МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА

Ловкова, Мая Яковлевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА"

На правах рукопне

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. И. БАХА

ЛОЧКОВА Мая Яковлевна

МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА

(специальность 03.00.04 — биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

М'осква — 1976

На про sax рукописи

лшдаия наук ссср

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИК шеші А. H. Е\ХЛ

ЛШКША Моя Яковлевне

МЕТАБОЛИЗМ А МАЛОЙ ДОЗ ГРУППЫ НИКОТИНА

В РАСТЕНИЯХ ТАШКА

(специальность 03.00.04 - Окологичосквя хгалкя) * '

List;;- ■ г . ' і ■

Автореферат диссергзци;: на ■■tVibxoi. ' с о иск в m; g у чвїіоіі степени ■ ■-^«їєил , донора биологических наук

Москва - 1975"

Рвбозз заполнялась в Ордена Ленина Институте биохииии им .А. И. Веха Академій наук СССР

Научный консультанї Доктор биологических неук Г.С.ИЛЬИН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.С.СОКОЛОВ Доктор фармацевтических наук А.И.БАНЬКОВСКИЙ Локгор биологических неук 3.Г.ЕВСТИГНЕЕВА

Не официальный отзыв работа направлена во Всесоюзный институт табака я махорки, Краснодар.

Автореферат разослан 1975 г.

Зацитэ диссертации состоится п " 1975г.

на заседании Ученого Совета Ордена Ленина Института биохимия ии.А.Н.Бзха Акадеиии наук СССР (Москва, В-7І, Ленинский проспект, 33).

С диссертацией шжнс ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

(Н.Н.ДЬЯЧКОВ)

ВВЕДЕНИЕ

Алкалоиди широко распространена а растительном мире и содержатся у предегавителеИ всех отделов вис^их растений, . таких кок папоротники, мхи, голосеменные и покрыгосеиенние растения. Эти соединения представлеют собой азотистые 1'етср о циклические основания, обладающие физиологической эктиьносгыэ. Со химическому строению они 2осы!о разнообразии; среди алкалоидов имеются соединения очень простого строения, но встречаются такие последовательно усложняющиеся струкуурц, вллогь до еосоко-молекуляртах полициклических соединений. Несмотря на такое разнообразие форм, общий для большинства алкалоидов известшх в . настоящее вреда, является наличие и их молекулах одного или нескольких простейших ГегерОЦИКЛОВ, 8 именно ЕИрЭД1Ш(?ВОГО, пир-ролидинового и пиперидинового колец. Алкалоиды разных групп» в состав которых входят эти гетеродинли, представлены на рис.1.

Пути образования рлкаловдов в растительной клетке до настоящего времени остаются недостаточно псслздовашшип. Вместе с геи изучение этой проблемы имеет первостепенное значение не только для изучения данного класса соединении, но таияе приобретает обще биологический сшсл, поскольку азотистно готороциклы помимо алкалоидов входят в состав важнейших биологически вктив-ных веществ, таких как коферменгц (НАД, НЛЕ5, ОН), витамина (В , РР), корфириш и отдельные аминокислоты. В силу универсальности, свойственной иивой природе, образование азотпетш: геге- ' рециклов, входящих в состав молекул самого разного строения, по-видимому, происходит по единому пути, из идентичных предшественников. При этом алкалоиды, кок относительно стабильные соединения, являются хорошей естественной моделью для исследования биосинтеза этих структурных единиц.

На припер о алкалоидов возможно такие изучение таких Х1:ми-ческих процессов, лозащих в основа кизнедеятельности растений, как первичное метилирование и трэсмоталирование, декэрбонсидиро-вание и. окислительное дезоцшшровзние и, наконец, процессов циклизации, предусматривающих образование актизшх ценуроз, способных к присоединению как отдельных фрагментов алифатических

го 1

0=C-R

Фип цммі&чЗрцн-tâmfapiniv2

Рис. 1 Нштірмі імт мшшдоа, содер.*ащке пй?ршишош, ттоидияода и пкридкноне шьцо

молекул, так и замкнутых гетероциклов при биосинтезе пол циклических структур.

В изучении элкблондоб исключительное значение іїі;е»г исследования метаболизма указанных соединений в процессе :;:it з ао^ок? с лености растений. Сочетание гетеродин личоскоі; структури с coupii-зшпагаи связями в иоле кул ex ряда алкэлокдов, э танк с отсутствие безалкалоидных мутантов среди олкалоидоносов, их летильнеК исход при потере способности к биосинтезу указанных соединений свидетельствуют о связи метаболизма алкалоидов с ослов кыш обіівшііа!я процессами растительно!! клетки»

Необходимость изучения алкалоидов диктуется на только теоретическим значением, но и практическими запросами, поскольку эти соединения находят с01ї0є иирокое пр ил с нєкко в ПїірбДНОІЛ хозяйство. В медицине они издавна кспользуются з качества лекарствен и шс препаратов при лечении сердачно-сосудистих» нервных, нелудочио-кишечных и циогих других заболеваний. В шгцевой про-шшлешшети создано целые отрасли по випуску продукции (кофе, чай» кэкоо, табак), тонизирующее деіїствио когороіі основано содержании алкалоидов в исходном сырье. В сельском хозяйства' алкалоида приценяются в качестве контактных кнсоктисцдоз против ряда вредителей сельскохозяйственных культур.

Всё вше изложенное свидетельствует о той, что дроблена биогенеза алкалоидов в настоящее время очень актуальна и боль-*-шое теороі'кческее и практическое значение. Приступ.05і к еіі исследованию, ш сосредоточили своё зккіоішє нз алкалоидах группы никотина, исходя из следующих сообренсішй:

1) но хшкческоиу строении никотиновое алкало їда явдяшея наиболее типичными предетавктоляки всего класса алкалоидов в долог,:, поскольку в составе их молекул присутствуют пиридиновое, пирролидюювое и пиперидиновое кольца (р::с.Х).

2) В огличке от алкалоидов многих Других групп, распространение которых строго специфично и ограничено paints м:: одного се-иейстза или даже одного рода, никотиновые алкалоид; обнаружены

у представителей больного числа филогенетически ис:::ду собоіі не связанных сеыейств растение. Такое широкое распространение, а тзк-ке отсутствие бозилкзлоидных мутантов среди вадов содер^ощіїх никотин и его Производные, по-вйдішоіп'у, обусловлено их активны« участием в обменных процессах растительной клетки.

3) И, наконец, никотинние алкалоида играют ванную роль s формировании кзчестээ сырья и ротовой продукции табачной промышленности, и, крема того, приценяются в качестве важнейших контактных ицсектисидов з сельском хозяйстве. При исследовании 0ИО-гонезв никотиновых алкалоидов мы ставили перед собой следующие основные задачи:

I. Р 8 с ш n'ipo Е о * ъ отдельные этапа биосинтеза пиридинового, пирролидинового и лкперкдкнезого колец, но основе которых построены элизлоидо группы никотина и на юс примере рассмотреть насколько принцип универсальности, свойственный айвой природе, прицепим к важнейшим азоте оде ркащш гетероциклэи.

2, Исследовать метаболизм и превращения алкалоидов группы »иксаниз с целью определения возшннше взаимосвязей tu биогенеза с Продуктами первичной биологической эссимиияции 630x8, а также выявлении места и роли эвих соедшюпк!; в таком важном звене ме-таболизиа, как азотистый обмен.

Роо'ого выполнена з лаборатория "Техническая биохимют" юрде-нэ Ленина Института биохимии .Н.Бохэ АН СССР. Отдельные этапы QS Проводились совместно с Институтом генетики BeurepCKCií аквдемии наук (г.Будвпешт), Институтом биохимии Академии наук Уаб.ССР (г.Ташкент) и Институтом ботаники Акэдекии наук Нэз.ССР (г.Алма-Ата).

БИОСИНТЕЗ АЛКАЛ011ДСВ ГРУППЫ НИКОТИНА

Известно, что первичными продуктами биологической ассимиляции азота являются аминокислота, а из них в результате вгорич-ных превращений синтезируется всё то многообразие азотистых форм, которое свойственно SK30Ü природе, вообще, ÍI роегигедьноыу ииру, з особенности (Ераукатейн, 1959). К середине 50-х годов в зарубежной лк^оротуре появились первые сообщения о тон, что биосинтез ликогиновнх алкалоидов, текке кок и других азотсодер-яоцих соединений происходит кз аминокислот. Еыло показано, в частности, что 2-С^ -орнитш включается в пирролидиновое кольцо никотина (tewoy et al. ,1954-, 1955; Léate, 1955 )» метионин, серии Ü Глицин - В его кетильную группу С Hewey et al., 1554-; Uyorrura et ai. ,195^,1955), a лизин является предшественником пи-перкдикового кольца анабазина (Lóete, 1953).

Однако, oiii дзнныо не расшифровывали кехэнкзноз образования основных структурны:*: единиц од налои нов - азотистых' ге га рециклов. Так, например, обсуждалось нзсколько возможных nyreii вюточонпя орнитина в никотин, но ни один кз hex в работох sex лог не*получил исчерпывающего экспериментального подтверждения (cu.^obkoeü, 1971)^ Кроме того, орнпткн, вообще^ иоано било рассматривать только в качестве прорекуточного соединения при биосинтезе пир-ролидина, так как в растениях, синтезирующих алкалоиды, ота еми-нокислотв либо полностью отсутствует, либо встречается в очень незначительной количество.(

Попреяйеыу открытие был зопрос о биосинтезе лкнерпдкнового гетероцикла, ток как в ряде случаев его преды есгвениико!: бйй не лизин, о ацетат и другие соединении (herr, 1э59; leute, 1963)-Ноксно было окидать, что это кольцо каш в одном и тои ке растении синтезируется различными путями.

Что касается пиридинового гетероцпкла, то его образование в растительной клзтке было ссверыенно не изученной. Ипеюцкеся факты свидетельствовали о том» что "триптофаповцй" дуть биосинтеза этого кольца, характерный для человека, животных и рндо микроорганизмов, у растений при биосинтезе никотина и других алкалоидов, а такие - никотиновой кислоты полностью отсутствует (Loete, 19i>S, 1У57} Christian, Ы&г1оп,1У5Ь; ilenderaon, .

Поэтому изучение но пршеро никотина нового пути'обрэзования пиридинового кольца, входящего в состав многих вэянейыих соедине--ний, представляло общебиологический интерес.

Для выяснения связи биосинтезе елкалоидоз с озотистым обие-hoi: растительной клетки принципиально венным бцло такг:о определение степени участия не только углеродного скелета, но текке и азоте аминокислот- предшественников в образовании этих соединений.

I* Меторкалы ми 1.гето7!,ы,

изучения биосинтеза никотиновых алкалоидов иа использовали в качестве объекта исследования проростки iiicoti^m'tci-bacum, а такие побеги К.(л1аиса u ftphyllu. В ОП^ТНые

растения вводили меченые С*^ илиЛ^15 прздиссгвмнкаси (ьминокпе-лоты, ацетат), спутся 3-4 днл из растительного материала экстра-

Гировэли суммарную фракцию елка до и до в, из которой выделяли кристаллические производные индивидуальных алкалоидов; последние очвдэлк ео посїоянноіі уд.радиоактивноети (Ловкобо, Ильин, 1962). С целью определения локализации метки в выделенных препаратах алкалоидов проводили их ступенчатое окислительное расцепление . (Ловкова, Ильин, 1967). Для очистки полученных продуктов реакции окисления нэин'были разработаны "микронетоды, которые позволяли работать с веществами в количества 5-8 мг (Нуримов,' Ложово, 1973). Чистоту выделенных алкалоидов и продуктов их расцепления контролировали по т-раи пл., а такне о помощью УФ и ИК спектрофотоыстрш. Радиоактивность препаратов определяли на торцовой я газопроточноы счётчиках» содержание н - по ыетоду . Риттенбергэ на ыосс-спектроаетре МИ 1301.

2. Результаты экспериментальных исследований І) Діщрслидииовоз^кольцо а) Роль орнитина

Установление факта включения 2-С ^-орнитина в никотин (сы.выше) полонило начало изучению пути образования пирролидино-вого гетероциклз у растений. Однако, было совершенно очевидно, что включение орнитина в никотин не является одноступенчатый процессом и происходит через ряд проиеяуточных соединений. Ответа же на вопрос; "Каковы эти соединения", - опубликованные данные не давали. Поэтому но очереди дня встал вопрос о необходимости определения последовательности реакций биосинтеза, в результате которой орнитин замыкается в пирролидииовое кольцо. Для понимания механизма образования этого кольца особенно важным било выяснить, которая из Мі^ групп орнитина участвует в биосинтезе алкалоида. В единственной публикации, посвященной этому вопросу, сообщалось о включении й-у/Н^-группы орнитина в никотин С Ї.ее-Ье еї аі., 196*0 и делалось заключение о том, что первой ступенью при биосинтезе пирролидкнэ является реакция «¿-дезаминированил орнитина. Однако, такое заключение вызвало серьезные возражения, тек кок при «і-дезаминировании не ыогло происходить образование симметричного компоненте, в то время как факт равномерного распределения редиовктивности иежду С2 и С5 0том8ыи в пирролидше

посла введення 2~СІ4-ориитиив бнл широко извосїсн и соїіор^'.но достовереп (си.Ловкова, 1969), Еолсс того, угьсрхкение Лі:т£і с

соавт. о вклпчєнкк в випоїш только л-хн2_0р>•*находилось

в явноьі проткворечии с их соосїеєіішііл: донними, а іменно: сост-иооение С ;ії ^ в тік о тине при ^-доззіікбкровонки доякио рьь-няться 1,0, по не 0,5, кзк получилк автори. Тг.іпіь: оброзок, роль азоте арниіина в обрєзовании иккогииа била факткческн не ксслй-'жована.

Для решенмя згого вопроса ш кспілталн в к&чесгво ПРСІ.Е«СЇ-веннпков никоЕкпа Н^5-орннтин, сопостевив его пслользов&нпс с Тї-С^-зргшипом, козорий легко преврец&етсп в орці:?::к через одну из реакциі: орктшшіГого цикла. Контролем слуїгкл к*5- и -С^ -лкзан. К&н видно из представлених дсшшх (табл.І) лсдсльзс-

ввіївс Н^-орннтшіа и и,-С1ч-зргиііі:ііо в бносан®езо олкалогса

Трблкце І

Удельноя радшоктиБНость шшотіша к обогсідсшге ппридкновога и і:ирроиадш:ового коксі; олколо:і£& после введення*в проростки твбека и-С^- Н^-£ріл;ііокі;слот

іш ніг о кис лоти -лредпествелникя

;Уд.актив-:ность ни- ГпбоГГі-гісотиіш в -ооог°-

¡гіоля и^тк % обеге-

:шли/тш/ кмоль

;іаені;я

:ткно ; н»

: доля иь :Шірролиди- :рид::нового :цеі:кн твінового „коль-Гісольцо О'і Гкоткноьсиі

:цз ОТ Об- Юбцего ВКЛЮ-ІККСЛСгі^

:щого вклю- гченш в НІ!- :

гчеш'л в і;и- :Ж)ТІШ, % :

:котші, % : , :

■зі- і^-орнкт ин — 1,45 5,1 0,49

и- С^-аргинин • 20,5^Ї03 - - А -

ц _ лизин г 2.ІХІ03 0,70 - -

х) Никотинозая кислота, лолученпзя пук рзецеллелии никотина, 'биосинтезировенного за ечет ^.-її^-орнвтина.

значительно превосходит (при одинаковых условиях опита) использование контрольной ЗКШШКИСЛОТЫ —лизина, ЧТО СБИДЗТеЛЬСТВуеГ о специфической включении б никотин аргинина и орнитинз и делает маловероятным возможность обрэзозания алкалоида гитом нереанимирования. Результаты окислительного расщепления N* -никотина показывают, что 1Г15-орниткп (тзбл.1), ток;:;е как и 2-С1г*-орни-твя (D«v;ey et al., ,1955¡beete', 1У55) почти полностью вклю-ЧВОТСЯ 2 Л1ГррОЛИДИИОВОО кольцо и не принимает учестия в синтезе пиридинового гетероциклэ. Включение «t- ./Г^-группы этой аминокислоты в никотин иокот свидетельствовать либо о А-дезаминировать предиостзсиякка (рио.2, путь А), либо о тзкоа последовательности реакций биосинтезе, когда деээминироввнию предшествует декарбоксилкроввниз (рис.2, путь В). Однако, возможность ¿-дез-ецииировзиия орнитина полностью исключается данными японских исследователей, которые показали, что процент включения в алкалоид Ь-Ш!рролид:'.н-5-карбонозой кислоты, которая должна образоваться в результате зтой реакции, значительно меньше процента включения орнитинз, что не•мо^ег иметь место при последовательности: орнитин—в- й-пирролкн-5-корбоповая кислота—никотин (idlBuaaiii et alnl9G3 ). Поэтому наиболее вероятным остается путь биосинтеза, при которой реакции де заминирования орнитина предшествует его декарбонсилироввние с образованием путрзецинэ в качество променуточного соединения.

Лутресцин, как известно, сиьыетричен, поэтому при его" включении источником азота в никотине в равной мере могут быть как U., TSK ил-Н-этош первонзчельного предшественника - орнитина. Эго полностью подтверждается нашими результатами, согласно который öt- ii^-орнитин является предшественником никотина (Ловкова, Ильин, 1957а,в), а такав данными других авторов, которые показали включение д- Л/н2-гРУппы орнитина в пирролидиновые кольца ^никотина (icoto et ai.), в настоящее время путь от орнитинз .через путрссцин к никотину (рис.2, путь В) находит всё большее. экспериментальное подтверждение и ре осматривается многими авторами, как единственно возмогший путь биосинтеза пирролидиново-го кольца (uotnes Schutte ,1969 ).

б) ешшокислоти в качестве про7*шестве;шкков нккотино

Поскольку в. растениях, синтезирующих алкалоида, орнитннз крайне пало, ш предположили, что в нормальных физиологически условиях первичными предшественниками никотина доле;ш быть соединения, которые могут доевть начало орнмтину, то есть свезших с нш в ходе котао'олическнх Превращений.

путресцин

нос

тина - масляный йльдегид

&-пирролин

'Л

НООС ННг NN2 орнитцм'1-С'*

сно

НООС *

N СООН

& -пкрротн - 5'ир$цно6аА киело/па /\

■и и-

N N

моомерныи анион

•и-

д -чшррмин

Рис.2. ОеММВАНИЕ ПИРРШШДИНОВОГО КОЛЬЦА КИ КОТИНА

Для проварки этой гипотезы в качество предшественников никотина испытали 15 протеииогоннкх аминокислот самого разного строения. Согласно полученным данным среди испытанных аминокислот по интенсивности включения в никотин особое положение занозив глутсминовая кислота, асперегиновзя кислота, аргинин и в мныаей иепеїш лролин (Лсзковэ, Ильин,- 1961, 1952). Удельные активности никотина при их использовании з 2-Ю раз превосходили уд.антявности алкалоида, полученного при подкормке другими эмияокисдозаци.

Ном но удалось обнаружить корреляции мекду химическим строением аминокислот., с одной схорони, и их включением в никотин, с другої:, так как среди активных предшественников алкалоида имеются дзе кислые сшшокислоти, одна - основная, и одна -циклическая. Однако, было установлено, что'наряду с еснарагино-БОЯ кислотой з биосинтезе никотина используются глутоминован кислота, пролкн и аргинин, то-есть аминокислот, связанные с ориа^шом в ходе иотайолическах превращений.

ЩзК ИЗЕЄ0ІИ0, "перечисленные вии9 соединения прйнэдлокат .к "семжсгву" глутамкнозой кислоты и легко взеимопрезращаются. (см.Кретсвич, 1972). 3 свете этого можно било вкидать, что включение указанных аминокислот в алкалоид происходит по единому пути, например, через ернигкн, в качестве промежуточного соединения. Исследование этого вопроса мы начали с определения роли глутаминовой кислоти в биосинтезе никотине;

в) Роль глугамизовой кислоты

В 1358 год/ ЛэмСортс и Бэйеррум в^етш,, 1 у^а)

впервые сообщили о включении глуввминовой кислоты в пирролиди-новее кольцо,. Однако, использование в этой работе глутомииовой кислоти, меченой только по углероду, но позволяло ответить но вопрос участвует ли з биосинтезе иикотина азот данного дрещест-зенника. Вмзсте с сом, исследование этого вопроса имело принципиальное значение, та:', нэк известно, что глутащноввя кислота занимает одно из центральних мест в азотистом обмене растительной клетки а является ззыи "основными воротами, через которые амглиек вступает в реакцій обмена веществ" (Кретозич, 1972).

Учтивая вышесказанное,-;;ы поставили перед сос'ои задачу определить роль глутаминово;! кислоты, двэкда моченой по углероду и азоту, в обр а зоз о ник колкого из готсроцкклов никотина в ос-дельности. О подобных исследованиях в ыировой литературе но сообщалось.

Нант вторэп задача состояла в выяснении вопроса происходит ЛИ в* нормсльнкх физиологических условиях включение 121.1 "ЛЮбой кислоты в пирролидин через орнитин в качество промежуточного соединения, или глутаииновоя кислота непосредственно включается в никотин. Каких-либо данных по этому-вопросу в мирово;) литературе чакае но било.

Зля ревопин этих вопросов ш использовали в качестве пред-сествешшсо никотина С^- К^-глутакииовую кислоту (Лобкова, Ильин, 1961, 1962, 1%7е). Чтобы проверить, возможно Ли включение глутаыиновой кислоты з никотин через орикгкк, как .лроиску-точную стадию, было необходимо сопоставить степени использования этих двух аминокислот в биосинтезе никотина. Поэтому ш использовали в крчостзе предшественника олкач о иди, помимо глутаиино-вой-ккспотц, <эС-Д'"^-орш1тиц. Аминокислота й ^-С^-лизин выполняла роль контроля.

Как видно "из табл.а и-с^- к^-глутаминоввя кислота является Предшественником никотина в проростках шсоъз.и.'ла и принимаем активное учэстиз в его образовании, при этои степень использования как атомов углерода, ток к азота донной аминокислоты в биосинтезе елкалонда значительно превосходит-использование контрольной аминокшлоты - лизинз. Этот факт еще раз подтверждает роль глутаыиновой ккслоти в качество специфического . предшественника никотина и исключает возможность биоемктезз последнего через общеметзболкчес'шй "котел".

Результаты окислительного расцепления в^-кикотинз, биосинтези-роваЕшого за счёт глутаминозой кислоты, покоз^оют, что последняя, включаясь в алкалоид, является предшественников.его ппрро-лидипового кольца и практически не участвует - в синтезе пиридинового гетероцикла.

Таблица 2

Включение С^- N^-глутаминовоіі кислоты в пирролидпновое и пиридиновое кольца никотина

Аминокислоты

Уд.активность никотина ■ имп/мия/ иЬЕОЙЬ

Кэ^аоя ;Изб:лтоі! :Дої!ї1 NIS имкоти- : И в іпирролвли-

тїя ™,t шиісотино-їнового кольни «iru.t;b0il ки0_;іїа от ні^

% :лото шпнотина,

• о Ttfl * і * /0

Доля H пиридинового кольца отм1^ никотина, f.

U-C»- „

глутамииовоя 25, бхІСГ 0,52 О, II 89,5 10,5

кислоте

U-C«- H15 _

лизин. 2,1x10* 0,26

Сопоставление степени участия орнитипа (таблЛ) и глутэыи-ловой кислоти (табл.2) в биосинтезе никотина показывает, что глу-тэмкновая кислота - іленео эффект га :шй предшественник, чзм ор пятин. Этот ¿акт свидетельствуот о том, что в нормальных физиологических условиях при биосинтезе пирролкдинового кольцо имеет место следувщая последовательность реакций: глутаминовая кислота —-»— орнитпл->- никотин.

Поскольку, превращение глутеминовой кислоти до орнитина является одноступенчатые процессом, ионно было ожидать, что степени участия этих двух аминокислот в биосинтезе алкалоида долины быть болое равными, чем это имеет место в ноших опытах. Однако, оценивая эти результаты, необходимо по:,шить, что глутаминовая кислота /занимает одно из цситрсдьнік мест в азотистом обмене растительной ґ клетки. Ток, согласно данным В.Л.Кретовича (Кгєіїоуі-Ьсіі, 1965) в растениях гдутомппсБая кислота являетя одной из аминокислот оС-ашшниіЗ азот которой происходит, главным образом, из аммрния. Подавляющее большинство других аминокислот может быть синтезировано !з реакциях переамкнирования соответствующих кетокислот. Эги реакции очень активно протекают с глутаминовой кислотой. В связи

с этим, невысокое обогащение алкалоида после вьеденкя ií -глутокк-ново;! кислоты, по-видимому, обусловлено теы, что значительная часть поглощенной аминокислоты используется цолоддмн растущими тканями проростков на биосинтез свободных аминокислот к белков. Поэтому эти реакции оказываются конкуронтниии биосинтезу никотина.

' 2) Пщи^иновоз кольцо,

э) Аспорагиновая кислота, как предшественник ¡natoтика

К началу настоящей работы было выявлена роль никотиновой кислоты, как предшественника пиридинового кольцо зшштииа (■Всл-.-соп et al. , 195в,1узО),но одловреиешо с этш такие било показано, чго никотиновая кислого у растении в отличие от человеке, еи-вотних и большинства микроорганизмов при расцеплении триптофана не образуется. Такии обрезом, вопрос о первичных прекосственникбх пиридинового кольца как никотиновой кислоты, гак и никотина оставался практически нерешенным. Исследование этого вопросз мы наче-ла с определения степени участия в биосинтезе никотина ряда лро-теииогошшХ ¡ешшокислот, и при этом установили, что эффективным предшественником алкалоида является аспэрагкновзя кислота '(Jiou-ково, Ильин, 1962). О роли эспорагиновой кислоты в образовании Hiatoтина о том se 1962 году независимо от нас сообщили к другие авторы ( Grii^'i-cii et al., 1962; v.'u ой al. » однако/они счи-

тали, что эсларагкновая кислота включается в никотин не непосредственно, а через сукцинат, Последнее соединение и'столп -рассматривать в качестве специфического предисствецнпка никотина. Б 1963 году было показано, что именно аспарзгиновая кислота, но nq сукцинат является предшественником никотиновой кислоты у иуссъ^с-t-crium tuberculosis (Grocü et- al.,1965). Хотя результаты 32их ' опытов, проведенных но iíkkjj о организмах, на основании простои аналогии, и нельзя было порекосить на растения, но оспэретиповая кислота, как предшественник никотина, вновь привлекла внипанке исследователей. В 1966 .году Якэмш и Бойоррум, усовершенствовав методы окислительного расщепления никотина, опровергли преаино данные и показали, что оспарaranosaя кислота, икнуя сукцинат, включается в С-2 и С-З атош пиридинового гетероцккла олкалоида <Jii.okr.Mic, 3jrorruEi,i96G). Однако, и эта работа не расшифровывала .полно-'стью роль еспзрагиновой цислоты в образовании никогкно, так кок

- и -

не деза л э с'іпїета на весьма вакш;1 вопрос включается ли ее азот в пирийішоииіі гэтероцикл алкалоида. Для исследования этого вопроса в настоящей работе была использована еспорагиновзя кислота, печеная по С^ a

Как видно из представленнях дэниш: (табл.3) степонь использования как углеродной части молекулы оспарагиловоі) кислоти, так и атома её езотэ значительно превосходит ивдользовэике контрольной аминокислоты - лизина, что подтверждает роль асперэпшозой кислоты в качестве специфического предшественника никотина. Результаты окислительного расцепления показывают, что при биосин-тозе никотина шее з место неодинаковое включение в гетероцкклц алкалоида агомса углерода зспарагпповой кислоти, с одной стороны, и её азота, с другой, а именно: азот аспарагяиовои кислоти пре-' їалуцественно используется в образовании пиридинового, кольца, в то spOLiii к § К это;лы углерода принимают практически ровное участие в синтезе кок пиридинового, так и пирролидшшвого ГОТСРОЦИКЛОЗа Такое распре де лоние С и между кольце і.: и никотина свидетельствует о том, что схема, предложенная Гроссом с ссавт.., для биосинтеза пиридинового кольцо, в частности, никотиновой кислоты у о оЪ a et с x-ii m tuborculosia (Gi-oaa et аі, мох:ЄТ бить рас-

пространена в на растения.

chjûh chj—со 0 h [* *

1 !i < I r^X—COOH ! ffi^'—COOH

chgh + ch—cûoh —- г a wj —rl jl

chjoh кнг l. n j n

їлингрин асаарггино£ая нжотииобся

кислота. кислота

Рис. 5. Схемі shocvwhia ішридинсаога кольца t

Согласно это;1 сХтш (рис.З) в биосинтезе пиридинового кольца участвует азот и внутренние С-2 и С-3 атомы эсг.арагшшзой кислоти, на долю которых в нзаеы опмтс приходится ЙОД от общей радиоактивности испытанного предшественника, о карбоксильные группы аминокислоты, содержащие остальные 50?» радиоактивности, декарбо-ксклируются и но включаится в кольцо. Образовавшаяся в результате декарбоксилирозания углекислота мо^ет давать начало ацетзту к пролионагу.

Тбблнца 3

Включение С^-Н ^-ЭСПОргГИЮЕОЙ 1ПЗЛ0ТЫ з пиридиновое и пирроладиновое кольцз никотина

а* 4* С» г 15

3 Е-* О 14 ■ о о <!> К К о Рч И О м о <и о Л Ггч О шк С-» ■ 1Л 'о л и я о аа ж м и И » ~ «ч. >> 1С зключе-НИЯ СО в то с: « О о< г\ о Й сэ 2 -:; о с-

м к та ' к о о о & 03 то V о ы (■5 <3 ¡й ьз и и «ч си в и о к о с14 СЭ* к И о м е- Ел к к • о ВС о . о и п 5 «* о (=£ : с, "> о

спораги- никотин 10,0 1,35 2,18 0,43 0,86 40 60 0,48 74 26 ;овая

:кслота иикоти-

' * новая ¥ч 7,0-0,83 1,46 0,27 - - - 0,71 кислота '

ЛИЗИН никогин ' 9,5 0,12 2,1 0,04 - 0,'20

х) Никотиновая кислота, полученная при расцеплении никотина.

Как известно, указанные соединения, являясь предыесгвенни-, каин никотина, включаются преимущественно в С-3 С-4 зтоцц его пирролидинового кольцо ( С^^а^мап^ы-л-аоп, ). Действи-

тельно, ,и в наших опытах радиоактивности никотина локализована в его пирролидкмовом кольце (тобл.З).

Тс<ш образом,, в никотине мы получили очень близкое к теоретическому (согласно схемы Гросс с соавт.) распределение С**';; к 15 меэду двумя гегзроцкклоыи при использовании зспарагиново!! кислоты в качестве прсяасствонкпкг, а кие ни о: пиридинозоо кольцо!? ^ рассчитанное - ЮС^, опытное - 76£ С1^ рассчитанное - 50^, опытное - 40;^

Полученное ног,::: дэккис о ролі: з сг; срс типової; кислоти в обрззозз-тіп никотине 1.;ы опубликовали в р;-;до работ (Хозкова, Гльы, 1962, з; Лоивовз ;і созвт.І970а, Лозксве, Кзиусігаьево,і9?0;

iovitova, Kii^onfcáeva, 197^)» К середине бО-х годов удалось получать и другие экс пер иканта ль кые данные, свидетельствующие о биосинтезе пиридкііозоїо кольцо зэ счет о л Готических соєдинєниі-;. 3 частности, било показано включение глидер-альдсгид-3-фосфата в 5 и 6 С-этоыи этого гетероциклв никотина ( ¿'lecker, вуєг-riti, 19S7).

Такті оброзоїл, уокг.иіши ряда лабораторий икра удзлось расшифровать образование лкридшюзого кольца никотина. Существенный вклад в разработку зїоіі пройлеш внесли и нэии исследования, которые установили узкт включенип аспарогикозоіі кислоти в ншсоткіг, a зє-тси показали участке не только углерода, но к азота отого пред-ccctsciihkko б 0и0сине03є піридинового,кольцо злкелоидє. Установление факта, что оспзрепгаовея кислото является специфическим лсодтаственшіком пиридинового кольца никотина ш,'/зет покнчитальное значение, тсіі как свидетельствует о той, что этот гетероцикл у рэстскии ток не как у некоторых микроорганизмов, образуется из йял&авкчееккх соединений простого строения.

б) Лслорогщювйя кне л оте, как предшественник анабазина

Роль аспарзгшювоп кислота э биосинтезе анабазина в отличие от. цикм'/лэ почті", не изучалось. Б единственной публикации, посвяцзипой этоиу допросу, использовалась аснарагинсвея кислото, печеная по карбоксилу, и з пей сообщалось о включении сспо-

р&гкновоі; кислоти 3 лнпєридпнсвоє кольцо С ürii'fith, Grifi'ith, -VjG6). Однако, пояснение яр'ейеествзннико, с локализацией мотке только 3 этой положении, из позволило ответить иэ вопрос о включенні; Бзото дспарегикозои кислоты з алкалоид, и, крот.:е г pro, "было весьіло нсудзчиі:і.і в cbu'ío денных Гросса с соовт. (Groes ot ai., 1уб5) сйглссіїо розорим карбоксильное груглш аспарагиновоЕі кислоты полностью отцепляются з процессе биосинтеза пиридинового кольца и заведено в :югс ло включеются,

Таккы образом, вопрос о биосинтезе пиридинового кольца анабазина зо счёт аспараі'кнозой кислоти до постановки ност^яцей рв-

боти оставался практически по исследозешпш, приступая к его изучения ш избрали в качестве объекта исследования два растения;

Тйбл:;»э 4

Включение и-С*^- ы^-аспарагиновой кислотц в пиридиновое и пиперидиновое кольца анабазина в 1Т1соЬ1апа к1аиси

о э о? ё • РС сз о О Ч ГЦ и □ м 41 Е-1 0> О ЕГ со « о и а о 0 ь> К »-ч н • са 32 41 « "Ъ ет § "О О —1_ Ъ <-Ч ЕЧ * а в к о м к ?! м я Ей М - ■ Щ И1 к гз ■ Й ЬЧ с14 ' ы ¡л • о • и а Я та и со «15 4*

сэ в 1 с, £ «я о £Э Й о, 0» к ч д Й В* ЕГ <3 РЧ а ' Л о Й Е. О с с се р; о

Анабазин 100,0 1,76 2,10 0, 06 29 71 0,46 43 57

Никотиновая

кислота1--* 50,0 0,69 1,78 03 0,40

х) Никотиновая кислота, получопнэя при расцеплении никотина.

&1(шссх и ЛаьЛазьв арЬуНа (Л03К0Ве И ООЭВГ., 1^70, 1974с). Как видно из представленных данных, эспарагпновая кислота является предиествснником анэбазпю у этих ре степи»,, при этом в АлаЪао1о арЬуНа она принимает практически равное участие в образовании как пиридинового, так и ттерпдинового колец алкалоида (табл.5), а в и1соХ;1апа е1аиса кисет цесто дане несколько большее её использование в биосинтезе пиперидинового кольца анабазина (табл.

Таблица, 5

Радиоактивность енабэзкнэ и продуктов его расцепления после введения и-С^-аспарегиновой кислоты в АпиЬазіз арЬуііа

Анабазин п продукты его расцепления : Уд.актив-: ность : иуп/ккп/ с :, ммоль.10-*^ : Обздя актив: ность е: имп/кин.ІСГ3 1 СГ I гвключе-: Сния : « і % от общей активности анабазина

Анабазин 0,24 ■ 0,22 0,04 100

Пиридин 0,16 0,12 0,сг 55

Пиперидин - ■ 0,10 0,02 45

Диализ литературных данных по биосинтезу пиперидинового кольЬэч У вмсшсс ростеїїиіі лоззолявт определить возможный путь включения эслорагиновой кислоты в этот гетороцшл. 1С настоящему времени установлено, что активным предшественником данного кольца моксї О'ыть лизин (сц.Лозковэ, 1970, ІР7І), для которого известны два различных пути образования (ї-ьзів-ьог, Сог-

ласно первому пути (рис,4, путь А) лизин синтезируется за счёт диэкинопимслшговой кислоты (ЇЗШ) при её декаро'оцеллировонии. Образованно £ЛП происходит в резуиьгето конденсации пирувата с еспарэгиновой кислотой. Второй путь биосинтеза лиэипа (рис.4, путь 3) проходит через амино-эдипинсвую кислоту (АА), которая синтезируется из 2-кето-глуторовой кислоти п ацетата.

Если предположив, что. в кісобівла ¿агтеа ,например, существует путь В, то в этом случае азот эспарагкновой кислоты, вообще, не дол;::еи участвовать в биосинтезе пиперидинов ого кольца алкалоида, а стоаді углероде - включаться весьма нозначительно только вследствие вторичных превращений аспарэгинозой кислоты в ацетат или 2-кето-глутарат в ходе реакций ТКЦ. Однако, согласно пайки данным 57#лГ. и С*** оизбэзшш локализовано в ого пипери-дксовоы кольце (габл.4). Это позволяет нам сделать вывод, что в іііес-ьіапа сіаиса образование лизинэ, а из него анабазина —

происходит по луга А, через промежуточную стадию £АП, что полностью согласуется с известными литературными доньями (оки'-^ь,

соон

с=0 1 СООН 1 НСМНг 1

1 снь 1 нсьт^ СНг

пиру$ат |Нг щтьА снг

•+■ -- ■'СИ, 1 1 снг

СООН снг !

1 1 нсмг

снг негмн» 1

1 1 ссон

начнг СООН лизин

СООН • СООН

I !

нсмг сн}

ут еуСнйя мсдзта

оито 3 СНг —- I --+

Г1 СООН

сн,- ¿=0

I I

СООН снг

М СНг

СООН '

"ОН ДАР г-лет-ыдтфОи

йспзрагцнойан кислота

кис/гжа

Рис. ^. Схема штоанния лимна а высших растения* ЛАР-диамииОПимели»о5ая кисдятй , АА-еС-й»иной$ипцноЗйя кислота

Учитывая, что з пиридиновое кольцо анабазина'оспэрзгииовая кислота должна включиться непосредственно, о в пиперидиноввй ге--тероцикл этого яе алкалоиде через ряд променуточных соединений (лизин, 2ЯП и т.д.) можно было окидагъ значительно меньаее использование этого пре дшссгво шш;а з биосинтезе пилор;:дниового кольцо по сравнению с его включением в пирпдпнозое кольцо. Но, согласно нэшш данным, величины рэдиозктивноетей указанных гете-роциклов в аизбазипе (например,в АпаЪи»±а практически

равны меяду собой (табл.5). По нопену мнение, этот объясняется тем,- что в биосинтезе пиридина участвуют золько внутренние С-2 и С-8 атомы аспарагиновоМ щюлоты, в то врсун кск в биосинтезе лизина, используется вся аспэрагиновэя кислота; это*и приводит к выравниванию активностей двух готероцкклов.

Высказывается предположение о суцсстзовэкпи определенной взаимосвязь; ко путей образов а игл лизина, с одно;) оторопи, в пиридинового ;:ольцв (например, никотиновой кислоты) - с другой (Gross еч; ai. ,1963» 19&5) • Показано, что в микроорганизмах, синтезирующих никотиновую кислоту из триптофана, лизин образуется ИЗ единоеДЕЛИКОЕОЗ кислоты (путь В). Если se биосинтез лизина происходит из и ;шо г. ж о лкн os о i,i кислоты (путь А), то никотиновая кислота синтезируется из оспаратиповой кислоты и глицерина. Очевидно, что з наших опытах наблюдается именно эта закономерность при биосинтезе пиридинозого и пиперидинового колец ОПСбаЗИНО у Kicotlana glauca u Anabasis aphjlla , ТЭК КОК образование лизина з них происходит через JMI, а в биосинтезе пиридинового кольца алкалоида принимает участие аспэрагииозоя кислота.

3) Лппедидинозое КОЛЬЦО,

■Пиперидиновос кольцо наряду с пиридиновым и пирролидинобым кольцами входит в состав елкзлоидоз группы никотина. Согласно современным представлениям его образование мокет происходить либо за счет лизина, либо за счёт ацетата. Кы поставили перед собой .задачу определить, какой из этих путей биосинтеза - "ацетатный" пли "лизиновый" является главном при образовании пипэридинового кольца анабазина у среднеазиатского растения АпаЪаыхя aphyiia (Ловксва и-соЕЗТ., 1974; Пуринов, Ловковз и соавт., 1974 в)..

Выбор данного объекта был обусловлен рядом причин, Преяде всего, детальный механизм биосинтоза анабазина, именно в этом растении практически не изучался. Единственная публикация, по-езяценная донному вопросу, носило предварительный характер, так как в работе не проводилось окислительного расцепления алкалоида до пиридина и пиперидина, а только до никотиновой кислоты (Кли-ментьева и соэвт., 1970).

Кроме того, в литература высказывались предположения о ноли- , ЧИП У, Anabasis apella иного, отличного от описанного в лите-^отуро, пути включения лизина в пипоридиновое кольцо анабазина. '.Однако, это предположение экспериментально подтверждено не былр.

И| наконоц, изучение биосинтеза анабазина у Лантал.« Uí.iíyllal представляет на только теоретический интерес, но гэкяе имеет и определенную практическую значимость в связи с тец, ЧТО это растение является единственным сырьем для промышленного полу-

VO to s

<D £-1

g и

О g

О И О

О fe я

о *

ал ^ р<

■ta m

я tu ■н

Я Й

ва со

:: А

« «

си а «ч

о м

и> 14 О

И Ь!

со о

со Рч

tí ^

v-t о _ I

К? — h) el p

,So«

ЙО!!

диет - м ra

oeíb

M S О ІО

m Й « te

¿ л •

та t4 ítí О SSilT»

«oa і

cu О

ЕУ « fc!

gSa •

О я З

1Л

tí И-І

^ й *

S Й

• OR а

КМ M

к Я

¿ л •

to еч £3 О Кіл

gg-íi'o

ОСУ

ил I

о » и

ел к: * К tí

• OK О

gzn й

Лп

» ÍS в та

ю íífí та о о

m &.cj

«ü с о.

о сО см

о <м и ы

É-t о о о

о о о о

сг\

ГО см

то с—

1-І о о О

1А W ^Г t> ^ (

и о о

§ 8

1-і ач

1-І со

4 Jt н ю w и о и

о о о о

о\ CJ с*-ci о и <л

>-)>-< о о

о D- СЭ

и *

1-і t-l о

сз

pj со VCÏ

о ^

зш

я о

W ti

к о

О,

а> ся е

H ' CD

» S

о іл s

-, H » S!

m jy Ci,

S3 t - rj

л m a w со с Я 3 к і ( Ц < s t-i и u «

тения энэбаэпн-сулъйг т э, взкнзйыэго контактного инеектисида, сироко применяемого в сельской хозяйстве.

а) Роль лизинз j

Как видно из табл.6 лизин является предшествеїшикои анабазина в Anabaois üphyiia а приникао2 активное у чъ ст не в его биосинтезе, при этап юес? мес?о практически равное использование этой аминокислоты, меченой С^ з разных положениях. Этот факт свидетельствует о той, что углеродный скелет лизина не подвергается су^зствзниыи изменениям и интоктно участвует в образовании алкалоида.

Результаты окислительного расщепления показывают, что основная радиоактивность алкалоида (89}í>) локализована в пиперидиновом гетсроцикле.

Величины рйдиоактивиостей препараэоз никотиновой кислоты, полученных при рэсдоплении анабазина, зависят от локализации метки в предшественнике. В случае 2-С ^-лизина радиоактизноети никотиновой кисеты и анабазина практически равны, в то ке врем при "использования U-c^^-лизина активность никотиновой кислоты составляет около 1/3 активности алкалоида. Однако, после декарбоксили-ровэния препаратов никотиновой кислоты получаются соответствующие препараты пиридина, обладающие почти равной радиоактивностью. Тзк как кольцо никотиновой кислоты образуется из пиридинового кольца анабазина, а её кврбоксильнзя группа возникает из С-2-эго-ио лилеридинозого гетероцикла алкалоида, то, очевидно, разница в активностях никотиновых кислот зависит ст резнкцы активностей С-2 атомов нкперидиповых колец анабазина. Следовательно, лкзии практически полностью включается в это положение, э лизия - частично.

Существует гипотеза, согласно которой лизин перед зклкче-іікен в пиперидинов оз кольцо подвергается до к а р б о к с и л ир оз a s; к:о с" 06p5 30B&iiKShí симетричного компонента - кадаверина (си.Ловкова, 1971). Поскольку дз растениях, синтезирующих анабазин, свободный кодэвервп не обнаружен, то можно било предположить, что он образуется при дскербоксилировопии лиэииэ в ходе биосинтеза алкалоида Но, если лизин перед включением в пиперидиковоо кольцо превращается в н&дэверин,_то-есть сшыетричшй компонент, то в ' анабазине при использовании этого предшественника рздиоэктивяоегь

долина быть равномерно распределено кег:ду С-2 к С-6 згомами пиперидина, что не подтверкдаотся экспериментально (тебл.6). Следовательно, образование кэдезерина из лизина не является обязательной променуточной ступень» при биосинтезе анабазине 3 Anabasis aphyila .Пе-видимону, перзой ступень» биосинтеза алкалоида в этом растении является не декорбоксплпровснке, о деземини-ровэнке лизина а послсдущоп спонтанная. циклизация мег.:ду ыдкао-rpynnoli, с одной стороны, И 8льдегидо-группой - с другой.

Как уне отмечалось, при использовании и-С^-лнзииа в качестве предшественника в С-2 осоке лнперидинсвого кольца анабазина содержится приблизительно 1/6 актив пост и алкалоида; так как большая часть ого радиоактивности (S9/i) сесре7,0точена в гон re кольце, мокко исключить, что все остальные атома углерода в нем мечены равномерно, что еще раз подтверждает интактиое включение лизина в пиперидиновое кольцо анабазина в Anabasis aijhyiia.

б) Роль ацетата V

Определение участии лизина в биосинтезе анабазина показало, что в Anabasis aphylla пиперидиновое кольцо алкалоида образуется за счёт аминокислоту. Однако, согласно современным представлениям, биосинтез этого гетероцикла в высших растениях монет происходить двумя различными путами: "ацетатным" или "лизиневым", причем наличие каждого из этих ¡тутей доказано но примере алкалоидов (си.Лозкова, X97I). Более того, доке в одном и том ко растении, согласно ладим данным (Нуримсв, Ловкова и соьвт., 197Ь) образование пвпервдкиовьас колец, входящих в состав рээгш>: алкалоидов, происходит либо за счёт лизина, либо за счет ацетата.

Поскольку, в литературе отсутствовали данные о роли ацетата в биосинтезе анабазина у Anabasis aphylla мы исследовали участие этого соединения в образовании каждого из готероцпклов алкалоида в отдельности (Нуримов, Ловкозо к соэвг., 1974). Как видно из табл.7, 2-С^-оцотзг является предшественником анабазина у Anabasis aphyila и принимает активное участие в образовании алкалоида, с .

Результаты океилигольного расщепления показывают, что основная радиоактивность анабазина, бкосинтезированного зз счёт 2-е1 -ацетата, локализована в его лирвдиновсм кольце (79,ед, и значительно меньшая (20,8$) - обнаружена в пиперидине. Нсзкачв-

- -

тольная радиоактивность пиперидине, по нашему мнению, моест иметь киоп;юо объяснение, а именно, первое: в АпаЬаа±э арйуПа анабезин образуется только по "лизиновому" пути. В этом случае появление некоторой радиоактивности в алкалоиде поело введения 2-С"^-эцотэ?э обусловлено вторичными превращениями последнего через общемегаболйчее;:и1$ "котел" до лизина. Поскольку такое превращение - многоступенчатый процесс, то закономерно значительно ь-еньЕое (в 5 раз) включонио 2-С^-эцетата в пиперидин, по сравнении с его включением в пиридиновый гетероцикл алкалоида.■ (По-видимому, включение 2-С^4-гцетэтэ в последний гетероцикл ыо-

происходить через глицерин и янгарную кислоту, которая,в свою очередь, дшг изчыю еспорэпшовой кислого).

1-*ы не исключаем тэкг.о к второй возможности, а именно: в дла;иаа1з ар'^иа пиперидиновое кольцо енабвзина синтезируется не только из лизина, но так^с непосредственно из ацетата. Однако, в в этом случае главным путем биосинтсза пиперидина является не "зцетотшнл, а "лизпкезып" путь»

- Таблицу X

Кэдпоактивиость апцбогина и продуктов его рос-вдплення, биоскитеаированлого из 2-С^-эцетата

Соединения

Уд.активное ть имнЛ*.кн/

акодь.Ю"

г5

Общая ек-

тивность

имл/ыпн.

лет

г 5

/О

включения :

% от общей активности анабазина,

Аиабззпк 5,9 2,97 0,33 100,0

Никотиновая к-тз 4,9 2,47 0,23 83,1

Пиридин 2,36 0,27 79,4

С-2-атом пиперидина - 0,П о,ооэ 3,7

С-3,<>,5,6 - асош *

пиперидина - 0,51 0, №2 17 Л

Пиперидин - 0,62 0,051 20,8

ПУТИ ПРЕВРАЩЕН І/Я НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ рода NICCTX»'J!A

Одної! из зєкіііяс проблем б изучении алкелекдоз является ис-следовашіе its иетоо'олизкэ. Однзко, ато чрезвычайно воїпюя нерудная проблема до последнего времени разрабатывается очень малмми сплаті.' Известным тормозом для оё развития является апроко распространенное ранее и, к сопалопи», разделяемое некоторыми авторами и сейчас неправильное преде¡гэвленио о том, что алкалоиды ке * выполняют никаких полезных щукнциіі в растительной клетке и являются,, своеобразными экскретами или коночными прбдуктемп основного метаболизма" (kiothes, 19^9) По-видимому представления такого рода могут бить отнесена только к некотором алкалоидам.

Но било бы совершенно неправильним считать, что подобная физиологическая инертность характерна для всех алкалоидов в целом.

Напротив, в последние годы, особенно после появления изотопной техники, в литературе публикуется всё большее уїдало зкепзри-меитэльиых данных, свидетельствующих о существенной мстао'оличе-скоіі подвижности алкалоидов, О ЇЄКЇЇЄ об ИХ полном клиі'.чостичном расуеплонии в процессе ккзкедеятелькосги pccTCHiii!. V ■ ;

1 Показано, например, что никотин и морфин синтезируется і молодше меристематических тканях, обладающих наибольшей метаболической активностью (Ochnid, Бсг:-а;;о, IV'^J; ¡¿оЪкоз, Siiriiany et 3.1., 1966). По мнению некоторых авторов Сйм^оп,

і1"«!гъаг!п, 1 5) синтез алкалоидов в активно деляцпхся кле> кох меристеш» а также наличие прямо пропорцію¡іакьноїі зависимости мекду скоростью роста табачного растения и накоплением в нем никотина свидетельствует о возможном влиянии указанных ооодинепил нз процессы роста.

Обнаружена тесная взаимосвязь ме;:;ду биогенезом никотина, с одіюіі стороны,' и прорастанием и созреванием семян, с другой. Так, В Процессе прорастания семян Kieotiona tobacuii u Nicotirnc. elauoa происходит активний синтез никотина, и родственных ему алкалоидов (Ильин, 1929; Еяыш, Довкоза,1959; Яовкоза и соазт.,1970). Действительна, в последние годы публикуется всё болушіе число вії-СНерИмеПТЬЛЬНЫХ д2шнлх, свидетельствующих Об VX х ш ич с сн о 1г л а б иль-ности. Нз примере алкалоидов групж никотина, в частности, показано, что указанные соединения могут давать начало таким метаболитом, кок никотиновая кислоте и НАД, что поззоляет рассматривать их з качестве резервно Я форш пиридкнозых колец у растений (Grii'-it.i

v ■ ~ 25 -

" ot ьХ. 9-30; Ki oüjci, ' c.a;íú;i, 1S468 ) . БОЛЬШОЙ метаболической актиз— постьй отличаемся и метильная группа никотина. С помощью алкалоида, ДЗЗлД^ и'счсного по углероду и водороду в СН3-группе, удалось определить её участие в образовании холина (Locte, Bill, .

Поскольку общеизвестна роль холина в реакциях трансыетили-рования, очевидно, что никотин, через холин, как промежуточное соединение, мезет зыступэть в растении в качестве одного из доноров мачильних групп. С позиций квантовой биохимии алкалоиди группы никотинаи, в первую очередь, их миперше представители, по-видимому , долк1ш участвовать в переносе электронов, те-ееть игрогь определенную роль.в окислит ель н о-в осс тс нов ит ельных процессах. (Пюлыаа н, Пюльман, 1964). В реакциях подобного рода эти алкалоиды могут принимать участие по только благодаря сочетанию сопряженных связей с гетероциклической структурой в их молекулах, по такяо в силу изменчивости величин валентностей атомов азота гетерощжлов из трехвалентных у восстановленных форм в пятивалентные - у окисленных (Арешккнэ, 1951).

Все зти (сакты убедительно свидетельствуют о химической лабильности алкалоидов, что является весьма ваш; olí про дп o cu л ко;! для понимания квтаболичсских гтутои расщепления последних в растительной клетке. Вместо с тем очевидно, что приведенных доппых недостаточно для установления взаимосвязи их метаболизма с основными обменными процессами с целью определения месте алкалоидов в общем и специализированном обмене веществ.

Приступая к изучению этой проблемы ш предположили, что превращение алкалоидов, как азотсодердэщих оснований, должно бить связано с азотистым обменом растительной клетки. Поскольку аминокислоты являются первичными продуктами биологической ассимиляции азота мм поставили перед собой задачу, прежде всего, исследовать возможность их образования в ходе превращений никотина. £ля изучения метаболизма этого алкалоида нам продетэвлялось также ванным углубить существующие представления о путях расщепления его молекулы / в целом и каждого из ос* фрагментов в отдельности, а та юга исследо-. взть взаимосвязь превращений никотина с родственными ему алка-* лоидами.

¡ I. 1,'атеркалы и методы

Для изучения путей превращения никотина в растениях рода ш-cotiana использовался метод радиоактивных изотопов. Объектом

исследования слукили растения Nicotians tabacua (водные культуры) И побеги b'icotiana glauca . Никотин, печеный С1*1 В разных положениях, получали биосантетическии путём, используя аспа-рагиновую и гдутэыиновую кислоты, которые, как было показано нами ранее, являются предшественниками пиридинового и пирролидк-нового колец алкалоида, соответствзпно. В качестве предшественников использовали такге 2-С^-ацетат, ксторыН в равной мере активно включается в пиридиновое и пирролидивовое кольца никотине ( Griffith , Byerrua , 1959), н U-C^-ojwhJj в основном ъг.тшчвю* ЩИЙСЯ В иетильную группу алкалоида ( Byerrura et al, t 1954), Для отделения никотина от {фракции аминокислот а других соединений noun был разработан метод их разделения и очистки с поиоесьо ионообменной хроматографии ( Lovkova, 1964), который позволял выделить никотин в виде кристаллического производного (алкалоид идентифицировали кристаллографически» но т-ре пл. и спектрально) и фракцию свободных аминокислот (выход 95/S), Очищенную до постоянной радиоактивности. Идентификацию„связакник и свободных аминокислот и их количественное определение проводили кетодом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге с использовчнкзы ряда оистеы рвехворителей и специфических проявителей ( Кс?аггеп, 1951; Hiller в« al. f 1952; Fraenkel-Conrat, Singer , 1956).

2. Результаты эксперпдснтольншс исследований

I) Прсв^о^ение нико® ено_в_анабаз ни и анптзбнн

Одна из характерных особенностей растений табака состоит в той» что в них наряду с никотином присутствую!; другие пир ид it-новые влкалоиды. Как известно, молекула указанных: соединений имеют сходное химическое строение и состоят из пиридинового» лир— ролидикового и пиперидкнового колец, вместе с тем они отличаются друг от друга по содеряанию СН3-грулп, е текне по степени гидрирования (рис.5).

Поскольку в никотине имеется метилированное пирролидиновоо кольцо» а также пиридиновый гетероцикл» изучение (й-о превращения, ь родственные алкалоиды сводится к ревения геких вопросов, как: X) метаболическая подвижность мет ильной группы и возмо^ость её отщепления, 2) преврэщонкэ пирролид«нового пятстланного гетеро-

спадами-*

никотин

норнихотин

гм-сн5

N * метилаяаоазин

СНз оксиникотин

- ЗипирадиЛ

шкоте/глин

N—013

N N

йнатабин анаталлия Ы- метипаншабин

Рис,5, Алкалоиды группы никотина

цанла в шестичленноз пиперидииовое кольцо, и, наконец, 3) место и роль окисленных форы алкалоидов в метаболизме никотина. Б настоящее время первый вопрос моано считать решенным, тек как в исследованиях многих авторов показано, что метильная группа алкалоида легко отщопляется и при этом из никотина образуется норни-КОТИН (Ильин, 19^8 ^ 1)а77Э0П , 1945; йЬерка , Еелеу , 1966).

На возможность превращения пирролидинового кольца никотина в пиперидииовое кольцо анабазина впервые указывал еиё в 1948 году Г.С*Ильии (Ильин, 1948). Однако, в то время аса гшотеэа не получила экспериментального подтверждения да и в последующие годи исследователи тзкае не смогли окончатльно подтвердить или опровергнуть ей, так как полученные ими результаты носили противоречивый характер ( ЗсЪгоЧег г 1957; ЬееЪе, 1968). Нереиешшм оставался такяе вопрос о роли окисленных форм - так называемых ."минорных" алкалоидов в метаболизме этого класса соединений.

-Учитывая вышеизложенное, мы поставили перед собоЦ задачу исследовать процесс расширения пирролидинового кольцо никотина за счёт ого метмльной группы до пиперидинового и тем саиым определить возможность превращения донного алкалоида в внабозин (Лсвкова и соэвт., 1973в). Нвыа вторая задача состояла в выяснение роли анатзбинэ, как предсяевмтеля минорных алкалоидов, в метаболизме никотина, и, в частности, на пути его превращения в анабазин.

При постановке опытов радиоактивный никотин, меченый С^ ПО метиру, ВВОДИЛИ В изолированные ПОбеГИ Н1со1;Аапа £1аиса, по окончании опита из растительного материала извлекали суммарную фракцию алкалоидов, которую разделяли но индивиду а льше соединения методом ТСХ (Довковз, Ииноесдиновз, 1969) и определяли их радиоактивное^ (табл.8). ,*

Как и следовало оявдать, введолиа экзогенного никотина в побеги НьеоШапа ц1аисапривоДИТ к увеличен!® суммарного содержания алкалоидов (з 2,5 роза) и одновременно существенно изменяет количественные соотнопения меаду отдельными представителями указанного класса соединений. Напршер, в опытных растениях уменьшается абсолютное и относительное содержание норннкотша при одновременном увеличении в 1,5 раза количества анабазина и

Табл^а 8

Содержание ешь лендов и юс радиоактивность в побегах Klcotiana glauca.

Алкалоиды

Содержание алкалоидов на 100 г, сухого веса

опитние растения

иг

% ог суммы алкалоидов, в >

контрольHÜO растения

ыг

: осщза.

' акткв-. нссть• : б ::ап/ : ива.-: на ЮЭг : сухого

% от суммы ол-: веса каловдов -в %

Уд.активность

ымоль

. о>

. р

:вкга>

;чс— .НИЯ

Суша алкалоидов 646, о

ííopHKKoiKH 20,0

Анабазин 253,3

\натэбин 23,3

Jkkoskh 350,0

\ *

100,0 250,0 100,0

3,1 37,0 14,8

39,1 172,0 60,8

3,6 0 0

54,1 * 41,0 16,4

Г»5.1С5 ' - 5,5

0,5.1С3 0.4.I04 0,02

0.4.IC5 2,4.10* 1,5

2,6.ХО3 1»8Л04 0,1

I.I.I05 4,9.10* 4,0

появлении анзтабина, отсутствующего у контрольных растений, В опитццх растениях б отпичке от контрольных глзвпш алкалоидеи становится никотин и на его доаэ приходится до 54, от суммы укззакньк соединений. Однвко, если учесть, что оштше растения подучили 2,1 г никотина (з пересчёте но ICO г навески), го становится очевидным, что за 4-е дня экспозиции основная часть введенного елкалеи да (83,3/3) активно метаболизкруется, при этом в результате превращения С^ -никотина образуются радиоактивные анабазин,, онатебин и ворникотин. (

'Как видно из табл.8 наибольшей радиоактивность» среди перечислению; вше соединений (порядка 1:16:80, соответственно) обладает анабазин. Так как в состав анабээкнз входит шостичленный гетероцикл, которого кет в никотине, то, очевидно, при превращении, последнего долено происходить расширение «королидикового кольц! до пиперидинового. Поскольку з нашем опыте у"С1 -никотине - предке сгвеннина, радиоактивность в основной сосредоточена в иегидькой

- so -

группе (Byerrum 0t al-s 1954), TO в побегах Ніcotіона clauca при образовании анзбззинэ из никотина расширение пирроліщинового кольца псслоднего до пиперидиыового происходит за счёт СН3-группы алкалоида.

На основании генетическік исследовании меявидовш; гибридов тэбзкз Тернсведий с соэвт. предположили, что за реакцию трэсфор-иации никотина в анабазин ответственен определенный ген (Тернобский и соэвт., 1937). Реакции подобного рода известии и в органической хиуии (Чичкбабкн^ 1931).

Как уяа отыечалось выше, введение экзогенного никотица в побеги Иісоtiада glauca приводит к появлению в них анетэбина, отсутствующего в контрольних растениях. Анзтабин является структурным аналогом ензбазинз и относится к иинориим алкалоидам. По мнении некоторых авторов, превращение никотина в анабазин долкно происходить чероэ внатабин в качестве проиенуточного соеди* нения (Alworth , Rapoporí , 1965). Однако, в нойих опытах УЛ.активность виобазина несколько выие (1,4 раза) уд.зктивности анзтвеі бииз, и, следовательно последний не ыозет выступать в качестве предшественника анабазина. *

Сравленке уд.активности указанных алкалоидов, напротив, позволяет предполокить, что в результате превращения никотина первично синтезируетсп анабазин и только при его дегидрировании иаеет место образование анатабинэ. Эти«, по-видимому, и объясняется появленью еизтабшэ на фоне увеличения содержания анабазина в опитних растениях по сравнению с контрольными с 172 иг % до 253 ит,%.

Подученные нами данные о том, что образование энэтебинэ не является обязательной лроцаяуточной ступенью на пути превращения никотина в анабазин, противоречит гипотезе, выдвинутой Лльвортоа и Рапопортоіл. І^ри использовании в качестве продаєственникэ но С^'-никотинз (как это имело иесто в нотис опитах), а радиоактивной углекислоты, они выделили алкалоиды, величина уд.активности

которых убывает в слодуюцеы порядке: и їжо тин-^анатабин->-

анабазин. На основании этого факта автори заключили, что анатабин - непосредственный предшественник анабазина.

- ЗІ -

Однако, тек оі'і вывод мог бы быть варнш голь к о л том случае, если нуги биосіштезз сн&оазкно и вногабкко обязательно идут через никотин и явдяится совершенно идентичными. По какому мнению, наиболее вероятно, что онэтабнц и анабазин образуются не только из никотина, но и независимо от него за счёт общеметаболических предшественников типа аминокислот, при этом больиая радиоактивность внатабико монет быть вызвана (в опитах Альзорта и Ропопор-. га), наиболее интенсивным, по сравнению с анабазином, процессом его первичного биосинтеза. Не исключено тєкеє, что при образовании анзтабина и анабазина используются совершенно разные предшественники їоккз, как это теот место в ходе биосинтеза восстановленных (СОДЗрЫЕЦИХ пирролиднповые кольца) и окисленных (содерпаших пиррольные гетерсциклы) структурних аналогов не только алкалоидов, но представителей и других классов, соединении. Достаточно сказать, что активным предшественником пирролидииовше колец многочисленных алкалоидов является глутэминозая кислота и родственные ЄІІ соединения (си. ЦсЯЛіег, Попитое, -1569 ) , в то время как ппрролькые гетерошшш порфир:;::овых ядер образуются за счёт глицина к д-аыиио-левулииовой кислота.

Сопоставление данных Лльворта и Рапопорта с нашими результатами позволяет предположить, что первичное образование окколонных форм алкалои дов - "минорных" - происходит иным путем, чей . образование основных йор;-л алкзлои дов, которые явлпотся более восстьновлєніінші соединениями. Но это предположение совершенно не исключает вторичного ресинтеза минорных алкалоидов за счёт основных. Напротив, основные алкалоиды в силу их относительной стабильности иоїодо рассматривать в качестве своеобразного депо для резервирования минорнее алкалоидов, о чом свидетельствует, з частности,•превраценпз анабазина в снотзбин, о котором говорилось вше. Кз выше изл оконного становится то к но очевидным, что шшорные алкалоиду не являются предаественііикоми основных алкалоидов при ІЗиоскнгезе последних.

На возможность превращения никотина в родственные ему алкалоиды, помимо результатов, о которых говорилось -зыше (тсбл.8) косвенно указывают гонке нащк данные по изучению алкалоидного спектра при прорастании семян, (їїісс^іаїїа єіааса ) • согласно

которым у IO-12-днезкых проростков наблюдается нрпмая коррелята меиду нзкоплеииеи анабазина, с одной стороны, и уменьшением относительного содержания никотина, с другой (Ловкова и соавт., 1971). Таким образом, метзболизм никотина тесно связан с родстве! ншш алкалоидами, и этот алкалоид монет выступать в кзчестве непосредственного предшественника не только норнакотинэ, как считалась ранее, но токке и зиабазинэ.

Для определения места' никотине в общем и специализированной обмене веществ представлялось ваянии исследовать возможность его превращения пе только в алкалоиды, но и другие азотсодержащие соединения. Поскольку большинство этих соединений являются не гетероциклическими, как никотин, о алифатическими, монао било ожидать, что подобные превращения должны происходит^ путем расцепления гетероциклов, входящих в молекулу,никотина. Исследованию этих вопросов посвяцен следующий раздел нашей работы.

2) Превращения экзогенного С^-никотинэ . ' "" . в ¿астениях таба^д.

Для исследования метаболизма никотин» в растительной клетке и определения возможности его расщепления в целом и какдого из его фрагментов (пиридинового и пирролмдинового колон, метальной Группы^) Б отдельности во взрослые решения Hicotiana ta-bacum , 8 такие побеги líicotiena glauca вводили рЭДИОЗКТИВНЫЙ никотин, меченый С^ в разных положениях (LovkoVa , 1964; Ильин, Ловнова, 1964, 1965, 1966, 1970; Ловкова и соавт., 1969). После 3—х дневных экспозиции аз растительного материала выделяли указанный алкалоид я определяли его радиоактивность (табл.9). Как видно из табл.9 возврат радиоактивности в никотине в наших опытах не превшзет 4-7JS, и при этом расцепление алкалоида, меченого по метилу, в 1,8 раза превосходит расцпление Никотина, меченого в гетероцкклзх. i

Метаболическая подвижность метальной группы алкалоида, как уне говорилось'выше, отмечалось также многими друг шли автораии прй инфильтрации никотина в листья Nicotiana glutinosa jj литературе указывалось такие на возможность окислительного расщеп-

Геблипа 9

Превращение экзогенного С^-никопша :

З ІГіооиІопа. та"Ьаоиа

Локализация і!Єїі:і" Іі ВііОДОІіНОІІ никотин о

ІІИКОТИИ, виделешшіі ИЗ ОПЫТНЫХ

растений

Сит)

Общая активность еы де л енного никотина ккп/ыин

Ппрролидішоіое кольцо 39,0

Пиридиновое кольцо 62,О

ПпрИДИНОВОе и пкрро-

лидиповое кольца В1,0

Погильыэя группа 64,О

0,4.10* 0,9.10і1

0,4 Л О*1 О, ЗЛО4

ЗОЗВСЗТ р!>'

дпооктиэ-

ности в ни'

кстине, /5

7,8

6, о

7,0 4,0

,-каа пиррслпдииозого кольца. Что касостея активного метаболизма никотине, меченого как в пиридиновой, тек и пирролидиновси кольце, -то такие дйннцо получе;ш впервые. Слизкие величины возззрогэ радиоактивности, после взедонкя инкстяна, разномерно кеченого з обои го горо цикле:-;, в та кг; з в каждом из еі'о колец в отдель.'шети, позволяют предположить, что растительная клетка в ровной пере активно и с одинаковой скоростью, иокот расцеплять оба гетсро-цкклй алкалоиде. Как известно, пирролидиновоа кольцо довольно "ноіістоіїко" по своей структуре и легко расцепляется после его дегидрирования по месту двойных сбязоіі. Ну против, для ліфі;-; илового гетероцикла характерна больроя -"стойкость", в связи с этим, для его расцепления, например, при сипгэнии требуются особое условия: гфяыенениз окиси ртути в качестве катализатора, поднятие температуры до 400-500°С, повышение давления я т.д. («Тг.соЪз, 1900, 1964).

Активный ыетаболизм экзогенного никотина, меченого в пирк-дипозои кольце, убедительно свидетельствует о том, что растительная клетка способно окислять довольно "стойкие" оргеничо-ские соединении и пепользоьать их в случае необходимости для своих иу;::д. Интересно, что ь отлична от рестигелышх* ткансіі, расцепление никотина у чолоьека и кизоиних 'закапчивается но уровне парролидинозого кольца, а пиридиновые кольца в больной

части выбрасываются вместе с балластными веществами (су.Лоикова, 1%9). Однако, растения более экономно относятся к поступающим в них органическим веществам, и, преяде всого, к азоту, поэтому они ire ликвидируют пиридиновые гегеродпкли, как "отбросы". Есть основания полагать, что "осколка" молекулы расцепленного никотина они используют для биосинтеза соединений zhoü природы» 1.5м считали, что такими соединениями, в первую очередь, могут бить аминокислоту, имеющие -с никотином много общщ; группировок*

3} Вторичные npQEngjcuim С^-к1иотинз_в_связатще_ Л свободные вминокполота

Для исследования возможности превращения никотина в аминокислоты в растения Hicott&iui ъаъасш-. вводили радиоактивный ии-логнн, мачонмй CIif в разных положениях, спустя 3-4-х-дневную зкенознцет из растительного материала выделяли фракцию свободных аминокислот, суммарный препарат белка и никотин (.Ильин, Лов-Коза, 1966; Ильин, ^овкова и соаат., 1969; Lovuova , 1964; ilrjia, bo'vkova, .1У72 ). После пропоратявного хроматогра^ичс-ского разделения гидролизэга бот:о определяли радиоактивность свободных и связанных аминокислот, о токмо никотина.

Как видно из таблЛО, в эрой серии опытов так ае, кок и в предыдущей,«экзогенный никотин активно расщепляется, приГэтом за счёт продуктов распада образуются езободше аминокислоты. Возврат радиоактивности в суммарной фракции свободных зыимокис- ■ лот практически равен аозвроту радиоактивности в никотине.

Относительно высокая степень использования проектов расцепления никотина в образовании аминокислот мокет свидетельствовать о специфическом включении алкалоида в укоззнные соединения только в случае избирательной локализации радиоактивности у от-долзных представителей этого класса соединений. Напротив, ровно-мерное распределение радиоактивности изиду всеми аминокислотами вызовет уменьшении процента включения соответственно в 15-20 раз, и в этом случае кокно говорить лишь о иеспецнфичоскоц вклдачовки сдкалоида в указанные соединения. Чтобы установить какой из этих д/roii,специфический или меелепифический, имеет место в растении тзбзкз» ми определили радиоактивность и^дивидуаль-

Таблица IQ

Содерканке и радиоактивность никотина в

свободных эмкнокислог в Hleotriona tabaeua

' Контрольные растения Опытные рестения

К—во ь!г :К-во :мкг * К-во иг К-ьо 1жг : Обц&а вд43озвраг ' ; тиБность:редио- ; küh/whl. icktkbhoc- : :ги, а

Никотин 29,4 36,5 0,31x10^ 3,7

28,5 - 30,5 - 0,27x10* 3,3

Свободные ашшсккслоть! - 505 5 SO - 500 590 0,30x10'' 3,5 0,23'хКЛ 3,4

них a пин OK kg лог, йзбрзв дли- згой цели связанные ашпюкислоты, так как количественное содержание свободных было очень незначительны!;.

Согласно аашкц данщм расцепление экзогенного С^-никотина приводит к образованию радио активных аминокислот, подавляющее большинство когорах представляет собой алифатические соединения довольно простого отроения (Ильин, Ловковз» 1966), Поскольку радиоактивность никотина - предшественника полностью локализовано в пиридиновое и лирролкднновш кольцах, то, очевидно, включению иетки алкалоида в внинокислош должно предавствовэть окислительное расщепление его гетерециклов до алифатических соединении. Теаиы образои, но характеру конечных продуктов (ашшокислот} иоа-но судить о путях расщепления первичного соединении - никотина.

Существенно,' что отдельные ем н окис л о ты, биос шгаез крова шше эо счёт элкрлоида^иетятся неравномерно, а в известной степени избирательно. Так, например, после введения никотина, иоченого С н в пирролидиновои кольце, образуется лейцин, радиоакткзкоегь которого в £-4 роза превосходит радиоактивность остальных аминокислот. Как известно, лейцин - аминокислота с разветвленной углеродной цепь», однако, её биосинтез осуществляется за счёт относительно простых соединений. По-видикоцу,,'при расцеплении яирро—

лндинового^кольцз пккотино образуются компоненты, близкие по структуре к предшественником лейцина, например, к ацето-молочной кислоте, той более, что в состав последней ток но, как пирроли-диновего кольца, входит 4-х углеродная цепочка.

Расщепление С^-никотииа до простых, ниакомолскуляриых соединений ещё нагляднее подтверждается но примере серина. Радиоактивность эх011 аминокислоты в 3-6 роз (предшественник никотина -2-С^-зцетат) превышает радиоактивность остальных аминокислот. Согласно современным представлениям биосинтез серина происходит за счёт активных С^-единац, центральное место в метаболизме которых принадлежит фолисвоы кислою и её активирование!; форме — т е гр а г ;т др ойо л и о во й кислоте - (ТГФ;С). Одноуглеродше единицы могут присоединяться к ТГОК или в виде "активного формальдегида" при переносо оксиметилыюй группировки, или в виде "активного форцизта" при переносе формилыгоУ группировки (Андреева, 1963).

Большая радиоактивность серина по сравнению с другими аминокислотами свидетельствует о том, что расщепление колец никотина, по-видимому, происходит до С^-одиниц, которые и используются при биосинтезе этой'аминокислоты. Конечно, с оноргетиче-ской точки зрения для растения, очевидно, было бы выгодное процесс катаболизма алкалоидов не доводить до таких простых "кирпичиков", а останавливаться на более сложных компонентах. Такое далеко идущое расщопление возмомно, вызвано тем, что растительная клетка в ходе эволюции не приспосабливалось к тому, чтобы подобным образом использовать никотин в ходе своей кизиедеятельности. В нормальных физиологических условиях такой процесс, по-видимому, вообще, но происходит, а окислительное расцепление алкалоида имеет место только в экстремальных условиях, например, при гс* лодном обмене (Машновцсв и'соавт., 1954), или во время созревания семян (Ил^ш, 1929; Ильин, Ловкозз, 1959в), когда азот' клетки практически полностью перекачивается в запасные белки.

Поскольку одноуглеродше компоненты являются наипростейшими "кирпичиками", па основе которых могут быть построены практически вси органические соединения, то расщепление никотина до С^-фрегмеитов, несмотря не частично избирательную локализацию радиоактивности (о чётд говорилось вше) всё ае свидетельствует

о неспвцифнческои включения метки алкалоида в сыпнокислоти.

Вместе с їїси, оценивая эти результаты, необходимо помнить, что в основе питания растений ленит использование ш не органических, а иинерглышх форм азота, таких как нитраты и аммонийные соли, поэтому дзке при усвоении аминокислот происходит предварительное расщепление последних, дезаминироваїтие и последуащее вовлечение о бра зовзб(2єгося с шлю кз в ре синтез ззсгисгідс соедше-' ниі) (Ухина, Ратнер, 1970).

В свете этого закономерно, что экзогенный никотин, прежде всего, ре оцепляетсн в ходе метаболических реакций, и только его метаболиты используются растениями в образовании аминокислот* Поэтому, несмотря ка относительно невысокую степень использования алкалоида ко ресинтез очиноккслот, мосногсворить о наличии определенной взаимосвязи метаболизма никотина с азотистим обменом растительной клетки,

КЗЇЛІЕЧіЗОСТЬ АШ.ЮЩШОГО СПЕКТРА Б ПРОЩССЕ РОСТА И РАЗЕИЇТІЇ РАСЕБіШІІ РОДІ НісоЬіаіми

Согласно современным представлениям, физиологические свойства и морфологические признаки, характеризующие каждый последовательный этап индивидуального развития, подготавливаются и предопределяются соответствуют на и физиолого-бпохимическимк изменениями, состовлятещими основу биохшической дифференциации, которая предшествует процессам морфогенеза (Чвйлахян, 1958; Хавккн,1969). Возрастные изменения, свезенные с обменными реакциями, в ряде случаев сопровождаются накоплением или потреблением специфических продуктов обмена, представителями которых, в частности, являются алкалоиды.

К .началу настоящей работы на примере алкалоидов семогр розного строения была показана изменчивость алкалоидного состава (качественного и количественного) в течение жизнедеятельности растений.. Полученные данные свидетельствовали о химической лабильности и метаболической активности указанных соединений. Однако, слабой стороной всех этих исследований, которая во ино-гоц обуславливалась утилитарным подходом к изучению данной проблемы (стремление увеличить выход алкалоидов из лекарственного сырья) была их неполноте и незавершенность, заключающаяся о том.

что авторы рассматривали изменчивость алкалоидного споктрэ не в течение всего низнэниого цикла растений, но только в нокотopus овделыио этапы их развития. Кроме того, в otwc работах, как правило, проводилось изучение состава алкалоидов в отдельных частях и органах растений, но не анализировались все растения, кок едини!! целостный организм, Емоето с тем, одна из характерных особенностей высши растений, как известно, состоит в налички у них двух систем вегетативных органов - надземной и подземной, возрастные изменения которых хотя и протекают с розной скоростью, но взаимосвязаны. Поэтому исчерпывающее представление об изменчивости содержания тех или иных соединении в теченио роста и развития растений ыоиет быть получено только на примере всего растительного орсзнвзз.:о, как единого целого. ' •

Что касается алкалоидов..группы никотина, которцо составляют предмет палих исследований, то изучение их состава в .течение полного цикла жизнедеятельности растении, включающего в .себя основные жизненные процессы (от ссвопй до семени) при взаимодействии всех его органов и тканей до постановки настоящей работы,, вообще, не проводилось.

Учитывая важность этих вопросов для углубления существующих представлений о роли алкалоидов группы никотииз в обвдм и специализированном обмене веществ, а такие для понимания путей! их метаболизма, мы исследовали изыенчиьоегь алкалоидного спектра в корнях, листьях, стеблях и репродуктивных органах растений .родз Eico--tiana при прохождении ими последовательных этапов индивидуального развития.

Поскольку в процессе индивидуальной жизни растения в основном мо^ет повторяться филогенетический путь развития,, то изучая качественные в количественные соотношения меиду родственными алкалоидами у растений разного возраста, мы рассмотрели и другую ванную сторону проблош метаболизма указанных соединений, э именно взаимосвязь мозду ними в эволюционном аспекта.

I. Материалы и методы

'Известные ранее методы определения алкалоидов группы никотина для решения поставленных задач оказались непригодными, поото-

uy мы разработали новый ыетод определения указанных соединений, основанной на применении тонкослойной хроматографии к спектро-фотометрии (Ловкова, Ь-иножединова, 1969), Разработанный метод позволяет разделить и количественно определить' 7 родственных никотину алкалоидов при концентрации в пробе каздого из них в отдельности от 10-250 мкг, при этом средняя величина возврата алкалоидов составляет 57,5, а средняя квадратичная ошибке - .

В качестве объекта исследования использовались семена разной степени зрелости следующих видов рсда Ш. соtianat li,Palaeri Gray,, H.Debneyi Donin, К. a lata Otto et lani:, N . tri goa opiiy 11 а Вил., Jí.baassdorfii tVeino, K.gxauca üran., Ii.rustica L. И И.glutinosa L. , проростки N.tabacuai Ь. И U,glauca Grah, ДИКИе И культурные виды растений рода lUcotiona (К. taba cuta L. сорта trapesand, Kerti, Havana, IT.sylvestris Spoß, et Coa-e», Ii.rustica L., N.glauca Grah, II. tri gonophy11 a Dun., К. Palmer! Gray, ll.panacu lata L., K.Biböiovii iVatsoa, ii. suave о I ©гиз Lehm., N. velutina Wheeler, Il.nacropliylla, В.BentbsyniEaia Doiiain, lí.longiriora Cav, и n. xan£5 d orí i i .voiná ) в 'стадии о брас об гния прикорневой po-, зетки, стеблевания и цветения, а такке реципрокные кекаадовае гибриды IT* glutinös а Ь,, N.tabacun Havana, lí.tabacum Kerti, И. sylvestris Боец, et Ccoes, Ы. rus tica L.K H.glauca Grab. В те Ее стадии развития.

2. Результаты экспериментальных исследований

Проведенное нами исследование алкалоидного спектра в корнях, листьс:, стеблях а репродуктивных органах 4-х культурных и 15-ти диких видов рода tíicotiana при гсрохоздешш иуи последовательных этапов индивидуального развития показало, что образование алкалоидов группы никотина в эт;цс растениях наблюдается в течение всего кизненкого цикла, начиная с прорастания семян, продолжается при'прохождении всех последующих фаз развития и только на заверь Еаззцеи этапе - при созревании семян - биосинтез указанных соединений прекращается и усиливается их расцепление, в результате которого зрелш семена растений рсда Иiсоtiana алкалоидов практически не содержат (Ильин и соавт., 1972; Ловкова, 1974; Лоакова и Усманой, 1969; Ловкова и соавт., 1970а, 1971, 1972в, 1973а,с, 1974 а,в).

Существенным показателем метаболической активности этих соединении является их постоянная кжзпчпзость при прохождении послодвватодьшх этапоз индивидуального развития, проявляющаяся в изменении количествеиных соотношении меяду отдельными олкалои-девд группы никотина, в их распределении по органам растения и суммарном содержанки. Нз определенную физиологическую роль алкалоидов данной груипп указывает топке установленный нами факт активизации их биогенеза в те периоды аизвенного цикла, которые хароктормзуются нэиболызей метаболической активностью.

Так, первоначальное образование указанных соединений, практически синтез йй Ьоуопроисходит в молодых, растущих тканях проростков, у которых обмен веществ наиболее интенсивен. Взаимосвязь биосинтеза алкалоидов группы никотина со стадийной молодостью всего растения в целом, а также отдельных его:органов наблюдается и в дальнейшем, У диких видов рода Місо-сісща , например, максимальное содержание алкалоидов имеет место в фазу образования прикорневоіі розетки, то-есть в ювенилыщи период молодости, когда все^обмегшые процессы подчинены интенсивному росту и протекают наиболее октизно. Правда, у культурных видов максимум в содеркопии алкалоидов приходится на зрелме листья периода цветения. Но считаем, что свойство накапливать алкалоида в этот период, когда выход и вегетативной массы максимален, является следствием целенаправленного отбора проводимого человеком при выведении более "крепких" и урокойных, чем дикие формы культурных видов Табаков. Уменьшение содержания алкалоидов-по мере роста и развития, характерное для большинства диких видов, по-видимому, является типичным первоначальным признаком растений рода N1 с сЫ аиа .

Кроме того, биосинтез алкалоидов у диких и культурных видов, В ТОК7ІО их накопление (дикие формы) происходит в корнях, которые; кзк известно, ввиду постоянного роста представляют собой наиболее стадиізно молодую часть растительного организма. И, наконец, основные изменения в количественных соотношения:: мевду отдельными алкалоидами этой группы связаны с наступлением цветения -важноитого этапа морфогенеза рестений.

Существенно, что полученные денные по динамике алкалоидного спектре у растений рода Hicotiana свидетельствуют не только о химической лабильности и метэболическэй еативности этих соединений, но TSKíte являются весьма ванными для понимания путей их превращения в растительной клетке. Так, у ряда диких и культурных видов этого рода поступление нккотина из корней в.надземные органы во время щегенпя растении приводит к его расщеплению in situ и превращению в норникоткн С н.glutinosa , li.p&lmtri , H.triGonophylla > д анабазин' ( H.debneyt).

3 процессе проращивания семян Nicotiana glauca доминирование никотина сменяется доминированием анабазина, при этом максимальный прирост анабазина во времени полностью коррелирует с уыеиьпением относительного содержат« никотина. И, наконец, общим для всех исследованных видов свойствен является количественное преобладание никотина как в подземных, ток и в надземных органах растений на ранних фазах роста и развития. Однако, у ряда видов но мере их дальнейшего роста никотин свое место, главнего по^количественному содержании* алкалоида уступоет норникоткну И анабазину.

Рассматривая эти результаты с позиции теории рекапитуляции, согласно которой в течение индивидуальной еизни растения повторяются (рекапитулируют) огдолыые этапы исторического пути развития данного вида, логично заключать, что в филогенезе, по-видимому, первично синтезировался никотин, который, в свою очередь, и мог дать начало норнккотину и снобаз юг/, .

Таким образом, приведенные факты полностью согласуются в хорошо дополняют результаты» полученные нами ранее с помощью изотопно!: техники, так как убедительно свидетельствуют ó том, что в нормальных физиологических условиях метаболизм никотина тесно связан с остальными алкалоидами этой группы и, преяде всего, ^с анабазином и нориикотином.

/ В процессе ЕНзкедеятельности растений рода Hicotiana , согласно нашим данным, ¿меет место по только превращение никотина в другие алкалоиды его группы, но такие к катаболизм этих соединений (в частностьJ при созревании семян). Важно подчеркнуть, что практически полное расщепление алкалоидов происходит

и ыомент мобилизации всех, азотистых веществ клетки на биосинтез запасных белков и при этом процессу катаболизма алкалоидоз предшествует их перемещение из различных частей растения в репродуктивные органы.

■Эти факты, а такке полученные нами ранее данные (методом радиоактивных изотопов) о рескктезе связанных и свободных аминокислот га счёт ыетаболитоз никотина позволяют рассматривать ал-колоиды, как одну из возможных форм резервирования азота. Очевидно, выполнением именно этой функция объясняется и активизация биосинтеза никогинозьк алк'аловдоэ во вреш проращивания седан

-ьаЬасша ь. ц II.^Хаиса. С^ап., так как в этот период происходит гидролиз запасных белкоз ,и резко увеличивается содер-вание свободных аминокислот (Ильин, Ловкова, 1959). .

ПРЕВРАЩЕНИЕ АЛКАЛОИДОВ ГРУППУ НИКОТИНА

ПРИ МЕШЭДСЬЗОЙ гаврадзАЩИ ТАБАКА

Для расширения существующих: предета^здеанй о метаболической активности алкалоидов группы никотина било важно определить возможность их превращения по только при прохождении последовательных этапов индивидуального развития (.о чём говорилось вше), но такие изучить изменения алкалоидного спектра в результате целенаправленной деятельности человека. Исследование этого вопроса представляет интерес не только в теоретическом плане, но так£е имеет большое практическое значение, поскольку табак является одной из важнейших технических культур, в формировании качества которой алкалоиды принимают самое активное участие, определяя физиологическую крепость готового продукта. Согласно общепринятом п наетс.тцее время стандартным нормам количество никотина в табаках средней крепости не. должно превышать 1-2%, Однако в последние годы в практике табаководства вследствие широкого применения (в целях повышения урожайности) минеральных удобрений и других агротехнических мероприятий содержание алкалоидов в сырье резко возросло и в рядо случаев стало достигать Вместе с

тем установлено, что повышение количества алкалоидов свиш 2% отрицательно сказывается на курительных достоинствах табака, определяющих его качество ( вкус, аромат, крепость ) к,

- чг -

кроне кого, вредно- для здоровья курильщиков, еоі: каї иояст вшивать рок легких* яззу кс лудиз, сердечно-сосудистые и другие заболевания.

Одній из путой уиеньпония с о дернения олк о лондон в юбочной рзсеєн1ш При сощ)зноипп ого вис око Ц урока ііііостц цоіісї стсть ион-видовая гибридизация, отої ыстод гшроко используется во многих странах для улучаєигл сортотнпа яабсков н придания ш кошшжса необходимо hojícshlk свойств и признаков, встречавшихся в родо Kicotioca в целом, но язляодт:ся розроэнонпиии сроди отдслышк его представителей. В частности, этот метод оказала восьиа Эффективным при bue о дс нии сортов, устойчиепх ко ішогш заболеваниям, наносяцш большой врод уросаю. В розультоте табаку били переданы 02 К. glutinosa иіпіунитег к табачной мозаике її к мучнистой poce, от lJ.pluLibaeenií'olia - i¡ чёрной иопко, .от N.longl-flcra - к бактериальной рябухе и чёрному osory, от N.dobne¿ -к чёрной корнезой гнили и к лоаной иучниотоіі росе (цат» по Косыо-децьпш&:ому, Власову, І9&9).

ЧІ-0 касается последовоикя алкалоидного комплекса у межвидовых гибридов табака, то в этой направлении достішений почти пег, да и, вообще, робот крайне голо. Приступая к исследованию этого зопросз (рсботи проводились hd'jh совместно с проф.Б.Дьёрфи Институт гоиеїгли Венгерской днадеши ноу к) ш їй брали в .качеств« растении - родителей сигарщле ХобокИ .N.tabacun Korti И.H.taba-сіш Havana , ц TOKSO дшше йорш - lí.sylvoatj-is , И,glauca И К.glutinosa . (Ильин и соавт., 1972; Ловкова и соавт.,1972а, 1973а,с). Главным итогом стих работ явилось получение иезаидових гибридов тобско, у которых суммарное содержание алкалоидов в листьях, цветущих раетелий но прошшаог 0,5-1,5^, что является, кок уко говорилось ьмао, восьме военш по ряду причин. Одновременно в ходе роботи бали виполеш следующие иитсресшо зокоиомер-ности: X) алкалоиде в заметно моньке (но 14-7 при использовони: диких фори в качество материнского начало ло сравнонш с соответствующий и рецвпрмсаш« гибридами (явление цитоплозмотической наследственности), 2} для всех гибридов в целой характерно более равномерное, чей у культурных видов табака, распределение алка-

лоидов мзнду подземными и надземными органами в период цветения растений - (чёткое влияние диких форм на эффокт наследования), 3) влияние кседого из растений - родителей определяется но только тем фактом, в качестве какого (изтеркпского или отцовского) растения они используются, но также к природой самого растения,, и как следствие этого важность подбора исходных родительских форм, 4) путём скрещивания диких и культурных видов рода Nico-tiaoa модно не только регулировать суммарное содоркаиие алкалоидов, по также изменять количественные соотношения нейду отдельными алкалоидами и даме влиять на их,качественный состав.

Изучение алкалоидного спектра у ряда ме&вядозэых гибридов, табака, кроме того, показало, что хорошей исходной формой для выведения нового сорта моает стать гибрид ll.tabacum Havana х N.sylvestris t так как суммарное содернанпе алкалоидов в нём около 1% (нижняя граница нормы), к тому see токсичность растения уменьшена за счет частичной замены никотина норништином. Для обогащения гибридов ворпикотином, вообще, целесообразно использовать ВИД И.sylvestris , так KSK ОТ N.glutiaosa ( который считается главным иорникОтинным видом, способность к биосинтезу этого алкалоида практически не передается по наследству меивидо-вкм гибридам табака и, по-видимому, является рецессивным признаком .

Б заключение необходимо подчеркнуть, что данные по наследованию алкалоидного комплекса при менвидовой гибридизации имеют, на только практическую значимость, но такке представляют интерес и в теоретическом плане, так как свидетельствуют о метаболической активности никотиновых алкалоидов и подтверждают возможность/ их превращения в результате целенаправленной деятельности человека.

. ЗАК-ЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, анализ полученных экспериментальных данных, в такко данных, известных в литературе, позволяет заключить, что биогенез никотиновых алкалоидов связан с основными звеньями азотистого обмена, при этом роль алкалоидов з этом веккои звене метаболизма состоит в поддержании баланса азота растительной клетки

(как одно из форі; его резервнрованкя) в условиях ПОСТОЯННОЙ изменчивости впещнеМ среди.

Ток, б биосинтезе нпкотшюных алкалоидов активное участие приншвюг глутаминовая и аспарагиновая кислоты, играющие главную роль в первичной биологической ассимиляции азота, поскольку их образовенпо в отличие от других аминокислот,, происходит главным образом из аммония (Крегович, 1972). Как известно, дпкарбоиовые аминокислоты не только быстро синтезируются, но, будучи активными метаболитам^, особенно интенсивно подвергаются окислительному расцепления в растительных тканих. Поэтому их включение в алкалоиды группы никотина мошю рассматривать как своеобразное резервирование этих ваанакшо; азотистых соединений. Доііствитель-но, с помощью метода меченых атомов удалось показать, что за счёт С^-никотинз синтезируется никотиновая кислота и её амид (Griffith oi; al.,1960) при биосинтаз'е которых в растениях обычно расходуется аспарагиновая кислота.

ЇЬ^яду с глутамниоітіі дислотоіі активными предшественниками никотина/ (а именно его пирролидинового кольцо) явдпютсп орнитин к аргинин. В настоящее время установлено, что реакции орнитино-вого цикла, в ходе которого образуются эти аминокислоты, свої1.-" ственны не только «ивотпым, по и растительном организмам и именно в растениях определена их важная роль в ассимиляции аммонийных солеіі и доказана связь с ферментативными превращениями аминокислот, в частности, с реакциями перезмнпировакш.

далее, в результате диссимиляции аминокислот и других органически соединений азота в почве под влиянием почнешші; микрофлоры воуникавт различные амины. Одной из ферм іас усвоения и одновременного обезвреіїивзния (многие амины токсичны) является образование алкалоидов. Показано, что в целом ряде растеши), принадлежащих к различным, филогенетически не связанным кеаду собой семействам, активными,, предшественниками алкалоидов пуринового, хиколизидиаового, тропанового, тшеридплового, а тонко пиридинового рядов (к которым принадлежат и игаоптовое алкалоиды), являются метил-гмин, кадаверин и дутресцин (Lo.nca, Gchütte, 1969) і; Наряду с экзогенными аминами в биосинтезе алкалоидов участвуют и эндогенные амины.

На йриыоре ШМОТИНС уC^DИОЗЛОИ'О, ЧТО ОбрСЗ03ЄННС его пирро-лидинового кольца происходит, за счёт глутаиикевой кислоты к ор-нитина через диамин - путресцин в качестве промежуточного соединения,

Кек известно, декарбоксилирование аминокислот, приводящее к образованию аминов, является весьма важным процессом при диссимиляции азота и играет определенную роль в ого обмене (Крето-вич, 197I). И хотя в настоящее время детально изучена только глутамэт декарбоксилаза (Кретович и др., 1969), однако, имеется ряд косвенных указаний (в том числе широкое' распространенно среди растений путреоцяка, кадаверина, гисташши, тирамипа и других. | аминов) на наличие у них активных декарбоксилаз аминокислот. ! Существенно, что в семейство бобових, отличающемся своей олка-- I лоидопосностыо, обнаружены специфические амины - производимо I гуанидина, такие кок галегин, окоигалегин, сыирновин'.и смирно- ' винин.

Ваші о, что использование аминов на синтез -алкалоидов очень выгодно растительной клетке с точки зрения энергетических затрат, ток кок циклизация, в частности диаминов после их частичного дозаминировэпия в гетороциклн алкалоидов происходит спонтанно, (опыты in vitro) (Кэррз'р, 1933; Glarlc«,. і..авк, 1959). j

І.ЇОНО- и диаминоокеидаэы, необходимый для дезаминиррвания аминов, тоїгае найдены э растительных тканях. Корни белладонны, например, синтезируют ко алкалоиды тропанового рада с о дер нот активную дномииосксидазу, акисляэдую кадаверин и путресцин, В опитах in vitro с помощью диашшооксидэзы, выделенной из проростков гороха, на основе кадаверина и путросцина осуществлен ■ | синтоэ норгигрино, анабазина и кзопелльтьерина, в состав которых [ входят пирролидиновое, пиридиновое и пилеридиновоэ гетероцикды. I (Clurits, ііуяіі, 1959)- " :

Существенно, что главный местом биосинтеза никотиновых | алкалоидов, a такие алкалоидов ряда других групп является кбр-невея система растений, где происходит первичная ассимиляция | эшиака я превращение неорганических форм азота в органические. ; В связи с этим, донные алкалоида модно рассматривать кзн одну из &орм обезвреживания аммиака и резервирования азота in situ. Действительно внесение азотних удобрений и, в первую очередь,

аммонийных вызывает значительное повышение содержания алкзлоидов и наиболее благоприятно для алкалоидоносов. Об определенной зависимости биосинтеза алкалоидов от поступления экзогенного азота косвенно свидетельствует факт широкого распространения разнообразных элкелоидоносов среди бобовых, исключительная роль которых в фиксации молекулярного азота широко известив, и напротив полное отсутствие алкалоидных форм среди растений гетеротрофного питания (Соколов, 1952).

Следует подчеркнуть, что синтезируясь в корнях, алкалоиды в них не накапливаются, а перемещаются в надземные части растения. На долю эзотэ никотина и анабазина, например, в пасоке ряда видов рода кісо-їіапа приходится до от общего азота. Такое высокое содержание позволяет рассматривать эти алкалоида,, как одну из транспортных форм азота.

' Особенно вогко, что с обменом азота растительной клетки связан не только биосинтез, но и метаболизм никотиновых алкалоидов. Так, их полное разрушение происходит во время созревания семян при мобилизации всех азотистых веществ клетки по биосинтез запасных белков, при этом разрушению.алкалоидов в'зрелых семенах предшествует их перемещение по мере приблмнения и конечным стадиям развития из вегетативных оргапов в репродуктивные. На возможность образования аминокислот и белков на пути деградации алкалоидов указывают результаты наших опытов с применением изотопной техники.

Известно, что растительная клетка очень экономно относится к поступающему в неё азоту. После использования большей его части на биосинтез ферментов, структурных белков, о таете Нуклеиновых кислот и других ш;знойно необходимых соединений, в растительной клетке происходит резервирование азота, начиная с иов-./сеиестно распространенных глутаминз и аепарагина и, кончая образованием аминов, бетаинов, непротейногенних аминокислот, а гакає, как показали наши исследования, и алкалоидов.

Специфика растений со'сравнению с иивотными в том и состоит,' что они способны синтезировать колоссальное разнообразие органических соединений, в том числе и азотистых. Действительно

исследования последам кет, когда лавинообразно порастает количестве вновь открытых алкалоидов наглядно показали, что эти соединения, практически не синтезирующиеся в гсивотных тканях и микроорганизмах широко распространены в рэотитольном мире, при этом помимо алкалоидов в растениях часто встречаются близкие им по строению простейшие органические осиозения, иногда называемые "яротоолколоидами1'.

С развитием современных микром от о дов постояшю увеличивается число известных нрлротеиногснных аминокислот, в нестояще© • время насчитывается около 200 соединении этого типа, в то время как в кивотных тканях но синтезируется дакс все 22 аминокислоты, входящие в состав белков. По-видимому, способность к биосинтезу такого многообразия азотистых соединений выработалась растительно:! клеткой в ходе эволюции в ответ на необходимость'поддериа-ния баланса азота в условиях постоянной изменчивости внешней ■ среды. . '

£Г, наконец, исследования биогенеза никотиновых алкалоидов позволили не только установить роль этих соединений в таком важном звене метаболизма растительной клетки, как азотистый обмен, , но также рассмотреть на их пршере принцип универсальности, свойственный нивой природе в целом, и его распространение на азотистые гетероциклические основания.

Сопоставление получении:; результатов с данными, опубликованными в последние годы по биосинтезу алкалоидов ряда других групп показало, что образование важнейших го те ¡.га циклов, составляющих ртруктурную осноЕу большинство алкалоидов, происходит за счёт одних и тех же предшественников, через сходные промежуточные компоненты, что значительно расширяет круг соединений и процессов, подчиненных принципу универсальности.

Докаээ]^), в частности, что активными предшосгвениикйли пирролидшюшх колец не только никотина, но и стахидрина, гигри-во, гигролина, куекгигрина, герродина (группа пирролиднна), го-лиотридина, монокроталина, ретронпцииа (группа пирролизидина), о такие атропина, гиосцизмина, скололамнне и других алкалоидов группы т'ропаиа являются либо представители "семейства" г лу те ми-новой кислоты, либо структурно близкие к ним егматин и путресцкн.

Среди веществ специализированного обмене наиболее ш:р око распространены соединения, ocuoBiicii структурной единицей которых рвляется пиперидиновсе кольцо» Укззакпий гетерещкл, в честности, входит б состав не только никотиновых алкалоидов, но юнге алкалоидов групп седammo, ксниина, лобелию, ареколино и других соединений, являющихся прости).::-] производными пиперидина. На основе пнперидинового кольца построена reuse более сложные бицкклические системы, такие как производные изохинолипа, акридина, хинолезидина, охватывакдие ещё большее разнообразие елка-лоидов, значительно отличающихся друг от друга по своему строению. В ряде случаез пиперидиновое кольцо входит в состав индоль-нах н стероидных алкалоидов.

8а исключением последних двух групп, у которых пкпериди-новий гетсроцпкл как-бы пристраиваемся к более слоеным многокомпонентном циклическим структурам и,' как правило, .образуется кз тех se "кирпичиков", на основе которых построена основная 'чвмдХигс молекулы, биосинтез пиперидина происходит либо за счёт лизине Vkok и в каиих опцтах) и структурно близкого ему кадаверина, либо за счёт ацетата, как это шеег L'.eera при образовании алкалоидов групп кониина, прозопина и корнакиз,

С помовд» алкалоидов в качестве естественной модели удалось подойти к решению вопросе о биосинтезе и пиридинового кольца в зысмих растениях. Результаты иаыпх работ (а чём говорилось выше), s такие исследования американских авторов продемонстрировали, что у растений, такае кок и у некоторых микроорганизмов существует принципиально иной, чем у человека, нивотнцх и большинства микроорганизмов дуть биосинтеза этого ввяке^лего гете-роцикла за счёт аспзрегинозой кислоты н гл пцо р о ль дег и д-3-фо сф а г а. Так как пиридиновый гетеродинл является основной структурной единицей нз только алкалоидов, но также входит в состав вэхней-ши коферментов, связанных с основными звеньями обмена, 'эти работы доказали особую роль acnaparwiosoii кислоты в растительных тканях в отличие от гхвотнш;, где образование указанного гетеро-цикла происходит за счёт триптофана. Возможно, именно этим объясняется несколько мекыее использование зспзрагиновои кислоты в реакциях перееминировакия по сравнению с глутемкновой кислотой

: ?

Распространенно принципе универсальности на олкэлоидп, .как класс соединений, сказывается не только в общности путой образования их гетероцкклоа, но такие и з той, что активными предшественниками алкалоидов являются протеипогенные аминокислоты» Такии образом, несмотря на обилие форм органических азотистых соединений наблюдается удивительное единство в путях их биосинтеза, а именно первичными продуктами биологической ассимиляции азота, являются лротеиногснныс аминокислоты, а уае из них, в результате вторичных превращений образуются другие гетероциклические основания, в том числе и алкалоиды.

И, последнее, поскольку в биосинтезе алкалоидов используются (за исключением1завершающих этапов) общебиологические механизмы оснсвного азотистого обмена, эти соединения, ввиду кх относительной стабильности, следует рассматривать в качестве удобной естественной модели, на примере которой моино изучать биогенез протеиногешшх аминокислот у высших растений.

ВЫВОДЫ

I. Проведённые исследования расшифровали ряд этапов .биосинтеза пиридинового, пирролидинового и пиперидинового гетеро циклов, составляющих структурную основу алкалоидов группы никотина:

1) Определена роль аспарагииовой кислоты, как предшественника никотина, и установлено участие не только углерода, но и азота этой аминокислоты в биосинтезе пиридинового кольца олка- ■ лоидэ. Таким образом докаээно, что у растений пмоет место "аспв-рагяновый" путь биосинтеза пиридинового кольца в обличив от человека, нивотних и большинства микроорганизмов, для которых ха-рзкторон "триптофановый" путь биосинтеза этого готероцккла.

2) Впервые покэзайо, что образование пирролидинового кольца никотина происходит за счёт об-И^-орнитина и Н *5-глутамино-вой кислоты.

3) Детально изучен механизм образования пиперидинового кольца анабазина у ранее в этом плане не исследованного алка-лоидоноса — ЛпаЪаэьс арЬуНа . Показано, что в данном растении главным путем биосинтеза указанного кольца является но "ацетатный", а "лизиновый" путь» при этом имеет место интэктноо включение лизина в пиперидииовый гетероцикл.

4) Не примере алкалоидов группы никотина (собственные экспериментальные денные), о также sлкалондоз других групп (данные известные з литературе) сделано обобщение о ток, что в растительной клетке синтез одних и тех se азотсодержат КС гетеро-циклов, входящих в состав молекул самого разного строение, происходит из идентичных предшественников, чти значительно раези-ряет круг соединений, образование которых подчинено принципу универсальности, свойственному природе в целом.

П. Получены принципиально новые данные о химической лабильности и метаболической активности алкалоидов группы никотина:

X) Показано, что в растениях рода Nieсriона никотиновые алкалоиды легко взэкмопревращаатеп, a именно

а) никотин дает начало анабазину, пиперидинозое кольцо которого образуется из пирролидииового кольца никотина, при этом в расширении пятичленного гетероцикла до шестичлеиного участвует метильная группа никотина;

б) за счёт никотина синтезируется структурный аналог анабазина - снатсбин. Превращение никотина в анатабин, по-видимому, происходит через анабазин в качестве промежуточного соединения;

в) установлен факт первичности образования никотина в филогенезе по сравнению с другими алкалоидами этой группы, что подтверждает о возможность его превращения в родственные алкалоиды.

2) Доказзно, что в процессе жизнедеятельности растений имеет место окислительное расщепление как менее стойкого пирролидииового кольцо, так и относительного ст&бпльного пиридинового гетероцикла никотина до алифатических создиношШ простого строения.

3) Установлено, что превращения никотиновых алкалоида не ограничиваются их взаимопревращениями внутри только этого класса соединений, алкалоиды группы никотина вовлекаются в общий азотистый обмен, а именно

а) при мобилизации всех азотистых веществ клетки'на биосинтез запасных белков, например, при созревании семян, они выступают в качестве резервной формы азота;

б) метаболизм никотина связан с важнейшими азотсодержащими соединениями - продуктами первичной .биологической 0сс1ши-

лпцш азота. Из алифатических соединений простого строения, образующихся при окислительном расщеплении никотина, происходит ресинтез свободных и связанных протеиногенных аминокислот

Определена постоянная изменчивость никотиновых алкалоидов при прохояденик последовательных этапов индивидуального развития в нормальных физиологических условиях, а тзкке под влиянием- межвидовой гибридизации. Покэзояо, что активизация биогенеза никотиновых алкалоидов имеет место в те периода кизнопкого цикла, которые в целом характеризуются наибольшей метаболической активностью (прорастание семян, цветение), что указывает нэ определенную физиологическую роль этих соединений.

Ш. Установлен факт принципиального различия в содержании алкалоидов моиду культурными и дикими видами рода Hicotiana.

Доказана возможность использования диких форм при межвидовой гибридизации для получения новых, менее токсичных, хозяй-ственнополезных сортов табака с пониженным содервишем алкалоидов. ■ -

Основные результаты роботы изложены в следующих статьях:

1. Ильин Г.С., Левкова М.Я. 1959. Превращение никотина и амино-

кислот при созревании семян табака, Биохимия, 24, 838.

2. Ильин Г.С., Яовкева М.Я. 1962. Биосинтез алкалоидов табаке, ■

Л-й Международный симпозиум по химии природных соединений. Сборн. реф., 77, Прага.

3. Ильин Г.С., Ловкоеа М.Я. 1964г. Превращение никотина в та-

бачном растении,- Тезисы докл. I Всесоюз, биохим. съезде, 3, 90.

4. Ильин Г.С., Ловковэ M.FI. 1965. Участие никотина в обмене ве-

ществ табачного растения, Рефераты сообщ. IX Менделеевского съозда, реф., 269. ..

■ 5* Ильин Г.С., Ловкова М.Я. 1966. Участие'никотина в взosистом обмене, Биохимия, 32, 174.

6. Ильин Г.С., Левкоиa tí .Я., Клглентьева Н.И. 1968. Превраще-

ние никотина в растениях табака. Изв.-АН СССР, серия биол., 6, 876. ,

7. Ильин Г.С., Лознозэ У .Я. 1970. Превращение никотина в рас-

тениях табака. Прикл. биохим. и микробиол., 6, 354.

8. Ильин Г.С., | gbëpgn Б."] , Ловксва П.Я., Шшоиединово U.C.

1972. Алкалоидный спектр в онтогенезе Nicotitma tabacua ( llavana ), Ni с о ti una syl ve stria к их рацплрохнцх гибридов. Изв. АН СССР, серия биол., 5, 756.

9. Ловко во Î.Î.H. 1967. Биосинтез никотина, Изв. АН СССР, серия,

биол., 3, 413.

10. Ловкоей У .п. 1969. Физиологическая роль никотина'в расте-

ниях и различные пути его превращения.' Успехи биол. химии, X, 241,

11. Ловкова ¡¿.Я. 1970. Биосинтез пиперидинового кольца алка-

лоидов, Пэв. АН СССР, серия биол., 3, 451.

12. Ловкоьэ !.;.f¡. 1971. Зиоисинтез алкалоидов группы никотина,

Успехи биол. химии, ХП, 2Ó8.

13. Ловкова Ы.Й. 1974. Биогенез алкалоидов группы никотина.

Изв. АН СССР, серия биол., 321.

14. Ловкова !,1.л., Ильин Г.С. 1961. К вопросу о биосинтезе пир-

ролидипового кольца никотина, Биохимия, 26, 82.

15. Ловкова М.Я., Ильин Г.С. 1962. Участие печеных аминокислот

в биосинтезе никотина, Биохимия, 27, 722.

16. Ловкова Ы.Я., Ильин Г.С. 1967. Накопление никотина в цро—

ростках табака. Прккл. биохкм. и микробиол., 3, 391. /

17. Ловкова I.t.íT., i-'льин Г.С. 1967. Биосинтез пиридинового и

пирролидинового колец никотина. Биохимия, 52, 812.

18. Ловкова У.Я., Ильин Г.С., Клиыентьева Н.И., Минокединова Н.С.

1969. Образование и превращение никотина в растонии табака, П-В Всесоюзн. биохим. сгезд, Тезисы рокц., сооб,: 22, 50.

«t

19. Ловко в а М.Я., Минояединова Н.С. 1969. Определение алкалои-

дов группы никотина методом тонкослойно;} хроматографил и спектрофотонатрии. Прикл.биохим, и микробиол., 5, 48?,

20. Ловковэ М.Н., Уем8нов Ш.У. 1969. Изучение алкалоидного

спектра В онтогенезе Hicotiana tabocua и Hicotiana glutinosa . П-іі Всесоюзн.биохим.съезд,

тезиси секц.сообщ,, 18, 115.

21. Ловкова Ы.Я., Ильин Г.С,, Климентьева Н.И. 1970. Роль acns-

рагиновой кислоты в биосинтезе никотина и анабазина.

Физиол.раст., 17»

22. Ловковэ ll.fi., Ильин Г.С., Миножединовз Н.С. 1970. Алкалоид-

ный спектр при прорастании семян Wicotian? tabacum. Прікл.о'иохиИ. и микробиол., С, 481.

23. Ловкова Ы.Й., Климентьева Н.И. 1970. Биосинтез никотина

В проросткахHicotiana tabacum- Прикл.биохш. И _микробиол., 6, 615.

24. Ловкова М.К.,, Ильин Р.С., Ыиногседииова ¡I.C., Усманов Ш.У.

1971. Алкалоидный спектр в онтогенезе некоторых видов Hicotiana . Изв. АН СССР, серия биол., 6, 839.

25. Ловкова М.Я., Ильин Р.С., Цинояединова Н.С. 1972. Алкалоид-

ный спектр В онтогенезе Hicotiana glaüca, Hicotiana rustica и их анфидиплодда. Кзв. АН СССР, серия биол., 2, 255.

26. Ловково М.8., Ильин Г .С., Миножединовз ¡I.C., 1972. Алкалоид-

ный спектр при прорастании семян Xíicoti&na glauca. Прикл. бкохим. и микробиол., 8_, 121.

27. Ловковэ М.Я. | Дьёрфи Б. ( , Ильин Г.С,, Уинокединова Н.С.

1973, Алкалоидный спектр в онтогенезе Hicotiana glutinosa, Ni со ti ana tabacum Havana.. И их реципрокных гибридов.*Изв. АН СССР, серия биол. - 1, 115. < ■

23. Ловкоза I.î.il., Ильин Г.С.,| ¿ьеріі.и £. ] , '¿пнодединова И.О.

1973. Алкалоиднии спектр в онтогенезе Nicotiana ta-Ьзсиїа £Kerti Ni о о tri а na sylvestris

и ікс реципрокных гибридов. Изв..АН СССР, серия биол.,

5» Это.

29. Ловкозз М.Й., Ильин Г.С., Ииножединовз.U.C. 1973.

Превращение никотина в анабазин в побегах Hicotiana Glauc^.Цр:іісл,биохим. и нквробиол., 9, 595.

30. Ловкова І.Ї.Я., Ильин Г.С., Ишюаедиаовз Н.С. 1975. Алкалоид-

ный спектр в онтогенезе диких видов рода Hicotiana.1 Пзв.АН СССР, серии биол., (в печати).

31. Ловкова H.a., Мкнонединозз Н.С., Ильин Г.С. 1975. Алкалоид-

ный спектр на ранних стадиях развития Kicotiana ■ціацеа . Изв. АН СССР, серия биол., (в печати).

32. Ловкова М.Я., Пуринов Э., Ильин Г.С. 1974. Роль аспарагино-

вой кислоты в биосинтезе анабазина в АпаЬазіз aphylla. Биохїімия, 39. 523.

33. Ловкова ¡¿¡.Я., Hyp ішов Э., Ильин Г.С, 1974. Роль лизина в

биосинтезе анабазина и лупинина. Биохимия, 39, 338.

34. Куркмов 3., Ловкова H.Я. 1973. Никрометоды очистки и де-

карбоксклирования никотиновой кислоты и пиридина. Прикл. бИОХИМ. И ІШїрОбИОЛ., 2» 13835. Нуримов Э., Ловкова Г4.Я. 1973. Выделение алкалоидов анабазиса безлистного методой отгонки с водяным паром. Прикл. биохим. и микробиол., 9, 789.

35. Нуримов Э., Ловкова М.Я., Ильин Г.С. 1974. Роль лизина и

ацетата в биосинтезе алкалоидов Anabasis aphyll^. Изв. Jill СССР, серга биол., I, 143.

37. Hyp nr. о в 3., Ловкова 1-і.fi., Ильин Г.С. 1975. Роль ацетата В бпосинтсзз анзбззинэ В Anabasis aphylla. , ПрИКЛ, биохим. м микробиол XX, 149

J8. XIJin 0.3., Lovkova U.Ja.,.1972. Stoffwecheel des Nicotins in der 'J anpflanzen. Abb..I)tsUuAcQd.V.riss.Berlin, 207.

59. Iljtn G.S., Lovkova M.Ja., Minozhedinova N.S., 1973*.

Tabacco alkaloids and nitrogenous metabolism. Ceakçslevengka îarmacip.

40. Lovlcova M.Ja1964. Metabolism of nicotine. in tabacco.

Acta Eiol.Acad. Soi. Hung. XIV, 275.

41. Lovkova M.Ja., Il J in G.3., 1971. Eioayntiiesia of pyridine,

pyrrolidine and piperidine rings of nicotine end anabasine.

IBES Letter, 2» ■ .

42. Lovkova K. Ja., Klinentjeva H.L., 1972. Biosynthesis of

Nicotine.

Abh. , Dtsch. ¿.cad. Wiss. Berlin, 209. 45. Lovkova M.Ja., Il jin G.3., Nurimov E., 1974. The role of

lisine, aspartic.acid and.acetate in the biosynthesis of anabasine.'Congres. Pharm. Hung, VI. Abstr 1, 26.

44. Lovkova LU Ja., Iljin G.3., Nurimov J3., 1974. Role of acetate and lysine in the biosynthesis of aphylline, aphyllidine, lupinirte and anabasaaina in Anabasis aphylla. Congres. Pharct. Hung. VI. Abstr. 1,29.

______________3aK_;__809____Tiîg. _200

Twnorpa<Jwn 2030 rocnnana CCCP

Информация о работе

Ловкова, Мая Яковлевна
доктора биологических наук
Москва, 1975
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
МЕТАБОЛИЗМ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ НИКОТИНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия