Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метанобразующие археи в многолетнемерзлых отложениях

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Метанобразующие археи в многолетнемерзлых отложениях"

На правах рукописи

КРИВУШИН Кирилл Владимирович

МЕТАНОБРАЗУЮЩИЕ АРХЕИ В МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004615627 -2 ДЕН 2010

МОСКВА - 2010

004615627

Работа выполнена в лаборатории криологии почв Учреждения Российской академии наук Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: кандидат геолого-минералогических наук

Ривкина Елизавета Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Умаров Марат Мутагарович

кандидат биологических наук Евдокимов Илья Витальевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Защита состоится 14 декабря 2010 г. в 15 часов 30 мин. в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 при МГУ имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» ноября 2010 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по вышеуказанному адресу.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Г.М. Зенова

Актуальность темы. Исследования последних десятилетий показали, что низкотемпературные экосистемы играют важную роль в формировании климата Земли и балансе парниковых газов в атмосфере [Corradi et al., 2005], а тундровая зона является значимым источником биогенного метана. В начале девяностых годов было установлено, что помимо сезонно-талого слоя значительное количество метана находится в вечной мерзлоте и выведено из современного биогеохимического круговорота [Ривкина и др., 1992; Rivkina et al, 2001; Gilichinsky et al., 1997; Wright, et al., 1998]. В многолетнемерзлых породах, наряду с метаном, сохраняются и жизнеспособные анаэробные микроорганизмы, в том числе, метанобразующие археи [Rivkina et al., 1998].

Метан в верхних горизонтах криолитосферы, в отличие от глубинного, способен легко высвободиться в атмосферу при деградации мерзлоты, что сегодня наблюдается, например, при термоабразии Арктического побережья. Кроме того, можно ожидать, что в случае оттаивания мерзлоты палеомикробное сообщество будет активно вовлекаться в биогеохимические процессы, включая продуцирование парниковых газов за счет ставшего доступным органического вещества [Rivkina et al., 2001]. Использование радиоактивно меченых субстратов (NaH,4C03 и Nal4CH3C02) показало, что метанобразование в многолетнемерзлых породах может происходить не только при их оттаивании, но и при отрицательных температурах до -1б.5°С [Rivkina et al., 2002, 2004, 2005]. Последнее свидетельствует о возможности метаболической активности метаногенов в многолетнемерзлых породах. Для оценки поведения метансодержащих пород при деградации мерзлоты, необходимо знать содержание в них метана и закономерности распределения метанобразущих архей в основных стратиграфических горизонтах мерзлой толщи.

До проведения настоящей работы описано всего несколько видов метаногенов, выделенных из низкотемпературных экотопов: Methanococcoides burtortii [Franzmann et al., 1992], Methanogenium frigidum [Franzmann et al., 1997], Methanomethylovorans hollandica [Lomans et al., 1999], в литературе не встречено описаний штаммов метаногенных архей, выделенных непосредственно из многолетнемерзлых отложений.

Таким образом, очевидна необходимость детального изучения сообщества метаногенов и их распределения в многолетнемерзлых породах.

Цель работы: характеристика сообщества метаногенов в многолетнемерзлых породах разного возраста и генезиса. Основные задачи:

• Выявить присутствие жизнеспособных метаногенов и охарактеризовать культуры метанобразующих архей в многолетнемерзлых породах Арктики и Антарктиды.

• Определить закономерности распределения метаногенов в горизонтах различного возраста и генезиса.

• Определить доминирующую группу в сообществе метаногенов мерзлых отложений.

Объект исследования: многолетнемерзлые осадочные породы Колымской низменности (Арктика) и долины Майерса (Антарктида, Сухие Долины). Научная новизна: Впервые:

■S сообщество метаногенов из многолетнемерзлых пород исследовано с применением микробиологических и молекулярно-экологических методов;

■S показано наличие генетических маркеров метаногенов в многолетнемерзлых породах Колымской низменности и доминирование среди них порядка Methanosarcinales;

из древних мерзлых пород различного возраста и генезиса Арктики и Антарктиды выделены и описаны жизнеспособные метаногены. Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы в микробной экологии, криобиологии, биотехнологии, моделях поведения многолетнемерзлых пород при глобальных климатических изменениях и астробиологии.

Апробация работы. Отдельные части диссертации докладывались на XII, XIII и XVII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005, 2006, 2010), II европейской конференции по мерзлотоведению (Потсдам, ФРГ, 2005); II и III Международных конференциях по полярной микробиологии (Инсбрук, Австрия, 2006; Банфф, Канада, 2008); международной конференции «Криогенные ресурсы полярных регионов» (Салехард, 2007), летней школе Nordic-NASA: вода, лед и происхождение жизни на Земле

(Рейкьявик, Исландия, 2009), международной Астробиологической конференции: эволюция и жизнь (Лига Сити, США, 2010) и 10°" европейском симпозиуме по астробиологии (Пущино, Россия, 2010).

Благодарности. Автор глубоко признателен своему научному руководителю к.г.-м.н. Е.М. Ривкиной за возможность принять участие в исследовании уникальной группы микроорганизмов и актуальной проблемы, за полученный опыт, плодотворные дискуссии, помощь в планировании экспериментов и всестороннюю поддержку. Отдельная благодарность - сотрудникам лаборатории анаэробных процессов (ИБФМ РАН) - к.б.н. В.А. Щербаковой, Г.А. Солдатенковой за методическое обеспечение и бесценный опыт анаэробного культивирования. Неоценимую помощь в выполнении работы оказали также проф. Р. Конрад, к.б.н. С. Печерицина (Мах Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Марбург, Германия) и проф. К. Тиммис, др. О. Дюплекс, др. О.Р. Коцурбенко (Helmholtz Centre for Infection Research, Брауншвейг, Германия).

Я благодарен к.б.н. Т.А. Вишнивецкой (Oak Ridge National Laboratory, Biosciences Division, США) за помощь в описании накопительной культуры, выделенной из Антарктиды, а также к.б.н. С.А. Булату (ПИЯФ РАН) за ценные замечания и дискуссии при планировании схем экспериментов.

Огромное спасибо всем сотрудникам лаборатории и участникам арктических и антарктических экспедиций: к.г-м.н. А.Л. Холодову, к.г-м.н. A.A. Абрамову, Д.Г. Федорову-Давыдову, Е.В. Спириной, JI.A. Шмаковой и остальным сотрудникам лаборатории, и в особенности: д.г-м.н. Д.А. Гиличинскому - заведующему лабораторией криологии почв. Всем им я выражаю глубокую признательность.

Автор выражает благодарность к.б.н. A.M. Лысенко - за определение ГЦ состава, выполнение ДНК-ДНК гибридизации, к.б.н. Н.Е. Сузиной - за электронно-микроскопические снимки культур.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения. Она изложена на 103 страницах текста, сопровождается 27 иллюстрациями и 12 таблицами. Список литературы включает 180 наименований, из них 171 - на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись образцы многолетнемерзлых пород, отобранные в результате экспедиций в тундровую зону Колымской низменности и сухие долины Антарктиды. Методика стерильного отбора проб при колонковом бурении мерзлых пород станком УКБ-12/25 детально описана [Гиличинский и др., 1989; Shi et al., 1997]. Отобранные пробы хранились при температуре -18С° до начала анализов.

Колымская низменность

Исследования проводили на образцах разного возраста и генезиса (рис.1), отобранных из геологических скважин в районе Колымской низменности (155-160° в.д. и 67-70° с.ш.).

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

¡01 совр. почва 1С 2 IC4 аласные IC5 IC6 отложния

СЩмл/кг)

IC13 IC14

3-10

современная почва

1С 12

IC9 отложения олерского горизонта IC10 1-3

млн. лет

Рис. 1. Сводный геологический разрез и схема отбора образцов

Возраст образцов моложе 60 тыс. лет определялся методами прямого радиоуглеродного датирования. Возраст образцов древнее 60 тыс. лет определялся непрямыми геологическими методами (палеонтологический, палеомагнитный и споро-пыльцевой анализы).

В отложениях наблюдается дискретное распределение метана: между слоями, содержащими метан, встречаются прослойки, в которых метана нет, либо он присутствует в следовых количествах. Тот факт, что метан за геологическое время не проник из нижележащих в вышележащие горизонты, указывает на отсутствие его диффузии в мерзлых толщах [Бдукта й а!., 2001]. Изотопный состав углерода метана (513С (С Н4) = -67/-99 %о) однозначно свидетельствует о его биогенном происхождении. Кроме того, предельно высокое содержание легкого изотопа |2С (СН4) в некоторых образцах указывает, с одной стороны, на низкие скорости метаногенеза, а с другой, на то, что метан образовывался, главным образом, из С02+Н2.

Долина Майерса (Сухие долины Антарктиды).

Исследования проводили на западном берегу озера Майерса в одноименной долине на высоте 190 метров над уровнем моря (163° в.д 78° ю.ш ). Глубина скважины 4/95 - 6.5 м. Нами были проанализированы образцы АпИ и Ап12 с глубины 2.01 и 3.75 м соответственно (рис. 2).

Порода представляла собой хорошо отсортированный кварцево-полевошпатовый песок с редкой галькой, сцементированный льдом. Возраст отложений 30.500 ± 2.500 лет установлен методом термолюминесценции.

Рис. 2. Географическое положение района исследования (А), распределение метана и схема отбора образцов (Б)

Газовое опробование образцов керна в скв. 4/95 выявило, что в образце с глубины 2.01 м содержание метана составляло 0.375 мл/кг. Это было значительно больше, чем в образцах, залегающих выше и ниже по разрезу. Повышенное содержание метана связано, по-видимому, с тем, что эти отложения представляют собой донные осадки реликтового озера [ОШсЫпвку е/ а!., 2007].

Образцы пород для анализа содержания СН4 отбирались из скважин. Буровые работы проводились установкой УКБ-12/25 с колонковым снарядом, которая позволяет извлекать керн мерзлых пород ненарушенного сложения диаметром 6.8-11.7 см.

Отбор газа из образцов многолетнемерзлых пород в полевых условиях осуществлялся методом „head space" [Alperin, Reeburgh, 1985] путем дегазации в 150 мл шприцах. Газ из шприцов компенсационным методом переводился во флаконы. Измерение содержания метана проводилось в лаборатории на газовом хроматографе ХПМ.4 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором.

Определение изотопного состава углерода метана (613С) проведено в Центре изотопных исследований Всероссийского геологического института (ВСЕГЕИ, Санкт-Петербург) на хромато-масс-спектрометре Deltaplus XL, GC Combustion III (ThermoFinnigan, Германия).

Значение 5|3С в промилле определялось по формуле:

VPDB [Copien, 1994], равное 0.0112372.

Анаэробное культивирование. Накопительные и чистые культуры метаногенов получали согласно методике анаэробного культивирования [Hungate., 1969; Miller, Wolin, 1973]. Для получения накопительной культуры применяли среду как ранее описано [Krivushin et al., 2010].

Способность штаммов использовать различные субстраты в качестве источника углерода и энергии определяли на основной среде, содержащей данный субстрат. О наличие роста судили по увеличению концентрации метана в газовой фазе и подтверждали двумя дополнительными пересевами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве стандарта использовалось отношение 13С/12С в международном стандарте

Содержание метана в газовой фазе определяли на газовом хроматографе PyeUnicam 304 (Великобритания). Для определения метана использовали стеклянную колонку (длина 1 м, внутренний диаметр 2 мм), заполненную Порапаком Q (80-100) (Fluka, Германия). Температура колонки, инжектора и пламенно-ионизационного детектора были 80, 140 и 180°С, соответственно. Газом - носителем был азот со скоростью потока 20 мл/мин.

Морфологию клеток культур изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом Люмам при увеличении 90 х 15, а также с применением электронного микроскопа JEM 100 (TOKYO BOEKI, Япония), используя ультратонкие срезы, которые получали на ультратоме LKB 3 (LKB, Швеция).

Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов проводили по Рейнольдсу [Reynolds, 1963].

Выделение тотальной ДНК. Геномную ДНК из образца 0.5 г (почва, грунт) или 1 мл (культура клеток) выделяли при помощи набора Fast DNA spin Kit for soil (Q-BIOgene, США).

Почти полный ген 16S рРНК чистых культур амплифицировали в 50 мкл реакционной смеси, используя набор Encyclo PCR kit (Evrogen) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler Personal (Eppendorf, Германия) с праймерами A8F (5'-TCCGGTTGATCCTGCCGG-3") и 1492R (5' -ACGG YTACCTTGTTACGACTT-3 ' ) [Krivushin et al., 2010].

Секвенирование амплифицированного фрагмента 16S рДНК проводили на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Германия) с использованием набора секвенирующих реагентов Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Германия) и прилагаемого к набору протокола. Секвенирования фрагментов 16S рРНК проводили как ранее описано [Krivushin et al., 2010].

Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических дендрограмм проводили с использованием программного пакета Mega4 [Tamura et al., 2007; http://www.megasoftware.net/].

Нуклеотидный состав ДНК анализируемых штаммов определяли методом термической денатурации [Marmur, Doty, 1962], используя саморегистрирующий

спектрофотометр Pye Unicam SP 1800 (Philips, Великобритания) со скоростью подогрева 0.5 град/мин.

Уровень ДНК-ДНК гибридизации бактериальных штаммов определяли методом реассоциации по ДеЛею [De Ley et al., 1970].

Полиморфизм длин концевых рестрикциониых фрагментов (T-RFLP).

ПЦР проводили при оптимальных условиях. Концентрацию геномной ДНК определяли на спектрофотометре Nano Drop (Thermo Fisher Scientific, Германия). Для ПЦР использовали следующую пару архей-специфичных праймеров: 109F (5'-ACKGCTCAGTAACACGT-3') и 934R* (5'-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3'). Праймер 934R* - флюоресцентномеченный по 5'-концу FAM (6-carboxyfluorescein) [Großkopf et al., 1998]. ПЦР проводили согласно следующему температурному профилю: предварительная денатурация - 94 °С, 3 мин; 32 цикла: денатурация - 94 °С, 30 сек, отжиг праймеров - 52 °С, 45 сек, элонгация - 72 °С, 90 сек; финальная элонгация - 72 °С, 5 мин. Далее ПЦР-продукт очищали при помощи набора Qiagen PCR purification kit (Qiagen, Германия), концентрацию ДНК определяли на анализаторе Nano drop. Затем проводили ферментативное расщепление с эндонуклеазой рестрикции Taql (Fermentas, Германия) при 65°С 3.5 часа. Рестрикт очищали с помощью набора SigmaSpin™ Post-Reaction Clean-Up (Sigma Aldrich, Германия). 5 мкл очищенного продукта рестрикции смешивали с 11 мкл Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems, Германия) и 0.3 мкл маркера MapMarker®1000 (Eurogentec, Германия), денатурировали 2 мин при 90°С и помещали в лед. Фрагментный анализ проводили на секвенаторе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Германия) с помощью программы GeneMapper® (Applied Biosystems, Германия).

Одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP) проводили как подробно описано Нгачу Джао [Ngatchou Djao, 2009].

Конструирование библиотеки клонов генов 16S рРНК.

Амплифицированные фрагменты 16S рДНК клонировали в вектор pGEM®-T (Promega) согласно рекомендациям производителя. Положительные клоны амлифицировали и секвенировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование структуры сообщества метаногенов многолетнемерзлых пород

Арктики.

Для определения структуры сообщества метаногенов использовали молекулярно-экологический подход с использованием метода "отпечатков пальцев" (fingerprinting). Данный метод позволяет существенно сократить время, необходимое для определения структуры сообщества микроорганизмов культуральными методами.

Первоочередной задачей было подобрать оптимальные методы экстракции геномной ДНК из образцов мерзлых пород и почв и протоколы амплификации генов 16S рРНК. После оптимизации соответствующих условий, удалось амплифицировать 16S рДНК с архей-специфичными праймерами из образцов IC1-IC8 и ГСП-1С 14. Для образцов IC9 и ICIO подобрать оптимальные условия для амплификации не удалось, что, вероятно, связано с возрастом отложений (3 млн. лет).

Следующий шаг был направлен на то, чтобы понять, присутствуют ли метаногены в исследованных образцах. Для решения данной задачи анализировали одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP) фрагментов генов 16S рРНК, амплифицированных с праймерами MethF894-ph ([Фосфат]-СТТ AAA GGA ATT GGC GGG GGA) и MethR1376 (GGG CGG TGT GTG CAA GGA G CA) [Ngatchou Djao, 2009], специфичными к метаногенам. В результате, было обнаружено присутствие метаногенов во всех образцах, за исключением IC4, IC5 и IC11, по- видимому, по причине деградации ДНК.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и сравнение с гомологами в генбанке NCBI показали присутствие метаногенов и выявили, что большинство из них относится к порядку Methanosarcinales (род Methanosarcinä) (рис. 3). Так же было показано присутствие представителей порядков Methanobacteriales и Methanococcales (рис. 3).

SSCP-анализ позволяет судить о качественном составе сообщества, но не дает информации о количественном соотношении микроорганизмов. Полиморфизм длин концевых рестрикционных фрагментов (T-RFLP), напротив, хорошо характеризует количественную структуру сообщества.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0 Mithanobacteriales El Jvkthanococales □ Methanosai-cinales

Рис. 3. ЗБСР-гель, соотношение фрагментов рДНК, отнесенных к соответствующим порядкам метаногенов

Метод Т-ИРи? применялся нами с целью определить структуру сообщества метаногенов и выявить в ней доминирующие группы. При анализе профилей концевых рестрикционных фрагментов отчетливо видно доминирование пика 184 нуклеотида (рис. 4).

J_L

J ,

184

150 300 900

Рис. 4. Рестрикционные профили tRF: А - образец ICI; Б - IC2; В - IC3; Г - IC4

w

120

60

.1

д 184

ж

184

180

120

во 1

i l , .

к 184

Рис. 4. (продолжение) : Д - IC5; Е - IC6 Ж - IC7 3 - IC8 И - 1С 11 К - 1С 12

Идентификацию доминирующего пика tRF осуществляли в два этапа: 1) при помощи веб-сервера "MiCA: T-RFLP Analysis (APLAUS+)" (http://www.mica.ibest.uidaho.edu/trflp.php) проводили виртуальную

амплификацию с последующей рестрикцией. В результате получали список соответствия между размером tRF и номером сиквснса в генбанке NCBI; В ходе первого этапа были получены результаты, представленные в таблице 1:

Таблица 1. Результаты MiCA: T-RFLP Analysis (APLAUS+)

tRF № генбанка NCBI Описание

186 DQ058823 Methanosarcina lacustris FRX-1.

186 EF452664 Methanosarcina mazei M-l.

186 EF202842 Methanolobuspsychrophilus R15.

187 AY692059 uncultured Methanosarcina sp. Ml5.

187 DQ068083 uncultured archaeon IRBA7.

187 DQ478747 uncultured archaeon CLONG74.

Как видно из таблицы 1 (показаны наиболее представленные ЖР), пику 1КР=184±3 нуклеотида (3 н. - максимально возможная погрешность измерения) соответствуют представители рода МеЛапояагста, а также некультивируемые археоны.

2) наиболее представительный по структуре рестрикционного профиля образец (в данном случае образец 1С13) клонировали. Затем, с каждым положительным клоном проводили Т-КРЪР-анализ и секвенирование, в результате чего получали список соответствия между размером и сиквенсом в генбанке N€81, наиболее гомологичным соответствующему клону. Анализ клоновой библиотеки подтвердил результаты виртуальной амплификации и рестрикции. Ряд клонов (1КР=184 н., доминирующий пик) показали гомологию порядку МеМапояагстЫез (табл. 2).

Таблица 2. Уровень гомологии клонов (tRF=184 н.) к соответствующим сиквенсам

генбанка NCBI

Клон № генбанка NCBI Описание Гомология

clone 3 AB353207 Uncultured Methanosarcinales archaeon gene for 16S rRNA, partial sequence 95%

clone 11 АВЗ 53207 Uncultured Methanosarcinales archaeon gene for 16S rRNA, partial sequence 95%

clone ЗОМ FJ982767 Uncultured methanogenic archaeon clone SMPFLSS58m(2)_12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 94%

clone 31 AB353207 Uncultured Methanosarcinales archaeon gene for 16S rRNA, partial sequence 93%

clone 36 FJ982757 Uncultured methanogenic archaeon clone SMPFLSS56m_5 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 93%

На основании представленных результатов, можно уверенно заключить, что доминирующей группой метаногенов в изученных многолетнемерзлых породах Арктики являются представители порядка МеЛапохагсгпа/ея (род Ме1капсиагсЫа). Метанобразующие археи из многолетнемерзлых пород Колымской низменности.

Для получения чистых культур метаногенов накопительное культивирование проводили анаэробно во флаконах объемом 60 мл. Культуры получали добавлением к 10 граммам образца 5 мл анаэробной среды. Накопительные культуры инкубировали при температуре 20 °С в течение длительного времени (не менее 12 месяцев). После достижения объемной концентрации метана 40% содержимое флакона переносили в пробирки Хангейта с добавлением 5 мл вышеописанной среды. Чистые культуры были получены посредством серии 10-кратных разведений. В результате последовательных пересевов было выделено три культуры метаногенов: водородиспользующие штаммы МКЗ и МК4 и ацетатиспользующий штамм Л.01.

Штамм \1ethanosarcina ер. .11.01.

Морфология клеток. Микроскопические исследования показали, что полученный нами штамм ЛЪ01 представлен коккообразными клетками диаметром около 2.0 мкм, часто образующими сарциноподобные пакеты (рис. 5, А).

Рис. 5. Клетки штамма Methanosarcina mazei JL01: А - фазовый контраст, Б-ультратонкие срезы (черные точки - включения полифосфатов), бар 1 мкм

Колонии штамма JL01 на агаре через 14 суток были зернистыми желтого цвета и достигали 1-3 мм в диаметре. Во многих клетках обнаружены электронллотные включения полифосфатов, характерные для метаносарцин [Mah, 1980; Mah, Boone, 1987; Sprott, Beveridge, 1993]. Клеточная стенка имеет толщину 40-50 нм (рис 5, Б) и

соответствует грамположительным бактериям, что было подтверждено окрашиванием.

Физиолого-биохимические особенности нового штамма метаносарцины.

В таблице 3 представлены результаты по определению скорости роста штамма Ш)1 на субстратах, типичных для метаногенеза. Как видно из таблицы, штамм Ш)1 не растет на формиате и Н2/С02. Максимальная скорость роста зафиксирована на метаноле (0.079 ч"1) и триметиламине (0.067 ч'1).

Таблица 3. Образование метана штаммом ЛЪ01 при росте на различных субстратах

Субстрат Удельная скорость роста, ч'1

Метанол 0.079

Ацетат 0.036

Метиламин 0.025

Диметиламин 0.034

Триметиламин 0.067

Новый штамм метаносарцины продуцировал метан при температурах от 10 до 37 °С, с оптимумом при 24-28 °С (рис. 7, Б.).

0.25

5 о.г

0.15

0.05

10 20 30 Температура, °С

10 20 30 40 Температура, °С

Рис. 7 Влияние температуры на рост МеЛапояагЫпа ер.ТЬО1 непосредственно после выделения (А) и после 10 пересевов (Б)

Оптимальный pH для роста был 6.8-7.3. Максимальная скорость роста наблюдалась при концентрации 0.45-0.60 % NaCl в питательной среде. Следует отметить, что при длительном культивировании штамма JL01 наблюдалось изменение температурных характеристик роста от психротрофных (рис. 7, А) к мезофильным (рис. 7, Б): температурный оптимум сдвигался с 18 до 28 °С.

Нуклеотидный состав ДНК. Содержание ГЦ пар в ДНК штамма JL01 составляет 39.2 мол.%, что находится в пределах, определенных для штаммов, относящихся к Methanosarcina mazei и Methanosarcina barkeri (от 38.8 до 43.9 мол.%). Уровень ДНК-ДНК гибридизации штамма JL01 с Methanosarcina mazei S-6T DSM 2053т и Methanosarcina barkeri DSM 800т составил 72 и 37%, соответственно.

Таким образом, по характеру деления, строению клеточной стенки и набору используемых субстратов и генотипу, выделенный микроорганизм является представителем рода Methanosarcina. Результаты филогенетического анализа и ДНК-ДНК гибридизации с типовыми штаммами близкородственных видов позволяют отнести новый штамм метаносарцины к виду Methanosarcina mazei, впервые выделенному из многолетнемерзлых отложений. Штамм JL01 помещен во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под номером ВКМ В-2370.

Филогенетический анализ. Секвенирование и сравнение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК показало высокую гомологию (99%) между изолятом и несколькими штаммами Methanosarcina mazei, и в том числе, с типовым штаммом рода (рис. 6).

— Methanocarcina barkeri (AF028692) Methanosarcina vacuolate (MVU20150)

I—JL01 (AF519802) 00 L Methanosarcina mazeii 5 (AF028691)

-Methanosarcina lacustris (AY260430)

-Methanosarcina semesiae (AJ012742)

I-1

0.01

Рис. 6. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК представителей рода Methanosarcina

99

76 |

Штаммы МеЛапоЬааепит эр. МКЗ и МевшпоЬасЛепит яр. МК4

Морфология и ультраструктура. Клетки водородиспользующих штаммов из более древних грунтов представляли собой палочки с уплощенными (МКЗ) и заостренными концами (МК4).

Размер клеток штамма МКЗ варьировал от 0.5 до 0.6 мкм в ширину и от 6 до 8 мкм в длину. Клетки штамма МК4 были более мелкими - 0.3-0.4 на 4-6 мкм. На ультратонких срезах заметны следы капсулы, которая часто образовывалась вокруг клетки (рис. 8).

По Граму изоляты окрашивались отрицательно. Исследования ультратонких срезов показали наличие клеточной стенки грамположительного типа. В старой культуре клетки образуют агрегаты и нити.

Рис. 8. Микрофотографии клеток штаммов МК-3 и МК-4: А, В -фазовый контраст, бар 10 мкм; Б, Г, Д - ультратонкие срезы, бар 0.5 (Б, Г) и 0.2 мкм (Д) мкм; К - капсула

Данные ДНК-ДНК гибридизации штаммов МКЗ и МК4 между собой (94%) показали, что изоляты по уровню гибридизации являются представителями одного вида. Таким образом, для дальнейшего описания был выбран штамм МК4. Штамм МеЛапоЬаШгшт ЬгуапШ УКМ В-1629т использован для сравнительных анализов.

Параметры роста изолята. На рисунке 9 представлены результаты влияния температуры на скорость роста штамма.

Рост штамма МК4Т обнаружен в диапазоне 10-46 °С (оптимум 28 °С), в то время как МеШапоЬаМегшт ЬгуапШ УКМ В-1629т рос при 20-50 °С (оптимум 37 °С). Согласно классификации Р. Морита [Могка, 1975] оба штамм являются мезофиллами, но МК4Т растет в более широком диапазоне температур.

Действие рН проверяли на среде Б8М2 506 с добавлением стерильного

0.04

0.035

т. 0.03

I 0.025 л

I 0.02 §

о

5 0.015 х

8 о.о1

0.005 0

0 10 20 30 40 50 60

Температура, °С

Рис. 9. Влияние температуры на скорость роста штаммов Ме&апоЬаМепит врр

раствора 1 М НС1, 10% №НС03 или 8% Ка2С03 до желаемого рН. В конце экспоненциальной фазы роста наблюдалось уменьшение рН на 0.2-0.4 единицы.

Штамм МК4Т рос при рН 5.2-9.4 (оптимум рН 7.0-7.2). Рост МеШапоЬааегшт ЬгуапШ УКМ В-1629т обнаружен при рН 5.8-8.8 (оптимум рН 6.9-7.0).

Влияние содержания NaCl проверено при следующих концентрациях в среде: 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 и 0.5 М. Штамм рос при 0-0.3 М (оптимум 0.05 М NaCl). Концентрация NaCl до 0.35 М не оказывала влияния на рост Methanobacterium bryantii VKM В-1629т.

Помимо смеси С02/Н2 для штаммов Methanobacterium bryantii VKM В-1629т и МК4Т был проверен ряд субстратов для роста: формиат (50 мМ), ацетат (50 мМ), метанол (50 мМ) + Н2, метиламин (20 мМ) + Н2, этанол (10 мМ), изопропанол (10 мМ), изобутанол (10 мМ), метиламин (20 мМ) и триметиламин (20 мМ).

На Н2 + С02 штамм МК4 т рос с удельной скоростью 0.026 ч'1, на метаноле + Н2 со скоростью 0. 014 ч'1 и на метиламине + Н2 со скоростью 0. 012 ч'1, в то время как Methanobacterium bryantii VKM В-1629т рос только на смеси Н2/С02 (ц=0.031 ч"1) и использовал изобутанол для метаногенеза без видимого роста. Хотя рост Methanobacterium bryantii VKM В-1629т на изопропаноле ранее описан [Zellner, Winter, 1987], в настоящей работе он не зафиксирован. Проверка добавления ацетата (1, 2, 5, 10 и 20 мМ), дрожжевого экстракта (0.1 и 0.5 г/л), коэнзима М (25 мг/л), казаминовых кислот (1 г/л) в качестве факторов роста показала увеличение скорости роста только при добавлении ацетата в концентрации 5 и 10 мМ.

Клетки штамма МК4Т в экспоненциальной фазе роста устойчивы к лизису в 1% SDS и дистиллированной воде как гипотоническому раствору.

Уровень ДНК-ДНК гибридизации штамма МК4 с ближайшим родственным видом Methanobacterium bryantii VKM В-1629т составлял 62%, что характеризует данные штаммы как представителей разных видов.

Содержание ГЦ пар в ДНК штаммов Methanobacterium bryantii VKM В-1629т и МК4Т составило 35.2±0.3 и 33.8±0.3 мол.%, соответственно.

Филогенетический анализ. Секвенирование и сравнение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК показало высокую гомологию между штаммами МКЗ и МК4 (99.9%), что свидетельствовало об их близком родстве.

По результатам филогенетического анализа последовательности гена 16S рРНК штамма МК4Т (1347 п.о., EF016285) была получена дендограмма (рис. 10).

Таким образом, по характеру деления, строению клеточной стенки и набору используемых субстратов и генотипу, выделенный микроорганизм является новым представителем рода Methanobacterium. На основании результатов

филогенетического анализа и ДНК-ДНК гибридизации с типовыми штаммами близкородственных видов культура МК4 предложена в качестве типового штамма нового вида МеАапоЬаМепит ге1егит, впервые выделенного из древних многолетнемерзлых отложений.

£

-М. oryzae FPi (AF028690)

100 г MK4(EF016285)

М. bryantii DSM 863 (М59124) ■ М. subterraneum А8р (Х99044)

-М. palustre F (AF093061)

-М. formicicum DSM 1535 (AF169245)

- M. alcaliphilum WeN4 (DQ649335)

Рис. 10. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК представителей рода Methanobacterium. Маркер - 0.005 замещений на нуклеотидную позицию. Жирным шрифтом показан исследованный штамм

Штамм МК4 помещен во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов и Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под номерами ВКМ В-2440 и DSM 19849, соответственно.

Краткое описание нового вида метаногенов Methanobacterium veterum sp. nov.

Methanobacterium veterum (ve'te.rum. L. gen. pl. п. древний, старый). Грамотрицательные, неподвижные, неспорообразующие, анаэробные, хемоавтотрофные палочки. Клетки слегка изогнутые, 2.0-8.0 мкм в длину и 0.40-0.45 мкм в ширину. Встречаются одиночно, но могут образовывать цепочки (до 30 мкм) и агрегаты. Флюоресцируют под ультрафиолетом (420 нм). Делятся путем образования септы. Используют Н2/С02, метанол+Н2 и метиламин+Н2 в качестве источника для роста и метаногенеза. Не растут на формиате, ацетате, этаноле, изопропаноле, изобутаноле, метиламине или триметиламине. Добавление ацетата стимулирует рост. Оптимальные условия роста: 28 °С, pH 7.0-7.2 и 0.05 М NaCl. Содержание Г+Ц в ДНК - 33.8±0.3 мол.%. Типовой штамм, МК4Т (=DSM

19849T=VKM В-2440т), выделен из древних (3 млн. лет) многолетнемерзлых отложений Арктики (Колымская низменность, 70°06' с.ш. 154°04' в.д.).

Метаногены в вечномерзлых отложениях Антарктиды.

Так же нами были исследованы многолетние мерзлые породы долины Майерса (Сухие долин Антарктиды).

Образцы мерзлых пород, содержащие и не содержащие метан, анаэробно культивировали, как описано выше. Из метансодержащих (Yes-CH4) образцов, отобранных в долине Майерса, после длительной инкубации получена накопительная культура метаногенов Antl. В образцах, не содержащих метан (No-CH4), образование метана при анаэробном культивировании не обнаружено.

Из тех и других образцов выделена геномная ДНК и амплифицирована с праймерами, специфичными к домену археи (рис. 11, Археи) (25F (5'-CYG GTT GAT ССТ GCC RG-3') и 958R (5'-YCC GGC GTT GAM ТСС AAT T-3') [Cytryn et al, 2000]) и бактерии (рис. 11, Бактерии) (8-27 (5'-AGA GTT TGA ТСС TGG CTC AG-3') и 1510-1492 (5'-GGT TAC CTT TTA CGA CTT-3') [Weisburg et al., 1991]), соответственно (рис. 11). Из рисунка видно, что археи, по-видимому, метаногены, присутствуют только в накопительной культуре продуцирующей метан - Antl.

Рис. 11. Результаты амплификации тДНК накопительных культур АпН и Ап£2: 1 -маркер; 2 - Уея-СЩ (АпН); 3 - №-СН4 (Ап12);4 - положительный контроль; 5 -отрицательный контроль.

Далее продукт амплификации с архей-специфичными праймерами образца АпП (Уев-СЩ) использовали для конструирования библиотеки клонов. Филогенетические анализы показали, что в состав сообщества входит 5 таксономических единиц (рис. 12).

Рис. 12. Дендрограмма 168 рДНК клонов накопительной культуры АпП

Данные таксономические единицы гомологичны некультивируемым археонам (ОС)869368, НС>214469, 011122859 и т.д.) и культивируемым представителям рода МеЛапозагста (АВ288264). Это позволяет предположить, что данная культура является новым видом рода МеШапоэагста.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе были исследованы многолетнемерзлые породы Арктики и Антарктиды. Особенность этих отложений - слоистое распределение метана: горизонты, содержащие метан, чередуются со слоями, в которых метан отсутствует. Последнее свидетельствует о том, что СН4 в мерзлых толщах находится в связанной (гидратной) форме и не диффундирует [Шукша й а1 2001]. Изотопный состав (513С (СН4) = -671-99 %о) говорит о его биогенном происхождении [Шук^па е! а1, 2007], а

чередование метансодержащих слоев и горизонтов без метана связано с условиями промерзания отложений [Ривкина и др., 2006]. При эпикриогенезе промерзание отложений происходило после осадконакопления (аласные горизонты и олерская свита), а фронт промерзания был направлен сверху вниз. Для сингенетического промерзания (ледовый комплекс) характерно одновременное осадконакопление и промерзание отложений (синкриогенез) - в этом случае фронт промерзания направлен снизу вверх. Присутствуя в эпикриогенных горизонтах и отсутствуя в синкриогенных толщах, метан является маркером, характеризующим палеомерзлотную обстановку. При этом, при сингенетическом промерзании возраст мерзлоты принимается равным возрасту пород, а для эпигенетического промерзания прямых методов определения возраста мерзлоты нет, и датирование эпикриогенных отложений проводится, как правило, по ряду геологических характеристик. В частности, тундровые палинологические спектры свидетельствуют о суровых палеоклиматических условиях, начиная с момента накопления олерской свиты в конце позднего плиоцена (~3 млн. лет. назад), и существовании мерзлоты в этот период. Перекрывающие олерскую свиты синкриогенные ледовые комплексы среднего и позднего плейстоцена с мощными ледяными жилами свидетельствуют о стабильном мерзлотном режиме олерской свиты после ее формирования.

Существует несколько возможных причин отсутствия метана в синкриогенных отложениях. Одна из них - это отсутствие условий для захоронения метана. Вторая причина - это неблагоприятные условия для жизнедеятельности и сохранения метаногенов. Исследованные отложения Арктики весьма однородны по физико-химическим характеристикам, что позволяет исключить ингибирующие действие вмещающих пород ледового комплекса на жизнедеятельность микроорганизмов. Тем не менее, лабораторными экспериментами установлено, что в отложениях ледового комплекса процессы метанобразования не идут [Rivkina et al., 2007, 2008]. Вместе с тем известно, что оттаивание ледового комплекса в период голоценового оптимума, а также в результате современного термокарста [Walter et al., 2006] ведет к активизации в них микробиологических процессов, и в том числе, процессов метанобразования. Это характеризует ледовый комплекс как потенциально благоприятную среду для биогенного метанобразования в случае оттаивания.

Молекулярно-генетические исследования показали присутствие фрагментов 16Б рДНК метаногенов в многолетнемерзлых породах разного возраста (современных и древних) и типа промерзания (эпи- и синкриогенного), включая ледовый комплекс.

При анаэробном культивировании образцов современной почвы, аласных горизонтов, ледового комплекса и олерской свиты наблюдалось образование метана во всех типах отложений, кроме ледового комплекса. Из эпигенетических аласных (залегающих над ледовым комплексом) и олерских (залегающим под ледовым комплексом) отложений выделены чистые культуры метаногенов.

Активность метанобразования наблюдалась только в тех образцах, где был изначально обнаружен метан (табл. 12).

Сравнивая результаты анаэробного культивирования и распределения молекулярных маркеров (16Б рДНК) в исследованных отложениях (табл. 12) с профилем метана и отношением окисленного железа к восстановленному (Ре3+/Те2+) [Ривкина и др. 2006] по горизонтам, можно отметить, что отложения ледового комплекса характеризуются более окислительными условиями, о чем свидетельствует резкое увеличение в них доли Ре3+ (в 10-100 раз).

Таблица 4. Некоторые характеристики исследованных типов отложений

Горизонт Эмиссия метана т \ч\<о Биогенный метан /и «йи 16$ рРНК метаногенов Чистые культуры Ре3+/Ре2+, %

Криозем + + + + 0

Аласная пачка + + + +

Ледовый комплекс — — + — -10

Олерская свита + + + -0,1

Таким образом, можно заключить, что метанобразующие археи присутствовали в ледовом комплексе, но условия криоконсервации и окислительно-

восстановительный режим не способствовали захоронению метана и сохранению жизнеспособных микроорганизмов данной группы.

К настоящему времени проведены лишь единичные исследования сообщества метаногенов на северо-востоке Арктики, и касаются они исключительно современных тундровых почв. Так, Л. Ганзерт с соавторами [вапгеЛ е1 а1., 2006] изучали биоразнообразие метногенов при помощи РСЯ-ВООЕ со специфичными праймерами к данной группе архей. Эти исследователи показали, что около 75% реамплифицированных сиквенсов соответствуют представителям рода МеЛапояагста. Наши данные также подтверждают доминирование порядка МеЛапозагстакя в широком спектре отложений. Таким образом, порядок МеЛапозагстакя можно рассматривать в качестве типичного доминанта в сообществе метаногенов многолетнемерзлых пород Арктики.

Многолетнемерзлые породы Сухих Долин Антарктики представляют собой кварц-полевошпатовый песок эолового и элювиального происхождения, который не содержит ни метан, ни метаногенов. Исключением являются мерзлые озерные отложения. Скважиной 4/95, заложенной в долине Майерса, вскрыты позднеплейстоценовые (30 тыс. лет) [ОШсИтвку е1 а1., 2007] метансодержащие отложения одноименного озера. В результате анаэробного культивирования образцов, содержащих метан, получена накопительная культура МеШапозагста ер.

Характерной особенностью накопительных культур метаногенов, выделенных из многолетнемерзлых пород, является длительная лаг-фаза. При этом, наблюдается зависимость между ее продолжительностью и возрастом мерзлоты: чем она древнее, тем длиннее лаг-фаза. Другим фактором, влияющим на длительность лаг-фазы, по-видимому, является температура вмещающих пород. Так, в долине Майерса среднегодовая температура мерзлых пород составляет -20°С, а в Арктике -10°С. В период лаг-фазы, по-видимому, происходит "реанимация" микробного сообщества, вызванная необходимостью репарировать нарушения в клеточных структурах, накопившиеся в результате длительного пребывания в условиях вечной мерзлоты. Учитывая возраст мерзлоты и уровень естественного радиационного фона, можно заключить, что чем древнее микроорганизмы, законсервированные в мерзлоте, тем больше повреждений накапливается в ДНК и других клеточных структурах.

В нашей работе показано, что жизнеспособные метаногены сохраняются в древних многолетнемерзлых породах возраста 3 тыс. (Methanosarcina mazei JLOl) и 3 млн. лет (Methanobacterium veterum МК4Т). Е. Виллерслеву и А Хансену с соавторами [Willerslev et al, 2004; Hansen et al, 2006] не удалось без прединкубирования образцов амплифицировать геномную ДНК из многолетней мерзлоты древнее 600.000 лет, что, очевидно, связано с ее поврежденностью. Соотнося наши данные и эти результаты, можно еще раз отметить, что в период столь длительной лаг-фазы (иногда более 350 дней) происходит репарация ДНК и поврежденных клеточных структур.

В итоге, с учетом выделения из аласных отложений чистой культуры Methanosarcina mazei JL01, и на основании результатов некультуральных методов, можно сделать вывод о доминировании порядка Methanosarcinales (род Methnosarciná) в многолетнемерзлых отложениях.

Представители семейства Methanosarcinaceae обладают наиболее ранообразной физиологией и метаболизмом. Только виды рода Methanosarcina способны осуществлять все три известных на настоящий момент пути метанобразования. Они используют минимум 9 субстратов для метаногенеза. Среди метаногенов Methanosarcinaceae характеризуется исключительным экологическим разнообразием. Отдельные виды рода были обнаружены в пресных и морских осадках, разлагающихся листьях и садовых почвах, нефтяных скважинах, сточных водах, отходах животноводства, экскрементах и желудке травоядных животных [Zinder 1993].

Метаболическое и физиологическое разнообразие метаносарцин показано на примере полного сиквенса генома Methanosarcina acetivorans С2А. Данный вид обладает наибольшим геномом (5.71МЬ) среди известных архей и сравним с геномом бактерий. Анализ 4.524 открытых рамок считывания показал поразительно широкое разнообразие метаболических и клеточных возможностей [Galagan et al., 2002]. Виды рода Methanosarcina обладают уникальной способностью, по сравнению с другими археями, образовывать сложные многоклеточные структуры в течении различных фаз роста и в ответ на изменений условий окружающей среды. Описано большое разнообразие морфологических форм: одиночные клетки, многоклеточные пакеты и ламины [Macario, Conway de Macario, 2001]. Пакеты и ламины отражают морфологическую гетерогенность и свидетельствуют о возможной клеточной

дифференциации. Предположительно, образование многоклеточных структур является ответом на неблагоприятные условия окружающей среды и, вероятно, играет роль в способность рода Ме^апозагЫпа колонизировать разнообразные экотопы.

По-видимому, доминирование рода МеШапозагста в исследованных многолетнемерзлых породах объясняется широкой экологической пластичностью его представителей и наибольшим эволюционным прогрессом данного филотипа среди метаногенов. Вместе с тем, доминирование рода Ме1Ьапо$агста не исключает существование в мерзлых породах представителей других групп метанобразующих архей. Что подтверждено, выделением штамма МеЛапоЪа^епит veterum МК4 из мерзлых позднеплиоценовых отложений.

ВЫВОДЫ

1. Генетические маркеры метанобразующих архей присутствуют как в эпикриогенных, так и в синкриогенных отложениях.

2. Жизнеспособные метанобразующие архей обнаружены только в эпикриогенных отложениях, содержащих метан.

3. Отсутствие жизнеспособных метаногенов в синкриогенных осадках, не содержащих метан, свидетельствует о неблагоприятных условиях для сохранения метанобразующих архей в данных отложениях.

4. В многолетнемерзлых породах изученных регионов доминируют представители порядка МеЖапозагстакя.

5. Из эпикриогенных отложений:

• голоценового возраста (3 тыс. лет, Колымская низменность) выделен новый штамм МеЛпохагста тагеи ЯЛ)1.

• позднеплиоценового возраста (3 млн. лет, Колымская низменность) выделен и описан новый вид метаногенов МеЛстоЪааегшт уе1егшп ер.

ПОУ.

• позднеплейстоценового возраста (30 тыс. лет, долина Майерса) выделена культура МеЛаповагста ер.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ В изданиях, рекомендованных ВАК

1. Ривкина Е.М., Краев Г.Н., Кривушин К.В., Лауринавичюс К.С., Федоров-Давыдов Д.Г., Холодов А.Л., Щербакова В.А., Гиличинский Д.А. Метан в вечномерзлых отложениях Северо-Восточного сектора Арктики // Криосфера Земли. 2006. т. X. № 3. с. 23-41.

2. Rivkina Е., Krivushin К., Shcherbakova V., Laurinavichius К., Pecheritsyna S., Kraev G., Gilichinsky D.Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost//FEMS Microbiology Ecolology. 2007. V. 61. pp. 1-15.

3. Krivushin К. V., Shcherbakova V. A., Petrovskaya L. E., Rivkina E. M. Methanobacterium veterum sp. nov., from ancient Siberian permafrost // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2010. V. 60. pp. 455 -459.

Статьи в сборниках научных трудов и тезисы докладов на научных конференциях

1. Кривушин К.В. Метанобразующие археи, выделенные из многолетнемерзлых отложений различного возраста // Материалы XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2005. Москва, 2005. С.113

2. Ривкина Е.М., Щербакова В.А., Лауринавичус К.С., Кривушин К.В., Гавриш Е.Ю., Троценко Ю.А., Гиличинский Д.А. Метанобразование и метанокисление в многолетнемерзлых породах // Приоритетные направления в изучении криосферы Земли. Тезисы докладов Международной конференции. Пущино, 2005. С. 53

3. Krivushin, К., Scherbakova, V., Rivkina, Е. Methanogenic bacteria isolated from Arctic permafrost sediments of different age // 2-nd European Conference On Permafrost. Potsdam, Germany, 2005. P. 42

4. Кривушин K.B., Щербакова В.А., Ривкина E.M. Метанобразующие археи, выделенные из древней мерзлоты Арктики // Материалы XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2006. Москва, 2006. С.53

5. Rivkina Е., Kraev G., Krivushin К. Biogeochemistry of methane in Arctic permafrost of late Cenozoic age // 2nd International Conference on Alpine and polar Microbiology. Innsbruck, Austria, 2006. P. 43

6. Krivushin К., Shcherbakova V., Rivkina E., Vorobyova E.. Methanogenic Archaea isolated from Arctic permafrost // 2nd International Conference on Alpine and polar Microbiology. Insbruck, Austria, 2006. P. 71

7. Кривушин K.B., Щербакова B.A., Ривкина E.M., Воробьева Е.А. Новые штаммы рода Methanobacterium, выделенные из многолетнемерзлых пород Арктики // Тез. докладов международной конференции «Криогенные ресурсы полярных регионов». Международная конференция в рамках МПГ. Салехард, 2007. Т. 2. С. 313314

8. Krivushin К., Vishnevetskaya Т., Rivkina Е. Methanogens in ancient Antarctic permafrost sediments // 3rd International Conference on Alpine and polar Microbiology. Banff, Canada, 2008. P. 47

9. Krivushin K., Vishnevetskaya Т., Rivkina E. Methane and methanogens in Antarctic permafrost // SCAR/IASC IPY Open Science Conference in association with the XXX SCAR Meeting. Saint-Petersburg, Russia, 2008. P. 361

10. Krivushin K, Scherbakova V., Vishnevetskaya Т., Rivkina E.Methanogens in ancient Permafrost // Nordic-NASA Summer School: Water, Ice and the Origin of Life. Reykjavik, Iceland, 2009. P. 8

11. Rivkina E. M., Sherbakova V. A., Krivushin К. V., Abramov A. A., Gilichinsky D. A. Permafrost on Earth — Models and Analogues of Martian Habitats and Inhabitants // Astrobiology Science Conference 2010: Evolution and Life: Surviving Catastrophes and Extremes on Earth and Beyond. League City, USA, 2010. P. 5620

12. Krivushin K., Rivkina E., Pecheritsina S., Scherbakova V. Methanogens in permafrost // 10th European Workshop on Astrobiology EANA'10. Pushchino, Russia, 2010. P. 26

Заказ№ 54-а/11/10 Подписано в печать 09.11.2010 Тираж 100экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 I ) / тш. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кривушин, Кирилл Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Метан и его роль в биосфере.

1.2. Основные источники метана.

1.3. Метанобразующие археи.

1.4*. Таксономия ^филогения метаногенов.

1.5. Субстраты для метаногенеза^.

1.6. Молекулярно-биологические подходы, к характеристике сообществ микроорганизмов цикла метана.

1.7. Метаногены холодных экотопов.

1.8. Трофические связи в сообществе метаногенов в холодных экотопах.

1.9. Метаногенезв условиях низких температур.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Колымская низменность.

2.2. Сухие долины Антарктиды.

ГЛАВА 3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Отбор и датирование образцов.

3.2. Схема экспериментов.

3.3. Полевые и аналитические методы.38'

3.4. Микробиологические методы.

3.5. Молекулярно-генетические методы.

3.5.1. Выделение тотальной ДНК.

3.5.2. Определение нуклеотидной последовательности гена 16Э рРНК чистых культур.

3.5.3. Филогенетический анализ.

3.5.4. Определение ГЦ состава. ДНК.

3.5.5. ДНК-ДНК гибридизация.

3.5.6. Полиморфизм длин концевых рестрикционных фрагментов (Т-РРИР).

3.5.7. Одноцепочечный конформационный полиморфизм (ввСР).

3.3.8. Конструирование библиотеки клонов генов 168» рРНК.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Исследование структуры сообщества метаногенов многолетнемерзлых пород Арктики.

4.2 Метанобразующие археи из многолетнемерзлых пород Колымской низменности.

4.2.1 Штамм МеИпапоБагс'та эр. Л01.

4.2.2 Штаммы Ме^апоЬа^епит эр. МКЗ и МеИ1апоЬа&епит эр. МК4.

4.3 Метаногены в вечномерзлых отложениях*Антарктиды

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метанобразующие археи в многолетнемерзлых отложениях"

Актуальность темы. Исследованиям последних десятилетию показали; что низкотемпературные экосистемы играют важную роль в формировании? климата Земли и балансе парниковых газов.в атмосфере [Corradi et al., 2005], а тундровая: зона; является значимым источником: биогенного метана: В начале девяностых годов: было: установлено; чтошомимо сезонно-талого слоя» значительное количество метана; находится- в вечной мерзлоте и выведено из современного - биогеохимического круговорота [Ривкина и? др., 1992; Rivkina et<al, 2001; Gilichinsky et alt, 1997; Wright, et al.,: 1998J; Bl многолетнемерзлых породах,, наряду с метаном, сохраняются: и жизнеспособные: анаэробные: микроорганизмы, в,том числе, метанобразующие археи [Rivkina et al., 1998].

Метан в верхних - горизонтах криолитосферы, в : отличие от глубинного; способен легко: высвободиться: в атмосферу при деградации мерзлоты, что сегодня наблюдается; например; при термоабразии Арктического- побережья: Кроме того, можно, ожидать, что. в случае оттаивания мерзлоты палеомикробное-сообщество будет активно вовлекаться в биогеохимические процессы, включая продуцирование парниковых газов за счет ставшего доступным органического вещества [Rivkina et al., 2001]. Использование радиоактивно меченых субстратов (NaH14C03 и Na14CH3C02) показало, что метанобразование в многолетнемерзлых породах может происходить не только при их оттаивании, но и при отрицательных температурах до -16.5°С [Rivkina et al., 2002, 2004, 2005].- Последнее свидетельствует о возможности метаболической активности метаногенов в-многолетнемерзлых породах. Для? оценки: поведенияметансодержащих пород при деградации мерзлоты;, •необходимо.знать содержание в них- метана' и закономерностифаспределенияг метатгобразущих архей в основных стратиграфических горизонтах мерзлой-толщи.

До проведения настоящей работы описано всего несколько видов метаногенов, выделенных из низкотемпературных экотопов: Methanococcoides burtonii [Franzmann et al., 1992], Methanogenium frigidum [Franzmann et al., 1997], Methanomethylovorans hollandica [Lomans et al., 1999], в литературе не встречено описаний штаммов метаногенных архей, • выделенных непосредственно из многолетнемерзлых отложений.

Таким образом, очевидна необходимость детального изучения сообщества метаногенов и их распределения в многолетнемерзлых породах.

Цель работы: характеристика сообщества метаногенов в многолетнемерзлых породах разного возраста и генезиса.

Задачи работы:

• Выявить присутствие жизнеспособных метаногенов и охарактеризовать культуры метанобразующих архей в многолетнемерзлых породах Арктики и Антарктиды.

• Определить закономерности распределения метаногенов в горизонтах различного возраста и генезиса.

• Определить доминирующую группу в сообществе метаногенов мерзлых отложений.

Объект исследования: многолетнемерзлые осадочные породы Колымской низменности и долины Майерса (Антарктида, Сухие Долины).

Научная новизна: Впервые:

S сообщество метаногенов из многолетнемерзлых пород исследованы с применением микробиологических и молекулярно-экологических методов.

S показано наличие генетических маркеров метаногенов в многолетнемерзлых породах Колымской низменности и доминирование среди них порядка Methanosarciriales, •f из древних мерзлых пород различного возраста и генезиса Арктики и Антарктиды выделены и описаны жизнеспособные метаногены.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы в микробной экологии, криобиологии, биотехнологии, моделях поведения многолетнемерзлых пород при глобальных климатических изменениях и в астробиологии.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Она изложена на 103 страницах текста, сопровождается 27 иллюстрациями и 12 таблицами. Список литературы включает 180 наименований, из них 171 — на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кривушин, Кирилл Владимирович

выводы

1. Генетические маркеры метанобразующих архей присутствуют как в эпикриогенных, так и в синкриогенных отложениях.

2. Жизнеспособные метанобразующие археи обнаружены только в эпикриогенных отложениях, содержащих метан.

3. Отсутствие жизнеспособных метаногенов в синкриогенных осадках, не содержащих метан, свидетельствует о неблагоприятных условиях для сохранения метанобразующих архей в данных отложениях.

4. В многолетнемерзлых породах изученных регионов доминируют представители порядка Methanosarcinales.

5. Из эпикриогенных отложений:

• голоценового возраста (3 тыс. лет, Колымская низменность) выделен новый штамм Methnosarcina mazeii JL01.

• позднеплиоценового возраста (3 млн. лет, Колымская низменность) выделен и описан новый вид метаногенов Methanobacterium veterum sp. nov. позднеплейстоценового возраста (30 тыс. лет, долина Майерса) выделена культура Methanosarcina sp.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кривушин, Кирилл Владимирович, Москва

1. Беляев С.С. Метанобразующие бактерии и их роль в биогеохимическом цикле. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. кбн. Пущино, 1984. 33с

2. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. ГЕОС М, 2001.

3. Гиличинский Д.А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д.Г., Федоров-Давыдов Д.Г., Кудрявцева Н.Н. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны // Изв. АН СССР. Сер. Геол. 1989. №6. с. 103-115.

4. Герхард Ф. Методы общей*бактериологии. М.: Мир, 1983.

5. Гусев М.В. Минеева JI.A. Микробиология. ИЦ "Академия" М., 2003.

6. Ривкина Е.М., Самаркин В.А., Гиличинский Д.А. Метан в многолетнемерзлых отложениях Колымо-Индигирской низменности // Докл. РАН. 19921 т. 323. №3. с. 559-563.

7. Ривкина Е., Краев Г., Кривушин К., Лауринавичюс К., Федоров-Давыдов Д., Холодов А., Щербакова В., Гиличинский Д. Метан в вечномерзлых отложениях северо-восточного сектора арктики // Криосфера Земли. 2006. 3. т. 10. с. 23-41.

8. Соломатин В., Попов А., Шумский П. Петрогенез подземных льдов. Изд-во" Наука," Сибирское отд-ние, 1986.

9. Alperin М., Reeburgh- W. Inhibition experiments on anaerobic methane oxidation // Applied and Environmental Microbiology. 1985. 4. Vol. 50.' p. 940.

10. Amann R., Ludwig W., Schleifer K. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1995. 1. Vol. 59. p. 143.

11. Arkhangelov A., Novgorodova E. Genesis of massive ice at 'ice mountain', yenesei river, western Siberia, according to results of gas analyses // Permafrost and Periglacial Processes. 2006. 2: Vol. 2. p. 167-170.

12. Baker G., Smiths J., Cowan D. Review and re-analysis of domain-specific 16s primers // Journal of microbiological methods. 2003. 3. Vol. 55. p: 541555.

13. Bapteste E., Brochier C., Boucher Y. Higher-level classification of the archaea: Evolution of methanogenesis andmethanogens // Archaea. 2005. 5. Vol. l.p. 353-63.

14. Bassam B., Caetano-Anoll s G., Gresshoff P. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels // Analytical biochemistry. 1991. 1. Vol. 196. p. 80-83.

15. Bleicher K., Zellner G., Winter J. Growth of methanogens on cyclopentanol/co2 and specificity of alcohol dehydrogenase // FEMS microbiology letters. 1989. 3. Vol. 59. p. 307-312.

16. Bonin A., Boone D. The order methanobacteriales // Prokaryotes. 2006. Vol. 3. p. 231-243.

17. Bracke Jj, Cruden D., Markovetz A. Intestinal microbial flora of the of the american cockroach, periplaneta americana 1 // Applied and Environmental Microbiology. 1979. 5. Vol. 38. p. 945.

18. Brioukhanov A., Netrusov A., Sordel M., Thauer R., Shima S. Protection of methanosarcina barker! against oxidative stress: Identification5 and characterization of an iron superoxide dismutase // Archives of microbiology. 2000. 3. Vol. 174. p. 213-216.

19. Bryant M., Wolin E., Wolin M., Wolfe R. Methanobacillus omelianskii, a symbiotic association of two species of bacteria // Archives of microbiology.1967. 1. Vol. 59. p. 20-31.

20. Bryant M. Microbiology of the rumen // Duke's physiology of domestic animals. 9th ed. Cornell University Press. Ithaca. NY. 1977. Vol. p. 287-'304.

21. Bryant M., Boone D. Isolation, and characterization of methanobacterium formicicum mf // International Journal of Systematic: and Evolutionary Microbiology. 1988. 4. Vol. 38. p. 453.

22. Carpenter E., Lin S., Capone D. Bacterial activity in south pole snow // Applied and Environmental Microbiology. 2000. 10. Vol. 66. p. 4514.

23. Cicerone R., Oremland R. Biogeochemical> aspects of atmospheric methane // Global Biogeochemical Cycles. 1988. 4. Vol. 2. p. 299-327. '

24. Coplen T. Reporting of stable hydrogen, carbon, and oxygen isotopic abundances // Pure and Applied Chemistry. 1994. Vol. 66. p. 273-273.

25. Corradi C., Kolle O., Walter K., Zimov S., Schulze E. Carbon dioxide and methane exchange of a north-east Siberian tussock tundra // Global Change Biology. 2005. 11. Vol. 11. p. 1910-1925.

26. Daniels L., Fuchs G., Thauer R., Zeikus J; Carbon monoxide oxidation by methanogenic bacteria //Journal of Bacteriology. 1977. 1. Vol. 132. p. 118.

27. De Ley J., Caffon H., Reinaerts A. The quantitative measurements of hybridization DNA from renaturation rates // Eur J Biochem. 1970. Vol. 12. p. 133-140:

28. DeLong E., Pace N. Environmental diversity of bacteria and archaea // Systematic Biology. 2001. 4. Vol. 50. p. 470-478.

29. Edwards C., Hales B., Hall G., McDonald I., Murrell J., Pickup R., Ritchie

30. D., Saunders J., Simon B., Upton M. Microbiological processes in theterrestrial carbon cycle: Methane cycling in peat // Atmospherict

31. Environment. 1998. 19. Vol. 32. p. 3247-3255.

32. Ehhalt D., Prather M., Dentener F., Derwent R., Dlugokencky E., Holland

33. E., Isaksen I., Katima J., Kirchhoff V., Matson P. Atmospheric chemistry and greenhouse gases, Houghton, JT et al; Cambridge University Press. Cambridge. United Kingdom. 2001.

34. Ferry J. Methanogenesis: Ecology, physiology, biochemistry & genetics, Springer. 1993.

35. Forney L., Zhou X., Brown C. Molecular microbial ecology: Land of the one-eyed king // Current opinion in microbiology. 2004. 3. Vol. 7. p. 210220.

36. Forster P., Ramaswamy V., Artaxo P., Berntsen T., Betts R. Changes in atmospheric constituents and in radiative forcing // Climate change 2007: The physical science basis. 2007.

37. Forster P., Ramaswamy V., Artaxo P., Berntsen T., Betts R., Fahey D., Haywood J., Lean J., Lowe D., Myhre G. Changes in atmospheric constituents and in radiative forcing // Climate change. 2007. Vol. 20.

38. Franzmann P., Springer N., Ludwig W., Conway de Macario E., Rohde M. A methanogenic archaeon from ace lake, antarctica: Methanococcoides burtonii sp. Nov // Systematic and Applied Microbiology. 1992. 4. Vol. 15. pi 573-581.

39. Friborg T., Christensen T., Hansen B., Nordstroem C., Soegaard H. Trace gas exchange in a high-arctic valley 2. Landscape ch4 fluxes measured and modeled using eddy correlation data // Global Biogeochemical Cycles. 2000. 3. Vol. 14. p. 715-723.

40. Galagan J., Nusbaum C., Roy A., Endrizzi M., Macdonald P., FitzHugh W., Calvo S., Engels R., Smirnov S., Atnoor D. The genome of m. Acetivorans reveals extensive metabolic and physiological diversity // Genome research.2002. 4. Vol. 12. p. 532.

41. Galand P., Fritze H., Yrj 1 K. Microsite-dependent changes in methanogenic populations in a boreal oligotrophic fen // Environmental Microbiology.2003. 11. Vol. 5. p. 1133-1143.

42. Galand P., Saarnio S., Fritze H., Yrj 1 K. Depth related diversity of methanogen archaea in finnish oligotrophic fen // FEMS microbiology ecology. 2006. 3. Vol. 42. p. 441-449.

43. Gans J., Wolinsky M., Dunbar J. Computational improvements reveal great bacterial diversity and high metal toxicity in soil // Science. 2005. 5739. Vol. 309. p. 1387.

44. Ganzert L., Jurgens G., Munster U., Wagner D. Methanogenic communities in permafrost-affected- soils of the laptev sea coast, Siberian arctic, characterized by 16s rrna gene fingerprints // FEMS microbiology ecology. 2007. 2. Vol. 59. p. 476-488.

45. Genney D., Anderson I., Alexander I. Fine-scale distribution of pine ectomycorrhizas and their extramatrical mycelium // New Phytologist. 2006. 2. Vol. 170. p. 381-390.

46. Gilichinsky D., Rivkina E., Samarkin V. The ancient viable microorganisms and radiative gases in west beringia permafrost: Research opportunities for paleoecological implications and forecast // Terrestrial Paleoenvironmental

47. Studies in Beringia (Edwards M, Sher A & Gutry D, eds). 1997. Vol. p.134.145.

48. Gray N., Head I. Linking genetic identity and function in communities of uncultured bacteria // Environmental Microbiology. 2001. 8. Vol. 3. p. 481492.

49. Hansen A., Mitchell D., Wiuf C., Paniker L., Brand T., Binladen J., Gilichinsky D., Ronn R., Willerslev E. Crosslinks rather than strand breaks determine access to ancient DNA sequences from frozen sediments // Genetics. 2006. 2. Vol. 173. p. 1175.

50. Head I., Saunders J., Pickup R. Microbial evolution, diversity, and ecology: A decade of ribosomal rna analysis of uncultivated microorganisms // Microbial Ecology. 1998. 1. Vol. 35. p. 1-21.

51. Hedderich R., Whitman W. Physiology and biochemistry of the methane-producing archaea // The prokaryotes. 2006. Vol. 2. p. 1050-1079.

52. Higuchi R., Ochman H. Production of single-stranded DNA templates; by exonuclease digestion following the polymerase chain reaction // Nucleic acids research.' 1989. 14. Vol. 17. p. 5865.

53. Hofmann D;, Butler J:, Dlugokencky E , Elkins J., Masarie K., Montzka S., Tans P. The role of carbon dioxide in climate forcing from 1979 to 2004: Introduction of the annual greenhouse gas index // Tellus. 2006. 5. Vol. 58. p. 614-619.

54. Horn M;, Matthies C., Kusel K., Schramm A., Drake H. ITydrogenotrophic methanogenesis, by moderately acid-tolerant methanogens of a methane-emitting acidic peat// Applied and Environmental Microbiology. 2003. 1. Vol. 69. p. 74.

55. Hornibrook E., Longstaffe F., Fyfe W. Evolution of stable carbon isotope compositions for methane and carbon dioxide in freshwater wetlands and other anaerobic environments // Geochimica et Cosmochimica Acta. 2000. 6. Vol. 64. p. 1013-1027.

56. Horz H., Rotthauwe J., Lukow T., Liesack W. Identification of major subgroups of ammonia-oxidizing bacteria in environmental samples by t-rflp analysis of amoa per products // Journal of microbiological methods. 2000. 3. Vol. 39. p. 197-204.

57. Hugenholtz P., Goebel B., Pace N. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity // Journal of Bacteriology. 1998. 18. Vol. 180. p. 4765.

58. Hullar M., Kaplan L., Stahl D. Recurring seasonal dynamics of microbial communities in stream habitats // Applied and Environmental Microbiology. 2006. 1. Vol. 72. p. 713.

59. Hungate R. A roll tube , method for cultivation of strict anaerobes //Methods in microbiology. 1969:'Voli 3: p. 117-132.

60. Ishii K., Fukui Mi Optimization? of annealing temperature to reduce bias ' caused? by a* primer mismatch in multitemplate pen* // Applied and EnvironmentaliMicrobiology. 2001. 8. Vol. 67. p. 3753.

61. Jones- W., Leigh J., Mayer F., Woese1 C.,. Wolfe R. Methanococcus jannaschii sp. Nov., an extremely thermophilic methanogen from a submarine hvdrothermal vent // Archives of microbiology. 1983. 4. Vol. 136. p. 254-261. .

62. Karakashev D., Batstone DJ., Angelidaki. I. Inflúence of environmental conditions on methanogenic compositions in anaerobic biogas reactors // Appl Environ Microbiol. 2005. 1. Vol. 71. p. 331-8.

63. Kato M., Field J., Lettinga G. Anaerobe tolerance to oxygen and the potentials of anaerobic and aerobic cocultures for wastewater treatment // Brazilian Journal of Chemical Engineering. 1997. Vol. 14.

64. Katsiveía E., Moore E., Maroukli D., Str mpl C., Pieper D., Kalogerakis N. , Bacterial community dynamics during in-situ- bioremediation of petroleum waste sludge in landfarming sites // Biodégradation. 2005. 2. Vol. 16. p. 169-180.

65. Kennedy N.,. Edwards S;, Clipson N. Soil bacterial and; fungal community structure across a range of unimproved and: semi-improved upland grasslands //Microbial Ecology. 2005. 3. Vol. 50. p. 463-473. .

66. Keppler F., Hamilton J;, Bra M., R ckmann T. Methane emissions from terrestrial plants under aerobic conditions // Nature. 2006; 7073. Vol. 439. p. 187-191.

67. Kiene R., Oremland R., Catena A., Miller L., Capone D. Metabolism of reduced methylated sulfur compounds in anaerobic sediments and by a pure culture of an estuarine methanogen // Applied and Environmental Microbiology. 1986. 5. Vol. 52. p. 1037.

68. Kotelnikova S., Pedersen K. Evidence for methanogenic archaea and homoacetogenic bacteria in deep granitic rock aquifers // FEMS Microbiology Reviews. 2006. 3-4'. Vol. 20: p. 339-349.

69. Kotsyurbenko O. Trophic interactions in the methanogenic microbial community of low-temperature terrestrial ecosystems // FEMS microbiology ecology. 2006. 1. Vol. 53. p. 3-13.

70. Kudo Y., Nakajima T., Miyaki T., Oyaizu H. Methanogen flora of paddy soils in japan // FEMS microbiology ecology. 2006. 1. Vol. 22. p. 39-48.

71. Kvenvolden K. Methane hydrate—a'major reservoir of carbon in the shallow geosphere? // Chemical Geology. 1988. 1-3. Vol. 71. p. 41-51.

72. Leybo A., Netrusov A., Conrad R. Effect of hydrogen concentration on the community structure of hydrogenotrophic methanogens studied by t-relp analysis of 16s rrna gene amplicons // Microbiology. 2006. 6. Vol. 75. p. 683-688.

73. Liesack W., Dunfield P. Biodiversity in soils: Use of molecular methods for its characterization // Encyclopedia of environmental microbiology. John Wiley and Sons. New York. NY. 2002. Vol. p. 528-544.

74. Little J., Lehman I., Kaiser A. An exonuclease induced» by bacteriophage lambda. I. Preparation of the crystalline enzyme // The Journal of biological chemistry. 1967. 4. Vol. 242. p. 672.

75. Liu W., Marsh T., Cheng H., Forney L. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16s rrna // Applied and Environmental Microbiology. 1997. 11. Vol. 63. p. 4516.

76. Liu Y., Whitman W. B. Metabolic, phylogenetic, and ecological diversity of the methanogenic archaea. // Annals of the New York Academy of Sciences. 2008. Vol. 1125. p. 171-189.

77. Lord N., Kaplan C., Shank P., Kitts C., Elrod S. Assessment of fungal diversity using terminal restriction fragment (trf) pattern analysis: Comparison of 18s and its ribosomal regions // Christopher L. Kitts. 2002. Vol. p. 16.

78. Lowe D. Global change: A green source of surprise // Nature. 2006: Vol. 439. p. 148-149.

79. Ma K., Liu X., Dong X. Methanobacterium beijingense sp. Nov., a novel methanogen isolated from anaerobic digesters // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2005. 1. Vol. 55. p. 325.

80. Macario A., Conway D. Thev molecular chaperone system and other antistress mechanisms in archaea // Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 2001. Vol. 6. p. D262.

81. MacNaughton S., Stephen J., Venosa A., Davis Gi, Chang Y., White D. Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill // Applied and Environmental Microbiology. 1999. 8. Vol. 65. p. 3566.

82. Mah R. Isolation and characterization of methanococcus mazei // Current Microbiology. 1980. 6. Vol. 3. p. 321-326.

83. Mah R., Boone D. Methanosarcina // Bergey's Manual of Systematic Microbiology (Staley JT, Pfennig N, Murrey RJE & Holt JG, eds). 1987. Vol. p. 2198-2205.

84. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature* // Journal of Molecular Biology. 1962. 1. Vol. 5. p. 109-118.

85. Mathrani I., Boone D., Mah R., Fox G., Lau P. Methanohalophilus zhilinae sp. Nov., an alkaliphilic, halophilic, methylotrophic methanogen // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1988. 2. Vol. 38. p. 139.

86. Matthews E., Fung I. Methane emission from natural wetlands: Global distribution, area, and environmental characteristics of sources // Global Biogeochem. Cycles. 1987. 1. Vol. 1. p. 61-86.

87. Meure C., Etheridge D., Tmdinger C., Steele P., Langenfelds R., Van Ommen T., Smith A., Elkins J. Law dome co, ch and no ice core records extended to 2000 years bp // Geophys. Res. Lett. 2006. Vol. 33. p. L14810.

88. Mikaloff Fletcher S., Tans P., Bruhwiler L., Miller J., Heimann M. Ch4 sources estimated from atmospheric observations of ch4 and its c-13/c~12 isotopic ratios: 1. Inverse modeling of source processes // Global Biogeochemical Cycles. 2004. 4. Vol. 18.

89. Miller T., Wolin M. A serum bottle modificationof the hungate technique for cultivating obligate anaerobes // Applied Microbiology. 1974/Vol. p. 985987.

90. Mintie A., Heichen R., Cromack Jr K., Myrold D., Bottomley P. Ammonia-oxidizing bacteria along meadow-to-forest transects in. the oregon cascade mountains // Applied and Environmental Microbiology. 2003. 6. Vol. 69. p. 3129.

91. Mohanty S., Bodelier P., Floris V., Conrad R. Differential effects of nitrogenous fertilizers on methane-consuming microbes in rice field and forest soils // Applied and Environmental Microbiology. 2006. 2. Vol. 72. p. 1346.

92. Morita R. Psychrophilic bacteria // Microbiology and Molecular Biology . Reviews. 1975. 2. Vol. 39. p. 144.

93. Ngatchou Djao O.D. Anaerobic microbial communities from two iron-rich sediments of the lakes monoun and merseburg. Braunschweig. Techn. Univ. 2009.

94. Nocker A., Burr M., Camper A. Genotypic microbial community profiling: A* critical technical review // Microbial Ecology. 2007. 2. Vol. 54. p. 276289.

95. Noll M., Matthies D., Frenzel P., Derakshani M., Liesack W. Succession of bacterial community structure and diversity in a paddy soil oxygen gradient // Environmental Microbiology. 2005. 3. Vol. 7. p. 382-395.

96. Oremland R. Methanogenic activity in plankton samples and fish intestines: A mechanism for in situ methanogenesis in oceanic surface waters // Limnology and Oceanography. 1979. Vol. p. 1136-1141.

97. Oremland R., Des Marais D. Distribution, abundance and carbon isotopic composition of gaseous hydrocarbons in big soda lake, nevada: An alkaline, meromictic lake // Geochimica et Cosmochimica Acta. 1983. 12. Vol. 47. p. 2107-2114.

98. Ovreas L. Population and community level approaches for analysing microbial diversity in natural environments // Ecology Letters. 2003. 3. Vol. 3.p. 236-251.

99. Patel G., Sprott G. Methanosaeta concilii gen. Nov., sp. Nov.(" methanothrix concilii") and methanosaeta thermoacetophila nom. Rev., comb. Nov // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1990. 1. Vol. 40. p. 79.

100. Paterek J., Smith P. Methanohalophilus mahii gen; Nov., sp. Nov., a methylotrophic halophilic, methanogen7/ International-Journal ofSystematic andEvolutionary-'Microbiology. 1988;1. Vol:38'. p. 122. .

101. Perez-Jimenez J., Kerkliof L. Phylogeograpliy of sulfate-reducing bacteria among disturbed sediments, disclosed by analysis of the dissimilatory sulfite reductase genes (dsrab) // Applied and Environmental Microbiology. 2005. 2. Vol; 71. p. 1004.

102. Perez-Piqueres A., Edel-Hermann V., Alabouvette G.,. Steinberg C. Response of soil microbial communities to compost: amendments // Soil Biology and Biochemistry. 2006; 3; Vol; 38: pi 460-4701

103. Powell G. Interpreting gas kinetics of batch cultures // Biotechnology Letters. 1983. 7. Vol. 5. p. 437-440.

104. Prather Mi, Ehhalt D., Dentener. F., Derwent R., Dlugokencky E., Holland E., Isaksen I., Katima J., Kirchhoff. V., Matson P: Atmospheric chemistry and greenhouse gases // Glimate change. 2001. Vol. p. 239-287.

105. Price P. A habitat for psychrophiles in deep antarctic ice // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2000. 3. Vol. 97. p. 1247.

106. Price P., Sowers T. Temperature dependence of metabolic rates for microbial growth, maintenance, and survival // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. 13. Vol. 101. p. 4631.

107. Price P. Microbial genesis, life and death in glacial ice // Canadian journal of microbiology. 2009. 1. Vol. 55. p. 1-11.

108. Prosser J: Molecular and functional diversity in soil micro-organisms // Plant and Soil. 2002. 1. Vol. 244. p. 9-17.

109. Ramakrishnan B., Lueders T., Conrad R., Friedrich M. Effect of soil aggregate size on methanogenesis and archaeal community structure in anoxic rice field soil // FEMS microbiology ecology. 2006. 3. Vol. 32. p. 261-270.

110. Rappe M:, Giovannoni S. The uncultured microbial majority // Annual Review of Microbiology. 2003. 1. Vol. 57. p. 369-394.

111. Reynolds E. The use of lead citrate at highph as an electron-opaque stain ¡in electron microscopy // Journal of Cell Biology. 1963. 1. Vol. 17. p. 208.

112. Rich J., Heichen R., Bottomley P., Cromack Jr K., Myrold D. Community composition and functioning of denitrifying bacteria from adjacent meadow and forest soils // Applied and Environmental Microbiology. 2003. 10. Vol. 69. p. 5974.

113. Rivkina E., Gilichinsky D., Wagener S., Tiedje J., McGrath J. Biogeochemical activity of anaerobic microorganisms from buried permafrost sediments // Geomicrobiology Journal. 1998. 3. Vol. 15. p. 187193.

114. Rivkina E., Friedmann E., McKay C., Gilichinsky D. Metabolic activity of permafrost bacteria below the freezing point // Applied and Environmental Microbiology. 2000. 8. Vol. 66. p. 3230.

115. Rivkina E., Gilichinsky D. Metabolic activity of permafrost microorganisms // The bridge between big bang and biology / book autli. Giovannelli F. 2001.

116. Rivkina E., Laurinavichus K., Gilichinsky D., Shcherbakova V. Methane generation in permafrost sediments // Dokl Biol Sci. 2002. Vol. 383. p. 179181.

117. Rivkina E., Laurinavichius K., McGrath J., Tiedje J., Shcherbakova- V., Gilichinsky D. Microbial life in permafrost // Advances in Space Research. 2004. 8. Vol. 33. p. 1215-1221.98;- .

118. Sambrook J., Russell David W. Molecular cloning: A-laboratory manual. Vol. 1. 1989. •

119. Schink B. Zeikus J. Microbial methanol formation: A major end product of pectin metabolism // Current Microbiology. 1980. 6. Vol. 4. p.387-389.

120. Schink B., Lupton F., Zeikus J. Radioassay for hydrogenase activity in viable cells and documentation of aerobic; hydrogen-consuming bacteria living in extreme environments,// Applied and Environmental Microbiology. 1983.5. Vol. 45. p. 1491.

121. Schmidt M., Prieme A., Stougaard P. Bacterial diversity in permanently cold and alkaline ikaite columns from greenland // Extremophiles. 2006. 6. Vol. 10: p. 551-562.

122. Schoell M. Multiple origins of methane in the earth // Chemical Geology. 1988: 1-3; Vol. 71.,p: 1-10.

123. Schwieger F., Tebbe C. A new approach to utilize pcr-single-strandconformation polymorphism-for 16s rrna, gene-based microbial community analysis // Applied and.Environmental:Microbiology. 1998: 12. Vol. 64. p; 4870.

124. Sekiguchi H., Tomioka N., Nakahara T., Uchiyama H. A single band does not always, represent, single bacterial strains in denaturing gradient gel99 .electrophoresis analysis // Biotechnology Letters. 2001. 15. Vol. 23. p. 12051208.

125. Sessitsch A., Weilharter A., Gerzabek M., Kirchmann H., Kandeler E. Microbial' populationstructures in soil'particle size fractions-of a long-tenn fertilizer field* experiment // Applied, and Environmental' Microbiology. 2001.9. Vol. 67. p. 4215.

126. Shi T., Reeves R., Gilichinsky D., Friedmann E. Characterization of viable bacteria, from Siberian permafrost, by 16s rdna • sequencing // Microbial Ecology. 1997. 3. Vol; 33. p. 169-179.'

127. Sizova M., Panikov N., Tourova T., .Flanagan P. Isolation and characterization of oligotrophic acido-tolerant methanogenic consortia from a sphagnum peat bog // FEMS microbiology ecology. 2006. 3. Vol. 45. p. . 301-315.

128. Solomon S., Qin D., Manning M., Chen Z., Marquis M., Averyt K., Tignor M., Miller H. Ipcc, 2007: Summary for policymakers // Climate change. Cambridge Univ Pr. 2007.

129. Sprott G., Beveridge T. Microscopy // Methanogenesis. Chapman & Hall. New York. NY. 1993. Vol. p. 81-127.

130. Stephen J., Chang Y., Macnaughton S., Whitaker S., Hicks C., Leung K., Flemming C., White D. Fate of a metal-resistant inoculum in contaminated and pristine soils assessed by denaturing gradient gel electrophoresis //

131. Environmental toxicology and chemistry. 1999. 6. Vol. 18. p. 1118-1123.<

132. Suzuki M., Giovannoni S. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16s rrna genes by per // Applied 'and Environmental Microbiology. 1996. 2. Vol. 62. p. 625.

133. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. Mega4: Molecular evolutionary genetics analysis (mega) software version 4.0 // Molecular biology and evolution. 2007. 8. Vol. 24. p. 1596.

134. Tan Z., Hurek T., Reinhold-Hurek B. Effect of n-fertilization, plant genotype and environmental conditions on nifh gene pools in roots of rice // Environmental Microbiology. 2003. 10. Vol. 5. p. 1009-1015.

135. Thies J. Soil 'microbial community analysis using terminal restriction fragment length polymorphisms // Soil Science Society of America Journal! 2007. 2. Vol. 71. p. 579.

136. Tiedje J., Asuming-Brempong S., N sslein K., Marsh T., Flynn S. Opening-the black box of. soil microbial diversity // Applied Soil Ecology. 1999. 2. Vol. 13. p. 109-122.

137. Torsvik V., Goksoyr J., Daae F. High'diversity in DNA of soil bacteria // Applied and Environmental Microbiology. 1990. 3. Vol. 56. p. 782*.

138. Torsvik V., Ovreas L., Thingstad T. Prokaryotic diversity—magnitude, dynamics, and controlling factors // Science. 2002. 5570. Vol. 296. p. 1064.

139. Tyler, S. The global methane budget // Microbial production and consumption; of greenhouse gases: Methane, nitrogen oxides, and halomethanes / book auth. Rogers J. Whitman W. Washington D.C., American Society for Microbiology. 1991.

140. Vishnivetskaya T., Kathariou S:, McGrath J., Gilichinsky D., Tiedje J. Low-temperature recovery strategies for the isolation of bacteria from ancient permafrost sediments // Extremophiles. 2000. 3. Vol. 4. p. 165-173.

141. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Zalinova N., Mamukelashvili A., Gilichinsky D., Rivkina E., Vishnivetskaya T. The deep cold biosphere: Facts and hypothesis // FEMS Microbiology Reviews. 2006. 3-4. Vol. 20. p. 277-290.

142. Walter K., Zimov S., ChantonJ., Verbyla D:, Chapin F. Methane bubbling from Siberian thaw lakes as a positive feedback to climate warming // Nature. 2006. 7107. Vol. 443. p. 71-75.

143. Weber S., Lueders T., Friedrich M., Conrad R. Methanogenic populations involved in the degradation of rice straw in anoxic paddy soil // FEMS microbiology ecology. 2006. 1. Vol. 38. p. 11-20.

144. Weisburg W., Barns S., Pelletier D., Lane D. 16s ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology. 1991. 2. Vol. 173. p. 697.

145. Whalen S., Reeburgh W. A methane flux time series for tundra enviromnents // Global Biogeochemical Cycles. 1988. 4. Vol. 2. p. 399-409.

146. Willerslev E:, Hansen A., Rbnn Ri, Brand T., Barnes Ii, Wiuf Ci, Gilichinsky D;, Mitchell D., Cooper A. Long-term persistence of bacterial DNA // Current Biology. 2004. 1. Vol. 14. p. R9-R10.

147. Wintzingerode F.,. G beli U„. Stackebrandt E. ^ Determinations of microbial .1 diversity in- environmental'samples: Pitfalls of; pcr-based? rrnai analysis; H FEMS Microbiology Reviews. 2006. 3. Vol. 21. p. 213-229.

148. Wolfe R. 1776-1996: Alessandro volta's combustible air. 220 years after volta's experiments, the microbial formation of methane approaches: an understanding // ASM News. 1996. Vol. 62. p. 529-534.

149. Worakit S., Boone D., Mah R., Abdel-Samie M., El-Halwagi M. Methanobacterium alcaliphilum sp. Nov., an h2-utilizing methanogen that grows at high ph values // International Journal of Systematic and Evolutionaiy Microbiology. 1986. 3. Vol. 36. p. 380.

150. Wright Ji, Chuvillin E., Dallimore S., Yakushev V., Nixon F. Methane hydrate formation and dissociation in fine sands at temperatures near 0°C // Proceedings of the 7th international Conference on Permafrost, p. 11471153.

151. Zhilina T., Zavarzin G. Extremely halophilic, methylotrophic, anaerobic bacteria // FEMS Microbiology Letters. 1990. 3-4. Vol. 87. p. 315-321.

152. Zinder S. Physiological ecology of methanogens // Methanogenesis: ecology, physiology, biochemistry and genetics. 1993. Vol. p. 128-206.