Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы специфической и неспецифической иммунопрофилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) карпа (CYPRINUS CARPIO L.)

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Методы специфической и неспецифической иммунопрофилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) карпа (CYPRINUS CARPIO L.)"

На правах рукописи

Гаврилин Кирилл Владимирович

МЕТОДЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ СЕПТИЦЕМИИ (АЭРОМОНОЗА) КАРПА {CYPRINUS CARPIO L)

03.00.10. "Ихтиология" 03.00.07. "Микробиология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства"

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Юхименко Людмила Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор, Умаров Марат Мутагарович.

кандидат биологических наук, Бекина Елена Николаевна.

Ведущая организация Межведомственная ихтиологическая комиссия

Защита диссертации состоится '<ЗЛ * ОлууииЯ. 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 307.003.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ) по адресу: 141821. Московская обл., Дмитровский р-н, пос. Рыбное.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП "ВНИИПРХ"

Автореферат разослан * ' 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Подоскина ТА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для прудовых хозяйств центральных и южных регионов Российской Федерации, выращивающих товарного карпа по интенсивной технологии, наиболее актуальной является проблема бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) рыб, обусловленной грамнегативными условно-патогенными бактериями, среди которых лидирующее место занимают подвижные аэромонады.

В 1999 г. неблагополучными по аэромонозу рыб признаны 39 пунктов. К началу 2003 г. - 37 (Яременко, Мачнев, 2000; Яременко, Селиверстов, 2003).

Традиционным, прочно вошедшим в практику рыбоводства методом борьбы с болезнями рыб бактериальной этиологии является их химиотерапия. Но в настоящее время применение антибиотиков и антибактериальных препаратов сильно ограничено из-за формирования среди бактериальных патогенов антибиотикорезистент-ных штаммов, возникновения под действием подавляющего большинства применяемых химиопрепаратов иммуносупрессии у рыб, разрушения механизмов регуляции численности популяций водных микроорганизмов.

Немаловажным является и загрязнение медикаментами конечной пищевой продукции, что значительно ограничивает возможности ее реализации. В условиях растущего насыщения потребительского рынка продукцией аквакультуры наиболее конкурентноспособной окажется экологически чистая, выращенная без применения антибиотиков рыба,

В данной ситуации иммунопрофилактика бактериальной геморрагической септицемии рыб становится весьма актуальной с точки зрения обеспечения здоровья рыб в условиях их искусственного выращивания и возможности дальнейшего развития интенсивного прудового рыбоводства

Цель работы. Разработать методы специфической и неспецифической иммунопрофилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) карпа [Cyprinus carpió L).

Задачи исследований:

1. Изучить эффективность применения пробиотика - субалина на основе Bacillus subUlis штамма 2335 для профилактики и терапии бактериальной геморрагической септицемии карпа в условиях интенсивного прудового рыбоводства.

2. Испытать в экспериментальных условиях бактерии из музейного штамма Aeromonas sobria 77-18. Исследовать протективный эффект, оказываемый вакцинацией, при искусственном заражении гомологичным и гетерологичными штаммами

вирулентных подвижных аэромонад. Проследить динамику развития иммунного ответа карпов на вакцинацию.

3. Провести испытания протективного действия и иммуногенного эффекта, оказываемого бактерином, в опытно-производственных условиях.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Исследовано влияние пробиотика субалина на динамическое равновесие в системе паразит-хозяин в условиях водной экосистемы интенсивно эксплуатируемого рыбоводного пруда. Подтверждена способность препарата, первоначально созданного для теплокровных животных, оказывать профилактический и терапевтический эффект при воздействии на пойкилотермный организм, повышать иммунитет рыб.

Впервые разработана и успешно испытана вакцина для рыб, предназначенная для профилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) путем групповой обработки рыб. Показана принципиальная возможность создания вакцин против подвижных аэромонад.

Практическаязначимостьработы. Применение в прудовом рыбоводстве новых высокоэффективных при борьбе с бактериальной геморрагической септицемией препаратов - пробиотика субалина и бактерина из A sobria 77-18 позволит избегать потерь, связанных с данным заболеванием, культивируемых гидробионтов за счет повышения способности организма рыб противостоять бактериальному прессингу из окружающей водной среды. Оба препарата являются альтернативой химиотерапев-тическим мероприятиям. Их применение позволит избегать загрязнения окружающей среды и получать высококачественную, экологически чистую и конкурентоспособную пищевую продукцию.

На защиту выносится совокупность новых научных результатов и положений. Применение пробиотика субалина на основе Вас. subtilis штамма 2335 и бактерина из A sobria штамма 77-18 могут служить методами профилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) карпа в условиях интенсивного прудового карповодства.

Автор принимал личное участие в проведении теоретических и экспериментальных исследований, результаты которых представлены в диссертации. Материалы по первичным экспериментальным испытаниям пробиотика и вакцины любезно предоставлены моим научным руководителем Л.Н. Юхименко. Все микробиологические исследования проведены совместно со ст.н.с, лаборатории ихтиопатологоии ФГУП "ВНИИПРХ" К.6.Н. Л.Н. Юхименко и н.с. той же лаборатории, к.б.н. Л.И. Бычковой. Значительную помощь в сборе первичного материала в опытно-

производственных условиях оказали трудовые коллективы ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и экспериментально-производственного отдела ФГУП "ВНИИПРХ* "Якоть".

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции "Аквакультура начала XXI века: истоки, состояние, стратегия развития", 3-6 сентября 2002 г. (пос. Рыбное, ФГУП "ВНИИПРХ"); Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов", 16-18 июля 2003 г. (пос. Борок, Институт биологии внутренних вод РАН); Памятных научных чтениях к 85-летию проф. ВА Мусселиус-Богоявленской (1918-2003), 1-2 октября 2003 г. (пос. Рыбное, ФГУП "ВНИИПРХ"); а также на методических, ученых советах и коллоквиумах лаборатории ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ".

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включая 41 таблицу. Содержит следующие разделы: введение; основную часть, заключение и список использованных источников. Основная часть включает в себя следующие подразделы: аналитический обзор, выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования, обобщение, оценка результатов исследования и основные выводы. Список использованных источников включает 171 работу, из которых 76 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР Бактериальная геморрагическая септицемия (аэромоноз) рыб и методы ее профилактики

Обзор посвящен проблеме бактериального заболевания рыб, вызываемого комплексом условно-патогенных грамнегативных бактерий, среди которых доминируют подвижные аэромонады. Эта проблема имеет наибольшее значение для прудовых хозяйств, выращивающих карпа по интенсивной технологии. Для характеристики этого неспецифического полиэтиологического бактериоза рядом отечественных и зарубежных авторов предложено использовать термин - бактериальная геморрагическая септицемия (БГС) рыб (Amlacher, 1972; Bullook et al., 1972; Austin, Austin, 1993; Юхименко, Койдан, 1997). Это не противоречит литературным источникам, где при помощи понятия аэромоноз характеризуют специфическую септицемию рыб и указывают возбудителя - определённый вид подвижного представителя p. Aeromonas.

В работе рассмотрены причины возникновения болезни, как совокупности нарастания численности и вирулентности грамнегативных факультативных патогенов в благоприятной для их существования эвтрофированной водной среде рыбоводного пруда, с одной стороны, и наличия плотной популяции восприимчивых хозяев, у которых антибактериальная резистентность снижена воздействием различных стрессоров, с другой.

К основным группам микроорганизмов, за последние годы наиболее часто регистрирующимся в качестве этиологических агентов БГС, относятся некоторые представители родов Aeromonas, Pseudomonas, Moraxella, Adnetobacter, сем. Enterobac-teriaceae (Boonyaratpalin, 1989; Жезмер и др., 1991; Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002). Указаны пути поступления данных групп микроорганизмов в экосистему рыбоводного пруда, описаны складывающиеся в водном микробиоценозе конкурентные взаимоотношения и приведены данные по опасности этих бактерий для здоровья человека.

Во второй части обзора литературы рассматриваются существующие на данный момент методы борьбы с БГС рыб. В ряде публикаций авторы подчеркивают, что часто эпизоотическое неблагополучие по бактериозам рыб в отечественной аквакультуре связано с нарушениями в биотехнологии культивирования гидробио-нтов (Юхименко и др., 1996; Юхименко, Койдан, 1997; Гаврилин и др., 2002). Основным из таких нарушений является пренебрежение или проведение в недостаточном объеме мероприятий, призванных оптимизировать зоогигиенические параметры водной среды, где выращивается рыба.

Рассмотрены материалы, касающиеся вопросов химиотерапии бактериозов рыб в аквакультуре. Большинство отечественных авторов говорят о необходимости применения значительного количества антибиотиков и антибактериальных препаратов при выращивании рыбы (Панасенко, 1990; Афанасьев, 1996; Бабенко, Аганесян, 1997; Скурат и др., 1997; Чугалинская, 1997). В зарубежных публикациях, наоборот, подчеркивается наблюдаемое в последние десятилетия снижение эффективности химиотерапии за счет роста количества антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, условно-патогенных не только для рыб, но и для человека, и указывается на необходимость получения в аквакультуре высококачественной экологически чистой пищевой продукции (Schlotfeldt et al., 1972; Brown, 1989; Me Millan, 1991; Me Pherson, 1991; Lewin, 1992; Dixon, 1994).

Выходом из данной ситуации является развитие иммунопрофилактических мероприятий в аквакультуре. В связи с этим приведены данные по недавним достижениям в области применения в аквакультуре вакцин и пробиотиков. Отдельно рассмотрен мировой опыт по разработке вакцин для рыб против подвижных аэромонад.

В литературных источниках представлен значительный теоретический материал по этому вопросу и показана принципиальная возможность создания вакцин против подвижных убиквитарных аэромонад (Shen, 1990; Гусева, Галаш, 1997; Юхименко и ДР., 1997).

2. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Все работы проведены в лаборатории ихтиопатологии ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства" с 1999 по 2003 гг. Иммуногенные и протективные свойства бактерина исследовали в аквари-альных и опытно-производственных условиях - на прудах экспериментально-производственного отдела ФГУП "ВНИИПРХ' "Якоть". Дополнительное испытание в производственных условиях проведено на тепловодном садковом хозяйстве "Нептун" НТЦ "Селекцентр" (Тверская область).

Испытания профилактического и терапевтического эффекта применения комбикорма, содержащего пробиотик субалин (ОАО "Днепрофарм"), проведены в Чере-пецком садковом хозяйстве Тульской области и на базе прудовых хозяйств: ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и в Лотошинском рыбхозе, расположенных в Московской области. Объектом исследования служили разновозрастные карпы, вода рыбоводных прудов и пробы лечебного комбикорма с субалином.

При сборе данных, необходимых для оценки эпизоотической ситуации на водоеме, был использован комплекс взаимосвязанных методов, включающий в себя клинический осмотр рыбы, ее патолого-анатомическое вскрытие, исследование микробиоценоза рыбы и среды ее выращивания - прудовой воды, оценку ряда иммунологических показателей культивируемого гидробионта.

Первичный посев материала проводили на плотные пластинчатые среды: Эндо и эритрит-агар. В дальнейшем изолированные колонии переносили на дифференциально-диагностическую среду - агар Клиглера Подвижные аэромонады дополнительно идентифицировали согласно со схемой, разработанной в лаборатории ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ' (Юхименко и др., 2001). Представителей сем. Entero-bacteriaceae типировали до рода, в некоторых случаях до вида при помощи "Определителя бактерий Берджи" (1997) и сокращённой таблицы биохимической дифференциальной диагностики (Кауфман, 1959). Идентификацию редко встречающихся микроорганизмов осуществляли до рода по "Определителю бактерий Берджи".

Вирулентность выделенных штаммов аэромонад оценивали по дезоксирибо-нуклеазной активности (Сборник..., 1998) на ДНК-азном агаре (Difco laboratories,

USA). Результаты, получаемые этим методом, в значительной степени коррелируют с данными биопроб на белых мышах (Хомяков и др., 2003).

Для контроля за активностью субалина в корме использовали метод прямого посева гранул комбикорма на поверхность эритрит-агара с канамицином. С целью определения приживаемости Вас. subtids в кишечнике рыб соскоб с поверхности слизистой оболочки кишечника засевали на эритрит-агар с канамицином. По завершении инкубации учитывали рост характерных колоний.

При приготовлении вакцины бактериальную массу A sobria штамма 77-18 смывали с поверхности эритрит-агара изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную суспензию центрифугировали, а осадок ресуспендировали. В окончательную суспензию клеток добавляли 0,1-0,2% формалина и выдерживали 24 часа при 37°С, после контроля ее стерильности определяли оптическую плотность и, исходя из этого, рассчитывали количество необходимое для создания в емкости для вакцинации рыб рабочей концентрации бактерина -1 09 кл/мл.

С целью исследования клеточного звена иммунитета рыб использовали реакцию завершенного фагоцитоза, специфического гуморального иммунитета - реакцию микроагглютинации. Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) демонстрировала суммарное действие гуморальных защитных факторов крови карпов. Определение БАСК проводили фотоколориметрическим методом, при исследовании уровня активности завершенного фагоцитоза - метод определения концентрации жизнеспособных микроорганизмов путем их высева на среду Эндо.

Защитный эффект тестируемых препаратов (бактерина и субалина) определяли по индексу защиты (Amend, 1981). Статистическую обработку данных, полученных при учете результатов реакции микроагглютинации, проводили по А Пьяцца (1981). Для статистической оценки данных активности фагоцитоза (реакция завершенного фагоцитоза) использовали методику И.Ашмарина с соавторами (1962). Достоверность различий средних величин определяли с помощью t-критерия Стью-дента, при уровнях значимости 95 и 99%. При обработке статистических материалов использовали компьютерную программу Microsoft EXEL - 97.

В процессе исследований клиническому осмотру подвергнуто 5300 экз. разновозрастных карпов. Проведен микробиологический анализ 2166 проб материала, взятого от 1013 разновозрастных карпов, 153 проб прудовой воды и 51 пробы лечебного гранулированного комбикорма с субалином. У 216 экз. рыб исследована приживаемость Вас. subtilis в кишечнике. Выделено и исследовано 1309 штаммов микроорганизмов, относящихся к 8 родам. В ходе иммунологических исследований поставлено 1304 реакции микроагтлютинации с различными антигенами, у 212 экз. карпов определена БАСК и у 222 экз. - уровень завершенного фагоцитоза.

2.2. Исследования эффективности применения пробиотика- субалина для профилактики бактериальной геморрагической септицемии карпа

2.2.1. Проверка протективного эффекта субалина в экспериментальных условиях проведена на сеголетках карпа средней массой 24 г. Рыб контрольной группы кормили гранулированным комбикормом РГМ 8М. Опытная фуппа получала тот же комбикорм, но содержащий субалин в количестве не менее 105 спор в грамме (по контрольному исследованию корма).

Установлено, что темп роста массы тела рыб в опытной группе составил 89,6% от первоначального, в то время как в контрольной - 45,8%. Для субалина получен 100% индекс защиты от экспериментального аэромоноза.

2. 22 Производственные испытанияпротективногодействия субалина. В Черепецком хозяйстве опытному кормлению с пробиотиком подвергли товарных карпов, содержавшихся в одном из садков. Рыбы были дважды отсортированы по клиническим признакам, т.е. в 100% случаев имели ярко выраженные поражения. Комбикорм, содержащий субалин в количестве не менее 105 спор в г (по результатам контрольного исследования корма), давали двумя курсами, по 3 дня каждый с перерывом в 4 дня. Контролем служил соседний садок, где карпы получали стандартный рацион.

За время наблюдения (21 день) в опытной группе погибло 8 особей, в контрольной - 20. Индекс защиты примененного препарата составил 60%.

223. Исследование иммуностимулирующего действия субалина. Для бо -лее полной характеристики биологического действия субалина в 2000 г. нами было предпринято изучение его влияния на уровень специфического иммунитета рыб, которое могло быть достигнуто за счёт нормализации всех физиологических процессов, протекающих в организме рыбы. Для этого нами был изучен уровень специфических антител сыворотки крови карпов.

Исследованы рыбы различных групп, получавших и не получавших субалин, выращиваемых при различных плотностях посадки в пруду.

На Центральном участке ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" сыворотки отбирали у 4-х групп рыб:

1-2 - из пруда №3, где рыба получала корм с субалином - мелкие (250-300 г) и крупные (500-600 г).

3 - из пруда № 1А, где средняя масса рыбы составляла 450 г, и она так же получала корм с субалином, но содержалась при более высоких плотностях посадки.

4 - из так называемого "министерского" пруда, где содержалась крупная (до 1 кг) рыба для спортивного рыболовства, не получавшая субалин.

Группы 5 и 6 - двухлетки карпа, чешуйчатые и зеркальные, из единственного пруда Образцовского участка ОАО "Бисеровский рыбокомбинат", получавшие субалин.

В рыбхозе "Лотошинский" исследовали одноразмерных сеголетков, которые в группе 7 получали комбикорм с субалином, а в группе 8 - стандартный рацион. Результаты исследований приведены в табл. 1.

Таблица 1

Уровень антителообразования у разноразмерных карпов, содержавшихся в различных условиях и получавших стандартную диету или кормившихся с добавкой субалина

№№ группы Кол- во, шт. Приживаемость субалина в кишечнике Используемый антиген 1одг обратного титра антител

1 9 + A. sobria 77-18 3,3 ±2,4

2 9 + A. sobria 77-18 8,0 + 1,3

3 7 + A. sobria 77-18 4,0 ±1,4

4 9 • A. sobria 77-18 5,1 ±2,5

5 8 + A. hydrophila 144-6п 9,9 + 0,9

6 12 + A. hydrophila 144-6п 9,2 ±0,6

7 8 + A. hydrophila 144-6п 6,8 + 1,2

8 10 - A. hydrophila 144-бп 6,1 ±0,7

По завершению исследований было установлено положительное влияние про-биотика на уровень антителообразования, которое играет важную роль в защите организма рыбы от бактериальных патогенов. Статистически достоверные различия между средними титрами специфических антител установлены между одноразмерными рыбами Центрального участка ОАО "Бисеровский рыбокомбинат", кормившимися стандартным рационом и с добавкой субалина (группы 2 и 4) Р < 0,01. У более мелких или находящихся в более неблагоприятных условиях (повышенные плотности посадки), но получавших субалин рыб также обнаружены циркулирующие антитела в достаточно высоких титрах

Различий между уровнями антителообразования в группах разнопородных карпов с Образцовского участка не обнаружено.

При исследовании интенсивности антителообразования у сеголетков карпа в рыбхозе "Лотошинский" установлено, что средний титр циркулирующих агглютининов в группе рыб, получавших субалин, статистически достоверно больше (Р < 0,05), чем в контроле, получавшем стандартный рацион.

2.2.4. Испытания субалина в условиях прудовыххозяйств в 2001 г. В ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" кормом с препаратом кормились карпы товарных групп, а в Лотошинском рыбхозе - сеголетки. Рыбхоз "Лотошинский" считается не-

благополучным по аэромонозу с 1989 г., но, благодаря комплексу проводимых вете-ринарно-санитарных мероприятий, заболеваний товарных рыб в острой форме не наблюдали с 1995 г. Основной проблемой хозяйства являлась выживаемость сеголетков в летний период. При обследовании рыб выявляли патологические изменения во внутренних органах и контаминацию подвижными аэромонадами. Для исследования влияния субалина на выживаемость сеголетков карпа в прудах №12 и 13 с 30.07. по 4.08. был проведен курс кормления с субалином. Пруд № 14 оставлен в качестве контроля. Условия выращивания сеголетков были одинаковыми как в опытных, так и в контрольном водоемах Исследования использовавшейся партии комбикорма с субалином показали его удовлетворительное качество и высокую активность содержавшегося в нем препарата.

В опытных прудах за время наблюдения общее микробное число (ОМЧ) воды колебалось от 5360 до 38400 колониеобразующих единиц в одном мл воды (КОЕ/мл). Микробиоценоз был представлен Adnetobactercalcoaceticus, MoraxeHasp., A. sobria, бактериями группы кишечной палочки (БГКП) и Proteus sp.. До кормления у 100% сеголетков наблюдались значительные патологические отклонения во внутренних органах (рыхлая гиперемированная печень, гипертрофированные почки). От 70 до 90% рыб имели внутренние органы, обсемененные БГКП и подвижными аэромонадами. После 6-ти дневного курса кормления с субалином в 100% случаев произошла нормализация состояния внутренних органов. В 70% случаев внутренние органы сеголетков не содержали бактериальной флоры.

В контрольном пруду ОМЧ воды было в среднем ниже, чем в опытных и колебалось от 7600 до 7980 КОЕ/мл, а ее микробиоценоз был представлен БГКП, Proteus, и A sobria. Все исследованные сеголетки имели выраженные патологические изменения во внутренних органах, которые у 78% были контаминированы комплексами подвижных аэромонад. К концу сезона количество рыб со стерильными внутренними органами снизилось еще на 8%, и в них продолжали наблюдаться патологические изменения.

Полученные результаты продемонстрировали высокую эффективность применения испытываемого пробиотика для деконтаминации и нормализации состояния внутренних органов сеголетков. Необходимо отметить, что препарат оказывал выраженное положительное действие даже при крайне высоком уровне бактериального прессинга в условиях выростного пруда № 13 (от 2,4 х 104 до 3,8 х 104 КОЕ/мл при наличии в микробиоценозе БГКП, Proteus sp.).

На базе ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" в 2001 г. препарат применялся в одном из нагульных прудов Центрального участка (1А) с трёхлетками карпа и Образцов-ском участке, где выращивался посадочный материал для трёхлетнего оборота.

В пруду 1А, где с субалином кормились трехлетки карпа, удалось добиться положительных результатов. После 2-х курсов кормления с субалином (по пять дней с промежутком 19 дней) у всех обследованных рыб исчезли клинические признаки и патологические изменения во внутренних органах (ранее наблюдаемые у 44% обследованных рыб). В 2,8 раза снизилось количество рыб, в посевах паренхиматозных органов которых обнаруживали рост бактериальной микрофлоры. Исследования лечебного комбикорма с субалином показали его хорошее качество. Получен положительный результат в 87% проб на приживаемость Вас. виМШв в кишечнике карпов.

На Образцовском участке ОАО "Бисеровского рыбокомбината", где содержались двухлетки после 2-х 5-ти дневных курсов кормления (перерыв 21 день) у 40% карпов сохранились клинические признаки. В 100% проб на приживаемость субалина в кишечнике получен отрицательный результат, а активность препарата в комбикорме была пониженной. Проведено дополнительное кормление рыб с пробиотиком (5 дней комбикормом другой партии). На этот раз в 80% проб обнаружена приживаемость пробиотика в кишечнике рыб. У всех карпов отмечено исчезновение клинических признаков и отсутствие контаминации внутренних органов.

Исследования, проведенные в Бисеровском и Лотошинском рыбхозах, показали эффективность применения субалина для улучшения иммуно-физиологического состояния рыбы и снижения уровня контаминации ее внутренних органов бактериальной флорой. В 2001 г. были получены результаты, которые вместе с исследованиями, проведенными в 1999 и 2000 гг., позволяют рекомендовать субалин как средство неспецифической иммунопрофилактики БГС рыб для прудовых карповодческих хозяйств.

2.3. Исследование протекгивного действия и иммуногенного эффекта бактерина из А воЬпаНАЬ

2.3.1. Испытания бактерина в экспериментальныхусловиях. Серия экспериментов, проведнных на годовиках и двухгодовиках карпа массой 35-38 г и 120-150 г соответственно, позволила установить концентрацию бактерина, дающую наибольший иммуногенный эффект при обработке рыб методом прямой иммерсии, как 109 микробных клеток в 1 мл рабочего раствора, и минимальную длительность обработки - 10-15 мин. Все дальнейшие работы с вакциной проводились исходя из этих параметров. В аквариальных условиях было проведено развернутое изучение про-тективного и иммуногенного эффекта бактерина. При проведении эксперимента имитировались условия весенней вакцинации двухгодовиков карпа средней массой 248,5 г, выращиваемых при трехлетнем обороте. Рыбы получали полноценный гранулированный комбикорм рецепта АК - 50 ФС. По завершении 10-дневного адапта-

ционного периода после посадки рыб в аквариальную при температуре 12°С был исследован исходный уровень иммунологических показателей (ИИП). При той же температуре проведена вакцинация 3-х опытных групп (в 3-х отдельных емкостях). После обработки карпов вакциной температура воды во всех емкостях в течение пяти дней была повышена до 20°С. Через 9 дней после вакцинации были взяты пробы крови у карпов 3-х вакцинированных (0) и 3-х контрольных (К) групп. Данные, полученные по завершении исследований, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Иммунологические показатели карпов до вакцинации (ИИП), опытных (О) и контрольных (К) фупп после вакцинации

Группа рыб Температура воды, °С Уровень завершенного фагоцитоза, % БАСК, % 1одг обратного титра антител

A. sobria 77-18 A. sobria 70-23П A. sobria 70-24П

ИИП 12 47,4 ±2,2 31,1 ±0,6 8,1 ±0,7 6,9 ±0,9 0,6 ±0,1

0 20 86,2 + 1,5 47,4 ±0,9 11,9 ±0,2 7,5 ±1,5 3,2 ± 1,3

к 20 78,2 + 2,2 43,0 ± 1,8 8,5 ±0,8 6,8 ±1,0 0,43 ±0,2

Анализ изложенных в табл. 2 данных показывает, что различия между средними по группам О и К, уровнем завершенного фагоцитоза, БАСК и титрами антител к A sobria 77-18, A sobria 70-24п статистически достоверны (Р < 0,01), а различия средних титров антител, специфичных к A sobria 70-23п, достоверны с более низкой степенью вероятности (Р < 0,05). Возрастание некоторых показателей в группе К по сравнению с начальным уровнем (ИИП) объясняется повышением температуры на 8°С. Следует отметить, что наиболее выраженный подъём претерпевают низкоспецифичные факторы защиты (БАСК и фагоцитоз), зависящие, в первую очередь, от физиологического состояния организма рыбы, в то время как различия по интенсивности гродукции агглютининов не выходят за рамки статистической ошибки.

По окончании восстановительного периода после взятия крови (14 дней) произведено заражение рыб внутримышечной инъекцией смывом суточных агаровых культур подвижных аэромонад - A sobria 77-18 (гомологичный штамм) и A sobria 70-23п, A sob//a 70-24л (гетерологичные штаммы).

Гибель рыбы началась в контрольной группе через 3 дня после заражения штаммом A sobria 77-18. У карпов наблюдали кровоизлияния в белковую оболочку глаз, гиперемию вокруг анального отверстия, припухлости в месте введения бактериальной суспензии. При патолого-анатомическом вскрытии в брюшной полости отмечали наличие кровянистого экссудата и отёк паренхиматозных органов. Позднее начали регистрировать локальное ерошение чешуи и обширное гнойное расплавление ткани в месте инъекции. Подобная клиническая картина была практически у всех

карпов контрольных групп и более чем у половины опытных. При вскрытии погибших рыб отмечали гипотрофию и гипоремию печени и почек, наличие выраженного спаечного процесса. Через 24 дня гибель рыб в опытных группах прекратилась и началось активное заживление поражений, развившихся в месте инъекции. Гибель рыб в контрольных группах продолжалась ещё 11 дней. У последних погибших экземпляров был выраженный геморрагический синдром, сопровождавшийся образованием язв.

У выживших в опытных группах карпов регенерация мышечной и покровных тканей в месте инъекции шла заметно быстрее по сравнению с контрольными. Данные по гибели двухгодовиков карпа от экспериментального аэромоноза и вычисленные на их основании индексы защиты (ИЗ), характеризующие протективный эффект бактерина, приведены втабл. 3.

Таблица 3

Индексы защиты испытуемого бактерина, полученные при экспериментальном аэромонозе

Группа рыб Заражающий штамм Заражено, экз. Погибло, экз. ИЗ

Oí A. sobria 70-23п 10 2 50%

К, 10 4

о2 A sobria 77-18 10 4 60%

Кг 10 10

Оз A. sobria 70-24П 10 2 67%

Кз 10 6

Обнаружен протективный эффект как при заражении гомологичным, так и гете-рологичными штаммами. Следует учитывать, что индексы защиты получены при максимально жёстком способе заражения - внутримышечном введении высоковирулентных аэромонад. Для заключительных иммунологических исследований выбраны группы, подвергнутые заражению A sobria 70-23п, так как там выжило большее количество рыб. Полученные результаты представлены втабл. 4.

Таблица 4

Некоторые иммунологические параметры опытной и контрольной групп рыб, выживших после экспериментального аэромоноза

Группа рыб Уровень завершенного фагоцитоза, % БАСК, % 1одг обратного титра антител

A sobria 77-18 A. sobria 70-23П A sobria 70-24П

Oí 73,2 ±2,6 78,0 ±0,3 18,5 ±0,5 13,1 ± 1,4 5,6 ±0,5

Ki 39,4 + 4,1 24,0 ±1,8 4,3 ±1,9 11,6 ±0,2 4,0 ±0,3

Анализ полученных данных указывает на то, что в опытной группе средние значения всех исследованных показателей достоверно выше, чем в контрольной (Р < 0,01). При сравнении результатов, полученных до и после заражения, установили, что у вакцинированных карпов после перенесенного экспериментального аэро-моноза произошло сильное повышение уровня БАСК (на 165%), которое можно объяснить появлением специфичных ко всем трем использованным антигенам антител в высоких титрах (до 1:262144) и незначительное (на 18%) снижение уровня завершенного фагоцитоза. В контрольной группе наблюдается сильное снижение всех неспецифических иммунных показателей (почти в 2 раза). Значительное увеличение претерпевает только интенсивность синтеза антител, специфичных к заражающему штамму (A sobria 70-23п). Данная ситуация может объясняться тяжело перенесенным заболеванием, сильно истощившим ресурсы организма, необходимые для продукции иммунных факторов, и возникшими физиологическими дисфункциями. В то же время антитела, продуцированные во время борьбы с инфекцией, сохранились в высоких титрах, что положительно характеризует иммуногенные свойства бактерина.

2.3.Z Испытания бактерина в условиях интенсивного прудового рыбоводства. Параллельно с экспериментальными исследованиями испытания иммуно-генных и протективных свойств вакцины вели в опытно-производственных условиях, на интенсивно эксплуатируемых нагульных прудах малой площади (0,5-0,61 га). Вакцинацию проводили в транспортировочных емкостях при перевозке рыб в нагульные или зимовальные пруды, что практически сводило на нет дополнительные трудовые затраты на обработку рыбы бактерином. Длительность контакта рыб с вакциной по техническим причинам могла варьировать в пределах от 15 до 25 мин.

При зарыблении двух экспериментальных нагульных прудов №4 и 5 было отобрано 210 экз. карпов, вакцинированных весной 2002 г. Все рыбы были без клинических признаков, средней массой 850 г. Из этой выборки 10 экз. подвергнуты иммунологическим, патолого-анатомическим и микробиологическим исследованиям, а остальные - ревакцинированы, помечены и по 100 экз. рассажены в экспериментальные пруды (группа Р). Затем нами было отобрано 810 экз. равноразмерных карпов того же возраста, ранее выращиваемых на ЭПО "Якать". Для дальнейших исследований оставлено 10 экз., из оставшихся рыб 200 карпов вакцинированы, помечены и размещены по 100 экз. в пруды №4 и 5 (группа В). Для доведения плотности посадки рыбы до нормативной в эти же пруды поровну были рассажены оставшиеся 600 экз. двухгодовиков (группа К). Вакцинация рыбы была проведена при температуре воды 13°С. Данные, полученные при исследовании рыб до вакцинации, представлены в табл. 5 и 6.

Таблица 5

Патолого-анатомическая картина, уровень обсемененносги паренхиматозных органов и характеристика микробиоценоза ранее вакцинированных и интактных

карпов весной 2003 г.

Группа рыб Патолого-анатомическая картина Уровень контаминации Выделенная микрофлора, ДНК-азная активность аэромонад, мм

Вакцинированные У100% рыб - печень и почки рыхлые, незначительно гипе-ремированные. Слизистая кишечника рыхлая У100% рыб-ростанет -

Интакг-ные У100% рыб - выраженный спаечный процесс в брюшной полости. Печень и почки рыхлые, шперемированные. Слизистая кишечника рыхлая с очаговыми кровоизлияниями 30% - роста нет, 50% - единичн., 10%-умерен., 10% - сливной 32%-A sobria (0-2,5), 38% - A sp.2 (1-1,5), 14% A caviae (0,5-2), 6% - A sp. 8 (3), 5% - A sp. 7 (2), 5% - A schubertii (0,5)

Таблица 6

Характеристика напряженности специфического иммунитета ранее вакцинированных и интактных карпов весной 2003 г.

Группа рыб !одг обратного титра антител

A sobna 77-18 A sobria 55-15п

Вакцинированные 8,0 ±0,4 6,0 ±1,4

Интаетные 3,6 ±0,4 3,3 ±1,9

Различия между средними показателями по группам статистически достоверны (Р < 0,01) для обоих антигенов. Положительное влияние бактерина на синтез антител продолжает сказываться даже по прошествии года.

На протяжении всего летнего периода бактериальная обсемененность воды в обоих прудах находилась в пределах 220 - 960 КОЕ/мл. Повышение ОМЧ воды до 1240 КОЕ/мл в пруду №5 и до 3740 КОЕ/мл в пруду №4, наблюдаемое в конце рыбоводного сезона, объясняется накоплением в водоёмах органики. В микробиоценозах в течение всего вегетационного периода доминировали подвижные аэромонады и бактерии группы кишечной палочки. Гибели рыб в опытных прудах или появления клинических признаков не наблюдали.

Заключительные исследования были проведены во второй половине октября. Зимовальный пруд, куда в конце сентября были пересажены трёхлетки из прудов №4 и 5, был частично обловлен. Методом случайной выборки из каждой группы

(Р, В, К) было отобрано по 20 экз. Вся отобранная рыба была без клинических признаков и значительных патологических изменений во внутренних органах. При микробиологическом исследовании контрольной рыбы обнаружено, что у 80% карпов паренхиматозные органы (печень и почки) были обсеменены единичными аэромонадами, в то время как в вакцинированной и ревакцинированной группах роста микрофлоры в посевах внутренних органов рыб не выявлено. Результаты, полученные при проведении исследования некоторых иммунологических показателей карпов вышеперечисленных групп, представлены в табл. 7.

Таблица 7

Характеристика иммунологических показателей карпов ревакцинированной (Р), вакцинированной (В) и контрольной (К) групп 22.10.03 г.

Группа рыб Уровень завершенного фагоцитоза, % БАСК, % 1одг обратного титра антител

А. аэЬпа 77-18 А. аэЬпа 55-15П

К 44,9 + 5,8 26,6 ±1,3 6,8 ±0,3 5,8 ±0,6

В 65,0 ±4,6 50,5 + 0,5 11,2 ±0,6 7,4 ±0,6

Р 73,6 ±4,0 55,5 ±0,7 11,8 ±0,2 7,6 ±0,6

Различия между средними по группам иммунологическими показателями статистически достоверны (Р < 0,01). Исключение составляют титры агглютинирующих антител в ревакцинированной и вакцинированной группах, различия между которыми несущественны. По сравнению с весенним уровнем титры антител значительно возросли во всех группах, что объясняется высоким иммуно-физиологическим статусом рыб после летнего нагула. Выявлено существенное положительное влияние ревакцинации на напряженность антибактериального иммунитета рыб, что позволяет рекомендовать ее для двухлеток при трехлетнем обороте.

2.3.3. Испытания бактерина в условияхтепловодного садкового хозяйст-вапроходили на садковом рыбоводном участке •Нептун" НТЦ 'Селекцентр". По предварительным данным, в хозяйстве во время второго года выращивания товарного карпа регулярно регистрировали язвенные поражения более, чем у 20% особей.

Работы в хозяйстве начаты с формирования двух групп по 500 экз. равнораз-мерных годовиков карпа без клинических признаков, одна из которых подверглась вакцинации при температуре 15°С, а другая осталась в качестве контроля.

При вскрытии годовиков, проведенном до вакцинации у всех обследованных рыб наблюдали патологические изменения внутренних органов. Из паренхиматозных органов всех рыб выделены единичные аэромонады. Двухгодовики с изъязвлениями на поверхности тела имели гипотрофированную рыхлую печень с массивными жировыми прослойками, в почках наблюдали застойную гиперемию, а их ткань имела рых-

лую консистенцию. Тем не меннее, рост бактериальной флоры в посевах взятого от них материала не обнаружен, т.е. язвообразование не сопровождалось септическим процессом.

В начале июля было отмечено язвообразование у рыб как в опытной, так и в контрольной группах. В середине июля был произведен осмотр всех карпов из групп В и К. У 13,4% рыб опытной группы отмечены язвенные поражения на поверхности тела и изредка - на жаберных крышках, не сопровождавшиеся проявлением каких-либо других болезненных симптомов. В контрольной группе карпов с аналогичной клинической картиной было 19,4 %. Гибель рыб ни в одной группе за время наблюдения не отмечена.

Патолого-анатомическое вскрытие 10 экз. рыб из каждой группы установило сходные патологические изменения во внутренних органах у всех 20-ти рыб. Печень была бледная, с массивными жировыми прожилками, гипотрофированная. Почки увеличенные, а их ткань рыхлая, селезёнка увеличена. Микробиологические характеристики карпов групп В и К представлены в табл. 8, основные параметры микробиоценоза воды - в табл. 9.

Таблица 8

Характеристика микробиоценоза карпов вакцинированной (В) и контрольной (К) фут

Группа рыб Уровень контаминации Микробиоценоз и ДНК-азная активность аэромонад (мм)

В 9 экз.-роста нет, 1 экз.-единичн. рост А. зр.2 (2-5)

К 7 экз.-роста нет, 2 экз. - единичн. рост, 1 экз.-умерен, рост 80% А. ф.2 (2-3), 20% А. БсЬиЬегй (4)

Таблица 9

Характеристика микробиоценоза воды водоёма-охладителя и садковой линии рыбоводного участка "Нептун" 15.07.03 г.

Место отбора проб ОМЧв КОЕ/мл Микробиоценоз и ДНК-азная активность аэромонад (мм)

Водоём-охладитель 360 60% - А всИиЬегШ (3), 20%-А 8оЬпа(2), 20% - Асте1 са1соасеИсиз

Садок 21 (с опытной рыбой) 400 60% - А воЬпа (1 - 5), 20% -А-эр. 2 (3,5), 20%-БГКП

Садок 9 (с контрольной рыбой) 780 80% - Аапе1 са1соасей'сиз, 20%-Азр. 3(1)

Анализ данных, полученных в ходе проведённых исследований, позволил однозначно отклонить предположение об эпизоотическом неблагополучии хозяйства по БГС. О небактериальной этиологии язвенного синдрома у рыб однозначно говорили результаты микробиологических исследований, а клиническая картина была нехарактерной для септицемии, вызванной грамнегативными бактериями, в то время как патолого-анатомическая картина могла свидетельствовать о наличии токсического фона в воде.

Окончательный учёт результатов опыта произведен во второй половине сентября. При осмотре 20 экз. карпов опытной группы клинических признаков не обнаружено, в то время как 3 рыбы из 20-ти, взятых из контроля, имели незначительные изъязвления на поверхности тела и у 6-ти наблюдалась гиперемия брюшка Средняя масса рыб в опытной группе составляла 1540 г, а в контрольной -1305 г. При вскрытии карпов, из опытной и контрольной групп, помимо больших количеств полостного жира и гипотрофии печени, значительных патологических отклонений во внутренних органах не обнаружено.

Из паренхиматозных органов карпов опытной группы у 20% выделены единичные аэромонады, ацинетобактеры и представители сем. Enterobacteriaceae. В контрольной группе контаминированными оказались внутренние органы 40% обследованных рыб. От них выделялись единичные аэромонады и неферментирующие щелочеобразователи. При проведении иммунологических исследований выявлено, что средние показатели в группе вакцинированных карпов были достоверно выше (Р < 0,01) аналогичных показателей в контрольной группе (табл. 10).

Таблица 10

Иммунологические показатели двухлеток карпа групп В и К рыбоводного участка "Нептун

Группа рыб Уровень завершенного фагоцитоза, % БАСК, % 1одг обратного титра антител

АадЬпа 77-18 (гомологичный) А. воЫа 48-12пч (гетерологичный)

В 30,2 ±3,2 62,6 ±1,6 10,8 ±0,2 7,6 ±0,2

К 16,3 ±3,5 очень низкая 8,4 ±0,6 6,2 ±0,6

Более высокая напряженность неспецифического иммунитета, сформировавшаяся под действием вакцины, обеспечила большую резистентность организма рыб к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды и, как следствие, меньший процент поражённых особей. Различия в средней массе рыб опытной и контрольной групп составили 235 г.

2.4. Обобщение и оценка результатов исследования

Для компенсации воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды при выращивании рыбы все более широкое применение находят пробиотики. Нами для неспецифической иммунопрофилактики БГС карпа в условиях интенсивного прудового рыбоводства использовался субалин.

Испытания препарата, проведенные в экспериментальных условиях, выявили его способность оказывать пробиотический эффект на пойкилотермных животных. При кормлении рыб с субалином установлены более высокие темпы их роста - на 43,8% выше, чем в контроле. Получен индекс защиты - 100% при экспериментальном аэромонозе. Причем следует отметить, что инфекционный процесс у карпов, получавших пробиотик, протекал доброкачественно, болезнь не переходила в хроническую форму и не вызывала гибели рыбы.

Испытания препарата в опытно-производственных условиях проходили на фоне высокого уровня бактериального прессинга на выращиваемую рыбу. Внутренние органы большинства карпов были контаминированы условно-патогенными микроорганизмами; зачастую имеющая место инфекция была клинически выражена. Кормление рыб с субалином во всех случаях в течение ближайшего времени приводило к исчезновению клинических признаков и нормализации состояния внутренних органов.

Необходимо отметить, что в ряде случаев применение пробиотика не позволило добиться полной деконтаминации внутренних органов 100% рыб. Анализ фактического материала показывает, что этот эффект мало зависит от параметров микробиоценоза прудовой воды, определяющих уровень бактериального прессинга, а в первую очередь связан с колонизационной активностью действующего начала препарата - жизнеспособными спорами Вас. subtlis. Необходимо отметить, что сохранение микрофлоры во внутренних органах у значительного количества обследованных рыб сопровождается большим процентом отрицательных проб на приживаемость субалина в кишечнике. Пробиотический эффект субалина может быть сильно снижен сокращением сроков профилактического кормления карпов, недостаточным количеством препарата в корме или его неравномерным распределением, неудовлетворительным качеством комбикорма.

Улучшение физиологического состояния при кормлении рыб с субалином подтверждают данные иммунологических исследований. В группах разновозрастных карпов, проходивших в течение рыбоводного сезона несколько курсов профилактического кормления, наблюдали усиление, по сравнению с контрольными группами, продукции специфических антител.

Нами проведены испытания бактерина, приготовленного из цельных формали-низированных клеток штамма A sobria 77-18 - облигатного патогена рыб, выделенного при естественной вспышке аэромоноза. При экспериментальном заражении карпов вирулентными подвижными аэромонадами показано, что вакцина защищает как от гомологичного, так и от гетерологичных штаммов. В группах вакцинированных рыб наблюдали качественно иное: доброкачественное течение инфекции. Болезнь не переходила в хроническую форму, зараженные рыбы быстрее выздоравливали, у них интенсивнее шли процессы регенерации поврежденных тканей.

Следует отметить различия в биологических свойствах факультативно и обли-гатно патогенных аэромонад. Штаммы A sobria 70-23п и A sobria 70-24п, выделенные от карпов без клинических признаков, несмотря на индуцированную вирулентность, не вызвали гибели 100% рыб в контрольных группах, в то время как все не-вакцинированные карпы, зараженные A sobria 77-18, погибли.

Таким образом, можно говорить о высоком уровне протективного эффекта, оказываемого бактерином. При менее жестком способе заражения и меньшей заражающей дозе, возможно получение еще более высоких индексов защиты. Их различия, учитывая малочисленность опытных и контрольных групп, не могут быть признаны существенными.

Динамика иммунного ответа, наблюдаемая в опыте, соответствовала изложенным в литературе данным. На 9-й день после вакцинации в опытных группах рыб наблюдали резкое возрастание всех исследованных иммунологических показателей. Увеличение БАСК и уровня завершенного фагоцитоза в контрольных группах объясняется повышением температуры воды. У выздоравливающих рыб отмечено появление специфических к заражающему штамму антител в очень высоких титрах.

Показано, что обработка рыб бактерином при 12°С, с последующим повышением температуры воды позволяет вакцине оказывать достаточное иммунногенное и про-тективное действие. Это определяет возможность весенней вакцинации рыб при пересадке в нагульные пруды, до активации водной условно-патогенной микрофлоры.

В хозяйстве, где проходили опытно-производственные испытания бактерина, не регистрировалась клинически выраженная БГС среди культивируемых рыб, в связи с чем оценка протективного эффекта вакцинации по внешним проявлениям болезни невозможна. Поэтому мы использовали не менее информативный в этом плане показатель - уровень контаминации паренхиматозных органов (печени и почки) карпов грамнегативной микрофлорой и обусловливающий ее уровень бактериального прессинга. При средних значениях ОМЧ воды наблюдается обсемененность внутренних органов интактных рыб, в то время как внутренняя среда организма вакцинированных рыб остается стерильной. В случае очень высокого уровня бактери-

ального прессинга, сопровождающегося наличием дополнительных стрессирующих факторов, различия по данному параметру могут становиться несущественными. Но патогены, внедрившиеся в организм вакцинированных рыб, в большинстве случаев не повреждают органы и ткани макроорганизма, несмотря на то, что обладают значительной вирулентностью. Микрофлора, контаминирующая органы интактных карпов, значительно менее вирулентна и вызывает латентную инфекцию, сопровождающуюся патологическими изменениями во внутренних органах.

Установлено положительное влияние ревакцинации на некоторые иммунологические показатели карпов (БАСК, фагоцитоз), на основании которого вакцину можно рекомендовать для обработки двухгодовиков карпов перед третьим сезоном выращивания.

Результаты, полученные в ходе испытания вакцины на рыбоводном участке «Нептун» НТЦ "Селекцентр", указывают на ее способность оказывать протективный эффект при язвенном синдроме небактериальной этиологии. Это может быть объяснено возрастанием под действием вакцины уровня БАСК и фагоцитоза, а также системным характером всех защитно-приспособительных реакций организма. Вакцинированная рыба имеет более высокие барьерные функции поверхностей тела и затрачивает значительно меньшее количество энергетических и пластических ресурсов на инактивацию, деструкцию и элиминацию внедрившихся патогенов. Находящиеся в лучшем физиологическом состоянии рыбы активнее сопротивляются любым неблагоприятным воздействиям. В вакцинированной группе на 31 % меньше количество рыб с язвенными поражениями и на 235 г больше средняя масса тела карпов.

Обобщая полученный в ходе экспериментальных и опытно-гроизводственных испытаний бактерина из A sobria 77-18 материал, можно говорить о получении эффективной вакцины против убиквитарных подвижных аэромонад с иммерсионным способом введения, пригодной для промышленного изготовления и использования в хозяйствах различного типа.

Предложенные иммунопрофилактические мероприятия способны эффективно контролировать эпизоотическую ситуацию по БГС (аэромоноза) карпа и вносить значительный вклад в обеспечение нормального протекания интенсифицированного рыбоводного процесса.

ВЫВОДЫ

1. Испытания пробиотика субалина в аквариальных условиях позволили установить индекс защиты карпов от экспериментального аэромоноза -100%. Также выявлено положительное влияние препарата на увеличение темпов роста. В условиях теплого

водного садкового (рыбхоз "Черепецкий") и прудового (ОАО "Бисеровский рыбокомбинат") карповых хозяйств показана высокая эффективность субалина при терапии клинически выраженной БГС.

2. Установлено, что под действием субалина усиливается продукция циркулирующих антител. Иммуностимулирующее действие препарата показано на карпах товарных групп в ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и на сеголетках в рыбхозе "Ло-тошинский".

3. Кормление рыб с субалином дает выраженный и стабильный эффект декон-таминации внутренних органов рыб, независимо от уровня бактериального прессинга окружающей водной среды.

4. Использование субалина на ОАО «Бисеровский рыбокомбинат» позволило эффективно контролировать эпизоотическую ситуацию по БГС карпа, несмотря на высокую интенсификацию рыбоводного процесса и полностью отказаться от применения антибиотиков и антибактериальных препаратов. Достоверные результаты, положительно характеризующие пробиотический препарат позволяют рекомендовать субалин на основе Вас. subtilis 2335 (регистр. № ВКПМ В-4759) для профилактики БГС рыб в условиях интенсивного прудового рыбоводства.

5. При экспериментальном испытании бактерина из A sobria штамма 77-18 получены высокие индексы защиты при внутримышечном заражении карпов гомологичным и гетерологичными штаммами вирулентных подвижных аэромонад.

6. Установлено, что пониженные температуры воды (не менее 12°С) не оказывают отрицательного влияния на эффективность вакцинации и формирование карпом приобретенного иммунитета, что определяет возможность весенней вакцинации рыб.

7. Испытания бактерина в опытно-производственных условиях выявили его высокие иммуногенные и протективные свойства.

8. Установлено положительное влияние вакцины на прирост массы тела товарных карпов в условиях хозяйства неблагополучного по язвенному синдрому небактериальной этиологии (рыбоводный участок "Нептун"). На основании публикаций ряда отечественных исследователей этот факт объяснен тем, что вакцинированная рыба способна затрачивать больше пластических и энергетических ресурсов, получаемых с кормом, на продукционный рост, не тратя их на элиминацию внедрившихся патогенов.

9. Методика проведения вакцинации, используемая нами, увязывает ее с биотехнологическими рыбоводными мероприятиями и практически сводит на нет трудовые затраты на дополнительную обработку рыбы.

10. Данные, положительно характеризующие протективный и иммуногенный эффект, оказываемый вакциной, позволяют рекомендовать препарат для специфической иммунопрофилактики БГС рыб.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Юхименко Л.Н., Койдан ГС, Бычкова Л.И., Гаврилин К.В., Сурова ИА Разработка бактерина для групповой вакцинации рыб против аэромоноза // Мат-лы докл. науч.-практ. конф. 'Проблемы и перспективы развития аквакультуры в России". -Адлер.: Здравствуйте, 2001. - С. 181.

2. Юхименко Л.Н., Койдан ГС, Головин П.П., Головина НА, Бычкова Л.И., Гаврилин К.В., Сурова ИА Протективное действие субалина против болезней культивируемых рыб // Мат-лы докл. науч.-практ. конф. "Проблемы и перспективы развития аквакупьтуры в России". - Адлер.: Здравствуйте, 2001. - С. 282-283.

3. Юхименко Л.Н., Койдан ГС, Бычкова Л.И., Гаврилин К.В. Этиологическая структура аэромонад и эпизоотическая ситуация в рыбоводных хозяйствах // Рыбн. хоз.-во. Сер. Болезни гидробионтов в аквакультуре. Аналит. и реф. информ. М.: ВНИЭРХ. - 2001. - Вып. 4. - С. 1-9.

4. Гаврилин К.В. Опыт борьбы с бактериальной геморрагической септицемией (БГС) в условиях декоративной аквариумистики // Мат-лы Межд. науч.-практ. конф. молодых ученых "Проблемы аквакультуры и функционирования водных экосистем". -Киев, 2002.-С. 147-149.

5. Гаврилин К.В., Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И. Влияние факторов окружающей среды на микробиоценоз рыбоводных прудов // Мат-лы Межд. науч.-практ. конф. "Аквакультура начала XXI века: истоки, состояние, стратегия развития". - М.: ВНИ-РО, 2002.-С. 282-285.

6. Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И., Гаврилин КВ. Испытания лечебного комбикорма с субалином в рыбхозах Московской области // Рыбн. хоз-во. Сер. Болезни гидробионтов в аквакультуре. Аналит. и реф. информ. М.: ВНИЭРХ. - 2002. - Вып. 2. -С. 18-27.

7. Юхименко Л.Н., Койдан ГС, Бычкова Л.И., Гаврилин К.В. Этиологическая структура аэромонад и её влияние на развитие эпизоотического процесса // Мат-лы Межд. науч.-практ. конф. "Аквакультура начала XXI века: истоки, состояние, стратегия развития". - М.: ВНИРО, 2002. - С. 240-244.

8. Гаврилин К.В., Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И. Специфическая иммунопрофилактика аэромонадной инфекции карпа (Cyprinus carpió L) II Тез. докл. Всерос. науч.-

практ. конф. "Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов". - М.: Россельхозакадемия, 2003. - С. 24-25.

9. Хомяков Ю.Н., Хомякова Т.И., Борзенкова Т.К. Борзенков В.Н., Гаври-линК.В., Юхименко Л.Н., Северин СЕ. Исследование вирулентности штаммов А hydrophila, полученных из разных природных источников // Междунар. конгресс "Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы". -С.-Петербург.: Ин-т Пастера, 2003. - С. 120.

10. Юхименко Л.Н., Гаврилин КВ., Бычкова Л.И. Химиотерапия бактериальных болезней рыб, достоинства и недостатки // Сб. тез. Всерос. науч.-практ. конф. "Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов". - М.: Россельхозакадемия, 2003. - С. 142-143.

Отпечатано в Полиграф-агентстве «Литера». Пола к печати 22.03.04г. Обуем 1.5 пл. Тираж 100 экз. Печать листовок, брошюр, авторефератов, буклетов: (095) 198-7033, »mail: mera@crosna.net

* - б 15 в

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврилин, Кирилл Владимирович

Введение

Основная часть.

1. Аналитический обзор

Бактериальная геморрагическая септицемия аэромоиоз) рыб и методы её профилактики.

2. Выбор направления исследований.лО

3. Теоретические и экспериментальные исследования.

3.1. Материалы и методы исследований.

3.1.1. Методы эпизоотических, клинических и патолого-анатомических исследований.

3.1.2. Методы экспериментального испытания протективного эффекта бактерина.

3.1.3. Микробиологические методы исследования .''■!■

3.1.4. Иммунологические методы исследования.6?

3.1.5. Математические и статистические методы

3.2. Исследование эффективности применения пробиотика субалина для профилактики бактериальной геморрагической септицемии карпа

3.2.1. Проверка протскивного эффекта субалина в экспериментальных условиях.

3.2.2. Производственные испытания протективного действия субалина в тепловодном садковом хозяйстве.7к

3.2.3. Производственные испытания иротективного действия субапина в условиях прудового карпового хозяйства.

3.2.4. Способ изготовления гранулированного комбикорма с субалином.

3.2.5. Контроль качества препарата субалина, выпускаемого различными производителями.

3.2.6. Исследование иммуностимулирующего действия субалина.

3.2.7. Испытания субалина в условиях прудовых карповых хозяйств в 2001 г.

3.3. Исследование иротективного действия и иммуногенного эффекта бактерина из

Aeromonas sobria штамма 77-18.

3.3.1. Испытания бактерина в экспериментальных условиях .'.9)

3.3.2. Испытания бактерина в условиях интенсивного прудового рыбоводства.

3.3.3. Испытания бактерина в условиях тепловодного садкового хозяйства

3.4. Обобщение и оценка результатов исследования.

Ныводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методы специфической и неспецифической иммунопрофилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) карпа (CYPRINUS CARPIO L.)"

Развитие аквакультуры, в целом, и прудового рыбоводства, в частности, обеспечивается интенсификацией биотехнологий культивирования гидробионтов. Это предусматривает использование высоких плотности\\ посадки рыбы, что влечет за собой значительное загрязнение окружающей водной среды органическими веществами.

В условиях высокой антропогенной нагрузки на прудовую экосистему естественные механизмы регуляции численности популяций паразита и хозяина не срабатывают. Одним из важнейших биологических факторов, нарушающих нормальное течение рыбоводного процесса, становятся инфекционные заболевания культивируемых рыб.

Для прудовых хозяйств центральных и южных регионов Российской Федерации, выращивающих товарного карпа по интенсивной технолог*."., наиболее актуальной является проблема бактериозов рыб, обусловленных грамнегативными бактериями, среди которых лидирующее место занимают подвижные аэромонады. Вызываемый ими язвенно-геморрагический синдром характеризуется терминами: бактериальная геморрагическая септицемия (БГС), аэромоноз, краснуха или краснухоподобное заболевание.

По данным за 1997 год 124 предприятия Росрыбхоза являлись неблагополучными по аэромонозу рыб, а согласно информации ветеринарной службы на территории Российской Федерации заболевание аэромонозом зарегистрировано в 28 регионах, 87 пунктах (Афанасьев, 1996; Катичева, 19S/ /; Стрелков и др., 1997; Яременко и др. 1997). В 1999 году неблагополучных.]! признаны 39 пунктов, и 37 - к началу 2003 года (Яременко, Мачнев, 2000; Яременко, Селиверстов, 2003). По тем же данным заболевания рыб бактериальной этиологии но своему распространению уступают некоторым паразитарным заболеваниям, но значительно превосходят их по наносимому ушсрбу, складывающемуся из прямой гибели рыб и снижеиию темпа роста инфицированных особей, которое имеет место, даже при отсутствии клинических проявлений.

Микроорганизмы - этиологические агенты БГС являются условг--патогенными для рыб и находятся с ними в постоянном контакте. Представители родов Aeromonas и Pseudomonas входят в состав нор.мофлоры воды. Одни бактерии семейства Enterobactericeae - нормальные обитатели кишечника рыб, другие - в значительном количестве вносятся в прудовую экосистему с обсеменёнными гранулированными комбикормами.

Реализация потенциала патогенности данных микроорганизмов обусловливается, с одной стороны, тем, что эвтрофированиая водная среда интенсивно эксплуатируемого рыбоводного пруда благоприятна для наращивания их численности и ферментативной активности. С другой сторож : i - наличием переуплотненной популяции рыб, чья антибактериальная резистентность значительно снижена нахождением в неблагоприятных условиях окружающей среды, возникающих из - за несовершенства существующих биотехнологий культивирования рыб. Сюда можно отнести неблагоприятный гидрохимический режим, токсичные, богатые условно-патогенными микроорганизмами комбикорма, большое количество ручных манипуляций (хендпинг) и т.д.

Помимо растущей интенсификации, современная ситуация по заболеваемости прудового карпа БГС обусловлена недостаточным объемом и, и полным отсутствием мероприятий, призванных снижать органического нагрузку на экосистему рыбоводного пруда и сдерживать размножение условно-патогенных микроорганизмов.

Традиционным, прочно вошедшим в практику рыбоводства методом борьбы с болезнями рыб бактериальной этиологии, является их химиотерапия. Но в настоящее время применение антибиотиков и антибактериальных препаратов сильно ограничено из-за формирования среди бактериальных патогенов антибиотикорезистентных штаммов, развития под действием препарата иммунодефицита у рыб, возникновения еще более глубок-!х изменений в экосистеме пруда. Все это создает благоприятные условия дг.я формирования суперинфекции. Немаловажным является и загрязнение медикаментами конечной пищевой продукции, что значительно ограничивает возможности ее реализации. В условиях растущего насыщения потребительского рынка продукцией аквакультуры наиболее конкурентоспособной окажется экологически чистая, выращенная без применения антибиотиков рыба.

В данной ситуации альтернативой химиотерапии может стать иммунопрофилактика БГС рыб. В мировой практике накоплен значительней опыт по повышению антибактериальной резистентности рыб, сохранению i поголовья и поддержанию высоких темпов роста при помощи пробиотиков и вакцин. Как в нашей стране, так и за рубежом ведутся работы по адаптации в аквакультуре пробиотических препаратов, созданных первоначально для теплокровных животных. К таким препаратам относится нробиотик су бал и н (Vetosubalinum), действующим началом которого является сенная палочка Bacillus subtilis, штамма 2335, успевший хорошо зарекомендовать себя не только в ветеринарной практике, но и в индустриальном рыбоводстве при терапии заболеваний осетровых и лососевых рыб преимущественно смешанной этиологии.

Получение вакцинного препарата против подвижных аэромопад, эффективного при заражении не только гомологичным, но и гетерологичными штаммами, длительное время наталкивалось на трудности, обусловленные их высокой антигенной гетерогенностью. Создание в 1987 году группой специалистов ВНИИПРХ и Карельского филиала РАМ биохимической вакцины ВЮС-2 для инъекционного способа введения продемонстрировало принципиальную иреодолимость этих трудностей. Продолжением практических разработок в области специфической иммунопрофилактики БГС рыб стало создание на основе того же штамма - Aeromonas sobria 77-'8 бактерина с иммерсионным способом введения, для вакцинации больших групп товарных карпов.

Целыо работы было продолжение разработки экологически чистых методов профилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) рыб. При этом предусматривалось решение следующих задач.

1. Изучение эффективности применения иробиотика - субалина на основе

Вас. subtilis штамма 2335 при профилактике и терапии БГС (аэромоноза) карпа t в условиях интенсивного прудового рыбоводства.

2. Проведение в экспериментальных условиях испыташи разрабатываемого бактерина из штамма A. sobria 77-18. Исследовать защитный эффект бактерина против гомологичного и гетерологичных штаммов подвижных аэромонад. Проследить динамику развития иммунного ответа карпов на вакцинацию.

3. Провести испытания иротективного действия и иммуногенного эффекта, оказываемых.бактерином в опытно-производственных условиях.

Автор принимал личное участие в проведении теоретических и экспериментальных исследований, результаты которых представлены в диссертации. Материалы по первичным экспериментальным испытания.»! иробиотика и вакцины-любезно предоставлены моим научным руководителем J1.II. Юхименко. Все микробиологические исследования проведены совместно со старшим научным сотрудником лаборатории ихтиопатологоии ФГУП "ВНИИПРХ" к.б.н. JI.H. Юхименко и научным сотрудником той же лаборатории, к.б.н. Л.И. Бычковой. Значительную помощь в сборе первичного материала в опытно-производственных условиях оказали трудовые коллективы ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и экспериментально-производственного отдела ФГУП "ВНИИПРХ" "Якоть".

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР БАКТЕРИАЛЬНАЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКАЯ СЕПТИЦЕМИЯ (АЭРОМОНОЗ) РЫБ И МЕТОДЫ ЕЁ ПРОФИЛАКТИКИ

В отечественной литературе, посвященной проблеме бактериальных заболеваний рыб, для обозначения патологического состояния гидробионтя, вызванного подвижными аэромонадами с 1972 официально используется термин - аэромоноз, а в качестве возбудителей инфекции указываются Aeromonas hydrophila, A.caviae, A.sobria (Борисова, Козаченко, 2000). В дальнейшем эпизоотически значимыми официально признаются все подвижные представители рода Aeromonas (Сборник инструкций., 1998), что согласуется с мнением зарубежных исследователей. Так, на страницах книги "Бактериальные болезни рыб", изданной в 1972 г., Г. Баллок с соавторами при рассмотрении бактериальных агентов, способных вызывать инфекционн» о процессы у культивируемых рыб, предложили название бактериальну! геморрагическая септицемия, для заболевания, вызванного убиквитарными аэромонадами (Bullok et al., 1972), и в дальнейшем в зарубежных литературных источниках подвижные аэромонады указываются, как возбудители бактериальной геморрагической септицемии (БГС) рыб (Amlacher, 1972; Austin, Austin, 1993).

По вместе с тем анализ литературных источников показывает, что при обследовании больных рыб с характерными для аэромонадной септицемии клиническими признаками во многих случаях не удаётся выдели предполагаемый этиологический агент - штамм подвижной аэромонады ни"л чистой культуре, ни при доминировании в микробиоценозе. Высеваются многокомпонентные ассоциации грамнегативных бактерий и микробный пейзаж обычно представлен несколькими видами подвижных аэромонад иногда даже авирулентными), энтеробактериями, неферментирующими щёлочеобразователями (Boonyaratpalin, 1989; Жсзмер и др., 1991; Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002).

Все эти микроорганизмы признаны условно-патогенными для рь;б г

Лморос-Хименес, 1993). Помимо этого все грамнегативные возбудители оппортунистических инфекций рыб, имеют сходные механизмы патогенеза и, как следствие, одинаковые проявления болезненных симптомов со стороны макроорганизма (Braude, 1964; Nowotny 1969).

В связи с этим в американской и западноевропейской литературе фигурирует термин - язвенный синдром (Ulcerative Disease Syndrome), обозначающий комплекс симптомов, возникающих в ответ на системное поражение организма рыбы токсическими, инвазивными или инфекционными факторами (Мс Gareu 1991; Новоскольцева и др., 1999). При наличии конкретных названий для большинства бактериальных, вирусных, паразитарных, алиментарных и др. болезней выращиваемых рыб это название используется для характеристики практически всех заболеваний неспецифических и с невыясненной этиологией.

С точки зрения эпизоотологии и борьбы с распространением инфекционных заболеваний рыб разграничение специфического аэромоноза от иеспецифических септицемий представляется весьма важным. В связи с этим ряд российских авторов для обозначения нолиэтиологического заболевания рыб, вызываемого подвижными аэромонадами в ассоциации с други:.-\ч условнопатогенными для рыб грамнегативными бактериями используют термин - бактериальная геморрагическая септицемия (Юхименко и др., 1997; Юхименко и др., 2001; Гаврилин, 2002; Гаврилин и др., 2002; Юхименко и др., 2002; Трифонова и др., 2003). Это не противоречит публикациям, в которых авторы используют название - аэромоноз, для характеристики инфекции рыб, вызванной определённым видом подвижных представителей p. Aeromonas.

Заболеванию подвержены многие филогенетически удалённые друг от друга виды пресноводных и морских рыб - объектов аквакультуры. Описаны эпизоотии БГС среди больших индийских карпов (Cirrhinus mrigala), форели (Oncorhinchus mykiss), рыбца (Vimba vimba), белого амура (Ctenopharingodon idella), толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix), трески (Gadus morhua), европейского угря (Anguilla rostrata) (Larsen, Jensen, 1977; Davis et al., 1983; Karunasagar et al., 1989; Денисов, 1990; Волыкин и др., 1991; Ragesvvari et al., 1996; Подзорова, 1997; Ogara et al., 1998).

На территории Российской Федерации проблема заболеваемости культивируемых рыб БГС наиболее актуальна в прудовых хозяйствах центрального и южных регионов, выращивающих товарного карпа го интенсивной технологии (Golovin, 1998; Яременко, Мачнев, 2000). Причём речь идёт не только о прямой гибели рыбы. Согласно ряду публикаций, гидробионты затрачивают значительные энергетические и пластические ресурсы на элиминацию внедрившихся микроорганизмов, что объясняет замедление темпов роста рыб, подвергающихся значительному бактериальному прессингу и снижение общей рыбопродуктивности водоёма (Есипова, 1978; Борисенко, 1991).

Для возникновения любого инфекционного заболевания необходимо совмещение трёх факторов: восприимчивого хозяина, вирулентно Г-э возбудителя и воздействия на макроорганизм субоптимальных фактору окружающей среды (Wedemeer, Meyer, 1976). К потенциальным возбудителям БГС можно отнести практически всю грамнегативную составляющую микробиоценоза воды пруда, где в течение рыбоводного сезона, как правило доминируют подвижные аэромонады (Гаврилин и др., 2002; Юхименко и др., 2002). Это объясняется тем, что на данный момент эвтрофирование воды интенсивно эксплуатируемых прудов достигло оптимального уровня для осуществления их жизнедеятельности. Количество аэромопад в загрязнённых органическими веществами водных биотопах может достигать сотен тыс;»ч микробных клеток в одном миллилитре (Юхименко и др., 1987). Представители p. Aeromonas являются неотъемлемой частью деструктивных энергетических цепей микробиоценоза, элементами самоочищения водоёма (Heuscmann-Brunner, 1978). Главными факторами, определяющими численность подвижных аэромонад в водоёме являются температура воды и уровень её загрязнения органическими субстратами (Seidler, 1980). Дальнейшее возрастание в воде количества органических соединений приводит к появлению в ней неферментирующих щёлочеобразователей и энтеробактерий, которые могут нарушать доминирование аэромонад (Юхименко и др., 2001; Юхименко и д 2002). Все рассмотренные группы бактерий являются эпизоотически значимыми, они относятся к условнопатогенным для рыб микроорганизмам, занимающим промежуточное положение между группами чистых сапрофигов и облигатных патогенов. С другой стороны, эти же группы микроорганизмов входят в состав нормофлоры поверхности тела, открытых полостей и кишечника рыб (Аморос-Хименес, 1993; Ларцева, Катунин, 1993), состав которой сильно зависит от микробиоценоза окружающей среды (Анисимова, Лавровский, 1983). Рядом исследователей установлено, что при определённых условиях представители родов Aeromonas и Pseudomonas, колонизирующее пищеварительный тракт рыб, продуцируют необходимые для хозяи.'.т аминокислоты, витамины, бактерицидные и антивирусные вещества, т. е. находятся с макроорганизмом в симбиозе на уровне мутуализма (Kimyra et al., 1990; Компанец и др., 1992).

Накопление условнопатогенных представителей сем. Enterobacteriaceae, таких как Proteus sp. и Klebsiella sp., обычно не представленных в водоёмах, происходит главным образом за счёт гранулированных кормов, где они способны длительное время выживать и даже размножаться (Жезмер и др., 1990). Таким образом хозяин и потенциальные паразиты находятся в теснсм контакте. В возникновении инфекционного процесса, связанного 'J условнопатогенными бактериями, значительную роль играет состояние il реактивности организма рыбы (Amlacher, 1961), а к основным причинам, определяющим развитие заболевания, можно отнести факторы, смещающие равновесие между микро- и макроорганизмом. Одним из главных пусковых механизмов возникновения БГС является воздействие на рыбу неблагоприятных факторов окружающей среды. Заболеванию, как правило, предшествует воздействие на культивируемого гидробионта одного или целого комплекса стрессоров (Roberts, 1994), которыми может явиться действ Ъ практически любого фактора, превышающего адаптационные возможности организма. Часто в этом качестве выступают неудовлетворительный гидрохимический режим (Просяная, Хуторной, 1979), перевозки или иные рыбоводные операции с рыбой, переуплотнённые посадки (Головин, 1984; Юхименко, Викторова, 1979; Wedemeer, Meyer, 1976). К стрессорам, наиболее ярко проявляющимся в прудовых хозяйствах, относятся: дефицит растворённого кислорода, повышенные концентрации углекислого газа и аммиака в воде, высокий уровень её загрязнения органическими веществами (Wedemeer, Meyer, 1976). Помимо этого используемая в настоящее время биотехнология культивирования карпа в прудах, предолагает значительно'.; количество ручных манипуляций с рыбой.

Способность стресс-факторов играть роль пускового механизма болезни подтверждена рядом экспериментов, в ходе которых установлено, что заболеваемость и гибель при введении сублетальных доз культуры Aeromonas hydrophila наступала главным образом у стрессированных гидробионтов (Walters, Plumb, 1980).

Если стрессовое воздействие слишком сильно или длилось продолжительное время, за стадией резистентности, наступает стадия истощения. Мобилизация источников энергии, необходимых для преодоления неблагоприятного воздействия приводит к потере белков, увеличению содержания аммиака в крови и усилению его экскреции через жабры. В случае значительного загрязнения воды органическими веществами, препятствующими выведению метаболита, он накапливается в крови (Олах и др., 1988), что само по себе вызывает физиологическую дисфункцию в организме рыбы. Под воздействием стресса происходит изменение картины крови: уменьшение количества лимфоцитов, тромбоцитов, снижается бактерицидная активность сыворотки, нарушаются барьерные функции кожи и слизистых оболочек (Головин, 1984; Грищенко, Рудиков, 1985).

При вспышках БГС из тканей поражённых рыб в подавляющем большинстве случаев высеваются подвижные аэромонады. Согласно наблюдениям, проведённым российскими исследователями в течениие длительного времени, в рыбхозах, расположенных в разных климатических зонах различные биовары аэромонад составляли более 50% микрофлоры, выделенной из воды и от рыбы с различным клиническим статусом (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002). t:

Аэромонады представляют собой прямые грамнегативные палочки с закруглёнными концами. Подвижные за счёт единственного полярно» j жгутика. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура 22 - 28° С, хотя подавляющее большинство штаммов хорошо растёт и при 37° С. По данным отечественных авторов максимально допустимая концентрация условно-патогенных бактерий в воде рыбоводного пруда, при которой они начинают обнаруживаться в органах и тканях рыб, составляет 104 КОЕ/мл, из них подвижных представителей рода Aeromonas - 3 х 103 КОЕ/мл (Каховский и др., 1997). Все представители p. Aeromonas потенциально способны вызывать заболевания рыб, но в каждом конкретном случае различные представленные в водоёме штаммы этих бактерий имеют различную вирулентность и разный удельный вес в микробиоценозе, и как следствие - степень их опасности для культивируемой рыбы различна. Исходя из этого, необходим учёт этиологической структуры содержащихся в воде аэромонад, путём их видовой идентификации. Без проведения этих исследований невозможна важнейшая с эпизоотологической точки зрения дифференциальная диагностика специфического аэромопоза и неспецифической БГС.

Группа подвижных аэромонад разделялась ранее на виды: A.punctat?<c двумя подвидами (punctata и caviae) и A.hydrophila с тремя подвидами i.4 hydrophila, anaerogenes и proteolitica) (Schubert, 1974). В дальнейшем было показано, что A.punctata и A.hydrophila это один вид, и описана новая группа штаммов, объединённая под названием A.sobria (Popoff, Veron, 1976). Но эта классификация при практическом применении для видовой идентификации подвижных аэромонад с целью оценки эпизоотической ситуации в рыбоводных хозяйствах и дифференциальной диагностики бактериозов рыб продемонстрировала свою низкую эффективность. Российские исследователи сообщали о невозможности идентифицировать до 60% выделяемых штамме"*, относящихся к роду Aeromonas, применяя данную классификацию несмотря ij.a изучение более 30-ти биохимических показателей (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002). Для снижения трудоёмкости работ авторами было предложено использовать сокращённую схему идентификации, разработанную зарубежными учёными. Она основана на использовании следующих признаков: гидролиз эскулина, утилизация L-арабинозы, ферментация салицина, образовании газа из глюкозы и H2S из цистеина (Joseph et al., 1987 цит. по Юхименко и др., 2001). Сокращённая схема идентификации приведена в таблице 1. ■)

Штаммы, биохимические характеристики которых не укладывались данную схему, было предложено относить к группам A.sp., A.sp.l, A.sp.2, и так далее (табл. 2).

После публикации очередной классификации аэромонад в девятом издании Определителя бактерий Берджи (Определитель бактерий Берджи, 1997) биовар A.sp.4 был отнесён к виду A.veronii, a A.sp.5 к A.schubertii. Дифференциальные признаки бактерий рода Aeromonas, согласно последней классификации представлены в таблице 3.

Таблица,1 N

Сокращенная схема биохимической идентификации подвижных аэромонад (Joseph et. al., 1987)

Признаки A.hydrophila A.sobria A.caviae

Гидролиз эскулина + - +

Утилизация L-аргинина + - +

Утилизация L-арабииозы + - +

Ферментация салицина + - +

Газ из глюкозы + + а.

IbS из цистеина + +

Примечание: + - положительная реакция, - - отрицательная реакция.

Таблица 2

Биохимические характеристики биоваров подвижных аэромонад, не идентифицируемых по сокращенной схеме

При знак A.sp. A.sp. 1 A.sp. 2 A.sp. 3 A.sp. 4 A.sp. 5 A.sp. 6 A.sp. 7 A.sp. 8 A.sp. 9 A.sp. 10

Газ из глюкозы + + + + +

Фер-мента-ция салицина + - - - + - + - - - + *

Утилизация L-ара-би-нозы + + + + +

Гидролиз эску-лина - + + - + - - + + - •* V,

Примечание: + - положительная реакция, - - отрицательная реакция.

Дифференциальные признаки подвижных бактерий p. Aeromonas (Определитель бактерий Берджи, 1997)

Таблица 3

Признаки A.caviae A.eucrenophila A.hydrophila A.media A.schubertii A.sobria A.veronii

Сахароза (кислота) + d + + • d +

Трегалоза (кислота) + + + + + d +

Эскулин (гидролиз) + + + d • +

Цитрат Христенсена d + +

Коричневый водорастворимый пигмент +

Глюкоза (газ) + + + + +

Примечание: + - положительная реакция, - - отрицательная реакция, d - часть штаммов положительна а часть отрицательна.

Штаммы, биохимические характеристики которых не позволяют определить их видовую принадлежность при помощи новейшей идентификационной схемы, приведённой в 9-ом издании определителя Берджи предложено относить к прежним группам A.sp. A.sp.l, A.sp.2 и т.д. Авторы сообщают об обнаружении уже 11-ти групп подвижных аэромонад, различающихся по имеющим дифференнциальное значение биохимическим характеристикам и не отражённым в определителе (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002).

Помимо создания теоретической основы, для учёта этиологической структуры подвижных аэромонад исследователями был предпринят ряд попыток классифицировать эти микроорганизмы, исходя из их биологических свойств, а именно способности вызывать патологические процессы у рыб.

Зарубежными авторами они были разделены на следующие три

4 5 группы: вирулентные LD5(,= 10 * микробных клеток, слабовирулентныс

С С Ц

LD5o=10 ' и авирулентные LD50=10/ (Lallier et al., 1981). Данная классификация имеет большое значение при оценке биологических свойств подвижных аэромонад и их роли в патологии рыб, но и не лишена некоторых недостатков: адекватно отражая ситуацию "на данный момент", она не учитывает возможности изменения вирулентности в процессе жизнедеятельности бактериального штамма. В то время, как процесс изменения уровня вирулентности, связанный с чередованием сапрофитного и паразитического способа существования аэромоиад широко распространён. Отмечено, что большинство штаммов подвижных аэромонад быстро теряют вирулентность при хранении на искусственных питательных средах. И, наоборот, при определённых условиях первоначально слабовирулентные или авирулентные штаммы приобретают способность вызывать патологический процесс у рыб (Юхименко и др., 2001).

В этой связи наиболее приемлемой представляется классификация аэромонад по их эпизоотической значимости, предложенная Л.Н. Юхименко с соавторами (Юхименко, Койдан, 1997). Подвижных представителей рода Aeromonas предложено подразделить так же натри группы. К первой отнести крайне немногочисленные микроорганизмы, являющиеся облигатными патогенами рыб, которые отличаются от всех прочих штаммов преобладанием в цитоплазме (до 17%) специфической белковой фракции с молекулярным весом 50 - 60 килодальтон, обладающей значительной имуногенностыо (Юхименко и др., 1997; Смирнов и др., 2000). Данные бактерии не теряют свою вирулентность даже при длительном хранении на искусственных питательных средах. При контакте данного возбудителя с восприиимчивым хозяином развивается специфическое инфекционное заболевание - аэромоноз, подлежащее строгому карантинированию. Во вторую группу входит наибольшее число аэромонад - факультативных патогенов рыб. Под воздействием внешних условий они способны менять свою вирулентность в широких пределах. При наличии определённых условий, таких как очень высокий уровень органического загрязнения воды и жёсткие конкурентные связи в её микробиоценозе, наличие токсического фона и т. д., аэромонады второй группы могут становиться высоковирулентными. И, наконец, к третьей группе предложено относить чисто сапрофитные аэромонады.

Гипотетическая модель формирования штаммов аэромонад, способных к паразитированию, предложена Г.П. Калиной (1983). Согласно ей сапротроф, способный разлагать высокомолекулярные органические вещества, имеет биохимическую основу для формирования факторов агрессии. Показано, что в короткий срок после гибели рыбы аэромоиады, содержащиеся в кишечнике, быстро проиикают в органы и ткани, где способны интенсивно размножаться. Следующим шагом становится приобретение способности инфицировать макроорганизмы с пониженным иммуно-физиологическим статусом и нарушенными барьерными функциями кожи и слизистых оболочек. Очевидно, что дальнейшее нарастание вирулентности позволяет использовать, как объект иаразитирования и вовлекать в эпизоотический процесс, всё более и более резистентных рыб.

С началом рыбоводного сезона и прогревом воды до температур, при которых начинается интенсивное размножение аэромонад, среда интенсивно обогощается питатательными субстратами за счёт кормления рыбы и выделения ею метаболитов. Микробная обсеменённость прудовой воды достигает высоких показателей, а её микробный пейзаж практически полностью представлен ассоциацией грамнегативных условно-патогенных бактерий. Немногочисленная и достаточно разнообразная в видовом отношении нормофлора, характерная для природного водоёма, оказывается практически полностью вытесненной (Гаврилин, 2002). Доминирующий комплекс характеризуется высокой напряжённостью межвидовых и внутривидовых конкурентных связей. Представители сем. Enterobacteriaceae зачастую подавляют аэромонады в количественном отношении, но последние резко увеличивают свою ферментативную активность и продуцирование факторов агрессии, как следствие - возрастает их эпизоотическая значимость (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002).

Ещё одним фактором, стимулирующим возрастание вирулентности, является наличие плотной популяции восприимчивых хозяев, чей иммунный статус, как правило, понижен воздействием различных стрессоров неизбежных при существующих на данный момент биотехнологиях культивирования рыб. Поражая в первую очередь, наиболее ослабленных особей комплекс грамнегативных патогенов максимально реализует потенциал вирулентности. По данным российских исследователей в течение рыбоводного сезона количество вирулентных штаммов аромонад, выделяемых из воды пруда, возростает с 8,8 % в мае - начале июня до 80 % к августу - сентябрю (Юхименко и др., 2001).

В качестве составляющей части комплекса грамнегативных условно-патогенных бактерий, вызывающих БГС рыб, часто регистрируют представителей семейства Enterobacteriaceae. В данную группу объединены грамотрицательные неспороносные палочки, большинство из которых подвижно за счёт перитрихиальных жгутиков. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, обладают как дыхательным, так и бродильным метаболизмом. Все микроорганизмы данной группы оксидазоотрицательны и каталазаположительны. Бактерии этого семейства не являются естественными обитателями воды, но постоянно присутствуют в интенсивно эксплуатируемых рыбоводных прудах. Их наличие в достаточно больших количествах обеспечивается привнесением с обсеменёнными комбикормами и экскрементами рыб. Представители ряда родов, а именно: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia являются представителями нормофлоры кишечника и жабр (Аморос-Хименес, 1993), а бактерии родов Klebsiella и Proteus накапливаются в воде и кишечниках рыб при кормлении их гранулированными комбикормами, контаминированными этими микроорганизмами (Жсзмер и др., 1990). При значительном обогащении воды органическими субстратами они достигают высокой численности и вступают в конкурентные взаимоотношения с аэромонадами (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002). Так по данным B.IO. Жезмер с соавторами (1988), удельный вес энтеробактерий в воде, обогащённой органикой до 40 мг/л, составляет от 30% до 40%.

Энтеробактерии не только способны участвовать в неспецифических септических процессах у рыб, но и вызывать специфические бактериозы. Например, Proteus vulgaris описан как этиологический агент при заболевании сазана и форели (Ларцева, 1990; Бычкова и др., 1995), Klebsiella pneumoniae способна вызывать разложение мышц канального сома (Жезмер и др., 1991), в развитии некоторых патологических состояний у лососевых рыб участвует Citrobacter freundii (Sanz, 1991).

Бактерии рода Proteus представляют собой прямые палочки, подвижные, обладающие феноменом роения. Температурные пределы роста от 10° до 43° С. Типичные представители гнилостной микрофлоры, обладают мощной протеолитической и гемолитической активностью. Патогенны для человека, вызывают инфекции мочевыводящих путей, способны к формированию септических очагов, особенно при ожогах.

Представители рода Citrobacter - подвижные палочки. Температурный оптимум 37°С. Часто встречаются в некачественных комбикормах (Бурлачеико и др., 2002). Во многих случаях зарегистрированы как возбудители оппортунистических инфекций человека.

Для некоторых видов бактерий, входяших в род Klebsiella, характерно наличие массивной полисахаридной капсулы. Температурный оптимум 37° С, неподвижные. Отмечены в качестве этиологических агентов при заболеваниях человека.

К роду Escherichia относятся прямые подвижные палочки, многие имеют капсулу или микрокапсулу. Температурный оптимум 37° С. Многие штаммы E.coli продуцируют энтеротоксины и другие факторы вирулентности. Являются возбудителями желудочно-кишечных и других инфекций человека.

Род Enterobacter представлен прямыми подвижными палочками с температурным оптимумом 30° -37° С. Данные бактерии зарегитрированы, как возбудители оппортунистических инфекций человека (раневых, ожоговых), способные формировать септические очаги и в некоторых случаях вызывать менигит.

В последние годы из водоёмов, на которых ведётся интенсивное рыбное хозяйство, и от рыб с различным клиническим статусом выделяются бактерии - представители родов Moraxella и Acinetobacter (Аморос-Хименес, 1993; Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002). Микроорганизмы этих таксонов объединяются в группу неферментирующих щёлочеобразователей (НФЩ). В микробиоценозах воды чрезмерно эвтрофированиых рыбохозяйственных водоёмов эта группа бактерий имеет значительный удельный вес. С увеличением антропогенной нагрузки на водоёмы в эпизоотически значимых количествах обнаруживаются новые, ранее не выделяемые ни из воды, ни от рыбы представители группы НФЩ. В 2000 году из прудовой воды рыбоводного хозяйства,расположенного в Московской области,был впервые выделен Acinetobacter baumannii. С этого момента он достаточно часто представлен в микробиоценозах воды и рыбы (Гаврилин и др., 2002).

К роду Moraxella относятся короткие толстые палочки, приближающиеся по форме к коккам (коккоиды), располагаются обычно в парах или коротких цепочках. Клетки иногда окружены капсулой, жгутики отсутствуют. Хемоорганотрофы, при использовании углеводов кислотообразования не происходит. Оптимальная температура для роста 33()-35° С. Каталазо- и оксидазоположительны. Относятся к паразитическим микроорганизмам, у человека вызывают инфкции мочеполовой системы.

Представители рода Acinetobacter - бактерии палочковидной формы, но в стационарной фазе роста меняют её на сферическую. Аэробы, метаболизм чисто дыхательного типа, с использованием кислорода в качестве окончательного акцептора электронов. Хорошо растут при 33()-35° С. Катал азо п ол ожител ь н ы, о кс идазоотр и цател ь н ы.

В род Pseudomonas объединены грамотрицательные прямые или слегка изогнутые палочки. За редким исключением подвижные, за счет одного или нескольких полярных жгутиков. Бактерии аэробны с чисто дыхательным типом метаболизма. В качестве окончательного акцептора электронов используют кислород, в некоторых случаях могут переходить на альтернативный акцептор - нитрат, что обеспечивает анаэробный рост. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений.

Псевдомонады • наряду с аэромонадами являются типичными представителями водных микробиоценозов и нормофлоры рыб (Hyp Эльдин Амин, 1974). В больших количествах представлены в грунтах и прудовой воде (Каховский, 1987). Представители рода Pseudomonas описаны как условные патогены культивируемых рыб, способные как вызывать специфические инфекции - псевдомонозы, так и участвовать в ассоциативных бактериозах. Псевдомонады - психрофильиые микроорганизмы, и вне своего температурного оптимума количественно подавляются аэромонадами, кроме того, они предпочитают менее загрязнённую органикой и богатую кислородом воду. Поэтому в течение летнего периода количество их в воде незначительно, и они редко контаминируют внутренние органы рыб. Вспышки псевдомонадиой септицемии и БГС с участием псевдомонад чаше всего приурочены к зимнему периоду, ранней весне и поздней осени (Волыкин и др., 1991). Но воздействие ряда факторов (чаше всего массированное применение антибиотиков) может привести к развитию летнего псевдомоноза, несмотря на субоптимальные температурные условия для развития возбудителя.

Следует отметить, что речь идёт о наиболее распространённых бактериальных патогенах, поражающих рыб (главным образом карпа) в условиях интенсивно эксплуатируемых прудовых систем. В силу ряда причин, связанных с интенсификацией рыбного хозяйства и глубокими изменениями в экосистеме рыбоводных прудов перечень инфекционных патогенов рыб постоянно пополняется, в то время, как некоторые из них значительно снижают свою эпизоотическую значимость. В частности, публикации, относящиеся к 80-м годам прошлого века, в качестве наиболее часто сопутствующих аэромонадам инфекционных агентов называют представителей рода Pseudomonas (Рудиков, Грищенко, 1985; Boonaratpalin, 1989), которые в последние годы мало представлены в микробных пейзажах прудовой воды и рыбы (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002).

Диагностика некоторых бактериальных болезней, наиболее часто поражающих карпов, культивируемых в прудах по интенсивной технологии, может быть осуществлена (табл. 4), на основании родовой идентификации выделенного возбудителя.

25

Таблица 4

Диагностика наиболее часто встречающихся бактериозов рыб на основании родовой идентификации выделенного возбудителя

Микроорганизмы, выделенные от поражённой рыбы Диагностируемое заболевание Литературный источник

Aeromonas sp. Аэромонадная септицемия (аэромоноз) Luderidz О.Е. (1986); Волыкин Ю.Л. и др., (1991); Austin B.I., Austin D.A. (1993); Сборник инструкций .,(1998); Бурлачеико И.В. и др. (2002)

Pseudomonas sp. Псевдомонадная септицемия (псевдомоноз) Рудиков Н.И., Грищенко Л.И. (1985); CsabaG. (1984); Aust В.1., Austin D.A. (1993)

Proteus sp., Klebsiella sp., Citrobacter sp., Moraxella sp. и т. д. Протеоз и т. д. Далин M.B., Фиш Н.Г. (1980); Ларцева Л.В. (1990); Жезмер В.Ю. и др. (1991); Бычкова Л.И. и др. (1995)

Комплекс грамнегативных бактерий Б ГС Юхименко Л.И., Койдан Г.С. (1997); Юхименко Л.II. и др. (2001); Гаврилин К.В. (2002); Гаврилин К.В. и др. (2002); Трифонова Е.С. и др. (2003)

Динамика развития эпизоотического процесса при БГС позволяет сделать вывод о существовании двух путей развития заболевания (Schaperclaus, 1954). Эндогенный путь развития септицемии приурочен к концу весны началу лета, и обусловлен проникновением микроорганизмов, главным образом аэромонад, сквозь ослабленную в течение зимовки, ставшую полупроницаемой слизистую оболочку кишечника. При подъёме температуры воды карпы начинают поедать детрит богатый уже размножающимися аэромонадами, а иммунный статус рыб еще понижен перенесённой зимовкой.

Второй путь связан с вышеописанными механизмами нарастания численности, ферментативной активности и вирулентности грамнегативных патогенов, находящихся в плотном контакте с рыбой. Экзогенный путь инфицирования обусловлен нарастанием бактериального прессинга из окружающей среды и нахождением рыб в субоптимальных условиях, получение ими различных микротравм. Эпизоотическое благополучие зависит от резистентности организма культивируемого гидробионта, с одной стороны, и санитарного состояния рыбоводного пруда с другой.

При контакте с "местными" штаммами факультативных патогенов у рыб формируется специфический иммунитет, в высоких (для рыб) титрах появляются антитела. При достаточно благоприятных внешних условиях и нахождении количества условно-патогенных бактерий ниже определённого порогового предела, сочетание специфического иммунитета и неспецифической резистентности организма позволяет осуществлять рыбе достаточно нормальную жизнедеятельность.

Сложившееся динамическое равновесие в системе паразит-хозяин весьма неустойчиво, воздействие любого из возможных в условиях рыбоводного пруда стресс-фактора может сместить его в пользу патогена. Одним из важных факторов, обусловливающих возникновение вспышек БГС являются перевозки гидробионтов, производимые без учёта этиологической структуры аэромонад. В 1954 году В. Шеперклаусом опубликованы данные, показывающие, что при пересадке карпов в "чужой" пруд они не только погибают сами, но и провоцируют вспышку болезни среди местной популяции (Schaperclaus, 1954). Сообщения о подобных эгшзоотиях имеются и в современных публикациях отечественных ихтиопатологов (Юхименко и др., 2001; Юхименко и др., 2002).

В данном случае причина развития инфекционного процесса кроется в высокой атигенной гетерогенности подвижных аэромонад. Помещённая в новый водоём рыба сталкивается с вирулентными возбудителями, к которым она не имеет специфического иммунитета, а общая резистентность снижена стрессом и травмами, неизбежными при облове и транспортировке. С другой стороны - вместе с рыбой происходит интродукция в пруд новых, возможно весьма вирулентных, бактериальных патогенов, к которым местная рыба так же не имеет специфических агглютининов. В случае заболевания привезённой рыбы она становится накопителем аэромонад, и других грамотрицательных бактерий. В связи с этим перед перевозкой рыбы необходим сравнительный анализ этиологической структуры условно-патогенных микроорганизмов и их биологических свойств в водоёмах, между которыми предполагается обмен гидробионтами.

Симптомы БГС были описаны многими исследователями (Schaperclaus, 1954; Amlacher, 1961). Авторы, как правило, выделяют четыре формы течения заболевания.

Сверхострос течение болезни характеризуется быстро прогрессирующим септическим процессом, приводящим к молниеносной массовой гибели поражённых рыб. Наружные симптомы либо слабо выражены, либо отсутствуют полностью. При патолого-анатомическом вскрытии обнаруживают застойную гиперемию внутренних органов, отёк и геморрагии на слизистой оболочке нижнего отдела кишечника, петехии на брюшине и в мускулатуре. Подобное течение болезни характерно в основном для специфического аэромоиоза или БГС при условии воздействия на рыб сильного стрсссора (хэндлинг, сильное превышение плотности посадки, резкие колебания физических факторов окружающей среды).

Острая форма заболевания проявляется в виде водянки, волдырей, абсцессов, ерошения чешуи и одно или двухстороннего экзофтальма. В брюшной полости накапливается желтоватая опалесцирующая или кровянистая жидкость. Наблюдаются дегенеративные изменения в тканях печени, ночек, селезёнки. Гибель поражённой рыбы наступает в течение нескольких дней и носит массовый характер. Эта клиническая форма заболевания обычно ассоциирована с эндогенным сепсисом, и приурочена к началу рыбоводного сезона.

Хроническая форма характерна для экзогенного пути развития инфекции и регистрируется в течение всего лета и начала осени до падения температур воды. Для неё характерно образование глубоких язв, фурункулов и абсцессов. Эпидермис, дерма и мускулатура в области язв иекротизирована. При внешнем осмотре внутренних органов отмечают нарушения в их окраске и консистенции, дегенеративные изменения и застойную гиперемию. При исследовании на гистологическом уровне отмечают некроз гепатоцитов и гемопоэтической ткани. Процент гибели рыб небольшой, но она продолжается в течение всего сезона.

Латентная форма проходит бессимптомно. Из паренхиматозных органов клинически здоровых рыб выделяются комплексы грамнегативных бактерий. В литературных источниках в трактовке данного вопроса имеются существенные расхождения. Ряд исследователей считает, что внутренние органы рыб часто, а возможно и постоянно обсеменены бактериальной флорой (Просяная, Хуторной, 1979; Ларцева 1990; Аморос-Хименес, 1993), и здоровые рыбы содержат те же микроорганизмы, что и больные, только в значительно меньшем количестве. По мнению других авторов при нормальном иммуно-физиологическом состоянии рыб внутренняя среда их организма стерильна (Proctor, 1935; Юхименко, Викторова, 1979). Более правильной представляется вторая точка зрения, так как поддержание гомеостаза и защита внутренней среды от внедрения инфекционных и инвазионных агентов является фундаментальным свойством живого организма.

Изменения гематологических показателей во время инфекционного процесса в первую очередь заключаются в снижении количества гемоглобина, гематокрита и количества эритроцитов, значительном увеличении числа лейкоцитов (Amlacher, 1972). Анализ большого количества фактических данных, касающихся изменения картины крови больных по сровнению со здоровыми рыбами, уже в 60-х годах прошлого века, позволил ряду зарубежных авторов сделать вывод о единой природе патогенеза для всех грамнегативных бактерий, вызывающих неспецифические септицемии у рыб. Патологическое действие этих микроорганизмов связывалось с наличием эндотоксина, присутствие которого не зависит от вида бактерий, а химическое строение - сходно у различных видов (Braude, 1964; Nowotny, 1969).

Современные биохимические исследования грамнегативных септицемий на примере экспериментального аэромоноза карпа указывали на корреляцию динамики фосфолипидного и жирнокислотного состава крови со стадийностью инфекционного процесса (Богдан и др., 1999). Авторы отмечали увеличение содержания полиеновых жирных кислот в мембранах лимфоцитов, объясняя это адаптивной реакцией, стимулирующей их функциональную активность. Исследователями обнаружена тесная связь между исходным фйзиологическим состоянием рыб течением у них инфекционного процесса и изменением биохимических параметров (Богдан. Смирнов, 1990; Смирнов и др., 1990; Богдан и др., 2002). У ослабленнных рыб уровень фосфолипидов в крови и лимфоцитах возрастал, и достигнув через 48 часов максимального уровня (150% от начального) снижался и оставался на 8% ниже начального. При нормальном физиологическом состоянии минимальный уровень фосфолипидов отмечался через 48 часов после экспериментального заражения и составлял всего 37% от контрольного. Затем начинал резко возрастать и к 168 часам после заражения достигал 226% от начального уровня и сохранялся длительное время. Отмечено значительное возростание активности лизосомальных иротеиназ -катепсинов В и D, особенно чётко выраженное в случае катепсина D. Причём повышение уровня заражения карпа аэромонадами приводило к усилению активности данных ферментов. При слабом заражении усиление активности катепсина D в зависимости от исследуемой ткани составляло 22% - 24% от контрольного уровня и 35% - 60% при сильном (Немова и др., 1994). Так же авторы указывают на то, что изменения биохимического состава крови сходны, как при экспериментальном аэромонозе, так и при экспериментальном псевдомонозе, что подтверждает мнение о единой природе патогенеза для всех грамнегативных бактерий.

Биомолекулярная основа "общего" фактора патогенности -липополисахарид (ЛПС), обладающий свойствами эндотоксина и являющийся одним из компонентов клеточной стенки грамнегативных бактерий (Езенчук, 1977). Эндотоксин является структурной частью О-аптигена. Морфологическая структура ЛПС у различных видов микроорганизмов очень сходна. ЛПС состоит из липида, соединённого амидной связью с полисахаридной частью. Полисахаридная часть имеет в своём составе базальную структуру и О-сиецифические цепи. Токсичность ЛПС обусловлена липидной частью, а О-специфические цепи и базальная часть не имеют прямого отношения к биологическому эффекту, вызываемому эндотоксином. Механизм патогенного действия токсина проявляется во взаимодействии с липидами и фосфолипидами клетки макроорганизма, нарушении проницаемости мембраны и воздействии на процессы, протекающие в цитоплазме клетки (Luderidz et al., 1986).

Помимо этого, доказана роль ЛПС в защите бактериальной клетки от фагоцитоза и воздействия лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков. Это подтверждено рядом опытов с R-мутантами, имеющими дефектный ЛПС и обладающими новышеной чувствительностью к химиопреиаратам (Езепчук, 1977). Грамнсгативиые патогены имеют также и видоспецифические факторы патогенности. Для аэромонад описаны: термолабильный и термостабильный гемолизины, протеазы, энтеротоксины, ДНК-азы. Представители сем. Enterobacteriaceae обладают цитотоксическими факторами с энтеротропной активностью, видоспецифичными термостабильными энтеротоксинами, р- и у- гемолизинами (Далин, Фиш, 1980). Но при развитии генерализованного септического процесса в организме рыбы, ведущая роль в патогенезе принадлежит общему эндотоксину - ЛПС, что невидимому, и обеспечивает сходный патогенез и одинаковые клинические проявления при поражении рыб грамнегативными микроорганизмами.

Характер патогенеза при генерализованной септицемии иосит системный характер, а по своим внешним проявлениям зачастую сходен с симитомами заболеваний неинфекционной этиологии. Клинические признаки, сходные с симптомами БГС, могут возникать в ответ на инвазию, токсикоз, механические повреждения и другие факторы не бактериальной природы (Новоскольцева и др., 1999). Например, описаны случаи язвообразования у некоторых морских рыб при скармливании им комбикормов сильно обсеменённых дрожжами (Roberts et al., 1993). На территории Российской Федерации, особенно в южных регионах, в последние годы отмечаются случаи возникновения гнойного геморрагического энтерита карпа. Казуативный агент, отнесённый к семейству Enterobacteriaceae, помимо гнойного воспаления кишечника вызывает также и образование язв на кожных покровах рыб (Афанасьев, 1996). Поэтому общая диагностика инфекционных болезней и постановка дифференциального диагноза при каждом конкретном случае возникновения бактериоза среди культивируемых рыб базируется на выделении и идентификации возбудителя.

Существующие профилактические мероприятия против БГС рыб, предусматривают создание оптимальных зоогигенических условий их культивирования. В ряде работ, опубликованных в период с 1989 по 1997 года, на примере рыбоводных хозяйств Молдовы, указаны бактериологические параметры водной среды, критические для выращиваемых рыб. Общее микробное число воды - 10000 КОЕ/мл из них 50% - грам отри нательные цитохромоксидазоположительные микроорганизмы. Общее количество аэромонад - 3000 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в 1 мл воды). Авторы указывают на то, что при привышении этих параметров печень карпов и растительноядных рыб, содержащихся в данном водоёме, оказывается обсеменена аэромонадами (Каховский, Тромбицкий, 1991). При этом неизбежно снижаются темпы её роста, получаемые с кормами питательные вещества затрачиваются на поддержание гомеостаза, а не на продукционный рост. Исследователи однозначно связывают эпизоотическое неблагополучие хозяйств по БГС с интенсификацией рыбоводных процессов (Каховский и др., 1989; Юхименко, Каховский, 1989; Каховский Михайловская 1990). Эвтрофикация рыбоводных прудов приводит к изменению экологии условно-патогенных бактерий и накоплением их в воде в значительном количестве. А.Е. Каховский (1991) в своей работе указывает па то, что большинство эксплуатируемых рыбоводных водоёмов приспособлены лищь для экстенсивного рыбоводства. Большинство из них имеют малые глубины и недостаточный для используемых плотностей посадки рыбы водообмен.

В качестве средств, позволяющих эффективно оптимизировать микробиологические параметры водной среды и профилактировать БГС рыб, авторами предложены регулярные обработки воды прудов гипохлоритом кальция и негашеной известью (Каховский и др., 1989; Каховский Михайловская 1990; Каховский и др, 1997). Наряду с этими важнейшими мероприятиями по поддержанию приемлемых зоогигиенических условий, для выращивания рыб является очистка прудов и их летование (Щербина, 1952; Справочник., 1978; Бауэр и др., 1981). Комплекс этих мероприятий позволяет снижать органическое загрязнение водоёмов, уменьшать бактериальный прессинг на рыбу и улучшать гидрохимический режим водоёма.

Несмотря на наличие эффективных мер, профилактика БГС остаётся весьма серьёзной проблемой отечественного рыбоводства. Литературные данные, опубликованные в течение последних лет, говорят, что на современном этапе развития отечественной аквакультуры эпизоотическое неблагополучие рыбоводных хозяйств определяется не его интенсификацией, а различными нарушениями биотехнологии культивирования рыб (Юхименко и др., 1996; Юхименко, Койдан, 1997; Гаврилии и др., 2002). Сюда можно отнести недостаточное кормление рыбы, использование токсичных кормов, неблагоприятные зоогигиенические условия в водоёме. Многие рыбоводные хозяйства по причинам экономического характера пренебрегают рыбоводно-мелиоративными и ветеринарно-санитарными мероприятиями. Во многих случаях не проводится выведение прудов на летование, гипохлорит кальция или негашёная известь вносятся в недостаточных количествах. Имеются данные о том, что в условиях Московской области общее микробное число воды в прудах, длительное время не выводившихся на летование, при недостаточном известковании может достигать к концу сезона 23000 - 27000 КОЕ/мл (Гаврилин и др., 2002). Интенсификация рыбоводства и несовершенство биотехнологий культивирования гидробионтов неизбежно ведёт к созданию в рыбоводном пруду искусственного биоценоза, резко отличающегося от природного. В новых условиях эволюционно сложившиеся механизмы регуляции численности популяций паразита и хозяина не срабатывают, возникает необходимость искусственного контроля за эпизоотической ситуацией на рыбоводном предприятии. Традиционным, наиболее развитым направлением в борьбе с БГС рыб в нашей стране является применение антибиотиков и антибактериальных препаратов, как для терапии заболевания, так и для его профилактики.

Серия исследований и экспериментов конца 40-х начала 50-х годов прошлого века, проведённых как за рубежом, так и в нашей стране, дали эффективный и достаточно низкозатратный метод борьбы с инфекционными заболеваниями рыб бактериальной этиологии. В борьбе с бактериозами культивируемых гидробионтов были применены антибиотики и антибактериальные препараты (Schaperclaus, 1954; Канаев, 1956). С данного момента они прочно вошли в практику рыбоводства. Согласно инструкции Департамента ветеринарии от 1998 года, с лечебной целыо против аэромоноза (БГС) рыб следует применять препараты нитрофуранового ряда и антибиотики: левомицетин, биомицин, дибиомиции и кротонолактон. Перечень антибиотиков, используемых, как в нашей стране, так и за рубежом для борьбы с бактериозами рыб достаточно широк. Наиболее часто используются тетрациклин, окситетрациклин, левомицетин, фуразолидон.

Подавляющее большинство отечественных публикаций, касающихся вопросов оздоровления неблагополучных по БГС (аэромонозу) рыбхозов указывает на необходимость комплексного и многократного применения антибиотиков (Панасенко, 1990; Афанасьев 1996; ; Бабенко, Оганесян, 1997; Скурат и др., 1997; Яременко и др., 1997). Ухудшение эпизоотической ситуации на рыбоводных хозяйствах часто связывают с уменьшением профилактического кормления рыб с препаратами нитрофуранового ряда (Чугалинская, 1997). О размахе химиотерапевтических мероприятий в современном отечественном рыбоводстве свидетельствует, тот факт, что в 1998 году только за счёт средств Росрыбхоза было закуплено и поставлено в хозяйства 2,5 тонны фуразолидона (Катичива, 1997).

Наряду с этим уже в начале 80-х годов рядом авторов отмечено снижение эффективности химиотерапевтических мероприятий, появились сообщения о появлении лекарственноустойчивых штаммов бактерий в товарном рыбоводстве, аквариумистике, разведении креветок (Brown, 1989; Dixon et al., 1990; Dixon, 1994). Устойчивость к антибиотикам формируется у широкого круга бактериальных патогенов рыб: аэромонад, псевдомонад, флавобактерий, миксобактерий и некоторых других (Schlotfeldt et al., 1985; Мс Phearson et al., 1991; Lewin, 1992).

Химиотерапия БГС представляет определённую сложность, так как при данном заболевании в качестве этиологических агентов выступает несколько различных микроорганизмов с различными уровнями чувствительности к антибиотикам. При такой ситуации даже после лабораторного исследования бывает трудно подобрать эффективный и приемлемый по стоимости препарат. Помимо этого при применении антибиотика значительное преимущество в реализации потенциала размножения и факторов вирулентности получит наиболее устойчивое к данному препарату звено микробиоценоза. В таком случае велика вероятность возникновения повторной вспышки заболевания, причём ранее применённый антибиотик будет уже малоэффективным.

Приобретение резистентности к антибиотикам обусловлено изменением ДНК, которое закрепляет селекция, дающая бактериальной клетке преимущества в окружающей среде (Dixon, 2001). Подобные перестройки генетического аппарата могут идти путём спонтанных хромосомных мутаций, которые происходят по одним данным с частотой 105

7 / I ^

- 10 клеточных делений (Dixon, 2001) и 10° - 10,J по другим (Навашин, Фомина, 1982). Большую роль в развитии антибиотикорезистентности играет возможность приобретения экстрахромосомальных ДНК - плазмид, во многих случаях несущих детерминанты лекарственной устойчивости -R-фактор. Наличие плазмид обнаружено у абсолютного большинства микроорганизмов, описанных в качестве этиологических агентов БГС. Среди них представители родов: Escherichia, Proteus, Enterobacter, Acinetobacter. Aeromonas, Pseudomonas (Shotts, 1967; Пехов, 1986). Плазмиды, несущие детерминанты резистентности сразу к пяти медикаментам обнаружены у A. hydrophila (De Paola et al., 1988).

Антибактериальные препараты подвергают бактерии селекции, часто давая в результате чрезвычайно быстрый рост резистентности и появление новой популяции устойчивых клеток. Эти клетки могут быть полностью инертными к воздействию отдельного антибиотика или эффективно подавляться только высокими концентрациями медикамента (Russel, Chora, 1990; Hindler et al., 1994). Широко используемый в отечественном рыбоводстве фуразолидон в концентрации 20 мкг/ мл не способен подавить размножение большинства выделенных в Подмосковных рыбхозах штаммов аэромонад (Борисова и др., 1999). Получены данные о резком снижении чувствительности аэромонад, выделенных из прудов и от рыбы в одном из рыбхозов Московской области к левомицетииу на фоне его многократного применения в течение рыбоводного сезона (Юхименко и др., 2003). По сути нерациональная химиотерапия бактериальных болезней рыб в аквакультуре является искусственной селекцией наиболее антибиотикорезистентных и биологически агрессивных бактериальных штаммов (Гаврилин и др., 2002).

Необходимо принимать во внимание, что большинство антибиотиков относятся к химическим соединениям с ярко выраженными иммунодепрессивными свойствами. За рубежом подробно исследовался такой, прочно вошедший в практику рыбоводства, препарат, как окситетрациклин. В ряде экспериментов показано, что антибиотик серьёзно подавляет тимусзависимый иммунный ответ (Rijkers et al., 1980; Crondel, Boesten, 1982). Исследования, проведённые в Национальной лаборатории исследования здоровья рыб в США, показали, что скармливание его карпам до инъецирования антигена снижает количество аитител-продуцирующих клеток на 75%. Если же окситетрациклин вводится в корм после контакта с антигеном эта цифра, достигает 90% (Van Muiswinkel, 1985). Испытания флорфеникола на форели продемонстрировало, что медикамент значительно снижает уровень фагоцитоза. При этом количество выживших при экспериментальном заражении рыб ниже на 10% в группе получавшей препарат перед заражением, по сравнению с контрольной (Lunden et al., 1999).

Большие надежды возлагаются на антибактериальные препараты из группы фторхинолонов, применение которых в отечественном рыбоводстве началось сравнительно недавно. В нашей стране наиболее широкое распространение получил препарат из группы монофторхинолонов -ципрофлаксацин. Медикамент поступает в рыбхозы иод коммерческим названием "Антибак". Ряд научных публикаций указывают на то, что препарат высокоэффективен против широкого круга грамнегативных патогенов рыб и практически не имеет "пробелов" в своём спектре антибактериального действия (Гаврилин, 2002; Гончаров, Енгашев, 2003). Также показано, что препарат не снижает количества циркулирующих антител как при купании рыб в растворах, так и при даче водонерастворимой формы "Антибака" с кормом (Гаврилин, 2002). К сожалению оптимистические прогнозы, что к фторхи полонам антибиотикорезистентность формироваться не будет, не оправдались. В медицинской практике, где препараты группы фторхинолонов применяются уже достаточно длительное время, обнаружены резистентные штаммы (Белобородова и др., 2000).

В западноевропейской и американской литературе, касающейся использования антибиотиков в аквакультуре, значительное внимание уделяется их роли в загрязнении конечной пищевой продукции. У некоторых препаратов отмечена способность длительное время после проведения курса лечения сохраняться в тканях рыбы и донных отложениях, чем обеспечивается длительный контакт водной микрофлоры с пониженными концентрациями медикамента (табл. 5).

38

Таблица 5

Некоторые данные по длительности сохранения медикаментов в рыбе и донных отложениях

Название препарата Срок обнаружения по окончании применения препарата, дн. Количество применённого препарата Место обнаружения Литературный источник

Окси-тетрациклин 14 Однократно внутри-брюшинно Печень, мышцы, кожа Posuniak A. et al. (1997)

Окси-тетрациклин 14 Перорально однократно Печень, мышцы, кожа Posuniak A. et al., (1997)

Окси-те|)ациклин Несколько месяцев Курс лечения Донные отложения Bjorklund H. V. (1991)

Окси-тетрациклин 5 Курс лечения 0,8 - 6,3 мг/г в донных отложениях Bjorklund I I. V. et al. (1994)

Оксалиновая кислота Несколько месяцев Курс лечения Донные отложения Bjorklund H. V. (1991)

Син- тетрациклин (синтетический) 80 70 мг/кг живой массы 7 дней Внутренние органы Romvary A. et al. (1997)

Хлор-тетрациклин 6 3,2 гр. карповита на 100 гр к/корма Различные ткани Мясоедов А.В. (1989)

Продолжение таблицы 5

Нор-флаксацин 30 Однократно виутри-брюшш/б 40 мг/кг живой массы Мышцы San Marthin N. В. et al. (1997)

Ципро-флаксацин 2 100 мг/кг живой массы однократно кровь Гончаров М.Н., Енгашев В.Г. (2003)

Амокси-циллин 10 Нет данных Макс, кол-во в коже, мин. -в позвоночнике Rocca G. D. et al. (1997)

Оксалиновая кислота 5 Курс лечения 0,2 мг/г в донных отложениях Bjorklund I I. V. et al. (1994)

Помимо необходимости получения в аквакультуре высококачественной экологически чистой и биологически безопасной продукции необходимо учитывать, что большинство грамнегативных патогенов рыб описаны и, как возбудители оппортунистических инфекций у человека. В иностранной литературе вопрос о формировании антибиотикорезистентных штаммов в аквакультуре рассматривается с точки зрения возможности угрозы здоровью людей (Mac Millan, 2001).

В мировой аквакультуре наблюдается однозначная тенденция к сокращению применения антибиотиков. Так, в 1996 году норвежская аквакультура потребила их более 1000 кг. К 2001 году это количество сократилось до 645 кг, при постоянно возрастающем производстве рыбной продукции (Asbjorn, 2002). В отечественной публикации со ссылкой на недавние исследования датских учёных, говорится, что борьбу с бактериозами рыб в аквакультуре при помощи химиотерапии можно еще более сократить за счёт применения вакцин и неспецифических иммуностимуляторов (Миронов, 2000).

В последние годы в литературе, посвященной рыбохозяйственным вопросам, всё чаще упоминаются препараты - пробиотики, зачастую выступающие, как альтернатива химиотерапии. В настоящее время понятие пробиотик формулируется, как добавка к корму, содержащая живые микроорганизмы, и благотворно влияющая на организм животного путём оздоровления микрофлоры кишечника (Мирзоева, 2001). Действие пробиотиков основано на способности вытеснять патогенные и условно-патогенные микроорганизмы из ниш их обитания в макроорганизме. Второй не менее важной функцией, обеспечивающей пробиотический эффект, является продуцирование комплекса биологически активных веществ, способных нейтрализовывать токсины бактерий, опасные метаболиты и способствовать процессу пищеварения. За счёт нормализации основных физиологических процессов усиливаются механизмы неснецифического иммунитета. Повышается антибактериальная активность лимфоцитов, увеличивается количество макрофагов, усиливается продукция антител (Muknict al., 1999).

Применение пробиотиков в аквакультуре весьма широко и разнообразно. Их используют при производстве живых стартовых кормов, для коррекции воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды при культивировании гидробиоитов, профилактике и терапии широкого круга их заболеваний. Пробиотическими свойствами могут обладать микроорганизмы различного систематического положения. Представителей бифидобактерий и рода Lactobacillus принято относить к классическим нробиотикам. Помимо них в медицинской и ветеринарной практике широко используются некоторые штаммы рода Bacillus (Вас. subtilis, Вас.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА | ^ j licheniforinis), Alcaligenes sp., Pscudomonas sp., Saccharomyces cerevisiae (Щавелева, 1999; Spanggard ct al., 2000; Мирзосва, 2001).

Как за рубежом, так и в нашей стране ведётся интенсивная работа, как по адаптации в аквакультуре уже хорошо зарекомендовавших себя препаратов, созданных изначально для теплокровных животных, так и по поиску оригинальных препаратов. Иностранными исследователями показана возможность нейтрализации поражающего действия па палтуса вирулентных Vibrio salmonicida, при помощи Lactobacillus sp. и непатогенных для этих рыб V. anguillarum. (Berg, 1998). Зарубежные учёные обнаружили способность оказывать пробиотический эффект на рыб у целого ряда микроорганизмов -водоросли Tetraselmis' suecica, бактерий V. alginolyticus, Corynobacterium inhibens Kl, Streptococcus faecium M74 (Mukni et al., 1999).

В нашей стране среди перспективных пробиотиков можно назвать биопрепарат "сухая бактериальная культура ацидофильной папочки". Препарат успешно используется в лососеводстве для борьбы с хроническими вялотекущими болезнями. При этом восстанавливаются функции желудочно-кишечного тракта, нормализуется рост рыб, уменьшаются потери товарной продукции. Применение биопрепарата зачастую помогает избежать применения антибиотиков (Карасева и др., 2000). Не менее успешно прошли испытания ацидофильного молока "Наринэ", приготовленного на основе другого штамма Lactobacillus acidophilus. Скармливание пробиотика в кличестве 10% от рациона в течение 5-ти дней позволило предотвратить отход и увеличить темпы роста молоди окской стерляди, осетра и севрюги. Показано более выраженное действие на повышение темпов роста стерляди добавления в корм ацидофильного молока, чем аскорбиновой кислоты. Прирост массы тела рыб, получавших молоко "Наринэ" был на 27% больше, чем в группе, кормившейся с добавкой аскорбиновой кислоты (Трифонова и др., 2003).

Казахскими исследователями разработан оригинальный пробиотик для рыб, на основе свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий

Azomonas agilis - "Азогилии". Разработчики сообщают об успешной деконтаминации внутренних органов сеголетка карпа при помощи своего препарата. Внутренние органы рыб, получавших пробиотик в количестве 5% от рациона, 5-ти дневными курсами с перерывами в 10 дней весь вегетационный период, были стерильными. В то время как печень, почки и селезёнка контрольных рыб были обсеменены низковирулентными аэромонадами (Швец и др., 1990). Исследователями указано, что "Азогилин" эффективно ингибирует патогенную кишечную микрофлору рыб и продуцирует молочную кислоту и витамины группы В, дающие жизненное преимущество кишечной нормофлоре и улучшающие усвоение корма.

Начаты исследования по влиянию па рост и физиологические показатели карпа и форели микробного препарата на основе ассоциации целлюлозолитических бактерий (Эрнст и др., 1995). Авторами показана возможность включения в рационы рыб вместо значительной части рыбной муки и пшеницы более дешевых растительных компонентов, без потери интенсивности роста рыб и нарушения физиологических функций. Добавление к рациону 1% целлобактерина обеспечивает хорошую усвояемость повышенных количеств клетчатки, поступающей с кормом.

Широкое применение на рыбоводных хозяйствах России находит пробиотик субалин (Vetosubalinum). Препарат изготовлен на основе жизнеспособных спор Вас. subtilis. Бактерии данного штамма обладают высокой антагонистической активностью к широкому кругу патогенов, как теплокровных животных, так и рыб, продуцирют ферменты, способствующие перевариванию пищи. Первоначально он использовался в животноводстве для лечения некоторых заболеваний, преимущественно смешанной этиологии. В настоящее время субалин хорошо зарекомендовал себя в индустриальных хозяйствах, на осетровых и лососевых заводах. Его применение улучшает физиологическое состояние рыбы, повышает неспецифическую резистентность их организма к неблагоприятным факторам окружающей среды (Vovk et al., 1999; Борисова и др., 2000; Юхименко и др, 2001; Юхименко и др., 2002).

Другим важнейшим способом профилактики инфекционных заболеваний разводимых рыб, способствующей непрерывному производству экологически чистой биологической продукции с минимальным использованием антибиотиков вряде литературных источников названа вакцинация (Sindermann, 1988; Dunn et al., 1990; Gudding et al., 1999). О значительном развитии вакцинации гидробионтов при их искуственном выращивании свидетельствует тот факт, что в 1983 году вакцинные препараты для аквакультуры официально лицензировались лишь в США и Канаде. К 1993 году число стран возросло до 13 (Smith, 1992). Наиболее успешно за последние годы вакцинация развивается в лососеводстве. Там широко применяется промышленная вакцина против вибриоза (Sindermann, 1988), в 1993 году лицензирована вакцина 2-го поколения против фурункулёза (Smith, 1992).

Одним из наиболее приоритетных направлений в развитии вакцинации карповых рыб, является создание вакцины против БГС, пригодной для массовой обработки рыбы. Тем более, что принципиальная возможность иммунизации рыб против подвижных аэромонад показана ещё В. Шаперклаусом, получившим индекс защиты около 67% (Schaperclaus, 1954).

Антигены подвижных аэромонад иммуногенны и приводят к формированию иммунной памяти. Взаимодействие вакцинного препарата с организмом рыбы можно представить следующим образом. Под воздействием антигена происходит стимуляция определённого числа лимфоцитов, имеющих специфические рецепторы к данному антигену. У рыб скопления лимфоцитов находятся в тимусе, головной и туловищной почках, селезёнке и стенке кишечника. Под действием антигенной стимуляции происходит пролиферация клона лимфоцитов с дифференциацией дочерних клеток, чьи функции меняются в зависимости от принадлежности к определённой популяции (Ellis, 1988; Микряков, 1990).

Выделяют две основные популяции - это тимусзависимые лимфоциты или Т-лимфоциты и В-лимфоциты, чаще всего ассоциированные у рыб с почками. (Warr, 1997). В-лимфоциты продуцируют антитела, а Т-лимфоциты дифференцируются на несколько функциональных типов клеток. К ним относятся: "клетки-киллеры" непосредственно лизирующие чужеродные частицы, "лимфокин-продуцирующие клетки", стимулирующие активность макрофагов за счёт продукции иитерлейкинов, "Т-супрессоры", чьей функцией является регуляция продуцирования антител и лимфокинов, "Т-помошники", при взаимодействии с В-лимфоцитами усиливающие ответ на введение антигена. И, наконец, продукция антител требует присутствия третьей клеточной популяции, перерабатывающей и подающей антиген, у рыб эту роль выполняют макрофаги и моноциты (Vallejio, 1992).

Продуцируемые антитела (иммуноглобулины) относятся к гликопротеидам и содержат различные количества олигосахаридов различного состава и строения. К настоящему времени для костистых рыб описан единственный класс иммуноглобулинов - тетрамерный макроглобулин с молекулярной массой от 600 до 800 кД (в зависимости от вида рыб) сходный с Ig М млекопитающих (Микряков, 1990). Основной функцией антител является специфическое взаимодействие с антигеном и его инактивация посредством агглютинации в случае бактерий или преципитации в случае растворимого антигена. Присоединение антитела к поверхностному рецептору бактерии запускает работу системы комплемента, действие которой приводит к лизису микроорганизма (Anderson, 1974;). Наличие на поверхности чужеродных частиц иммуноглобулинов служит меткой, обеспечивающей более быстрое распознавание антигена и как следствие - усиление фагоцитоза.

Главной трудностью на пути создания вакцин против подвижных аэромонад является их антигенная гетерогенность (Newman, 1993). Моновалентные вакцины, изготовленные из подвижных аэромонад, демонстрировали удовлетворительную защиту от гомологичных штаммов (у разных авторов кумулятивная гибель в опытных группах составляла от 0% до 30%, при 70% - 100% - в контрольных), но не оказывали протективного эффекта в случае гетерологичных штаммов (Post, 1963; Song et al., 1976). Сходными недостатками обладали и используемые для иммунизации рыб очищенные антигены - гемолизины (Schaperclaus, 1967) и липополисахариды (Babaet al., 1988).

Попыткой обойти это препятствие стали работы по созданию поливалентных вакцин, содержащих несколько генетически разнородных штаммов. Хороший протективный эффект продемонстрировала испытанная в 1997 году трёхвалентная вакцина, продемострировавшая 100% защиту опытных рыб, при гибели 3/4 контрольной группы (Karunasagar et al., 1997). Но при использовании подобных препаратов невозможно учесть огромного разнообразия штаммов подвижных аэромонад, с которыми рыбе предстоит столкнуться в процессе выращивания (Plumb, 1984). Необходимость создания вакцины для каждого водоёма трудоёмко и не позволяет получить медикамент для широкого коммерческого использования.

Это серьёзное препятствие было успешно преодолено группой отечественных учёных. Ими было обнаружено, что подвижные аэромонады, относящиеся к первой группе вирулентности и являющиеся облигатными патогенами рыб, могут стать продуцентами протективного антигена. Белковая цитоплазматическая фракция II (молекулярный вес около 67 кД), полученная из штамма Л. sobria 77-18, обладает выраженными иммуногенными свойствами и защищает как от заражения штаммом -продуцентом, так и от гетерологичных штаммов подвижных аэромонад (Гусева, Галаш, 1997; Юхименко и др., 1997; Юхименко и др., 1998). На способ получения протективного антигена был получен патент.

На основании этого вещества была создана биохимическая вакцина ВЮС-2. Производственные испытания этого препарата дали положительные результаты. Авторы сообщают о 100 % защите вакцинированных рыб, при заболевании более половины контрольных рыб во время естественной вспышки БГС, сопровождавшейся появлением большого числа штаммов высоковирулентных аэромонад.

Широкое коммерческое применение вакцины ВЮС-2 сильно ограничено, трудоёмким, требующим специального навыка, путём введения - внутрибрюшинная инъекция. Это серьёзно снижает возможность вакцинации больших групп товарных рыб.

В силу вышеизложенного работы по созданию антиаэромонадной вакцины с иммерсионным способом введения не утратили своей актуальности. Подобные исследования в последние годы ведутся как на территории Российской Федерации, так и за рубежом. Иностранные авторы сообщают об успешных испытаниях бактерина, изготовленного из А. hydrophila, и предназначенного для иммерсионного или внутрибрюшинного введения. По их данным испытываемая вакцина ведёт к увеличению количества лейкоцитов, Т-лимфоцитов, нейтрофилов и к усилению фагоцитоза, которое достигает максимума через 7-14 дней после введения антигена. Наибольший иммуногенный эффект вакцина оказывала при введении антигена при температуре воды 12° С, с последующим ее повышением. Так же установлено, что формалинизированный антиген более иммуногенен, чем инактивированный нагреванием (Kozinska, Antychowicz, 2000).

В литературе, посвящёиной общим вопросам создания корпускулярных формалинизированных вакцин, приводятся данные по оптимальным количествам формалина, используемого для инактивации антигена. Исследователи рекомендуют использовать концентрации, не превышающие 0,05% - 0,2 %, во избежание потери иммуногенности вакцинного препарата, и токсического поражения обрабатываемых рыб. Авторы указывают на преимущества инактивации антигена формалином по сравнению с ультразвуком (Chen et al., 1996).

Украинские учёные сообщают о повышении неспецифической резистентности рыб, достигаемой их купанием в бактерине, приготовленом из вирулентного штамма A. hydrophila (Просяная, 1990).

Значительный интерес представляет статья канадских исследователей, посвящённая вакцинации атлантического лосося экстраклеточной протеазой, полученной из A. sobria. Авторы сообщают, что иммунизация защищала молодь рыб, как от заражения штаммом - продуцентом протеазы, так и от гетерологичных штаммов. (Shen, 1990)

Некоторые данные по развитию вакцинации против подвижных аэромонад приведены в таблице 6.

Таблица б

Некоторые опыты вакцинации против подвижных аэромонад

Литературный источник Вакцинный препарат Путь введения Иммуно-генность Полученный протективный эффект

Гомологичный штамм Гетероло-гичиый штамм

Post G. (1966) Суспензия клеток, убитых нагреванием Оральный + + нет данных

Просяная В. В. (1990) Бактерии Прямая иммерсия + нет данных нет данных

Продолжение таблицы 6

Kozinska Формалинизи нет данных + + нет л., рованная данных

Antycho- взвесь клеток wicz J. A. hydrophila

2000

Schaper Смесь нет данных + + claus W. гемолизинов

1967) различных штаммов

Baba T. et Очищеный Ванны или + + al. (1988) ЛПС внутрибрюши нно

Shen Экстраклеточ- Внутри + + +

M.S. ная протеаза мышечно

1990)

Гусева Биохими- Внутри + + +

H.B. ческая брюшин'б

Галаш вакцина

B.T. ВЮС-2

1997);

Юхимен- ко JI.H. и

ДР-,

1997)

Таким образом на данный момент создан достаточный теоретический фундамент для развития иммунопрофилактических процедур против БГС рыб. Актуальность данных работ определяется тем фактом, что от создания эффективного комплекса мер ио профилактике БГС во многом будет зависеть эпизоотическое благополучие предприятий российской аквакультуры.

Заключение Диссертация по теме "Ихтиология", Гаврилин, Кирилл Владимирович

выводы

1. Испытания иробиотика субалина в аквариальных условиях позволили установить индекс защиты карпов от экспериментального аэромоноза - 100%. Также выявлено положительное влияние препарата на увеличение темпа роста. В условиях тепловодного садкового (рыбхоз "Черенецкий") и прудового (ОАО "Бисеровский рыбокомбинат) карповых хозяйств показана высокая эффективность субалина при терапии клинически выраженной БГС.

2. Установлено, что иод действием субалина усиливается продукция циркулирующих антител. Иммуностимулирующее действие препарата показано на карпах товарных групп в ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и на сеголетках в рыбхозе "Лотошинский".

3. Кормление рыб с субалином дает выраженный и стабильный эффект деконтаминации внутренних органов рыб, независимо от уровня бактериального прессинга окружающей водной среды.

4. Использование субалина на ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" позволило эффективно контролировать эпизоотическую ситуацию по БГС карпа, несмотря на высокую интенсификацию рыбоводного процесса и полностью отказаться от применения антибиотиков и антибактериальных препаратов. Достоверные результаты, положительно характеризующие пробиотический препарат,позволяют рекомендовать субалин на основе Вас. subtilis 2335 (регистр. № ВКПМ В-4759) для профилактики БГС рыб в условиях интенсивного прудового рыбоводства.

5. При экспериментальном испытании бактерина из A. sobria штамма 77-18 получены высокие индексы защиты при внутримышечном заражении карпов гомологичным и гетерологичными штаммами вирулентных подвижных аэромонад.

6. Установлено, что пониженные температуры воды (не менее 12° С) не оказывают отрицательного влияния на эффективность вакцинации и формирование карном приобретенного иммунитета, что определяет возможность весенней вакцинации рыб.

7. Испытания бактерина в опытно-производственных условиях выявили его высокие иммуногеиные и протективные свойства.

8. Установлено положительное влияние вакцины на прирост массы тела товарного карпа в условиях хозяйства^неблагополучного по язвенному синдрому небактериальной этиологии (рыбоводный участок "Нептун"). На основании публикаций ряда отечественных исследователей этот факт объяснен тем, что вакцинированная рыба способна затрачивать больше пластических и энергетических ресурсов, получаемых с кормом, на продукционный рост, не тратя их на элиминацию внедрившихся патогенов.

9. Методика проведения вакцинации, используемая нами, увязывает ее с биотехнологическими рыбоводными мероприятиями и практически сводит на нет трудовые затраты на дополнительную обработку рыбы.

10. Данные, положительно характеризующие протективный и иммуногенный эффект, оказываемый вакциной, позволяют рекомендовать препарат для специфической иммунопрофилактики БГС рыб.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили разработать методы специфической и неспецифической иммунопрофилактики БГС карпа в условиях интенсивного прудового рыбоводства. Использование этих препаратов позволит увеличивать способность рыб противостоять бактериальному прессингу из окружающей водной среды и выживать в измененных экологических условиях интенсивно эксплуатируемого рыбоводного пруда. Помимо этого за счет общей нормализации физиологических процессов препараты способны повышать устойчивость раб к стрессирующим факторам играющим роль пускового механизма в развитии БГС.

Наличие надежных средств профилактики наиболее распространенного на территории нашей страны бактериального заболевания прудового карпа необходимо, для осуществления интенсифицированного рыбоводного процесса. Использование при контроле эпизоотической ситуации по БГС карпа иммунонрофилактических методов позволит рыбоводным предприятиям наращивать выпуск экологически чистой пищевой рыбной продукции.

Полученные результаты подтверждают данные отечественных и зарубежных исследователей о высокой эффективности пробиотиков при профилактики и терапии бактериальных болезней рыб в аквакультуре.

Испытанная вакцина представляет собой единственный препарат своего класса. В литературе нет сведений о успешном испытании вакцин против подвижных аэромонад в форме бактерина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврилин, Кирилл Владимирович, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.:Гос. Изд-во мед. лит-ры, 1962.- 177 с.

2. Анисимова И.М., Лавровский В.В. Ихтиология. М.: Высшая школа, 1983.-255 с.

3. Аморос Хименес Г.К. Микрофлора сазана (Cyprinus саф1'о) в дельте р. Волги в современных условиях и ее эпизоотическое значение / Автореф. канд. дисс. С. - Петербург, 1993. - 25 с.

4. Афанасьев В.И. Лечение и профилактика инфекционных и инвазионных болезней рыб // Рыб-во и рыболовство 1996. - N 1. -С. 35-37.

5. Бабенко О.В., Оганесян Г.С. Опыт борьбы с аэромонозом карпа// Ветеринария. 1997.-N7.-С. 14-15.

6. Бауэр О.Н., Мусселиус В.А., Стрелков Ю.А. Болезни прудовых рыб М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. - 320 с.

7. Белобородова Н.В., Богданов М.Б., Черненькая Т.В. Алгоритмы аитибиотикотерапии / Руководство для врачей. 2000. - 192 с.

8. Берджи. Определитель бактерий. М.: Мир, 1997. - 761 с.

9. Богдан В.В., Смирнов Л.П. Изменение фосфолипидного состава крови у разных по физиологическому состоянию карпов при аэромонозе // Биохим. экто- и эндотермных организмов в норме и при патологии. -Петрозаводск, 1990. С. 116-120.

10. Богдан В.В., Смирнов Л.П., Сидоров B.C. Влияние аэромонад разной патогенности на жирнокислотный состав фосфолипидов крови карпа // Прикл. биохимия и микробиол. 1999. - Т.35, N 2. - С. 236-238.

11. Богдан В.В., Смирнов Л.П., Сидоров B.C. Липидный состав лимфоцитов крови карпа при бактериальной инфекции // Прикл. биохимия и микробиол. 2002. - Т.38, N2. - С. 190-193.

12. Борисенко В.Ф. Свойства аэромонад и их значение в интенсивно эксплуатируемых рыбоводных прудах / Автореф. канд. дисс. М., 1991. - 29 с.

13. Борисова М.Н., Новоскольцева Т.М., Иренков И.П., Белявская В.А., Пронин В.В. Субалин для рыб//Рыб-во. и рыболовство. 2000. -N2. - С. 21.

14. Борисова М.Н., Козачеико Н.Г., Болезни рыб, вызываемые аэромонадами: взгляд на проблему // Рыбн. хоз.-во / Сер. Болезни гидробионтов в аквакультуре. Аналит. и реф. информ. М.: ВЫИЭРХ, 2000.-Вып. 1.-С. 25-26.

15. Бурлаченко И.В., Аветисов К.Б., Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И. Влияние микробной обсеменённости кормов на рост и физиологическое состояние молоди стерляди / Тр. ВНИРО. М. - 2002. -С. 194-207.

16. Бычкова Л.И., Юхименко Л.Н., Можарова А.И. Протейная инфекция у форели при выращивании в морских садках // Рыбн. хоз.-во / Сер. Аквакультура. Информ. пакет. М.: ЦНИИТЭИРХ, 1995. - Выи. 2. -С. 7-10.

17. Волынкин Ю.Л., Ноздрин С.П., Евсюкова Т.Ф., Борисов А.Г., Грохотов С.В. Шимко В.В. Краснуха в рыбхозах Белгородской области // Рыбн. хоз.-во. 1991.-N9.-С. 41-43.

18. Гаврилин К.В. Опыт борьбы с бактериальной геморрагической септицемией (БГС) в условиях декоративной аквариумистики // Мат-лы Межд. науч.-практ. конф. молодых ученых «Проблемы аквакультуры и функционирования водных экосистем». Киев, 2002.-С. 147-149.

19. Гаврилин К.В., Юхименко Л.II., Бычкова Л.И. Влияние факторов окружающей среды на микробиоценоз рыбоводных прудов // Мат-лы Межд. науч.-практ. конф. «Аквакультура начала XXI века: истоки, состояние, стратегия развития». М.: ВНИРО, 2002. - С. 282-285.

20. Головин П.П. Стресс-факторы в индустриальном рыбоводстве, их влияние на рыб и меры предупреждения / Автореф. каид. дис. М., 1984.- 21 с.

21. Гончаров М.Н., Енгашев В.Г. Фармакинетика фторхинолонов в организме рыб. // Сб. тез. Всероссийской научн.-практ. конф. «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов». М.: Россельхозакадемия, 2003. -С. 192-193.

22. Грищенко Л.И., Рудиков Н.И. Проблемы патологии и иммунитета при инфекционных болезнях рыб // Ихтиология (Итоги науки и техники). -М.: ВИНИТИ, 1985. Т.1. - С. 190-211.

23. Гусева Н.В., Галаш В.Т. Влияние вакцинного преперата «ВЮС-2» и глюкана на эпидермальную слизь и миграцию макрофагов в конечном отделе кишечника // Тез. докл. I конгр. ихтиологов России. -Астрахань, 1997.-С. 375.

24. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М.: Медицина, 1980.-224 с.

25. Денисов Л.И. Аэромоноз карпа в рыбоводно-тепловодных хозяйствах: Тез. докл. IV Вссс. совещ. по рыбохоз. использ. тепл. вод. М., 1990. -С. 177-178.

26. Езеичук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977.-215 с.

27. Есииова М.А., Глазачева Е.В., Соловьев JI.M. Влияние органического загрязнения водной среды на продуктивность рыбоводных прудов / Сб. науч. тр. / Вонр. товарного рыбоводства.- М.: ВНИИПРХ, 1978. -Вып. 19. С. 172-181.

28. Жезмер В.Ю., Белякова Н.В., Заливака J1.B. Энтеробактерии в установках с замкнутым циклом водоснабжения / Сб. научн. тр. / Индустр. методы рыб-ва в замкнутых системах.- М.: ВНИИПРХ, 1988. -Вып. 55. С. 84-88.

29. Жезмер В.Ю., Ляшенко Е.В., Галдина Е.А., Кутищева II.В., Лаврова Н.С. Бактериальные болезни рыб в установках с замкнутым циклом водообеспечения. Вопросы их профилактики // Тез. докл. IX Всес. совещ. но паразитам и болезням рыб. Л., 1990. - С. 44-45.

30. Жезмер В.Ю., Галдина Е.А., Кутищева Н.В., Лаврова Н.С. Патогенность для канального сома гетеротрофных бактерий, функционирующих при выращивании рыбы в замкнутых системах / Сб. науч. тр. / Болезни рыб. М.: ВНИИПРХ, 1991. - Выи. 63. -С.39-44.

31. Канаев А.И. Профилактика и лечение краснухи карпа антибиотиками.-М.: ВНИРО, 1956.-30 с.

32. Кауфман Ф. Семейство кишечных бактерий (пер. с английского Доссер Е.М., Голубевой И.В.).- М.: Медгиз, 1959. 354 с.

33. Калина Г.П. Теоретические обоснования изучения потенциально-патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды // Гигиена и санитария. 1983. - N 10. - С. 4-7.

34. Каховский А.Е. Распределение саиротрофных бактерий родов Aeromonas и Pseudomonas по акватории рыбоводного пруда / Сб. науч. тр. / Болезни рыб и водная токсикология. М.: ВНИИПРХ, 1987. -Выи. 50.-С. 21-30.

35. Каховский А.Е. Михайловская JI.B., Кузьмина JI.B. Взаимосвязь интенсификации рыбоводства, условий обитания аэромонад и клинического состояния рыб // Иитенсиф. выращивания товарн. рыбы в Молдавии. Кишинев, 1989. - С. 68-79.

36. Каховский А.Е., Тромбицкий И.Д. Метод профилактики аэромонозов прудовых рыб и повышения продуктивности рыбоводных прудов. // Рыбн. хоз.-во / Сер. Аквакультура. Информ. пакет. М.: ЦНИИТЭИРХ, 1991.-Вып. 1.-С. 7-10.

37. Каховский Л.Е. Профилактика болезней рыб бактериальной этиологии в интенсивно эксплуатируемых рыбоводных прудах / Лвтореф. канд. дис.-М., 1991.-26 с.

38. Каховский А.Е., Тромбицкий И.Д., Михайловская JI.В, Синяева Т. Контроль качества воды, прогноз и профилактика бактериальных заболеваний рыб в рыбоводстве Молдовы // Тез. докл. I конгр. ихтиологов России. Астрахань, 1997. - С. 397.

39. Карасева Т.А., Воробьева U.K., Лазарева М.А. Влияние препарата «сухая бактериальная культура ацидофильной палочки» на здоровье и рост радужной форели // Тез. докл. науч.-практ. конф. «Марикультура Северо-Запада России». Мурманск, 2000. - С. 22-23.

40. Катичева Л.Ю. Работа по улучшению эпизоотического состояния рыбоводных хозяйств Росрыбхоза // Итоги нуч.-практ. работ в ихтиологии М.: МИК, 1997. - С. 54-56.

41. Комианец Э.В., Исаева М.Н., Балахнин И.А. Бактерии рода Aeromonas и их роль в аквакультуре // Микробиол. журн. 1992.- Т.54, N 4. -С.89-99.

42. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - 394 с.

43. ЛарцеваЛ.В. Микрофлора промысловых рыб Волого-Каспийского региона //Тез. докл. IX Всес. совещ. по паразитам и болезням рыб. -Л., 1990.-С. 73-75.

44. Ларцева Л.В., Катунин Д.Н. Микрофлора рыб биоиндикатор загрязнения дельты Волги / Сб. научи, тр. / Водные биоресурсы, воспр-во и экология гидробионтов. - М.: ВНИИПРХ, 1993. - Вып. 69. -С. 155-163.

45. Микряков В.Р. Закономерности формирования приобретенного иммунитета рыб. Рыбинск, 1990. - 151 с.

46. Миронов С.Г. Можно ли сократить применение антибиотиков при выращивании рыб // Рыб-во и рыболовство. 2000. - N 4. - С. 31-32.

47. Мирзоева Л.М. Применение пробиотиков в аквакультуре // Рыбн. хоз.- во / Сер. Болезни гидробионтов в аквакультуре. Аналит. и реф. информ.- М.: ВИИЭРХ, 2001. Вып. 2. - С. 23-30.

48. Мясоедов А.В. Фармакодинамика хлортетрациклина при лечении аэромоноза карпов карповитом // Бюл. ВИЭВ. 1989. - N 64. - С. 188-190.

49. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М.: Медицина, 1982. -496 с.

50. Пемова Н.Н., Круппова М.Ю., Смирнов Л.П., Сидоров B.C. Активность протеиназ лизосом в тканях карпа при аэромонозе // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т.30, N3. - С. 454-457.

51. Новоскольцева Т.М., Иренков И.П., Борисова М.Н. Язвенный синдром у рыб // Рыбн. хоз.-во. / Сер. Аквакультура: Информ. пакет Болезни рыб. М.: ВНИЭРХ, 1999. - Вып. 1. - С. 28-30.

52. Hyp Эльдин Амии М.А. О частоте выделения из органов клинически здоровых белых толстолобиков условно-патогенных бактерий Aeromonas punctata и Pseudomonas // Тез. докл. VI Всес. совещ. по болезням и паразитам рыб. М., 1974 - С. 169-172.

53. Олах Я., Фаркаш Й., Еней Г., Еней Ж., Малик Э. Роль стресса в бактериальном жаберном некрозе карпа // Болезни и паразиты в тепловодном рыбном хозяйстве. Душанбе, 1988. - С. 37-42.

54. Панасенко В.В. Новые способы оздоровления тепловодных хозяйств от аэромоноза карпов // Тез.докл. Всес. совещ. по рыбохоз. использ. тепл. вод. М., 1990.-С. 176.

55. Пехов А.П. Плазмиды бактерий. М.: Медицина, 1968. - 224 с.

56. Подзорова А.А. Аэромоноз производителей рыбца // Итоги науч. -практ. работ в ихтиол. М.: МИК, 1997. - С. 86-87.

57. Покровский В.И. Энтеробактерии (Руководство для врачей). М.: Медицина, 1985.-321 с.

58. Просяная В.В., Хуторной П.М. Бактериальная флора белого амура в условиях неудовлетворительного гидрохимического режима / Сб. науч. тр. / Болезни рыб и борьба с ними. М.: ВНИИПРХ, 1979. - Выи. 23. -С. 29-36.

59. Просяная В.В. Влияние бактерина на иммунологические показатели карпа // Тез. докл. IX Всес. совещ. по паразитам и болезням рыб. JI., 1990.-С. 105-106.

60. Пьяцца Л. Анализ иммунологических данных // Методы исследования в иммунологии. М.: Мир, 1981. - С. 429-439.

61. Рудиков Н.И., Грищенко Л.И. Микрофлора и бактериальные болезни рыб // Ихтиология (Итоги науки и техники).- М.: ВИНИТИ, 1985. -Т.1.-С. 93-160.

62. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. Ч. 1.- М.: Отдел маркетинга АМБ-агро, 1998. 310 с.

63. Смирнов Л.П., Богдан В.В., Юхименко Л.Н. Биохимические аспекты аэромоноза карпа // Тез. докл. IX Всес. совещ. по паразитам и болезням рыб.-Л., 1990-С. 118-119.

64. Смирнов Л.П., Богдан В.В., Немова Н.Н., Юхименко Л.Н. Цитоплазматическая белковая вакцина против бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) рыб // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т.36, N5. - С. 592-596.

65. Скурат Э.К., Сиволоцкая В.А., Говор Т.А., Гребнева Е.И. Аэромоноз карпа и меры борьбы с ним и условиях республики Беларусь // Тез. докл. I конгр. ихтиологов России. Астрахань, 1997. - С. 390-391.

66. Справочник по болезням рыб (иод. ред. Осетрова B.C.). М.: Колос, 1978.-350 с.

67. Чугалинская Л.О. Изыскание новых препаратов для профилактики и лечения аэромоноза рыб // Итоги нуч.-нракт. работ в ихтиологии. -М.: МИК, 1997.-С. 120-121.

68. Щербина А.К. Болезни прудовых рыб. М.: Гос. изд-во с.-х. л-ры, 1952. 205 с.

69. Щвсц I I.М., Бугаев М.А., Иванова Г.М. Микробиологический метод профилактики аэромоноза карпа // Тез. докл. IX Всес. совещ. по паразитам и болезням рыб. JI., 1990. - С. 142-143.

70. Щавелева С.А. Пробиотики, пребиотики и иробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопр. питания, 1999. N 2. -С. 32-30.

71. Юхименко Л.II., Викторова В.Ф. Аэромонады рыб / Сб. научн. тр./ Болезни рыб и борьба с ними. М.: ВНИИПРХ, 1979. - Вып. 23. -С. 37-55.

72. Юхименко Л.Н., Викторова В.Ф., Федорченко В.И. Выделение аэромонад из воды рыбоводных прудов / Сб. иаучн. тр. / Болезни рыб и водная токсикология. М.: ВНИИПРХ, 1987. - Вып. 50. - С. 37-46.

73. Юхименко Л.Н., Каховский А.Е. Способ повышения рыбопродуктивности эвтрофных прудов путем снижения бактериального инфицирования рыб / Сб. научн. тр. / Комплексная интенсификация пруд, рыб-ва.- М.: ВНИИПРХ, 1989. N 56. - С. 114120.

74. Юхименко Л.Н., Гусева Н.В., Койдан Г.С. Иммунопрофилактика аэромоноза рыб // Тез. докл. I конгр. ихтиологов России. Астрахань, 1997.-С. 399.

75. Юхименко Л.Н., Койдан Г.С. Современное состояние проблемы аэромоноза рыб // Рыбн. хоз.-во / Сер. Аквакультура: Информ. пакет Болезни рыб. М.: ВНИЭРХ, 1997. - Вып. 2. - С. 1-5.

76. Юхименко Л.Н., Смирнов Л.П., Койдан Г.С., Гусева Н.В. Специфическая профилактика бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) рыб // Рыбн. хоз.-во / Сер. Аквакультура: Информ. пакет Болезни рыб. М.: ВНИЭРХ, 1998. -Вып. 2.-С. 14-21.

77. Юхименко Л.Н., Койдан Г.С., Бычкова Л.И., Смирнов Л.П. Биологические свойства аэромонад и их роль в патологии рыб // Рыбн. хоз.-во/Сер. Болезни гидробионтов в аквакультуре. Аналит. и реф. информ.-М.: ВНИЭРХ, 2001.-Вып. 1.-С. 1-10.

78. Юхименко JI.П., Бычкова Л.И., Гаврилин К.В. Испытания лечебного комбикорма с субалином в рыбхозах Московской области // Рыбн. хоз.-во Сер. Болезни гидробионтов в аквакультуре. Аналит. и реф. ипформ. М.:ВНИЭРХ. 2002. - Вып. 2. - С. 18-27.

79. Яременко Н.А., Темиров Р.Т., Сапожников Г.И. Эпизоотическое состояние ио болезням рыб и борьба с ними в рыбоводных хозяйствах Российской Федерации // Итоги нуч.-практ. работ в ихтиологии. М.: МИК, 1997. -.С 129-130.

80. Яременко Н.А., Мачнев А.Н. Эпизоотическая обстановка по заразным болезням рыб в Российской Федерации // Тез. науч.-практ. конф. «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре». М.: Россельхозакадемия, 2000.-С. 10-13.

81. Ainlacher Е. Taschenbuch der fishkrankhciten. Jena: Gustaf fisher verlag, 1961.-286 s.

82. Amlacher E. Taschenbuch der Fishkrankhcitcn fur Vetcrinarmcdiziner und Biologen. Jena, 1972. - 378 s.

83. Amend D.F. Potency testing of fish vaccines // Dev. biol. standard. 1981.1. V. 49, N1.-P. 447-454.

84. Anderson P.D. Diseases offish. Book 4. // Fish immunology (eds. Snieszko S.F., Axelrod R.H.). Neptune city: T.F.H. Publication, 1974. - 239 p.

85. Asbjorn B. Less medicine needed every year // Fish farmer. 2002. - V. 16, N5.-P. 5.

86. Austin B.I., Austin D.A. Bacterial fish pathogens (ed. 2). New York: Ellis Horwood, 1993.-384 p.

87. Baba Т., Imamura J., Izawa K., Ikeda K. Immune protection in carp, Cyprinus carpio after immunization with Aeromonas hydrophila crude liupopolysaccharide // Fish diseases. 1988. - V. 11, N 2. -P. 237-244.

88. Berg O. Probiotika helsekost for marin fishkeyngel // Norsk Fiskeoppdr. -1998.-N 2.-P. 38-39.

89. Bjoklund II.V. Oxytetracycline and oxolinic acid as antibacterials in aquaculture analysis, pharmacokinetics and environmental impacts// Acta acad. Aboen. -1991. - 51, N 6. - P. 1 -43.

90. Bjoklund H.V., Rabergh C.M.I., Bylund G. Residueas of oxolinic acid and oxytetracycline in fish farms // Aquaculture. 1994. - N 97. - P. 85-86.

91. Boonyaratpalin S. Bacterial pathogens involved in the epizootic ulcerative syndrome offish in Southeast Asia // Aquat. Anim. Health, 1989. V. 1, N 4.-P. 271-276.

92. Braude A. Bacterial endotoxins // Sci. Amer., 1964. 210, N 3. - P. 36-45.

93. Brown J.H. Antibiotics: Their use and abuse in aquaculture//World Aquaculture. 1989. - P. 34-43.

94. Bullook G.L., Conroy D.A., Snieszko S.F. Bacterial diseases of fish (eds. Snieszko S.F., Axelord H.R.). Neptune city: T.F.H. Publications, 1972.- 144 p.

95. Chen Yuenying, Quan Dong, Shen Zhihua, ShenJihyu, Cao Zhen, Yin Welin, Zhang Nianci. Produktion of bacterin for fishes disease of bacterial septicaemia//Fish China, 1996. 20, N 2. - P. 125-131.

96. Crondel J.L., Boesten J. A.M., The influence of antibiotics on the immune system. Inhibition of the mitogenic leukocyte response in vitro by oxytetracycline// Develop. Сотр. Immunol., 1982. N 2. - P. 211-216.

97. Davis J.F., Haysaka S.S. Pathogenic bacteria associated with American eels, Anguila rostrata Le Sueur// Fish Biol., 1983. V. 23, N 6. - P. 557-564.143

98. Dc Paola Л.Р., Flunn P.A., Mc Phcarson R.M., Levy S.B. Phenotypic and genotypic characterization of tetracycline and oxycycline resistant Aeromonas hydrophila from cultured channel catfish (Ictalurus punctatus) and their environments // Applied and

99. Environmental Microbiology. 1988. - V. 54. - P. 1861-1863.

100. Dixon В.Л., Yamashita E.F. Antibiotic resistance of Aeromonas spp. isolated from tropical fish imported from Singapore // Aquatic Animal Health. 1990. - N 2. - P. 295-297.

101. Dixon В.Л. Antibiotic resistance of bacterial fish pathogen//World Aquaculture Society. 1994. - N 25. - P. 60-63.

102. Dixon B.A. The biology of antibiotic resistance // World Aquaculture. -2001.-V 32, N4.- P. 63-65.

103. Dunn E.J., Polk A., Scarrett D.J., Oliver G., Lall S., Guosen M.F.A. Vaccines in aquaculture: The search for an efficient delivery system// Aquacult. Eng. 1990. - 9, N 1. - P. 23-32.

104. Ellis A.E. Fish vaccination. New York: Academic press, 1988. - 255 p.

105. Golovin P.P. Fish diseases in aquaculture of the Central-European region of Russia // Book of abst. First Russia-USA symp. «Aquaculture and fish health».- Rybnoe, 1998. P. 21-23.

106. Gudding R., Lillehaug A. Evensen O. Recent developments in fish vaccinology // Vet. Immunol, and immunopathol. 1999. - 72, N1-2. -P. 203 -212.4» 144

107. Hcuschmann-Brunncr G. Die Aeromonaden der «Hydrophila-Punctata» gruppe bei Subwasserfischen. // Arh. Hydrobiol., 1978. 83, N 1. -S. 99-125.

108. Hindler J.A., Howard B.J., Keiser J.F. Antimicrobial agents and antimicrobial susceptibility testing//Clinical and pathogenic microbiology. St. Lous: Mosby, 1994. - P. 145-195.

109. Karunasagar I., Rosalind G.M., Karunasagar I., Raok G. Aeromonas hydrophila septicaemia of Indian major carps in some commercial fish farms of West Godavari District, Andhra Pradesh // Curr. Sci. (India). -1989.-58, N 18.-P. 1044-1045.

110. Karunasagar I., Ali A., Otta S.K. Immunization with bacterial antigens infection with motile Aeromonads // Fish vaccinology. Kargen: Dev. Biol. Stand, 1997.-V. 90. - P. 135-141.

111. Kimura Т., Yoshimizi M., Ezura Y., Kamei Y. An antiviral agent (46NW -04A) produced by Pseudomonas sp. and activity against fish viruses // Aquacult. Anim. Health. 1990. - V. 2, N 1. - P. 12-20.

112. Kozinska A., Antychowicz J. Immunization of carp (Cyprinus carpio L.) against motile Aeromonas // Bull. Vet. Inst. Pulawy. 2000. - 44, N1. -P. 53-58.

113. Larsen J.L., Jensen N.J. An Aeromonas species implicated in ulcer-disease of the cod (Gadus morhua) // Nordisk Veterinaermedicin. 1977. - N 29. -P. 199-211.145

114. Lallier R., Mittal K.R., Lcblanc D., LaLondc G., Oliver G. Rapid methods for the differentiation of virulent and non-virulent Aeromonas hydrophila strains // Serodiagn. and vaccines. Leetown, 1981. - P. 119-123.

115. Levvin C.S., Mechanisms of resistence development in aquatic microorganisms // Chemiotherapy in aquaculture from ther to reality. -Paris: O.I.E., 1992. P. 288-301

116. Luderidz O.E., Freundenberg М.Л., Galanos G.,Lehmann V., Rietschel E., Shaw D.W. Lipopolysaccharides of grain-negative bacteria//Curr. Top. Membr. Transp., 1986.-N 17. P. 79-181.

117. Lunden Т., Meittinen S., Lonnstrom L.G., Lilius E.M., Bylund G. Effect of florfenicol on the immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Vet. Immunol, and Immunophatol. 1999. - 67, N 4. - P. 317-325.

118. Mac Millan J.R. Aquaculture and antibiotic resistance: A negligible public health risk ? // World Aquacult. 2001. - 32, N 2. - P. 49-51.

119. Mc Garey D.J., Milanesi L., Foley D.P., Reyes Jr.B., Fryel C., Lim D.V. The role of motile aeromonads in the fish disease, Ulcerative Disease Syndrome (UDS) // Experietia, 1991. 47, N 5. - P. 441 -444.

120. Mc Pherson R.M., De Paola A., Zuwno S.R., Motes J.R., Miles L., Guarino A.M. Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria from cultured catfish and aquaculture ponds // Aquaculture. 1991. - 99, N 3-4. - P. 203-211.

121. Mukhi S.K., Rami K., Madhavi B. Immunomodulatory feed additives for Asain industry // Fish farmer. 1999. - V. 22, N 6. - P. 35-37.

122. Newmann S.G. Bacterial vaccines for fish // Ann. Rev. Fish Dis. 1993. -P. 145-185.

123. Novvotny A. Molecular aspects of endotoxic reactions // Bacteriol. Rev., * 1969.-33, N 1.-P. 72-98.

124. Plumb J.A. Immunization of warm water fish against five important pathogens // Book of abst. symp. «Fish vaccination». Paris, 1984. -P. 135-227.f

125. Popoff M., Veron M. A taxonomic study of the Aeromonas hydrophila- punctata group // General Microbiology, 1976. N 94. -P. 11-22.

126. Post G. The immune response of rainbow trout (Salmo gairdneri) to ^ Aeromonas hydrophila // Inform, bull. Dept. Utah State of Fish and Game,1963.-P. 3-7. .

127. Post G. Response of rainbow trout (Salmo gairdneri) to antigens of Aeromonas hydrophila // Fish Res. Brd. Can. 1966. - V. 23, N 6. - P. 1487-1494.

128. Posyniac A., Zmudzki J., Zelazny J., Seineniuk S., Niedzielska J. Residues of oxytetracycline in tussues of the carp (Cyprinus carpio) // Vet. Pharmacol. And Ther., 1997.-20, N 1.- P. 210-211.

129. Proctor В.E., Nickerson J.T.R. An investigation on the sterility of fish tissues. // Bacterid. 1935 - V. 30. - P. 377-382.

130. Rageswari S., Rageswari B.R., Srangi N., Bandyopandhyay A.K. Etiological characterization of acute infection abdominal dropsy outbreak affecting Indian major carp Cirrinus mrigala in South Andaman // Curr. Sci. (India), 1996. -70, N 8. P. 744-747.

131. Rijkers G.T., Teunessen A.G., Van Osterom R., Van Muiswinkel W.B. The immune system of Cyprinid fish. The immunosuppressive effect of the antibiotic oxytetracycline in carp (Cyprinus carpio L.) // Aquaculture, 1980 -N 19.-P. 177-189.

132. Roberts R.J., Willoughby L.G., Chinabyt S. Mycotic aspects of epizootic ulcerative syndrome (EUS) of Asian fishes. // Fish Diseases. 1993. - V. 16, N3.-P. 168-184.

133. Roberts R.J. Motile aeromonad septicaemia // Bacterial diseases of fish (eds. Roberts R.J., Bromade N.R.). Oxford, 1994.- P. 143-156.

134. Rocca G.D., Malvisi J., Zaghini A. Tissue distribution and depletion of amoxicillin in sea-bream (Sparus aurata) after oral administration // Vet. Pharmacol, and Ther. 1997. - 20, N 1. - P. 209-210.

135. Romvary A., Feresir S., Kovaesis A.L., Szakolezai J., Zzoke I. Oxitetraciklinnel kezelt pontyok maradekanyayvizsgalata. // Magy. Allatorv. Jap. 1997. - 46, N 8. - P. 436-466.

136. Russel A.D., Chora I. Understanding antibacterial action and resistance. New York: Ellis Horwood, 1990. P. 3-6.

137. San MarthinN.B., BatagliaJ., Nunez Ch., Herrera P., Romero J.P. Pharmokenetic studies and withdrawal times of norfloxacin in coho salmon (Oncorhynchys kisutch) // Vet. Pharmacol, and. Ther., 1997. 20, N 1.1. P. 210-212.

138. Sanz F. Rainbow trout mortalities associated with a mixed infection with Citrobacter frcundii and IPN virus // Bull, of the EAFP. - Dorset: Warwick press, 1991.-V. 11, N 6. - P. 222.

139. Schaperclaus W.' Fischkranheiten. // Berlin: Akademie Verlag, 1954. -708 s.

140. Schaperclaus W., Probleme der Karpfenimmunitat gegeniiber Aeromonas punctata und Fragen der Antigenstruktur des Bacteriums // Fish Hilvviss. -1967. -N 5.-S. 129-130.

141. Schlotfeldt H.J., Neumann W., Fuhrmann H., Pfortmueller K. Boehm I I. Remarks on increasing resistance of fish pathogenic and facultative- fishpatogenic bacteria in Lower Saxony (FRG) // Fish Pathology.- 1985.- N9.-P. 85-91.

142. Schubert R.H.W. Genus Aeromonas. // Bergeus manual of determinative bacteriology. Baltimore, 1974. - P. 345-348. 157.

143. Shcn M.S. Protection of atlantic salmon against A. sobria infection. //• Microbios Lett., 1990.-43, N 171-172.-P. 171-172.

144. Shotts J. E.B., Vanderwork V.L., Campbell C.N. Occurrence of R-factors associated with Aeromonas hydrophila isolates from aquarium fish waters // Fish Res. Board Can. 1967. - V. 33. - P. 736-740.

145. Sindermann C.J. Vaccines and disease resistance // Disease Diagn. and Contr.N. Amer. mar. aquacult. Amsterdam, 1988. - P. 390-393.

146. Smith P., Ten years of progress in fish vaccines. // Fish farm. Int. 1992. -19, N7.-P. 34-36.

147. Song Y., Chen S.N., Kou G.H. Agglutinating antibodies production and protection in Anguilla japonica inoculated with Aeromonas hydrophila (A. liquefaciens) // Fish Soc. Taiwan. 1976. - N 4. - P. 25-29.

148. Spanggard В., Iluber I., Nielsen J. Proliferation and location of Vibrio anguillarum during infection of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) // Fish diseases. 2000. - V. 23. - N 6. - P. 423-427.

149. Van Muswinkel W.B., Anderson D.P., Lamers C.H.J., Egberts E., Van Loon J.J.A., Ljssel J.P. Fish immunology and fish health //Fish immunologyeds. Manning M.J., Tather M.F.). London: Academic press, 1985. -P. 1-9.

150. Vovk N.I., Soroculova I.В., Sergiychuk T.M. Use the probiotics on the base of Bacillus subtilis in fishery// Book abstr. IX Int. Conf. «Diseases fish and shellfish». Rhodes, 1999. - P. 247-248.

151. Warr T.P. The adaptive immune system of fish // Fish vaccinology. -Kargen: Dev. boil, standard, 1997. V. 90. - P. 15-23.

152. Waters G.R., Plumb J.A. Environmental stress and bacterial infection in channel catfish, Ictalurus punctatus Rafinesque // Fish Biol., 1980 V. 17, N2.- P. 177-185.

153. Wedemeyer G.A., Meyer F.P. Diseases of fish. Book 5: Environmental' stress and fish disease (eds. Sniesco S.F., Axelord H.R.). Neptune city: T.F.II. Publications, 1976. - 192 p.