Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Методы идентификации спироплазмы-возбудителя столбура томатов

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Методы идентификации спироплазмы-возбудителя столбура томатов"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫ« ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ СПИРОПЛАЗМЫ -ВОЗБУДИТЕЛЯ СТОЛ БУРА ТОМАТОВ

Специальность: 06.01.11 — Зашита растении от вредителей

и болезней

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

РАСУЛОВА МАВЛУДА

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в лаборатории вирусологии Института микробиологии ЛН УзССР и в лаборатории вирусных, микоплазменных и нематодных болезней Всесоюзного института защиты растений.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Ю. И. Власов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю, И. Шнейдер; кандидат биологических наук В. А. Колобаев.

Ведущее учреждение: Казахский институт защиты растении.

Защита состоится « Ь » и 1991 года в часоэ на засе-

дании Специализированного совета, шифр Д-020.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620, г. Ленинград—Пушкнн-8, шоссе Подбельского, 3, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЗР.

Автореферат разослан «З.дъ&и.^ии/Х- 1991 Г-

Ученый секретарь .-у» ,

Специализированного совета ВИЗР " А- Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Мтеоплаэш как возбудители болезней растений были открыты в 19С-7 г. японским; исследователями. Они обнаружили со ¿лооме больных растеши! своеобразные тела сферической и эллипсовидно!'; форм!, сходные с возбудителями некоторых болезней человека и хнвотнш'.

Б настоящее вр.еш описано около 200 заболевании растений, для которых установлена шкоплазменная природа. К числу вредоносных и широко распространенных болезней миконлагменпой этнологии относится и столбур томатов.

В Средней Азии и других регионах страны столбур. изучался многими авторами. Нередко признаки столбура бывают сходни с Еирусной или вироидной инфекцией - это прежде всего касается редукции ли- : стьев. Ввиду того, что визуальная, картина проявления столбура " иногда бывает неспецифичной, не всегда мо;шо четко определить .имеем ли мы дело с микоплазменным поражением или болезньп иной природы.

Б связи с этим разработка к совершенствование методов диагностики микоплазмозов /включая столбур/ остается актуально!! научной и практической задачей.

Цель к задачи исследованият Целью наиего псследоваш'я являлось определение природ» столбура томатов б Узбекистане г разработка для практики простых и доступных приемов, подтверздающих микопдазыенную этиологию заболевания.

. Для реа^зацпи этой цели необходимо было решить следующие .основные задачи: . "

1, Определить природу столбура томатов с вдепти&вкаш.ей патогена до ранга- семейства.

2. Усовершенствовать методы диагностики возбудителя столбура, обратив особое внимание на экспресс-методы, которые могут быть доступны для использования в производственно?! работе на етанцшп защит}) растений, а так:е в селекцгошшх уареэдениях.

Научная новизна-исследования. Впервые в ресаублике было обнаружено, что стслбур томатов вызывает сппроплазма, которая отпсскт-ся к семеГ.стьу Зр1гор1аата1асеав , к классу шшсиьев . Ь качестве экспресс-метода вкявлешш млкоплазпоза использован метод ■ окраски тканей по Дкнесу. По сравнению с другие метод Лгаеса позволяет обнаруха^ть ю-,коплазмеш:не поражения с покори обычного

светового микроскопа, не требует труднодоступных реактивов и, кроне того, пригоден для массовых анализов. Выделены и изучены микро-*-организмы на искусственных питательных средах - СшШБ-72, Ш.А,кроме того,.били использованы среда Эдварда и ЕСБС. Получены специфические. антисыворотки и апробированы различные иммунологические реакции для диагностики микоплазм. Биервие на шкоплазмах апробирован АШ-тосг в реакции с неочищенным соком пораженных растений и показала целесообразность его применения в серодиагностике фитош-коплазм при низках титрах полученных антисывороток. Били изучены морфологические ультраструктуры спиронлазм в темном' поле при увеличении 1000-1250. . '

Практическая ценность. Разработанные якспресс-методы диагностики микоплазмоза ватаы душ практического использования на станциях защатшрастшиай и в селекционных, учреждениях. Применение этих-методов способствует, в частности, более объективной оценке сорго-образцов на устойчивость к столбуру, '

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены в Институте микробиологии АН УзССР /Ташкент - 1989/.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 4 статьях. .'..,' '.''■

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена' на страницах мачшношсного текста в состоит из обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований,, выводов 1г предложений, списка искрльзованной литературы. Работа .шщю- • . стрирована ХО таблицами,¿У рисунками.

СОДЕИШйЕ.РАБОТЫ-. '. ■ ;

" Введение. Показана актуальность проблемы,, сформулированы ос- . вовние итоги работы. '

Глава" 1. СТЕПЕПЬ ИЗУЧЕННОСТИ СТОЛЕУРА ТОМАТОВ В СССР И ЗА ИГ-БЕИЗМ.

Дан обзор литературных данных советских и- зарубежных авторов по следущиы направлениям: . . ' .•. :

Микоилазмы как. патогены растений* .'.

• ■.Столбур томатов /возбудитель, диагностика; биология, меры борь-' бы/. '.. . ....

Распространенность и вредоносность с'толбура'томатов в Узбекис-. тано, проявления болезни, • .

Задачи исследований.

Глава 2. МАТЕРИАЛ П ЖТОДЫ 1ВСЛЩОВАШЯ '

Экспериментальная работа выполнена в точение 19СЗ-1989 гг. в габоратории вирусологии Института микробиологии ЛИ УзССР. 1йд ис- , :ледований, касаащихся изучения возбудителей,. проведен в лаборатории вирусных, микоплазменных и неыагодных болезней Всесоюзного оютитута заднгы растений прк аелосродственион методп-юской помо-ци проф. Ю.й.Власова и старшего-научного сотрудника Л.Н.Самсоновой.

Материал для исследований был. собран в Среднеазиатском фрлиа--ге ВИРа, в хозяйствах Ташкентской, Андижанской, Ферганской, Намап-ганской, Самаркандской областей Узбекской ССР, в Таджикской ССР 'Ленкнабадская обл./ и в Киргизской ССР /Отекая обл./. ■

. По Ташкентской облети проведены обследования в совхозах Хас-(ова, Назарбек и им.Свердлова.

. .'Для анализа использовали томаты сортов Волгоградский 5/95, По-сар очный 105, ¡Майкопский урожайный 2090, Прогресс и Октябрь. ' В качестве тест-растений при идентификации мйкоплазм пепользе-

(али Nicotiana glutinosa, N.glauca,. Capelcum annuum, Catharant-

iius roeeue . Передачу ршфекции осуществляли прививкой и повиликой Cuscuta campestria Junck Возбудителей столбура поддерживали на »астениях в условиях теплицн при периодическом пассировании на доровис индикаторные растения.

Первичную зараженность растений ыикошизшД ог.ределя/'И по ме-■оду Динеса, моди^здированноку на?.*х врысеинтельно к объему косле-;ования.

" Для изучения морфологии мйкоплазм в тканях пораженных расте-ий применяли электронную»микроскопию ультратонких срезов тканей ольных растений.

.' Выделение и культивирование микроорганизмов проводили на искусственных питательных средах СМИМВ-72, !;11А, кроме того, для ис-ледовшшй использовали среды Эдварда и ВСВС.

Основные исследования по изучению микробиологических свойств 1 озбудителей проводили е лаборатории вирусных, ьъ ко^аз.леьшх и ематодньк болезней_ВЙЗР. Особенности роста и колоний

пкоплазм на плотной питательной среде изучал: в ci ovorou :.:;;кро-коп "Еиолам". Диализ в темней поле снегового микроскопа лнреко рименяется пра первичной' идентификации спироплазм после нделе-.. 1-я на хшдкуа питательную среду.

Для получолня здт.счзороток i спо.-ъзока,11:: o4:ct.;y к::уиазаода'.

кроликов, рекомендованную в методических указаниях /1984/.

Антигенные'свойства выделенных микоплазм изучали в серологи-, ческнх реакциях татабиции роста /РИР/, двойной дтТ■'••узии в геле /РД1ГГ/ но Ухтерлони и в реакции йактериально-вирусноп аиглютивации /АГО-тест/, которую применительно к микоплазмам правильно называть АБ?.1~тест.

Глава 3-. ОПТТЩЕЛЕКИЕ ПРИРОДЫ СТОЛБУРА ТОМАТОВ II СОВЕРШЕНО Т- .

В0ВА№№ ЖТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПАТОПЗДА.

■ 3.1. Симптомы столбура на томатах.

При маршрутных обследованиях' посадок'томатов отмечено разнообразие проявления столбура на вегетативных-и репродуктивных органах. з

"Столбур" - заболевание, объединяющее в себе рлодный. сиштомо-комплекс. Штрокое разнообразие признаков проявления болезни может быть обусловлено штаммовой специфичностью возбудителей, сортовыми особенностями растений, смешанными инфекциями. Наиболее часто встречались растения с двумя формами проявления "болезни.

-В том и другом случае на заболевших'растениях отмечалась 'сильная редукция листьев, позеленение дабо антоциановая окраска цветков. ' '

Во ьсех случаях у столбурнкх растений единичные плоды образовывались лишь на нвдних побегах. Они имели желтоватую или оранжевую окраску, были.одревесневшими и ребристыми. Семена в таких плодах либо полностью отсутствовали, либо буит щуплыми, не развитыми. ' _ .... '

Следует отметить, что на томатах нередко отмечается смешанное поражение разными формами столбура. Зто может приводить, и к боль-' шому разнообразию симптомов на растениях-индикаторах, когда на V них прививается материал, собранный в поле,в условиях естественного заражения. В связи с этим индикаторный .метод использован нами не дм дифференцирования разных типов столбура, а для характеристики обще;' картины болезни, и с целью накопления и поддержания

■ мщюгоргэма-пнхекщ.и • . '. •

' 3.2. Передача тозбудутеля 'столбура томата на тастешун-рндикаторн

о

Передачу возбудителя с больных рас тонн? томатов с симптомами столбуоа на нндшаторные растения осуществлял! п посредством по-

-виликп и- npramav'симптомы болезни развивались через 2Ü-47 дно.* после заражения. Miootiana glauca оказалась датептгши носителем мгкоплазмы. . ' • ■

Таблица

См'птомн проявления мздоплпзмы' стодбуря на '

рас тон ия х~ин днкя.т о рл х

Вид растения- Способ Инкубацион- Симптомы проявления болезни индикатора передачи ннй период

' _•_/дни/_____

Catharantbus roseus

Nlootlaaa glutinosa

Nlootlana glauca.

Lyoopersioon esculentura

Capslcum annuum

Пошлина, прививка

Повилика, прививка

Повилика, пппкивка

ПпгБивка

IIoinv^Ka, чпг тп'вка

40-45 25-40

35-40 40-45

40-45

35-40

45-47 35-40

Карликовость, сильная кустистость, укорочение междоузлий. Измельчение V хлороз листьев, пролиферация цветков.

Задержка роста, сильвин хлороз листьев, уменьшение размера листовкх пластинок, позеленение цветков.

Ветвление нормгшюе, цветки без иямедоний, свчптомы отсутствуют /латентная ин-рек-Д"я/.

.Задержка тгастя, уто^ .епве и редукция л»сторол пластинки, хлороз и антоциановая окраска, редукция цветков.

Задержка воста, укорочение макдоузлиЧ, редукция и хлороз

листьев, позеленение цветков,

плодоношение отсутствует.

Развитее четких, типичных дле .,ятомю«>!ши*м ciWforor на рчс-тенгях-тадцкаторзх, и пре-'де всего т: барашке / C.roseus / свицй-телъствтзало о »ткопллзмрпчо4 ю'-одч усслодусого заС-о/орэго я. Для постоянного подле гтнгя т^чотзги столбупа на rnjrKiTopax, взятия проб для анализов щг обычно гсполъзовали . catharanthus

roseas И. Nleatlana glauca.

.' 3.3. Метод экспресс-диагностики микодлазма-инфе'кцки путем окраапвания тканей по Дкнесу.

Чрезвычайно простым и доступным методом, характеризующим патологическое состояние тканей под воздействием микоплазм, является окрашивание флоэмы красителемДинеса и анализ срезов в световом микроскопе. Ранее этот метод применялся в ветершарноп микоплазмо-лопщ. В отношении столбура томатов исследования проведены наш впервые. При этом особо важно подчеркнуть специфичность метода по отношению к шкоплазмам, так как .другие использовшшые в нашей работе микроорганизмы не дают характерного окрашивания флоэмы. " ' ,

В качестве контроля были взяты растения, зараженные: вирусом, /мозаика Томатов/,, бактериями /увядание томата/, грибами /макро-, спориоз томата/. 'Анализ этих растений показал отрицательные результаты. Исследование томатов, пораженный- столбуром, позволило вдавить наличие характерного' бкрашивания клеток флоэмы, заполненных микоплагмой. Использование метода позволяет вдавить патогена и в . тех случаях, когда внешние признаки болезни нв проявляются /например, на Nlootiana glauca , „являющемся латентным носителем мико-т плдз^ столбура/. При больших увеличениях микроскопа окрашенные в синий цвет ткани отчетливо видны и представляют группы флоэмных клеток, заполненных миноплазмой. Наилучшие результаты получены при окрашивании тканей красителем Динеса в концентрации 0,05 ^ Отметим, что этот метод' позволяет выявиуь микоплаэма-инфекцию независимо от вида пораженного растения /таблица 2/.

* 3.4. Электронномикроскопическое изучение ультратонкйх

срезов тканей пораженного столбуром томата.

Важнш "доказательством микоплазменной этиологии' столбура яви-, лось изучение морфологии микоплазм на ультратонких срезах больных растений.

При исследовании в электронном микроскопе выявлены клетки микоплазм, окруженный трехслойной дитодлазматическоГ; мембраной,' толщина которой варьировала от 7,5 до 10 нм. Элементарная мембрана ■ имела два электронно-плотных слоя толщиной 3 ям ка-ццнй, между ко' торнглк располагался электронно-прозрачный слой толщиной 4 нм. Размеры теле?» колебались от 60-100 нм до 600-800 нм. Основная масса ■• клеток гнела размеры 600-800 нм в диаметре..

Таблица 2

Результаты, анализа разных видов растений на выявление микоплазмы методом Динеса!

Растение ' Заболевание Окрашивание ¿Глоэмн Возбудите.яь

/по Динесу/

1. Томат столбур + миколлазма .

2. Барвинок желтуха + мткоп.тазма

3. Перец столбур + мвкоплазма

4. Вьюнок желтуха + микоп.газма

5. N.glauca. латентная инфекция столбура + миколлазма

В. Томат здоровый - .

7. Перец здоровый - -

3. Барвинок здоровый - -

э. Томат мозаика - ЕГМ

3. Томат увядание ■ - бактерии

L. Томат пятнистость — грибная инфекция

г. Перец мозаика - ВТМ

+ срецифическое окрашивание тканей флоомы - отсутствие специфического окрашивания •

У зрелых.^клеток отмечено усиление плеоморфизма. Иногда наблто-цалоеь тяжи разной длины у формт. Внутри зрелых крупных клеток просматривалось образование корпускулярных /дочерних/ структур.

• Микроорганизмы были заполнены рибосомоподобными гранулам, зредт'. которых нередко можно было наблюдать фибриллярные структуры, аналогичные ДНК подобным нитям. В некоторых округлых телах фибриллы находились в, электронно-прозрачном центре, рибоеомоподобные ) -■ гранулы располагались на периферии, образуя электронно-плотное ¡солцо.

Таким образом, по морфологическим особенностям исследуо'шй возбудитель принадлежит к классу иоШоигев.

3.5. Выделение мпкоплазм на искусственную питательную . . сведу.

Для изучения микробиологических свойств проведено выделение

патогена на искусственные среди.

В uEOí-x яксперинеитах ми применяли различные среды. Среда СШ.Ш-72 алрсбиротона в связи с успешным культивирование-!i на ней ахолепжкчл из растений различных видов, среда MIA ранее была.ис-иользоьана французским микоплазмолсгом доктором Ддианнотти для вы-делечпг и культивирования растительных спироплазм. Среди Эдварда и ЕСВС* нашли широкое применение при изучении микоплазм животных^ Первичное выделение ликоплазм проводилось на среды СМШВ-72 и Ш.А. При этом на среде MIA отмечено успешное выделение как спироплазм, так и ахолеплазм. Среда СШ;®-72 более эффективна при выделении ахолеплазм. В отличие от среды СММЗ-72, среда MIA содержит большое количество углеводов, которые вероятно необходим для первичной изоляции спироплазм. Внесение в питательную среду углеводов и амтаокг.ссют позволяет стабильно поддерживать необходимое для роста мнкоплазм осмотическое давление'. Среды Эдварда ц ВСЕС оказались эффективны только для накопления биомасса фитомикоплазм.

При использовании среди Í.HA из растений с различными типами, столбу]!" были выделены спиралевидные -микроорганизмы.

Оптиммдьипя температура роста возбудителя столбура составляла.' 32-34°С, рН 7,2-7,4, .После, получения первичной культуры проведено ' клг-дгрораш'е выделенных микроорганизмов,

На основании- дачных, полученных в результате нескольких последователен»?: субкультт'-рований на средах без пенициллина /ингибитора бактедаишлого роста/', было показано отличие выделенного.возбудителя: от I -форм бактерий, что ..свидетельствовало о принадлежности его к микоплязшм. .

З.С. Культурально-мог)':'ологические свойства микоплаам. '.

Гост мпкоплаим к нндкой среде характеризовался легкой опали-, ценпцей,, вызванной однородной взвесью клеток, при атом наблюдалось изменение окраски среды от малиновой до желтой, что вызвано измй-кенгем рН спады из млечной в кислую. В полугсидкой среде рост ми-коплазнн сопровождался ойлаковкдннм образованием в толще агара, что сш-детедьсУБОвапо о. принадлежности выделенного микроорганизма к ^акультатш-н'-'м анаэробам. На таердой питательной среде рост патогена ксрактепизовалсп образованием типичных для шкоплазм коло-пни типа "яични¡иi-глазуаы!" с-темным уплотнением, врастапцим в

* С pfi.ua ВСЮ разработана Jií'iSP совместно с Ветеринарным институтом гткиог.одгтра. ' •

.«trap, центром и нежной периферической зоной, расположенной на по-, рерхности агара. Размеры колонии варьировали в зависимости от продолжительности культивирования.интенсивности роста, густоты посева, толщины агарового слоя. В среднем диаметр колоний составлял 40-70 мим.

Таким образом, по культуральио-морфологическим свойствам возбудитель ,■выделенный при заболевании растений столбуром, являлся типичным представителем класса Uoiiioutes.

3.7. Изучение морфологических особенности^ вндвлелптя

на искусственную пгтательную среду микроорганизмов.-

В раннюю и среднюю логарифмическую $азу роста бульонную культуру киколлазм анализировали в световом микроскопе методом темного поля и в электронном микроскопе с помощью "-transfer " метода.

3.7.1. Анализ в темном поле светового микроскопа

Микроскопирование в темном поле является элективным и бист-. рым методом изучения морфологических свойств микоплазм, .выращиваемых-на жидкой питательней среде.

Для. проведения анализа использовали 1 мл двухдневной бульонной культуры, которую наносили на чистое,.предметное стекло. Сверху кяпло накрывал! покровным стеклом. На поверхность порченного таким образом препарата, та.оке как и на конденсор светового микроскопа, наносили иммерсионное масло. При анализе в темном иоле наблюдали типичные полиморфные клетки спироштазму которые иаходи-г лись в броуновском движении. Клетки имели форму нитевидных спиралевидных структур, .что свидетельствовало об их принадлежности к семейству . Spiroylaemataoeae,

■ 3.7.2. Анализ клеток микоплазм в электронном микроскопе с помощью " transfer " метода.

Для-анализа была использована двухдневная бульонная культура микоплазм. Клетки, микоплазм фиксировали в 12,5% глютаральдегиде| и затем-помещали на чашки Петри с плотной питательно,"; средоЛ. После подсыхания на поверхность культуры наносил! парладион Образующуюся после итого пленку с возбудителем помещали на сеточку и •просматривали в электронный микроойоп. С помощью этого метода выявлены спиралевидный формы микоплазм. Нити спира видной. jopxui имели диаметр 100-170 нм. и,длину 30.00-10000 им."

Таким образЬм, выявленные с помощью электронного микроскопа спиралевидные формы еще раз подтвердили принадлежность выделенного возбудителя к семейству Spiroplaeeataceae.

3,8. Серологическая идентификация мккоплазмы -возбудителя столбущ томата /в реакции ингибиции роста/

. Таксономическое исследование выделенных микроорганизмов было продолжено путем^изучения их антигенных свойств. Д/Ш анализа использована реакция ингибиции роста.

Эта реакция является наиболее специфической. 0на основана на способности антиснвороток подавлять рост гомологичных и родственных микроррганизмов. При наложении бумажна дисков, пропитанных гомологичной и гетерологичной сыворотками, на плотную питательную срвДУ» заселенную микоплазмой, наблюдали'задержку роста возбудители. Реакция была поставлена с сывороткой к референтному штамму Splroplaeaa citri щт. с 189 И Acheleplasna laldlewi« rar. lno-cuu« - сапрофитная ахолеплазма.

. Таблица 3

Реакция ингибиции роста.возбудителя столбура с иммуноспецифическими сыворотками к референтным штаммам микоплазм.

Антиснворотка - • Штаммы микоплазм

Столбур томата Aoh.laldlavie Sp.citri о 189

Aeb.lelilewie + -

var,lnocuua

Sp.oltri о 189 + +

Условные обозначения: /-/ отсутствие задержки "роста микоплазм" /+/'наличие задержки роста микоплазм.

Как показали) результаты анализа, исследуемая мккоплазма имела идентичные антигенные компоненты со штаммом 8р1гор1авша о&г1 шг. с 189. Таким образом, на основании данных серологического анализа еце раз била'подтверждена принадлежность иссле,дуемого возбудителя, к классу Ыо111си1еа , се. геГ: ству Эр1 гор1авта1аое ае. .

3.9. Серологическая идентификация микоплазмы -возбудителя столбура томатов в соке больных растений.

С целью идентификации микоплазмы непосредственно в соке больных растений была получена специфическая антисыворотка. Для получения скворотки проведена пшунизация кроликов согласно методическим указаниям'/1984/. В качестве антигена использовали чистую культуру возбудителя, выращенную на жидкой питательной среде. Накопление антигенной биомассы осуществляли на среде ВСБС, которая позволила значительно увеличить выход биомассы с одного литра среды. Титр полученной сыворотки определяли в реакции двойной ди^уэии в геле, при этом в качестве антигена использовали сок растений, пораненных столбуром. Для повышения достоверности результатов анализа необходимо было разрушить мембраны микоплазм, характеризующиеся наибольшей, активностью. С этой целью сок растений подвергали ультразвуковой дезингтеграции, а также обработке додецилсульфатом натрия /СНд /СН^^ОЯЭдЫ а/ с последующим нагреванием.

Таблица 4

Определение титра сыворотки с помощью реакции двойной ди'21У'зин в геле

Концентрация _Разведение сыворотки

додещрсулз^ата натрия. без разведения 1:2 1!4 1:8 .

3% /с нагреванием/ + + + -

.5 % /с нагревание^/' + +' • + -

3'% /без нагревания/ ■ + • -

5 % /без'нагревания/ + + -

Нами установлено, что использование метода дезинтеграции микроорганизмов посредством додецилсульфата натрия с последуюдам нагреванием незначительно повышает чувствительность реакции /табл.4/.

С целы*)' повышения чувствительности серологического метода был использован тест, который получил название пгглятийащш бактери-ально-шкоплазменная /АБМ-тест/. Метод успешно применяется п вирусологии и известен как АЕВ-тест. Он основан на коасрлютинашш возбудителя и клеток золотистого ста^илдаокка, сенсибилизированных ■ гомологичной возбудителю снворотко!!, Нами эта реакция впервне при-

менена для диагностики микоплазма-инЛекщш г соке больных растении. Большую методическую помопь в этой работе нам оказал доктор биологических наук А.Х.Вахабов. Использование АШ-теста мо*.ет быть отнесено к экспресс-диагностике патогена.

В результате проведенных исследований установлено, что полученная нами сыворотка при поставке этой реакции работала 1:32 /таблица 5/, в то время как в реакции двойной ди£;уэии в геле 1:4. Таким образом, !БМ-тест может найти практическое применение при диагностике возбудителя столбура в соке 'растений.

Таблица 5

Выявление микоплазма-инйекции с помощью АБ.Ч-теста

__:_I_:_._

Разведение антисыворотки Резульиатн реакции

1:2 +

■ 1:4 . +

J • 1:8 +

1:16 ' +

1:32 +

1:64 -

Примечание: /+/ положительная реакция • • /-/ отрицательная реакция ...

К обоснованна мер бопьбы со-столбупом томата

. Хотя в диссертации прямо не ставились задачи разработки мер боръбн со столбуром, тем-не менее из проведенных исследований вытекают некоторые практические выводы.

Усовершенствованные нами методы диагностики микоплазмы столбура могут быть использованы при оценке коллекционного и селекционного материала на устойчивость к Заболеванию. В настоящее время В1"ЗР начал проводить оценку томатов на полевую устойчивость к стол-буру совместно с Крымской оттю-селегаднонноч станцией ВИР /Власов, Саксоноиа, Беседгаа и др., 1991/. Несомненно, учитывая большую вредоносность столбура томатов, исследования в указанное на-праатецетг будут расагряться в разннх регионах странм. йязра-боткп облегчают драгтсгяку микоплазм в растениях, позволяя установить прнпод7 болезни не только по прянн», но.и по кос«епчкч показателем.

Чрезг>"-г',.!'но ппосп"' и дос~улшя/ г/стодоы,* хаоакт»;тгартгщ'н пат о—

логическое состояние растений, является метод с использование,'! .красителя Динеса. При этом особо важно подчеркнуть его спецг^ич- 1 ность по отношению к микоплязмам, т.к. другие микроорганизм», кроме миколлаэм, не дают синего окрашивания во флоэме. Известно, что симптомы поражения томатов столбуром многообразны и могут бить в чем-то сходны с другими заболеваниями, например, с аспермией томатов. Б подобных сомнительных случаях селекционер может легко определить залаженнооть того или иного образца именнолжкоплнзмеиио», а пс другой инфекцией, используя метод Дгшеса.

Важным практическим результатом является применение в уитош-коплазмологки АБМ-теста. При этом АБМ-тест выявляет наличие мнко-плаэма-интекции при использованш!! неочищенного сока зараженных растений, что существенно упрощает применение метода в практике. ■Параллельно с наш АШ-тест использовала в Армении А.В.Погосян /1988/, однако в ее работе антигенами служили осажденные центрифугированием. клетки бульонных культур мпкоплазм, но не сок больных . ряптенр1'*. АБМ-тест может быть использован и при характеристике круга растений-хозяев микоплазмн столбура, включая обнаружение растеннУ-резерваторов, выявление которых имеет непосредственное практическое значение.-

В Ы В О, Д Ы

1. Идентифицирован возбудитель, вызывающий столбур томатов в Средней Азии, доказана его принадлежность к шкоплазмам /класс

• Uollloutes /,

2. Проведена идентификация патогена до ранга семейства. В результате использования комплекса методов /микробиологически", а!нектронномикроск.опический, метод "темного поля",.серологический/ показано) что патоген, является, сиироплазмой и отнооитоя к классу Uollicuteft , семейству Splroplasmataoeae.

3. Испытано 4 вида питательных сред для первичного выделения

р накопления биомассы спироплазм. Наиболее э:МективЯой для первичного выделения спироплаэмы столбура оказалась среда MIA, а для пакогокмтая.'биомассы - среда ВСВС.

• 4. Получена спетр-Тзическая антиенворотка к возбудителю столбура. Впервые для диагностики мпжоплязмн столбура в соке больных растений адробирована серологическая:реакция 'агглютинации бакте-риально-микоплазмешюй '/АБ^теот/.

5. В целях ускоренного определения зараженности томатов мнко-

плазменной инфекцией впервые использован применительно к культуре■ томатов метод окрашивания тканей по Динесу. У заракепных стодбу-рсл растений.наблюдается характерное синее окрашивание клеток флоэмы. Установлены оптимальные параметры применения метода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основе проведенных нами разработок рекомендуется для ■ диагностика столбура использовать па.станциях защиты растений и в селекционных учреждениях метод окрашивания клеток флоэмц топатов /по Динесу/.

2. При разработке методов иммунодиагностики микоплазм следует обратить внимание на серологическую реакцию АБМ-тест /агглютинации бактериально-микоплазмепвой/, позволяющую определить зараженность иикоплазмой при использовании сока больных растений.

3. Для первичного выделения спироплазмы столбура на искусственную питательную среду предлагается среда MIA, а для накопления био-иассы - среда ВСВС. Наш опыт, относящийся к апробации питательных сред, рекомендуется использовать не только в отношении столбура,

но и при работе с другими объектами, относящимися к сем. ípirepiae-

aatacaas.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1." Абидова У., Расулова Ы., Каримов Т.Н.-, Исамухаыёдов U.3. Идентификация. микодлазменных организмов методом растений-индикаторов на столбур томата // Тез.докл. научно-теор.конф. молодых ученых и специалистов АН УзССР "Актуальные проблемы общественных, естественных и технических наук" биологические; хзшико-

. техниче.сйте науки. Изд-во ФАН, Ташкент, 1984. 14 с.

2. Расулова 1Í. Исследование иикоплазменных организмов со столбур-

' ного т.оиата методой электронной микроскопии // Доклады Академии наук УзССР, 1987. - !.'? 10. - С.' 51-53. • >

3. Алиид:;анова 1,1., Расулова !.!., Исамухамедов М;8. Ускоренная диагностика, иикоплазиенн'ых болезней растений // В сб. "Бактерии, водоросли, грибы". Ташкент1987. -. Изд-во'ФАН. - С. 147-150.

4. Ka¿7:;::oB Т.!.!., Разулова. П. Выделение возбудителя столбура» томата микробиологические методом // В сб. "Биологические и химические' методы борьбы В' т;тег/>иро'вашюЛ защите растений от вредителей • и болезней". Тапкеат, 1989. - С. '62-64. ■