Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм дофамина у DROSOPHILA VIRILIS в нормальных и стрессирующих условиях среды. Генетико-биохимические аспекты

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм дофамина у DROSOPHILA VIRILIS в нормальных и стрессирующих условиях среды. Генетико-биохимические аспекты"

На правах рукописи УДК 575.16:*591.14: 595:773.4

У

ШУМНАЯ Людмила Владимировна

МЕТАБОЛИЗМ ДОФАМИНА У ОНОБОРНИА УШИБ В НОРМАЛЬНЫХ И СТРЕССИРУЮЩИХ УСЛОВИЯХ СРЕДЫ. ГЕНЕТИКО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ.

Генетика 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

И.Ю. Раушенбах

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Дыгало H.H.,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук,

профессор,

Кайданов Л.З.,

Санкт-Петербургский университет, г. Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится " г. на

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-.002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " " ^^»г^гр^ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема стресса является одной из важнейших в современной биологии. Актуальность исследования реакции стресса насекомых связана, во-первых, с тем, что сопоставление ее механизма у насекомых и млекопитающих может пролить свет на эволюционные закономерности возникновения этой защитной биологической реакции, и, во-вторых, с тем, что насекомые могут служить моделью для выяснения закономерностей генетического контроля стресс-реакции млекопитающих.

Действительно, хотя эволюционные пути млекопитающих и насекомых разошлись порядка 600 миллионов лет назад и механизм стресс-реакции насекомых не идентичен таковому у млекопитающих, некоторые звенья этой реакции одинаковы у представителей обоих классов, в частности, биогенные амины (обз.: Jankovic-Hladni, 1991; Chernysh,1991; Rauschenbach, 1991).

В течение последних 15 лет во многих исследованиях было установлено, что у насекомых различных видов из разных отрядов стрессирующие воздействия вызывают повышение содержания октопа-мина, дофамина и, в ряде случаев, серотонина в гемолимфе и в тканях нейрального происхождения. Причем ответ системы биогенных аминов на стрессирующие воздействия оказался неспецифичным. Он возникает при действии высокой и низкой температуры, высокой плотности, механических и химических раздражителей, при социальном и иммобилизационном стрессе (Orchard et al., 1981; Davenport. Evans, 1984; Kozanek et al., 1988; Harris, Woodring, 1992; Hirashima, Eto, 1993; Hirashima, 1995). Необходимо отметить, что несмотря на большой интерес в мире к этой проблеме, никто пока не занимался выяснением вопроса, какие звенья в цепи метаболизма биогенных аминов у насекомых ответственны за повышение их содержания при стрессе. Насколько можно судить по доступной нам литературе, отсутствуют также исследования, в которых предпринимались бы попытки изучения генетического контроля ответа системы метаболизма биогенных аминов на стрессирующие воздействия. В нашей лаборатории ( лаборатории генетики стресса насекомых) была создана модель, делающая возможным проведение такого рода исследований. Модель представлена двумя линиями Drosophila vi-rilis , контрастно различающимися по реакции на стрессирующие

воздействия. Особи одной из линий (101) отвечают на стрессирую-щие воздействия возникновением стресс-реакции и адаптируются благодаря этому к неблагоприятным условиям среды. У особей другой линии (147) подобная реакция отсутствует (обз.: Раушенбах, 1990).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование ответа системы метаболизма биогенных аминов (дофамина и серотонина) 0.у1гШз на стрессирующие воздействия и изучение его генетического контроля. Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить содержание дофамина и серотонина у имаго линий 101 и 147 Б. у!гШз, контрастно различающтхся по реакции на стрессирующие воздействия, в нормальных условиях и при кратковременном стрессировании у провести генетический анализ обнаруженных различий.

2. Исследовать систему метаболизма дофамина у имаго линий 101 и 147 Б. уХгШб: а/ Изучить активность фенолоксидаз у имаго обеих линий в нормальных условиях и при кратковременном тепловом стрессе и провести генетический анализ обнаруженных различий. б/ Исследовать активность тирозингидроксилазы у имаго обеих линий и их П гибридов в нормальных условиях и при кратковременном тепловом стрессе, в/ Изучить активность дофадекарбок-силазы у имаго обеих линий в нормальных условиях и при кратковременном тепловом стрессе и провести генетический анализ обнаруженных различий.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучен генетический контроль содержания дофамина у насекомых. Показано, что у Б.у1гШз содержание амина в нормальных условиях и при стрессе контролируется генами, локализованными в разных группах сцепления, в Х-хромосоме в первом случае и в аутосоме - во втором. На основании результатов исследования активности трех ферментов синтеза дофамина (монофенолоксидазы, тирозингидроксилазы и дофадекарбоксилазы) и одного фермента деградации (дифенолок-сидазы) у мух линий О.уХгШб с высоким и низким содержанием амина, впервые установлено, что содержание дофамина у БгоБорЫ-1а в нормальных условиях регулируется в большей степени контролем его деградации, чем синтеза. Впервые у изучен генетический'контроль активности дифенолоксидазы и дофадекарбок-

силазы. Впервые исследовано влияние стрессирующего воздействия

на активность ферментоЕ, метаболизирующих дофамин у насекомых. Установлено, что активность дифенолоксидазы, нонофенолоксидазы и дофадекарбоксилазы у D.virilis не изменяется в условиях стрссса. Активность тирозингидроксилазы резко снижается при 30 - 60 минутном стрессировании и возрастает при более длительном. Предложена гипотеза с механизме регуляции содержания дофамина у DrosopMla в условиях стресса. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание механизма стресс-реакции насекомых и закономерностей ее генетического контроля и могут быть полезны "сслвпппчтрлям, занимающимся проблемой стресса у позвоночных.

Анрооания результатов. Результаты работы были аредсгавяенц на Международной конференции "Механизмы адаптации у беспозвоночных к изменениям окружающей среды (Айзенах, Германия, 1993) и 1-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994г.),

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 130 наименований. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и 13 таблиц.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории, Гренбзк Л.Г., Грунтенко Н.Е., Сухановой К.Ж. и дипломнице НГУ Тимохиной И.С., принимавшим участие в выполнении ряда экспериментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исследование проведено на двух линиях D.virilis, контрастных по их реакции на действие длительного теплового стресса: линии 101 дикого типа и линии 147, несущей мутации brick, broken и detached в хромосоме II и температурочувствительную деталь в хромосоме VI. У особей линии 101, развивзв;цихся в условиях длительного теплового стресса (32°С в течение третьего личиночного возраста), возникает стрессорная гормональная реакция, позволяющая адаптироваться к неблагоприятным условиям и нормально ме-таморфизировать. У особей линии 147 температурочувствительная мутация нарушает, одно из звеньев стрессорной реакции и они нес-

пособны к метаморфозу при 32°С.

Использовали три типа стрессирующих воздействий: 1) помещение мух в термостат с температурой 38°С (время экспозиции указано в соответствующих разделах), 2) анестезия эфиром в течение 20 секунд, 3) встряхивание на шейкере в течение часа. Содержание дофамина (ДА) и серотонина (5НТ) измеряли, • используя слегка модифицированный фдюориметрический метод Майкеля с соавторами (Ма1ке1 1?. Р. еЬ а1., 1968). Активность моно и'дифе-нолоксидазы в полиакриламидном геле определяли, используя модифицированный метод Рицки с соавторами (Иг1а е! а1., 1985). Для измерения активности тирозингидроксилазы был использован модифицированный радиоизотопный мед'од Нагацу с соавторами (ЫаеаЬБи Т. еЬ а1., 1964). Активность дофадекарбоксилазы определяли, используя модифицированный радиоизотопный метод МакКэмана с соавторами (МсСашап et а1., 1972).

Для статистической обработки результатов использовали <:-тест Стьюдента и критерий х2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. I. Биогенные аыикы 0.у1гШб в нормальных условиях и при

кратковременном стрессе 1.1. Изучение содержания ДА и серотонина в онтогенезе линий 101 и 147

Измерение содержания ДА и серотонина проводили у особей линий 101 и 14? 0.у1гШз с конца второго личиночного возраста и до вылета имаго. Результаты измерений содержания ДА представлены на рис.1. Видно, что в ходе развития у обеих линий наблюдается два пика содержания амина, первый при формировании пупариума,. второй при вылете имаго. Как следует из рис.1 динамика изменения содержания ДА в ходе метаморфоза у особей обеих линии не различается, однако, после вылета имаго, содержание дофамина становится существенно выше у самцов и самок линии 147, чем у особей линии 101 (различия достоверны, Р>0.99). При этом необходимо отметить, что данные различия не связаны с отличиями в массе особей, так как мы установили, что последняя достоверно не различается у мух линий 101 и 147.

Результаты измерения содержания серотонина в онтогенезе линий 101 и 147 показали, что изменения в его содержании не столь выражены и межлинейные различия отсутствуют.

30 25 20 15 ГО 5

.гЬ

101

24 48 72 96 0 24 48 72 96 0 21

IV ч

V

✓ ^

\

V

/

✓ / V

-ч

^

/

«"> Л

Рис.1. Динамика содержания дофамина в онтогенезе линий 101 и 147

1 - самцы и самки

2 - самки

3 - самцы

01 02

а3

Ж

147

¿5

гЬ

О 24 48 72 96

вылуп-леняе

О г

цупари-ация

36 О *

вылет

24

24 48 72

РАЗВИТИЕ (час)

1.2. Влияние кратковременного стресса на содержание ДА и серо-

тонина у 0.у1г1Из Исходя из данных о том, что изменение содержания биогенных аминов при стрессе является видоспецифическим ( у разных видов содержание различных биогенных аминов изменяется при стрессе) мы исследовали влияние трех видов стрессорных воздействий -кратковременного теплового (60 мин), анестезии и механического стресса на содержание биогенных аминов у-0.у1гШв. На рис.2 приведены результаты измерения содержания ДА при

кратковременном (60 мин) тепловом стрессе у особей линий 101 и 147 0.у1г111з. Видно, что у куколок обеих линий в условиях теплового стресса содержание ДА не изменяется. Вместе с тем, 24-часовые имаго ( самки' и самцы) обеих исследуемых линий реагируют на тепловой стресс возрастанием содержания ДА. Однако. если у мух, линии 101 различия с контролем высоки и достоверны, Р>0.99, то повышение содержания ДА у особей линии 147 весьма незначительно. Механическое и химическое стрессирование мух обеих линий дало аналогичные результаты: у особей линии 101 содержание ДА резко--возрастало, а у мух линии 147 изменялось крайне мало.

Рис.2. Влияние теплового стресса (38°С, 60 мин) на содержание ДА у особей линий 101 и 147 0.у1гШз. А - куколки, В -мухи; 1 - контроль, 2 -опыт

Измерение содержания серотонина у куколок и мух обеих линий после 60 минутной экспозиции их при 38°С показало, что кратковременный тепловой стресс не влияет на содержание этого амина у.

Таким образом, мы выяснили, что содержание серотонина при тепловом стрессе у 0.у1г1118 не изменяется, а содержание ДА существенно возрастает у мух дикого- типа (линия 101).

Далее мы попытались выяснить, не коррелирует ли способность

мух реагировать на стреосирующие воздействия возрастанием содержания ДА при стрессе. Мы изучили выживаемость мух обеих линий после экспозиции их при 38°С в течение 1, 3 и 6 часов и обнаружили положительную корреляцию между этими признаками. 1.3. Генетический контроль содержания ДА у О.уггШэ в нормальных условиях и при стрессе Поскольку исследуемые линии различаются по содержанию ДА в норме и чувствительность метода позволяет измерять его содержание у одной мухи, оказалось возможным осуществить генетический анализ наследования данного признака. Результаты этого анализа представлены на рис.3.

га101 га м?

□ 147x101 £3 ¡01x147 ПВ £¿(101x147 )х!47

8 12 16 20 24

4 В 12 18 20 21 28 32

одариив доздкинл (шг/г шеек т»»)

Рис.3. Гибридологический анализ различий в содержании ДА у линий 101 и 147

На нижних графиках приведены гистограммы распределения особей

по содержанию ДА в двух выборках родительских линий 101 и 147 для самок и самцов. На средних графиках показаны гистограммы распределения особей в выборках реципрокных гибридов П , на верхних графиках - соответствующие распределения для потомства беккросса. Объемы выборок Р1, Р2, п , В (беккросса) равны, со-

ответственно, 92, 78, 100, 96 для самок и 99, 85, 105, 98 - для самцов. Из единообразия гибридных самок двух направлений скрещивания можно ааключить, что у гибридов Р1 отсутствует материнский эффект. Низкое содержание ДА у последних, характерное для линии 101, свидетельствует о доминировании этой линии по данному признаку ( степень доминирования, рассчитанная по Фоль-конеру (Ра1копег, 1960) равна 1.03 ). У гибридных самцов в зависимости от направления скрещивания наблюдаются различные уровни ДА. В случае, когда матерью является самка из 101 линии, у гибридных самцов обнаруживается низкий уровень ДА, характерный для линии 101. Если родительская самка принадлежит линии 147, уровень ДА у самцов П высок. Все это вместе взятое позволило предположить, что генетические элементы, контролирующие различия в содержании ДА у исследуемых линий локализованы в Х-хромосоме. Исходя из данного предположения было поставлено анализирующее скрещивание по схеме: О Г1 (101x147) х 0 147.

На гистограмме распределения особей в выборке потомства бекк-россов хорошо видно, что оно распадается на два класса и для самок и для самцов. Такой вид распределения позволяет рассмотреть вопрос о справедливости гипотезы о моногенном контроле различий в содержании ДА у мух линий 101 и 147.

1& осуществили проверку гипотезы критерием %г и установили, что она не отвергается.

Так как линии 101 и 147 Б.у1гШб отличаются по уровню ДА в норме, проведение генетического анализа различий в содержании ДА при стрессе с использованием абсолютных значений было невозможно. Поэтому мы анализировали различия в реактивности ДА системы при стрессе, под которой понимали повышение содержания ДА при стрессе в процентах к контролю. Проведенный анализ показал, что признак не сцеплен с полом, что аллель линии 147 доминирует (степень доминирования равна 0.81) и что характер расщепления в потомстве бэккросса соответствует гипотезе о моногенном контроле признака. Нельзя, конечно, исключить эффект майоргена или наличия блока тесно сцепленных генов, но нам это представляется маловероятным.

II. Метаболизм ДА у Ю.уШПб в нормальных условиях и при тепловой стрессе 11.1. Фенолоксидааы (ФО) Б.у1гШз

•<¡4*. д

w

IS?

¡A

P

3 4

2 3

Рис. 4. Спектр фенолоксидаз. у D.virilis. Al, А2, A3 - основные фракции спектра, 4 - фракция с непостоянным проявлением, г - компонент РКОХ. образцы 1,2 слева и i-з справа -ДСФА о качество субстрата; образца 3,4 слева - тирозин в кячег.ткй елгбетоата* образец 1 ^ справа - получасовая инкуба-п тени »''-ничичевиной (чхЮ^П перед злектрсфсрзссм.

ФО у D.virilis до сих пор не были описаны. На рис.4 представлен спектр фенолоксидаз линии 101. Образцы 3,4 слева представляют собой спектр ФО линии 101 при использовании в качестве субстрата тирозина, образцы 1,2 слева - в качестве субстрата использован ДОФА. Видно, что так же, как у D.melanogaster (Rlz-kl et al., 1985; Pentz, Wright,1986 ), спектр представлен тремя огнокнади Фракциями, которые мы по аналогии с D.melanogaster обозначил;! А1, А2, A3. Кроме того, в спектре ФО D.virilis иногда вылзллотся ещо две фракции: одна - медленномигрирующая, на рисунке оча обочнач^на цифрой 4 я вторая - самая быстромигриру-&шая. которая, пс-видимому, соответствует кокг.онегпу РНОХ у D.iaelaaoEaster (Pent;', Wright.198R). Видно, что хотя все фракции обладают и ДФО и МФО активностью, при использовании в качестве субстрата тирозина самой высокой активностью обладает компонент А1, который.по-видимому, и является собственно монофе-нолоксидазой (МФО). Когда же в качестве субстрата был использован ДОФА, активность компонента А) оказалась существенно ниже, чем активность А2. Компонент А2, очевидно, и является собственно дифенолоксидазой (ДФО). Необходимо отметить, что А2 у D.virilis состоит из двух субфракций, настолько близко друг к другу .мигрирующих, что они различимы лишь при денситометрии (см. рис. 5).

Хорошо также видно, что все фракции ФО ингибируются фенилтиомо-чезикой (образец 1, справа), что свидетельствует о том, что мы имеем дело именно с ФО, так как фенилтиомочевина является специфическим ингибитором этого фермента.

Изучение спектра МФО самцов и самок линий .101 и 147 в норме и при стрессе показало, что ни самки, ни'самцы обеих исследуемых, линий.не различаются по активности МФО в норме и что кратковременный тепловой стресс (60 мин) не .влияет на активность МФО. у обеих линий.

Исследование спектра ДФО. у самок и самцов линий 101 и 147 в норме и при тепловом стрессе позволило установить, что стресс не влияет на ДФО активность ни у самок, ни у самцов обеих линий. Вместе с тем, линии отчетливо различаются по активности А2 компонента в норме (рис.5). Активность этой фракции у самок и самцов линии 101 существенно выше, чем у особей линии 147.

Рис.5. Денситограммы спектра ДФО линий 101 и 147 и их П гибридов. Кривые: сплошная - линия 101, штриховая - линия 147, штрихпунктирная - гибриды 101x147, волнистая - гибриды 147x101.

Проведя с помощью денситометрии измерение относительной активности ДФО у самок линий 101 и 147, мы убедились, что линии не трансгрессируют по данному признаку, . следовательно, различия в активности ДФО можно рассматривать как качественные и возможно провести анализ генетического контроля этих различий.

Результаты анализа активности ДФО. у гибридов П обоих направ-

А2

лений скрещивания представлены на рис. 5. Мы показали, что у санок гибридов обоих направлений скрещивания активность ДФО не различается и соответствует активности фермента у самок линии 10Т" (рис.5).1 Вместе с тем, активность ДФО у самцов различных

направлений скрещивания отличается. Хорошо видно, что, когда родительская самка принадлежит линии 147, активность ДФС у гибридов существенно ниже, чем у самцов 101 пинии и близка активности фермента у самцов 147 линии. У реципрокных гибридов активность ДФО соответствует активности фермента у самцов линии 101. Таким образом, мы установили, что признак сцеплен с Х-хро-мосомой и что линия 101 доминирует.

Походя из от:::: сэкточечий; анаиизиоующее окреалваапг было проведено по следующей схеме: ^ Р1 (101x147; х 0 147.

Среди потомства беккросса отчетливо обнаруживались особи, имеющие по уровню ДФО активности фенотипы 147 линии и гибридный. Результаты анализа наблюдаемого расщепления показали его соответствие гипотезе о моногенном контроле признака.

Интересным представляется сопоставление генетического контроля различий в активности ДФО у линий 101 и 147 и контроля различий с содержании ДА у зтих линий. И те и другие контролируются монотонно ( или блоком тесно сцепленных генов ) и в обоих случаях ген локализован в Х-хромоссме. По-видимому, это один и тот же ген, и более высокое содержание ДА у особей линии 147 по сравнению с мухами линии 101 объясняется более низкой активностью ДФО у первых. Это заключений подтверждается, как будет показано ниже, результатами исследования активности ТГ и ДДК у самок и самцов линий 101 и 147. 11.2. Тирозингидроксилаза (ТГ) Б.у1гШз

3 таблице 1 приведены результаты измерения активности фермента, у 24 час самок и самцов обеих исследуемых линий и их П гибридов в нормальных условиях.

Активность ТГ оказалась в норме выше у самок, чем у самцов Хотя содержание ДА'выше у самцов (см.рисЛ) .По-видимому, более высокое содержание ДА у самцов связано не с более интенсивным синтезом амина, а с менее интенсивной его деградацией: как уже говорилось, активность ДФО, деградирующей ДА и ДОФА, у самцов Б. У1гШз ниже, чем у самок (см. рис. 5). Межли-

Таблица 1. Активность ТГ у 24 час самцов и самок линий 101 и 147 0.у1гШз и их ?! гибридов

Группа Активность ТГ (фмоль/мин/животное)

линия 101 ЛИНИЯ 147 П(101X147) П(147x101)

самцы самки 554+18.3 651±35.4 232+14.7 296±26.2 510±19.8 513+36.3 642+23.0

Примечание: "-" - измерения не проводились нейное сравнение активности ТГ демонстрирует ту же закономерность. Активность фермента существенно ниже у особей линии 147, чем у мух линии 101, хотя можно было ожидать обратного, исходя из того, что содержание ДА значительно выше у первых. Следовательно, ДФО, активность которой выше у мух 101 линии, вносит существенно больший вклад в контроль межлинейных различий в содержании ДА у 0. vi.ril.is, чем ТГ. Ну и, конечно, нельзя исключить возможный вклад других ферментов деградации ДА, пока не изучавшихся нами. ...

. . Рис.6. Влияние стресса на активность тирозингидроксилазы.

Важно.подчеркнуть, что у гибридов Г1 ■ активность ТГ при тепловом стрессе не изменялась ( что свидетельствует о доминировании линии 147 по этому признаку) и что данный признак не сцеплен с полом (активность фермента не изменялась у самцов обоих направлений скрещивания) . Необходимо отметить, что из-за большой сложности определения ТГ активности у БгоБорЬПа мы не смогли провести полный генетический анализ межлинейных различий в активности фермента, ограничившись лишь его первым этапом. ТГ активность крайне низка у ОгоБор1й1а, и нам первым удалось провести такого рода исследование. Все попытки измерить

вэтшцртн)

активность фермента у 0.те1ашжаз1ег кончались неудачей, и

только в 1994 году в лаборатории профессора Хирша (В1гшапп еЬ а1.,-1994).удалось определить наличие активности ТГ у О.теЛапо-еаз1ег.

П.З Дофадекарбоксилаза (ДДК) В.у1гШз

В таблице 2 приведены результаты измерения активности ДДК у 24-часовых самок и самцов линий 101 и 147 0. ухгШз и их П гибридов.

Таблица 2. Активность ДДК у самок и самцов линий 101 и 147 и их реципрокных гибридов П

АКТИВНОСТЬ ¡'и ¡К ( отн. од.)

ГРУППЫ самки самцы

101 78+3.6 48 + 3.6

147 57 ± 3.6 33 ± 2.4-

П(101X147) - 44 + 2.6

Р1(147x101) - 47 ± 3.9

Примечание. (-) - измерения не проводили.

Из данных, представленных в этсй таблице, следует, что активность ДДК у особей линии 147, и у самок и у самцов, ниже, чем у мух 101 линии (различия достоверны, Р>0.99). Как и для ТГ, имеет место половой диморфизм по активности фермента, сна существенно выше у самок обеих линий ( различия достоверны. Р>0.39). Видно так же, что линия 101 доминирует по этому признаку, и что признак не сцеплен о полом ( активность ДДК одинакова у реципрокных гибридов самцов).

Вид распределений особей линий 101 и 147 по активности ДДК, представленных на рис.7, показал, что линии слабо трансгрессируют по данному .признаку и это позволило провести генетический-анализ обнаруженных различий. Анализирующее скрещивание поставили по следующей схеме: £(101х147)хЛ47. На среднем графике рис.7 приведена гистограмма распределения особей в выборке гибридов П, на верхнем - распределение потомства беккросса. Обьем выборок Р1(147), Р2(101),'П, В(беккросс) равен соответственно

Рис.7. Гибридологический анализ различий в активности ДДК у линий 101 и 147 Б.уИ-Шб. Нижние гистограммы: левая -линия 147. правая - линия 101; средняя гистограмма- гибриды П; верхняя гистограмма - потомство бекк-росса П (101х147)х147.

22, 19, 23, 61. На гистограмме распределения особей в выборке потомства беккросса хорошо видно, что ' распределение распадается на два класса. Такой вид распределения позволяет рассмотреть . вопрос о справедливости

гипотезы о моногенном контроле различий в активности ДДК у особей линий 101 и 147. Проверка гипотезы критерием X2 показала, что она не отвергается.

Таким образом, мы установили, что активность ДДК, так же как активность ТГ, выше у самок, чем у самцов Р.у1гШб и выше у особей линии 101, чем у мух линии 147. А так как. активность МФО, также фермента синтеза ДА, одинакова у самок и самцов обеих линий , мы приходим к заключению, что уровень содержания ДА у Б-уШ-Иб в нормальных условиях контролируется посредством регуляции деградации амина.

Исследование активности ДДК при 30 и 60 мин стрессировании мух обеих линий высокой температурой показало, что активность фермента при стрессе не изменяется ни у особей линии 147. ни у мух линии 101.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что попытка выяснить, какой из изученных нами ферментов отвечает за обнаруженное повышение содержания ДА после часового стрессирования мух 101 линии высокой температурой показала, что ни активность

АКТИВНОСТЬ ДДК (уел. ад.)

МФО, ни ДФО, ни ДДК не изменяется в этих условиях. Изменяется только активность ТГ. Но. к нашему удивлению, активность фермента не повышалась, а сначала (после 30 минут стрессирования) оезко падала, и затем начинала повышаться (см. рис.6). Наиболее вероятным объяснением наблюдаемому нам представляется, следующее. Известно, что при кратковременных стрессах (порядка 15 -30 мин) содержание биогенных аминов б гемолимфе насекомых возрастает е 3 - 10 раз, в основном, за счет выброса их из депонирующих органов (Evans, 1S85; Davenport, Evans, 1984; Hlrashlma, 1995^. Если у D.virilis то же самое происходит с ДА, резкое возрастание содержания продукта должно по механизму обратной связи снизить активность синтезирующего его фермента, т. е. ТГ, ч?с ::п я н^лядае". При урытичении длительнее™: воздсйстряя стрессора повышения содержания ДА за счет ыо выброса из депо оказывается недостаточным и необходимо увеличение его синтеза, т.е. возрастание активности ТГ. Действительно, после 120 мин стрессирования активность ТГ возрастает (см. рис.6).

Предлагаемый нами механизм контроля содержания ДА у Drosophila при стрессе представляется вполне правомочным, если учесть особенности нейральной формы ТГ. В недавней работе Хирша с соавторами (Birir,an et al.,1994) продемонстрировано, что, судя по последовательности мРНК, нейраяьная форма ТГ отличается от гипо-д&рг.пдьло1! наличием в регудяторйой зоне кислого домена, благодаря которому да может ингибировать активность Фермента.

Таким образом, мы установили, что если в нормальных условиях контроль содержания ДА у Drosophila осуществляется, по-видимому, на уровне деградации, то в условиях стресса - на уровне синтеза амина.

ВЫВОДЫ.

1. Исследовано содержание дофамина и серотонина в онтогенезе двух линий D.virilis з нормальных условиях п при стрессиру-ющих воздействиях. Обнаружены межлинейные различия в содержании дофамина у имаго. Показано, что особи с низким содержанием амина' в норме реагируют., на кратковременный температурный, механический и химический стресс резким его увеличением. У мух с высоким содержанием дофамина подобная реакция выражена крайне слабо. Изменений б содержании серотонина при стрессе у D.virilis не обнаружено.

2..Впервые изучен генетический контроль содержания дофамина у насекомых. Установлено, что содержание амина в нормальных условиях контролируется у D.virilis геном (или блоком тесно сцепленных генов), локализованным в Х-хромосоме, а повышение его содержания при стрессе - аутосомным локусом (или блоком тесно сцепленных генов).

3. Исследована активность трех ферментов синтеза дофамина (мо-нофенолоксидазы, тирозингидроксилазы и дофадекарбоксилазы) и одного фермента деградации (дифенолоксидазы) у мух линий D.virilis с высоким и низким содержанием амина. Впервые установлено, что содержание дофамина у Drosophila регулируется в большей степени контролем его деградации, чем синтеза.

4. Впервые у D.virilis изучен генетический контроль активности дифенолоксидазы и дофадекарбоксилазы. Показано, что активность дифенолоксидазы контролируется геном, по-видимому, ре-гуляторным, .локализованным в Х-хромосоме. Активность дофадекарбоксилазы контролируется аутосомным локусом (или блоком тесно сцепленных генов).

5. Впервые исследовано влияние стрессирующего воздействия на активность ферментов, метаболизирующих дофамин у насекомых. Установлено, что активность дифенолоксидазы, монофенолокси-дазы и дофадекарбоксилазы у D.virilis не изменяется в условиях стресса. Активность тирозингидроксилазы резко снижается при 30 - 60 минутном стрессировании и возрастает при более длительном.

6. Предложена гипотеза о механизме регуляции содержания дофамина у Drosophila в условиях стресса.

СПИСОК СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Раушенбах И.Ю., Серова Л.И., Тимохина И.С., Ченцова H.A., Шумная Л.В. Изменение содержания биогенных аминов у двух линий Drosophila virilis и их гибридов в онтогенезе и при тепловом стрессе // Генетика, 1991, 27, 4. 657-667.

2. Rauschenbach I.Y., Shumnaya L.V., Chentsova И.A. Genetic control of phenol oxidase activity In D.virilis. // Blochem. Genet. (Life Scl. Adv.), 1992, 11, 47-53.

3. Раушенбах И.Ю.. Серова Л. И.. Тимохина И. С., Шумная Л. В.. Ченцова H.A., Бабенко В.Н. Генетический анализ-различий в метаболизме дофамина у двух линий D.virilis в норме и при

тепловом стрессе. // Генетика, 1993, 29, 935-949

4. Раушенбах И.Ю., Шумная Л. В. Биогенные амины в реакции стресса у насекомых. // Успехи Совр. Биологии, 1Э93. 113.

327-335

5. Rauschenbach I.Y.. SerovaL. I.. Timokhina I.S., Chentsova N. A., Schumnaja L.V. Analysis differences In dopamine content between two lines of D.virilis in response to heat stress. // J.Insect Physiol., 1993, 39, 761-767

6. Раушенбах И. Ю.. Хлебодарова Т.М., Шумная Л. В., Ченцоза Н. А., Гренбек Л.Г., Серова Л. И. Активность тирозингидрокси-лазы у контрастных по реакции на стресс линий Drosophila virilis и их Fl-гибридсв. // Генетика, 1995, 31, 353-357.

7. Rauschenbach I.Y., Shumnaya L.V., Khlebodarova Т.М., Chentsova N. A., Grenback L.G. Role of phenol oxidases and thyroslne hydroxylase in control of dopamine content in Drosophila virilis under normal conditions and heat stress. // J. Insect Physiol., 1995, 41, 279-286.

Подписано к печати 23.05.1996 г.

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. Уч.-изд. л.

Тираж 110 экз. Заказ 46

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН

630090, Новосибирск, проспект академика М.А.Лаврентьева, 10.