, соответствующей таковому до хранения, однако дальнейшего увеличения активности в работе с 4-МП не наблюдалось (рис. 3).

Штамм Arthrobacter sp. КМ-4 до хранения не потреблял пиридин, но клетки не теряли жизнеспособность на этом субстрате. После хранения штамм в течение месяца был адаптирован к утилизации пиридина. В результате постоянных пересевов на синтетической среде с пиридином в течение 1,5 лет активность штамма была повышена до 2,5 г за 24 ч (рис. 1).

Таким образом, были изолированы 4 варианта исходной культуры: вариант штамма, утилизирующий пиридин далее будет обозначен как Arthrobacter sp. КМ-Р; 2-метилпиридин - Arthrobacter sp. КМ-2МР; 4-метилпиридин - Arthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-диметилпиридин - Arthrobacter sp. KM-2.6DMP (рис. 1-4).

Восстановительный период для штамма R. wratislaviensis КМ-Р, разрушающего пиридин, длился месяц. При постоянных пересевах активность штамма возросла с 1,5 г/л за 36 часов до 2,5 г/л за 24 часа. Для штамма R. erythropolis 2.4DMP разрушающего 2,4-диметилпиридин, адаптационный период был длительным (1 год).

4. Масс-спектрометрический анализ клеток бактерии. Масс-спектрометрия была впервые применена для анализа микроорганизмов по типу «отпечатков пальцев» в 70-х годах прошлого века [Anhalt, Fenselau, 1975], используя в качестве одного из маркеров белки. Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) позволяет получить информацию о молекулярной массе (м.м) белков, и продуктов их энзиматического расщепления. Наиболее часто используемые матрицы при исследовании белкового профиля бактерий: 2,5-дигидроксибензойная (DHB); а-циано-4-гидрокси-коричная (НССА); синапиновая кислоты (SA).

4.2. Влияние условий культнвирования на МАЛДИ-профиль бактерий. Анализ проведен на примере штамма Arthrobacter sp. КМ-Р. Постулируется, что вне зависимости от условий культивирования клетки конкретного микроорганизма вырабатывают определенный набор белков, пики молекулярных ионов которых должны присутствовать в спектре [Giebel et all., 2008; Sulca et all., 2009]. При этом, безусловно, возможны существенные изменения в количестве и интенсивности соответствующих пиков.

Для проведения сравнительного анализа белковых профилей, полученных методом МАЛДИ, клетки Arthrobacter sp. КМ-Р выращивали на трех различных средах: агаризованной минеральной среде с пиридином (АМП), сусло-агаре (CA) и мясо-пептонном агаре (МПА). На рис. 13 приведены полученные для всех трех вариантов спектры.

Как и предполагалось, характерный для Arthrobacter sp. КМ-Р пик с максимальной интенсивностью и m/z 7297-7299 сохранялся при всех условиях культивирования. Обратим внимание, что наибольшее число значимых пиков наблюдалось в спектре, полученном для клеток, выращенных на АМП. Эта среда является наиболее бедной из всех трех использованных, в ней единственным источником углерода, азота и энергии для роста бактерий является пиридин. По всей видимости, в связи с этим, клетки штамма максимально активизируют ферментные системы, что приводит к синтезу белков, обладающих деструктивной и синтетической активностью.

15 6433 ¿994 3318 4050Д18 5462^ -И — ■ ыД 97 93 8927 1 е1.09 1 АМП 29 10051 11643 18653

]7 Д28 5034 6685 _-«а—4-и. 99 СА 1зэб; <Ш ,2627 I 18654 Л____и.—А................................ГГ.А,.............. ~Т7 . „

36*7 4400 6681 — .......................... .„.Д. 97 МПА 8179 10054 12624~^* 18651 1.Х,..............и„д........ 7Г~, , \ .. "Г

Ю ОООО еото 8000 10000 12000 1ЭДОО 1ВДОО 1ВМО

гтЛ

Рис. 13. Белковые профили (МАЛДИ) штамма АнИгоЬаМег эр. КМ-Р на разных средах.

Для более удобного визуального сравнения на рис. 14 приведена гистограмма, отображающая относительные интенсивности основных пиков МАЛДИ-профилей, полученных для каждой из трех сред.

Г \ 4

1 1

5» \ 1 *»»» • 1 * 4 л 11«ет в »Л л 1 г 31 50 1 нИн 1 1 1 11! 1 II III г 1 1» 1!Н 1 сА

^ ? } 4 # ^ ^ # % <? о1 / / / # / / / N V V

Рис. 14. Гистограмма, демонстрирующая совпадение пиков при анализе клеток Аг1кгоЬас(ег эр. КМ-Р, выращенных на различных средах.

Таким образом, вне зависимости от условий культивирования, штамм бактерий может быть успешно идентифицирован с применением МАЛДИ-МС.

4.1. Сравнительный анализ биодсградирующих штаммов АШиоЬпсШ ер. КМ-Р и Я. мгаИ$1ау1еп8к КМ-Р методом МАЛДИ. Исследуемые штаммы - деструкторы пиридина представлены грамположительными клетками, их суспендирование проводили в 50% растворе ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУК) с обработкой клеток ультразвуком для разрушения клеточной стенки. Первый этап работы включал подбор подходящей матрицы. Были опробованы ОНВ, НССА, ЭА. При использовании ОНВ не удалось получить хорошего разрешения в анализируемом диапазоне масс. Аналогичная картина наблюдалась и для Я. \vratislaviensis КМ-Р. Для проведения последующих экспериментов в качестве матрицы использовали ЭА.

На рис. 15 приведена гистограмма, демонстрирующая степень схожести белковых профилей клеток исследуемых бактерий.

Рис. 15. Сравнение относительной интенсивности пиков, общих для штаммов АПкгоЬас1ег эр. КМ-Р и R.wratislaviensis КМ-Р.

- ШАпЬюЬаХег™.

1 ■ ИжаИзшепт

щ ■

И •'.! _ _...............

_ ИИ ■— Шш................«в........

5982 7220 7297 т/г 8456 9251 9719

Таким образом, для двух немицелиальных актинобактерий разных видов при анализе методом МАЛДИ удалось выявить сходство их белковых профилей. Можно предположить, что белки, дающие сигнал в спектре обоих штаммов, относятся к ферментной системе, осуществляющей деградацию пиридина. Интересно, что кроме основного пика с т/г 7297, который был общим в спектрах клеток Аг1кгоЬас1ег эр. КМ-Р и Л^га/и/ст'еш'г.у КМ-Р, выращенных на АМП, в МАЛДИ-профилях клеток АпИгоЬаМег эр. КМ-Р, культивируемых на органических средах (СА и МПА), другие пики отсутствуют.

5. Исследование путей деградации пиридина и его производных.

Как правило, данные о путях метаболизма органического соединения получают при работе с бесклеточными экстрактами, определяя активности вовлеченных в его трансформацию ферментов. К настоящему времени с использованием такой методологии достаточно хорошо изучен бактериальный метаболизм бензольного кольца. Деструкция фенолов, например, проходит с образованием пирокатехина, который далее может подвергаться расщеплению в мета- или в ор/яо-положениях. Было показано, что ключевыми ферментами биодеградации фенолов являются пирокатехин-1,2- или 2,3-диоксигеназы, которые были выделены и охарактеризованы [Соляникова, 2007]. О реакциях раскрытия пиридинового кольца однозначной информации нет. Это, с одной стороны, обусловлено физико-химическими особенностями азотсодержащего гетероцикла [Джилкрист, 1996], с другой - безуспешностью попыток получить каталитически активные бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридин и его производные. Исследования указанных соединений штаммами актинобактерий проводили в динамике роста микробных культур. Интермедиа™, накапливаемые в КЖ, были обнаружены и

извлечены. Выделенные образцы, состояли, как правило, из смеси веществ, и содержались в малых количествах (мкг). Поэтому идентификацию многих из них удалось осуществить в виде триметилсилилированных производных методами газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС).

5.1. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-Р. Из экстракта 1 (щелочного) было выделено вещество, которое присутствовало в КЖ в следовых количествах. Основное количество этого вещества (2-3 мг) было выделено из экстракта 3 (кислого). При анализе методом ВЭЖХ оказалось, что время удерживания (Rf) 2,4-динитрофенилгидразона этого соединения идентично Rf 2,4-ДНФ-гидразона синтетического свидетеля - янтарного полуальдегида (2,00 мин).

Хроматографирование экстракта 2 (нейтрального) показало присутствие соединения, которое окрашивалось РсСЬ. Оно не соответствовало по значению Rf ни одному гидроксипиридину, что давало основание предположить наличие двух гидроксильных групп в пиридиновом кольце. Хроматомасс-спектральный анализ данного образца доказал наличие в нем нескольких соединений, одно из которых имело м.м. 111 и соответствовало дигидроксипиридину (табл. 3, 1).Для разделения этой смеси образец триметилсилилировали и исследовали хроматомасс-спектрометрически. После указанной обработки в образце удалось выявить еще два соединения с м.м 183 и 257.

Масс-спектральный распад первого вещества соответствовал распаду моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина, в котором просилилировался один атом водорода гидроксила (табл. 3, II). М.м, а также распад второго соединения указывали на то, что оно является продуктом присоединения воды к молекуле гидроксипиридина в положении С-6 (С-2). Учитывая сравнительно низкую величину времени удерживания (tyÄ) для этого соединения на хроматограмме, которая оказалось близкой к tj-д бис-ТМС-производного (см. далее) 2,6-дигидроксипиридина, наиболее вероятной для этого гидрата гидроксипиридина можно считать структуру 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина (табл. 3, III).

Для выявления структуры дигидроксипиридина был проведен дополнительный анализ КЖ, снятой в середине экспоненциальной фазы роста культуры. С помощью тонкослойной препаративной хроматографии на силикагеле из экстракта 2 был выделен образец, который давал характерное окрашивание с FeCl2. После получения триметилсилильного производного данный образец был исследован хроматомасс-спектрометрически. В нем было обнаружено 5 соединений: два изомера с м.м. 255, соответствующие дигидроксипиридинам, в которых два атома водорода замещены ТМС-группами, соединение с м.м. 167, соответствующее гидроксипиридину и два продукта раскрытия пиридинового кольца с м.м. 161 и 248.

Один из изомеров с м.м 255 с большим значением Rf на хроматограмме (6,38 мин) имел хроматографические характеристики такие же, как у синтетического свидетеля ТМС-производного 2,3-дигидроксииридина (6, 40 мин).

Время удерживания второго изомера (5,45 мин) резко отличалось от аналогичной характеристики синтетического ТМС-производного 2,5-дигидроксипиридина (7,35 мин). Очень короткое время удерживания для выделенного изомера с м.м. 255 свидетельствовало о высокой пространственной затрудненности его атома, что исключает возможность присутствия 2,5-, 3,4- и 2,4-изомеров. Это позволяет предположить для данного соединения единственно возможную структуру бис-ТМС-производного 2,6-дигидроксипиридина (табл. 3, IV).

Масс-спектр гидросипиридина с м.м. 167 был идентичен спектру ТМС-производного синтетического 3-гидроксипиридина.

Анализ соединения с м.м. 161 позволяет предложить для него структурную формулу З-амино-2 (либо 3)-гидроксипропионового альдегида в виде моно-ТМС-производного (табл. 3, V). Этот альдегид может образовываться из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина при его гидролитическом окислении.

Вещество с м.м. 248 (ТМС-производное) представляет собой, по-видимому, 2-гидроксимапоновый полуальдегид. Вероятно, он образуется аналогично предыдущему соединению из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина в результате его гидролитического дезаминирования (табл. 3, VI).

Таблица 3.

Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина {Лг&гоЬаМег Бр. КМ-Р)

Соединения Структура соединений m/z Интенсивность в % К максимальному пику Процесс образования фрагмента

Дигидрокси-пиридин (I) ОН 111 109 83 82 71 55 12 11 74 29 100 46 М М-2Н М-СО М-СНО М-С2Н2Ы М-2СО

2,3-дигидрок-сипиридин (моно-ТМС-производное) (П) СХо н 183 168 155 150 139 112 73 30 17 4 5 15 4 100 М М-СН3 М-СО М-СН3-Н20 М-СНз-СНО М-СНз-СНО-НСЫ 81(СНз)з

2,6-дигидрок-си-1,2-дигид-ропиридин (бис- ТМС-производное) (III) н в1(СН3)3 257 215 185 145 129 103 73 30 87 72 100 16 33 72 М М-СН2-СО (М-<СНз)г81СН2) = А А-С3Н4 А-С2Н21МО а-с3н4мсо Б](СНз)з

2,6-дигидро-ксипиридин (бис-ТМС-производное) (IV) О N ОБ! (СН3)3 (СН3)3 255 240 225 156 103 96 73 7 10 38 14 58 15 100 М М-СНз М-2СН3 М-СНСОЗКСНз)2 СН2ОЗКСНз)з М-2СНз-81(СНз)з-2СО 81(СН3)з

З-амино-2-ги-дроксипропи-оновый аль-д (ТМС-произ-водное) (V) амв] \ о. ^сно ^сн н21ч ЫН2 161 146 118 116 103 75 73 2 80 38 20 65 100 50 М М-СНз М-СНз-СО М-СНз-СН2ЫН2 М-2СНз-СО (СНз)2 БЮН 81(СНз)з

248 5 М

233 2 М-СНз

2-гидрокси- 218 30 М-2СН3

малоновый СООЭМе., 205 85 М-СНз-СО

полуаль-д. (ТМС-производное) (VI) 1 СН-О-вМе, 1 189 147 117 40 68 50 м-сн3-со2 (СНз)З8Ю8!(СНЗ)2 С0051(СНз)з

сно 103 20 (СНз)з ЭЮСНг

89 9 (СВДз&О

73 100 51(СНз)з

273 16 М

5-амино-2-ок-со-4-пентено- 258 10 М-СНз

229 6 М-СНз-СНО

[Гт 228 6 М-СН3-СН20

воя к-та (бис-ТМС-произ-водное) (VII) С003|(СН)з 214 156 4 62 М-СН3-СО2 М-СОО$1(СНз)з

1 &(СИ)з 147 52 (СНз)з 8>СЩСНз)2

117 4 СООБКСНзЪ

102 4 С0051(СНЗ)2

73 100 51(СНз)з

129 86 М

111 16 М-Н20

2,3,6-тригид- 101 16 М-СО

.он 95 28 М-20Н

рокси-5,6-ди- ££ 84 100 М-Н20-НСЫ

гидропиридин (VIII) 60 52 М-СО-СНСО(С2Н6МО)

но он 56 82 СзН40(С202)

45 83 с2н5о

44 86 С2Н40

369 4 м

0 368 6 м-н

о 339 2 м-н-нсо

313 4 М-2СО

299 3 м-ж2о2

297 3 м-н-ныс2о2

о 284 5 (М-ШСО-КСО )=А

пигмент 256 13 (А-СО) = В

аз&хиноновой о 255 5 (М-2Н1ЧСО-СО)=В

природы (IX) 239 7 Б-ОН

237 5 в-н2о

236 7 в-н2о-н

213 7 (А-НЫСО-СО) = г

200 4 Б-2СО

199 5 Б-СО-СНО

185 10 Г-СО

71 40 с2нш2

55 100 С2ИКО

О 293 3 М

II НО „С 218 20 M-OSi(CH3)2

бис-ТМС- 1 OSiMe3 205 45 (M-NHSi(CH3)3 )=А

II н О 191 5 M-CH3NSi(CH3)3

производное 177 5 M-(CH3)3SiNHCO

полуамида винной кислоты (X) 147 60 HOCHCOOSi(CH3)3

/33 129 8 9 A-Si(CH3)jCH2 A-<CH3)2SiHOH

117 28 COOSi(CH3)3

103 31 CH2OSi(CH3)3

73 100 Si(CH3)3

5.2. Превращение 2- и З-гидроксмпиридмнов штаммом Art/itrobacter sр. КМ-Р.

Полагая, что 2- и 3-гидроксипиридины являются одними из интермедиатов начального пути деградации пиридина штаммом Arthtrobacter sp. КМ-Р, была проверена способность штамма расти на этих субстратах. Культура не росла на гидроксипиридинах (0,5-1,0 г/л), хотя клетки оставались жизнеспособными длительное время. Внесение в среду пиридина (до 0,3 г/л) стимулировало потребление гидроксипиридинов и рост биомассы. При хроматографировании экстрактов КЖ, выросшего на 2-гидроксипиридине штамма, кроме исходного соединения были обнаружены два вещества, окрашивающиеся 2,4-ДНФГ, и также пигмент интенсивно голубой окраски.

Хроматомасс-слектральный анализ показал, что оба вещества, дающие реакцию с 2,4-ДНФГ, имели м.м. 129. Масс-спектральный распад одного из них соответствовал структуре 2,3,6-тригидрокси-5,6-дигидроксипиридина (табл. 3, VIII), который является продуктом гидратации 2,3-дигидроксипиридина.

Распад второго вещества, с такой же м.м., позволил идентифицировать его как 5-амино-2-оксо-4-пентеновую кислоту (табл. 3, VII), которая является продуктом гидролиза 2,3-дигидроксипирдина. Такая структура полностью подтверждается данными ИК-спектра, в которой наблюдали полосы поглощения в области 1680 см"1 (vc=0), 1600 см'1 (vc=0) и размытую полосу 3400 см'1 (Vmh+cooh)-

Данные масс-спектра голубого пигмента (м.м. 369) говорят о том, что он имеет азахиноновую структуру. В масс-спектральном распаде этого пигмента наблюдались многократные потери молекул СО, NCO, HNCO, Н20, что характерно для таких полиненасыщенных хиноноподобных структур. Крайне малые количества этого вещества не позволили проанализировать его с помощью других физико-химических методов исследования. Можно предположить, что обнаруженный нами голубой пигмент является продуктом конденсации трех молекул тригидроксипиридина (табл. 3, IX).

Продукты трансформации 2-гидроксипиридина, обнаруженные хроматомасс-спектрометрически в КЖ после предварительного хроматографического разделения на пластинке с последующим бистриметилсилилированием образцов, включали вещества с м.м. 183, 227, 273 и 293. Первое вещество по Rf (5,5 мин) и масс-спектральному распаду, отличалось от моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина (Rf= 5,29 мин), который имеет такую же м.м. Такая малая величина времени удерживания на хроматограмме может соответствовать только моно-ТМС-производному 2,6-дигидроксипиридина, так как Rf для моно-ТМС-производных 2,3-, 3,4- и 2,5-дигидроксипиридинов близки между собой, но резко отличаются от Rf 2,6- производного.

Соединение с м.м. 273 соответствовало бис-ТМС-производному 5-амино-2-оксо-4-пентеновой кислоты (табл. 3, VII). Масс-спектральная фрагментация вещества с м.м. 293 позволила предположить для него структуру бис-ТМС-производного полуамида винной

кислоты (табл. 3, X). Появление этого соединения в КЖ можно объяснить как результат раскрытия 2,3,6-тригидроксипиридина с последующим дигидроксилированием полуамида малеиновой кислоты.

Как и в опыте с 2-гидроксипиридином, добавление пиридина индуцировало потребление 3-гидроксипиридина штаммом Аг1ЫгоЬас1ег Бр. КМ-Р.

Анализ экстракта КЖ с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе 1 показал, что кроме исходного 3-гидроксипиридина он содержит еще несколько полярных веществ с близкими значениями ЛГ Смесь этих веществ была выделена с помощью препаративной колоночной хроматографии и обработана бис-(триметилсилилтрифтор)-ацетамидом. При хроматомасс-спектральном анализе этой смеси были обнаружены четыре вещества с м.м. 183, 227, 293 и 219. Первое соединение соответствовало по величине КГ и масс-спектру моно-ТМС-производному 2,3-гидроксипиридина, а два других с м.м. 227 и 293 соответствовали бис-ТМС-производным 2-гидроксипиррола и полуамида винной кислоты. Для вещества с м.м. 219, основываясь на данных его масс-спектра, можно предположить структуру бис-ТМС-производного аминоуксусной кислоты. Появление последнего в КЖ можно объяснить окислительно-восстановительными превращениями 5-амино-2-оксо-4-пентеновой кислоты, хотя присутствие глицина может иметь неспецифический характер.

Суммируя все вышеизложенное, путь катаболизма незамещенного пиридина штаммом Аг!ЫгоЬас1ег ер. КМ-Р можно представить следующим образом (рис. 17).

Х^соон

V н ™

VII

Рис. 17. Катаболизм пиридина (I) штаммом АгЛгоЬаЫег Бр. КМ-Р II - 3-гидроксипиридин; III - 2-гидроксипиридин; IV - 2,5-дигидроксипиридин; V - 2,3-дигидроксипиридин; VI - 2,3,5-тригидроксипиридин; VII - 5-амино-2-оксо-4-пентеновая кислота; VIII - янтарный полуальдегид; IX - пигмент азахиноновой структуры.

5.3. Анализ и идентификация продуктов деградации 2-МП штаммом АгЛгоЬаШт ер. КМ-2МР. Анализ хроматограмм кислых дихлорметановых экстрактов, полученных из проб, отобранных через 6, 12, 18, и 22 часа роста АгЛгоЬаЫег ер. КМ-2МР, отражает динамику изменений в составе продуктов биодеградации 2-МП (рис. 18).

Рис. 18. Хроматограммы (ГХ-МС) кислых экстрактов КЖ в процессе роста АпкгоЬааег ер. КМ-2МР на 2-МП (а-6, 6-12, в-18; г-22 часа).

Наблюдается уменьшение количества исходного 2-МП до практически полного его исчезновения (рис 18 а-с, пик I), параллельно с возрастанием количества бутанона-2 (пик 2), 4-оксопентановой кислоты (пик 9) и других продуктов (пики 3-8 и 10-15). Процесс интерпретации масс-спектров оказался не столь простым. Масс-спектры лишь нескольких продуктов трансформации 2-МП были представлены в компьютерных библиотеках масс-спектров (гидрокси-2-МП, 4-оксопентановая кислота, бутанон-2). Спектры остальных соединений были идентифицированы вручную с использованием известных направлений распада органических соединений в условиях электронной ионизации (ЭИ) [Лебедев, 2003] и представлены в таблице 4

Таблица 4.

Основные интермедиа™ деградации 2-метилпиридина (в % от массы внесенного субстрата)

R.T. 6 12 18 22 часа

ff Название (мин ) m/z часо в часо в часо в

1 2-метилпиридин 5,40 93 78,9 63,6 9,69 0,57

2 2-бутанон 5,52 72 7,55 46,5 12,3

3 5-метил-2(ЗН)-фуранон 5,65 98 0,38 0,28 0,34

4 бутиролактон 6,10 86 0,06 0,64 0,64

5 2(ЗН)-фуранон 6,15 84 0,15 0,43

6 5-метил-2(ЗН)-дигидрофуранон 6,45 100 0,09 0,04 0,11 1,44

7 N-ацетилпиррол 6,52 109 18,2 12,1 10,6 0,01

8 М-формил-2-метилпиррол 6,57 109 1,86 6,44 5,32 0,13

9 4-оксопентановая кислота 7,25 116 0,8 2,11 39,0

10 дигидрокси-2-метилпиридин 7,75 125 0,32 0,11 0,45

11 дигидрокси-2-метилпиридин 7,81 125 0,36 2,01 2,04 10,7

12 тригидрокси-2-метилпиридин 7,93 141 0,18 1,9 1,92 1,05

13 3.6-дигидрокси-3.4-ди гидро-2-метилпиридин 7,95 127 0,02 3,05 1,15 21,2

14 дигидрокси-2-метилпиридин 8,05 125 1,28 6,27 3,32

15 дигидрокси-2-метилпиридин 8,30 125 0,05 0,3 1,26

16 дигидрокси-2-метилпиридин 8,35 125 0,25 0,17 0,51

Одним из интенсивных на хроматограммах был пик вещества с tyÄ = 6,52 мин (рис. 18, пик 7). Его м.м. (109Да) совпадала с ожидаемой для гидрокси-2-МП как первичного продукта окисления исходного субстрата, однако такие гидроксипроизводные характеризуются существенно большими временами выхода. Библиотека масс-спектров также не предложила приемлемого варианта. Масс-спектр этого вещества (рис. 19, А), характеризовался интенсивным пиком молекулярного иона с m/z 109. Ион с m/z 67 образуется при элиминировании из М+' нейтральной частицы с массой 42 Да. Наиболее вероятной нейтральной частицей является молекула кетена, выброс которого может происходить, если в молекуле присутствует ацетильный фрагмент. Дальнейший распад иона с m/z=67 соответствовал фрагментации пиррола. Исходя из этого, было предположено, что вещество в пике 7 представляет собой N-ацетилпиррол

Рис. 19. Масс-спектры выделенного из КЖ (А) и синтезированного (Б) М-ацетилпиррола.

Для подтверждения образования Ы-аистилпиррола как одного из интермедиатов деградации 2-МП, он был синтезирован. Масс-спектры синтезированного соединения и обнаруженного в экстрактах КЖ оказались полностью идентичны (рис. 19, Б).

Таким образом, доказано наличие Ы-ацетилпиррола среди продуктов биодеградации 2-МП. Предполагаемый путь образования Ы-ацстилпиррола - раскрытие гидроксилированного пиридинового кольца между С-2 и С-3 атомами с последующей реакцией конденсации по атомам N и С (рис. 20). Такой разрыв связи в химической реакции может быть затруднительным, но энзиматическая реакция весьма вероятна.

^он

^СН,

сн

/О

ш хн3

•ел — и

N ^он N

Рис. 20. Предполагаемый путь образования >1-ацетилпиррола.

Вещество в пике 8 с 1уд = 6,57 мин и м.м. 109 Да могло быть одним из изомеров моногидрокси-2-МП (рис. 18, пик 8). В связи с тем, что по масс-спектральному распаду невозможно установить точную структуру изомеров гидрокси-2-метилпиридина, для идентификации этого интермедиата были проанализированы масс-спектры коммерческих препаратов 6-гидрокси-2-МП и 5-гидрокси-2-МП, а также специально синтезированного 3-

гидрокси-2-МП. Времена удерживания оказались следующими: З-гидрокси-2-МП = 10,00 мин; 5-гидрокси-2-МП = 10,40 мин; б-гидрокси-2-МП = 10,58 мин; т.е. на 3-4 минуты превышали tyil вещества из КЖ. Анализ масс-спектра определяемого вещества в пике 8 дал возможность предположить структуру 1Ч-формил-2-метилпиррол& Масс-спектр этого соединения (рис. 21) в компьютерных базах данных и в литературе отсутствовал. В условиях ЭИ от М-формил-2-метилпиррола отщепляется молекула СО и образуется М+'2-метилпиррола (m/z=81). Дальнейший распад связан с последовательным элиминированием атома водорода (m/z 80) и молекулы HCN (m/z 53).

а ж

l'C'O 1SQQ

41 00 4ЯЛ0

35 40 45 50 55

Tm.WУм ,

65 70 75

Рис. 21. Масс-спектр ЭИ N-формил-2-ме-тилпиррола.

¡00 91 00 9300 0700

1С6 00

1WÜ0 I I

jjgcn:

105 110 115 120

Ещё одним косвенным доказательством в пользу структуры >1-формил-2-метил-пиррола было его Цл = 6,57 мин, близкое к 1,д = 6,52 мин для Ы-ацетилпиррола. Можно предположить, что образование М-формил-2-метилпиррола при биодеградации 2-МП осуществляется по механизму, аналогичному для образования Ы-ацетилпиррола, но с энзиматическим раскрытием пиридинового кольца между 5 и 6 атомами углерода и последующей конденсацией по атомам N и С (рис. 22).

сн3

.сн

СН, HCT ^N'

^СН О^ ^NH

U1-

Рис. 22. Предполагаемый путь образования К-формил-2-метилпиррола

При дальнейшем анализе кислых экстрактов КЖ (рис. 18, пики 10,11,14-16) был обнаружен ряд изомеров с м.м. 125 Да и следы соединения с м.м. 141 (пик 12). В спектрах соединений с м.м. 125 Да присутствовали пики фрагментных ионов, свидетельствующие о наличии в их составе фенольных гидроксилов. Это позволило предположить, что данные

соединения являются изомерами дигидрокси-2-МП. Установление положения гидроксильных групп без наличия стандартных образцов невозможно. Количество двух изомеров с м.м. 125 Да в смеси было велико, они обнаруживались во всех кислотных экстрактах (3-22 ч) тогда как количество остальных трех изомеров было мало, они определялись только в 12, 15 и 18 часовых экстрактах. Нельзя исключить, что эти соединения являются гидроксилсодержащими пирролами, которые с потерей молекулы воды превращаются в соответствующие зарегистрированные пиррольные структуры (рис. 20 и 22). Анализ масс-спектра соединения 12 (рис. 18) с tyn =7,93 мин (м.м.141 Да), следы которого были обнаружены в 12 и 15 часовых экстрактах КЖ, позволил предположительно идентифицировать его как тригидрокси-2-МП (рис. 23).

Рис. 23. Масс-спектр ЭИ три-гидрокси-2-МП.

, SOB2

I" » I

100

iOt 109

I 141

128 137 | 143

15° m/z

Для подтверждения предполагаемых структур и обнаружения других интермедиатов, содержащих ОН-группы, было проведено их силилирование в дихлорметановых экстрактах КЖ. Триметилсилильные производные изучаемых соединений имели характерные пики в масс-спектрах, что облегчало их идентификацию. Этот подход позволил детектировать соединение, с m/z 181 и tM = 10,12 мин (рис. 24). Масс-спектр этого вещества был найден в базе данных и соответствовал триметилсилильному производному гидрокси-2-МП. Однако масс-спектральный распад не позволяет однозначно отнести обнаруженное соединение к или З-гидрокси-2-метил-, или 5-гидрокси-2-метилпиридину.

Рис. 24. Масс-спектр ЭИ силильного произвоного гидрокси-2-МП.

&шыж

.Tfflff, "i", .TS

Хотя нами не был однозначно детектирован 5-гидрокси-2-МП в качестве интермедиата, однако обнаружение как 4-оксопентановой кислоты, так и >1-формил-2-метилиррола подтверждает образование этого соединения при деградации 2-МП.

Как следует из вышеизложенного, нами представлены в основном соединения первичных стадий трансформации метаболизма 2-МП: М-ацетилпиррол, 4-оксопентановая кислота, М-формил-2-метилпиррол, Ы-формил-2-гидрокси-2,3-дигидро-4-метилпиррол, изомерные дигидрокси-2-МП, тригидрокси-2-МП. Далее пиррольные производные расщепляются с образованием пиррола и последующим раскрытием кольца с отщеплением молекулы аммиака и образованием молекулы 1,4-бутандиола, который после ряда стадий окисляется до С02. 4-Оксопентановая кислота декарбоксилируется с образованием 2-бутанона, который окисляется сначала до 2-оскопропановой кислоты, а затем до щавелевой кислоты. Основная масса дигидрокси-2-МП подвергается дальнейшему гидроксили-рованию с образованием тригидрокси-2-МП, который в свою очередь служит субстратом для образования пигмента азахиноновой структуры.

Рис. 25. Катаболизм 2-метилпиридина (I) штаммом Arthrobacter sp. КМ-2МР. II - З-гидрокси-2-метилпиридин; III - 5-гидрокси-2-метилпиридин; IV - 3,6-дигидрокси-2-метилпиридин; V - 5,6-дигидрокси-2-метилпиридин; VI - 3,5,6-тригидрокси-2-метилпири-дин; VII - пигмент азахиноновой природы; VIII - Ы-формил-2-метилпиррол; IX - N-ацетилпиррол; X - 4-оксопентановая кислота.

Такие соединения, как 1,4-бутандиол, 2-бутанон, 2-оскопропановая и щавелевая кислоты, обнаруживались во всех кислых экстрактах после 15 часов культивирования бактерий на 2-МП. Этот факт подтверждает полную деградацию 2-МП Arthrobacter sp. КМ-2МР.

В литературе описаны случаи образования пигментов диазадифенохиноновой природы при окислении соединений пиридиновой природы, например, в процессе метаболизма 2-гидроксипиридина бактериями Arthrobacter crystallopoietes [Kolenbrander Weinberger, 1977]. Пигмент образовывался при автоокислении 2,3,6-тригидрокси-пиридина. Предполагают, что это соединение является одновременно интермедиатом деградации пиридинового кольца и предшественником пигмента [Jiwu et all., 2009].

Предполагаемые пути катаболизма 2-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-2МР.

Суммируя полученные данные о структуре образующихся интермедиатов (рис. 25), можно сделать вывод, что штамм осуществляет катаболизм 2-МП в результате реализации несколько необходимых и обязательных реакций.

1. Катаболизм 2-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-2МР начинается с гидроксилирования пиридинового кольца в 3 или 5 положениях, с образованием гидрокси-2-МП (II или III).

2. В результате раскрытия кольца З-гидрокси-2-МП (рис. 25, И) по связи С2 - СЗ, образуется интермедиат, содержащий карбонильную группу в четвёртом положении от атома азота, что даёт ему возможность замыкаться в пятичленный цикл, с образованием N-ацетилпиррола (рис. 25, IX). Раскрытие кольца 5-гидрокси-2-МП между С-5 и С-6, аналогично, приводит к образованию Ы-формил-2-метилпиррола (рис. 25, VIII). Таким образом, образуются N-карбонилпиррольные производные, которые в дальнейшем подвергаются как окислению, так и восстановлению. Такой путь показан впервые.

3. Гидрокси-2-МП (рис.25, II и III) окисляются в дигидрокси-2-МП (рис.25, IV и V). При раскрытии цикла на этом этапе, образуется 4-оксопентановая кислота (рис.25, X). Тригидрокси-2-МП (рис.25, VI), образующийся при дальнейшем окислении дигидрокси-производного, в свою очередь быстро конденсируется с образованием пигмента азахиноновой природы (рис. 25, VII).

5.4. Анализ и идентификация продуктов деградации 4-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-4МР. Хроматографирование (ТСХ) щелочного экстракта КЖ показал появление в ней вещества с Rf = 0,38 (система 2). Соединение было выделено в индивидуальном состоянии. При обработке раствором FeCl2 оно окрашивалось в желтый цвет, что говорило о возможном присутствии ОН-группы в положении 2- или 4-пиридинового кольца [Watson et al., 1974].

При подщелачивании этанольного раствора выделенного вещества, максимум поглощения (Я. тах = 295 им) не сдвигался в длинноволновую область спектра, что также свойственно для 2- и 4-гидроксипиридина [Klinsberg, 1962].

Характерную для 2-гидроксипиридина полосу поглощения в области 1660 см наблюдали в ИК-спектре [Schofield, 1967]. В масс-спектре анализируемого соединения наблюдался интенсивный пик молекулярного иона, последующая фрагментация которого приводила к образованию фрагментов 109(100)М+', 81(Ю)(М-СО)+, 80(54)(М-НСО)+, и 53(17)(M-HCO-HCN)+, характерных для гидроксипиридинов.

В спектре ЯМР образца этого вещества, снятого в CDC13 (стандарт ТМС внутренний), наблюдался дублет протона в 6-ом положении пиридинового кольца с химическим сдвигом 6,37 м.д. (J56 = 6,6Гц), уширенный синглет протона Н-3 с

химическим сдвигом 6,37 м.д., дублет дублетов протона Н-5 с химическим сдвигом 6,12 м.д. Уз 5 = 1,7 Гц, 15 6 = 6,6Гц) и синглет трех протонов метальной группы с химическим сдвигом 2,23 м.д. На основании совокупности спектральных данных структура выделенного интермедиата определена как 2-гидрокси-4-МП (рис.26, II).

Пигментирование ЮК при росте штамма на 4-МП отличалась от такового при росте на 2-МП и 2,6-ДМП. Анализ (ТСХ) КЖ с нейтральной рН выявил наличие голубого и розового (КГ = 0,69; ЯГ = 0,8 в системе 2) пигментов, которые препаративно были выделены. Количество розового пигмента оказалось недостаточным для его идентификации. По данным масс-спектров химической ионизации (т/г): 259(100)(МН)+, 242(15ХМН-ОН)4", 224(4)(МН-0Н-Н20)+', 215(5)(МН-ОН-ПСЫ)+, 168(72)(МН-ОН-Н20)+', голубой пигмент, возможно, имел структуру замещенного диазафлуорена, который мог образоваться из соответствующего диазахинона в результате ферментативной дегидратации (рис. 26, VI).

Рис. 26. Катаболизм 4-метилпиридина (I) штаммом Arthrobacter sp. КМ-4МР. II - 2-гидрокси-4-метилпиридин; III - З-гидрокси-4-МП,

IV - 4-(Ы-ацетиламино)-2-оксо-пентен-3-овая кислота;

V - метилмалеиновая кислота; VI - пигмент диазафлуореновой природы.

Химическая литература конца XX века содержит сведения об образовании пигментов интенсивно голубой и слабо-голубой окраски при окислении соединений пиридиновой природы, к которым применили групповое название "азахиноны" [Ensign et al., 1963]. Образование голубых пигментов наблюдали в процессе метаболизма никотиновой кислоты микроорганизмами рода Bacillus [Ensign et al., 1965], никотина [Holmes et al., 1975], 2-гидроксипиридина штаммом A. crystallopoietes [Ensign et al., 1963], тремя видами Arhtrobacter [Kolenbrander, 1977]. Для артробактера, утилизирующего 2-гидроксипиридин, характерно образование голубого пигмента диазадифенохиноновой

розовый пигмент

природы [Knackmuss, 1962; Gupta, 1975]. Известно, что он образуется при автоокислении 2,3,6-тригидроксипиридина. По видимому, это соединение является одновременно интермедиатом пути деградации пиридинового кольца и предшественником пигмента [Ensign et al., 1965]. На основании этих данных мы предположили, что розовый и голубой пигменты, образуемые выделенным нами штаммом Arthrobacter sp. КМ-4МР, являются продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-МП и 2,3,6-тригидрокси-4-МП соответственно (рис. 26, VI).

Хроматограммы кислых экстрактов КЖ были обработаны спиртовым раствором бомкрезолового зеленого. Наблюдали проявление желтых пятен на синем фоне, что свидетельствует о наличие карбоновых кислот специфического строения. Действительно, на хроматограмме было обнаружено соединение, Rf которого (Rf = 0,15, система 3) был идентичен Rf метилмалеиновой (цитраконовой) кислоты (Rf = 0,17). Клетки Arthrobacter sp. КМ-4МР потребляли цитраконовую кислоту в качестве единственного источника углерода без лаг-фазы.

Известно, что при раскрытии кольца 2,3,6-тригидроксипиридина образуется полуамид малеиновой кислоты, мапеиновая и фумаровая кислоты [Коростелева и др., 1981]. Можно предположить, что раскрытие 2,3,6-тригидрокси-4-МП аналогичным образом приведет к образованию полуамида метилмалеиновой и метилмалеиновой кислот. Присутствие в среде полуамида метилмалеиновой кислоты доказать не удалось. Участие в процессе метилмалеиновой кислоты было зафиксировано как прямыми, так и косвенными методами (рис. 26, V).

На основании полученных результатов экспериментальных исследований и литературных данных, предлагаем путь катаболизма 4-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-4МР (рис. 26).

5.5. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,6-ДМП штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP. При хроматографическом анализе экстракта 1 (щелочного) параллельно со снижением количества субстрата (Rf = 0,8, система 1) наблюдали появление вещества, хроматографическая подвижность которого на силикагеле (Rf = 0,43) соответствовала хроматографической подвижности (Rf = 0,42) 3-гидрокси-2,6-ДМП (табл. 5, II). Для этого соединения была характерна пурпурная окраска в реакции раствором FeCl2, что указывало на возможность присутствия ОН-группы в кольце пиридина.

При анализе экстракта 2 (нейтрального) была получена аналогичная картина, то есть появление вещества с Rf, соответствующего таковому 3-гидрокси-2,6-диметилпиридину.

При использовании тонкослойной препаративной хроматографии, данное соединение было выделено в индивидуальном состоянии в виде белых кристаллов, температура плавления которых (Т™ 200-2 Ю°С) идентична температуре плавления синтетического свидетеля. При доведении рН метанольного раствора выделенного соединения до 8,0 максимум поглощения вещества сдвигался в длинноволновую область спектра на 23 нм (288 нм при рН 7,0, против 311 нм при рН 8,0), что характерно для 3-гидроксипиридинов [Klinsberg, 1962]. Результаты масс-спектрального анализа выделенного образца (II) и синтетического свидетеля, представленные в таблице 5, подтвердили их идентичность. В спектре, помимо молекулярного иона наблюдались характерные для метилпиридинов (М-Н)+ ионы, а также ионы (М-СО)+ и (М-СНО)+, что доказывало наличие в структуре ароматической гидроксигруппы. Присутствие гидроксигруппы подтверждало также полоса поглощения 3510 см"1. В начальной фазе роста соединение присутствовало в следовых количествах. Максимальное накопление этого вещества, идентифицированного как 3-гидрокси-2,6-ДМП, наблюдалось к 15 ч роста; соединение полностью изчезало к 24 ч

культивирования. Таким образом, оказалось, что растущие клетки способны использовать это соединение (3-гидрокси-2,6-ДМП) в качестве ростового субстрата (табл. 5, II).

При хроматографировании экстракта 3 (кислого) было обнаружено соединение, дающее реакцию с 2,4-ДНФГ. Это вещество было выделено с помощью тонкослойной препаративной хроматографии в виде густого масла. После обработки его раствором 2,4-ДНФГ был получен дигидразон, повторно очищенный с помощью препаративной хроматографии на силикагеле в системе растворителей 5. Максимальное количество этого соединения накапливалось к 6-9 ч культивирования, затем содержание вещества в КЖ постепенно уменьшалось по мере роста культуры.

На основании масс-спектрального распада бисгидразона, его идентифицировали как бис-2,4-ДНФ-гидразон ацетилпировиноградной кислоты (табл.5, IV). Присутствие в КЖ кетокислоты такого строения указывало на то, что пиридиновое кольцо, предположительно содержащее две ОН-группы, раскрывалось между вторым и третьим атомами углерода. В результате, возможно, появлялось соединение 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП (табл.5, III).

Таблица 5.

Масс-спектры соединений, интермедиатов распада 2,6-диметилпиридина (Arthrobacter sp. KM-2.6DMP)

Соединения Масс-спектры m/z, (I %) ИК- спектры vcm'1 УФ- спек тры Ä-max. HM

3-гидрокси-2,6-ДМП (П) 123(73)М\ 122(12)(М-Н)+, 108(6)(М-СН3)+, 95(20)(М-С0)+, 94( 100)(М-СНО)+, 81 (7)(MCH3-HCN)+, 80(11)(М-СН3-СО)+ 3510 pH 7,0 288 pH 8,0 311

3,4-дигидрокси-2,6-ДМП (III) 139(51)+(М), 111(20)(М-С0)+ , 110(ЮО)(М-СНО)+, 96(7)(М-СО-СН3)\ 95(5)(М-СНО-СН3)+ 3525 3490 pH 7,0 276 pH 9,0 302

2,4-динитро-фенилгидразон ацетил-ПВК (IV) 491(2)(МН)+, 474(2)(МН-ОН)+, 447(2)(МН-СОа)+, 266(19)(CH2-C(COOH)-N2-Ar*)+, 237(9)(CH3-C(CH2)-N2H-Ar)+, 223(9)(CH3-C=N+-NH-Ar), 183(42)(NHrAr)+182(100)(NH-Ar)+, 167(35)(Ar)+ - -

Ar - 2,4(NC2)2C6H3

Однако ни в КЖ штамма, растущего на 2,6-ДМП, ни в суспензии покоящихся клеток в присутствии данного субстрата дигидроксипроизводное пиридина выявлено не было. Его удалось обнаружить в следовых количествах в КЖ той же культуры, растущей на 3-гидрокси-2,6-ДМП, и при деградации 3-гидрокси-2,6-ДМП суспензией клеток, выращенных на 3-гидрокси-2,6-ДМП. В обоих случаях наблюдали снижение концентрации внесенного субстрата и появление нового вещества с ЯГ = 0,4 (в системе 2), соответствующего КГ 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП. Вещество было выделено с помощью тонкослойной препаративной

хроматографии и по физико-химическим свойствам (УФ-спектр: X тах = 276 нм при рН 7,0 и X max = 302 нм при рН 9,0; масс-спектральный анализ) идентифицировано как 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП (таблица 5, III).

Образование аммиака не наблюдалось ни в растущей культуре с 2,6-ДМП, ни в суспензии покоящихся клеток с 3-гидрокси-2,6-ДМП. На основании строения выделенных интермедиатов, можно предположить, что азот включается в состав двухуглеродного фрагмента - ацетамида, образующегося при гидролизе ацетил-ПВК (табл. 5, IV). Ацетамид не был обнаружен в КЖ, возможно, потому что культура хорошо росла на этом субстрате, используя его в качестве единственного источника углерода и азота.

Итак, первой реакцией ферментной системы выделенного нами штамма являлось гидроксилирование кольца 2,6-ДМП.

Раскрытие кольца в данном случае может протекать так, как это описано для деградации 3,4-дигидроксипиридина штаммом Agrobacterium sp.[Watson et all., 1974].

На основании полученных результатов экспериментальных исследований и литературных данных, предлагаем путь катаболизма 2,6-ДМП штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP (рис. 27).

СООН

h2nwCH3

Н*С О IV

с Н20 СН3СООН +

со2 + Н20

Рис. 27. Катаболизм 2,6-метилпиридина (I) штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP II - 3-гидрокси 2,6-ДМП; III - 1,3-дигидро-4-оксо-2,6-ДМП; IV - ацетилпировиноградная кислота; V - ацетамид.

5.6. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом R. wratislaviensis КМ-Р. При хроматографировании щелочного экстракта КЖ штамма, растущего на пиридине, был выделен образец, который по данным хроматомасс-спектрального анализа содержал два вещества. Масс-спектральный распад вещества с м.м. 97 (табл. 6,1), позволяет интерпретировать его как продукт гидратации пиридина. В масс-спектре второго вещества наблюдается пик молекулярного иона с м.м 95, что соответствует моногидроксипиридину. с( -пиридону) (табл. 6, II). Такая структура полностью подтверждается масс-спектральным распадом моно-ТМС-производного этого соединения: фрагментация вещества 167 была идентична таковой моно-ТМС-производного синтетического свидетеля 2-ГП.

При хроматографировании кислого экстракта был получен образец, который анализировали в виде его ТМС-производного. В его масс-спектре наблюдался пик с м.м.

257. Такие м.м. и фрагментация могут соответствовать продукту гидратации 2-гидрокси-пиридина в виде бис-ТМС-производного. По хроматографической характеристике и по масс-спектральному распаду наиболее вероятной для этого соединения является структура 2,6-дигидрокси- 1,2-дигидропиридина (см. табл. 3, III).

Таблица 6.

Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина (Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р)

Соединение

Структура соединения

m/z

Интенсивность

в % к максимальному иону

Процесс образования фрагмента

Гидрат Пиридина

(I)

97 95 80 79 59 52 43

19 13 70 64 100 41 76

М М-2Н М-ОН М-Н20 М-СзН2

m-h2o-hcn

hocn

2-гидрокси-пиридин (И)

95 78 67 52 43

24 84 22 70 100

М-ОН М-СО m-hocn hocn

4-карбонил-

амино-3-бутеновая к-та(бис ТМС-производное)

(Ш)

fi^COOSifCHj);

Si(CH3)3

273 258 230 202 156 147 73

2 16 12 4 100 10 32

М-СНз

М-СНз-СО

М-СН3-2СО

M-COOSi(CH3)3

(CH3)3SiOSi(CH3)2

Si(CH3)3_

амид ß-гидроксипро-пионовой к-ы

(бис-ТМС-производное) (IV)

CH2-0-Si(CH3)3

N-Si(CH3)3 Н

233 218 202 130 116 73

4 100 16 19 2 8

М-СНз

М-ОСНз

M-CH2OSi(CH3)3

(CH3)SiNHCO

(CH3)3Si

2,6-дигидрок-сипиридин(моно -ТМС-производное) (V)

183 168 155 150 139 112 100 95 81 73

25 24 6 2 9 4 3

4 100

М-СНз М-СО

м-сн3-н2о

М-СНз- сно

М-СНз-CHO-HCN

(CHshSiOCN

M-OSi(CH3)2CH2

M-CHOSi(CH3)3

Si(CH3)3_

В другом хроматографическом пике, на основании м.м. 233, и данных спектрального распада, соединение идентифицировано как амидР-гидроксипропионовой кислоты в виде бис-ТМС-производного, которое может образоваться в результате гидроксилирования таутомерной формы этого же соединения по кратной связи с последующим ее разрывом (табл. 6, IV). Кроме того, в экстрактах КЖ R. wraiislaviensis КМ-Р были обнаружены два вещества, которые изучали в виде ТМС-производных. Одно из соединений, с м.м. 183, по Rf = 5,5 мин и масс-спектральному распаду, соответствовало моно-ТМС-производному 2,6-дигидроксипиридина (табл. 6, V). Второе вещество, с м.м. 273, и длительным временем выхода на хроматограмме (11,30 мин), по масс-спектру соответствовало бис-ТМС-производному 4-карбониламино-З-бутеновой кислоты (табл. 6, III).Эта кислота может образоваться из 2,6-дигидроксипиридина путем гидролитического расщепления по C-N связи.

Рис. 28. Катаболизм пиридина (I) штаммом бактерий Rhodococcus wraiislaviensis КМ-Р II - 2-гидрат пиридина: III - 2-гидроксипиридин; IV - 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропири-дин; V - 2,6-дигидроксипиридин; VI - 4-карбониламино-З-бутеновая кислота; VII - амид ß-гидроксипропионовой кислоты; VIII - карбаминовая кислота.

При росте R. wraiislaviensis КМ-Р на синтетической среде с 2-гидроксипиридином потребление субстрата и накопление биомассы происходило только после добавления пиридина (0,3 г/л). Хроматомасс-спектральный анализ ТМС-производных продуктов, выделенных из экстрактов КЖ, позволил идентифицировать вещества с м.м. 183, 273 и 233, которые по своим характеристикам соответствовали соединениям: моно-ТМС-производному 2,6-ДГП (табл. 6, VII), бис-ТМС-производным 4-карбониламино-З-бутеновой кислоты и амида ß-гидроксипропионовой кислоты (табл. 6, III и IV).

Итак, путь катаболизма пиридина штаммом бактерий R. wraiislaviensis КМ-Р можно изобразить следующим образом (рис. 28).

5.7. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,4-ДМП штаммом Rodococcus erythropolis 2.4DMP. Хроматографирование щелочного и нейтрального экстрактов показало убывание исходного субстрата (Rf = 0,7) параллельно с появлением нового вещества с Rf = 0,4. В начале роста (6 ч) оно присутствовало в крайне малых количествах, накапливалось в логарифмической фазе (18-20 ч) и убывало в стационарной фазе (30 ч). Препаративной тонкослойной хроматографией это соединение (рис. 29, II) было выделено. С раствором РеС12 оно давало розовое окрашивание, характерное для 3-гидроксипиридинов. В УФ-спектре выделенного образца в этаноле (pH 7,0) наблюдали поглощение с максимумом 275 нм, который при подщелачивании раствора до pH 9,0 сдвигался до 297 нм. Такой батохромный сдвиг на 22 нм характерен для гидроксипиридинов с ОН-группой в положении 3 пиридинового кольца [Klinsberg, 1962]. Окончательно строение выделенного вещества было установлено на основании данных спектра ЯМР, снятого в CDCI3 (стандарт ТМС внутренний). В спектре наблюдались синглет протона Н - 2 с химическим сдвигом 7,63 м.д., синглет протона Н - 5 с химическим сдвигом 7,00 м.д., и два трехпротонных синглета 4-СН3 и 6-СН3 - групп с химическим сдвигом соответственно 2,30 м.д. и 2,50 м.д. В спектре также присутствовал синглет протона ОН-группы в виде уширенного сигнала с химическим сдвигом 6,20 м.д. Структура соединения исследуемого соединения соответствовала данной картине.

На хроматограммах кислых экстрактов КЖ (система 2) после обработки раствором 2,4-ДНФГ в 2 н HCl в виде ярко-желтых пятен были обнаружены две карбоновые кислоты с Rf = 0,37 (IV) и 0.21 (V). Вещества были выделены, очищены с помощью препаративной хроматографии (система 4) на силикагеле и проанализированы в виде их 2,4-ДНФ-гидразидов. По результатам анализа масс-спектров одно из соединений, с большей хроматографической подвижностью, было идентифицировано как 5-(2,4-ДНФ-гидразид)-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота (IV). Другому соединению с меньшей хроматографической подвижностью на основании анализа его масс-спектра была приписана структура 3-гидрокси-5-(2,4-ДНФ-гидразида)-2-карбокси-4-формил-иминопентен-2-диовой кислоты (V). Соединения присутствовали исключительно в экстрактах КЖ культур логарифмической фазы роста. Дальнейшее превращение продуктов раскрытия кольца - 2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовой (IV) и 3-гидрокси-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовой (V) кислот, можно представить так, как это происходит для близко родственных по строению дикарбоновых кислот-а-(Ы-ацетиламинометилен) янтарной и а -гидроксиметил-а'-(Ы-ацетиламинометилен) янтарной кислот - продуктов раскрытия пиридинового кольца. Они образуются при деградации пиридоксамина штаммом Pseudomonas MA-I и пиридоксина штаммом Pseudomonas-IA [Huynh, 1985].

Хроматографический анализ кислых экстрактов КЖ в стационарной фазе роста показал присутствие еще одной карбоновой кислоты с Rf = 0,38, которая была выделена и проанализирована в виде ее бутилового эфира и идентифицирована как дибутиловый эфир 2,4-пиридинкарбоновой (лутидиновой) кислоты (III).

Таким образом, на основании анализа структур выделенных нами интермедиатов можно констатировать, что первичный процесс деградации 2,4-ДМП протекал как за счет гидроксилирования кольца с образованием 3-гидрокси-4,6-ДМП, так и в результате окисления метальных групп, приводящего к образованию лутидиновой кислоты.

сн3

соон

но.

он

соон

.он

соон

М'

соон

Рис. 29. Катаболизм 2,4-ДМП (I) культурой Л егуЛгороНв 2.40МР.

II - 3-гидрокси-4,6-диметилпиридин; III - лутидиновая кислота,

IV - 2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота;

V - 3-гидрокси-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота.

Строение двух выделенных трикарбоновых кислот свидетельствовало о раскрытии гидроксилированного пиридинового кольца, (у которого обе метальные группы были окислены до карбонильных групп) между С-5 и С-6 атомами углерода. Однако это не позволило установить, какой процесс являлся первичным - гидроксилирование кольца или окисление метальных групп. Поэтому процесс деградации 2,4-ДМП (I) можно представить следующим образом (рис. 29).

6. Деградация пиридина свободно растущими, суспензионными и иммобилизованными клетками Ап1ггоЪааег $р. КМ-Р. Анализируя кинетику утилизации пиридина свободно растущими клетками Аг1ИгоЬас1ег ер. КМ-Р (см. рис. 1), видно, что продолжительность лаг-фазы составляла около 3 часов. Начиная с 6 часов, наблюдалось интенсивное потребление субстрата, которое продолжалось вплоть до 21 часа роста. За это время культурой потреблялось до 90% внесенного субстрата при интенсивном накоплении биомассы. Таким образом, выделенный нами штамм обладает высокой утилизирующей активностью, является одним из наиболее перспективных штаммов-деструкторов и рекомендован для очистки сточных вод от пиридина.

Следует отметить, что, несмотря на высокую эффективность биологических способов очистки, использование микроорганизмов в очистных сооружениях приводит к накоплению больших объемов избыточной биомассы, которая также требует утилизации. Замена суспензии свободно растущих клеток на иммобилизованные клетки частично разрешает эту проблему. Хотя использование иммобилизованных клеток микроорганизмов открывает новые возможности биотехнологии, нельзя, тем не менее, обойти

молчанием трудности, которые возникают при замене свободно растущих клеток на иммобилизованные.

В качестве носителя для иммобилизации клеток АпИгоЬаМег ер. КМ-Р использовали Са-альгинатный гель. Выбор обусловлен относительно мягкими условиями иммобилизации, обеспечением иммобилизованных клеток питательными веществами и кислородом, а также возможностью отвода продуктов метаболизма, так как материал носителя не создает значительных диффузных препятствий массообменным процессам.

Время, ч Время, ч

Рис. 30. Деградация пиридина суспензионными (А) и иммобилизованными (Б) клетками АпИгоЬаМег эр. КМ-4. Концентрации пиридина: 1 - 1,5 г/л; 2 - 2,5 г/л; 3 - 3,0 г/л; 4 - 3,4 г/л.

Оценивали скорость утилизации пиридина суспензионными клетками и клетками, иммобилизованными в альгинате кальция (рис. 30, А и Б). В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях 1,5; 2,5; 3,0 и 3,4 г/л; по 8,3 мл суспензии клеток и по 25 мл гранул с клетками. Инкубацию на качалке (200 об/мин) проводили при 28-30°С. Пробы отбирали через 3 часа (1,5 г/л пиридина) и 6 часов (остальные концентрации).

Показано, что скорость утилизации пиридина была выше у суспензионных клеток, чем у иммобилизованных или свободно растущих клеток. Пиридин (1,5 г/л) полностью потребляется суспензионными клетками за 6 часов. Иммобилизованные клетки использовали эту концентрацию за 9 часов. Концентрация пиридина 2,5 г/л для растущих клеток была оптимальной, суспензионными клетками потреблялась за 12 часов, а иммобилизованными - за 18 часов.

Концентрация пиридина 3,0 г/л, при которой наблюдали лаг-фазу у растущих клеток, и 3.4 г/л, которая ингибировала рост штамма, суспензионными клетками утилизировалась почти за 18 часов, а 3.4 г/л - более 24 часов (рис. 30, А). Иммобилизованные клетки Аг1ИгоЬас1ег 5р. КМ-Р эти же концентрации субстрата (3,0 и 3,4 г/л) разрушали медленнее суспензионных клеток (рис. 30, Б), но значительно быстрее растущих клеток (рис. 30).

Таким образом, продемонстрирована эффективность использования суспензионных или иммобилизованных клеток Аг(ИгоЬас1ег эр. КМ-Р для деградации токсичного пиридина и его производных, присутствующих в очищаемой водной среде в высоких концентрациях (3,0-3,4 г/л).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование содержит сумму доказательств высокой биологической активности представителей немицелиальных актинобактерий, широко представленных в различных природных субстратах и обнаруживаемых в большом количестве в длительно консервированных глубокомёрзлых почвенных осадках. Штаммы, выделенные из почв, длительно подвергавшихся воздействию пиридинов, были идентифицированы как представители родов АгМгоЬаМег и НкоЛососсия. Они обладали не только широкой субстратной специфичностью в отношении соединений пиридинового ряда, но и способностью утилизировать высокие их концентрации со скоростью, существенно превышающей известные для мировых аналогов, что подтверждено сравнительным анализом полученных результатов и литературных данных и данных патентного поиска (табл. 7).

В связи с этим выделенные штаммы, не имеющие аналогов в мировой практике, рекомендованы для биотехнологий очистки от пиридиновых загрязнителей сточных вод и биоремедиации почв.

Таблица 7.

Микроорганизмы, утилизирующие пиридин и его производные

Штаммы-деструкторы Потребляемая концентрация пиридинов Ссылки

Corynebacterium sp. Brevibacterium sp. 2,0 г/л (2-5 сут) Shukla, 1973

Nocardia sp. Z1 10 ммоль/л (50 ч) Houghton, Cain, 1972

Nocardia sp. K.M-2 2,0 г/л (72 ч) Коростелева, 1981

Nocardioides pyridinolyticus OS4 0,1 г/л Yoonetal., 1997

Micrococcus luteus 0,8 г/л (48 ч) Sims et al., 1986

Shewanella putrefaciens 0,5 г/л (140 ч) Mathur et al., 2008

Azoarcus evansii pF6 0,2 г/л (60ч) Rhee et al., 1997

Alcaligenes sp. 0,1 г/л (44 ч) Ronen et al., 1991

Bacillus sphaericus 0,5 г/л (150 ч) Mathur et al., 2008

Pseudomonas putida MK1 0,5 г/л (168 ч) Kim et al., 2006

Pseudomonas pseudoalcaligenes 0,3 г/л Pandey et al., 2007

Arhtrobacter sp. KM-P 2,5 г/л (24 ч) Хасасва ii др., 2008

A rhtrobacter s p. KM-2.M P 2,5 г/л (24-0 Хасасва ii др.. 2008

Arhtrobacter sp. K.M-4MP 1.5 г/л (24 ч) Хасасва н лр , 2007

Arhtrobacter sp. 2.6DMP 3,0 г/л (24 ч) Хасасва ii ,ip , 2007

Rhodococcus wrathlaviensis KM-P 2.5г/л (24 ч) Хасасва п др., 2009

Rhodococcus ervthropnlis 2.4DMP 2,0 г/л (36 ч) Хасасва.н др., 2008

Rhodococcus opacus UFZ 0,21 г/ч Brinkmann et al., 1996

Rhodococcus opacus 1,5 г/л (48 ч) Zefirov et al., 1994

Rhodococcus pyridinivorans PDB9T 3,5г/л J.-H. Yoon et al., 2000

Rhodococcus sp. KCTC 0,07г/л (15 ч) J.W. Do et al., 1999

Paracoccus sp. BW001 2,6 г/л (50 ч) Yaohui et al., 2008

Gordonia terrea IIPN1 2,3 г/л (72 ч) Stobdan et al., 2008

Другой результат работы связан с выяснением метаболических путей биодеградации пиридинов. Отметим, что широко применяемая методология подобных исследований, основанная на изучении ферментов биодеградации определенных токсичных соединений, и показавшая блестящие результаты для разложения замещенных фенолов [Solyanikova, Golovleva, 2004; Travkin et al., 2006], оказалась непригодной для изучения разложения пиридинов. Объективной практикой была показана невозможность получения активных бесклеточных экстрактов и стабильно функционирующих выделенных и очищенных ферментов биодеградации пиридинов.

Нами был использован подход, основанный на выделении и идентификации современными методами химического и физико-химического анализов интермедиатов метаболизма пиридинов (как единственных источников углерода, азота и энергии) в динамике развития культур бактерий-деструкторов. Кроме того, выделенные препаративно интермедиа™ были, в свою очередь, использованы как единственные источники питания изучаемых бактерий. Отметим, что утилизация интермедиатов разложения незамещенного пиридина начиналась только при их соокислении с пиридином, который, по-видимому, является облигатным индуктором синтеза ферментов биодеградации пиридина.

Другой подход, дополняющий первый принцип, был построен на аналогии между предполагаемыми нами реакциями и уже известными для разрушения других циклических соединений [Huynh, Snell, 1985; Sims et al., 1986; Pandey et al., 2007; Mathur et al., 2008]. Совмещение этих подходов позволило идентифицировать интермедиа™ деструкции пиридинов и предложить обобщенную схему их разложения. Схема включает следующие необходимые этапы: 1) окисление гетероциклического кольца, а не его первоначальное восстановление, как это предполагалось ранее [Houghton, Cain, 1972; Shukla, 1975]; 2) раскрытие окисленного кольца по орто-, мета-пути и между N - С; 3) дальнейшее окисление и циклизацию с образованием пирролов или реакции конденсации.

Еще одним важным результатом работы является апробация возможности использования протеомного анализа МАЛДИ для характеристики белковых профилей клеток бактерий деструкторов пиридина родов Arthrobacter и Rhodococcus. Сравнение белковых спектров клеток, выращенных на среде с пиридином или органической среде, позволило сделать следующие выводы: 1) клетки артробактера и родококка, вне зависимости от условий их роста (состава сред), имеют в МАЛДИ-спектре пики, характеризующие их таксономическую принадлежность на уровне рода; 2) белковые спектры клеток одного и того же штамма различаются в зависимости от источников питания; 3) белковые спектры клеток артробактера и родококка, выращенных на среде с пиридином, имеют идентичный набор пиков, отсутствующих при росте на органической среде, и, по-видимому, принадлежащих белкам, вовлеченным в систему деградации пиридинов.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и идентифицированы высокоэффективные штаммы бактерий-деструкторов пиридинов, утилизирующих за короткий срок (24-36 ч) высокие концентрации (1,5-3,0 г/л) пиридина и его метил- и диметилпроизводных в качестве единственных источников углерода, азота и энергии, и обладающие более высокой деградирующей активностью, чем их мировые аналоги. Штаммы рекомендованы для очистки от пиридиновых токсикантов промышленных сточных вод и биоремедиации почв (Патент №4222352/31-13,1993 г).

2. Катаболизм пиридиновых соединений немицелиальными актинобактериями идет через окисление гетероцикла с образованием гидроксипроизводных превращением их в ди- и тригидроксипроизводные и последующим раскрытием кольца. Утилизация субстратов актинобактериями сопровождается синтезом пигментов, интенсивность которого коррелирует с количеством вносимого субстрата.

3. При катаболизме пиридина штаммами Arthrobacter sp. КМ-4 и Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р, впервые выделены и идентифицированы продукты первой стадии деструкции пиридина - 2-гидроксипиридин и 2,3-дигидроксипиридин, в которых атом кислорода гидроксильных групп в С-2 и С-3 положениях происходит из воды. Раскрытие пиридинового кольца в молекулах дигидроксипиридинов происходит путем гидролиза по C-N связи с образованием кетокислот специфического строения.

4. При катаболизме 2-метилпиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-2МР после гидроксилирования кольца в opino- или в .мета-положениях реализуются несколько путей дальнейших превращений: а) его раскрытие с образованием пятичленных циклов N-ацетилпиррола или Ы-формил-2-мети л пиррола; б) образование дигидрокси-2-метилпиридина и разрыв кольца с образованием 4-оксопентановой кислоты; в) окисление дигидрокси-2-метилпиридина до тригидрокси-2-метилпиридина, который конденсируется с образованием пигмента азахиноновой природы.

5. Катаболизм 4-метилпиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-диметилпиридина штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP после гидроксилирования кольца имеет следующие особенности. Раскрытие цикла у 4-метил- и 2,6-диметилпиридинов проходит только в .мета-положении. Катаболизм 2,4-диметил-пиридина штаммом R. erythropolis 2.4DMP, сопровождается как гидроксилированием кольца, так и окислением метальных групп 2,4-диметилпиридина.

6. Доказано использование бактериями интермедиатов метаболизма пиридина (2-гидрокси- и 3- гидроксипиридинов) в качестве источников питания и энергии. Утилизация интермедиатов требовала присутствия в среде пиридина (0,3 г/л), что указывает на функционирование пиридина как отличного индуктора синтеза ферментов биодеградации пиридина.

7. Оптимизированы условия длительного хранения штамма Arthrobacter sp. КМ-4, с использованием защитных сред, протектирующих клетки при замораживании и дегидратации. Показано, что в реактивированных после лиофилизации и криоконсервации образцах количество жизнеспособных клеток и их утилизирующая активность сохраняются на высоком уровне.

8. Проведенный сравнительный анализ методом МАЛДИ белкового профиля клеток артробактеров и родококков, выращенных на различных по составу средах, выявил наличие в белковых спектрах специфических пиков, характеризующих клетки на уровне рода. При сравнении белковых спектров штаммов Arthrobacter sp. КМ-4 и R. wratislaviensis КМ-Р, развивающихся на среде с пиридином, показало наличие общих сигналов, отсутствующих в спектрах клеток, выращенных на богатых средах без пиридина. Предполагается, что выявленные белки могут быть ассоциированы с системой деградации пиридинов.

9. Иммобилизованные в альгнате кальция или суспензионные клетки Arthrobacter sp. КМ-4 способны эффективно окислять пиридин, что можно рекомендовать для разработки биотехнологии очистки от пиридиновых токсикантов сточных вод и биоремедиации почв.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ

1. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Arthrobacter crystallopoietes КМ-4 - штамм-деструктор метил- и диметилпиридинов. //Биотехнология. 2007. № 3. С.58-63.

2. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Утилизация штаммом Arthrobacter crystallopoietes КМ-4 метил- и диметилпиридинов. //Биотехнология. 2007. №4. С.61-63.

3. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Деструкция 2,6-метил-пиридина штаммом Arthrobacter crystallopoietes КМ-4. //Биотехнология. 2007. № 4. С.64-68

4. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Деструкция 4-метил-пиридина штаммом Arthrobacter crystallopoietes КМ-4. //Биотехнология. 2007. № 6. С.50-54.

5. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б.Биодеградация 2,4-диметилпиридина штаммом Rhodococcus sp. //Биотехнология. 2008. № 1 С.72-78.

6. Хасаева Ф.М., Терентьев П.Б. Изучение начальных путей катаболизма пиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-4. //Вода: химия и экология. 2008. №4. С.35-40.

7. Хасаева Ф.М., Терентьев П.Б. Установление путей катаболизма пиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-4. //Вода: химия и экология. 2008. № 6. С.35-41.

8. Хасаева Ф.М., Колганова Т.В., Турова Т.П. Утилизация 2,4-диметилпиридина штаммом Rhodococcus erythropolis 2.4DMP. //Биотехнология. 2008. № 3. С.85-89.

9. Khasaeva F., Vasilyuk N., Terentyev Р., Troshina M., Lebedev A. GC/MS Study of microbiological destruction of Pyridine and its methyl derivatives. //Environmental Chemistry Letters. 2010. DOI 10.1007/s 10311-010-0299-6.

10.Хасаева Ф.М., Василюк H.B., Лебедев A.T., Колганова Т.В., Турова Т.П. Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р - деструктор незамещенного пиридина. //Вода: химия и экология. 2010. № 6. С.29-33.

11. Хасаева Ф.М. Изучение путей катаболизма незамещенного пиридина штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р. //Вода: химия и экология. 2011. № 1.С.30-36.

12. Хасаева Ф.М., Василюк Н.В., Лебедев А.Т. Изучение начальных путей катаболизма 2-метилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. КМ-2МР. Микробиология, 2011. № 3. (в печати).

Статьи в других журналах и сборниках

13. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б., Бундель Ю.Г. Очистка окружающей среды от алкилпиридинов. //В кн. «Охрана окружающей среды», 1988. Братислава, ЧССР.

14. Хасаева Ф.М. Методы хранения штамма Arthrobacter crystallopoietes КМ-4. //Сборник научных статей «Проблемы и перспективы повышения продуктивных и племенных качеств сельскохозяйственных животных» г. Нальчик, 2001. С. 21-24.

15. Хасаева Ф.М., Мирзоев P.C., Хочуев И.Ю., Валехова М.А. Исследование токсичности бентонитовых глин, месторождения «Герпегеж» методом биотестирования. //Межвузовский сборник. Материалы Всероссийской научно-практической

конференции. Проблемы и перспективные направления прикладной биологической науки в начале XXI века. Часть 2. Москва - Нальчик. 2003. С. 54-58.

Патенты

16. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Довгилевич Е.В., Таптыкова С.Д., Модянова Л.В., Терентьев П.Б., Бундель Ю.Г. Штамм Arthrobacter crystallopoietes КМ-4, используемый для очистки сточных вод от 2,6-диметилпиридина, 2-метилпиридина и 4-метил-пиридина. Патент на изобретение № 4222352/31-13. 1993 г.

Материалы научных конференций

17. Khasaeva F.M., Vorobyeva L.I., Modyanova L.V. Degradation of 2.4-lutidine by mixed culture of microorganisms. //Pros. 8 International biotechnology, Symposium, 17-22 July, 1988. Paris, France.

18. Khasaeva F.M., Vorobyeva L.I., Modyanova L.V., Taptykova S.D. Unique properties of new isolates of Arthrobacter. //3 Symposium of European Group of Actinomicetologists, 2-4 September, 1988, V.I, p. C.6. Budapest, Hungary.

19. Khasaeva F.M., Sidyakina T.M., Modyanova L.V., Taptykova S.D. Survival and biochemical activity of bacteria Arthrobacter crystallopoietes VKM Ac-1098 after freeze-drying and cryopreservation. //Abst. IV International Congress on Culture Collection, 28 October -5 November, 1988. Washington, USA.

20. Хасаева Ф.М., Базарова И.М.Агапова С.P. Разработка биотехнологических методов детоксикации промышленных сточных вод. //Конференция молодых ученых «Человек в биосфере», 1988 г, С. 86. Москва.

21. Khasaeva F.M., Basarova I.V., Vorobyeva L.I., Terentyev P.B., Modyanova L.V. Degradation of 4-methylpyrdine by coryneform bacteria. Fifth international symposium on microbiology 27 august-1 September, 1989, Kyoto, Japan.

22. Хасаева Ф.М., Модянова Л.В., Базарова И.М., Терентьев П.Б. Микробиологический метод очистки промышленных сточных вод от пиридинов. //Труды VIII научно-технической конференции молодых ученых, 1989 г, Нальчик.

23. Хасаева Ф.М., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Микробиологический метод детоксикации промышленных сточных вод от пиридиновых оснований. //Международный симпозиум по гидробиологии, 1990 г, Нальчик.

24. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Артеменко К.А., Терентьев П.Б., Лебедев А.Т. Характеристика микроорганизмов методом MALDI - TOF. //3-ий съезд ВМСО и всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» 03-07 сентября 2007 г. Москва.

25. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Евтушенко Л.И. Выживаемость и деградирующая активность штаммов-деструкторов пиридиновых производных после 15-20 лет хранения. //Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» Москва, 19-20 ноября 2007 г.

26. Хасаева Ф.М., Терентьев П.Б., Лебедев А.Т., Трошина М.А. Аэробная детоксикация ксенобиотиков штаммом Arthrobacter sp. и Rhodococcus opacus. //Международная научно-практическая конференция БИОТЕХНОЛОГИЯ. Вода и пищевые продукты. Москва, 11-13 марта 2008 г.

27. Хасаева Ф.М., Трошина М.А., Терентьев П.Б., Лебедев А.Т. Штамм ARTHROBACTER SP. КМ-4 - деструктор пиридина и апкилпиридинов. //Ломоносовские чтения. Москва, Апрель, 2008 г.

28. Воробьева Л.И., Воробьева Н.В., Хаджаев Е.Ю., Хасаева Ф.М. Пропионовокислые бактерии как пробиотики. //Международная конференция «Пробиотики, птебиотики и синбиотики». С-Петербург, май 2007 г. С.59.

29. Khasaeva F., Terentyev P., Troshina M., Lebedev A. GC-MS Study of microbiological destruction of pyridine with its alkyl derivatives and MALDI characterization of the strain destructor. //56' ASMS Conference on Mass Spectrometry, July 1-5, 2008. Denver, USA.

30. Lebedev A., Khasaeva F., Vasilyuk N. Rhodococcus and Arhrobacler strains - new bacterial destructor of pyridine and alkylpyridines. //FEMS-2009, 28 Juny-03 July 2009, Gothenburg, Sweden.

31. Lebedev A., Khasaeva F. Pyridine and alkylpyridines: biodégradation by microorganisms. //Conference on Mass Spectrometry, 30 August-03 September 2009. Bremen, Germany.

32.Василюк H.B., Присяжная H.B., Хасаева Ф.М. Видовое разнообразие актиномицетов рода Kribbella. //Всероссийская конференция «Экотоксикология», 26-30 октября 2009 г. г. Пущино. Московская обл.

33. Хасаева Ф.М. Биодеградация соединений ряда пиридина. //3-ая Международная конференция «Химия гетероциклических соединений», посвященная 95-летию профессора А.Н. Коста, 18-21 октября 2010 г, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова

34. Хасаева Ф.М., Захарчук Л.М., Нетрусов А.И. Биодеградация пиридина свободными и иммобилизованными клетками Arhrobacter sp. КМ-Р. //4-ый научный симпозиум «Автотрофные микроорганизмы» посвященного памяти выдающегося российского микробиолога, академика РАН, Е. Н. Кондратьевой, 23-26 декабря 2010 г, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова

Заказ № 121-А/12/2010 Подписано в печать 20.12.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

¿С^ 000 "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

mvw.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Список сокращений

• АМП - агаризованная минеральная среда с пиридином

• ГХ-МС - метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии

• 2,4-ДМП - 2,4-диметилпиридин

• 2,6-ДМП - 2,6-диметилпиридин

• 2,4-ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин

• КЖ - культуральная жидкость

• МАЛДИ (MALDI) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (matrixassisted laser desorption/ionisation)

• МАЛДИ-МС - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией /ионизацией

• МПА - мясо-пептонный агар

• 2-МП - 2-метилпиридин

• 4-МП - 4-метилпиридин

• НАД(Р)+ - никотинамиддинуклеотидфосфат окисленный

• НАД(Р)Н - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный

• ПДК - предельно-допустимая концентрация

• П - пиридин

• СА - сусло-агар

• ТСХ - тонкослойная хроматография

• ТФУК - трифторуксусная кислота

• ТМС - тетраметилсилан

• DHB - 2,5-дигидроксибензойная кислота

• FA - феруловая кислота (З-метокси-4-гидроксикоричная кислота)

• НССА - а-циано-4-гидроксикоричная кислота

• SA - синапиновая (3,5-диметокси-4-гидроксикоричная) кислота

• S/N - отношение сигнал/шум

• ЭИ - электронная ионизация

Благодарности. Автор бесконечно благодарен профессору Лене Ивановне Воробьевой (каф. микробиологии МГУ) и профессору Петру Борисовичу Терентьеву (каф. органической химии МГУ), по инициативе которых была начата данная работа, д.б.н. Людмиле Ивановне Евтушенко (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов»), за помощь в хранении культур в течение многих лет.

Искренне благодарна сотрудникам кафедры микробиологии биологического и лаборатории органического анализа химического факультетов МГУ, оказавшим помощь и поддержку на всех этапах выполнения представленной работы.

Автор признателен научным консультантам настоящей работы профессору Александру Ивановичу Нетрусову (Биологический ф-т, МГУ, зав. каф. микробиологии) и профессору Альберту Тарасовичу Лебедеву (Химический ф-т, МГУ, зав. лабораторией органического анализа) за внимание и постоянный интерес к работе, а также за помощь в обсуждении результатов работы.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Хасаева, Фатимат Машировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микробиологическая деградация гетероциклических соединений производных пиридина.

1.1.1. Деградация пиридина.

1.1.2. Деградация алкилпиридинов.

1.1.3. Деградация гидроксипиридинов.

1.1.4. Деструкция пиридинкарбоновых кислот.

1.1.4.1. Деградация пиколиновой (лиридин-2-карбоновой) кислоты.

1.1.4 2. Деградация никотиновой (пиридин-3-карбоновой) кислоты.

1.1.4.3. Деструкция изоникотиновой (пиридин-4-карбоновой) кислоты.

1.1.4.4. Деградация 2,6-дипиколиновой (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислоты.

1.2. Анализ микроорганизмов методом МАЛДИ МС.

1.2.1. Метод МАЛДИ МС.

1.2.2. МАЛДИ МС анализ микроорганизмов.

1.2.2.1. Практическое применение микробного профилирования методом МАЛДИ.

1.2.2.2. Факторы, влияющие на качество и воспроизводимость спектров микроорганизмов, полученных методом МАЛДИ.

1.3. Современное состояние и иммобилизация клеток микроорганизмов для целей биотехнологических производств и биодеградации ксенобиотиков

1.3.1. Общие характеристики процессов иммобилизации.

1.3.2. Связывание клеток микроорганизмов на поверхности нерастворимого носителя.

1.3.3. Включение клеток микроорганизмов в структуру полимерного носителя.

1.3.4. Иммобилизация клеток микроорганизмов с использованием мембранной технологии.

1.3.5. Физиология иммобилизированных микроорганизмов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Соединения ряда пиридина - субстраты и продукты деградации.

2.1.2. Микроорганизмы - деструкторы незамещенного пиридина, метил- и диметилпиридинов.

2.2. Идентификация выделенных микроорганизмов-деструкторов.

2.2.1. Изучение культуральных и физиолого-биохимических особенностей

2.2.2. Хранение штаммов бактерий АНкгоЬа&ег эр. КМ-4, Ккойососсш лугаИЕ1а\1епз15 КМ-Р и Ккойососст егуМгороШ 2.40МР.

2.2.3. Сохранение утилизирующей пиридины активности штамма бактерий АгШгоЬас1ег Бр. КМ-4 после хранения.

2.2.4. Количественное определение потребления пиридина и его производных.

2.2.5. Определение скорости утилизации пиридина.

2.2.6. Анализ методом матрично-активированиой лазерной десорбции/ ионизации (МАЛДИ).

2.2.7. Получение бесклеточных экстрактов клеток бактерий Аг/кгоЬааег Бр. КМ-4.

2.2.8. Выделение и идентификация индивидуальных продуктов деградации пиридинов.

2.2.9. Выделение и идентификация продуктов деградации 2-метилпиридина

2.2.10. Получение суспензионных клеток АНкгоЬаШг Бр. КМ-Р.

2.2.11. Иммобилизация клетокАпЪгоЬа^ег Бр. КМ-Р в альгинате кальция.

2.2.12. Определение потребления пиридина суспензионными и иммобилизованными клетками АНкгоЬаЫег Бр. КМ-Р.

2.2.13. Сканирующая электронная микроскопия.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение, идентификация и характеристики штаммов бактерий, утилизирующих пиридин и его производные.

3.1.1. Выделение и характеристика штамма, утилизирующего незамещенный пиридин.

3.1.2. Выделение и характеристика штамма утилизирующего 2,4-диметилпиридин.

3.1.3. Секвенирование последовательности гена 16S рРНК штаммов-деструкторов пиридина и 2,4-диметилпиридина.

3.1.4. Выделение и идентификация штамма, утилизирующего метилпиридины и диметилпиридин.

3.1.5. Характеристика деградативной активности штамма Arthrobacter sp. КМ-4, утилизирующего метил- и диметилпиридины.

3.2. Хранение штаммов бактерий, утилизирующих пиридин и его производные

3.2.1. Лиофшшзация клеток штамма Arthrobacter sp. КМ-4.

3.2.2. «Тест на ускоренное хранение» лиофшшзированных клеток бактерий Arthrobacter sp. КМ-4.

3.2.3. Криоконсервация клеток штамма Arthrobacter sp. КМ-4.

3.3 Утилизирующая активность штаммов-деструкторов ииридииов после длительного хранения.

3.3.1. Утилизация 2,6-диметилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. KM-2.6DMP.

3.3.2. Утилизация 2-метилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. КМ-2МР.

3.3.3. Утилизация 4-метилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. КМ-4МР.

3.3.4. Утилизация незамещенного пиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. КМ-Р.

3.3.5. Утилизация незамещенного пиридина штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р.

3.3.6. Утилизация 2,4-диметилпиридина штаммом бактерий Rhodococcus erythropolis KM-2.4DMP.

3.3.7. Сравнительный анализ деструкции пиридина штаммами Arthrobacter sp. КМ-Р и Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р.

3.4. Масс-спектрометрический анализ клеток бактерий.

3.4.1. Сравнительный анализ биодеградирующих штаммов Arthrobacter sp. КМ-Р и R. wratislaviensis КМ-Р методом МАЛДИ.

3.4.2. Влияние условий культивирования на МАЛДИ-профиль бактерий.

3.5. Изучение пиридин и 2,6-диметилпиридин окисляющих активностей бесклеточных экстрактов артробактеров.

3.6. Исследование путей деградации пиридина и его производных.

3.6.1. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,6-димегилпиридина штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP.

3.6.2. Анализ и идентификация продуктов деградации 2-метилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. КМ-2МР.

3.6.3. Анализ и идентификация продуктов деградации 4-метилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. КМ-4МР.

3.6.5. Превращение 2-гидрокси- и 3-гидроксипиридинов штаммом Arthrobacter sp. КМ-Р.

3.6.6. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р.

3.6.7. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,4-диметилпиридина штаммом Rhodococcus erythropolis 2.4DMP.

3.7. Деградация пиридина культурой, суспензионными и иммобилизованными клетками Arthrobacter sp. КМ-Р.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus"

Актуальность проблемы.

В настоящее время практически все природные среды подвергаются антропогенным воздействиям. Интенсивное развитие химической промышленности привело к тому, что в биосферу постоянно и в возрастающих количествах поступают вещества-загрязнители [Кузнецов, Градова, 2006; 2010]. Одним из загрязнителей, требующего приоритетного внимания, являются органические гетероциклические соединения, масштабы производства которых, составляют несколько тысяч тонн в год. По данным, 1989 года мировое производство для пиридина ровнялось 26000 т/год, 2-метилпиридина 8000 т/год, 3-метилпиридина 9000 т/год, 4-метилпиридина 1500 т/год [Fetzner, 1998]. Пиридин и его производные являются важным классом гетероциклических соединений [Lettau, 1980]. Они образуются при коксохимической переработке угля, содержатся в сточных водах нефтеперерабатывающих и химических предприятий, заводов по производству синтетического каучука, пластмасс, красителей [Dobson et al., 1985; Pereira et al., 1988; Rogers et al., 1985]. В чистом виде пиридины широко используются в качестве растворителей и исходных реагентов при производстве химикатов для сельского хозяйства, фармацевтических препаратов и т. д. [Sims, O'Loughlm, 1989; Kaiser et al., 1996; Граник, 2009]. В организм эти ксенобиотики поступают при вдыхании паров и через кожу, а также процессе потребления загрязненных продуктов и воды. Даже невысокие концентрации пиридинов приводят к отравлению и нарушению функций центральной нервной системы [ATSDR, 1992, Куценко, 2004]. По своей канцерогенности пиридин отнесен к 3 группе [IARC, 2000].

Хорошая растворимость пиридина и его производных в воде обеспечивает легкость их транспорта и распространения в окружающей среде. Особую опасность для экосистем в целом, и для водных ресурсов в частности, представляют сточные воды коксохимических, нефтеперерабатывающих и химических производств [Грушко, 1982; Ефремов, 1998]. Вода это не только источник водоснабжения и транспортное средство, но и среда обитания животных и растений, круговорот которой в природе создает необходимые условия для функционирования биосферы [Хубларян, Моисеенко, 2009; Гос. доклад о состоянии окружающей среды РФ в 2006 г., 2007]. Возросшее в последние десятилетия загрязнение вод токсичными веществами обусловило существенное повышение уровня заболеваемости людей, включая онкологические, генетические и аллергические, а также дефекты умственного и физического развития детей [Ревич и др., 2003].

Желательно, чтобы отходы химических производств попадали в окружающую среду в форме и концентрациях, предварительно обезвреженных- для жизни [Одум, 1986]. Утилизация отходов путем сжигания процесс энергоемкий и служит активным источником загрязнения окружающей среды, так как зола и шлак, образующиеся при сжигании, содержат продукты неполного сгорания органических веществ.

Санитарным законодательством предъявляются высокие требования к содержанию пиридинов в объектах окружающей среды [Вредные вещества в промышленности, 1976]. Предельно-допустимая концентрация (ПДК) для пиридина в питьевой воде установлена на уровне 0,2 мг/л, пиколинов и лутидинов - 0,05 мг/л, паров в воздухе - 0,0015 мг/м [ГН 2.2.5.2308-07, 2007], а для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение, составляет 0,01 и 0,001 мг/л, соответственно [Перечень рыбохозяйственных нормативов, 1999; Дополнение № 2, 2001]. Такие значения ПДК предполагают глубокую очистку сточных вод.

На данный момент предложены различные физико-химические способы очистки пиридинов: адсорбция [Akita, Takeuchi, 1993; Sabah, Celik, 2002], озонирование [Stern, et al., 1997], адсорбция с электросорбцией [Niu, Conway,

2002], но, ни один из современных методов химической очистки не являеся, ни экономичным, ни достаточно эффективным.

Микроорганизмы представляются перспективными объектами для решения проблем рационального природопользования, как для эффективной биотехнологической очистки отходов на стадии производства, так и при обезвреживании токсикантов, уже попавших в окружающую среду [Кузьмина, 2010],

Действительно, наиболее приемлемым, эффективным и безальтернативным до настоящего времени остается биологический, в частности, микробиологический метод [Алиева, 1987; Pandey et al., 2007].

Биологический метод очистки обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых относится его экологичность: в процессе биологической очистки редко образуются чуждые природной среде соединения, и деструкция органических загрязнений происходит до ССЬ и Н20 [Лохов, 2002; Лохова, 2008].

Современный уровень развития промышленного производства и экологическое состояние окружающей среды обусловили повышение требований к качеству сточных вод, сбрасываемых в водные объекты, а традиционные технологии биологической очистки в аэротенках уже не позволяют достичь необходимой степени очистки. Одним из наиболее эффективных и очевидных способов увеличения окислительной мощности и улучшения ряда технологических показателей традиционных биологических очистных сооружений является применение иммобилизованной микробной < биомассы на нерастворимых в воде материалах [Демаков и др., 2009].

В связи с этим первостепенное значение приобретает разработка микробиологических способов очистки, предусматривающая поиск эффективных микроорганизмов-деструкторов и всестороннее их изучение. Также подбор оптимальных способов хранения, обеспечивающих как жизнеспособность клеток, так и ферментативную активность превращений ксенобиотиков для эффективного использования этих микроорганизмов в процессах очистки промышленных сточных вод и биоремедиации почв.

Состояние вопроса.

К началу настоящей работы было известно, что первичной реакцией микробного метаболизма бензольного кольца является его гидрокси-лирование с образованием диоксисоединений [Арчаков, 1983; Leslie, 1985; Кулинский, 1999; Соляникова, 2007]. Последующее раскрытие кольца может проходить по одному из путей его окислительного расщепления: орто-, мета- и через образование гентизиновой кислоты.

Реакции раскрытия пиридинового кольца, в отличие от бензольного, не имеют однозначной интерпретации. С одной стороны, это обусловлено тем, что пиридин является электронодефицитным соединением, поскольку замена в кольце бензола одного атома углерода более электроотрицательным атомом . азота приводит к резкому перераспределению электронной плотности в ядре так, что в положениях 2- и 4- электронная плотность понижена [Гранберг, 1973, Пожарский, 1986]. В результате, наряду с повышенной основностью пиридина (за счет свободной пары электронов азота), его электрофильность резко подавлена, а нуклеофильные реагенты атакуют а- и у - положения в ядре. Таким образом, нуклеофильная атака, например, введение ОН-группы, становится более легкой по сравнению с электрофильным замещением (Джилкрист, 1996). С другой стороны, до сих пор не удалось получить бактериальные бесклеточные экстракты, способные трансформировать молекулу пиридина: отсюда многие стадии его деградации остаются неизученными.

Sims et al., 1985, 1986] могут использовать пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при его концентрации 1,5-2,0 г/л и времени утилизации от 2 до 5 суток. Первыми идентифицированными интермедиатами оказались насыщенные алифатические кислоты, янтарный и глутаровый полуальдегиды, присутствие которых свидетельствует о восстановлении пиридинового кольца [Shukla, 1973; Watson, Cain, 1975]. Вполне вероятно, что интермедиатом при деградации пиридина является 1,4-дигидропиридин

Watson, Cain, 1972], однако прямых доказательств этого процесса нет, первичные продукты восстановительной реакции не выделены. Более поздние исследования дали другие результаты. Бактерия Nocardia sp. КМ-2

Коростелева, 1982] утилизировала пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при максимально потребляемой концентрации 0,2% за 96 часов. В культуральной жидкости (КЖ) накапливался интермедиат, который был идентифицирован как 3-гидроксипиридин: это предполагает, что окисление кольца пиридина, предшествует его раскрытию. И в этом случае в качестве интермедиата был идентифицирован янтарный полуальдегид.

Цель работы:

Основные задачи исследований.

2. Изучение и подбор оптимальных условий для утилизации пиридина и пиридиновых производных выделенными штаммами.

4. Выделение, характеристика и определение структуры индивидуальных продуктов интермедиатов биодеградации пиридинов ' методами хроматографии и хроматомасс-спектрометрии. Установление путей микробной деградации пиридина и его производных.

5. Масс-спектрометрический анализ белкового профиля бактерий Аг{кгоЬаМег Бр. КМ-Р и КНойососст \vrcitislaviensis КМ-Р, утилизирующие пиридин, методом матрично-активированной лазерной десорбции /ионизации (МАЛДИ).

8. Иммобилизация клеток бактерий АпкгоЬа^ег Бр. КМ-Р, утилизирующих пиридин, в альгинате кальция для применения в биотехнологических процессах деструкции ксенобиотиков этого класса.

Научная новизна работы.

Выделены бактерии-деструкторы пиридинов из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» и

Авдеевского коксохимического завода, производящего чистые фракции легких пиридинов. Выделенные штаммы, обладающие высокой деградирующей активностью и широкой субстратной специфичностью, были идентифицированы на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств и результатам секвенирования 16Б рРНК как представители родов АнкгоЬа^ег и Шюс/ососсш,

Установлено, что деградация пиридина и его производных выделенными микроорганизмами происходит по окислительному пути через гидроксилирование гетероциклического кольца в С-2 и (или) С-3 положении. Обнаружение в качестве промежуточных продуктов метаболизма пиридина, 2-гидрокси-, 2,3-дигидрокси- и 2,6-дигидроксипроизводных пиридина предполагает происхождение атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-6 из воды. На основании анализа продуктов раскрытия дигидроксипроизводных установлено, что пиридиновое кольцо подвергается гидролитическому разрыву по С-Ы связи обоими штаммами бактерий: Аг1кгоЬас(ег эр. КМ-Р и Ккос1ососси$ лх^аИзЬюгепи'^ КМ-Р. Впервые при изучении метаболизма 2-метилпиридина (2-МП) показано, что раскрытие кольца гидрокси-2-МП между 2-м и 3-м атомами углерода с последующей . реакцией конденсации приводит к образованию Ы-ацетилпиррола. Раскрытие кольца между С-5 и С-6 атомами углерода, аналогично, приводит .к образованию 1М-формил-2-метилпиррола. Таким образом, раскрытие кольца наблюдается и в орто- и в мета-положении. Обнаружено, что метаболизм 4-метилпиридина (4-МП) сопровождается образованием розового и голубого пигментов, являющиеся продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-МП и 2,3,6-тригидрокси-4-МП, соответственно, а метаболизм 2,4-диметилпиридина (4-ДМП) - окислением как кольца гетероцикла, так и метальных групп. Раскрытие кольца у 4-метилпиридина, 2,4-диметилпиридина и 2,6-диметил-пиридина наблюдается только в .мета-положении.

Практическое значение работы.

Из почв, длительное время подвергавшихся воздействию пиридина и его производных, выделены штаммы бактерий родов А^кгоЬас1ег и Я1юс1ососст, способные разлагать устойчивые азотсодержащие поллютанты - пиридин, 2-метил-, 4-метил-, 2,4-диметил- и 2,6-диметилпиридины. Создана коллекция штаммов бактерий, адаптированных к высоким концентрациям токсикантов и характеризующихся высокой скоростью их разложения. Штамм АнкгоЬасгег Бр. КМ-4 за 24 часа утилизировал 2,5 г/л пиридина и 2-МП; 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП и депонирован в ВКМ (Ас-1098Д). Штамм Якойососст \vratislaviensis КМ-Р утилизировал за 24 часа 2,5 г/л пиридина; Я. егу(НгороИ$ 2.4БМР - 2,0 г/л 2,4-ДМП за 36 часов. ,

Проведенные испытания по биодеградации пиридиновых оснований, содержащихся в сточных водах коксохимического производства, с помощью бактерий АпкгоЬаМег эр. КМ-4 показали их высокую деструктивную активность: снижение концентрации пиридинов с 75-90 мг/л ,до 8-15 мг/л в течение 6 часов.

Штаммы АгГкгоЬас1ег эр. КМ-4, Я. лугаИ$1а\чеп818 КМ-Р и Я. егуЖгороШ 2.4ЭМР рекомендованы для очистки промышленных сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности.

Апробацш! результатов и публикации.

1989); на 3-м Съезде ВМСО и всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007); на Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ» (Москва, 2008); на 56-ом съезде по масс-спектрометрии (Денвер, США, 2008); на 3-м Европейском конгрессе по микробиологии (Гётеборг, Швеция, 2009); на 18-ой Международной конференции по масс-спектрометрии (Бремен, Германия, 2009), на 3-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений" (Москва, 2010), на 4-ом научном симпозиуме "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2010).

Положения, выносимые на защиту.

• Представители немицелиальных актинобактерий нз родов АгЖгоЬаМег и ЯкосИососсив обладают высокой утилизирующей способностью в отношении широкого спектра токсичных пиридиновых соединений.

• Первой стадией разложения пиридина и его производных актинобактериями родов АгЛгоЬаЫег и Ккойососсив могут быть не только восстановление, но и окисление гетероциклического кольца, аналогично начальному этапу окисления ароматического кольца при биодеградации % замещенных фенолов.

• Разрыв окисленного кольца пиридина может идти по нескольким путям: орто-, мета- или между С-1Ч, аналогично многочисленным путям разрушения ароматического кольца у замещенных фенолов. Дальнейшие превращения окисленных пиридинов могут осуществляться по нескольким независимым путям.

1. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хасаева, Фатимат Машировна

ВЫВОДЫ

1. Выделены и идентифицированы высокоэффективные штаммы бактерий-деструкторов пиридинов, утилизирующие за короткий срок (24-36 ч) высокие концентрации (1,5-3,0 г/л) пиридина и его метил- и диметилпроизводные в качестве единственных источников углерода, азота и энергии и обладающие более высокой деградирующей активностью, чем их мировые аналоги. Штаммы рекомендованы для очистки от пиридиновых токсикантов промышленных сточных вод" и биоремедиации почв (Патент №4222352/31-13, 1993 г).

2. Катаболизм пиридиновых соединений немицелиальными актинобактериями идет через окисление гетероцикла с образованием гидроксипроизводных, с превращением их в ди- и тригидроксипроизводные и последующим раскрытием кольца. Утилизация субстратов актинобактериями сопровождается синтезом пигментов, интенсивность которого коррелирует с количеством вносимого субстрата.

3. При катаболизме пиридина штаммами АнкгоЪасгег эр. КМ-4 и Ююйососсих \vratislaviensis КМ-Р, впервые выделены и идентифицированы продукты первой стадии деструкции пиридина - 2-гидроксипиридин и 2,3-дигидроксипиридин, в которых атом кислорода гидроксильных групп в С-2 и С-3 положениях происходит из воды. Раскрытие пиридинового кольца в молекулах дигидроксипиридинов происходит путем гидролиза по С-1Ч связи с образованием кетокислот специфического строения.

4. При катаболизме 2-метилпиридина штаммом АнкгоЬаШг эр. КМ-2МР после гидроксилирования в орто- или в мета-положениях, реализуются несколько путей дальнейших превращений: а) раскрытие кольца с образованием пятичленных циклов Ы-ацетилпиррола или 1ч1-формил-2-метилпиррола; б) образование дигидрокси-2-метилпиридина и разрыв с образованием 4-оксопентановой кислоты; в) окисление дигидрокси-2-метилпиридина до тригидрокси-2-метилпиридина, который конденсируется с образованием пигмента азахиноновой природы.

5. Катаболизм 4-метилпиридина штаммом АпкгоЬаМег зр. КМ-4МР и 2,6-диметилпиридина штаммом АгМгоЬас1ег эр. КМ-2.60МР после гидроксилирования кольца имеют следующие особенности: раскрытие цикла у 4-метил- и 2,6-диметилпиридинов проходит только в мета-положеиии. Катаболизм 2,4-диметилпиридина штаммом Ююскососст егуШгороШ 2.4БМР сопровождается как гидроксилироваиием кольца, так и окислением метальных групп 2,4-диметилпиридина.

7. Оптимизированы условия длительного хранения штамма АнкгоЬаЫег эр. КМ-4 с использованием защитных сред, протектизирующих клетки при замораживании и дегидратации. Показано, что в реактивированных образцах количество жизнеспособных клеток и их утилизирующая активность сохраняются на высоком уровне.

8. Проведенный сравнительный анализ методом МАЛДИ белкового профиля клеток артробактеров и родококков, выращенных на различных по составу средах, выявил наличие в белковых спектрах специфических пиков, характеризующих клетки на уровне рода. При сравнении белковых спектров штаммов А}1кгоЪас(ег Бр. КМ-4 и КкосЬсоссш \vratisla\nensis КМ-Р, развивающихся на среде с пиридином, показало наличие общих сигналов, отсутствующих в спектрах клеток, выращенных на богатых средах без пиридина. Предполагается, что выявленные белки могут быть ассоциированы с системой деградации пиридинов.

9. Иммобилизованные в альгнате кальция или суспензионные клетки АнНгоЬас!ег зр. КМ-4 способны эффективно окислять пиридин, что позволяет рекомендовать для разработки биотехнологий очистки от пиридиновых токсикантов сточных вод и биоремедиации почв.

Заключение

Биохимический метод очистки промышленных сточных вод в аэротенках не всегда оказывается эффективным при обезвреживании промышленных стоков, содержащих высокие концентрации токсичных чужеродных органических соединений [Алиева, 1987; Kim et al., 2006; Pandey et al., 2007; Jiwu, 2009].

Поиск активных культур с повышенной деструктивной активностью, их всестороннее изучение и создание эффективных форм их применения, позволило бы обогащать ими активный ил, используемый как инокулят, и предохранять формируемые ассоциации от воздействия высокотоксичных компонентов.

В настоящее время во многих научных центрах ведется поиск микроорганизмов-деструкторов, способных разлагать токсичные соединения с целью довести до технологического решения их разложение.

Отметим, что очистка промышленных стоков от таких токсичных соединений как пиридин и его алкилзамещенные производные не решена и заслуживает пристального внимания.

Следует подчеркнуть, что работы по деградации пиридинов велись широким фронтом при апробации в качестве предполагаемых деструкторов коллекционных бактерий, грибов и дрожжей, а также целенаправленным выделением микроорганизмов, обладающих способностью к деструкции этих соединений. При этом было отмечено, что хотя некоторые микроорганизмы способны проводить первые стадии окисления пиридинов, но далее процесс не идет по причине образования более токсичных соединений, чем исходный субстрат. Так, трансформация 2,6-диметилпиридина одним из грибов приводила к накоплению в культуральной жидкости высокотоксичного 2,6-диметилпирпдин-Н-оксида, который дальнейшему метаболизму не подвергался [Kost et al., 1977]. Также, до начала наших работ не удавалось выделить микроорганизм, способный расти и деградировать 2,4-диметил-пиридин.

Настоящее исследование содержит сумму доказательств высокой биологической активности представителей немицелиальных актинобактерий, широко представленных в различных природных субстратах. Штаммы, выделенные из почв, длительно подвергавшихся воздействию пиридинов, были идентифицированы как представители родов АпНгоЬасгег и ШойососсиБ, Они обладали способностью к утилизации не только незамещенного пиридина и метилпиридинов, но и диметилпиридинов (в частности 2,6-диметил- и 2,4-диметилпиридины), которые намного труднее окисляются биохимическим путем (их ПДК в 4 раза ниже, чем у пиридина).

Бактерии АгШгоЬаМег и КЬойососсиз обладали как широкой субстратной специфичностью в отношении соединений пиридинового ряда, так и способностью утилизировать их со скоростью, существенно превышающих активность штаммов, известных их литературных источников (таблица 19).

Другой результат работы связан с выяснением метаболических путей биодеградации пиридинов. Отметим, что широко применяемая методология подобных исследований, основанная на изучении ферментов биодеградации определенных токсикантов, и показавшая блестящие результаты для разложения замещенных фенолов [8о1уашкоуа, Оо1оу1еуа, 2004; Тгаукт е1 а1., 2006], оказалась непригодной для изучения разложения пиридинов. Объективной практикой была показана невозможность получения активных бесклеточных экстрактов и стабильно функционирующих выделенных и очищенных ферментов биодеградации.

Нами был использован подход, основанный на выделении и идентификации современными методами химического и физико-химического анализов интермедиатов метаболизма пиридинов как единственных источников питания и энергии в динамике развития культур бактерий-деструкторов. Интермедиатный характер выделенных веществ подтверждает тот факт, что в процессе роста культур на соответствующих субстратах наблюдалось постепенное появление этих соединений и полное их исчезновение к концу культивирования. Строение интермедиатов позволило понять процесс протекания и начальных этапов деградации этих соединений, и установить характер раскрытия пиридинового кольца.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Хасаева, Фатимат Машировна, Москва

1. Абелян В.А. Иммобилизация клеток включением в аубазидан // Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т.36. С.85-88.

2. Алиева P.M. Микробиологические аспекты очистки сточных вод. Дис. докт. биол. н. // МГУ им. М.В. Ломоносова. 1987.

3. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения. Научн. докл. высшей школы. Биол. науки. 1983. №4. С. 93-105.

4. Арчаков А.И., Карузина И.И. Окисление чужеродных соединений. //Вестник АМН СССР. 1988. №1. С. 14-23.

5. Бекер М.Е., Дамберг Б.Е., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига. Знание. 1981.

6. Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. 1985. 208с

7. Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты. Киев. Наукова думка. 1979.

8. Бидей С.П., Броделиус П., Кабрал И.М. и др. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. /Под ред. Дж. Вудворда. М.: Мир., 1988. 215с.

9. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М.:Колос. 2004. 296с.

10. Брюханов А.Л., Нетрусов Л.И. Длительное хранение строго анаэробных микроорганизмов в глицерине. // Прикл. биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №2. С.200-203.

11. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучениенуклеотидных последовательностей генов niffl некоторых метанотрофных бактерий. //Микробиология. 2002. Т.71. №4. С.500-509.

12. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы биологических процессов. М.: Высшая школа. 1990. 296с.

13. Волков В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию. Микробиология. 1994. Т.63. С.5-16.

14. Скрябин Г.К., Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов///Биотехнология. М.: Наука, 1984.

15. Вредные вещества в промышленности. Справочник для химиков, инженеров и врачей. Изд. 7-ое. В 3-х томах. Т. 1 .Органические вещества. Под редакцией Н.В.Лазарева, Э.Н.Левиной. Л.: Химия, 1976.

16. Вульфсон Н.С. Препаративная органическая химия. М. ГХИ, 1959. 459с.

17. Герна Н. Хранение микроорганизмов. // Методы общей бактериологии. М.Мир. 1983. Т.1. С.512-533.

18. ГН 2.2.5.2308-07 Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны, утв. 19.12.2007г. №89.

19. Государственный доклад о состоянии окружающей среды РФ в 2006 г. М.: Министерство природных ресурсов, 2007.

20. Грандберг И. И. Органическая химия. М.: Мир. 1973. 310с.

21. Граник В.К. Токсикология лекарств. М. Вузовская книга. 2009.438с.

22. Грушко Я.М. Вредные вещества в промышленных сточных водах. Л: Химия. 1982.216с.

23. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных выбросах в атмосферу. Справочник, Л.: Химия, 1986

24. Давиденко Т.Н. Угольные материалы носители для иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов. Одесса: Изд-во ФХИ НАН Украины, 1995. 36с.

25. Давиденко Т.Н., Бондаренко Г.И. Восстановление нитрозамещенных соединений нативными и иммобилизованными клетками Escherichia coli. //Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т.36. С.74-79.

26. Демаков В.А., Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю. Иммобилизация микроорганизмов: биотехнологические аспекты. // Биотехнология. 2008. №2. с.30-45.

27. Джилкрист Дж., Миллс К. Химия гетероциклических соединений. М.: Мир. 2004. 727с.

28. Дополнение № 2 к Перечню предельно-допустимых концентраций (ПДК) и (ОБУВ) вредных веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение от 23.04.01 N 02-46/561, 2001.

29. Доронина Н.В., Назаров Н.М., Ежов В.А., Троценко Ю.А. Биодеградация метилацетата и этилацетата иммобилизованными клетками Pseudomonas esterophilus. II Прикладная биохимия и микробиология. 2006. V.42. Р. 5254.

30. Ефременко E.H., Татаринова Н.Ю. Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов. //Микробиология. 2007. Т.76. №3. С.383-389.

31. Ефремов A.A. Эколого-химическая безопасность питьевой воды промышленных городов России: состояние и перспективы. // Химия растительного сырья. 1998. №3. С. 75-81.

32. Зарипова С.К. Метаболизм арилкарбоновых кислот у Rhodococcus rubropertinctus'. Дисс. канд. биол. наук. Казанский университет, 1989. 120с.

33. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии. М.: Высшая школа, 2002. 412с.

34. Китова А.Е., Кувичкина Т.Н., АринбасароваА.Ю., Решетипов А.Н. Деградация 2,4-дииитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1. // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т.40. №3. С.307-311.

35. Коломыцева М.П., Соляникова И.П., Головлев Е.Л., Головлева Л.А. Гетерогенность Rhodococcus opacus 1СР как ответ на стрессовое воздействие хлорфенолов. // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т.41. №5. С.541-546.

36. Коростелева Л.А., Кост А.Н., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б., Куликов Н.С. Микробиологическая деградация пиридина и 3-метилпиридина. //Микробиология, 19816. Т.17. С.380-388.

37. Коростелева Л.И. Микробиологическая трансформация и деградация пиридиновых оснований. Дис. канд. биол. наук. МГУ им. М.В. Ломоносова. 1981а. С. 129-136.

38. Кост А.Н., Терентьев П.Б., Куплетская М.Б., Модянова Л.В., Демина A.C., Ховрычев М.П., Шушеначева Е.В., Микробиологическая трансформация 2-метил-5-этилпиридина. Доклады АН СССР. 1974. Т.214. №4. 937с.

39. Лохова С.С. Новая медико-биологическая модель функционирования замкнутого цикла оксида азота. // Современные проблемы науки и образования. 2008. № 4 С. 22-29.

40. Макаренко A.A., Аринбасарова А.Ю., Кувичкина Т.Н., Балашов C.B., Решетилов А.Н. Деградация n-толуолсульфоната иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO). // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т.41. №5. С.521-524.

41. Марек П., Кирстен Д., Кафлэн М.П. Иммобилизация клеток и ферментов включением их в гель. // В кн. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М. Мир. 1988. С.53-64.

42. Милько Е.С., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Процесс диссоциации у бактерий. Учебное пособие. М.:МАКС Пресс, 2007. 68с.

43. Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Накардиоподобные и кориноподобные бактерии. Киев: Наукова думка. 1985. 334с.

44. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. М:: Академия, 2007. 352с.

45. Одум Ю. Экология, Т.1. М.: Мир, 1986, 328с.

46. Олонцев В.Ф., Безруков P.A. Российские активные угли. М.:Изд-во ГУ ВШЭ, 1999. 90с.

47. Перечень рыбохозяйственных нормативов: предельно допустимых концентраций (ПДК) и ОБУВ вредных веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение, М.:ВНИРО, 1999.

48. Пожарский А.Ф. Теоретические основы химии гетероциклов. М.: Химия, 1986.

49. Практикум по микробиологии: (под ред. Нетрусова А.И.) Академия. 608с

50. Пучков Е.О., Говорунов И.Г. Проблемы криоконсервации бактериальных структур. Серия «Консервация генетических ресурсов», Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1983

51. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основы экобиотехнологии. М.: Мир. 2006. С. 183-416.

52. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Прикладная экобиотехнология. М.: Бином, Лаборатория заний. 1 том. 2010, 629с.

53. Кузнецов В.Д., Филиппова С.Н., Муравьева С.А., Фишман В.М. Прогнозирование выживаемости лиофилизированных спор Actinomyces parvullum, основанной на методе «ускоренного хранения» //Микробиология. Т. 46. Вып.2. С. 318-323.

54. Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Горохов А.Г., Сергеева А.С., Курильская Т.Е., Пивоваров Ю.Н., Рунович А.А. Микросомальное окисление в физиологических и патологических процессах. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2007. №4 Вып.56 С. 170-180.

55. Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для студентов биологических факультетов http: // www.biotechnolog.ru/. 2010.

56. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков. Соросовский образовательный журнал. 1999. № 1. С. 8-12.

57. Куплетская М.Б. Результаты 25 летнего хранения лиофилизированных культур микроорганизмов. //Микробиология. 1987. Т.56. С.488-491.

58. Курдиш И.К., Титова Л.В. Применение и получение высокодисперсных материалов в технологии культивирования гранулированных препаратов Agrobacterium radiobacter I. // Прикл. биохим. микробиол. 2001. Т.37. М 3. С.369-373.

59. Куценко С.А. Основы токсикологии. С.-П.: Фолиант. 2004. 720с.

60. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.:Бином. Лаборатория знаний. 2003. 493с.

61. Лохов А.Р. «Использование комплексных соединений цинка с пиридином и никотиновой кислотой и витамина С для устоксикации нитратов в организме цыплят-бройлеров». Дисс. канд. биол. наук. Владикавказ. 2002

62. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Теория и практика криогенного и сублимационного криоконсервирования. Киев: Наукова думка. 1984.264с.

63. Ревич Б.А., Фвалиани СЛ., Тихонова Г.И. Окружающая среда и здоровье населения: региональная экологическая политика. М.: ЦЭПР, 2003.

64. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. // Под ред. Н.С. Егорова 2-е изд. М.Изд-во МГУ. 1983. 215с.

65. Саприн А.Н. // Успехи биол. химии. 1991. Т.32. С.146-175.

66. Сапунова Л.И., Лобанок А.Г., Парахня Е.В., Казакевич И.О. Свойства Arihrobacter sp. препарата иммобилизованных клеток продуцента ксилозо(глюкозо)изомеразы. //Микробиология. 2003. Т. 72. С.395-399.

67. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. //Сб. научн. трудов "Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы". АН СССР, Пущинский научн. центр. Институт биологической физики. Пущино, 1991, с.81-159

68. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов. Пущино, 1985. 62с.

69. Синицын А.Л., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.:Изд-во МГУ. 1994. 288с.

70. Слабова О.И., Никитин Д.И. Иммобилизация олиготрофных бактерий на пористых носителях методом сорбции. // Микробиология. 2005. Y.74. Р.430-432.

71. Солянникова И.П. Организация биодеградативных путей у родококков. Дисс. докт. биол. наук. Пущино, 2007.

72. Суворова М.В., Соляникова И.П., Головлева Л.А. Особенности орто-расщепления пирокатехина при разложении пара-толуата бактерией Rhodococcus opacus lcp. //Биохимия. 2006. Т.71. Вып. 12. С. 1616-1624.

73. Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Сингирцев И.Н. Хранение штаммов промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы. //Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т. 36. С.59-67

74. Филиппова С.Н., Сургучева H.A., Кузнецов В.Д., Эль-Регистан Г.И., Гальченко В.Ф. Оптимизация защитных сред для хранения актиномицетов в жидком азоте. // Микробиология. 2007. Т.76. №4. С.573-576.

75. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе. М.:Мир. 1991. 204с.

76. Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Жуков В.Г. и др. Молекулярно-генетическая характеристика метаболических путей утилизации ароматических углеводородов консорциумами микроорганизмов. //Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т.41.ЖЗ.С. 298-302.

77. Хубларян М.Г., Моисеенко Т.И. Качество воды. // ВЕСТНИК РАН, 2009, Т.79. № 5. С.403-410.

78. Чумаков Ю.И. N окиси алкилпиридинов. // Методы получения химических реактивов и препаратов. М. ИРЕА. 1963. №7. С.58-61.

79. Чумаков Ю.И. Пиридиновые основания. Киев: Техника, 1965. 113с.

80. Чумаков Ю.И., Столяров З.Е. 2-метил-6-гидроксиметилпиридин, 2-гидроксиметилпиридин и 2,6-бис (гидроксиметил) пиридин. М. ИРЕА. 1963. №7. стр. 71-79.

81. Чумаков Ю.И., Столяров З.Е. 2-оксипиридин. М. ИРЕА. 1963. №7. стр. 65-69.

82. Шевченко А.Г., Старовойтов И.И., Зякун А.Ш. и др. Гидроксилирование хинолина бактериями Pseudomonas aeruginosa. II Докл. АН СССР. 1990. Т.310. №6. С.1493-1495.

83. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, 567с.

84. Abd El-Hady A., Abd El-Rehim H.A. Production of Prednisolone by Pseudomonas oleovorans Cells Incorporated Info PVP/PEO Radiation Crosslinlced Hydrogels. // J. Biomed. Biotechnol. 2004. V.4. P.219-226.

85. Adam W., Lukacs Z., Kahle C., Saha-Moller C.R., Schreier P. Biocatalytic asymmetric hydroxylation of hydrocarbons by free and immobilized Bacillus megaterium cells. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 11. P.377-385.

86. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Atlanta, GA:U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service. Toxicological profile for pyridine. 1992.

87. Akita S., Takeuchi H. Sorption equilibria of pyridine derivatives in aqueous solution on porous resins and ion exchange resins. // J. Chem. Eng. Jpn. 1993. V.26. №3. P. 237-241.

88. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecular Biology of the Cell. // New York. Garland Publishing Inc. 1994.

89. Anchordoguy T., Carpenter J.F., Loomis S.H. Crowe, J.H. Mechanisms of interaction of amino acids with phospholipid bilayers during freezing. // BB A. 1988. V.946.P.299

90. Anhalt J.P., Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry. //Anal. Chem. 1975. V. 47. P. 219-225.

91. Arima K., Kobayashi Y. Bacterial oxidation of dipicolinic acid. I. Isolation of microorganisms, their culture conditions, and end products. // J. Bacterid. 1962. V.84.P. 759-764.

92. Arnold R.J., Karty J.A., Ellington A.D., Reilly J.P. Monitoring the growth of a bacteria culture by MALDI-MS of whole cells. // Anal. Chem. 1999. V.71. P.1990-1996.

93. Ashwood-Smith M. J. Preservation of microorganisms by freezing, freeze-drying and desiccation. In: Low temperature preservation in medicine and biologe. Ed. by M. J. Ashwood-Smith and J.Farrat. Pitman Press, London. 1980. P.219-252.

94. Axcell B.C., Gearty P.J. Purification and some properties of a soluble benzene-oxidiziong system from a strain Pseudomonas. II Biochtm. J. 1975. V.146 P.173-183.

95. Banno J., Salcane T. Prediction of prospective viability of L-dried culture of bacteria after long-term preservation. // Res. Commun. Inst. Ferment. Osaka. 1981. №.10. P.33-38.

96. Behrman E. J., Stanier R. Y. The bacterial oxidation of nicotinic acid. // J. Biol. Chem. 1957. V.228. P. 923-945.

97. Behrman E.I., Pitt B.M. The Elbe peroxydisulfate oxidation in the pyridine series. A new synthesis of 2,3-dihydroxypyridine. // J.Am.Chem. Soc. 1958. V.80. P.3717-3718.

98. Behrman E.J.,Stanier R.Y. The bacterial oxidation of nicotinic acid. // J. Biol. Chem. 1957. V. 228. P. 923-945.

99. Beshay U., Abd-El-Haleem D., Moawad H., Zaki, S. Phenol biodégradation by free and immobilized Acinetobacter. II Biotechnol Lett 2002. V.24. P.1295-1297.

100. Bias J.C.T., Rezende R.P., Linardi V.R. Bioconversion of nitriles by Candida guilliermondii CCT 7207 cells immobilized in barium alginate. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.56. P.757-761.

101. Bradford M. A. Repid and sensitive method for the quantification miorogram quantifies of protein utilising the prinoiple of protein dye-binding. // Anal. Biochem. 1976. V.72. № 1-2. P. 248-254.

102. Brady D., Logan S.R., McHale A.P. The effect of soluble alginate and calcium on 13-galactosidase activity produced by the thermotolerant, ethanol-producing yeast strain Kluyveromyces marxianus imb3. // Bioprocess Engineering. 1998. V.18. P.101-104.

103. Buitink J., van den Dries I.J., Hoekstra F.A., Alberda M., Hemminga M.A. High critical temperature above Tg may contribute to the stability of biological systems. //Biophys. J. 2000. V.79 P.l 119-1128.

104. Cabral J.M.S., Kennedy J.F. Immobilization of microbial cells on transition metal-activated supports: Methods in enzy-mology. V. 135. // Eds. S.P. Colo wick, N.O. Kaplan. Orlando: Academic Press, 1987. P. 357-372.

105. Cain R. B., Houghton C., Wright K. A. Microbial metabolism of the pyridine ring. Metabolism of 2- and 3-hydroxypyridines by the maleamate pathway in Achromobacter sp. //Biochem. J. 1974. V. 140. P. 293-300.

106. Campball K.N., Ackerman L.F., Campball B.V. Studies of pyrones. II. Synthesis of 4-pyperidinols. //J. Org. Chem. 1950. V.15. P.337-342.

107. Chang C.C., Tseng S.K. A new method for carbon addition in an anoxic denitrification bioreactor. //Biotechnol. Tech. 1998. V.12. P.865-868.

108. Chang Y.-C, Chou C.-C. Growth and production of cholesterol oxidase by alginate-immobilized cells of Rhodococcus equi No. 23. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. V.35. P.69-74.

109. Chibata I., Tosa T., Sato T. Immobilized aspartase-containing microbial cells: preparation and enzymatic properties. // Appl Microbiol. 1974. V.27. P.878-885.

110. Colby J., Snell D., Black G.W. Immobilization of Rhodococcus AJ270 and Useof Entrapped Biocatalyst for the Productionof Acrylic Acid. //Monatshefte fur Chemie. 2000. V.131. P.655-666.

111. Collins M.D. Isoprenoid quinone analisis in bacterial classification and identification. // Chemical methods in bacterial sistematic (eds. M.Loodfellod and M/E/Minnildn). Academic Press. 1985. P.267-288.

112. Coradin T., Nassif N., Livage J. Silica-alginate composites for microencapsulation. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.61. P.429-434.

113. Corcoran B.M., Ross R.P., Fitzgerald G.F., Stanton C. Comparative survival of probiotic lactobacilli spray-dried in the presence of prebiotic substances. //Journal of Applied Microbiology 2004. V.96. P.1024-1039.

114. Crowe J.H., Crowe L.M., Oliver A.E., Tsvetkova N.M., Wolkers W.F., Tablin F. The trehalose myth revisited: introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state. // Cryobiology. 2001. V.43. P.89-105.

115. Crowe, J.H., Carpenter, J.F., Crowe, L.M., The role of nitrification in anhydrobiosis. // Annual Review of Physiology 1998.V.60. №1. P.73-103.

116. Cuiping Zhang, Mingchen Li, Guangli Liu, Haiping Luo, Renduo Zhang. Pyridine degradation in the microbial fuel cells. // J. Hazard. Mat. 2009. V.172. P.465-471.

117. Dalluge J.J. Mass spectrometry for direct determiniation of proteins in cells: Applications in biotechnology and microbiology. // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. V.366. P.701-711.

118. Davies D.G., McFeters G.A. Growth and comparative physiology of Klebsiella oxytoca attached to granular activated carbon particles and in liquid media. //Microbial Ecology. 1988. V. 15. P. 165-175.

119. Demirev P., Fenselau C. Mass spectrometry for rapid characterization of microorganisms. // Annu. Rev. Anal. Chem. 2008a V.l. P.71-93.

120. Demirev P., Ho Y., Ryzhov V., Fenselau C. Microorganism identification by mass spectrometry and protein database searches. // Anal. Chem. 1999. V.71. P.2732-2738.

121. Demirev P.A., Fenselau C. Mass spectrometry in biodefense. // J. Mass Spectrom. 2008b V.43. P. 1441-1457.

122. Dias J.C.T., Rezende R.P., Linardi V.R. Biodégradation of acetonitrile by cells of Candida guilliermondii UFMG-Y65 immobilized in alginate, k-carrageenan and citric pectin. // Braz. J. Microb. 2000. V.31. P.61-66.

123. Dobreva E., Tonlcova A., Ivanova V., Stefanova M., Kabaivanova L., Spasova D. Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable a-amylase, on polymer membranes. // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1998. V.20. P.166-170.

124. Dobson K.R., Stephenson M., Greenfield P.F., Bell P.R.F. Identification and treatability of organics in oil shale retort water. // Wat. Res. 1985. V.19. C. 849-856.

125. Domingo J.S., Radway J.C., Wilde E. W., Hermann P., Hazen T.C. Immobilization of Burkholderia cepacia in polyurethanebased foams: embedding efficiency and effect on bacterial activity. // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1997. V.18. P.389-395.

126. Duong T., Barrangou R., Russell W.M., Klaenhammer T.R. Characterization of the tre locus and analysis of trehalose cryoprotection in Lactobacillus acidophilus NCFM. // Appl Environ Microbiol. 2006. V.72. №2. P. 1218-25.

127. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complété nucleotide determination of entire genes , characterization ofgene coding for 16S ribosomal RNA. //Nucl. Acids Res. 1989. V.17. P.7843-7853

128. Elsgaard L. Ethylene Removal by a Biofilter with Immobilized Bacteria. //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.4168-4173.

129. Ensign J. C., Rittenberg S. C. The formation of a blue pigment in the bacterial oxidation of isonicotinic acid. // Arch. Microbiol. 1965. V.51. P. 384-392.

130. Evason D.J., Claydon M.A., Gordon D.B. Exploring the limits of bacterial identification by intact cell-mass spectrometry. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001. V.12.P.49-54.

131. Feng Y., Kaiser J-P., Minold R.D., Bollag J-M. Microbial transformation of ethylpyridines. // Biodégradation. 1994. V.5. P. 121-128.

132. Feng Y., Racke K.D., Bollag J.-M. Use of immobilized bacteria to treat industrial wastewater containing a chlorinated pyridinol. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V.47. P.73-77.

133. Fenselau C., Demirev P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. //Mass Spectr. Rev. 2001. V.20. P. 157-171.

134. Fetzner S. Bacterial degradation of pyridine, indole, quinoline and their derivatives under different redox conditions. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V 49. P. 237-250.

135. Fukushima Y., Okamura K., Imai K., Motai H. A new immobilization technique of whole cells and enzymes with colloidal silica and alginate. //Biotechnol. Bioeng. 1988. V.32. P.584-594.

136. Gardin PI., Pauss A. K-carrageenan/gelatin gel beads for the co-immobilization of aerobic and anaerobic microbial communities degrading 2,4,6-trichlorophenol under air-limited conditions. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.56. P.517-523.

137. Gauthier J. J., Rittenberg S. C. The metabolism of nicotinic acid. II. 2,5-Dihydroxypyridine oxidation, product formation, and oxygen 18 incorporation. //J. Biol. Chem. 19716. V.246. P. 3743-3748.

138. Gauthier S.S., Rittenberg S.C. The metabolism of nicotinic acid. Purification and properties of 2,5-dihydroxyperidine oxygenase from Pseudomonas putida N9. //J. Biol. Chem. 1971a. V. 246. N 11. P. 3737-3742.

139. Gauthier S.S., Rittenberg S.C. The metabolism of nicotinic acid. 2,5-dihydroxyperidine oxidation. Formation of products and incorporation of oxygen -18. // J. Biol. Chem. 19716. V. 246. N 11. P. 3743-3748.

140. Gauthier, J. J., Rittenberg S. C. The metabolism of nicotinic acid. 1. Purification and properties of 2,5-dihydroxypyridine oxygenase from Pseudomonas putida N-9. // J. Biol. Chem. 1971a. V.246. P. 3737-3742.

141. Gehrke C.W., Laking D.B. Gas-liquing chromatography of the purine and pyrimidine bases. // J. Chromatography. 1971. V.64. № 1. P. 135-142.

142. Geldreich E.E. Pathogenic agents in freshwater resources. // Hydrol. Process. 1996. V.10.P.315-333.

143. Gibson D.T., Mahadevan V., Davey J.F. Bacterial mttabolism of para- and metaxylene. Oxidation of the aromatic ring. // J. Bacteriol. 1974. №3.P.930-936.

144. Giebel R.A., Fredenberg W., Sandrin T.R. Characterization of environmental isolates of Enterococcus spp. by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.// Water Res. 2008. V.42. P.931-940.

145. Gomez Zavaglia A., Tymczyszyn E., De Antoni G., Anibal Disalvo E. Action of trehalose on the preservation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus by heat and osmotic dehydration. // J. of Applied Microbiology 2003. V.95 P.1315-1320.

146. Gostin L.O., Lazzarini Z., Neslund V.S., Osterholm M.T. Water quality laws and waterborne diseases: Cryptosporidium and other emerging pathogens. //Am. J. Public Health 2000. V.90. P.847-853.

147. Gough S., McHale A.P. Continuous ethanol production from molasses at 45°C using alginate-immobilized Kluyveromyces marxianus IMB3 in a continuous-flow bioreactor. // Bioprocess Engineering. 1998. V.19. P.33-36.

148. Graham D., Pereira R.3 Barfield D., Cowan D. Nitrile biotransformations using free and immobilized cells of a thermophilic Bacillus spp. // Enzyme Microbiol. Technol. 2000. V.26. P.368-373.

149. Griffin C.N., Cook E.C., Mehaffey M.A. Predicting the stability of freeze-dried tests. // Cryobiology. 1981. V. 18. №4. P.420-425.

150. Gupta R. C., Shukla O. P. 2-Hydroxy-isonicotinic acid—an intermediate in metabolism of isonicotinic acid hydrazide and isonicotinic acid by Sarcina. //Indian J. Biochem. Biophys. 1978. V.15. P. 492-493.

151. Gupta R. C., Shukla O. P. Metabolism of nicotinic acid by Sarcina sp. //Indian J. Biochem. Biophys. 1978. V.15. P. 462-464.

152. Gupta R. C., Shukla O. P. Microbial metabolism of 2-hydroxypyridine. //Indian J. Biochem. Biophys. 1975. V.12. P. 296-298.

153. Gupte A., D'Souza S.H. Stabilization of alginate beads using radiation polymerized Polyacrylamide. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1999. V.40. P.39-44.

154. Hallas L.E., Adams W.J., Heitkamp M.A. Glyphosate degradation by immobilized bacteria:field studies with industrial wastewater effluent. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.1215-1219.

155. Harary I. Bacterial fermentation of nicotinic acid. I. End products. // J. Biol. Chem. 1957. V.227. P. 815-831.

156. Harayama S., Timmis K.N. Metal ions in biological sistem. // Eds. H.Sigel, A.Sigel. NY. Marsel Dekker. 1992. V.28. P.99-156

157. Heclcly R.J. Preservation of microorganisms. // Adv. Appl. Microbiol. V.24. Academ. Press. NY. 1978. P.l-53.

158. Heitkamp M.A., Stewart W.P. A novel porous nylon biocarrier for immobilized bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.4659-4662.

159. Hirschberg R., Ensign J. C. Oxidation of nicotinic acid by a Bacillus species: purification and properties of nicotinic acid and 6-hydroxynicotinic acid hydroxylases. //J. Bacteriol. 1971a. V.108. P. 751-756.

160. Hirschberg R., Ensign J. C. Oxidation of nicotinic acid by a Bacillus species: source of oxygen atoms for the hydroxylation of nicotinic acid and 6-hydroxynicotinic acid. // J. Bacteriol. 19716. V.108. P. 757-759.

161. Hirschberg R., Ensign J. C. Oxidation of nicotinic acid by a Bacillus species: regulation of nicotinic acid and 6-hydroxynicotinic acid hydroxylases. // J. Bacteriol. 1972. V.l 12. P. 392-397.

162. Hirshberg R., Ensing L.C. Oxidation of nicotinic acid by a Bacillus species: source of oxygen atoms for the hydroxylation of nicotinic acid and 6-hydroxynicotinic acid. // J. Bacteriol. 1971. V.108. P.757-759.

163. Holcenberg J. S., Stadtman E. R. Nicotinic acid metabolism. III. Purification and properties of a nicotinic acid hydroxylase. // J. Biol. Chem. 1969. V.244. P. 1194-1203.

164. Hou C.T., Patel P., Lillard M.O. Extradiol cltavage of 3-methylcatechol by catechol 1,2-dioxygenase from various microorganisms. // Appl. Environ. Microbiol. 1977. V.33.P.725-727.

165. Houghton C., Cain R.B. Microbial metabolism pyridine ring. Formation of pyridine diols (dihydroxyperidine) as intermediates in the degradation of pyridine compounds by microorganisms. // J. Biochem. 1972. V. 190. P. 879893.

166. Houghton C., Cain R.B. Microbial metabolism pyridine ring. Formation of pyridine diols (dihydroxyperidine) as intermediates in the degradation ofpyridine compounds by microorganisms. // J. Biochem. 1972. V. 190. P. 879893.

167. Houghton C., Watson G.K., Cain R.B. The metabolism of 4-hydroxypyridine by Agrobacterium sp.: a new ring cleavage of the pyridine nucleus. //Biochem. J. 1969. V.l 14. P.75.

168. Houghton C., Wright K.A., Cain R.B. Pyridine diols as intermediates in the bacterial metabolism of the pyridine ring. // J. Biochem. 1968. V. 106. № 4. P. 51.

169. Hsieh S., Tseng C., Lee Y., ICuo A., Sun C., Lin Y., Chen J. Highly efficient classification and identification of human pathogenic bacteria by MALDI-TOF MS. // Mol. Cell Proteomics 2008. V.7. P.448-456.

170. Hubalek, Z., Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. //Cryobiology. 2003. V.46. P.205-229.

171. Hughes D. E. 6-Hydroxynicotinic acid as an intermediate in the oxidation of nicotinic acid by Pseudomonas fluorescens. II Biochim. Biophys. Acta. 1952. Y.9. P. 226-227.

172. PIunt A. L., Hughes D. E.s Lowenstein J. M. The hydroxylation of nicotinic acid by Pseudomonas fluorescens. //Biochem. J. 1958. V.69. P. 170-173.

173. Huynh S., Shell E.E. Enzymes of vitamin B6 degradation. // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. N 6. P. 1555-1559.

174. Imhoff-Stuckle D., Pfennig N. Isolation and characterization of a nicotinic acid-degrading sulfate-reducing bacterium, Desulfococcus niacini sp. nov. //Arch. Microbiol. 1983. V.136. P. 194-198.

175. International Agency for Research on Cancer (I ARC). Pyridine. //Summaries&Evaluations. 2000. V.77.

176. Israeli E., Shaffer B.T., Lighthart B., Protection of freeze-dried Escherichia coli by trehalose upon exposure to environmental conditions. // Cryobiology 1993. V.30P.519-523.

177. Jackson K.A., Edwards-Jones V., Sutton C.W., Fox A.J. Optimisation of intact cell MALDI method for fingerprinting of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // J. Microbiol. Methods 2005. V.62. P.273-284.

178. Jakoby W. B. Succinic semyldehyde. // Meth. Enzym. 1962. V.5. P.774.

179. Jiang H.-L., Tay J.-H., Tay S. T.-L. Aggregation of immobilized activated sludge cells into aerobically grown microbial granules for the aerobic biodégradation of phenol. // Lett. Appl. Microbiol. 2002. V.35. P.439-445.

180. Jiang J., Parker C.E., Fuller J.R., Kawula T.H., Borchers C.H. An immunoaffinity tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for detection of Francisella tularensis. // Anal. Chim. Acta 2007. V.605. P.70-79.

181. Jianlong W., Ping L, Yi Q. Biodégradation of phthalic acid esters by immobilized microbial cells. // Environ. International. 1997. V.23. P.775-782.

182. Jirku, V., Turkova, J. Cell immobilization by covalent linkage: Methods in enzymology. V. 135. // Eds S.P. Colo wick, N.O. Kaplan. Orlando: Academic Press, 1987. P. 341-357.

183. Jiwu Li, Weijiang Caib, Jingjing Cai. The characteristics and mechanisms of pyridine biodégradation by Streptomyces sp. // J. Hazard. Mater. 2009. V.165 P.950-954.

184. Jones M. V., Hughes D. E. The oxidation of nicotinic acid by Pseudomonas ovalis Chester. //Biochem. J. 1972. V.129. P. 755-761.

185. Kaiser J. P., Bollag J.M. The transformation of 3- and 4-picoline under sulfate-reducting conditions. // Appl. and Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 701-705.

186. Kaiser J.P, Bollag J.M. Metabolism of pyridine and 3-hydroxypyridine under aerobic, denitrifying and sulfate-reducing condition. // Experientia. 1991. Y.47. P.292-296.

187. Kaiser J.P., Feng Y., Bollag J.M. Metabolism of pyridine, qunoline, acridine and derivatives under aerobic and anaerobic conditions. // Microbiological Reviews. 1996.V. 60.P. 483-498.

188. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. // Anal. Chem. 1985. V.57. P. 2935-2939.

189. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. // Anal. Chem. 1988. V.60. P. 2299-2301.

190. Khanna M., Shulda O. P. Microbial metabolism of 3-hydroxypyridine. //Indian J. Biochem. Biophys. 1977. V.14. P. 301-302.

191. Kim M.IC., Singleton I., Yin C.-R., Quan Z.-X., Lee M., Lee S.-T. Influence of phenol on the biodégradation of pyridine by freely suspended and immobilized Pseudomonadas putida MK1. // Lett. Appl. Microbiol. 2006. V.42. P.495-500.

192. Kirsop B. Freeze-drying and kryopreservation of yeast cultures. Commonwealth Mecological Institute Publication. Kew. Surrey. UK. 1983.

193. Kobayashi Y., Arima K. Bacterial oxidation of dipicolinic acid. II. Identification of a-ketoglutaric acid and 3-hydroxydipicolinic acid and some properties of cell-free extracts. // J. Bacteriol. 1962. V.84. P. 765-771.

194. Kolenbrander P. E., LotongN., Ensign J. C. Growth and pigment production by Arthrobacter pyridinolis sp. // Arch. Microbiol. 1976. V.l 10. P. 239-245.

195. Kolenbrander P. E., Weinberger M. 2-Hydroxypyridine metabolism and pigment formation in three Arthrobacter sp. // J. Bacteriol. 1977. V.132. P. 51-59.

196. Kost A. N., Vorob'eva L. I., Terent'ev P. B., Modyanova L. V., Shibilkina O. K., Korosteleva L. A. Microbiological transformation of 2,6-dimethylpyridine. //Appl. Biochem. Microbiol. 1977. V.13. P. 541-546.

197. Kovalenko G.A., Kuznetsova E.V., Mogilnylch Yu.I., Andreeva I.S., Kuvshinov D.G., N.A. Rudina. Catalytic filamentous carbons for immobilization of biologically active substances and non-growing bacterial cells. // Carbon. 2001. V.39. P. 1033-1043.

198. Krishnainurthy T., Ross P. L., Rajamani U. Detection of pathogenic and nonpathogenic bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996. V.10. P.883-888.

199. Kulinsky V., Kolesnichenlco L.S. Extrinsic regulation of metabolic and energetic mitochondrial functions. // Focus on Signal Transduction Research. Ed. G. McApple. — NY: Nova Science Publishers, Inc., 2007.

200. Kung H.-F., Tsai L. Nicotinic acid metabolism. VII. Mechanisms of action of clostridial a-methyleneglutarate mutase (B12-dependent) and methylitaconate isomerase. // J. Biol. Chem. 1971. V.246. P. 6436-6443.

201. Lasch P., Nattermann H., Erhard M., Stàmmler M., Grunow R., Bannert N., Appel B., Naumann D. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. // Anal. Chem. 2008. V.80. P.2026-2034.

202. Lee G.M., Rhee S.K., Lee S.-T. Degradation of 3-methylpyridine and 3-ethylpyridine by Godonia nitida LE31. Appl. and Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4342-4345.

203. Lee J., Yoon J.-IT., Yang S.-Y, Lee S.-T. Aerobic biodégradation of 4-methylpyridine and 4-ethylpyridine by newly isolated Pseudonocardia sp. strain M43. // FEMS Microbiol. Lett. 2005. V.254. P. 95-100.

204. Leslie S.B., Israeli E., Lighthart B., Crowe J.H., Crowe L.M. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. // App. Environmental Microbiology 1995. V.61. P. 3592-3597

205. Leslie S.B., Israeli E., Lighthart B., Crowe J.H., Crowe L.M. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. // Applied and Environmental Microbiology 1995. V.61. P.3592-3597.

206. Lettau H. Chemie der Heterocyclen. // Leipzig,Germany. 1980. 360 p

207. Linders J.M., Wolkers W.F., Hoekstra F.A., van Riet K. Effect of added carbohydrates on membrane phase behavior and survival of dried Lactobacillusplantarum. // Cryobiology 1997. V.35. P.31-40.

208. Liu H., Du Z., Wang J., Yang R. Universal sample preparation method for characterization of bacteria by matrix-assisated laser desorption ionization -time of flight mass-spectrometry. // Appl. Envir. Microbiol. 2007. V.73. P. 1899-1907.

209. Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. //Enzyme and Microb. Technol. 1998. V.23. P.227-242.

210. Malik K.A. Liquid-drying of microorganism using a simple apparatus. UNESCO/WFCC Technical Information Sheet. №8. 1990.P.1.

211. Manohar S., Kim C.K., Karegoudar T.B. Enhanced degradation of naphthalene by immobilization of Pseudomonas sp. Strain NGK1 in polyurethane foam. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.55. P.311-316.

212. Marmur J.A. Procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. //J.Mol.Biol. 1961. V.3. P.208.

213. Marmur J.A., Dory P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid its thermal denaturation temperature. // J.Mol.Biol. 1962. V. 5. №1. P. 109-118.

214. Martín M., Mengs G.,. Plaza E, Garbi C., Sánchez M„ Gibello A., Gutierrez F., Ferrer E. Propachlor removal by Pseudomonas strain GCH1 in an immobilized-cell system. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P.1190-1194.

215. Mathur A.K., Majumder C.D., Chatterjee S., Partha Roy. Biodégradation of pyridine by the new bacterial isoletes S. putrefaciens and B. sphaericus. // J. Hazardous Materials. 2008/ V.157. Issues 2-3. P.335-343.

216. Meays C.L., Broersma K., Nordin R., Mazumder A. Source tracking fecal bacteria in water: A critical review of current methods. // J. Environ. Manage. 2004. V.73.P.71-79.

217. Meays C.L., Broersma K., Nordin R., Mazumder A. Source tracking fecal bacteria in water: A critical review of current methods. // J. Environ. Manage. 2004. V.73. P.71-79.

218. Moore F.W. The utilization of pyridine by microorganisms. // Journal of general microbiology. 1949. V.3. P. 143-147.

219. Morgan C.A., Herman N., White P.A., Vesey G. Preservation of microorganisms by drying. // J. of Microbiol. Methods. 2006. V.66. P.183-193.

220. Morgan C.A., Vesey G. Freeze-Diying of Microorganisms. Encyclopedia of Microbiology (Third Edition) 2009. P 162-173.

221. Mudliar S.N., Padoley K.V., Sureshkumar P.B.M, Lokhande S.K., Pandey R.A., Vaidya A.N. Pyridine biodégradation in noval rope bioreactor. //Bioresourse Technology. 2008. V.99. P.1044-1051.

222. Mukerjee-Dhar G., Shimura M., Kimbara K. Degradation of polychlorinated biphenyl by cells of Rhodococcus opacus strain TSP203 immobilized in alginate and in solution. // Enzyme Microb. Technol. 1998. V.23. P.34-41.

223. Oh Y.S., Maeng J., Kim S.J. Use of microorganism-immobilized polyurethane foams to absorb and degrade oil on water surface. // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. V.54. P.418-423.

224. Ohsugi M., Inoue Y., Takami K., Namikawa M. Microbial degradation of a-picolinic acid, 2-pyridinecarboxylic acid. //Agric. Biol. Chem. 1981. V.45. P. 1879-1880.

225. Oliveira A.C., Rosa M.F., Cabrai J.M.S., Aires-Barros M.R. Immobilization of Saccharomyces cerevisiae cells and rhizomucor miehei lipase for the production and extractive biocatalysis of ethanol. // Bioprocess Engineering. 1997. V.16. P.349-353.

226. Orpin C.G., Knight M., Evans W.C. The bacterial oxidation of picolineamide, a photolytic product of diquat. // J. Biochem. 1972. V. 127. P.819-831.

227. P.H.A. Sneath. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2. Baltimore: Williams & Wilkins. 1986.

228. Palade G.E. F stady of fixation for electron microspory. // J. Exp.Med. 1952. V.52. P.285-298.

229. Palmfeldt J., Radstrom P., Hahn-Hagerdal B., Optimization of initial cell concentration enhances freeze-drying tolerance of Psendomonas chlororaphis. // Cryobiology. 2003. V.47. P.21-29.

230. Pandey R.A., Padoley K.V., Mukherji S.S., Mudliar S.N., Vaidya A.N., Rajvaidya A.S., Subbarao T.V. Biotreatment of waste gascontaining pyridine in a biofilter. // Bioresour. Technol. 2007. V.98. P. 2258-2267

231. Park J.K., Chang H.N. Microencapsulation of microbial cells. // Biotechnol. Advances. 2000. V.18. P.303-319.

232. Pattanapipitpaisal P., Brown N.L., Macaskie L.E. Chromate reduction by Micro bacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol. // Biotechnol. Lett. 2001. V.23.P.61-65.

233. Perei K., Râkhely G., Kiss I., Polyâk B., Kovâcs K.L. Biodégradation of sulfanilic acid by Psendomonas paucimobilis. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.55.P.101-107.

234. Pereira W.E., Rostand C.E., Leiker T.J., Updergraff D.M., Beennett J.L. Microbial hydroxylation of quinoline in contaminated groundwater: evidence for incorporation of the oxygen atom of water. //J. Appl. Eviron. Microbiol. 1988. V.54. P.827-829.

235. Plazek. Uber die Nitriezung von einigen Methylhomologen des Pyridines.Ber. 1939. V.72. P.577.

236. Plieva F.M., Galaev I.Y., Noppe W., Mattiasson B. Cryogel application in microbiology. //Trends in Microbiology. 2008. V.16. №11. P. 543-551.

237. Pourciel M.L., Launay J., Sant W., Conédéra V., Martinez A., Temple-Boyer P. Development of photo-polymerisable polyvinyl alcohol for biotechnological applications. // Sensors and Actuators B: Chemical. 2003. V.94. P.330-336.

238. Pribil P., Fenselau C. Characterization of Enterobacteria using MALDI-TOF mass spectrometry. // Anal. Chem. 2005. V.77. P.6092-6095.

239. Rabinovici S.J.M., Bernknopf R.L., Wein A.M., Coursey D.L., Whitman R.L. Economic and health risk trade-offs of swim closures at a Lake Michigan beach.// Environ. Sci. Technol. 2004. V.38. P.2737-2745.

240. Rhee S.K., Lee G.M., Park Y.H. Anaerobic and aerobic degradation of pyridine by a newly isolated denitrifying bacterium. // Appl. and Environ. Microbiol. 1997. V. 63. N 7. P. 2578-2585.

241. Rogers J. E., Riley R. G, Li S. W. Microbial transformation of alkylpyridines in groundwater. // Water, Air and Soil Pollution. 1985. V.24. № 4. P. 443-454.

242. Rogers J.E., Riley R.G, Li S.W., O'Malley M.L., Thomas B.L. Microbial transformation of alkylpyridines in groundwater. // Water, Air and Soil Pollution. 1985. V.24. № 4. P. 443-454.

243. Ronen Z., Bollag J.-M. Biodégradation of pyridine and derivatives by soil and subsurface microorganisms. // Inter. J.of Environm, Analyt. Chemistry. 1995. V.59. P. 133-143.

244. Ronen, Z., Bollag J.-M. Pyridine metabolism by a denitrifying bacterium. //Can. J. Microbiol. 1991. V.37. P.725-729.

245. Ryu IT.-W., Wee Y.-J. Characterization of bioconversion of fumarate to succinate by alginate immobilized Enterococcus faecalis RKY1. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. V.91-93. P.525-535.

246. Sabah E., Celik M.S. Interaction of pyridine derivatives with sepiolite. // J. Colloid Interface Sci. 2002. V. 251. №1. P. 33-38.

247. Sabatini D.D., Bensch K., Barnett R.J. Cytochemistry and electron microscopy the preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. //J. Cell Biol. 1963. V.17. P. 19-58.

248. Sauer S., Freiwald A., Maier T., Kube M., Reinhardt R., Kostzewa M., Geider K. Classification and identification of bacteria by mass spectrometry and computational analysis. // PLoS ONE. 2008. V.3. e2843. doi:10.1371/journal. pone.0002843.

249. Schmauder H.-P., Schlosser D., Gunther T., Hattenbach A., Sauerstein J., Jungnickel F., Augsten H. Application of immobilized cells for biotransformations of steroids. // J. Basic Microbiol. 1991. V.31. P.453-477.

250. Schmidt J.E, Ahring B.K. Immobilization patterns and dynamics of acetate-utilizing methanogens immobilized in sterile granular sludge in upflow anaerobic sludge blanket reactors. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. P.1050-1054.

251. Schofield K. Hetero-aromatic nitrogen compounds. Plenum, New York. 1967. P. 144.

252. Seyfried B., S chink B. Fermentative degradation of dipicolinic acid (peridine-2,6-dicarboxylic acid) by a defined of strictly anaerobic bacteria. // J. Biodégradation. 1990. N l.P. 1-7.

253. Seyfried B., Schink B. Fermentative degradation of dipicolinic acid (peridine-2,6-dicarboxylic acid) by a defined of strictly anaerobic bacteria. // J. Biodégradation. 1990. N1. P. 1-7.

254. Shan H., Obbard J.P. Ammonia removal from prawn aquaculture water using immobilized nitrifying bacteria. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.57. P.791-798.

255. Sharma S., Sachdeva P., Virdi J.S. Emerging water-borne pathogens. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.61. P.424^128.

256. Shriver-Lake L.C., Gammeter W.B., Bang S.S., Pazirandeh M. Covalent binding of genetically engineered microorganisms to porous glass beads. //Analytica Chimica Acta. 2002. V.470. P.71-78.

257. Shukla O. P. Isolation, characterization and metabolic activities of a Bacillus sp. metabolizing a-picolinate. // Indian J. Exp. Biol. 1975. VI3. P. 80-82.

258. Shukla O. P. Microbial decomposition of a-picoline. // Indian J. Biochem. Biophys. 19746. V.ll.P. 192-200.

259. Shukla O. P., Kaul S. M. Microbial transformation of 2-picoline by Bacillus sp. II Indian J. Biochem. Biophys. 1973. V.10. P. 176-178.

260. Shukla O. P., Kaul S. M., Khanna M. Microbial transformation of pyridine derivatives: a-picolinate metabolism by a gram-negative coccus. // Indian J. Biochem. Biophys. 1977. V.14. P. 292-295.

261. Shukla O.P. Microbial decomposition of 2-ethylperidine, 2,4-lutidine and 2,4,6-collidine. // Indian J. Exp. Biol. 1975. V.13. P.564-575.

262. Shukla O.P. Microbial decomposition of pyridine. // Indian J. Exp. Biol. 1973. V.l 1. P.463-464.

263. Shukla O.P. Microbial tnransformation of pyridine compounds. // Proc. Indian Acad. Sci. (Chem. Sci.). 1984. V. 93. №. 7. P. 1143-1153.

264. Shukla O.P. Microbial transformation of a-picoline, 2-ethylpyridine and a-picolinate. // Biochem. J. 1972. V.128. P.64.

265. Shukla O.P., Kaul S.M. Constitutive pyridine degrading system in Corynebacterium sp. // Ind. J. Biochem. Biophys. 1974a. V. 11. N. 3. P. 201207.

266. Shukla O.P., Kaul S.M. Microbial transformation of pyridine-N-oxide and pyridine by Nocardia sp. II Can. J. Microbiol. 1986. V.32. P.330.

267. Shukla O.P., Kaul S.M. Succinate semialdehyd an intermediate in the degrative of pyridine by Brevibacterium sp. // Indian J. Biochem. Biophys. 1975. V.12. P.321-330.

268. Sidyakina T. M., Golimbet V. E. Viability and genetic stability of the bacterium Escherichia coli HB101 with the recombinant plasmid during preservation by various methods. // Cryobiology. 1991. V.28. P.251-254

269. Sims G.K. Metabolism of pyridine by Arthrobacter crystallopoietes. II Agron. Abstr.1987. P. 192.

270. Sims G.K., O'Loughlin E.J. Degradations in the environment. // Crit. Rev. Environ. Control. 1989. V.19 P.309-340.

271. Sims G.K., Sommers L.E. Degradation of pyridine derivatives in soil. // J. of Environ. Quality. 1985. V.14. N4. P. 580-584.

272. Sims G.K., Sommers L.E., Conopka A. Degradation of pyridine by Micrococcus luteus, isolated from soil. // Appl. and Environ. Microbiol. 1986. V. 51. N5. P. 963-968.

273. Sims K.G., O'Loughlin E.J. Riboflavin production during growth of Mirococcus luteus on Pyridine. // Appl. Envir. Microbiol. 1992. V.58. №10. P.3423-3425.

274. Singh R. P. Studies on the utilization of dipicolinic acid as carbon and nitrogen source by a laboratory isolated strain of Bacillus brevis. // Indian J. Exp. Biol. 1982. V.20. P. 223-226.

275. Singh R. P., Shukla O. P. Succinic semialdehyde: an intermediate in the degradation of isonicotinic acid by a Bacillus sp. // Indian J. Biochem. Biophys. 1977. V.18. P. 8-8-89.

276. Smole S.C., King L.A., Leopold P.E., Arbeit R.D. Sample preparation of gram-positive bacteria for identification by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight. // J. Microbiol. Methods. 2002. V.48. P. 107-115.

277. Stadtman E. R., Stadtman T. C., Pastan I., Smith L. D. Clostridium barkeri sp. nov. // J. Bacteriol. 1972. V.110. P. 758-760.

278. Stern M., Elmar H., Kut O.M., Hungerbuhler K. Removal of substituted pyridines by combined ozonation/fluidized bed biofilm treatment. // Water Sci. Technol. 1997. V.35. №4. P.329-335.

279. Streeter J.G. Effect of trehalose on survival of Bradyrhizobium japonicum during desiccation. // Journal of Applied Microbiology 2003. V.95. P.484-491.

280. Sulca M., Peslovaa K., Zabkaa M., Hajduch M., Havliceka V. Biomarkers of Aspergillus spores: Strain typing andprotein identification. // Int. J. Mass Spectrom. 2009. V.280. P.162-168.

281. Sun W.Q., Davidson P. Protein inactivation in amorphous sucrose and trehalose matrices: effects of phase separation and crystallization. //Biochimica en Biophysica Acta. 1998. V.1425. P.235-244.

282. Syu, M.-J, Wang, Y.-W. Immobilization materials mixed with activated sludge as column biofilters for the treatment of gaseous stream containing benzene and toluene. // Bioprocess Engineering. 1999. V.21. P.239-244.

283. Szczesna, M., Galas E., Bielecki S. PVA-biocatalyst with entrapped viable Bacillus subtilis cells. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2001. V.ll. P.671-676.

284. Szczesna-Antczak M., Antczak T., Bielecki S. Stability of extracellular proteinase productivity by Bacillus subtilis cells immobilized in PVA-cryogel. // Enzyme andMicrob. Technol. 2004. V.34. P.168-176

285. T. M. Sidyakina, N. D. Lozitskaya, T. G. Dobrovolskaya and L. V. Kalakoutskii. Cryopreservation of various types of soil bacteria and mixtures thereof. Cryobiology. 1992. V.29. P. 274-280.

286. Tate R. L., Ensign J. C. A new species of Arthrobacter which degrades picolinic acid. // Can. J. Microbiol. 19746. V.20. P. 691-694.

287. Tate R. L., Ensign J. C. Picolinic acid hydroxylase of Arthrobacter picolinophilus. II Can. J. Microbiol. 1974a. V.20. P. 695-702.

288. Taylor B. F., King C. A. Phthalic acid and pyridine dicarboxylic acids as catabolic analogs. //FEMS Microbiol. Lett. 1987. V.44. P. 401-405.

289. Travkin V.M., Solyanikova I.P., Golovleva L.A. Hydroxyquinol Pathway for Microbial Degradation of Halogenated Aromatic Compounds. // J. Environm. Sci. Health. 2006. V.41. P.1361-1382

290. Tsai L., Pastan L, Stadtman E. R. Nicotinic acid metabolism. II. The isolation and characterization of intermediates in the fermentation of nicotinic acid. // J. Biol. Chem. 1966. V.241. P. 1807-1813.

291. Tsai L., Stadtman E. R. Anaerobic degradation of nicotinic acid. // Methods Enzymol. 1971. V.18. P. 233-249.

292. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. // Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P.569-570.

293. Vargha M., Takats Z., Konopka A., Nakatsu C.H. Optimization of MALDI-TOF MS for strain level differentiation of Arthrobacter isolates. // J. of Microbiol. Methods. 2006. V.66. P. 399-409.

294. Verbelen P.J., De Schutter D.P., Delvaux F.R., Verstrepen IC.J., Delvaux F.R. Immobilized yeast cell systems for continuous fermentation applications. //Biotechnol. Lett. 2006. V.28. P. 1515-1525.

295. Watson G. K., Houghton C., Cain R. B. Microbial metabolism of the pyridine ring. The hydroxylation of 4-hydroxypyridine to pyridine-3,4-diol (3,4-di hydroxy pyridine) by 4-hydroxypyridine-3-hydroxylase. // Biochem. J. 1974a. V.140. P. 265-276.

296. Watson G. K., Houghton C., Cain R.B. Microbial metabolism of the pyridine ring. The metabolism of pyridine-3,4-diol (3,4-dihydroxypyridine) by Agrobacterium sp. // Biochem. J. 19746. V.140. P. 277-292.

297. Watson G.K., Cain R.B. Metabolic pathway of pyridine biodégradation by soil bacteria. // J. Biochem. 1975. V. 146. N 1. P. 157-172.

298. Watson G.K., Gain R.B. Metabolism ring by soil bacteria. // J. Biochem. 1972. V. 127. N 2. P.44

299. Widenue H., Danielsen S. Evaluation of the use of Sr2+ in alginate immobilization of cells. //Naturwissenschaften. 2001. V.88. P.224-228.

300. Williams H., Kaufmann P., Mosher H. S. The rearrangement of acylfurans to 3-hydroxypyridines. // J. Org. Chem. 1955. V.20. P. 1139-1145.

301. Williams L.T., Andrzejewslci D., Lay J.O., Musser M.S. Experimental factors affecting the quality and reproducibility of MALDI TOF mass spectraobtained form whole bacteria cells. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003. V.14. P. 342-351.

302. Yadanova T.N., Skokova I.F., Aleshina E.Yu., Gal'braikh L.S. Polyvinyl alcohol film materials containing biopolymers: preparation and properties. //Fibre Chemistry. 2000. V.32. P.347-352.

303. Yaohui Bai, Qinghua Sun, Cui Zhao, Donghui Wen, Xiaoyan Tang. Simultaneous biodégradation of pyridine and quinoline by two mixed bacterial strains. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. V.82. P.963-973.

304. Yaohui Bai, Qinghua Sun, Cui Zhao. Donghui Wen, Xiaoyan Tang. Microbial degradation and metabolic pathway of pyridine by a Paracoccus sp. strain BW001. //Biodégradation. 2008. V.19. P.915-926.

305. Yuan Y., Wang S., Song Z., Gao R. Immobilization of an L-aminoacylase-producing strain of Aspergillus oryzae into gelatin pellets and its application in the resolution of D,L-methionine. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. V.35. P.107-113.

306. Yudanova T.N., Skokova I.F., Aleshina E.Yu., Gal'braikh L.S. Polyfunctional biologically active polyvinyl alcohol film materials. // Fibre Chemistry. 2001. V.33. P.20-24.

307. Zefirov N.S., Agapova S.R., Terentiev P.B., Bulakhova I.M., Vasyukova N.I., Modyanova L.V. Degradation of pyridine by Arthrobacter crystal!opoietes and Rhodococcus opacus strains. // FEMS Microbiol. Let. 1994. V.118. P.71-74.

308. МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. ЛОМОНОСОВА1. БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ1. На правах рукописи1. ХАСАЕВА Фатимат Машировна05201±50586

309. ДЕГРАДАЦИЯ ПИРИДИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ РОДОВ АЮНКОВАСТЕЯ И КНОТУОСОССШ

310. Специальности 03.02.03 микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

311. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

312. Научные консультанты: д.б.н., профессор Нетрусов А. И.д.х.н., профессор Лебедев А. Т.1. Москва 2011

Информация о работе

Хасаева, Фатимат Машировна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Хасаева, Фатимат Машировна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хасаева, Фатимат Машировна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Хасаева, Фатимат Машировна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология