Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм пестицидов в растениях (феноксикислоты, триезины, нитрофенолы, карбаматы и дитиокарбаматы)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм пестицидов в растениях (феноксикислоты, триезины, нитрофенолы, карбаматы и дитиокарбаматы)"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н.БАХА . ^

На правах рукописи

КАХНИШВШШ ХРИСТО АЛЕКСЕЕВИЧ

УДК 581.192.7:632.954.028:543.544

МЕТАБОЛИЗМ ПЕСТИЦИДОВ В РАСТЕНИЯХ ' •

(феноксикислоты, триазины, нитрофенолы, карбаматы и дитиокарбаматы)

(03. 00. 04 - биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

illaii), fi/fbf

Москва - 1989

Работа выполнена в лаборатории ксенобиохимии Института биохимии растений АН ГССР

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор М.Н.Запрометов Доктор биологических наук, профессор Д.И.Чкаников Доктор биологических наук, профессор Н.В.Карапетян Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский институт удобрений и агропочвоведения им. Д.И. Прянишникова ВАСХНИЛ

'Защита диссертации состоится "_"_ 1990 г* в

_ часов на заседании специализированного совета (Д 002.96.01)

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (117091, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2).

С диссертацией можно .ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (117071, Москва', Ленинский проспект, 33, корп. I).

Автореферат разослан "_"_ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного' совета доктор уимичес ких наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Масштабы применения пестицидов и современное требование защиты окружающей среды от загрязнения их токсическими остатками делают необходимым исследование биологической системы "культурные растения - пестициды". Прежде всего необходимо знать поведение применяемых сельскохозяйственных ксенобиотиков в растениях и количественное содержание продуктов метаболизма пестицидов в конкретных объектах агрофитоценоза. Особое значение приобретает выявление ферментных систем, катализирующих отдельные реакции метаболизма пестицидов, так как стало необходимым управление детоксикационными процессами в желаемом направлении.

К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе накопился огромный материал по изучению поведения пестицидов в различных объектах о кружащей среды (Галиулин и др., 1987; Го-ловлева, 1987; Гольдфельд, Карапетян, 1988; Клисенко, 1987; Ла— донин, Лунев, 1984; Мельников, 1986; Угрехелидзе, Дурмишидзе, 1984; Чкаников, 1970, 1985; Крафгс, 1963; Майер-боде, 1972; Кер-ни, Кауфман, 1971; Тинсли, 1982; Эйхлер, 1985; Khan et al.,1975» Lewia et al., 1983» Mean, Still, 1977» Piraentel, Edwards, 1982» Simabulcuro et al., 1979; Sherma, 1987 и др.).'Сельскохозяйственная химизация совершенствуется в направлении снижения опасности для человека, полезных организмов, а также природы в целом. Вместе с тем повсеместное применение значительного количества пестицидов создает опасность нежелательного накопления этих веществ и их токсических метаболитов в продуктах сельского хозяйства.

До начала наших исследований молекулярные основы детоксика-ции многих широко применяемых пбрсистентннх пестицидов в растениях были исследованы далеко недостаточно. В связи с этим интерес представлял вопрос о метаболизме пестицидов различных классов органических соединений в важных культурных растениях и изучение механизма действия исследуемых ксенобиотиков на растения.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена изучению мйта-болизма пестицидов производных феноксиуксусной кислоты, симм-триа-зинов, карбаматов и нитрофенола в важных сельскохозяйственных растениях (чай, лимон, апельсин, виноградная лоза, яблоня, кукуруза, ^азоль, горох, томаты, овес, суданская трава и др.) и выяснению

их воздействия на процессы обмена клетки. Были поставлены следующие задачи:

- установление путей поступления, транспорта, внутриклеточной локализации и определение роли отдельных органелл в процессах трансформации пестицидов;

- выделение, идентификация и химическая характеристика продуктов превращения пестицидов;

- выяснение особенностей метаболизма пестицидов в рь^тени-ях разных видов и выявление общих закономерностей их детоксикации;

- установление физиологической активности и тонсичности основных продуктов метаболизма изучавшихся пестицидов;

- исследование детоксикационных механизмов растительной клетки и ферментативных систем, катализирующих процессы трансформации пестицидов;

- изучение влияния различных концентраций пестицидов на обмен клетки и на важные биохимические показатели (на качество) пищевого растительного сырья;

- разработка способов определения остатков и регуляция процессов детоксикации пестицидов в культурных растениях в хелзехкш направлении на осьрве знания механизма этих процессов.

Научная новизна работы. Выявлены осношке пути ызтаболязма широко применяемых персистентных пестицидов различных классов органических соединений - 2,4-Д, атразжа, сигазина, карбарияа, цм-неба, ДНОК в важных сельскохозяйственных растениях. Бадежена и идентифицированы основные продукты метаболизма пестицидов, закгв-чащиеся в конъюгации этих веществ и продуктов их гудрокслякрова-ния с пептидами и белками клетки. Установлено образование совместных сложных конъюгатов оксипроизводных <ЁУК, 2,4-Д и атразина с глюкозой и пептидами. Впервые установлена способность стерильных проростков исследуемых растений окислять молекулы феноксиуксусной кислоты (ФУК), 2,4-Д, карбарила и ДНОК вплоть до расцепления ароматического кольца.

Изучены процессы превращения остатков пестицидов при биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья. Выяснены токсические эффекты агликонов пестицидных конъюгатов, выделенных из обработанных растений метаболитов на центральную нервную систему СЦНС) млекопитающих и установлены ДДзд- Исследованы действия некоторых пестицидов на важные биохимические показатели и на ферментные системы растений.

Практическая ценность. Результаты, полученные при изучении молекулярных основ метаболизма пестицидов в культурных растениях, выделение и токсикологическая характеристика продуктов их биотрансформации имеют несомненное теоретическое и чисто экологическое значение при решении ряда проблем, сопутствующих развитию производства и применения пестицидов. Накопление сведения будут содействовать развитию биохимии чужеродных соединений - отрасли науки,роль которой стала особенно значительной в связи с все возрастающей опасностью загрязнения биосферы разнообразными химическими веществами, особенно пестицидами; Они являются основой разработки общей схемы детоксикационного механизм растительной клетки и тех закономерностей, которые дают возможность прогнозировать поведение пестицидов в растениях, предвидеть степень реальной опасности и разработать адекватные методы анализа остатков. Данные о судьбе пестицидов в растениях дают ключ к выяснению причин селективности, длительности сохранения их активности; позволяют наметить пути создания новых, экологически менее опасных физиологически активных веществ и обосновать биохимические основы защиты окружающей среды.

Результаты изучения действия различных концентраций пестицидов на важные биохимические показатели и на ферментные системы различных растений целесообразно учесть при нормировании расходов, установлении сроков обработки культурных растений и времени ожидания.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации были представлены на республиканских конференциях по' вопросам физиологии и биохимии в Тбилиси (1976, 1977, 1978, 1980, 1987), II Грузинской республиканской конференции молодых химиков в Кутаиси (1978), республиканской научной сессии по охране окружающей среды, Тбилиси (1980), республиканской конференции по вопросам технической биохимии, Тбилиси (1980), У Международном конгрессе по химии пестицидов в Японии (Киото, 1982), Х1У ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды, Москва (1984) научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню охраны окружающей среды, Тбилиси (1984, 1985), научной сессии по актуальным вопросам биохимии и биотехнологии, Тбилиси (1985), У1 Международном конгрессе по химии пестицидов в Канаде, Торонто (1986), У Всесоюзном биохимическом съезде, Киев (1986), заседании бюро координационного совета по проблемам борьбы с сорной расти-

тельностью по теме: "Проблема охраны окружающей среды при применении гербицидов в условиях интенсификации с/х производства", Тбилиси (1986), I конференции биохимиков Узбекской ССР, Ташкент (1986), заседании Общества биохимиков ГССР, Тбилиси (I98U, 1986), Всесоюзной конференции на тему: "Проблемы экологическсЧ биофизики" Тбилиси (1966, 1988).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 научные работы, в том числе две - в виде книг.

Объем работы. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, приложения, списка литературы, включающего 583 наименования, из них 302 на иностраннчх языках. Диссертация содержит 282 страницы машинописного текста, 58 таблиц, 43 рисунка и схем.

• СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектами исследования служили 2-3-летние саженцы чая ( Tee sinensis I. ) сорта "Кол-хети", лимона (Citrus bimonia Osbeck ) сорта "Мейер", апельсина (Citrus sinensis Osbeck) сорта "Вашингтон Невель", виноградной лозы ( Vitis vinifera ъ. ) сортов "Ркацители" и "Саперави", яблони (Malus domestica Borf. ) сортов "Иверия" и "Кехура", 1012-дневные проростки кукурузы (Zea maye L. ) сорта "Аджаметис тетри", фасоли (Phasedus vulgaris 1. Savi ) сорта "Цанава", гороха (Piaum sativum L. ) сорта "Победитель", томата (Lycoper-sicum esculentura Mill ) сорта "Скороспелка", овса ( Avena sativa Ii. ) сорта "Советский" и суданской травы ( Sorghum eutjanenae (Pip) stapf. ), а "также побеги и листья ви-

ноградной лозы, чая, лимона и апельсина.

Реактивы. Основные результаты исследований были получены с применением меченых по углероду соединений,объединения

"Изотоп" (Ленинград).

Применяли следующие меченые препараты? феноксиуксусная кислота I-, С (метка в кольце) с удельной радиоактивностью 61,8*10 Бк/г, феноксиуксусная кислота 1-^С (метка в карбоксильной группе) с удельной радиоактивностью 331*10* Бк/r, 1-14С-2,4 - дихлорфено-ксиуксусная кислота (метка в карбоксильной группе) с удельной радиоактивностью 69,2'Ю Бк/г; 2-^-2,4- дихяорфеноксиуксуокая кислота (метка в мотиленовой группе) с удельной радиоактивность» 66,6'Ьк/г, 2-хлор-4-эгиламино-6-изопропиламино-симм-триазин-

2,4,6-*4С с удельной радиоактивностью 59,2'Ю7 Бк/г и 2-хлор-4-этил-1-*4С-амино-6-изопропил-1-^С-амино-симм-триазин с удельной радиоактивностью 55,5'Ю7 Бк/г, 2-хлор-4,6-бис (этиламино)-симметричный триазин с удельной радиоактивностью 66,6'Ю^ Бк/г, N -метил-1-нафтил-^С-карбамат ó удельной радиоактивностью 16,5' Ю7 Бк/г; цинеб (метилен- С) с удельной радиоактивностью 7,4,10^ Бк/г, 4,6-динитро-о-крезол-*Т! с удельной радиоактивностью 165'Ю7 Бк/г (метка в боковой цепи) и 92,ЭТО7 Бк/г (метка в кольце), салициловая кислота (14СОООН) с удельной радиоактивностью 74-Ю?Ек/г

Кроме перечисленных радиоактивных пестицидов в лабораторных условиях нами были синтезированы ^С-динитро-о-крезол, а также для идентификации и токсикологической оценки продуктов превращения орто- и пара-оксифеноксиуксусные кислоты: 4-окси-2,3-Д и 4-окси-2,5-Д и ОН-триазины. В работе использованы также эталонные образцы окситриазинов, синтезированных фирмой " Ciba Geigi " (Швейцария). Чистота образцов соответствовала 99-100%.

Для исследования суммарных альфа- и бета-адренорецепторов использовали [Зн] дигидроалпренолон (222'Бк/мол1) и [fHj ди-гидроэргокриптин (64,7*10^ Бк/моль) фирмы " Ameraban "(Англия).

Опыты проводили в эксикаторах или в специальных камерах из органического стекла в условиях фиксации углекислого газа смесью моноэтаноламин-метилцеллозоль (9:1) в специальной барботажной ловушке. Основные эксперименты были проведены в стерильных условиях.

Меченые препараты вводили в растения через корни в виде водных растворов или суспензий. Экспозиция от I ч. до 21 дня, для многолетних растений опыты продолжались до б месяцев.

Опыты проводили также в полевых условиях - на чайных плантациях, плодоносящей виноградной лозе и посевах растений кукурузы, суданской травы и овса. Обработку принятыми дозами гербицида осуществляли по существующим правилам. Изучали влияние различных концентраций применяемых гербицидов на биохимические показатели растений. Анализы проводили на протяжении всего вегетационного периода. Опыты ставили с 3-5-кратной повторностью.

После экспозиции из биоматериала экстрагировали низкомолеку-лярние вещества. .Таким образом получали две фракции: низкомолеку-¿ярных соединений и биополимеров.

Суммарную фракцию низкомолекулярных веществ разделяли на три основные фракции, которые затем подвергались хроматографическому разделению на отдельные компоненты. Идентификацию индивидуальных радиоактивных метаболитов осуществляли с применением хроматогра-фических; авторадиографических, химических и спектральных методов анализа. Неидентифицированные метаболиты-конъюгаты подвергали кислотному или ферментативному гидролизу. Радиоактивную часть гидролизатов анализировали па содержание исходных пестицидов и продуктов их биотрансформации. Нерадиоактивную часть гидролизатов исследовали на содержание аминокислот и Сахаров.

Фракции биополимеров гидролизовали и гидролиз'зты анализировали аналогично вышеизложенному.

С целью изучения механизма взаимодействия и включения ^С исследуемых ксенобиотиков в состав белков из обработанных пестицидами растений выделили и анализировали меченые белковые фракции (Девени, Гергей, 1578; Аронов, 1959; эии^е , 1966).

Влияние пестицидов на биосинтез низкомолекулярных пептидов в растениях исследовали методом Телегиной и Павловской (1975).

Динамику остаточных количеств некоторых исследуемых пестицидов изучали известными методами анализа. В процессе работы разработаны способы определения.остатков карбарила, 2,4-Д, симм-триази-нов и их метаболитов в растениях.

Контроль поступления и локализации пестицидов и их метаболитов в растениях осуществляли злектронномикроскопическим методом, модифицированным для радиоавтографии ( Иолпапс11п - 1973).

Исследовали превращения пестицидов пластидами и влияние селективных ингибиторов на их окисление; окисление С феноксиук-сусной, 2,4-дихлорфеиоксиуксусной кислот и карбарила ыикросомаль-ной фракцией; изменение содержания пигментов и гидролизной активности хлорфиллазы листьев виноградной лозы; изменение активности некоторых окислительно-восстановительных ферментов (о-дифенолок-сидаза, пероксидаза, каталаза); изменение содержания отдельных химических веществ под влиянием различных концентраций пестицидов (фенбльные соединения, сирой протеин, сырой жир, сырая клетчатка, сырая зола, микроэлементы).

Изучали процессы превращения С-ФУК, 2,4-Д, атразина и симазина под-действием факторов биотехнологической переработки чайного листа (ферментация, приготовление настоя и др.) и кормовых растений (силосование).

Исслодовали степень токсичности и опасности отдельных продуктов биотрансформации пестицидов: физиологические эффекты на центральную нервную систему (ЦНС) млекопитающих (симазин, атразин, 2,4-Д, карбарил и основные продукты их биотрансформации), ДЦзд для некоторых метаболистов 2,4-Д и карбарила.

Применяемая аппаратура. Выделение клеточных органелл и микросома.тьной фракции проводили с помощью центрифуг К-23, К-24 и ультрацентрифуги VA.C-60I.

Микроскопический контроль осуществляли на электронном микроскопе ЭВМ-ГОООЛ, срезы готовили на уяьтрамикротомз КВ-8800. Электронные спектры и оптическую экстинкцию измеряли на приборах 05-4, 05-26, Speoord UV vis ЗреооХГДР). Спектрометрические исследования проводили на спектрометре Hitachi - 124 (Япония). Продукты трансформации исследуемьтх пестицидов идентифицированы также с помощью ^С-ЯМР-спектроскопии, Масс-спектрометрии и У4-спектроскопии. Регистрацию ЯМР спектров проводили на импульсном Фурье-спектрометре ВС-567 фирмы " Tssla " (ЧССР). Масс-спектры снимали на хромато-масс-спактрометрз MAG R -10-108 (Франция). Аминокислоты определяли на аминоанадизаторе фирмы " Amino Aoid Analyzer JEC -6н (Япония); Анализ метиловых эфиров метаболитов 2,4-Д проводили на хроматографе Цвет-106 с детектором постоянной скорости рекомбинации. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтиляционном счетчике SL -30 (Франция) с эффективностью 90% и "1215 nackbeta XI" (Финляндия) с эффективностью 93%, Ра-' диоактивность твердых образцов определяли радиометром ПП-8 с торцовым счетчиком Т-25 БФЛ.

Для обработки и интерпретации результатов экспериментов применяли методы математической обработки (Бейли, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основные пути превращения исследуемых пестицидов в растениях.; Исследования распределения меченого углерода ФУК, 2,4-Д, атразина, симазина, карбарила, цинеба и ДНОК среди органических соединений

Т4„

изучаемых растений показали, что С метка в основном включается, во фракцию низкомолекулярных веществ (60-90% от поглощенных растением радиоактивных пестицидов), значительно меньше - а биополимеры (1,5-20%) и всего 0,4-17% выделяется'в виде ^COg. Содержа-

ние неизмененных гербицидов зависит от экспозиции и вида исследуемого растения.

При изучении детоксикационного механизма растительной клетки важное значение имеет стерильность исследуемых объектов и среды, так как разнообразная микрофлора подземных и надземных частей • растений, а также природной почвы и воды способны поглощать и метаболизировать ксенобиотики (Агапов, Лебедева, 1986; Брагинский и др. 1979; Галиулин и др. 1967; Головлева, 1987; Лунев, J484, Мельников, 1987, Audus, 1964, loos et al 1967). Поэтому опыты по усвоению и метаболизму исследуемых ^С пестицидов в основном проводились в стерильных условиях (рис.1). Превращение некоторых пестицидов изучали как стерильными растениями in vivo , так и хлоропластами, гомогенатами, ацетоновыми препаратами и микросо-мальными белками in vitro.

Рис.1. Установка для проведения опыта в стерильных условиях. 1.№икрокомпрессор, 2. Конц.серная к-та, ¿.Насыщенный раствор щелочи, 4.Дист.вода, 5.Хлористый кальций, 6.Термометр, 7.Стеклянный колпак, 8.Сосуд с питательной средой, 9.Стерильно выращенное растение, 10.Штуцер для ввода'стерильного воздуха, II.Штуцер для вывода воздуха, 12.Отвод для смены питательной среды. 13.Раствор для фиксации 14с0 , 14.Диет, вода, 15.Стерильная вата. 2

Анализ фракции низкомолекулярных соединений, в которых и сосредоточена основная доля метки исследуемых пестицидов, показал, что радиоактивность эндогенных метаболитов (органические кислоты,, аминокислоты, сахара и др.) незначительна ( <Ь% от радиоактивности фракции низкомолекулярных веществ). Основная доля радиоактивности (ЬО-90%) преходится на вещества, которые не являлись эндогенными для растительной клетки. Они оказались .метаболитами исследуемых пестицидов, частично присутствующими в свободном состоянии, а большей частью - в виде конъюгатов с эндогенными веществами клетки.

/

15 14 13

5 4 3 2

БИОТРАНЙОРМАЦИЯ ФЕНОКСЙУКСУСНЫХ КИСЛОТ В РАСТЕНИЯХ

Деградация боковой цепи 2,4-Д в растениях. С использованием препаратов 2,4-Д, меченных по углероду карбоксильной и метилено-вой групп, показано, что определенная часть исследуемого гербицида подвергается декарбон'силированию и отщеплению о( -метиленового углерода. Выделение за первые 24 часа как из молекулы (I-

■^С)-2,4-Д, так и (2-^С)-2,4-Д для всех изучаемых растений характеризуется приблизительно одинаковой скоростью. Однако, по мере увеличения экспозиции эта закономерность нагэднается (рис.2)'. Среди опытных растений максимальное выделение СО^ из молекулы * С-2.4-Д наблюдалось у фасоли и суданской травы (рис.2). Однако отщепление -метиленового углерода 2,4-Д-в фасоли протекает медленнее, чем декарбоксилирование. Можно предположить, что в фасоли после декарбоксилирования 2,4-Д определенная часть образующегося метаболита (вероятно дихлоранизола) не подвергается деметилированию и, по-видимому, вступает в процессы конъюгации (рис.2). В опытах с кукурузой наблюдали одинаковую скорость выделения из карбоксильной и метиленовой групп 2,4-Д.

По наблюдениям отдельных исследователей некоторые виды растений характеризуются высокой скоростью деградации боковой цепи 2,4-Д ( ЬисЬлгШ et а1 . , 1960, Земская, 1969, Ду-

бовой и др., 1973).

Полученные результаты позволяют резюмировать, что в суданской траве и фасоли путь декарбоксилирования и отщепления с1-метилено- 1 вого углерода в количественном отношении имеет существенное значение в процессе биотрансформации 2,4-Д.

\

.Р/ 1 п

ет (Я ш Рч

к ж В/

СП & СО

СО ся Я] &

ж ,—, к л

и Е* аз

2 п Щ ш о

О) а 8 о

я •'1 --- а

X Су >ы<

аз С, п.

и

0) в

Э •д а « /—

с\г 1 ж л С\Г 1 о га Л!

О ч о о и

э:

•1 —» ОН

о 1 к 1 г; «3

ьч ом о

Он У-1 о ¡М X

" зг и.

ЭКСПОЗИЦИЯ 3 ч.

Глубокие окислительные превращения ¿УН и 2,4-Д в растениях. Предварительно надо отметить,.что под этим заглавием объединяются такие превращения исследуемых ксенобиотиков, которые приводят к полной деструкции углеродного скелета их молекул.

Первые экспериментальные данные о способности растений расщеплять ароматическое ядро фенольных соединений были опубликованы Запрометовым в 1959 г. После этого появились многочисленные работы, указывающие на то, что высшие растения используют соединения ароматического ряда в качестве источников энергии и углерода (Запрометов, 1969, 1977, Дурмишидэе, Угрехелидзе, 1969, Угре-хелидзе, 1974).

Метаболизм ароматического фрагмента феноксиуксусных кислот в растительной клетке по существу не исследовался.

Для изучения процессов расщепления ароматических колец молекул <ИШ и 2,4-Д, меченных по кольцу 1-14С, опыты проводили в специальных камерах з условиях фиксации углекислого газа. Экспе- . рименты показали, что меченый углерод колца ФУК и 2,4-Д с сравнительно низкой интенсивностью'выделяется в виде а также включается в вещества с открытой цепью. Радиоактивными оказались такие компоненты клетки, как органические кислоты, аминокислоты и сахара.

Включение радиоактивного углерода кольца I- чЗ-ФУК и I- С-2?4-Д в состав органических кислот, аминокислот и Сахаров, а также выделение ^СО^ указывают на то, что в растениях исследуемые вещества подвергаются глубоким окислительным превращениям с расщеплением ароматического ядра и включением углеродного скелета этих молекул в общий метаболизм клетки (рис.3)._

сн^соон

9 / тглпн 9* ... сран

ОЗОН рбшйР°& мЩЕслизм

Рис.3. Расщепление ароматического кольца феноксиуксусной кислоты в растениях

Аналогично вышеизложенному можно представить расщепление ароматического кольца молекулы 2,4-Д.

Так''м образом, установлена способность стерильных проростков исследуемых растений окислять молекулы '¿УК и 2,4-Д вплоть до расщепления ароматического кольца.

Как показали результаты опытов, интенсивность глубокого окислительного превращения иссчедуемых пестицидов по сравнению с другими метаболическими путями невелика (1-345 за 72 ч.), однако, как отмечалось, оно приводит к пЪлной деструкции ксенобиотика и включению их углеродных атомов в состав эндогенных метаболитов клетки. К настоящему времени получено множество экспериментальных доказательств того, что путь расщепления бензольного ядра для многих представителей ароматических ксенобиотиков является важным в процессе метаболизма различных растений (Дурмизидзе, 1975, Уг-рехелидзе, 1974, Jansen, Olsen , 1969, Кйгта , 1975, 1977).

Реакции арилгидроксилировзния и конъюгации ¿'УК и 2,4-Д в растениях. Исследования показали, что в основных метаболитах изучаемых ксенобиотиков сохранен ароматический скелет исходных молекул. Функциональные группы указанных мотаболитов в оснозном блокированы эндогенными веществами клетки исследуемых растений, а некоторые метаболиты давали характерную цветовую реакцию на свободную гидроксильную группу.

Анализ фенольных соединений, присутствующих в фракции низкомолекулярных веществ кукурузы, фасоли, гороха, овса, суданской травы и виноградной лозы, показал, что в указанной фракции присутствуют в небольшом количестве* продукты^гадроксилирования ФУК И 2,4-Д.

Известно, что для ароматических углеводородов образование гидроксипроизводных является первичным процессом метаболизма. Производные феноксиуксусных кислот в большинства исследуемых растений гидроксилируются довольно интенсивно, однако выделение "свободных" оксипроизводных изДа высокой скорости их конъвгяро-вания не всегда удается. _ •

Оказалось, что некоторые метаболиты ФУКси 2,4-Д давали характерную цветную реакцию на свободную гидроксильную группу, однако не идентифицировались как известные оксипроизводные исследуемых веществ. После кислотного гидролиза названных метаболитов высвобождаются агликоны, соотвествующие продуктам гидроксилироэа-ния ФУК и 2,4-Д.

Наличие "свободных1' гидроксилированных производных ФУК и 2,4-Д, по-видимому, надо рассматривать как результат фиксации этих метаболитов на данном этапе биотрансформации изучаемых гербицидов. Фактически накопление образующихся оксипроизводных исследуемых ксенобиотиков не происходит, т.к. они подвергаются дальнейшему конъюгированию.

Конъюгация ФУК и 2,4-Д с пептидами. Эксперименты показывают, что все изучавшиеся нами растения способны образовывать метаболиты ФУК и 2,4-Д, функциональные группы которых блокированы эндогенными веществами клетки.

• Для выяснения химической природы выделенных из фракции низкомолекулярных веществ индивидуальные продукты превращения ФУК и 2,4-Д (которые не давали качественных цветных реакций на свободные функциональные группы - СООН, ОН) подвергались кислотному гидролизу и последующему исследованию радиоактивных и нерадиоактивных компонентов гидролизатов.

Результаты исследований показали, что каждый исследуемый метаболит в качестве меченого компонента содержит фрагменты исходных молекул <5УК и 2,4-Д оксипроизводных веществ в пара- и орто-положениях (2-оксифеноксиуксусная кислота, 4-окси-2,3-дихлорфе-ноксиуксусная и 4-оЛси-2,5-дихлорфеноксиуксусная кислоты), фенола и 2,4-дихлорфенола. Агликоны конъюгатов были идентифицированы с помощью хроматографических, масс-ЯМР и УФ-спектроскопических методов. Для этой цели было проведено препаративное выделение продуктов биотрансформации из >5 кг обработанных гербицидами-кукурузы или суданской травы.

Таким образом, было установлено, что основными агликонами конъюгатов 2,4-Д в изучаемых растениях являются 4-0Н-2,5-Д, 4-0Н-2,3-Д и 2,4-Д. В растениях суданской травы обнаружено незначительное количество 2,4-дихлорфекола.

Нерадиоактивную часть кислотных гидролизатов конъюгатов <5УК и 2,4-Д анализировали на содержание аминокислот и Сахаров. При кислотном гидролизе высвобождаются различные аминокислоты. 3'некоторых метаболитах из устойчивых растений (кукуруза, виноградная лоза) вместе с аминокислотами были обнаружены углеводы.

Установлен аминокислотный состав участвующих в конъюгации пептидов. В пептидную часть конъюгатов в основном входят следую-

щие аминокислоты: аргинин, аспарзгин, лизин, пролин, валин, глицин, аланин, аспарагиновая и гчутаминовая кислот1.;, лейцин и некоторые другие.

Таким образом, наличие з.гидролиз'атах метаболитов набора различных аминокислот показывает, что они являются различными пептидами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ана-.лизируемые метаболиты 1уУК и 2,4-Д являются продуктами конъюгации неизмененных молекул исследуемых веществ и их арилоксипроизводных с пептидами растительной клетки. При этом функциональше группы исследуемых вещесты блокируются, благодаря чему указанные метаболиты лишаются реакционной способности и подвижности. Из этого следует, что конкогация с пептида;«'. исследуемых гербицидов является процессом детоксикации для растительного организма. Следует предположить, что связь с пептидами образуется за счет карбоксильных групп молекул уУК и 2,4-Д или же зз счет гидроксильннх групп их оксипроизводнкх с одной стороны, и свободных функциональных групп пептидов с другой.

Количественный анализ образующихся метаболитов ФУК и 2,4-Д показал, что образование конъгагатов с низкомолекулярными пептидами - это один из основных путей биотрансформации в изучаемых растениях.

3 последнее время появились многочисленные экспериментальные данные об образовании пептидных коньюгатов и для других экзогенных веществ Ыитзшвили и др., 197В, Назарова, 1963, Угрэхелидзе и др. 1979, 1960, Чкаников и др., 1985).

До наших исследований многими авторами было показано, что 2,4-Д в растительной клетке в основном образует соединения с отдельными аминокислотами и сахарами. Естественно, что и в наших условиях опытов можно было ожидать идентификации аналогичных продуктов конъюгации. Однако среди метаболитов исследуемых веществ конъюгаты с отдельными аминокислотами и сахарами нами не были обнаружены. Причиной таких расхождений, по-видимому, являются неодинаковые условия. 3 частности, в наших условиях опытов меченые препараты ФУК и 2,4-Д подавали растениям через корневую систему в стерильных условиях. Судьба дальнейыей биотрансформации и конъюгации исследуемых ксенобиотиков в определенной степени зависит от способов поступления и транспорта ксенобиотиков.

Для выделения и идентификации углеводных кон'ыогатов 2,4-Д были применены методические условия, описанные Назаровой и др. (1985), которые в злаковых растениях идентифицировали указанные

конъюгаты как основные метаболиты. Известно, что кукуруза и ппе-ница (Назарова, 1983, Чканикоз и др. 1985) отличаются повышенной способностью образования глюкозного эфира 2,4-Д (усвоение гербицида через листья). Поэтому в опытах в качестве объекта для идентификации описанных в литературе;глюкозных конъюгатов 2,4-Д нами выбрана кукуруза.

Эксперименты показали, что при таких условиях опытов в кукурузе образуется глюкозный эфир гербицида. Количество образующегося 1-0-(2,4-дихлорфеноксиацетил)- р> -Д-глюкозида за 3 суток составляет более 10% от всей усвоенной через листья растением гербицида.

Образование совместных конъюгатов с пептидами и углеводами при метаболизме ¿УК и 2.,4-Д в рзсгенйях. Ферментативный гидролиз , отдельных меченых конъюгатов, выделенных из обработанных С-ЙУК и 2,4-Д растений (кукуруза, виноградная лоза) приводил к высвобождению глюкозы. • '

Количество глюкозы эквивалентно оксипроизводным ФУК и 2,4-Д. На основании этого можно предполагать, что оксигруппа гидроксили-рованных молекул исследуемых препаратов блокирована глюкозой.

Результаты хроматографического, радиоавтографического и спектроскопического изучения (с помощью метчиков-свидетелей) агли-конов, содержащихся в гидролизатах, позволяют заключить, что они представляют собой продукты гидроксилирования гербицидов (табл.1).

Таблица I

Идентификация агликонов совместных конъюгатов ФУК и 2,4-Д . с пептидами и углеводами (результаты ферментативного гидролиза конъюгатов).

Вещество . Растение

5 И} ТОО : кок"ьюга-та

В[ЮО радиоан- :Дцентифика-тивного Фрагмен-ция агли-та после гйд- " кона конъюгг ролиэа : та

.Фук 2,4-Д

Виноградная лоза

Кукуруза

Виноградная лоза

Кукуруза

48 95

.70

70

95

60

70

92

П

92 95 85 85 95

4-0Н-^УК

4-0Н-2,5-Д 4-0Н-2.3-Д

П

4-0Н-2.5-Д

п

нри гидролизе названных "сложных" конъюгатов в основном высвобождаются те же аминокислоты, которые были идентифицированы в гидролизатах пептидных конъюгатов исследуемых гербицидов.

Таким образом, установлено, что проникшие в клетки растений (кукуруза, виноградная лоза) меченые препараты ФУК и 2,4-Д после первичных окислительных превращений образуют' "сложные" конъюгаты с пептидами и углеводами. Вероятнее всего, из имеющихся функциональных групп (-С00Н, -ОН) исследуемых гербицидов одна блокируется молекулой пептида, а вторая - Д-глюкозой (рис.4).

Рис.4. Возможные пути конъюгации фУК^и 2,4-Д (б) и их оксипроизводных с пептидами и глюкозой

Количественное изучение распределения ^С 3>УК и 2,4-Д показывает, что образование пептидно-углеводных конъюгатов явля«-ется важным путем детоксикации названных ксенобиотиков в виноградной лозе и кукурузе (10-20%) от усвоенного растением гербицида).

Белковые конъюгаты ¡5УК и 2,4-Д в растениях. Как указывали выше, меченый углерод §УК и 2,4-Д включается в состав биополимеров. Основным объектом включения названных ксенобиотиков в состав фракции биополимеров вероятнее всего являются молекулы белков.

Электрофоретическое изучение белковой фракции показало, что связь гербицидов с белковыми молекулами довольно прочна, так. как ^С метка мигрирует вместе с белками.

Исследование радиоактивной части гидролизата позволило идентифицировать в качестве радиоактивных компонентов продукты биотрансформации исследуемых пестицидов (4-ОН-ФУК, 2,4-ОН-ФУК, 4-0Н-2,3-Д, 4-0Н-2,5-Д, 2,4-Д!@).

Некоторые авторы обнаружили, что во многих видах растений значительное количество 2,4-Д находится в составе белкового компо-

нента (Земская, 1963, Чкаников и др., 1975). Предполагают, что связывание феноксиуксусных кислот с белками,в особенности в листьях злаковых культур, является одним из важнейших факторов иммобилизации гербицида.

В наших условиях образование белковых конъюгатов ФУК и 2,4-Д в изучаемых растениях по сравнению с коньюгированием с пептидами' осуществляется значительно в меньией степени, однако, по-видимому, оно все-таки играет определенную роль в процессе метаболизма исследуемых ксенобиотиков, т.к. с увеличением экспозиции наблюдается рост радиоактивности фракции белковых конъюгатов.

Внутриклеточная локализация ^С ФУК, 2,4-Д и продуктов их биотрансформации в растениях. Вопросы поступления, передвижения и внутриклеточной локализации ^УК и 2,4-Д изучали методами электронно-микроскопической радиоавтографии и дифференциального центрифугирования.

Анализ злектрокограмм показал, что уже через 10 мин. С ФУК и 2,4-Д поступают в клетки исслецуемых растений и метка обнаруживается почти во всех «клетках. метка отмечается в лейкопластах, ядре, ядрышке и вакуолях, а клеточные оболочки и плазма-лемма не содержат ^С. После 60-минутной инкубации наблюдается увеличение содеркания метки ФУК и 2,4-Д в вакуолях, одновременно происходит уменьшение метки в других органеллах клетки.

i- Известно, что многие конъюгаты пестицидов и других ксенобиотиков лучше растворяются в воде, чем исходные вещества (Стом, 1979, Тоуэрс, I96B, Чкаников, 1985). Из-за такого изменения гидро-фильно-липофильного баланса они приобретают способность накапливаться в вакуолях, лишаясь возможности участвовать в обмене веществ растительной клетки. '

Очевидно, процессы конъюгации ксенобиотиков происходят в различных органеллах к'летки, а образующиеся продукты проникают через- тонопласт и накапливаются в вакуолях. По-видимому, этим обусловлена высокая радиоактивность надосадочной жидкости.

Следует предположить, что благодаря способности многих растений локализовывать метаболиты экзогенных веществ в вакуоли и клеточной стенке, цитоплазма освобождается от токсиканта- Такая система клетки очень важна для освобождения цитоплазмы от конъюгатов чужеродных токсикантов. Отсюда можно предположить, что в растениях vivo конъюгаты пестицидов локализуются в таких местах клетки, где они не могут служить субстратами соответствующих фер-

ментов и, следовательно, мало вероятно высвобождение неизмененных токсических веществ."

Изучение локализации радиоактивного углерода I- С-£УК и 1--^С-2,4-Д в клеточных органеллах методом дифференциального центрифугирования показало, что из клеточных органелл наиболее радиоактивными оказались пластицы и митохондрии. Важным является факт концентрирования меченого углерода ¿УК л 2,4-Д в пластидах, что, вероятно, указывает на активную роль хлоропластов в процессах окислительных превращений яссл дуемых гербицидов.

'Окисление <ДУК и 2,4-Д интаутнчпи хлороплзстаыи. С целью выявления функции хлоропластов в процессе превращения (¿Ж и 2,4-Д нами проведены исследования с интактными хлоропластами из листьев гороха. Пш инкубации хлоропластов с меченными по кольцу I- С-5УК и 1-^С-2,4-Д из первого выделяется около 2,5^ *4С02 от общей радиоактивности, а 'в случае 2,4-Д*4С02 обнаруживается в виде следов. Опыты с меченными по карбокисльной группе I - С-ФУК и I - 4С-2,4-Д показали, что в обоих случаях выделяется значительно большое количество ^СО^, чем при инкубации хлоропластов с меченными по углероду ароматическому кольцу ¿>УК и 2,4-Д (табл.2).

Таблица 2

Распределение ^С &УК и'2,4-Д ею фракциям в интактных хдо-ропластах гороха (концентрация ФУК - 100 мг/л, 2,4-Д - 50 мг/л, экспозиция 3 ч., 25-26°С).

Вещество

Суммарная радиоактивность

Ю3 шд/мин на I мл сусп.

% от суммарной радиоактивности эфирораст- • водораст- ' вооткая :вотамая : 14™ фракция .фракция •. 2

1-14С-ФУК

(метка в кольце) 950 ¡М^С-ФУК

(метка в кар- .

ооксиле) * 635

(метка в карбоксиле) 600

114С-2,4-Д

(метка в колице) 556

Ошибка опыта - 2,5-4%

71,0

65,9

59,8 62,4

26,9

29,9

37,7 37,6

2,1

4,2

2,5 Следы

- Ití -

Анатоз .мечешх метаболитов ЛУК и 2,4-Д з хлоропластах гороха показал, что зги соединения является продуктами кокьюгирования ¿УК и 2,4-Д или их океипроизводных с пептидами.

Таким образом можно заключить, что в хлоропластах ¿УК и 2,4-Д в основном коньюгируются с пептидами, а меньшая часть их молекул претерпевает окислительные превращения - гидрокоилироваше, дгкарбоксклирова1!не и расцепление ароматического кольца вплоть до выделения радиоактивного углекислого газа.

Тот факт, что з интактшх хлоропластах исследуемые вещества образуют аналогичное продукты коньюигрова.чня с пептидами, как и 'в растениях in vivo , указывает на активную роль хлоропластов в процессах детоксикации чужеродных веществ.

С целью выявления природы ферментных систем, участвующих в окислительных превращениях и 2,4-Д (метка в карбоксильной

группе) изучено влияние селективных ингибитороз п -хлормеркур-беьзоата натрия, N,11 -дизтилдиокарбамата натрия и <з( Д1 -дипириди-ла на процессы декарбоксилирования изучаемых веществ.

Полученные данное показали, что указаны-'е ингибиторы оказывают различное воздействие на процесс -i декарбоксилирования ФУК и 2,4-Д. Уже при концентрации 10 »i п -хлормеркурбекзоат и h,n-диэтилди.тиокарбамат ингибирумт процесс.: декарбоксилирования, тогда как с»,ы'-дипиридил в этих устовиях не оказывает заметного воздей/ стзия. При концентрации Ю"ЧЫ наблюдается-значительное ингибирую-щее действие перзых двух реагентов, третий ннгибирует процесс J декарбоксилирования-гораздо слабее. При концентрации п -хлормеркур-бензоата и H,N -диэтилдитиокарбамата I0-3..i почти прекращается выделение радиоактивного углекислого газа, в то время как йд'-дипи-ридил ингибирует процесс декарбоксилирования лишь наполовину.

На основании полученных данных следует заключить, что процесс декарбоксилирования ЙУК и 2,4-Д взаимосвязан с другими окислительными превращениями этих веществ, в частности, с гидроксилированием, '.т.к. процессы декарбоксилирования ингибируатся теми же реагентами, которыми подавляется гидроксилирование. tie исключено, что процесс гидроксилировэния является предшествующим актом к з какой-то степени предопределяет течение процесса ¡^екарбоютилирозания ФУК и

Окисление 5УК и 2,4-Д микросомадьными ферментами. С целью установления роли микросомальной редокссистемы в окислении ^С <£УК и 2,4-Д проводили исследования с микросомальной фракцией кукурузы, фракцию инкубировали раздельно с меченными по карбоксильной группе и по кольцу веществами. В качестве второго донора добавляли НАД5Н и НДДН отдельно или в комбинации. Об интенсивности окисления судили по выделении ^СО^ и по количественному соотношению метаболитов ^УK и 2,4-Д (рис. 5).'

Из рисунка видно, что амидопирин значительно снижает образование оксипроизводных из щУК по сравнению с контролем, что указывает на конкуренцию этих веществ за редуцирующие эквиваленты. Добавлением 525А ингибируется процесс гидроксилирования

ФУК. Это указывает на чувствительность ферментной системы минро-сомальной фракции растений к этому ингибитору. Процесс окисления ФУК в микросомальной фракции растений незначительно ингибируется добавлением фенобарбитала. Бензгидроксамат натрия не влияет на процесс окисления ФУК, что указывает на незначительное .участие митохондриальных окислительных систем в этих опытах (рис.5). На основе полученных результатов можно предположить, что феноксиуксус-1 ные кислоты являются субстратами шткросомального окисления, но менее специфичными, чем амидопирин.

I Е* га о з

От-* С

кК ОР-!^ «С* « . о и

с5 ¡в р.

з&ё

>! о о о и й

1+

Рис. 5. Влияние амидопирина (I), фенобарбитала (2), бенз-гидроксаката натрия (3) и БКР- 525А (4) на окислительное превращение 1-^С-ФУК (метка в кольце) в микросомальной фракции из корней кукурузы (фосфатный буфер рН 6,0, НАДф 2,5'Ю"2М, амидопирин Г0"°М, фенобарбитал 2,5'Ю~3М, бензгидроксамат Натрия Ю~5М, 5КТ 525А 6,5'10"®М, 1-Г4С-ФУК-100 мг/л, 25-26°С, Инкубация 4 ч. в темноте) .

ДЕЙСТВИЕ 2,4-Д НА ПРОЦЕССЫ ОБМЕНА БЕГСТВ КЛЕТКИ

Влияние гербицидной концентрации 2,4-Д на некоторые окислительные ферменты кормовых растений. Действие гербицида во многом зависит от применяемой концентрации, продолжительности воздействие видовой специфичности и периода вегетации растений. Нами изучено влияние гербицидных концентраций калиевой соли 2,4-Д на активность о-дифенолоксидазы и лероксидазы в растениях овса и суданской травы. Послевсходовые обработки проростоков проводились водными растворами калиевой соли 2,4-Д. Применяли концентрации гербицида 1,1'10"ёМ и 2,2'10-чМ.

Результаты анализов показали, что как низкие, так и высокие концентрации гербицида заметно стимулируют исследуемые окислительные ферменты. В зависимости от времени воздействия активность о-фенолоксидазы повышается на 100-160% по сравнению с контролем. Максимум активации приходится на 12-дневную экспозицию. После этого наблюдается понижение активизирующего эффекта 2,4-Д и тенденция возврата в пределы нормы. Однако через 24 дня активность изучаемого фермента достаточно высокая (рис.б).

• Экспозиция, дни

Рис. 6. Динамика изменения о-фенолоксидазной (а) и пер-

оксидазной (б) активности в листьях овса и суданской травы под влиянием'2,4-Д. 1411 - овес, П-1У— суданская трава, 1-Ш - концентрация 2,2'Ю~3М,

плу -1,1- 1б3ш;

Как и в случае фенолоксидазы активация пароксидазы зависит от времени воздействия и концентрации гербицида. Максимальное повышение активности исследуемых ферментов достигается через 12 дней. После- этого сгимулирущий эффект гербицида постепенно снимается.

Количественное изучение распределения меченого углерода атра-зина и симазина среди метаболитоэ показывает, что конъюгация с пептидами является основном путем детоксикации этих гербицидов в растениях виноградной лозы, чая, лимона, апельсина, кукурузы и фасоли.

Изучение распределения ^С атра зина и симазина во фракциях органических соединений клетки показало, что меченый углерод включается также и в состав белков.

Исследование радиоактивной части гидролизатов позволило идентифицировать в качестве радиоактивных компонентов белковых конъюгатов оксипроизводные симм-триазинов (аналогично пептидным конъюгатам симазина и атразина).

Белковые конъюгаты атразина и симазина по сравнению с пептидными конъюгатами образуются в меньшей степени, однако, с увеличением экспозиции количество связанного с белками гербицида *

Рис.8. Влияние продолжительности экспозиции на соотношение метаболитов атразина в виноградной лозе I. Конъюгаты с пептидами + совместные конъюгаты с пептидами и глюкозой, П. Белковые конъюгаты, Ш.Неизмененный гербицид

Деалкилирование аминогрупп атразина и симазина. С применением атразина и симазина, меченных по углероду боковых цепей изучали процессы деалкилирования гербицидов в растениях чая, лимона, апельсина, виноградной лозы, кукурузы и фасоли.

Показано, что определенная доля гербицидов подвергается реакциям, затрагивающим заместители при углеродных атомах э положениях 4 и 6.

Об интенсивности деалкилирования молекул гербицидов судили по уровни выделения радиоактивного углекислого газа, а также по включению радиоактивной метки в состав органических кислот, аминокислот и Сахаров.

Как показали результаты опытов, выделение радоиактивного углекислого газа из ^С-атразина в изучаемых растениях протекает не очень интенсивно. Доля радиоактивного углерода, выделяющегося в виде ^4С02 б условиях опыта обычно не превышает Ь% от суммарной радиоактивности поглощенного растением гербицида. С наибольшей интенсивностью атразин и симазин-окисляются в тканях чая и цитрусовых растениях (4,3-7,1%). Для виноградной лозы этот показатель за 192 часа составляет 3,6%, а для фасоли (чувствительна к атразину) - всего лишь 1%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что способность растений к окислительной деградации атразина может служить показателем устойчивости данного вида к триазиновым гербицидам.

Надо принять во внимание то обстоятельство, что образующийся при деградации боковой цепи атразина и симазина не только выделяется в атмосферу, но и включается б обмен веществ растений. Наши эксперименты показали, что меченый углерод "боковых цепей атразина и 'симазина включается в вещества с открытой цепью: радиоактивными оказались органические кислоты, аминокислоты и сахара.

Включение ^С атразина и симазина в состав органических кислот, аминокислот и Сахаров, а также выделение в виде ^С0£ указывает на то,что в растениях эти гербициды подвергаются глубоким окислительным превращениям и'углеродные атомы включаются в общий метаболизм клетки. Интенсивность этого пути превращения по сравнению с другими метаболическими путями невелика (от I до 15$), однако при длительных экспозициях в некоторых видах растений может играть более существенную роль в процессе детокси-кации симм-триазиновых гербицидов.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СИММ-ТРИАЗИНОВЫХ ГЕШЩВДОВ НА ОБМЕН НЕКОТОРЫХ ВЕЩЕСТВ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Изменение количественного со-става пигментов и гидролитической активности хлорофиллаэы листьев виноградной лозы под действием атразина. Влияние триазиновых гербицидов на содержание

•

пигментов и хлорфиллазную активность листьев виноградной лозы практически не исследовано. Мы поставили целью изучить воздействие различных концентраций атразина на содержание пигментов и гидролитическую активность хлорфиллазы листьев виноградной лозы и установить продолжительность фитотоксического эффекта на растения. •

Исследования показали, что изменение состава пигментов, а также активность фермента хлорфиллазы листьев виноградной лозы сорта Ркацители находятся в прямой зависимости от применяемых концентраций атразина. Оказалось, что под влиянием высоких доз (10-16 кг/га) атразина снижается содержание пигментов в листьях виноградной лозы. Одновременно, высокие концентрации гербицида заметно активировали хлорофиллазу (рис.7). Признаки формативного изменения и хлороза отмечаются только при применении герб..цида в дозе 16 кг/га.

На второй год наблюдалась тенденция восстановления содержания пигментов и активности хлорофиллаэы почти до нормы.

я К I К I га е; <ю ж е-

х I в о 01 г шк-1 к о,о х Е-| я о о от пошчк -о « (->, го'а'егяпгЕУяж сь Ч РуОТ очень нлхькья к . я сгсо-н со

О О X £3 Я О СО молхяуоь - \ яжооьпр, от I с?

К Н йце О.Я 0\ г; !с со .о коя -нС ПЛНРЯ 15НЮЛ к

■х о о х я I

о^юо со х Е ч « го о>о и Ргам

о а.

Дата определения

Исходя из литературных данных и полученного нами экспериментального материала можно предположить, что под влиянием атразина существующая зависимость между активностью хчорофил-лазного комплекса и процессом накопления хлорофилла смещается в сторону повыиения гидролитической функции указанного лоли-фермента. ото приводит в конечном счете к снижению содержания хлорофилла. Однако, снижение количества хлорофилла является следствием не только повышения гидролитической активности

хлорофиялазного комплекса, но и возможного влияния гербицида или продуктов его биотрансформации на различные ступени биосинтеза хлорофилла.

Действие атразина и симазина на содержание некоторых фе-нольных соединений и на активность оксидоредуктаз вино града __В чая. Исследовали влияние различных гербицидных концентраций атразина на соединение катехинов, флавонолов, антоцианов и на активность.о-фенояоксидазы, пероксидазы и каталазы листьев и ягод винограда сортов Ркацители и Саперави. Оказалось, что под влиянием атразина количество катехинов уменьшается, причем влияние экстремальной дозы гербицида (16 кг/га) сильнее ингибирует биосинтез катехинов. Изучение влияния атразина на содержание флавонолов (в сорте Ркацители) и антоциановДв сорте Саперави) показало, что при применении гербицида содержание указанных полифенолов в гроздьях заметно возрастает (табл.4).

Таблица 4

Влияние атразина на содержание флавонолов и катехинов винограда сорта Ркацители (3-5-летние растения, экспозиция 6 мес., полевые условия опыта, мг/г на сухой вес)

Дозы гербицида : Образцы ! [ Катехшы :• Флавонолы

Контроль Гребень 44,2 5,0

Кожица + семена 22,7 2,7

Сок 0,05 0,01

8 кг/га Гребень 36,3 5,9

Кожица + семена 18,5 3,2

Сок 0,04 -

16 кг/га Гребень 25,0 ?,2

Кожица + семена 11,3 4,1

Сок 0,02' -

Ошибка опыта - Ь%. Повторность трехкратная %

Из полученных результатов следует, что различные концентрации атразина по-разному влияют на отдельные флавоноидные соединения винограда. Высокие дозы-гербицида значительно уменьшают содержание катехинов, тогда' как количество флавоноидов и антоцианов возрастает. Изменение содержания фенольных соединений при

воздействии гербицидов можно считать закономерны^ если принять во внимание способность растительной ткани разнообразно биотранс-формировать фенольные соединения (Запрометов, 1959, 1977) и еще более интенсивно их синтезировать (Запрометов, Колонкова, 1967). Остается выяснить какие последствия будет иметь повышенно или снижение уровня фенольных соединений в тканях для самих растений. Данные наших исследований показали, что флавоноидные вещества винограда оказались чувствительными биотестами на гербицид, а этот факт следует учитывать при установлении гербицидных доз атразина в виноградниках. Возможно, что появление фитотоксического эффекта триазиновых гербицидов происходит в результате накопления в растительных тканях метаболитов фенольной природы.

Под действием гербицидных концентраций атразина в основном наблюдается тенденция повышения активности о-ди$енолоксидазы, пероксидазы и каталазы листьев и ягод винограда сортов Ркацители и Саперави. В зависимости от концентрации применяемого гербицида и от вегетационного периода, активность исследуемых оксиредуктаз изменяется по-разному.

Под влиянием гербицидных концентраций атраэиг.а (8, 10, 16 кг/га) активность о-дифенолоксидазы сильно возрастает как в листьях, так и в ягодах на протяжении всего вегетационного периода. Максимальная активация этого фермента наблюдается при применении экстремальной дозы гербицида (16 кг/га). Активность о-дифенолоксидазы по сравнению с контролем сначала увеличивается, а затем постепенно снижается. Б конце вегетационного периода при низкой концентрации атразина (8 кг/га) активность о-дифенолоксидазы выше уровня контроля лишь на 10 15% (рис. 10} ,а.). *

Стимулирующее влияние оказывает атраэин также на перокси-дазную активность листьев и ягод исследуемых сортов винограда. Уровень активации этого фермента по сравнению с контролем относительно высокий в листьях виноградной лозы сорта Саперави. Он в июле-августе при концентрации атразина 16 кг/га повышается до 176%. Потом происходит.постепенное понижение активности фермента, но в период сбора урожая вновь сохраняется на достаточно высоком уровне (рис.10,.б).

При исследовании влияния атразина на активность каталазы наблюдается довольно слодная картина. Под действием низких гербицидных доз этого препарата ( <10 кг/га) имеет место активация названного фермента как в листьях,' так и в ягодах в обоих иссле-

дуемых сортах виноградной лозы. С повышением концентрации гербицида (16 кг/га) каталазная активность исследуемых объектов подавляется (рис.10 (в).

Рис. 10 Влияние атразина на активность о-дифенолоксидазы (а), пероксидазы (б) и каталазы (в) листьев винограда сортов Ркацители (1,П) и Саперави (11,1У) (1-й1 - Б кг/га, П-1У - 16 кг/га)

Следует отметить, что ингибиролание каталаэной активности оказалось обратимым, т.к. в конце-вегетационного периода активность фермента восстанавливалась, а в некоторых случаях она даже стимулировалась.

Исследовали также влияние гербицидных коГцентраций атразина и симазина на активность оксицоредуктаз и некоторое биохимические показатели в двухлистиых флешах чайного растения.

Результаты анализов показали, что под влиянием гербицидных концентраций симазина и атразина Наблюдается тенденция активации о-фенолоксидаиой системы чайного листа. Под действием исследуемых гербицидов (за исключением некоторых случаев) наблюдается тенденция повышения содержания танина. Содержание кзтехиьов повышается на 4%, а экстрактивных веществ - на 2$.

С целью установления влияния исследуемых гербицидов на качественные показатели готового черного чая определяли содержание танина, экстрактивных веществ, настой, аромат и вкус.

Таким образом, оказалось, что основные показатели, определявшие качество черного чая, под элияиивм гербицидных доз атразина и симазина меняются незначительно.

ИВТАЁШВШ ДОИГО-О-ШШи (ДНОК), КАРБЛРИЛА Н ЦИНЕЬА В РАСТЕН ИЯХ

Конъюгация цинитро-окпезола и карбарила в растениях. Каши эксперименты показам, что в процессе биотрансформэции Д1ЮК и карбарила в исследуемых растениях в качестве оскозннх метаболитов образуются продукты конвугэции этих ксенобиотиков с кизкомолекуляр-ными пептидами клетки.

Из обработанных 14с д:ок растений виноградной лозы, лимона и кукурузы нами выделены Ц основных метаболитоэ. Среди выделенных метаболитов основная, часть радиоактивного углерода сосредоточена в дзух продуктах биотрансформации пестицида.

Кислотный гидролиз выделенных и очищенных индивидуальных метаболитов ДЮК внсиобогкдал исхо.дкчй пестицид, 3,5-динитро-2-оксибензиловый спирт, 4,6-диамино-о~крезол и два неидентифицирован-ных вещества. Среди метаболитов основная радиоактивность приходилась на 3,5-динитро-2-оксибенэиловый спирт.

В нерадиоактивной части гидролизата идентифицированы следующие аминокислоты: серии, аргинин, треонин, аланин, трифтофан, фе-нилаланин, лейцин. Следовательно, нерадиоактизная'часть кон'->»га-тов является пептидом.

Таким образом, вышеназванные метаболиты ДШК - продукты хоншгацик исходного пестицида или их биотрансформэции с пептидами.

3 процессе биотрансформации карбарила в зависимости от экспозиции и вида растений образуется 4Г5 метаболитов. Из всех вылеченных метаболитов карбарила в преобладающем количестве образуется один. На указанной продукт приходится 60-90$ от всей радиоактивности усвоенной растением пестицида. 3 конце 72 ч. на неизмененный пестицид приходится 6,0-16,4$.

Различными химическими и физико-химическими методами установ- . лено, что выделенные нами метаболиты карбарила являются продуктами конъюгации с эндогенными веществами клетки.

С целью изучения химической природы образующихся конънгатов проводи та кислотной гидролиз. В результате образовывались нерадио-

акгиБнче аминокислоты й соответствующие продукты биотрансформации карбарила. В качестве главного метаболита из всех изучаемых растений нами идентифицирован с( -нафтол.

На основании полученных данных можно заключить, что при метаболизме ДГОК и карбарила в растениях основными реакциями являются окисление и образование конъюгатов с пептидами (рис.11).

Рис.11 Возможные процессы коньюгации ДНОК (А) и карбарила (Б) с пептидами -.

Данные, полученные в наших экспериментах, показывают, что количество пестицидо-пептидных конъюгатов зависит не только от химической природы ксенобиотика, но и от вида растений. Интересно отметить, что количество пестицид-пептидных конъюгатов возрастает с увеличением продолжительности контакта растений с ксенобиотиком. •

Определенная часть меченого углерода исследуемых пестицидов включается в состав белковой фракции.

Расщеп тенив ароматического кольца Д'ЮК и кар^апита з растениях. 0,рзскр;1тии бензольного кольца дшштро-о-крезола (Д!ЙК) в растениях судили по выделению ^СО^

Опыты показали, что за 72 часа из меченной по кольцу ^С-ДНОК определенное количество (1,1-1,7>) окисляется до углекислого газа.

Расщепление ароматического кольца нами установлено и для меченого кольц? С-карбарила. В этом случае до за 72 ч.

окисляется от 0,5 до 1,3$ усвоенного растением пестицида.

Как показали результаты опытов, интенсивность глубокого окислительного превращения исследуемых пестицидов по сравнению с другими метаболическими путями невелика (1-25? за 72 ч.), однако, как-отмечалось, она приводит к полной цетоксикации.

В последнее время интенсивно изучаются окислительные процессы гидроксилировапия многих ксенобиотиков •( в том числе схожих по химической структуре с карбзрилом) микросомами, животных и растений. Показано участие в ней цитохрома Р-450 (Арчаков, 1975).

Цель» настоящего исследования являлось установление роли микросомальнчх ферментов растений з процессе окисления карбарила.

Микросомальную фракцию выделяли из корней 10-дневных проростков гороха.

Интенсивность окисления карбарила оценивали по количеству образовавшегося »1 -нафтола. Об интенсивности окислительного катаболизма карбарила сулили по выделению радиоактивного углекси-лого газа.

Результаты экспериментов с применением

14С -карбарила показали, что окислительный процесс не ограничивается актом образования с>ч- нафтола, но идет с последующим окислительным расцеплением ароматической структуры и выделением радиоактивного углекислого газа. Таким образом, результаты позволяют заключить, что микро-сомальная фракция из корней гороха окисляет карбарил до расщепления ароматической структуры пестицида. Идентифицирован конечный продукт окисления ^СО^. Определяющим актом окислительного катаболизма карабрила, по-видимому, является образование с^-нафтола. Процессы образования сЭг нафтола и расщепление ароматической структуры карбарила стимулируются никотинамидными коферментами, не чувствительными к гидроперекиси кумила (донор активного кислорода) и амидопирина (субстрат микросомального окисления 1-го типа).

Изучение динамики разложения ци.чеба в растениях. Продукты разложения ''"^С цинеба- изучали в саженцах виноградной лозы и в проростках томата.

Результаты исследований показали, что при 72-часовой экспозиции основная доля радиоактивного углерода цинеба (60-65%) включается в низкомолекулярные вещества клетки, незначительное количество (10-135?) включается в биополимеры, а определенная доля (8-1052) выделяется в виде ^СС^. Выделение из молекулы

С цинеба указывает на то, что з исследуемых растениях определенное количество пестицида претерпевает полную детокеикацию. Надо полагать, что с увеличением экспозиции путь полной детокси-кации будет более значительным.

Интересно отметить, что конъюгаты циноба и .и его метаболитов с компонентами клетки (пептида, аминокислоты, углеводы) не обнаружены. Результаты нащих анализов показали (методы смешаных проб и качественных реакций), что в качестве основных метаболитов в изучаемых растениях обнаруживается этилентиомочевина (60% из всех метаболитов). Определенная часть ^С цинеба после 72-часовой экспозиции остается в неизменном виде.

С целью изучения динамики разложения цинеба (как неизмененного, так и его основного метаболита) в винограде и плодах томата • растения обрабатывали 0,45$-ным препаратом фунгицида (норма расхода 4,5 кг/га) и количество цинеба определяли в процессе созревания плодов (табл.5).

Таблица 5

. Разложение цинеба в плодах винограда и томаяа в процессе созревания (плоду обработаны 0,45»-нкм препаратом цинеба)

Плоди Время после обработки в Содержание цинеба: мг/кг сырой биомассы

сутках кожура сок (мякоть)

3 3,75+0,08 0,64+0,06

Виноград ю. 1,95+0,04 1,25+0,07

30 0,70+0,01 0,28+0,04

40 ■ 0,065+0,004 0,38+0,003 ■

3 4,84+0,07 0,76+0,03

Томат 10 2,60+0,04 : 0,46+0,02■

• - 30 0,85+0,005 0,14^0,003

40 0,072+0,004 0,026+0,003

Как показали результаты,э обработанных плопах цмнеб сохраняется довольно длительное зремя. Следовательно, строгое регламентирование "времени ожидания" является необходимом условием для обеспечения нужного урозня остаточных количеств цинеба в растительной продукции.

О РОЛИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ 3 ПРОЦЕССАХ ИР^ШИЗАЦИП ПЕСТИЦИДОВ

Как было показано выше, конъюгация с низкомолекулярными пептидами клетки является основным путем метаболизма пестицидов в растениях.

Возникает вопрос: конъйгируются ли пестициды с уже имеющимися в клетке пептидами или же с синтезированными в растениях посте обработки ксенобиотиками?

С целью выяснения этого вопроса изучали влияние ФИ, 2,4-Д атрайина, симазина и карбарила на биосинтез пептидов.

Полученное результаты показали, что введение в проростки растений пестицидов вызывает ответную реакцию со стороны растения, выражающуюся в накоплении низкомолекулярнух пептидов. Количество пептидов возрастает под влиянием фвноксиуксусной кислоты, .2,4-Д, симазина и атраоина. Что касается карбарила, то количество пептидов а обработанных этим пестицидом в растениях гороха было на уровне контроля, а в кукурузе - меньше по сравнению с контролем. Следует думать, что степень стимуляции биосинтеза пептидов зависит от многих факторов, но одно ясно, что увеличение количества пептидов является ответной реакцией растения на поступление в клетку пестицидов.

О механизме образования пестицид-пептидных коноюгатоэ в растениях. Для изучения механизма образования пептидных конъюга-.тов пестицидов из корней гороха выделяли пептидную фракцию, очищали ее от аминокислот и инкубировали с "^С 2,4-Д, атразкном и карбарилом (концентрация 10~чм). После инкубации (З 'час.) проводили анализ реакционной смеси с целью выяснения возможности образования пептидшх конъыгатов з этих условиях. Результаты анализов показали, что пептцднне коньагаты ксенобиотиков не образуются.

3 дпльнеГые.Ризучали возможности образования пептидных конь-агатов исследуемых пестицидов в присутствии суммарного белкового препарата.

Оказалось, что в таких условиях опытоэ (в присутствии сухарного белка) часть исследуемых пестисрпов образует ко»!м;готи с пептидами, часть вкчввдется в состав биополимеров, а определенная доля остается в неизменном вице (табл.6).

Таблица 6

Распределение радиоактивной метки ^G 2,4-Д, атразина и карбарила по фракциям в реакции in vitro (уц.радиоактивность 2,4-Д - III* 10^ Ьк/г, атрззина - 52,2'Ю7 Ьк/г, карбарила -Id,5*М'ьк/г, концентрация Ю'ЧЫ на I г белка, экспозиция 3 ч., 25-26°С).

:0бщая радио-д % от общей радиоактивности_

Пестицид :шКД/минСнп т .пептидные '.фракция био.неизмененный ■ г ipin :кокьюгатн 'полимеров 'пестицид

2,4-Д 130,0 23,1 14,2 62,7

Атразин 119,4 17,3 10,4 72,3

Карбарил 27,3 15,4 16,4 6Ъ,2

Ошибка опыта 4%

С целью выявления природы ферментов растительной клетки, участвующих в конъюгации исследуемых пестицидов с пептидами, использовали метод сечективного.ингибирозания.

Проведенные исследования с применением в качестве селективного ингибитора Я-хлормэркурбенэоата натрия (концентрация 10~ЧМ) показывают, что этот ингибитор не оказывает существенного влияния на образование" пестицид-пептидных конъвгатоа. Это дает основание заключить, что исследуемый фермент не содержит в активном центре сульфигидрильную группу.

Результаты, полученные нами путем применения 5-1 ,н --диэтил-дитиокарбамата (концентрация 10-ча) показали, что названный ингибитор подавляет образование пептидных конъюгатов.

Эксперименты с применением <*,о(' -дипиридила показали, что этот ингибитор (концентрация 10~ЧМ) также подавляет синтез

(Яблоков, 1988, Kenzil, 1973, Huber, Otto, 1982).

Полученные нами материалы о судьбе пестицидов в культурных растениях, токсикологическая оценка продуктов их биотрансформации делают необходимым, чтобы соответствующие службы в обязательном порядке контролировали, в первую очередь в продуктах питания и кормах, конъюгированные с эндогенными биокомпонентами потенциально опасные метаболиты.

Проведенные исследования послужили основой для разработки способов определения свободных и конъюгировакных форм некоторых пестицидов.

На основе познания механизма превращения исследуемых пестицидов можно выявить способы ускорения и регуляции процессов их биотрансформации в сторону полной детоксикации.

Изучено влияние различных концентраций исследуемых пестицидов на важные биохимические показатели и ферментные системы различных растений. Результаты этих исследований целесообразно учесть при нормировании удельных- расходов и установлении сроков обработки культурных растений.

С учетом полученных сведений о физиологической активности, токсичности и персистентности отдельных продуктов биотрансформации исследуемых пестицидов следует пересмотреть и обоснование перечня пестицидов, относимых к основным химическим загрязнениям продуктов питания и природной среды в целом.

ВЫВОДЫ

Исследован метаболизм и влияние на обмен веществ пестицидов - производных феноксиуксусных кислот (§УК, 2,4-Д), симм-триа-зинов (симазиы, атразин), бис- и дитиокарбаматов (карбарил, ци-неб) и нитрофенолов (ДНОК) в растениях. Установлено, что:

I. В растениях усвоенные пестициды-.подвергаются разнообразным превращениям. Важнейиими путями метаболизма 'исследуемых пестицидов является окислительные реакции и образование конъюгатов с эндогенными компонентами растительной клетки. Процессы биотрансформации и конъюгации изучаемых пестицидов протекают достаточно быстро, так как после 72-часовой экспозиции неизмененные молекулы названных ксенобиотиков в растениях практически^не

обнаруживаются.

2. Выявлены и идентифицированы ранее неизвестные продукты метаболизма исследуемых пестицидов, образующиеся при конъюгации самих веществ и продуктов их трансформации с низкомолекулярными пептидами. Конъюгация осуществляется за счет функциональных групп пестицидов (-С00Щ -ОН, -ннг) и свободных функциональных групп пептицов (-С00Н, _цд ).

Выяснен аминокислотный состав участвующих в конъюгации пептидов и химическая природа пестицидных фрагментов в таких конйогатах. В пептидную часть конъюгатов в основном вхоДят следующие аминокислоты: изолейцин, лейцин, валин, метионин, о( -аланин, треонин, глицин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.

3. Установлено образование сложных конъюгатов оксипроиз-водных ФУК, 2,4-Д и атразина с глюкозой и пептидами, вероятнее всего, одна из имеющихся функциональных групп исследуемых гербицидов блокируется молекулой пептида, другая - Д-глюкоэой.

Из обработанных 2,4-Д растений кукурузы (усвоение гербицида через листья) выделен эфир 2,4-Д с глюкозой - 1-0-(2,4-дихлорфеноксиацетил)- Д-глюкоза.

4. В процессе метаболизма исследуемых пестицидов часть образующихся океипроизводных необратимо связывается с белками, образуя белковые конъюгаты. С белками связывг.ется значительно . меньшее количество пестицидов, чем с пептидами, однако с увеличением экспозиции содержание белковых конъюгатов возрастает.

5. При глубоких окислительных превращениях ФУК, 2,4-Д, карбарила и ДЮК первичным процессом является гидроксилирование. Дальнейшие окислительные превращения океипроизводных приводят деградации ароматического ядра. Установлена способность стерильных проростков исследуемых растений окислять молекулы ФУК, 2,4-Д, карбарила и ДЮК вплоть до расщепления ароматического кольца. Б результате ароматический углеродный скелет молекул исследуемых пестицидов включается в общий метаболизм. Среди промежуточных продуктов окисления ФУК,- 2,4-Д, карбарила и ДЮК выделены и идентифицированы радиоактивные вещества с открытой цепь» - органические кислоты, аминокислоты, сахара, а также

СО^. Интенсивность глубокого окислительного превращения исследуемых пестицидов по сравнению с другими метаболическими

процессы адренорецепции нервных клеток моэта млекопитающих. -Труды П.Респ. конф. на тему?"Проблемы экологической биофизики", Тбилиси, 1966, с.64.

27. Кахниашвили Х.А. Исследование процессов детоксикации пестицидов производных карбаминовой (севин) и дитикарбаминовой (цинеб) кислот в растениях. - Материалы научно-практической конф. Тбилиси, 1967, с.42.

28. Кахниашвили Х.А., Дурмишидзе C.B., Гигаури M.U. Исследование путей превращения 14с -атразина в растениях чая. -

■ Агрохимия, 1987, И, с.8Э.

29. Кахниашвили Х.А. Синтез о-дшитро-о-крезола (ДШК) и изучение его метаболизма в растениях. - Материала

Iii Респ. конф- по биохтаз!н я физиологии растений. Тбилиси, 198Г7. с. ПО.

30. Дурястдзе C.B., Доздаркиш Т.З., Дгхкнгсткли Х.А., Буадзе O.A. Бготрансфорггцкя ггеенобЕоиков з растениях. -Уонографяя, Кяд^си, ]3ег51йереба, 19а8, 273 с.

31. КгхЕггззяла Х.А., Дургютдзэ €.3., Ткегндздзе Р.2., Гаручаза IÎ.3. »I^rajEsaEE« л фгзЕзэ-лмдэсзая ззрактертетгЕЗ прз^уягэз мэтабэлЕЗЕа 2,4-Д з tcjbhiehx растениях. — Доклада Mi СССР, раздел "Brasдш", т.ЗЕО, s.730t РЗ.

32. йрятгящвз C.B., .ХгрезЕгтздзэ Д-5., Ещсзалгетя Я.А. Лсмядзе Э.Я., Джггшазжпн Т. А. Сгаееб определения Езгбзрига icesasa) з рзстятздяззя кетерягяз. — A.c. ЗЕ£Ш37ш El ГОЭ» Е£Э.

33. Езхнжпвкжл H.A., Гарутазз 15.3. Оззгтэб сарз^этеетя 2,4-Д я ее гтвтэбэгггтсз з zsjtsîhsï рзетгетях. — A.c. 33521502, BI То, ЕШ

34. Назкяззвига Х.А., Сясвгузтдаз H.H., Гогсзздзз Г.Г., Гкгауря Влияклэ ся?.гг-?рязззз?<;з';х герйтцядоз и рэунздлэ ка некоторые биохиятаесние погаззтеги и плкстаэ тая. - Субтропические культуры, 1989, !?1, с.61.

35. Кахниаавилп Х.А., Дурышвдээ С.З., Гигауга ÎI.ZÎ. Метаболизм симм-триазиновых гербицидов в чзе и цитрусовых растениях. - Физиология растений, 1989, вкп.1, т.36, с.99.