Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методологические аспекты исследования микробиоты памятников истории и культуры

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Методологические аспекты исследования микробиоты памятников истории и культуры"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правахрукописи

ПЕТУШКОВА Юлия Алексеевна

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБИОТЫ ПАМЯТНИКОВ ИСТОРИИ И КУЛЬТУРЫ

03.00.16.-Экология 03.00.07. - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор М.В. Гусев Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор В.М. Горленко Кандидат биологических наук, В.П. Голиков

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина

Защита диссертации состоится 02 июня 2005 г. в 1530 часов на заседании специализированного совета Д.501.001.55 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, г. Москва, Ленинские горы, Биологический факультет, ауд. 389 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

Отзыв в двух экземплярах просим направлять по адресу:

119899, Москва, Биологический факультет МГУ, специализированный Ученый совет Д.501.001.55

Автореферат разослан «28» апреля 2005 г.

МГУ.

Ученый секретарь специализированного Совета, к.б.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микробиологические исследования объектов культурного наследия ведутся активно в последние десятилетия как в России, так и за рубежом. Это связано, в первую очередь, с процессами биоповреждения памятников истории и культуры, вызванными геохимической деятельностью микроорганизмов и их ферментативной активностью в каменной кладке и настенных росписях в исторических зданиях, музеях, церквях и монастырях, на поверхности мрамора скульптур, бумаги, пергамента и кожаных переплетов книг.

Задача таких исследований - микробиологическая диагностика памятников с целью последующей разработки программы по их сохранению. Для этого необходимо не только выделить, идентифицировать все компоненты микробного сообщества, включая бактерии, микроскопические грибы, микроводоросли, и определить их количественный состав, но также оценить их физиологическую активность, которая косвенно характеризует степень разрушающего влияния. При этом наиболее полные выводы можно сделать только при условии проведения большого количества измерений. В таком случае при отборе значительного количества проб материалов объекта возможно нанесение дополнительного ущерба памятнику. Следовательно, при проведении биомониторинга, прежде всего требуется применение неразрушающих методов исследования. Кроме того, в ходе диагностического исследования необходима оптимизация выбора места взятия проб, а также использование микробиологических методов, не требующих для анализа большого количества материала.

Следует отметить также, что в современных исследованиях микробиоты памятников архитектуры недостаточное внимание уделяется изучению геохимического состава материалов, что необходимо для адекватной оценки результатов микробиологических исследований и возможности их сравнения при изучении памятников, находящихся в разных макро- и микроэкологических условиях. В таких работах принимаются во внимание в основном климатические факторы, а также температура и относительная влажность воздуха в интерьерах исторических зданий [Camuffo, 2003], при этом геохимические исследования памятников архитектуры геологами проводятся, главным образом, без микробиологического анализа. Для грамотной постановки модельных экспериментов также необходимо учитывать влияние факторов окружающей среды, которые вследствие конструктивных особенностей и географического положения исследуемых объектов могут быть разными.

В настоящее время микробиологические исследования памятников зачастую ограничиваются изучением только отдельных физиологических групп микроорганизмов: микромицетов [Кураков и др., 2004], актиномицетов [Зенова, 1998], микроводорослей [Wee, 1991]. Проводилось также изучение микробного комплекса в целом, его количественный и качественный анализ, но только в произвольно отобранных пробах и с применением ограниченного числа методов, которые не относятся к категории «неразрушающих» [Сомова, 1999]. В результате в первом случае биодиагностика памятника является неполной, а во втором случае получают результат исследования не памятника в целом, а его отдельных произвольно выбранных участков.

Тем не менее, для точного выявления причин биоповреждения памятников необходимо вести микробиологический мониторинг, который требует анализа большого количества проб. С проблемой быстрой идентификации значительного биоразнообразия сталкиваются почвенные микробиологи [Добровольская, 1989]. Решением этой проблемы в исследовании памятников архитектуры за рубежом служит зарекомендовавшие себя в последние годы молекулярно-биологические методы идентификации, в частности, секвенирование ДНК [Gonsales et.al., 1999, Rolleke et. al., 2003]. Данный метод позволяет отобрать большое количество микропроб со всей поверхности изучаемого объекта, быстро идентифицировать бактерии и микромицеты, обнаружить некультивируемые микроорганизмы, однако он не дает точной количественной оценки микробной контаминации. Однако, в молекулярно-биологических лабораториях не проводились работы по изучению физиологических особенностей идентифицированных штаммов микроорганизмов в зависимости от материала памятника, факторов окружающей среды, влияющих на архитектурные сооружения, а также условий хранения музейных ценностей, в частности, температурно-влажностного режима.

Большинство работ связано с изучением наружных стен, однако внутренние стены памятников архитектуры и музеев также подвержены процессам микробного воздействия. В этой связи важной характеристикой служит показатель количества микроорганизмов в воздухе помещений. До сих пор работы по количественным аэромикробиологическим исследованиям в музеях проводились в основном с применением седиментационного метода, то есть без проведения точного количественного анализа [Petushkova, Kandyba, 1986].

Крупнейшие зарубежные лаборатории, занимающиеся микробиологическими исследованиями исторических памятников, в качестве основных объектов исследования рассматривают памятники архитектуры [Bock, Sand, 1993; Urzi, 2002; Krumbein; 2003, Saiz-Jimenez, 2003], реже - книги [Gallo, Valenti, 1999]. При этом особенности микробиоты музейного археологического текстиля остаются практически не изученными.

Цель и задачи. Учитывая многофакторность исследований, необходимых для микробиологической диагностики памятников истории и культуры, целью данной работы явилась разработка комплексного методологического подхода к исследованию микробиоты памятников культуры. Для этого в работе были поставлены следующие задачи:

1. Анализ и разработка методов микробиологического исследования памятников, не требующих отбора большого количества материала, а также оптимизация методов отбора проб.

2. Сравнительный анализ и выбор методов для определения влияния факторов окружающей среды (элементный состав и влагосодержание материала, воздействие температурных перепадов) на физиологическую активность микроорганизмов в пробах памятников и, как следствие, на их разрушающую способность.

3. Сравнительное аэромикробиологическое исследование музейных помещений.

4. Постановка модельных экспериментов по изучению обрастания известняка альгобактериальными сообществами в зависимости от условий влажности, температуры и содержания солей тяжелых металлов.

5. Разработка схемы комплексного методологического подхода к изучению микробиоты памятников архитектуры.

Научная новизна. На основе разработанной схемы комплексного методологического подхода проведена биодиагностика памятников архитектуры и предметов археологической кожи и текстиля.

Впервые была проведено комплексное микробиологическое исследование археологического текстиля из погребений исторического некрополя Вознесенского собора музея Московского Кремля. Результаты секвенирования ДНК, кодирующей 16S рРНК, показали, что на коже и текстиле обнаружены бактерии Paenibacillus validus, Rhodococcus opacus, Bacillus luciferensis, Kitasatosporaputterlickiae, Micrococcus luteus.

Впервые с применением импакционного метода для определения экологического состояния музейных помещений проведено сравнительное аэромикробиологическое исследование экспозиционных залов и фондохранилищ, характеризующихся разными условиями микроклимата.

Впервые проведены комплексные микробиологические и геохимические исследования памятников архитектуры и прикладного искусства. Изучение элементного состава проб и микробиоты позволило выявить устойчивые к тяжелым металлам микроорганизмы, оценить их функциональную активность непосредственно на памятнике. Впервые применены на памятниках методы изучения фотосинтетической активности (ФА), анализ элементного состава рентгено-флуоресцентным методом с параллельным применением оптической микроскопии. Это дало возможность определять степень физиологической активности локальных участков биопленок на поверхности объектов.

Впервые для определения плошади биопоражения стен памятников, а также известняка в модельных экспериментах применена компьютерная обработка цифровых изображений, что позволяет вести изучение динамики обрастания камня альгоцианобактериальными биопленками и образования на нем патины вследствие жизнедеятельности микромицетов.

Научно-практическая значимость. Разработан и защищен патентом способ обнаружения микроорганизмов в каменной кладке, позволяющий определить очаги микробной контаминации по распределению влагосодержания в глубине этой кладки.

Разработанная схема комплексного методологического подхода дает возможность проводить микробиологический контроль в процессе реставрации и антимикробной обработки памятников, не нанося при этом ущерба материалу в виде многократного отбора большого количества проб.

В ходе работы были проведены микробиологические исследования памятников архитектуры музея-усадьбы «Архангельское», Ростовского и Рязанского Кремлей, Государственного музея изобразительных искусств им. А.С. Пушкина, Государственного Исторического музея, Новодевичьего монастыря, археологических предметов из текстиля и кожи музеев Московского Кремля и Государственного Исторического Музея, а также книг из библиотеки кн. Юсуповых музея-усадьбы «Архангельское». Полученные результаты послужили основой для осуществления последующих антимикробных обработок перечисленных памятников культуры. Основные положения и результаты работы по биодиагностике памятников архитектуры были включены в сборник методической документации в строительстве «Правила обследования зданий, сооружений и комплексов богослужебного и вспомогательного назначения».

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: 1 Межд. симпозиуме «Биокосные взаимодействия: «Жизнь и камень» (Санкт-Петербург, 2002), 7th Intern. Symposium of World Heritage Cities (Родес, Греция, 2003), Межд. научно-практич. симпозиуме «Природные условия строительства и сохранения храмов православной Руси» (Сергиев Посад, 2003), II Межд. симпозиуме «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень» (Санкт-Петербург, 2004), Забелинских научньк чтениях Государственного Исторического музея (Москва, 2004), на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ (2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, включая 1 патент, 1 - принята в печать.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 195 страницах текста и включает 39 рисунков и 23 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсужденя, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 249 источников, из которых 182 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор проб штукатурки, каменной и кирпичной кладки, текстиля, кожи, бумаги для микробиологического исследования проводили методами: 1. соскоба поврежденного материала в стерильные чашки Петри, 2. прямого посева соскоба поверхностного налета в чашки Петри с питательными средами для выделения хемоорганотрофных микроорганизмов, 3. с использованием ватных стерильных тампонов.

Подготовку проб для количественного микробиологического анализа осуществляли следующим образом. Размельченные пробы камня, текстиля, кожи массой 0,1-1,0 г суспендировали в воде, содержащей 0,001% твин-60. Флаконы с пробами встряхивали в течение 20 минут при комнатной температуре.

Для выделения и культивирования хемоорганотрофных микроорганизмов использовали среды ПДГ, Чапека и Тиллера [Lyalikova, Petushkova, 1991], для галотолерантных - модифицированные среды ПДГ с добавлением 10% NaCI или 7% CaSO4. Для выделения хемолитотрофных бактерий использовали среды: Сориана и Вокера - для нитритобразующих (нитрификаторов I фазы) [Soriano, Walker, 1968], Ватсона - для нитратобразующих (нитрификаторы II фазы), Бейеринка - для тионовых бактерий. [Vishiniac, Santer, 1957]. Для получения накопительной культуры микроводорослей использовали среду Костенхольца [Castenholz, Pierson, 1981].

Количественный учет хемоорганотрофных микроорганизмов проводили чашечным методом Коха путем подсчета выросших на них колоний. Количество хемолитотрофных бактерий определяли методом десятикратных разведений. О наличии тионовых бактерий в пробах судили по образованию в среде Бейеринка, содержащей тиосульфат Na2(S203), ионов сульфата SO42- которые определяли методом осаждения сульфата бария (BaSO4) при добавлении к культуральной жидкости HCI и BaCI2. О наличии в пробах нитритобразующих образующих NO2- бактерий судили с помощью реактива Грисса по малиновой окраске ионов нитрита. Присутствие в пробах нитратобразующих бактерий определяли по использованию ими нитрита также по реакции с реактивом Грисса. Нитраты определяли путем реакции их восстановления до нитритов при добавлении металлического цинка.

Сканирующая электронная микроскопия. Образцы проб камня и текстиля (0,1 мг) высушивали на установке НСР-2, затем напыляли золотом с палладием на установке IB-3 и изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-35.

Люминесцентная МИКРОСКОПИЯ, Препараты накопительных культур альгобактериальных сообществ готовили методом осаждения окрашенного образца на мембранные фильтры поликарбонатного состава, Диаметр пор - 0,23 мкм, В качестве красителя использовали 0,3% акридин оранжевый [Семенов, Шаталов, 2002], Использовали микроскоп Л ЮМАМ И-2, Возбуждение люминисценции вызывали с помощью синих лучей, Использовали светофильтры ФС1 -2, ФС1 -4,

Идентификацию микроводорослей, микромицетов и хемоорганотрофных бактери й, предварительно выделенных в чистые культуры, проводили на основе морфологических признаков с помощью световой микроскопии, Использовали определители зеленых водорослей (Андреева, 1998), цианобактерий [Голлербах и др,, 1953], микромицетов [Билай, 1980], бактерий [Определитель Берджи, 1997], Дифференциацию бактерий по Граму проводили с использованием 3% раствора КОН,

Определение фотосинтетической активности микроводорослей осуществляли методом импульсной амплитудной модуляции [Schreiber et al,, 1988] на приборе РАМ-2000 производства WALZ, EFFELRICH (Германия) контактным неразрушающим способом, Относительную переменную флуоресценцию хлорофилла микроводорослей определяли по формуле (Fm-F0)/Fm, где Fm -максимальная, a F0 - минимальная флуоресценция, Этот показатель отражает эффективность фотохимического преобразования энергии в реакционных центрах ФС II и коррелирует со скоростями фотосинтеза, измеренными по выделению кислорода и поглощению двуокиси углерода, и тем самым служит индикатором фотосинтетической активности [Klughammer, 1992], Расчеты переменной флуоресценции проводились с помощью программы DA-2000 (WALZ),

Абсолютную (весовую) влажность проб камня и текстиля определяли высушиванием до постоянной массы при температуре 105-107°С весовым методом (ГОСТ 5180-84),

Определение влагосодержания строительных конструкций in situ осуществляли контактным неразрушающим методом с помощью электронного влагомера G 810 фирмы Denzel (Германия) для определения концентрации воды в штукатурке, каменной и кирпичной кладке на глубине 1 см и 4 см, и влагомера ИВ 1-7 (Россия) для определения влагосодержания деревянных конструкций,

Температуру и относительную влажность воздуха (ОВВ) измеряли прибором ИВТМ-7 (Россия), Физические характеристики протонов внутриклеточной воды в выделенных альгобактериальных комплексах определяли методом ЯМР-спиновое эхо [Фаррар, Беккер, 1973], Рабочая частота установки 17 МГц, Время спин-спиновой релаксации протонов (Т2) определяли из кривых спада спинового эха, Характерные кривые спада сигнала спинового эха от протонов высушенных образцов имеют сложный, многокомпонентный характер, При разложении их на составляющие получали две компоненты, подчиняющихся экспоненциальному закону и характеризующихся своими скоростями слада [Аксенов и др,, 1971 ],

Содержание тяжелых металлов в пробах камня и текстиля определяли методом атомной абсорбции на спектрофотометре «Hitachi-180-80» (Япония), Для анализа образцов также использовали рентгеновский оптический микроскоп с локальным анализатором химического состава (модель X-OPTI-01), разработанный при совместном участии Физического института им, П,Н, Лебедева РАН и Института рентгеновской оптики [Турьянский и др,, 1999], Для исследования внутренней структуры образцов камня использовали метод проекционной рентгеновской микроскопии, В выделенной зоне интереса (путем микроскопирования образца) с помощью сфокусированного рентгеновского пучка (о 150-200 мкм) проводили локальный анализ химического состава образца, Для качественного и полуколичественного флюоресцентного анализа химического состава образцов использовали трубку с молибденовыми анодами,

Исследования микрофлоры воздуха проводили с помощью высокочувствительного электрического пробоотборного устройства ПУ-1Б (Россия), обеспечивающего отбор проб аэрозолей на плотную питательную среду импакционным осаждением, Анализ пробы осуществляется путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на поверхности агара, соответствующих числу частиц, содержащих живые микроорганизмы (микробное число) в отобранном объеме воздуха,

Концентрация микроорганизмов в исследуемом воздухе определялась по формуле: С = 1000 (P/Q), где С - концентрация частиц в м3 воздуха; Р - вероятное число частиц в пробе, которое коррелирует с количеством колоний на плотной среде; Q - объем пробы, л.

Статистические исследования проводились с использованием статистического пакета STATISTICA for WINDOWS 5.5. Интерпретацию осуществляли с помощью материалов Ю.Н.Тюрина и А.А.Макарова [Тюрин, Макаров, 1997] и сайта http://www.statsoft.ru/home/portal/default.asp.

Обработку компьютерных цифровых изображений осуществляли с использованием программы FRACDIM-10, разработанной на кафедре физической географии и ландшафтоведения Географического факультета МГУ.

Экспресс-метод обнаружения микроорганизмов в пробах археологического текстиля с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). которую проводили в приборе для амплификации производства «НПО Биопор». Выделение ДНК осуществляли в стерильных условиях, используя набор «ДНК-сорб-А». Денатурацию ДНК проводили при 95'С в течение 30 сек. Отжиг праймеров для определения микоплазм и вируса герпеса - при 65'С в течение 2 мин, хламидий - при 61°С в течение 1 мин 30 сек, дрожжей рода Candida spp. - при 67*С в течение 2 мин. Продукты амплификации участков ДНК анализировали в 1,2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Секвенирование ДНК выделенных штаммов бактерий было проведено на базе факультета химической и биологической инженерии национального технологического колледжа Ареаки, Япония. Работа включала следующе этапы: экстракция ДНК, амплификация участка экстрагированной ДНК с помощью ПЦР, очистка амплифицированной ДНК, повторная ПЦР с использованием флуоресцирующих красителей, автоматическое секвенирование [Suhara, 2002]. Концентрации реагентов подбирали экспериментально.

Экстракция ДНК из бактерий. Бактериальные штаммы суспендировали в стерильной бидистиллированной воде (567 мкл). Добавляли смесь протеиназы К (1 мг/мкл) и 10% SDS (ЗОмкл) в соотношении 1:10. После перемешивания инкубировали 60 мин при 37°С на инкубаторе BI-515A. Затем добавляли 100 мкл 5М NaCI и 80 мкл STAB (2% гексадецилтриметиламмониум бромид, 1,4 М NaCI, 0,1 М трис-HCI, 0,1% меркаптоэтанол, 20мМ ЭДТА). Инкубировали 10 мин при 65°С, добавляли 600 мкл хлороформа для экстракции белков. Центрифугировали 5 мин. при 12 тыс. об/мин. Отделяли верхний слой надосадочной жидкости и добавляли 500 мкл изопропанола, инкубировали при -15° в течение 15 мин. После промывания 70% этанолом в образец вводили водный раствор экзонуклеазы РНКазьА (10 мг/л) и инкубировали 30 мин при 45° для активации фермента.

Электрофорез в агарозном геле. Готовили 1% агарозный гель в стерильной бидистиллированной воде с добавлением ТАЕ буфера и бромистого этидия (0.5 мг/л). Использовали краситель бромфеноловый синий. В качестве контроля применяли коммерческие препараты смесей нуклеиновых кислот. Задаваемое напряжение - 100V. Результат регистрировали в УФ.

ПЦР. Используя результаты электрофореза, экспериментально для каждой конкретной пробы подбирали концентрации экстрагированной ДНК для ПЦР. Для ПЦР использовали смесь из следующих компонентов: смеси дезоксинуклеотидов, Taq-полимеразы, буфера, воды и праймеров в концентрации 10 пмоль/мкл. Были использованы праймеры Bac16Sr-1 и 27-f (5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'). Приготовленную смесь помещали в растворы экстрагированных из бактериальных клеток ДНК и инкубировали на приборе Program Temp control system PC 708 ASTEC. Денатурация осуществлялась при 94°C в течение 30 сек., присоединение праймеров - при 54°С 30 сек, гибридизация - при 72°С 75 сек. Всего проводили 35 циклов. Результат проверяли путем проведения электрофореза, где в качестве положительного контроля использовали раствор ДНК, а в качестве отрицательного - стерильную бидистиллированную воду.

Очистка амплифицированной ДНК. По результатам электрофореза исследуемую ДНК очищали, используя коммерческий препарат Viogene (США), результаты очистки проверяли с помощью электрофореза. Для последующего секвенирования экспериментально подбирали концентрации очищенной исследуемой ДНК.

Секвенирование 16S рДНК, Для предварительного этапа, инкубации, готовили смесь коммерческого препарата (Big-Dye erminator Cycle seqiuencing Ready reaction Kit), содержащего флуоресцирующие красители препарата (4 мкл), буфера (2 мкл), воды (9 мкл), очищенной исследуемой ДНК (1 мкл) и одного из праймеров (27f), обеспечивая синтез в одном направлении. Параллельно готовилась смесь с другим праймером (Bac16Sr-1) для синтеза в противоположном направлении. Концентрация праймеров составляла 0,8 пмоль/мкл (4 мкл в смесь). Использовали прибор ProgramTemp control system PC 708 ASTEC, при этом денатурация осуществлялась при 96°С в течение 10 сек., присоединение праймеров - при 50°С 5 сек, гибридизация - при 60°С 240 сек. Всего проводили 35 циклов. В полученную смесь добавляли 2 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 5,1), затем 50 мкл 99,5% этанола с последующей инкубацией на ледяной бане в течение 4 мин. После последующего центрифугирования супернатант сливали и добавляли 100 мкл 70% этанола (холодного), центрифугировали 10 мин. После удаления спирта для выведения осадка ДНК в раствор добавляли коммерческий препарат Template Supression Reagent, нагревали в течение 3 мин при 95°С и моментальтно охлаждали. Затем помещали раствор в специальную емкость для автоматического секвенатора 310 Genetic Analyzer Applied Biosistems ABI PRIZM.

Анализ полученных спектров осуществлялся с помощью программы Genetyx-MAC 9.0. Полученные результаты в виде последовательности участка ДНК, кодирующего 16S рРНК, анализировали с помощью базы данных DDBJ /GenBank of Japan/.

Для постановки модельных экспериментов по обрастанию кубиков камня альгобактериальными сообществами, выделенными со стен памятников архитектуры, использовали известняк Мячковского горизонта, являющегося основным строительным камнем, используемым при строительстве большинства исторических зданий России [Звягинцев, Викторов, 1989]. Перед началом экспериментов кубики известняка были стерилизованы ионизирующим излучением на у-установке 60Со дозой 25 кГр.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка неповреждающих методов для исследования микробиоты памятников истории и культуры in situ. При визуальном обследовании памятников истории и культуры с целью предварительного выявления природы и характера повреждений материалов, в первую очередь, обращалось внимание на участки, покрытые налетом различных оттенков, обусловленных как ростом хемоорганотрофных и фототрофных микроорганизмов, так и загрязнениями из атмосферы. На каменных кладках внутренних стен зачастую образуются «высолы» - кристаллы гипса. Порошковидное и пластинчатое разрушение кирпича и кладочного раствора могут являться следствием жизнедеятельности основных деструкторов камня - хемолитотрофных бактерий, тионовых и нитрифицирующих, окисляющих восстановленные соединения серы и азота соответственно до серной, азотистой и азотной кислот. На предметах археологического текстиля из погребений некрополя, на бумаге книг основными типами повреждений были пятна разного цвета и истонышение материала, которое может быть вызвано целлюлозолитической активностью микромицетов и бактерий. Активные процессы биоповреждения памятников микроорганизмами возможны только при концентрациях воды в материалах, достаточных для роста клеток и их физиологической активности.

В работе исследована микробиота памятников архитектуры и музейных объектов с использованием различных методов, перечень которых представлен в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Памятники архитектуры и методы исследования населяющей их микробиоты - основных деструкторов камня: хемоорганотрофных, хемолитотрофных бактерий, микромицетов, микроводорослей

Памятник аохитектуры. матеоиал Проводимые исследования (применяемый метод)

Музей-усадьба «Аохангельское»: -Дворец «Каприз». XIX в. Белый камень, штукатурка наружных и внутренних стен -Гоот. XIX в. Белый камень, кирпич и кладочный раствор -Аэромикробиологический анализ (импакционный метод) -Количественный микробиологический анализ (метод предельных разведений, культивирование на селективных средах) -Определение элементного состава (атомная абсорбция, рентгеновская флуоресценция) -Измерение влагосодержания (контактный метод), картограммы -Определение ФА (контактный метод) -Сканирующая электронная микроскопия -Идентификация выделенных штаммов (Секвенирование ШрДНК)

Музей-усадьба «Аохангельское»: Театр -Аэромикробиологический анализ -Картограммы влагосодержания -Количественный микробиологический анализ

Гонзаго. XIX в. Кирпич и кладочный раствор

Ростовский Коемль: -Красная палата. XVII в. -Белая палата. XVII в. Белый камень, кирпич и кладочный раствор наружных и внутренних стен -Аэромикробиологический анализ -Картограммы влагосодержания -Количественный микробиологический анализ -Определение элементного состава

ГМИИ им. Пушкина: Музей личных коллекций. Х1Хв. Штукатурка внутренних стен -Аэромикробиологический анализ -Картограммы влагосодержания -Количественный микробиологический анализ

ГМИИ им. Пушкина: Главное здание.начало XX в. Мраморная облицовка стен -Количественный микробиологический анализ -Аэромикробиологический анализ

Новодевичий монастыоь: Надвратная Покровская церковь. XVII в. Белый камень наружных стен -Количественный микробиологический анализ -Определение элементного состава

ГМЗ «Коломенское» Ломик Петра 1. XVIII в. Дерево, наружные и внутренние стены -Аэромикробиологический анализ -Количественный микробиологический анализ -Измерение влагосодержания (контактный метод)

Гос. Исторический музей Главное здание. XIX в. Витрины, воздух -Аэромикробиологический анализ -Микробиологический анализ археологического предмета

Московский Коемль. полклет Архангельского собора. XVI в. Саркофаги, воздух -Аэромикробиологический анализ -Измерение влагосодержания (контактный метод) -Микробиологический анализ археологического предмета

Рязанский Коемль Подклет Успенского собора. XVII в. Кирпич, белый камень, кладочный раствор Аэромикробиологический анализ Количественный микробиологический анализ

1.1. Изучение влагосодержания камня. Разработка метода обнаружения зон микробного развития внутри каменных материалов памятников архитектуры. Учитывая зависимость роста микроорганизмов от условий влажности, в ходе проводимых исследований разработан способ обнаружения локальных зон микробных повреждений каменных строительных материалов (известняка, мрамора, кирпича, штукатурки).

Таблица 2. Музейные объекты: памятники истории и культуры и методы исследования населяющей их микробиоты: хемоорганотрофных бактерий и микромицетов.

Памятник истории и культуры Примененные методы исследования -Количественный микробиологический анализ (метод предельных разведений) -Экспресс-идентификация (ПЦР) -Идентификация бактериальных штаммов (Секвенирование 168 рДНК) -Определение элементного состава -Сканирующая электронная микроскопия

Археологический текстиль. Некрополь Московского Кремля, Погребения ХУ-ХУШв.: 1. Грушецкой Агафьи Семеновны 2. Милославской Марии Ильиничны 3 Нарышкиной Натальи Кирилловны 4. Романовой Софьи Михайловны 5. Романовой Марфы Михайловны 6. Марии Долгорукой 7. Марфы Собакиной 8. Елены Глинской

Книги (бумага, кожаный переплет) Библиотека кн. Юсуповых (Музей-усадьба «Архангельское»), 9 книг XVIII- нач.Х1Х вв. -Микробиологический анализ методом прямого посева на селективные среды

Археологическая кожа Катандинский кафтан И-1 в. до н. э. (Гос. исторический музей) -Количественный микробиологический анализ -Идентификация выделенных бактериальных штаммов (Секвенирование 16Э рДНК)

Фотодокументы. Альбом княгини Волконской, сер.Х!Х - нач.ХХ вв. -Микробиологический анализ методом прямого посева на селективные среды

Способ предназначен для обнаружения потенциального роста микроорганизмов в подповерхностном слое каменной кладки памятников архитектуры благодаря применению контактного неповреждающего метода измерения влагосодержания камня. С помощью электронного влагомера измеряли количество воды на глубине 1 и 4 см по всей площади исследуемого объекта, причем расстояние между соседними точками замеров составляла от 10 до 20 см. Затем строилась компьютерная схематическая карта для выявления зон с различным влагосодержанием, на которой определяли участки, соответствующие зонам повышенного влагосодержания материала, и, следовательно, являющиеся потенциальными «очагами» развития микроорганизмов. По результатам таких замеров была построена картограмма распределения влагосодержания в стенах западной ниши Грота Музея-усадьбы «Архангельское» (рис. 1), на которой видны участки увлажнения стены и цоколя ниши из-за с отсутствия гидроизоляции. В этих места наблюдается обрастание зелеными микроводорослями, причем площадь обрастания в летнее время составляла более 50% поверхности внутренних стен, а зимой она не превышала 5%.

Микробиологическое исследование проб, взятых в зонах разного увлажнения, показало, что в большинстве случаев при влагосодержании стен в пределах 1-5% количество микробных клеток в 1г составляет 0-10 для хемолитотрофных (нитрифицирующих и/или тионовых) бактерий, 0-100 для хемоорганотрофных бактерий и микромицетов; в пробах с влагосодержанием 5-8% эти величины составляли 0-100 и 100-1000 соответственно; в пробах с влагосодержанием 8-> 10% эти показатели находились в пределах от 100 до 1000000 и от 1000 до 10000000 соответственно.

Таким образом, разработанный способ позволяет, не разрушая целостности камня, оценить, в каких зонах исследуемого участка, как на поверхности, так и в глубине материала, можно прогнозировать повышенную активность микроорганизмов-деструкторов.

Кроме того, способ дал возможность сократить количество отобранных проб для микробиологического анализа и, таким образом, быстро и эффективно, с минимальными затратами осуществить диагностику биоповреждений исследуемых памятников архитектуры. С применением этого способа были исследованы также исторические здания ГМИИ им. А.С. Пушкина, Музея-усадьбы «Архангельское», памятники архитектуры Ростова Великого.

Рис. 1. Картограмма распределения влагосодержания каменной кладки западной ниши Грота на глубине 1см.

1.2. Измерение фотосинтетической активности водорослевых биопленок контактным методом. На

поверхности наружных стен зачастую развиваются окрашенные биопленки, образованные альгоцианобактериаль-ными сообществами, которые могут оказывать двоякое воздействие на памятник, образуя, с одной стороны, защитный слой на каменной кладке, предохраняющий от загрязняющих веществ атмосферы и температурных перепадов, кроме того, подщелачивая среду и тем самым препятствуя процессам биокоррозии. С другой стороны, микроводоросли в результате фотосинтеза продуцируют органические вещества, способствуя развитию микромицетов и бактерий, участвующих в деструкции камня. Следовательно, биопленки микроводорослей с низкой фотосинтетической активностью (ФА) не представляют реальной опасности для состояния сохранности каменной кладки, а участки биообрастания микроводорослями с высокой ФА, напротив, косвенно указывают на

активные процессы биодеструкции.

Для изучения физиологической активности микроводорослей на памятнике использовали недеструктивный метод импульсной амплитудной модуляции, который дает возможность измерять ФА не только в лаборатории, но и in situ. В результате измерений фотосинтетической активности, проведенных непосредственно на стенах Грота (рис. 1), и нанесении их на картограмму влагосодержания кладки, была выявлена корреляция между образованием микроводорослевой биопленки и влажностью камня.

В точках обильного обрастания показатель ФА микроводорослей менялся от 0,37 до 0,55, что свидетельствует об интенсивных фотосинтетических процессах и, как следствие, продукции органических веществ. Кроме того, высокая фотосинтетическая активность микроводорослей (до 0,54) проявлялась и там, где водорослевый рост был незначителен.

1.3. Аэромикробиологические исследования в помещениях памятников архитектуры. Микробиологический мониторинг воздушной среды позволяет вовремя оценить степень превышения допустимого уровня микробной контаминации воздуха в музейных помещениях. Интенсивность распространения спор и вегетативных клеток микроорганизмов, возрастание уровня микробной контаминации музейных объектов и, следовательно, опасность возникновения процессов повреждения экспонатов в музеях, зависят от совокупности двух составляющих: количества микроорганизмов в воздухе и факторов окружающей среды (в первую очередь, температуры и влажности). С целью выявления источников развития микроорганизмов, а также определения степени микробной контаминации памятника в целом проводились аэромикробиологические исследования, что является неповреждающим методом исследования объектов культурного наследия, предваряющим стадию отбора проб.

1.3.1. Сравнительное аэромикробиологическое исследование музейных помещений. Объектами исследования была аэромикробиота музейных помещений, характеризующихся различными условиями температурно-влажностного режима.

I. Неотапливаемые помещения с высокими показателями относительной влажности воздуха (ОВВ), достигающими 95-97%, и температурой воздуха в пределах 1О°-12°С, на примере Судной палаты Архангельского собора Московского кремля и подклета Успенского собора Рязанского Кремля.

II. Неотапливаемые помещения со средними показателями ОВВ в пределах 75-78%, температурой, близкой к температуре окружающей среды, и воздушной циркуляции, создаваемой за счет постоянного проветривания, на примере театра Гонзаго Музея-усадьбы «Архангельское».

III. Отапливаемые музейные помещения, в которых отсутствует централизованные системы кондиционирования и вентиляции, на примере экспозиционных залов Красной палаты Ростовского кремля.

IV. Экспозиционные залы Государственного Исторического музея, Музея личных коллекций и Главного здания ГМИИ им. А.С. Пушкина с централизованными системами кондиционирования и приточной вентиляции и большим числом посетителей. В них поддерживаются оптимальные показатели температуры (18-20°С), ОВВ (около 55%) и циркуляции воздуха (скорость воздушного потока 0,2 м/сек).

В результате проведенных сезонных исследований воздушной среды этих помещений было показано, что: в помещениях I типа максимальные значения микробного числа (КОЕ/м3) достигало 6000; в помещениях II типа показатели микробного числа Cmax/Cmin составляли 3500/1400; III типа - 600/170; IV типа - 70/10 (в отдельных точках 350/80). Методами статистического анализа полученных результатов было сокращено количество точек отбора проб воздуха для проведения последующего мониторинга.

Результаты аэромикробиологического анализа помещениях памятников архитектуры с отбором проб в разные сезоны могут служить основой для принятия допустимых норм по уровню микробной зараженности музейных помещений. Согласно нашим данным, в условиях оптимального температурно-влажностного режима, микробное число (число КОЕ микроорганизмов в 1 м3) в музейных помещениях не должно превышать 200 для грибной составляющей и 500 - для бактериальной составляющей.

1.3.2. Микробиологическое исследование воздуха в витринах как метод выявления очагов развития микроорганизмов на музейных экспонатах. Большинство экспонатов Государственного Исторического Музея (ГИМ) представляют объекты археологических раскопок небольшого размера, помещенные в витрины по нескольку десятков. Ведение микробиологического мониторинга объектов подразумевает тщательный осмотр, микроскопирование каждого предмета. В связи с этим отбор проб воздуха, их количественный анализ с последующим выделением доминирующих микроорганизмов является наиболее приемлемым способом выявления тех витрин, в которых могут находиться подверженные процессам биоповреждения музейные экспонаты, что сокращает объем проводимых исследований.

Результаты аэромикробиологического исследования 42 витрин в экспозиционных залах ГИМ показали в большинстве случаев невысокую микробную контаминацию воздуха: микробное число (количество спор микроорганизмов в 1 м3) не превышало 100. В качестве контроля отбирались пробы воздуха самих экспозиционных залов. При этом во всех пробах число КОЕ микроскопических грибов преобладало над количеством бактерий. Среди выделенных микромицетов доминировали представители родов Penicillium, Cladosporium, Aspergillus, среди бактерий - пигментированные неположительные формы. Были также выявлены 9 витрин, в воздухе которых концентрация спор микромицетов составляла 150450 КОЕ в 1 м3. При этом степень микробной контаминации воздуха залов, в которых были выявлены такие витрины, не превышала 50 КОЕ в 1 м3, что является хорошим показателем чистоты воздуха.

2. Методы исследования проб материалов памятников истории и культуры. Применение на памятниках истории и культуры описанных в разделе 1 способов предварительного исследования неразрушающими методами позволило оптимизировать выбор мест взятия проб и, таким образом, отобрать в конечном итоге необходимое и достаточное количество материала для получения достоверного результата. В данном разделе рассматриваются методы исследования объектов культурного наследия, требующие отбора проб. Особое внимание в работе уделялось методам анализа, для проведения которого используются микропробы.

2.1. Оптическая и электронная микроскопия. Оптическая фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия проб использовалась для обнаружения грибного мицелия на поверхности материала, состояния клеток микроводорослей и их идентификации; сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) - как прямой метод определения характера и степени разрушения материала и участия микроорганизмов в этих разрушениях. При изучении поврежденного археологического текстиля методом СЭМ был обнаружен мицелий грибов на поверхности фибрилл шелка.

В большинстве проб археологического текстиля из 6 погребений были выделены микромицеты, идентифицированные как Penicillium spp., Aspergillus spp., Acremonium sp., Cladosporiumsp., Mucor sp., Doratomyces sp., Mycelia sterilia.

2.2. ДНК-диагностика проб и выделенных штаммов с применением методов ПЦР. Применение ДНК-технологий значительно облегчает микробиологический анализ проб, так как использование классических методов идентификации по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам из-за большого разнообразия систематических групп микроорганизмов, развивающихся на памятниках, вызывает затруднение.

Методом ПЦР был проведен экспресс-анализ большого количества проб, которые отбирались путем взятия мазков для обнаружения некоторых родов бактерий и грибов. В целом ряде проб, взятых с живописи декораций Гонзаго и археологического текстиля из погребений некрополя Вознесенского собора, результаты показали отсутствие таких представителей микробиоты, как дрожжи рода Candida и микоплазмы, ранее обнаруженных на настенных росписях (Petushkova, Lyalikova, 1986).

2.3. Идентификация микроорганизмов в пробах методом секвенирования ДНК. В результате секвенировния бактериальной ДНК, кодирующей 16S рРНК, были идентифицированы штаммы бактерий, доминирующие в пробах белого камня, кирпича памятников архитектуры и археологического текстиля. Предварительно был проведен посев проб на питательные среды ПДГ, Чапека и Тиллера с последующим выделением доминирующих бактерий в чистые культуры. По результатам секвенирования с использованием базы данных DDBJ были определены виды бактерий, которые являются наиболее близкими генетически к изучаемым штаммам. Степень генетической близости варьировала от 93% до 100%, при этом большинство штаммов были идентифицированы на основе 99% и 100% степени идентичности.

Для микробиологического анализа поврежденных предметов археологического текстиля из погребений Некрополя XV-XVIII в.в. путем секвенирования ДНК выделенных бактериальных штаммов были выбраны те материалы, в микробиоте которых доминировали бактерии (табл. 3). Для этого предварительно был проведен микробиологический анализ проб текстиля 8 погребений путем посева на селективные питательные среды и количественного учета методом предельных разведений. Выделенные из проб поврежденных археологических предметов шелка из погребений Грушецкой и Милославской бактерии были идентифицированы как: Rhodococcus opacus, Bacillus luciferensis, Kitasatospora putterlickiae, Micrococcus luteus (табл. З). Условия, которые создавались в закрытых каменных саркофагах при высокой относительной влажности воздуха (свыше 90%), оказались благоприятными для преимущественного развития Micrococcus luteus -типичного обитателя почв и пресных вод. Перечисленные бактерии, очевидно, подавляли рост микромицетов, так как в этих материалах, по сравнению с пробами шелка из других погребений, количество грибов было в 100-1000 раз меньше, при этом выделялись только представители родовAspergillus и Penicillium.

В пробах археологической кожи Катандинского кафтана (II-I в. до н.э.) единственными представителями микробиоты были бактерии только одного рода, идентифицированные как Paenibacillus va lidus.

Таблица 3. Результаты секвенирования 16S рДНК бактериальных штаммов, вьщеленных с поврежденных археологических предметов

Объект Штамм Таксономическая Степень идентичности: доля совпадений

исследования (источник выделения микроорганизмов) принадлежность /№ по базе данных DDBJ/ нуклеотидных пар (% совпадений)

Кожаный кафтан 11-1 в. до н.э. (Государственный исторический музей)

Кожа /деструкция/ АК-11 Paenibacillus sp./AB18691S/ (Paenibacillus validus) 485/494 (98%)

Погребение Грушецкой XVII в. (Гос. музей-заповедник «Московский Кремль»)

Шелк, обмотки НГ-12-2 Rhodococcus opacus /Y11893/ 413/414 (99%)

Шелк, саван НГ-14 Bacillus luciferensis /AJ419629/ 484/499 (96%)

Погребение Милославской XVII в. (Гос. музей-заповедник «Московский Кремль»)

Шелк, саван /серый НМ-13-1 Bacillus luciferensis /AJ419629/ 477/493 (96%)

налет/ НМ-13-2 Kitasatospora putterlickiae /AY189976/ 447/458 (97%)

НМ-13-4 Micrococcus luteus /AF501366/ 446/447 (99%)

По данным определителя Берги, эти грамположительные бактерии генетически близки к rpynneAmmoniphilus-Aneurinibacillus-Oxalophagus[Bergey's manualof systematic bacteriology, 2001]. В литературных данных информация об обнаружении этих бактерий в пробах памятников истории и культуры отсутствует. Выделенный штамм обладает устойчивостью к различным биоцидным и консервирующим составам, которыми в течение 60 последних лет неоднократно обрабатывался кафтан.

Методом секвенирования ДНК были идентифицированы хемоорганотрофные бактерии, обитающие на поверхности каменных памятников архитектуры. Многие из них входят в состав альгобактериальных комплексов, где в качестве альгокомпонента преобладают микроводоросли p. Chlorella. В биопленках обрастаний на кирпичной и белокаменной кладке стен Грота, образованных спустя 2 года после биоцидной обработки, были идентифицированы Bacillus mycoides, Rhodococcus erythropolis, Aminobacteraminovorans, Pseudomonas reactans и Flavobacterium frigoris (табл. 4). Представители последних двух видов, относящиеся к грамотрицательным бактериям, в пробах преобладали. Многие виды родов Pseudomonas и Flavobacterium являются факультативными психрофилами, способными расти при 0°С, имея оптимум 25-30°С [Громов, Павленко, 1989]. Вследствие того, что внутри Грота создаются условия повышенной влажности и пониженных температур (до -20° зимой) и выделенные штаммы Pseudomonas reactans и Flavobacterium frigoris культивируются при температуре 10°С, их можно отнести к группе факультативных психрофильных микроорганизмов. Грамотрицательные почкующиеся бактерии Aminobacter aminovorans, как и бациллы, образуют аммиак, который является субстратом для нитрифицирующих бактерий. Ранее методом секвенирования 16S рДНК были выявлены и идентифицированы бактерии, населяющие камень в пещерах Испании и Грота Италии. В камне пещер доминировали актиномицеты, включая виды рода Rhodococcus [Groth et.al., 1999], а в пробах сталактитов Грота dey Cervi Porto Badisco доминировали актиномицеты рода Streptomyces и бактерии p. Bacillus [Laiz et. al., 2000].

3. Геохимический состав камня исторических памятников и его влияние на разнообразие физиологических групп микроорганизмов и их количественные соотношения. В процессе выветривания на поверхности и в подповерхностных слоях каменных стен памятников архитектуры в результате атмосферного воздействия и при капиллярном подсосе фунтовых вод аккумулируются органические и неорганические вещества, которые оказывают влияние на минеральный состав камня. Наряду с этим, накапливаемые в камне вещества могут являться питательной средой для микроорганизмов, а также ингибировать в определенных концентрациях их физиологическую активность. Известно, что клетки микроорганизмов способны аккумулировать тяжелые металлы в количествах, намного превышающих их потребность. Сублетальные концентрации металлов вызывают нарушения в ультраструктуре клеток, ингибируют транспортные и энергетические процессы, действуют на многие участки метаболических путей [Сенцова, Максимов, 1985].

3.1. Определение элементного состава проб методом атомной абсорбции. В ходе работы был исследован элементный состав белокаменной и кирпичной кладки наружных стен в местах образования патины биологического происхождения на памятниках архитектуры, находящихся в разных условиях окружающей среды. Параллельно проводилось изучение микробиоты анализируемых проб, которое показало высокое микробное разнообразие выделенных физиологических групп (табл. 4). Это хемолитотрофные тионовые и нитрифицирующие бактерии, хемоорганотрофные бактерии и микроскопические грибы. В микробиоценозе белого камня Грота и Красной палаты Ростовского Кремля преобладающими были бактерии p. Bacillus, а также микромицеты Aspergillus spp., Penicillium spp., Altemaria sp., Cladosporium sp., Tritirachium sp. и зеленые водоросли р. Chlorella, образующие биопленки разных оттенков зеленого, бурого, темно-серого цветов.

Геохимический анализ белого камня Покровской церкви Новодевичьего монастыря показал очевидное различие в содержании элементов тяжелых металлов в пробах в зависимости от типа биоповреждений известняка. Пробы камня с темными пятнами обрастания (преимущественно, микромицетами и хемоорганотрофными бактериями) содержали Си в 70 раз, Zn в 200 раз, Ni в 1,5 раза, Мп в 2,5 раза меньше, а Сг в 1,5 раза больше, чем в зеленой патине, образованной альгобактериальной биопленкой. Во всех анализируемых пробах было отмечено сравнительно низкое содержание РЬ (0,06-%, 14 мкг/г). Таким образом, в микроводорослевой биопленке, образованной на известняке Новодевичьего монастыря, аккумулируется максимальное количество элементов Zn, Ni, Fe и Мп. Более низкая их концентрация наблюдалась в темно-серой патине. По сравнению с пробами патины в неповрежденном известняке концентрация анализируемых элементов была наименьшей (рис. 2А).

Грот в подмосковном Музее-усадьбе «Архангельское», в отличие от стен Покровской церкви Новодевичьего монастыря, менее подвержен атмосферному загрязнению. Микробиологический анализ проб, взятых с внутренних стен Грота, показал высокую зараженность хемоорганотрофными микроорганизмами, составляющую в среднем выше 107 клеток на 1 г пробы (табл. 4). Доминирующими представителями микробных сообществ во всех пробах были бактерии.

Таблица 4. Хемолитотрофные и хемоорганотрофные микроорганизмы, обнаруженные в пробах с поврежденных стен каменных памятников архитектуры (число клеток/1 г).

Место отбора проб Нитрифицирующие бактерии Тионовые Хемоорганотрофные микроорганизмы

Нитрит образующие Нитрат образующие бактерии Бактерии/ актиномицеты Микромицегы

Надвратная Покровская церковь Новодевичьего монастыря (г. Москва)

Белый камень, темная патина 0 10J 10 МО* з-ю6

Белый камень, зеленая патина 10' 0 10J 7-10= 5-104

Грот Госуда рственного музея-усадьбы «Архангельское» (Московская обл.)

Белый камень, зеленая патина юа 0 10* 2*10/10 200

Белый камень, без патины 10* 10 10" 1,мо'/ю' 100

Красная палата Ростовского Кремля (Ярославская обл.)

Кирпич, зеленая патина 10* 0 10а 1.8-10S 10*

Кирпич, без патины 10* 0 0 5-Ю' 3,7-10°

Штукатурка, зеленая патина 10J 10* юл 4-10° 3,5-10'

Штукатурка, без патины 10' 10* 9-1 о' з-ю'

Кладочный раствор, без патины 0 0 10' 9,2-10Э 2-10*

Примечание: Зеленая патина образована микроводорослями, доминирующий род - Chlorella.

Рис. 2 (А.Б). Концентрация тяжелых металлов, отобранных с цоколей памятников архитектуры Новодевичьего мостыря и Грота ГМУ «Архангельское». Зеленая патина образована микроводорослевым обрастанием.

Одна из причин ингибирования роста микроскопических грибов, возможно, связана с присутствием актиномицетов, количество которых в пробах достигало 10 клеток/г. Среди обшэго числа бактерий, развивающихся на каменных стенах Грота, большинство штаммов бактерий оказались галотолерантными, способными к росту на средах, содержащих 10% №С! или 7% Сав04. Таким образом, основная часть микробиоты может развиваться в присутствии повышенных концентраций солей, которые обильно выступают в виде кристаллов гипса на поверхности стен. Среди хемолитотрофных бактерий преобладали тионовые и нитритобразующие бактери, продуцирующие серную и азотистую кислоту. В отдельных пробах их концентрация была в пределах 1000-10000 клеток в 1 г.

Диапазон содержания элементов в пробах со стен Грота оказался весьма широким (рис. 2Б). В пробах, взятых с водорослевых биопленок, содержащих около 30% органического вещества, наблюдалось повышенное количество 7п, Ре, Сг и Мп по сравнению с камнем без биообрастания (цинка больше в 20 раз, кобальта и хрома в 2 раза, железа и марганца в 3-6 раз). Видимый рост фототрофов отсутствовал в пробах, содержащих высокие концентрации элементов Си, РЬ, и № Можно предположить, что высокое содержание анализируемых элементов в стенах Грота обусловлено природно-техническими особенностями данной исторической территории (в грунте над сводом Грота имеется металлическая арматура, которая корродирует под действием избыточной влаги). Таким образом, показано, что высокие концентрации тяжелых металлов, обнаруженные в пробах, влияют на разнообразие микробиоты стен Грота.

Памятники архитектуры Ростовского Кремля Ярославской области по сравнению с памятниками Московского региона находятся в условиях наименее загрязненной окружающей среды. Результаты микробиологических исследований показали высокие концентрации хемоорганотрофных бактерий и микромицетов в штукатурке, кирпиче и кладочном растворе, достигающие 100000 КОЕ в 1 г пробы. Кроме того, во всех пробах были обнаружены хемолитотрофные бактерии (табл. 4). В отличие от памятников Московского региона диапазон содержания элементов в пробах с патиной и в неповрежденном материале оказался незначительным и составил менее 20% (рис. 3). При этом концентрация токсичных для клеток микроорганизмов Си, № и РЬ не превышала 4,1; 0,75 и 1,74 мкг/г, соответственно, что способствовало обильному росту грибов и бактерий.

Таким образом, можно заключить, что геохимический состав поверхности камня памятников архитектуры оказывает непосредственное влияние на качественный и количественный состав микроорганизмов и, как следствие, на степень разрушения каменных архитектурных сооружений. Несмотря на то, что содержание тяжелых металлов в камне в основном значительно выше оптимальных концентраций для жизнедеятельности клеток, количество хемоорганотрофных бактерий в ряде проб превышало 106 клеток/г. Показано, что в отличие от микромицетов рост хемолитотрофных бактерий не ингибируется повышенными концентрациями тяжелых металлов. Следовательно, развивающиеся на стенах альгобактериальные сообщества адаптированы к высоким концентрациям в каменных материалах элементов 7п, Си, РЬ, N11, накопленных за многолетний период существования исторических сооружений.

Рис. 3. Концентрация тяжелых металлов в пробах строительных материалов Красной палаты Ростовского Кремля. Зеленая патина образована микроводорослевым обрастанием.

3.2. Анализ элементного состава проб с помощью рентгеновской флуоресценции.

Существенным ограничением использования метода атомной абсорбции для получения достоверных результатов анализа является необходимость отбора большого объема проб (более 1 г). Применение метода рентгеновской флуоресценции позволило определить элементный состав проб без проведения предварительной обработки, оставляя интактным анализируемый образец с возможностью последующего исследования микробного состава. Белокаменный цоколь Малого Дворца «Каприз» покрыт сине-зеленой патиной, обусловленной присутствием водорослей и соединений меди, поступающих с дождевой водой, льющейся с металлических конструкций крыши. Несмотря на видимый рост микроводорослей, камень остается крепким и возможен отбор только небольшого объема пробы (10-50 мг). Вследствие этого и был применен метод рентгеновской флуоресценции в сочетании с оптической микроскопией образцов, что дало возможность провести локальный геохимический анализ интересующих участков пробы: как с микроводорослевой патиной, так и без нее. Результаты показали присутствие в пробах, наряду с Си, также элементов Ре, Са, Мп, И, причем в участках с водорослевым обрастанием, где сине-зеленый налет был менее интенсивным, количество Си было меньше в 2,5 раза, а Ре - в 14 раз, тогда как количество Са было в 2 раза больше (рис. 4). Остальные элементы с атомными номерами, начиная с 14 (кремний) и до 41 (молибден), присутствовали в незначительных количествах, находящихся за пределами чувствительности метода.

Результаты идентификации бактериальных штаммов, выделенных со стен Дворца «Каприз», показали, что в штукатурном слое вне зон обрастания микроводорослями выделялись только виды р. Arthrobacter.

В местах повреждения белокаменного цоколя с выраженным сине-зеленым налетом, в котором было обнаружено высокое содержание Си и Fe, в микробных сообществах наряду с микроводорослями Chlorella vulgaris преобладали устойчивые к воздействию этих металлов бактерии p. Bacillus, Dyadobacterfermentens иActinobacterium (табл.5).

энергия, КЭВ Энаргия, кэВ

Рис. 4. Изучение элементного состава проб методом рентгеновской флуоресценции. А - известняк с сине-зеленой патиной, Б- известняк без сине-зеленой патины.

Ранее было показано, что представители p. Actinobacterium являются доминирующими среди метаболически активных бактерий в зараженных тяжелыми металлами почвах [Gremion et al., 2003]. В участках цоколя с яркой сине-зеленой окраской ФА микроводорослей была равна нулю или не превышала 0,1, тогда как в других местах обрастаний, она составляла 0,3-0,5. Это свидетельствует о том, что окраска обусловлена присутствием меди, подавляющей активность фототрофных обрастателей камня. На участках слабоокрашенного известняка с низким содержанием Си и Fe наряду с Chlorella vulgaris были обнаружены представители p. Flavobacterium. В пробах, взятых со стен, где микроводорослевая патина отсутствовала, микробное разнообразие было существенно ниже.

4. Разработка модельных экспериментов. Учитывая многофакторность условий внешней среды, трудно сделать вывод о действии какого-либо отдельного фактора. Для этого были поставлены модельные эксперименты, где объекты исследования находились в одинаковых, постоянных условиях за исключением интересующего нас фактора, влияние которого изучалось.

Таблица 5. Результаты секвенирования 16S рДНК бактериальных штаммов, выделенных со стен Малого Дворца «Каприз» Музея-усадьбы «Архангельское»

Объект исследования (источник выделения микроорганизмов) Штамм Таксономическая принадлежность /№ по базе данных DDBJ/ Степень идентичности: доля совпадений нуклеотидных пар (% совпадений)

Штукатуока. покрасочный слой, водоросли АК-1-1-1 АК-1-1-3 Microbacterium oxydans /AY509223/ 385/387 (99%)

АК-1-1-4 АК-1-1-2 Dyadobacter fermentens /AF137029/ 421/441 (95%)

АК-1-1-5 Microbacterium oxydans /AY509223/ 412/413 (99%)

АК-1-3 Streptomyces griseus /Y15502/ 420/423 (99%)

АК-1-5-1 АК-1-5-2 Streptomyces griseus /Y15502/ 420/423 (99%)

АК-1-6-1 Sphingomonas sp. /AF131296/ 413/419 (98%)

Штукатуока. покрасочный слой, без водорослей АК-10-2 АК-10-3 АК-10-4 Arthrobacter crystallopoietes /Х80738/ 388/389 (99%)

Известняк, водоросли АК-3-2 АК-3-3 Flavobacterium johnsoniae /АВ078043/ 351/366 (95%)

АК-3-4 Flavobacterium johnsoniae /АВ078043/ 375/406 (92%)

Известняк, неповрежденный АК-6-1-1 Dyadobacter fermentens /AF137029/ 424/448 (94%)

АК-6-4 Pedobacter cryoconitis /AY275474/ 398/406 (98%)

Известняк,медьсодержащая патина (интенсивная), водоросли (слабый рост) АК-2-3 АК-2-4 Dyadobacter fermentens /AF137029/ 421/441 (95%)

Известняк.меаьсодеожашая патина, без водорослей АК-9 Methylobacterium mesophilicum /D32225/ 428/430 (99%)

Известняк. водоросли (обильный рост), медьсодержащая патина АК-7-1 Bacillus thuringiensis /АУ170457/ 485/485 (100%)

АК-7-2 АК-7-3 Actinobacterium 5L-2 /AY561536/ 457/457 (100%)

4.1. Изучение параметров физиологической активности альгобактериального комплекса в зависимости от концентрации CuSOa в модельных экспериментах по обрастанию образцов СаСОз. В экспериментах были использованы накопительные культуры альгоцианобактериальных сообществ, взятых со стены Грота, в которых фототрофный компонент был представлен одноклеточными зелеными водорослями Chlorella vulgaris Beijeru цианобактериями рода Lyngbya. В среду с накопительной культурой помещали кубики мячковского известняка, добавляли CuSO4 в различных концентрациях: 0;

-9-8 7 *6 -5

6'10 ; 6*10 ; 6*10" ; 6*10 ;6*ю М и инкубировали на свету в течение 7 недель. В задачи

эксперимента входило изучение динамики обрастания кубиков водорослями с использованием метода обработки компьютерных цифровых изображений, микроскопия с целью контроля за изменением морфологии клеток водорослей в зависимости от концентрации CuSO4.

Наряду с этим измеряли фотосинтетическую активность фототрофных компонентов микробных сообществ на гранях образцов известняка и проводили люминесцентную микроскопию с целью определения доли жизнеспособных клеток в зависимости от концентрации CuSO4.

Люминесцентная микроскопия клеток альгобактериальных сообществ показала, что CuSO4 в концентрации почти не влияет на состояние хлорофилла и свидетельствует

о жизнеспособности клеток (рис. 5). Только 2-3% клеток в препарате желто-зеленые, остальные - красные, что обусловлено люминесценцией хлорофилла. При концентрации CuSO« 6'107м доля люминесцентных клеток заметно уменьшается. Следует отметить, что локализация бактерий в этом препарате отличается от контрольного. Если в отсутствие CuS04 бактерии располагались по всему полю зрения и на некотором расстоянии от клеток водорослей, то при концентрации бактерии, потребляющие продукты распада

клеток микроводорослей в этих условиях, скапливаются в районе лизированных клеток Chlorella vulgaris, которые полностью потеряли жизнеспособность. Концентрация CuS04 6*1 О^М приводит к необратимым изменениям в морфологии клеток Chlorella vulgaris.

На рис. 6 показана динамика обрастания альгоцианобактериального комплекса в зависимости от концентрации CuSO4, полученная методом компьютерной обработки цифровых изображений. Так, отмечено положительное влияние концентраций сульфата меди до 6'109М на начальных стадиях обрастания по сравнению с контролем. При концентрациях Си выше 6*10^М ВИДИМОЙ биопленки не выявлено. Морфология клеток Chlorella vulgaris при повышенных концентрациях CuSO4 претерпевает изменения: появляются включения и исчезает пиреноид, утолщается клеточная оболочка. Это косвенно подтверждает то, что у этих клеток отсутствует фотосинтетическая активность, и они живут за счет эндогенных запасных веществ. Бактериальная компонента сообщества оказалась более устойчивой: бактерии p. Rhodococcus сохраняли жизнеспособность при концентрации CuSO4 в культуральной жидкости вплоть до при которой численность бактерий

резко упала, но полного подавления их роста не наблюдалось.

Результаты измерения ФА водорослей на гранях образцов камня и в культуральной

жидкости в эксперименте показаны на рис. 7. Было обнаружено, что ФА микроводорослей в

культуральной жидкости на 20% выше, чем на поверхности камня. Это можно объяснить

тем, что клетки Chlorella vulgaris более приспособлены к росту в водной среде во

взвешенном состоянии, нежели на субстрате. Вместе с тем ФА этих микроводорослей на

стенках кубиков известняка достаточно высока (Fv/Fm >0,4). В присутствии меди ФА

-в -7

водорослей ингибируется при концентрациях CuSO4 в пределах 6'10 -6*10 М и выше. Известно, что у водорослей и цианобактерий под действием ионов тяжелых металлов

подавляется фотосинтез, снижается содержание хлорофилла и цитохромов в клетках, ионы 2+

Си включаются в хлоропласты и ингибируют образование триплетного состояния хлорофилла [Сенцова, Максимов, 1985].

4.2. Изучение устойчивости к высушиванию альгоцианобактериальных биопленок, выделенных со стен памятников архитектуры с применением метода ЯМР-спиновое эхо.

Рис. 5 Люминесцентная микроскопия клеток альгобактериального комплекса (выделенного со стен Грота Музея-усадьюы «Архангельское») в присутствии CuSO4 различных концентраций.

КОНЦЕНТРАЦИИ Си804: А -контроль; Б - 6«10'9 М; Д- б-Ю^М; Г- 6'Ю 7 М; Д -640 * М; Е - 6'10'5 М

30 25 * 20 О г 15 X а. "МО со о = 5 *е

А

/\у/

____Г

-5

3 недели <1 недели 5 недель б издать 7 кед ель время

Рис. 6. Динамика обрастания кубиков известняка Рис.

_7.

альгобактериальным комплексом (выделенным со стен Грота музея-усадьбы «Архангельское») в присутствии СиЭ04 различных концентраций. Расчет проводился методом компьютерной обработки цифровых изображений. Результаты приведены как среднее по всем граням кубиков в трех повторностях.

Зависимость Фотосинтетической активности микроводорослей альгобактериального комплекса (выделенного со стен Грота музея-усадьбы «Архангельское»), от СиЭ04 различных концентраций. Ру/Рт - относительная переменная флуоресценция. Результаты приведены как среднее по всем граням кубиков. Эксперимент проводился в трех повторностях.

Недостаток влаги и воздействие низких температур создают экстремальные условия для жизни микроорганизмов на поверхности камня памятников. Однако мы наблюдаем интенсивное обрастание микроорганизмами известняка, несмотря на происходящие в камне циклические процессы замораживания/оттаивания воды.

Задачей эксперимента было выяснить, сохраняют ли фотосинтетическую активность водоросли, образующие пленку обрастания на памятниках архитектуры, в условиях изменений влагосодержания образцов. Результаты лабораторного исследования образцов биопленки в зависимости от условий влажности методами ЯМР-спиновое эхо и измерения ФА показали следующее (таблица 6).

Таблица № 6. Влияние влажности на фотосинтетическую активность и релаксационные характеристики протонов воды, сорбируемой альгоцианобактериальными биопленками, выделенными со стен Грота. _____

Условия содержания образца Относит, переменная флюоресценции (ФА) Влагосодержан ие биопленки, % Время сп релаксации Т ин-спиновой протонов воды, г, мс

1 компонента II компонента

Нативный образец (взят со стены при -20'С) 0,46 ± 0,04 48

Лиофильное высушивание, 10"3ммрт. ст.,-10'С 0,00 0 .

Экспозиция при ОВВ 52%, ЗО'С, 7дней 0,01 ± 0,001 12 2,0 ±0,15 0

Экспозиция при ОВВ 96%, ЗО'С, 7дней 0,1 ± 0,01 22 7,0 ±0,5 0

Экспозиция при ОВВ 100%, ЗО'С, 7 дней 0,1 ± 0,04 39 .

Экспозиция при ОВВ 100%, | ЗО'С, 28 дней 0,41 ± 0,02 39 5,0 ±0,3 70,0 ± 5

«-»• определения не проводили.

Лиофильно сухие образцы не проявляли фотосинтетическую активность, но оставались жизнеспособными, а при их увлажнении до 12% начинала проявляться слабая ФА. В этих условиях образец содержит связанную воду, характеризующуюся временем спин-спиновой релаксации протонов воды (Т2), равным 2мс. Известно, что для протонов свободной воды этот параметр равен 2 секундам, в то время как Т2 для протонов льда составляет Ю^-Ю"6 сек. В образцах биопленки, увлажненной до 22%, Т2 достигает 7 мс, а ФА 0,1. Таким образом, увеличение вдвое количества воды в образце практически не меняет ее физическое состояние, присутствующая вода может быть отнесена к так называемой связанной воде. Недельная экспозиция в условиях 100% ОВВ приводила к тому, что влагосодержание образцов увеличилось до 39%, тогда как фотосинтетическая активность не изменилась. ФА повысилась в 4 раза и достигла уровня исходной активности нативного образца только после инкубации при 100% ОВВ в течение 28 дней. В этих условиях в образце присутствуют протоны относительно подвижной воды (появляется вторая компонента Т2 = 70мс), которая необходима для метаболизма клеток.

5. Разработка схемы комплексного исследования с целью биодиагностики памятников истории и культуры. Изучение микроорганизмов - деструкторов памятников архитектуры и прикладного искусства может ограничиваться выделением доминирующих форм бактерий и микромицетов.

Самостоятельное значение могут иметь исследования физиологических особенностей выделенного микробного комплекса в целом, а также его устойчивости к факторам внешнего воздействия. Однако только комплексное исследование позволит прогнозировать микробиологическую ситуацию для каждого конкретного памятника истории и культуры и разработать рекомендации для их долговременного сохранения.

С этой целью была разработана схема комплексного методологического подхода к биодиагностике памятников архитектуры (рис. 8). Как видно из схемы, проведение исследования памятников in situ дало возможность получить результаты о потенциальных зонах микробного заражения, о физиологической активности видимой биопленки, кроме того, выявить места повышенной микробной контаминации воздуха и, таким образом, определить целесообразность отбора проб в тех или иных участках. Приведенные в схеме «неповреждающие» методы (без отбора проб) были использованы в ходе биомониторинга памятников архитектуры и рекомендованы для контроля проведения реставрационных и консервационных работ. В соответствии с разработанной схемой было проведено комплексное исследование стен Малого Дворца «Каприз» Государственного музея-усадьбы «Архангельское».

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован метод выбора мест отбора проб с целью получения достоверных результатов при минимальном повреждении памятника в ходе комплексного исследования и микробиологического мониторинга. Построены карты влагосодержания кирпичной и каменной кладки контактным методом на глубине 1 см и 4 см для наружных и внутренних стен исторических сооружений музея-усадьбы «Архангельское», Рязанского и Ростовского кремлей. Показано, что при влагосодержании кладки 5% и выше наблюдается интенсивное развитие хемолитотрофных и хемоорганотрофных бактерий, микромицетов в количестве от 103идо 107- 108 КОЕ в 1 гпробы.

2. Изучение элементного состава проб позволило судить о степени устойчивости клеток бактерий и микроводорослей, развивающихся на материале памятников архитектуры Московского и Ярославского регионов. Показано, что фотосинтетическая активность обрастателей каменной кладки Дворца «Каприз» - микроводорослей p. Chlorella остается высокой (Fv/Fm составляла 0,30 - 0,47), несмотря на присутствие металлов Си и РЬ в концентрациях, превышающих 140 мкг/г пробы. Наиболее устойчивыми к воздействию меди и железа оказались бактерии, идентифицированные какBacШus thuringiensis, Actinobacterium sp., Dyadobacterfermentensи Methylobacteriummesophilicum, причем последние выделены с участков стен, где отсутствовал рост микроводорослей.

3. В результате сравнительного аэромикробиологического исследования воздуха в витринах экспозиционных залов и в музейных помещениях, характеризующихся различными условиями температурно-влажностного режима, было обнаружено, что численность КОЕ микроорганизмов в 1 м колебалась в широких пределах (от 20 до 6000). На основе анализа результатов определены допустимые уровни загрязнения воздуха в музеях и возможные источники микробной контаминации без отбора проб материалов.

4. Впервые методом секвенирования ДНК, кодирующей 16S рРНК, были идентифицированы бактериальные штаммы Rhodococcus opacus, Bacillus luciferensis, Kitasatospora putterlickiae и Micrococcus luteus, выделенные с предметов археологического текстиля XVIIB. Государственного Музея «Московский Кремль», и Paenibacillus validus, выделенные из кожи II-I в. до н.э. Государственного Исторического Музея.

5. Результаты модельных экспериментов по изучению обрастания известняка биопленками альгобактериальных сообществ (доминирующий фототрофный компонент -микроводоросли Chlorella vulgaris), выделенными с белокаменного цоколя Грота музея-усадьбы «Архангельское», показали пределы их устойчивости к влиянию различных условий влажности и воздействия сульфата меди. Методами люминесцентной микроскопии, компьютерной обработки цифровых изображений, измерения влагосодержания камня и ЯМР спиновое-эхо было установлено, что CuSO4 в концентрациях до 6*10^М не влияет на фотосинтетическую активность микроводорослей, их функциональное состояние и интенсивность обрастания ими известняка. Концентрации и выше полностью подавляют физиологическую активность микроводорослей. При лиофильном высушивании микроводорослей на поверхности камня жизнеспособность клеток сохранялась, однако полное восстановление их фотосинтетической активности происходило при последующем длительном увлажнении только с появлением «свободной» воды, характеризующейся Т2 около 70 мс.

6. В ходе проводимой работы была разработана схема комплексного методологического подхода к биодиагностике памятников архитектуры, на основе которой был исследован Дворец «Каприз» Музея-усадьбы «Архангельское».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петушкова Ю.А., Николаева Ю.Г., Антал Т.К., Гусев М.В. Изучение устойчивости сообществ цианобактерий и микроводорослей к воздействию низких температур и высушивания в известняке памятников архитектуры. Материалы 1 Межд. симпозиума «Биокосные взаимо-действия: «Жизнь и камень», Санкт-Петербург, 2002. с. 237-239.

2. Petushkova Ju.P., Petushkova Ju.A., Kandyba, P.E., Kruplna M.V., Gusev M.V. Biomonitoring and geochemlcal studies of stone historical buildings directed to protection of the Russian Medieval Cities. Proceedings of the 7th Intern. Symposium of World Heritage Cities. Rhodes (Greece), 24-26 September 2003.063doc. Mb 2,03.

3. Петушкова Ю.А., Петушкова Ю.П., Крупина М.В. Комплексное микробиологическое и геохимическое исследование памятников архитектуры Ростовского Кремля и Новодевичьего монастыря. Сб. тезисов 2-го Межд. научно-практич. симпозиума «Природные условия строительства и сохранения храмов православной Руси», г. Сергиев Посад, 7-11 октября 2003. с. 82-85.

4. Петушкова Ю.П., Петушкова Ю.А., Филиппов СП. Биотехнология, ее роль и место в организации мониторинга и в защите храмовой архитектуры. Сб. тезисов 2-го Межд. научно-практич. симпозиума «Природные условия строительства и сохранения храмов православной Руси», г. Сергиев Посад, 7-11 октября 2003 с. 164-166.

5. Петушкова Ю.А., Петушкова Ю.П., Гусев М.В. Способ обнаружения микробиологических повреждений в минеральных строительных материалах. Патент №2223491. Зарегистрировано 10 февраля 2004г. Приоритет 26 августа 2002 г.

6. Петушкова Ю.А., Колотилова Н.Н., Кукарских Г.П., Кренделева Т.Е. Влияние солей меди и свинца на физиологию эпилитных фототрофных микроорганизмов, выделенных с камня исторических зданий. Материалы II Межд. симпозиума «Биокосные взаимодействия: «Жизнь и камень», Санкт-Петербург, 2004. с. 220-223.

7. Петушкова Ю.А., Нариманова Н.Ю., Селях И.О., Семенова Л.Р., Турьянский А.Г., Петушкова Ю.П. Биогеохимический анализ камня памятников архитектуры с помощью оптической и рентгеновской микроскопии. Материалы II Межд. симпозиума «Биокосные взаимодействия: «Жизнь и камень», Санкт-Петербург, 2004. с. 223-225.

8. Петушкова Ю.П., Петушкова Ю.А., Филиппов СП. Роль биодиагностики и биомониторинга в сохранении памятников каменного зодчества. Материалы II Межд. симпозиума «Биокосные взаимодействия: «Жизнь и камень», Санкт-Петербург, 2004. с. 225227.

9. Гарбар Н.М., Петушкова Ю.А., Петушкова Ю.П. Микробиологические исследования и защита от биоповреждений фотографий декабристов из собрания Государственного исторического музея. Тезисы докладов XVI Симпозиума «Современная химическая физика», г.Туапсе, 2004. с.212-213.

10. Петушкова Ю.А., Орлов Т.В., Кандыба П.Е., Петушкова Ю.П. Аэромикробиологическое исследование музейных помещений с применением статистического анализа Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 2004. №4. с. 28-38.

11. Петушкова Ю.П., Петушкова Ю.А., Филиппов СП. Биодиагностика материалов. Гл. 7.8. В сб. Методическая документация в строительстве: Правила обследования зданий, сооружений и комплексов богослужебного и вспомогательного назначения. МДС 1 1-17.2004. М.:ФГУПЦПП,2005.с.15-16.

12. Петушкова Ю.А., Крупина М.В., Петушкова Ю.П., Гусев М.В. Биогеохимическое исследование известняка памятников архитектуры. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 2005. №2. с. 23-30.

13. Петушкова Ю.А. Микробиологическое исследование воздуха помещений экспозиционных залов и витрин Главного здания Государственного Исторического Музея. Консервация и реставрация музейных ценностей. Труды Гос. Историч. музея. 2005 /в печати/.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Тираж 100 экз.

о 7 мдя

710

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петушкова, Юлия Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микроорганизмы — обитатели объектов культурного наследия

1.2. Окружающая среда и культурное наследие

1.3. Методы изучения микробиоты памятников истории и культуры

1.3.1. Классические микробиологические методы посева на 26 селективные питательные среды.

1.3.2. Методы микроскопии

1.3.3. Методы идентификации микроорганизмов

1.3.3.1. Метод с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)

1.3.3.2. Иммунохимический метод. Иммуноферментный анализ

1.3.4. Методы определения физиолого-биохимических 36 параметров активности микроорганизмов

1.3.4.1. Метод измерения фотосинтетической активности

1.3.4.2. Методы определения метаболической активности

1.3.5. Методы количественного анализа. Биолюминесцентный метод

1.4. Аэромикробиологические методы исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка и применение неповреждающих методов для исследования микробиоты памятников истории и культуры in situ

3.1.1. Определение типов повреждений и выявление патины биологического происхождения

3.1.2. Изучение влагосодержания камня. Разработка метода обнаружения зон микробного развития внутри каменных материалов памятников архитектуры.

3.1.3. Измерение фотосинтетической активности водорослевых биопленок контактным методом.

3.1.4. Аэромикробиологические исследования в помещениях памятников архитектуры

3.1.4.1. Сравнительное аэромикробиологическое исследование музейных помещений.

3.1.4.2. Микробиологическое исследование воздуха в витринах как метод выявления очагов развития микроорганизмов на музейных экспонатах.

3.2. Методы исследования проб материалов памятников истории и культуры

3.2.1. Методы посева на селективные питательные среды и культивирования. Определение доминирующих видов-биодеструкторов.

3.2.1.1. Микробиологические исследования фотодокументов.

3.2.1.2. Микробиологические исследования книг из библиотеки князей Юсуповых музея-усадьбы «Архангельское».

3.2.1.3. Микробиологические исследования деревянного памятника архитектуры -Домика Петра I музея-заповедника

Коломенское».

3.2.2. Оптическая и электронная микроскопия проб как метод прямого 118 анализа

3.2.3. ДНК-диагностика проб и выделенных штаммов-деструкторов с 124 применением методов ПЦР, секвенирования ДНК

3.2.4. Идентификация микроорганизмов в пробах методом секвенирования ДНК.

3.3. Геохимический состав камня исторических памятников и его влияние 131 на разнообразие физиологических групп микроорганизмов и их количественные соотношения.

3.3.1. Определение элементного состава ролбметодом атомной абсорбции

3.3.2. Анализ элементного состава проб с помощью рентгеновской 143 флуоресценции.

3.3.3. Определение концентраций тяжелых металлов в пробах 146 археологического шелка.

3.4. Разработка модельных экспериментов

3.4.1. Изучение некоторых параметров физиологической активности 149 альгобактериального комплекса в зависимости от концентрации

C11SO4 в модельных экспериментах по обрастанию образцов СаСОз

3.4.1.1. Идентификация компонентов в составе цианобактериального 149 сообщества.

3.4.1.2.Изучение динамики обрастания кубиков известняка с 153 помощью метода компьютерной обработки цифровых изображений.

3.4.1.3. Люминесцентная микроскопия клеток альгобактериального 156 комплекса

3.4.2. Изучение зависимости фотосинтетической активности 162 альгобактериального комплекса в зависимости от концентрации CUSO4 и РЬ(1ЧОз)г в модельных экспериментах по обрастанию образцов СаСОз.

3.4.3. Изучение устойчивости к высушиванию 166 альгоцианобактериальных биопленок, выделенных со стен памятников архитектуры с применением метода ЯМР-спиновое эхо.

3.5. Разработка схемы проведения комплексного исследования с целью 170 биодиагностики памятников истории и культуры

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методологические аспекты исследования микробиоты памятников истории и культуры"

Актуальность проблемы. Микробиологические исследования объектов культурного наследия ведутся активно в последние десятилетия, как в России, так и за рубежом. Это связано, в первую очередь, с процессами биоповреждения памятников истории и культуры, вызванными геохимической деятельностью микроорганизмов и их ферментативной активностью в каменной кладке и настенных росписях в исторических зданиях, музеях, церквях и монастырях, на поверхности мрамора скульптур, бумаги, пергамента и кожаных переплетов книг.

Задача таких исследований - микробиологическая диагностика памятников с целью последующей разработки программы по их сохранению. Для этого необходимо не только выделить, идентифицировать все компоненты микробного сообщества, включая бактерии, микроскопические грибы, микроводоросли, и определить их количественный состав, но также оценить их физиологическую активность, которая косвенно характеризует степень разрушающего влияния. При этом наиболее полные выводы можно сделать только при условии проведения большого количества измерений. В таком случае при отборе значительного количества проб материалов объекта возможно нанесение дополнительного ущерба памятнику. Следовательно, при проведении биомониторинга, прежде всего требуется применение неразрушающих методов исследования. Кроме того, в ходе диагностического исследования необходима оптимизация выбора места взятия проб, а также использование микробиологических методов, не требующих для анализа большого количества материала.

Следует отметить также, что в современных исследованиях микробиоты памятников архитектуры недостаточное внимание уделяется изучению геохимического состава материалов, что необходимо для адекватной оценки результатов микробиологических исследований и возможности их сравнения при изучении памятников, находящихся в разных макро- и микроэкологических условиях. В таких работах принимаются во внимание в основном климатические факторы, а также температура и относительная влажность воздуха в интерьерах исторических зданий [СатиГГо, 2003], при этом геохимические исследования памятников архитектуры геологами проводятся, главным образом, без микробиологического анализа. Для грамотной постановки модельных экспериментов также необходимо учитывать влияние факторов окружающей среды, которые вследствие конструктивных особенностей и географического положения исследуемых объектов могут быть разными.

В настоящее время микробиологические исследования памятников зачастую ограничиваются изучением только отдельных физиологических групп микроорганизмов: микромицетов [Кураков и др., 2004], актиномицетов в лаборатории Зеновой [Сомова и др., 1998], микроводорослей [John, 1988; Wee, 1991]. Проводилось также изучение микробного комплекса в целом, его количественный и качественный анализ, но только в произвольно отобранных пробах и с применением ограниченного числа методов, которые не относятся к категории «неразрушающих» [Сомова, 1999]. В результате в первом случае биодиагностика памятника является неполной, а во втором случае получают результат исследования не памятника в целом, а его отдельных произвольно выбранных участков.

Тем не менее, для точного выявления причин биоповреждения памятников необходимо вести микробиологический мониторинг, который требует анализа большого количества проб. С проблемой быстрой идентификации значительного биоразнообразия сталкиваются почвенные микробиологи (Добровольская, 1989). Решением этой проблемы в исследовании памятников архитектуры за рубежом служит зарекомендовавшие себя в последние годы молекулярно-биологические методы идентификации, в частности, секвенирование ДНК [Gonsales et.al., 1999, 2003; Rolleke et. al., 2003; Schabereiter et al., 2001; Schabereiter et al., 2002]. Данный метод позволяет отобрать большое количество микропроб со всей поверхности изучаемого объекта, быстро идентифицировать бактерии и микромицеты, обнаружить некультивируемые микроорганизмы, однако он не дает точной количественной оценки микробной контаминации. Однако, в молекулярно-биологических лабораториях не проводились работы по изучению физиологических особенностей идентифицированных штаммов микроорганизмов в зависимости от материала памятника, факторов окружающей среды, влияющих на архитектурные сооружения, а также условий хранения музейных ценностей, в частности, температурно-влажностного режима.

Большинство работ связано с изучением наружных стен, однако внутренние стены памятников архитектуры и музеев также подвержены процессам микробного воздействия. В этой связи важной характеристикой служит показатель количества микроорганизмов в воздухе помещений. До сих пор работы по количественным аэромикробиологическим исследованиям в музеях проводились в основном с применением седиментационного метода, то есть без проведения точного количественного анализа (Petushkova, Kandyba, 1986).

Крупнейшие зарубежные лаборатории, занимающиеся микробиологическими исследованиями исторических памятников, в качестве основных объектов исследования рассматривают памятники архитектуры [Bock, Sand, 1993; Urzi, 2002; Krumbein, 2003, реже - книги [Gallo et al. 1999]. При этом особенности микробиоты музейного археологического текстиля остаются практически не изученными.

Цель и задачи. Учитывая многофакторность исследований, необходимых для микробиологической диагностики памятников истории и культуры, целью данной работы явилась разработка комплексного методологического подхода к исследованию микробиоты памятников культуры. Для этого в работе были поставлены следующие задачи:

1. Анализ и разработка методов микробиологического исследования памятников, не требующих отбора большого количества материала, а также оптимизация методов отбора проб.

2. Сравнительный анализ и выбор методов для определения влияния факторов окружающей среды (элементный состав и влагосодержание материала, воздействие температурных перепадов) на физиологическую активность микроорганизмов в пробах памятников и, как следствие, на их разрушающую способность.

3. Сравнительное аэромикробиологическое исследование музейных помещений.

4. Постановка модельных экспериментов по изучению обрастания известняка альгобактериальными сообществами в зависимости от условий влажности, температуры и содержания солей тяжелых металлов.

5. Разработка схемы комплексного методологического подхода к изучению микробиоты памятников архитектуры.

Научная новизна. На основе разработанной схемы комплексного методологического подхода проведена биодиагностика памятников архитектуры и предметов археологической кожи и текстиля.

Впервые была проведено комплексное микробиологическое исследование археологического текстиля из погребений исторического некрополя Вознесенского собора музея Московского Кремля. Результаты секвенирования ДНК, кодирующей 16S рРНК, показали, что на коже и текстиле обнаружены бактерии Paenibacillus validus, Rhodococcus opacus, Bacillus luciferensis, Kitasatospora putterlickiae, Micrococcus luteus.

Впервые с применением импакционного метода для определения экологического состояния музейных помещений проведено сравнительное аэромикробиологическое исследование экспозиционных залов и фондохранилищ, характеризующихся разными условиями микроклимата.

Впервые проведены комплексные микробиологические и геохимические исследования памятников архитектуры и прикладного искусства. Изучение элементного состава проб и микробиоты позволило выявить устойчивые к тяжелым металлам микроорганизмы, оценить их функциональную активность непосредственно на памятнике. Впервые применены на памятниках методы изучения фотосинтетической активности (ФА), анализ элементного состава рентгено-флуоресцентным методом с параллельным применением оптической микроскопии. Это дало возможность определять степень физиологической активности локальных участков биопленок на поверхности объектов.

Впервые для определения площади биопоражения стен памятников, а также известняка в модельных экспериментах применена компьютерная обработка цифровых изображений, что позволяет вести изучение динамики обрастания камня альгоцианобактериальными биопленками и образования на нем патины вследствие жизнедеятельности микромицетов.

Научно-практическая значимость. Разработан и защищен патентом способ обнаружения микроорганизмов в каменной кладке, позволяющий определить очаги микробной контаминации по распределению влагосодержания в глубине этой кладки.

Разработанная схема комплексного методологического подхода дает возможность проводить микробиологический контроль в процессе реставрации и антимикробной обработки памятников, не нанося при этом ущерба материалу в виде многократного отбора большого количества проб.

В ходе работы были проведены микробиологические исследования памятников архитектуры музея-усадьбы «Архангельское», Ростовского и Рязанского Кремлей, Государственного музея изобразительных искусств им. А.С. Пушкина, Государственного Исторического музея, Новодевичьего монастыря, археологических предметов из текстиля и кожи музеев Московского Кремля и Государственного Исторического Музея, а также книг из библиотеки кн. Юсуповых музея-усадьбы «Архангельское». Полученные результаты послужили основой для осуществления последующих антимикробных обработок перечисленных памятников культуры. Основные положения и результаты работы по биодиагностике памятников архитектуры были включены в сборник методической документации в строительстве «Правила обследования зданий, сооружений и комплексов богослужебного и вспомогательного назначения».

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на следующих конференциях: 1 Мсжд. симпозиуме «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень, (Санкт-Петербург, 2002), 7th Intern. Symposium of World Heritage Cities. (Родес, Греция, 2003), Межд. научно-практич. симпозиуме «Природные условия строительства и сохранения храмов православной Руси» (г. Сергиев Посад, 2003), II Межд. симпозиуме «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень» (г. Санкт-Петербург, 2004), Забелинских научных чтениях Государственного Исторического музея (Москва, 2004), на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ (2005).

Заключение Диссертация по теме "Экология", Петушкова, Юлия Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован метод выбора мест отбора проб с целью получения достоверных результатов при минимальном повреждении памятника в ходе комплексного исследования и микробиологического мониторинга. Построены карты влагосодержания кирпичной и каменной кладки контактным методом на глубине 1 см и 4 см для наружных и внутренних стен исторических сооружений музея-усадьбы «Архангельское», Рязанского и Ростовского кремлей. Показано, что при влагосодержании кладки 5% и выше наблюдается интенсивное развитие хемолитотрофных и хемоорганотрофных бактерий, микромицетов в количестве от 103 и до 107- 108 КОЕ в 1 г пробы.

2. Изучение элементного состава проб позволило судить о степени устойчивости клеток бактерий и микроводорослей, развивающихся на материале памятников архитектуры Московского и Ярославского регионов. Показано, что фотосинтетическая активность обрастателей каменной кладки Дворца «Каприз» -микроводорослей р. Chlorella остается высокой (Fv/Fm составляла 0,30 - 0,47), несмотря на присутствие металлов Си и РЬ в концентрациях, превышающих 140 мкг/г пробы. Наиболее устойчивыми к воздействию меди и железа оказались бактерии, идентифицированные как Bacillus thuringiensis, Actinobacterium sp., Dyadobacter fermentens и Methylobacterium mesophilicum, причем последние выделены с участков стен, где отсутствовал рост микроводорослей.

3. В результате сравнительного аэромикробиологического исследования воздуха в витринах экспозиционных залов и в музейных помещениях, характеризующихся различными условиями температурно-влажностного режима, было обнаружено, что численность КОЕ микроорганизмов в 1 м3 колебалась в широких пределах (от 20 до 6000). На основе анализа результатов определены допустимые уровни загрязнения воздуха в музеях и возможные источники микробной контаминации без отбора проб материалов.

4. Впервые методом секвенирования ДНК, кодирующей 16S рРНК, были идентифицированы бактериальные штаммы Rhodococcus opacus, Bacillus luciferensis, Kitasatospora putterlickiae и Micrococcus lute us, выделенные с предметов археологического текстиля XVIIb. Государственного Музея «Московский

Кремль», и Paenibacillus validus, выделенные из кожи II-I в. до н.э. Государственного Исторического Музея.

5. Результаты модельных экспериментов по изучению обрастания известняка биопленками альгобактериальных сообществ (доминирующий фототрофный компонент — микроводоросли Chlorella vulgaris), выделенными с белокаменного цоколя Грота музея-усадьбы «Архангельское», показали пределы их устойчивости к влиянию различных условий влажности и воздействия сульфата меди. Методами люминесцентной микроскопии, компьютерной обработки цифровых изображений, измерения влагосодержания камня и ЯМР спиновое-эхо было установлено, что CuSC>4 в концентрациях до 6*10"8М не влияет на фотосинтетическую активность микроводорослей, их функциональное состояние и интенсивность обрастания ими известняка. Концентрации CuSÜ4 6*10~бМ и выше полностью подавляют физиологическую активность микроводорослей. При лиофильном высушивании микроводорослей на поверхности камня жизнеспособность клеток сохранялась, однако полное восстановление их фотосинтетической активности происходило при последующем длительном увлажнении только с появлением «свободной» воды, характеризующейся Тг около 70 мс.

6. В ходе проводимой работы была разработана схема комплексного методологического подхода к биодиагностике памятников архитектуры, на основе которой был исследован Дворец «Каприз» Музея-усадьбы «Архангельское».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петушкова, Юлия Алексеевна, Москва

1. Аксенов С.И. 1987. Особенности воздействия воды на состояние биологических структур. В кн. Торможение жизнедеятельности клеток под ред. Бекера М.Е., изд-во «Зинатне», Рига, с. 55-71.

2. Аксенов С.И., Николаев Г.М., Горячев С.Н. 1987. Изолированная подвижная вода как показатель устойчивости организмов к высушиванию. В кн. Торможение жизнедеятельности клеток под ред. Бекера М.Е., изд-во «Зинатне», Рига, с. 71-84.

3. Алекси-Месхишвили Л.Г. 1986. Микрофлора книгохранилищ Грузии. Сообщения АНГССР. Тбилиси. Т. 124, № 3. С. 609-611.

4. Андреева В.М. 1998. Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли, изд-во «Наука», Санкт-Петербург, 351 с.

5. Беррин Д. 1978. Спектроскопические методы. В кн. Методы практической биохимии под ред. Уильямса Б., Уилсона К., изд-во «Мир», Москва, с. 141184.

6. Билай В.И. 1980. Основы общей микологии, изд-во «Вища-школа», Киев, 360 с.

7. Буракова О.В. 2001. Иммуноферментный анализ. В кн. Практикум по иммунологии под ред. Кондратьевой И.А., Самуилова В.Д., изд-во МГУ, Москва, с. 69-82.

8. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Соболева H.A., Зотова Е.В. 2000. Иммуноферментная тест-система определения афлатоксина Bj. Прикладная биохимия и микробиология, 36,1, с.93-97.

9. Вартапетян А.Б. 1991. Полимеразная цепная реакция. Молекулярная биология, 25, с.926-936.

10. Воробейчиков Е.В. 1991. Совершенствование методов санитарно-бактериологического исследования воздуха закрытых помещений: Автореферат дисс.канд. мед. наук. СПб. 17 с.

11. П.Гарг Г.Н., Саньял Б., Пандей Г.Н. 1984. Микробиологическая коррозия металлов, вызываемая сульфатвосстанавливающими бактериями. В кн. Биоповреждения в строительстве под ред. Иванова Ф.М., Горшина С.Н., Стройиздат, Москва, с. 222-230.

12. Голлербах М.М., Косинская E.H., Полянский В.И. 1953. Синезеленые водоросли. Определитель пресноводных водорослей СССР, изд-во «Советская наука», Москва 651 с.

13. Горбушина A.A., Ляликова H.H., Власов Д.Ю., Хижняк Т.В. 2002. Микробные сообщества на мраморных памятниках Санкт-Петербурга и Москвы: видовой состав (разнообразие) и трофические взаимоотношения. Микробиология, 71,3, с. 1-9.

14. Горленко М.В. 1985. Экологические аспекты микодеструкции. В кн. Экологические основы защиты от биоповреждений под ред. Нюкши Ю.П. Изд-во «Наука», Москва, с. 32-35.

15. Грегори Ф. 1964. Микробиология атмосферы. 371 с.

16. Громов Б.В., Павленко Г.В. 1989. Экология бактерий. Учебное пособие. // Л., Изд-во ЛГУ., 248 с.

17. Гусев М,В., Минеева Л.А. 1985. Микробиология, изд-во МГУ, Москва, 376 с.

18. Добровольская Т.Г., Скворцова, Лысак Л.В. 1989. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий. Изд-во Московского университета, г. Москва, 72 с.

19. Дробеня В.В. 1930. Сравнительная характеристика методов определения бактериальной обсемененности воздуха. Гигиена и санитария. № 4. С. 34-36.

20. Загуляева З.Л. 1964. Микромицеты — разрушители бумаги и некоторые меры борьбы с ними. Автореф. дис. канд. биол. наук. Л. 18 с.

21. Звягинцев Л.И., Викторов А.М., 1989. Белый камень Подмосковья, изд-во «Недра», Москва, 118 с.

22. Игнаткин З.И. 1987. Сравнительная оценка прибора Кротова и чашечного импактора. Вопросы зоогигиены и ветеринарной санитарии при различных технологиях содержания животныхю М. С. 9-13.

23. Илялетдинов А.Н. 1984. Микробиологические превращения металлов, изд-во «Наука», Алма-Ата, 268 с.

24. Кашкин П.Н., Лисин B.B. 1983. Практическое руководство по медицинской микологии. Л. 180 с.

25. Кононов A.B. 1985. Оптимизация количественной оценки и зараженности фонда документов грибами. ЛКРД АН СССР. Л. Деп. в ВИНИТИ/25.12.85. №326-В-86.7 с.

26. Кротов Ю.А. 1953. Новый аппарат для микробиологических исследований воздуха. Гигиена и санитария. № 4. С. 11-15.

27. Лугаускас А.Ю., Золубас М.И. 1989. Микромицеты в окружающей человека среде: Микромицеты в пыли жилых помещений. Тр. АНЛитССР. Сер. В.Т. 4, № 108. С. 24-31.

28. Краткий определитель Берги. 1980. Под ред. Хоулта Дж., изд-во «Мир», Москва, 496 с.

29. Лугаускас А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. 1987. Каталог микромицетов-биодеструкторов полимерных материалов, изд-во «Наука», Москва 339 с.

30. Лысенко Н.Л. Особенности развития пресноводного водорослевого сообщества под влиянием меди. 1999. Альгология, 9,2, с.76.

31. Мантуровская Н.В., Сизова Т.П., Сараева В.М. 1987. Микробиологическое состояние воздуха хранилищ документов. Тезисы докл. III Всесоюз. конф. по биоповреждениям. М. 4.1. С. 30-31.

32. Мантуровская Н.В., Сизова Т.П., Сараева В.М. 1989. Микробиологическое состояние воздуха книгохранилищ ГБЛ как фактор обеспечения сохранности фондов. Тезисы докл. и сообщ. по итогам НИР ГБЛ за 1988 г. ГБЛ. М. С. 68-70.

33. Мецлер Д. 1980. Биохимия, изд-во «Мир», Москва.

34. Михайлюк Т.И. 1999. Водоросли обрастаний каменных субстратов с территории канаевского природного заповедника. Альгология, 9,2, с. 93-94.

35. Немыря В.И., Влодавец В.В. 1979. Охрана окружающей среды от выбросов предприятий микробиологической промышленности. М. 142 с.

36. Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М. 1985. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Изд-во «Наукова думка», Киев, 336 с.

37. Николаев Г.М., Тропин И.В., Горячев С.Н. 2002. Изменение состояния воды в талломе макроводоросли Ascophyllum nodosum при действии отрицательных температур. Физиология растений, 49, 2, с. 1-9.

38. Нюкша Ю.П. 1954. К вопросу о гигиеническом состоянии воздуха книгохранилищ // Опыт работы Гос. Публичной библиотеки им. М.Е. Салтыкова-Щедрина: Сб. ст. / ГПБ. JI., Вып. 9. С. 3-15.

39. Нюкша Ю.П. 1983. Особенности формирования микрофлоры бумаги, находящейся в организованном хранении // Актуальные вопросы биоповреждений. JL, С. 102-128.

40. Определитель бактерий Берджи. 1997. девятое издание под ред. Хоулта Д, крига Н., Снита П., Стейли Д., Уилльямса С., изд-во «Мир», Москва.

41. Петушкова Ю.П., Кандыба П.Е. 1998. Новые технологии для микробиологического контроля и оздоровления воздуха в музейных помещениях // Материальная база сферы культуры. Вып. 1. 46-55.

42. Поглазова М.Н., Мицкевич И.Н. 1984. Применение флуорескамина для определения количества микроорганизмов в морской воде эпифлуоресцентным методом. Микробиология, 5, с. 850-858.

43. Прозоровский C.B., Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995. Медицинская микоплазмология, изд-во «Медицина», Москва, 288 с.

44. Профилактика биоповреждений библиотечных фондов: Методические рекомендации. 1987. Сост.: З.П. Дворяшина, Н.В. Мантуровская. М. 40с.

45. Ребрикова H.JI. 1999. Биология в реставрации, РИО ГосНИИР, Москва,184 с.

46. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Гусев М.В. 2001. Микроводоросли и цианобактерии: устойчивость к действию тяжелых металлов. Вестн. Моск. Ун-та. СерЛб. Биология, 3, с. 14-21.

47. Семенов A.M., Шаталов A.A. 2002. Флуоресцентно-микроскопические методы учета микроорганизмов в экологических исследованиях, МАКС-Пресс, Москва, 22 с.

48. Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. 1985. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы. Успехи микробиологии, 20 с. 227-248.

49. Сергеева JI.E. 1990. Определение заспоренности воздуха в книгохранилищах. Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов'. Сб. ст. Вильнюс. С. 152-156.

50. Сергеева JI.E. 1992. Сравнительный анализ экологического состояния книгохранилищ Российской национальной библиотеки. Теория и практика сохранения книг в библиотеке. JI. Вып. 16. С. 32-49.

51. Смит Д. 1981. Значение воды для микроорганизмов в природе. В кн.: Жизнь микробов в экстремальных условиях под ред. Кашнера Д., Москва, Изд-во «Мир», с.426-440.

52. Сомова Н.Г. 1999. Структура микробных сообществ, развивающихся на поверхности каменных памятников архитектуры. Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 27 с.

53. Сомова Н.Г., Добровольская Т.Г., Зенова Г.М., Ивановский Р.Н. 1998. Микробное заселение поверхности каменных строений: синэкологический анализ. Микробиология, 67,5, с. 687-693.

54. Турьянский А.Г., Виноградов A.B., Пиршин И.В. 1999. ПТЭ, № 1. с.105-111.

55. Тюрин Ю.Н., Макаров A.A. 1997. Статистический анализ данных на компьютере. М.

56. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Трдатян И.Ю., Райнина Е.И. 1987. Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии. Прикладная биохимия и микробиология, 23,1, с. 14-24.

57. Фаррар Т., Беккер Э., 1973. Импульсная и Фурье-спектрометрия ЯМР. Изд-во «Мир», Москва, 162 с.

58. Хзмалян В.В. 1956. Микроорганизмы книжного фонда Матенадарана Армянской ССР и разработка мероприятий по борьбе с ними .Автореф. дис. канд. биол. наук. Ереван. 21 с.

59. Чернова О.А. 1997. Биохимические аспекты патогенеза при персистенции микоплазму человека. Днсс. на соиск. уч. ст. доктора бнол. наук.

60. Экология микроорганизмов. Учеб. для студ. вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.Г. Горленко и др.; под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2004. -272 с.

61. Эрлих X. 1981. Жизнь микробов в присутствии тяжелых металлов, мышьяка и сурьмы. В кн. Жизнь микробов в экстремальных условиях под ред. Кашнера Д. изд-во «Мир», Москва, с. 440-469.

62. Языкина Е.В., Жердев А.В., Еремин С.А., Попова В.А., Дзантиев Б.Б. 2002. Разработка иммуноферментных методов определения гербицида хлорсульфурона. Прикладная биохимия и микробиология, 38,1, с. 14-19.

63. Ярных B.C., Игнаткин В.М. 1981. Сравнительная оценка воздухоотборников для микробиологического анализа воздуха. Труды ВНИИВС. JI. С. 138-144.

64. Alvarez J.C., Casto J.F. 1952. Quantitative studies of airborne fungi of Gavana in each of the twenty four hours of the day. J. Allergy. Vol. 23, № 3. P. 259-264.

65. Arai H. 1987. On the foxing-causing fungi. Preprints of the 8th Triennial ICOM Meeting, ICOM CC, Sydney, p. 1165-1167.

66. Arino X., Saiz-Jimenez C. 1996. Colonization and deterioration processes in Roman mortars by cyanobacteria, algae and lichens. Aerobiologia, 12,1, p. 9-18.

67. Baer, N.S., C. Sabbioni, and A.I. Sors. 1991. Science, Technology and European Cultural Heritage. London: Butterworth.

68. Barranguet, С., E. Charantoni, M. Plans, and W. Admiraal. 2000. Short-term response of monospecific and natural algal biofilms to copper exposure. Eur. J. Phycol. 35:397-406.

69. Barranguet, C., M. Plans, E. Van der Grinten, J. J. Sinke, and W. Admiraal. 2002. Development of photosynthesis biofilms affected by dissolved and sorbed copper in a eutrophic river. Environ. Toxicol. Client. 21:1955-1965.

70. Bartosch S, Mansch R, Knotzsch K, Bock E. 2003. CTC staining and counting of actively respiring bacteria in natural stone using confocal laser scanning microscopy. J Microbiol Methods. 52(l):75-84.

71. Bathke L., Rhiel E., Krumbein W. E. and Marquardt J. 1999. Biochemical and Immunochemical Investigations on the Light-Harvesting System of the Cryptophyte Rhodomonas sp.: Evidence for a Photosystem I Specific Antenna, Plant Biol, 1, p.516-523.

72. Bashan, V, and R. Lifshitz. 1984. Foxing in stamps: Long-term effects of sterilization and treatment with NaCL System. Appl. Microbiol. 5:564-569.

73. Bassi, M., and D. Chiatante. 1976. The role of pigeon excrement in the stone deteriorarion. Intl.Biodet. 12:73-79.

74. Bassi, M., A. Ferrari, M. Realini, and C. Sorlini. 1986. Red stains on the Certosa of Pavia. A case of biodeterioration. Intl Biodet. 22:201-205.

75. Bergey's manual of systematic bacteriology. 2001. Boone D.R., Castenholz R.W. (Eds) V.l. p. 64.

76. Berthelin J. 1985. Microbial leaching of metals from rocks. In: Biogeotechnology of metals. Proc. of Intern. Seminar and Intern. Training Course. Moscow. P. 157174.

77. Blanchette, R.A., K.R. Cease, A. Abad, R.J. Koestler, E. Simpson, and G.K. Sams. 1991. An evaluation of different forms of deterioration found in archaeological wood. Int. Biodet. 28:3-22.

78. Blanchette, R.A., and C.G. Shaw. 1978. Associations among bacteria, yeasts and basidiomycetes during wood decay. Phytopathology 68:631-637.

79. Bock E., Sand W. 1993. The microbiology of masonry biodeterioration. Journal of Applied Bacteriology, 74, p. 503-514.

80. Brimblecombe, P. 1989. The Big Smoke. London: Routledge.

81. Brock, T.D. 1989. The study of microorganisms in situ. Progress and problems. In: Ecology of Microbial Communities, 41st Symposium of the Society for General Microbiology, pp. 1-17. Cambridge: Cambridge Univ. Press.

82. Camuffo D. 2003. Thermodynamics for Cultural Heritage. Proc. of Eur. Pract. School, Science and Materials of the Cultural Heritage. Ravello. pp. 1-51.

83. Cardone P., Breccia S., Di Bonaventura M.P., Di Nardo S., Cacchio P., Lepidi A. 1997. Fractal analysis of monument surfaces to diagnose biological degradation. Proc. XIII Intern. Symp. on Environ. Biogeochemistry. Monopoli. P.195.

84. Ciferri O. 1999. Microbial Degradation of Paintings. Appl. Environ. Microbiol. 65 (3), p. 879-885.

85. Costerton, J.W., G.G. Geesey, and PA. Jones. 1988. Bacterial biofilms in relation to internal corrosion monitoring and biocide strategies. Mater. Perf pp. 49-53.

86. Crispim C.A., Gaylarde C.C. 2005. Cyanobacteria and biodeterioration of cultural heritage: a review. Microb Ecol. 49(1): 1-9.

87. Crispim CA, Gaylarde PM, Gaylarde CC. 2003. Algal and cyanobacterial biofilms on calcareous historic buildings. Curr Microbiol. 46(2): 79-82.

88. Curri S.B. 1979. Microbiological aspects of weathering of the Caryatids. Biochenu Exp. Biol 15. P. 293-297.

89. Danin, A., and G. Caneva. 1990. Deterioration of limestone walls in Jerusalem and marble monuments in Rome caused by cyanobacteria and cyanophilous lichens. Intl. Biodet. 26: 397-417.

90. Decrouez, D., J. Chamay, and F. Zezza. 1992. The Conservation of Monuments in the Mediterranean Basin. Geneva: Musee d'art et d'historié, 519 pp.

91. Dornieden T., Gorbushina A. A. and Krumbein W. E. 2000. Biodecay of mural paintings and stone monuments as a space/time related ecological situation an evaluation of a series, Int. Biodeterioration & Biodégradation 46, p.261-270.

92. Eckhardt, F.E.W. 1985. Solubilization, transport, and deposition of mineral cations by microorganisms Efficient rock weathering agents. In: The Chemistry of Weathering, vol. 149, ed. J. Drever, pp. 161-173. Dordrecht: D. Reidel Publ. Co.

93. Ehrlich, H.L. 1990. Geomicrobiology. 2nd ed. New York: Makel Dekker.

94. Ellis R.J., Morgan P., Weighman A.J., Fry J.C. 2003. Cultivation-dependent and -independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil. Appl Environ Microbiol. 2003 Jun; 69(6): 3223-30.

95. Fermor, T.R., and H.O.W. Eggins. 1981. The use of actinomycetes in textile biocide testing. Intl. Biodet. 17:15-17.

96. Ferris, M. J., and D. M. Ward. 1997. Seasonal distributions of dominant 16S rRNA-defined populations in a hot spring microbial mat examined by denaturing gradient gel electrophoresis. ,4/7/7/. Environ. Microbiol. 63:1375-1381.

97. Ford, T.E., J.S. Maki, and R. Mitchell. 1988. Involvement of bacterial exopolymers in biodeteriorarion of metals. In: Biodeterioration, vol. 7, ed. R. N. Houghton, R.N. Smith, and H.O.W. Eggins, pp. 378-384. London: Elsevier.

98. Fowler, J., L. Cohen, and P. Jarvis. 1998. Practical statistics for field biology. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, United Kingdom.

99. Fluckiger B., Koller Th., Monn Ch. 1998. Comparison of airoborne spore concentration and fungal allergen content. 6th international congress on aerobiology, Italy, Perugia.

100. Gallo, F. 1976. Esperienze nel campo della disinfezione e disinfestazione del materials librario. Bollettino delVIstituto Centrale per la Patologia del Libro 34:5394.

101. Gallo, F., and A. Strzelczyk. 1971. Indagine preliminare sulle alterazioni microbiche della pergamena. Bollettino delVIstituto Centrale per la Patologia del Libro 30:71-87.

102. Gallo F. 1993. Aerobiological Research and Problems in Libraries. Aerobiology, 9, №2-3, p. 117-130.

103. Gandjar J., Adbis D.N., Wargasasmita S. 1989. Moulds isolated from old archive materials in Indinesia. J. Appl. Microbiol, a. Biotechnol. Vol. 5, № 3. P. 384-389.

104. Gerdes G., Krumbein W. E., Lellau T. and Rullkotter J. 1999. Microbially mediated orange patination of rock surfaces. Ancient Biomolecules, 3, p.51-65.

105. Gehrmann, C., Krumbein W.E., Petersen K. 1988. Lichen weathering activities on mineral and rock surfaces. Stud. Geobot. 8:33-45.

106. Gehrmann, C., Krumbein W.E. 1994. Interaction between epilithic and endolithic lichens and carbonate rocks. In: The conservation of monuments in the Mediterranean Basin. Proceedings of the 3 Int. Symp. Venice, 22-25 June 1994. P. 311-316.

107. Gilbert P, Maira-Litran T, McBain AJ, Rickard AH, Whyte FW 2002. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Adv Microb Physiol. 46:202-256.

108. Gonzalez I, Laiz L, Hermosin B, Caballero B, Incerti C, Saiz-Jimenez C. 1999. Bacteria isolated from rock art paintings: the case of Atlanterra shelter (south Spain). J. Microbiol Methods. 36 (1-2). pp. 123-127.

109. Gonzalez JM, Saiz-Jimenez C. 2003. Optical thermal cycler for use as a fluorimetric plate reader to estimate DNA concentrations. Biotechniques. 34(4):710-712.

110. Gonzalez J.M., Saiz-Ji menez C. 2004. Microbial diversity in biodeteriorated monuments as studied by denaturing gradient gel electrophoresis. J Sep Sei, 27(3): 174-180.

111. Gorbushina A. A. and Krumbein W. E. 2000. Rock dwelling fungal communities: Diversity of Life Styles and Colony Structure, In Journey to Diverse Microbial Worlds, p.317-334, edited by Seckbach, J., Kluwer Academic Publishers, Amsterdam.

112. Groth I., Vettermann R., Schumann P., Saiz-Jimenez C. 1997. Actinomycetes in caves and hypogean environments. Proc. XIII Intern. Symp. on Environ. Biogeochemistry. Monopoli. P. 194.

113. Groth I, Vettermann R, Schuetze B, Schumann P, Saiz-Jimenez C. 1999. Actinomycetes in Karstic caves of northern Spain (Altamira and Tito Bustillo). J Microbiol Methods. 36(1-2): 115-122.

114. Heid A., Stevens J., Livak K.J., Williams P. 1996. Real time Quantitative PCR, Genom research, 6, p. 986-994.

115. Hirsch P., Eckhardt F.E.W., Halmer R.J. 1995. Methods for the study of rock-inhabiting microorganisms A mini review. Journal of Microbiological Methods, 23, p. 143-167.

116. Hopkins D.W., Lawson Т., Jan away R.C. 1997. Interaction of soil microbial community with buried archaeological remains. Proc. XIII Intern. Symp. on Environ. Biogeochemistry. Monopoli. P.196.

117. Horton P., Bowyer J.R. год Chlorophill Fluorescence Transients, in Methods in Plant Biochemistry, ed. by Harwood J.I., Bower J.R., pp. 259-296.

118. Hughes KA, Lawley B. 2003. A novel Antarctic microbial endolithic community within gypsum crusts. Environ Microbiology. 5(7): 555-565.

119. Hust M., Krumbein W. E. and Rhiel E. 1999. An immunochemical approach to detect adaptation processes in the photosynthetic apparatus of diatoms of the Wadden Sea sediment surface layers, Microbiol. Methods, 38, p.69-80.

120. Icenhour C.R., Levetin E. 1997. Penicillum and Aspergillus spesies in the habitats of allergy patients in the Tulsa, Oklahoma area. Aerobiologia, 13, 161166.

121. Inoue, M., and M. Koyano. 1991. Fungal contamination of oil paintings in Japan. Intl. Biodet. 28:23-35.

122. Isabelle Itemanl, Rosmarie Rippkal, Nicole Tandeau de Marsacl and Michael Herdmanl 2000. Comparison of conserved structural and regulatory domains within divergent 16S rRNA-23S rRNA spacer sequences of cyanobacteria. Microbiology 146,1275-1286

123. Janssen M., Bathke L., Marquardt J., Krumbein W. E. and Rhiel E. 2001. Changes in the photosynthetic apparatus of diatoms in response to low and high light intensities, International Microbiology, 4, p.27-33.

124. John, D.M. 1988. Algal growths on buildings: A general review and methods of treatment. Biodet. Abst. 2:81-102.

125. Koestler, R.J., and J. Vedral. 1991. Biodeterioration of cultural property: A Bibliography. Intl. Biodeterioration, 28:229-340.

126. Konopka A., Zakharova T., Bischoff M., Oliver L., Nakatsu C., Turco R.F. Microbial Biomass and Activity in Lead-Contaminated Soil. 1999. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 65, No. 5., p. 2256-2259.

127. Kowalik R., Sadurska I. 1956. Mikroflora niszczaca paoier, spore I pieczecie woskowe, wystepyjaca w powietrzu magazinow archivalnych, Acta Microbiol., Vol. 5, № 2. S. 277-284.

128. Kowalik, R. 1980. Decomposition of parchment by microorganisms. Restaurator 4:200-207.

129. Knorre H. and Krumbein W. E. 2000. Bacterial calcification, In Microbial Sediments, p.25-31, edited by Riding, R. E. and Awramik, S.M., Springer-Verlag Berlin, 331p.

130. Kramer D.M., Robinson H. R. Crofrs A.R. 1990. A Portable Multi-Flash Fluorometer for Measurment of Donor and Acceptor Reactions of Photo system 2 in Leaves of Intact Plants Under Field Conditions. Photosynth. Res., 26 pp. 181193.

131. Kramer G., Kainka E., Wildfuhr W. 1998. Investigations according to mould fungi in the indoor area and exponates of a castle museum in Saxonia. 6th international congress on aerobiology, Perugia. P. 271.

132. Krumbein, W.E. 1983. Microbial Geochemistry. Oxford: Blackwell.

133. Krumbein, W.E. 1988. Microbial interactions with mineral materials. In: Biodeterioration, vol.7, ed. D.R. Houghton, R.N. Smith, and H.O.W. Eggins, pp. 78-100. London: Elsevier.

134. Krumbein, W.E., and K. Jens. 1981. Biogenic rock varnishes of the Negev Desert (Israel): An ecologiql study of iron and manganese transformation by cyanobacteria and fungi. Oecologia 50:25-38.

135. Krumbein, W.E., C. Urzi, and C. Gehrmann. 1991. On the Biocorrosion and Biodeterioration of Antique and Mediaeval Glass. Geomicrobiol. J. 9:139-160.

136. Krumbein W. E. and Gorbushina A. A. 2003. Damage Assessment -Conservation Restoration Biofilms - Patina - Bioreceptivity - Biodeterioration State of the Art, Prag Proceedings.

137. Krumbein W. E. and Gorbushina A. A. 1995. Organic pollution and rock decay. In: Proc. of the 1995 LCP Congress. Preservation and Restoration of Cultural Heritage. Montreux. P. 277-284.

138. Laborda F., Ortiz L., Arroyo I. 1994. Microbiological study carried out on the roman aqueduct at Segovia (Spain). In: The conservation of monuments in the Mediterranean Basin. Proceedings of the 3 Int. Symp. Venice, 22-25 June 1994. P. 359-363.

139. Laiz L, Groth I, Gonzalez I, Saiz-Jimenez C. 1999. Microbiological study of the dripping waters in Altamira cave (Santillana del Mar, Spain). J Microbiol Methods. 36(1-2): 129-138.

140. Laiz L, Groth I, Schumann P, Zezza F, Felske A, Hermosin B, Saiz-Jimenez C. 2000. Microbiology of the stalactites from Grotta dei Cervi, Porto Badisco, Italy. Int Microbiol. 3(l):25-30.

141. Laiz L., Pinar G., Lubitz W., Saz-Jimenez C. 2003. Monitoring the colonization of monuments by bacteria: cultivation versus molecular methods. Environ Microbiology, 5(l):72-74.

142. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. 2002. Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, No. 3, Vol. 66, p. 506-577.

143. Lyalikova N.N., Petushkova Y.P. 1991. Role of Microorganisms in the Weathering of Minerals in Building Stone of Historical Buildings. Geomicrobiology Journal, 9, p. 91-101.

144. Maggi O., Persiani A.M., Gallo F., Valenti P. 1998. Airborne fungal sporeslitin dusts present in archives: proposal for a new detection method. 6 international congress on aerobiology, Perugia. P. 270.

145. Mays S, Fysh E, Taylor GM. 2002. Investigation of the link between visceral surface rib lesions and tuberculosis in a Medieval skeletal series from England using ancient DNA./lm JPhys Anthropol. Sep; 119 (l):27-36.

146. Matheson V G., Munakata-Marr J., Hopkins G.D., McCarty P.L., Tiedje J.M., Forney L.G. 1997. A novel means to develop strain-specific DNA probes for detecting bacteria in the environment. Appl. Environ Microbiol. 63 (7). p. 28632869.

147. Meyer T., Hust M., Marquardt J., Krumbein W. E. and Rhiel E. 2003. A methodological approach to investigate steady state fucoxanthin chlorophyll a/c binding protein mRNA levels in Wadden Sea sediments. Int. Microbiol. 6, p.33-39.

148. Montacutelli R., Maggi O., Tarsitani G., Gabrielli N. 1998. Aerobiological monitoring of "Sistine Chapel". Airbone bacteria and microfungi trends. 6th international congress on aerobiology, Perugia, p. 264.

149. Monte M., Ferrari R. 1998. Airborne microorganisms in subterranean archaeological area of the basilica of san Lorenzo in Lucina (Rome). 6th international congress on aerobiology, Perugia. P. 266.

150. Morring K.Z. 1983. Sampling for airborne fungi: A statistical comparison of media, Amer. Industr. Hyg. Ass. Journal, Vol. 44, № 9. P. 662-664.

151. Noffke N. and Krumbein W. E. 1999. A quantitative approach to sedimentary surface structures contoured by the interplay of microbial colonization and physical dynamics. Sedimentology, 46, p.417-426.

152. Newton, R., and S. Davison. 1989. Conservation of Glass. London: Butterworth.

153. Nicol G.W., Glover L.A., Prosser J.I. Spatial analysis of archaeal community structure in grassland soil. Appl Environ Microbiol. 2003 Dec;69(12):7420-9.

154. Nimis, P.L., D. Pinna, and O. Salvadori. 1992. Licheni e Conservazione dei monumenti. Bologna: CLUEB.

155. Nimis, RL., and L. Zappa. 1988.1 licheni endolitlici calcicoli su monumenti nell'area archeologica di Fiesole. Stud. Geobot. 8:125-133.

156. Nugari, M.R, G.F. Priori, D. Mate, and F. Scala. 1987. Fungicides for Use on Textiles Employed during the Restoration of Works of Art. Intl Biodet. 23:295306.

157. Nugari M.P., Roccardi A. 1998. Aerobiological investigation to project and check the interventions for conservation of works of art. 6th international congress on aerobiology, Perugia. P. 267.

158. Ogren E., Baker N.R. 1985. Evaluation of a Technique for the Measurement of Chlorophyll Fluorescence from Leaves Exposed to Continuous White Light. Plant Cell Environ., 8, pp. 539-547.

159. Ortega-Morales O, Guezennec J, Hernandez-Duque G, Gaylarde CC, Gaylarde PM. 2000. Phototrophic biofilms on ancient Mayan buildings in Yucatan, Mexico. Curr Microbiol. 40(2):81-5.

160. Paine, S.G., F.V. Linggood, F. Schimmer, and T.C. Thrupp. 1933. The relationship of microorganisms to the decay of stone. Phil. Trans. Roy. Soc. London B 222:97-127.

161. Petushkova J., Kandyba P. 1999. Aeromicrobiological studies in the Moscow cathedrals. Aeromicrobiologia, 15, pp. 193-201.

162. Petushkova J., Koestler R. J. 1996. Biodeterioration studies on parchment and leather attacked by bacteria in the commonwealth of socialist States. In: International Conference on Conservation and Restoration of Archival and Library

163. Materials (Erice, 22nd-29th April 1996). Ed. C. Federici & P. Munafo. Roma, p. 195-211.

164. Petushkova J., Lyalikova N. 1993. The microbial deterioration of historical buildings and mural painting, in Recent Advances in Biodeterioration and Biodégradation (Ed. by Garg K.L., Garg N., Mukerji K.G.). p. 145-171.

165. PetushkovaYu.P., Nikolaev G.M. 1983. Nuclear Magnetic Resonance Study of Parchment and Leather. Restaurator, 5, p. 242-248.

166. Pinar G., Gurtner C., Lubitz W., Rolleke S. 2001. Identification of archaea in objects of art by denaturing gradient gel electrophoresis analysis and shotgun cloning. In Methods Enzymol. 336:356-66.

167. Phung N.T., Lee J., Kang K.H., Chang I.S., Gadd G.M., Kim B.H. 2004. Analysis of microbial diversity in oligotrophic microbial fuel cells using 16S rDNA sequences. FEMS Microbial Letters. 233(l):77-82.

168. Pochon, J., and C. Jaton. 1968. Facteurs biologiques de l'altération des pierres. In: Biodeterioration of Materials, vol. I, ed. A.H. Walters and J.J. Elphick, pp.258-268. Amsterdam: Elsevier.

169. Pochon, J., and C. Jaton. 1975. Aspects microbiologiques de l'altération sur les calcaires. In:.La maladie de la pierre, pp. 48. Paris: Les monuments historiques de la France.

170. Polacheck, I., I.E Salkin, D. Schenav, L. Ofer, M. Maggen, and J.H. Haines. 1989. Damage to an ancient parchment document by Aspergillus. Mycopathologia 106:89-93.

171. Pitt J.I. 1979. The Genus Pénicillium and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces. London et al., 634 s.

172. Prieto B., Silva B., Lantes O. 2004. Biofilm quantification on stone surfaces: comparison of various methods. Sci Total Environ. 333 (l-3):l-7.

173. Rapper K.B., Fennel D.C., Austwick P.K. 1985. The genus Aspergillus. Baltimore, 686 p.

174. Rapper K.B., Thorn Ch. A. 1949. A manual of the Pénicillium. Baltimore, 817p.

175. Rasehle, P. 1989. Microbial influence on cellulosic textiles and microbiological testing, Intl. Biodeterioration. 25:237-244.

176. Ricci S., Pietrini A.M. 1994. Characterization of the microfloral algae present on the Fontain of Four Rivers, Rome. In: The conservation of monuments in the Mediterranean Basin. Proceedings of the 3 Int. Symp. Venice, 22-25 June 1994. P. 353-357.

177. Rolleke S. 1997. Identification of Microorganisms in Biodeterioration Process Using Molecular Biological Means. "Biotechnology and Preservation of Cultural Artifacts", Italy, Torino.

178. Romao P.M. 1994. Understanding lichens colonization on granitic substrata. In: Proc. of the 1995 LCP Congress. Preservation and Restoration of Cultural Heritage. Montreux. P. 303-310.

179. Saiz-Jimenez C. 1997. Biogeochemistry of weathering processes in monuments. Proc. XIII Intern. Symp. on Environ. Biogeochemistry. Monopoli. P.189.

180. Salvadori O. 1997. Microbiological and Strumental Techniques in the study of Biodeteriogens. "Biotechnology and Preservation of Cultural Artifacts", Italy, Torino.

181. Sand W., Bock E. 1991. Biodeterioration of mineral materials by microorganisms: biogenic sulfuric and nitric acid corrosion of concrete and natural stone. Geomicrobiology Journal.9,129. p.138.

182. Schreiber U. 1986. Detection of rapid induction kinetics with a new type of high-frequency modulated chlorophyll fluorometer. Photosynth. Res., 9, pp. 261272.

183. Schreiber U., Neubauer C.,Klughammer C. 1988. New ways of assessing photosynthetic activity with a Pulse Modulation Fluorometer. Applications of chlorophyllfluorescene, edited by Lichtenthaler H.K., Amsterdam, Kluwer, p. 6369.

184. Schreiber U., Schliwa U., Bilger W. 1986. Continuous Recording of Photochemical and Non Photochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching with a New Type of Modulation Fluorometer. Photosynth. Res., 10, pp. 51-62.

185. Schabereiter-Gurtner C., Pinar G., Vydral D., Lubitz W, Rolleke S. Rubrobacter-related bacteria associated with rosy discolouration of masonry and lime wall paintings. Arch Microbiol. 2001 Nov; 176(5):347-54.

186. Schabereiter-Gurtner C., Saiz-Jimenez C., Pinar G., Lubitz W., Rolleke S. 2002. Altamira cave Paleolithic paintings harbor partly unknown bacterial communities. FEMS Microbiol. Letters 211(1):7-11.

187. Schabereiter-Gurtner C., Saiz-Jimenez C., Pinar G., Lubitz W., Rolleke S. 2001. An advanced molecular strategy to identify bacterial communities on art objects. J. Microbiol Methods. 45(2):77-87.

188. Segre A. L., Proietti N. 1999. The Paper as Observed by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. International journal on the history and conservation of the book, 1,1, pp. 179-192.

189. Shi W., Becker J., Bischoff M., Turco R.F., Konopka A. E. 2002. Association of Microbial Community Composition and Activity with Lead, Chromium, and Hydrocarbon Contamination Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, No. 8. p. 3859-3866.

190. Soriano s., Walker N. 1968. Isolation of ammonia-oxidizing autotrophic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 31. p. 491-497.

191. Sorlini, C., M. Sacchi, and A. Ferrari. 1987. Microbiological deteriorationof Ganibara's frescoes exposed to open air in Brescia, Italy. Intl. Biodeterioration. 23:167-179.

192. Staib F. 1979. Zur Bekamfung von Aspergillus fumigatus infection wahrend des Klinika unterhalts. Off. Gesundheitswesen. Bd. 41, № 11. S. 111.

193. Sterflinger, K. 1993. In situ respiratory rate measurements. Univ. of Oldenburg: MSci. Thesis.

194. Sterflinger K., Krumbein W. E. 1995. Precision replicas of microbially contaminated surfaces for optical and SEM-analyses. Journal of microbiological methods, 23, p. 301-308.

195. Sterflinger K., Krumbein W. E. and Rullkotter J. 1999. Patination of marbles, sandstone and granite by microbial communities. Z. dt. geol. Ges., 150, p.299-311.

196. Strzelczyk, A.B., J. Kuroczkin, and W.E. Krumbein. 1987. Studies on the microbial degradation of ancient leather bookbindings, part I. Intl. Biodeterioration. 23:3-27.

197. Strzelczyk, A.B., J. Kuroczkin, and W.E. Krumbein. 1989. Studies on the microbial degradation of ancient leather bookbindings, part II. Int. Biodeterioration, 25:39-47.

198. Suhara H., Maekawa N., Kubayashi T., Sakai K., Kondo R. 2002. Identification of the basidiomycetous fungus isolated from butt rot of the Japanese cypress. Mycoscience, 43, p. 477-481.

199. Tonolo A., Giacobini C. 1963. Microbiological changes of frescoes. In: Recent advances in Conservation. Ed. G. Thomson. Butterworths, London. P. 6264.

200. Urzi C7 1998. Airborne fungal spores connected with marble colonization• fh monitored in the terrace of Messina museum. 6 international congress onaerobiology, Perugia. P. 273.

201. Urzi C., Krumbein W.E. 1994. Microbial Impacts on the Cultural Heritage. Durability and Change. The Science, Responsibility, and Cost of Sustaining Cultural Heritage/ Ed. W.E.Krumbein et al.

202. Urzi C, De Leo F. 2001. Sampling with adhesive tape strips: an easy and rapid method to monitor microbial colonization on monument surfaces. J Microbiol Methods. 44(1):1-11.

203. Valentin N., Lidstrom M., Preusser F. 1990. Microbial control by low oxygen and low relative humidity environment. Study in Conservation. 35. pp. 222230.

204. Ventosa F., Nieto J.J., Oren A. 1998. Biology of Moderately Halophilic Aerobic Bacteria. Microbiol Mol Biol Rev, June, Vol. 62, No. 2. p. 504-544.

205. Vishniac W., Santer M. 1957. The thiobacilli. Bacteriol. Rev. 21. p. 195-213.

206. Vollu RE, dos Santos SC, Seldin L. 2003. 16S rDNA targeted PCR for the detection of Paenibacillus macerans. LettAppl Microbiol.;37(5):415-420.

207. Walters A.H. 1971 Microbiological and applied aspects of biodeterioration. Prog. Ind. Microbiol. 10. pp. 179-218.

208. Wanner 0.1989. Modeling Population Dynamics. Structure andfunction of biofilms. Ed. by Characklis W.G., Wilderer P.A., Dahlem Konferenzen, pp. 91110.

209. Ward J.H. 1963. Herardical grouping to optimize an objective function. J. of the American Statistical Association. 58. p. 236.

210. Watson, G. H., and W. B. Bollen. 1952. Effect of copper sulphate weed treatment on bacteria in lake bottoms. Ecology 33:522-529.

211. Wee Y.C. 1988. Growth of algae on exterior painted masonry surfaces. International biodeterioration, 24, p. 113-117.

212. Yu-Hsiu Chang, Yung-Hui Shangkuan, Hung-Chi Lin, Hwan-Wun Liu. 2003. PCR Assay of the groEL Gene for Detection and Differentiation of Bacillus cereus Group Cells. Appl. Environ Microbiol. 69 (8). p. 4502-4510.

213. Zagulyaeva Z.A. 1968. Biological stability of papers of various compositions. In: Preservation of Documents and Papers. Ed. D.M. Flyak. Jerusalem, pp. 32-53.