Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболические и сигнальные пути, контролирующие секрецию инсулина бета-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, и их роль в норме и при сахарном диабете

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболические и сигнальные пути, контролирующие секрецию инсулина бета-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, и их роль в норме и при сахарном диабете"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах руЯаЩдп

/^С^РОи ¿СО

ШАРОЙКО Владимир Владимирович

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ И СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА Р-КЛЕТКАМИ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, И ИХ РОЛЬ В НОРМЕ И ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 |!ЮН 2011

Санкт-Петербург - 2011

4848296

Работа выполнена на базе следующих научно-исследовательских учреждений: лаборатория экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск, РФ), Центр исследований диабета и эндокринологии им. Рольфа Люфта Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция), лаборатория молекулярного метаболизма Центра исследований диабета Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция).

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шишкин Сергей Сергеевич

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, лаборатория биомедицинских исследований, г. Москва.

доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, лаборатория общей патологии, г. Санкт-Петербург.

доктор биологических наук, профессор Кудрявцев Борис Николаевич Институт цитологии РАН, лаборатория клеточной патологии, г. Санкт-Петербург.

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им.

И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится «20» октября 2011 г. в 16 часов на заседании совета Д 212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (СПбГУ) по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького СПбГУ.

Автореферат разослан «_» _ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232.09, кандидат биологических наук

Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По определению Международной Диабетической Федерации, сахарный диабет (СД) характеризуется как эпидемия. Предполагаемый показатель распространенности этого заболевания к 2025 году может составить около 330 миллионов человек (Diabetes Atlas IDF, 2006). Уже сегодня СД является большой медицинской и социально-экономической проблемой общества (Zimmet, et al., 2001). Около 10-15% от общего числа больных СД составляют люди, страдающие СД первого типа (СД1), тогда как остальная часть приходится на СД второго типа (СД2; Diabetes Atlas IDF, 2006). СД1 связан с прогрессивной деструкцией ß-клеток в результате аутоиммунных процессов в островках Лангерганса поджелудочной железы, индуцированных макрофагами и Т-лимфоцитами (Chandra et al., 2001; Mandrup-Poulsen et al., 2003). Провоспалительные цитокины, в особенности интерлейкин-lß (ИЛ-lß), фактор некроза опухоли-a (ФНО-а) и интерферон-Y (ИФ-у), играют важную роль в патогенезе СД1, вызывая некротическую или апоптотическую гибель ß-клеток островков Лангерганса (Mandrup-Poulsen et al., 2001).

СД2 является метаболическим заболеванием, в патогенезе которого выделяют два главных компонента: инсулинорезистентность периферических тканей и снижение секреции инсулина ß-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы (Yki-Jarvinen et al., 1994; Polonsky et al., 1996). Согласно последней этиологической классификации нарушений гликемии, СД2 может быть с преобладанием дефектов секреции инсулина или преобладанием инсулинорезистентности (Report of WHO Consultation, 1999). Установлено, что генетические факторы и факторы внешней среды вовлечены в патогенез СД2 (Gloyn et al., 2001). При действии этих факторов ß-клетки островков Лангерганса не способны компенсировать повышение концентрации глюкозы в крови адекватным увеличением секреции инсулина (Muoio et al., 2006), приводя к развитию гипергликемии и других метаболических нарушений. Подавление инсулиносекреторной функции ß-клеток является признаком СД2 и рассматривается как один из вероятных механизмов снижения толерантности инсулинозависимых тканей к глюкозе (Groop, 2000; LeRoith, 2002; Del Prato et al., 2004; Ähren, 2005). При СД гипергликемия и воздействие провоспалительных цитокинов вызывают дефицит инсулина как минимум по двум механизмам: нарушение секреции инсулина и уменьшение популяции ß-клеток в результате индукции апоптоза (Спор et al., 2005). В связи с этим, разработка стратегии протекции ß-клеток в отношении цитотоксического пролонгированного действия глюкозы в повышенной концентрации и провоспалительных цитокинов заслуживает особого внимания.

Глюкоза - главный физиологический стимул секреции инсулина ß-клетками. В норме, повышение её концентрации в крови приводит к активации транспорта глюкозы в ß-клетки. Последующий метаболизм глюкозы генерирует метаболические и сигнальные каскады реакций, которые вызывают секрецию инсулина по двум основным механизмам: инициирующий и амплифицирующий (Henquin, 2009). Первый из них запускается путем закрытия АТФ-зависимых К+-каналов вследствие увеличения отношения [АТФ] к [АДФ] в результате метаболизма глюкозы. При закрытии К+-каналов клеточная мембрана деполяризуется, приводя к открытию потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа. Последующее увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ запускает экзоцитоз инсулина. Инициирующий механизм изучен достаточно хорошо (Ashcroft et al., 1984), тогда как амплифицирующий механизм секреции инсулина изучен недостаточно. Более того, остаются до конца невыясненными особенности генной и метаболической регуляции секреции инсулина, а также роль полиморфных модификаций генов, изменение уровней метаболитов, вторичных посредников, активности трансляционных и транскрипционных факторов в этом процессе.

Для лечения пациентов с СД2 используется широкий спектр фармакологических препаратов с различным механизмом действия, направленных на улучшение гомеостаза глюкозы. В течение многих лет препараты сульфонилмочевины, мишенью воздействия

которых являются ß-клетки, доминируют на фармацевтическом рынке (Krentz et al., 1994, Aquilante, 2010; Polakof, 2010). Недостатком препаратов этого класса являются эпизоды гипогликемии (Ferner et al., 1988; Shorr et al., 1997) и стимуляция апоптоза ß-клеток (Maedler et al., 2005). Кроме того, большинство пациентов, получающих лечение производными сульфонилмочевины в течение 3-10 лет, становятся нечувствительными к данному классу препаратов (Groop et al., 1992). В этой связи представляют интерес новые классы соединений, синтезированные химическим путем или биологически активные соединения природного происхождения, обладающие глюкозонормализующим эффектом и пониженной токсичностью.

Таким образом, независимо от инициирующих факторов, на начальных и последующих этапах развития СД, в островках Лангерганса наблюдается деструкция и прогрессирующее уменьшение количества ß-клеток вплоть до полного их исчезновения и развития абсолютной инсулиновой недостаточности (Вопога, 2008; Meier, 2008; Eizirik, 2009), поэтому перспективным направлением в лечении СД1 является разработка методов сохранения имеющихся ß-клеток на ранней стадии заболевания, а при СД2 - на всех стадиях заболевания. В данной работе обобщены результаты цикла исследований, направленных на выяснение физиолого-биохимических механизмов функционирования ß-клеток в норме и при патологии, результаты которых могут быть использованы при разработке фармакологических и молекуярно-генетических методов протекции ß-клеток не только для предотвращения развития СД, но и уже при развившемся СД.

Цели и задачи исследования

Цель работы. Изучение метаболических и сигнальных путей, участвующих в секреции инсулина ß-клетками островков Лангерганса в норме и при патологии с целью разработки стратегии воздействия на эти пути с помощью фармакологических и молекулярно-генетических методов для нормализации функциональной активности этих клеток.

В ходе исследования решались следующие основные задачи

1. Разработать экспериментальную модель для исследования механизмов секреции инсулина ß-клетками в условиях in vitro.

2. Используя разработанную модель, изучить особенности метаболизма в ß-клетках с нормальной и сниженной секрецией инсулина.

3. Изучить эффект глюкозы в повышенной концентрации и цитокинов на метаболизм и секрецию инсулина в ß-клетках.

4. Исследовать изменение профиля метаболитов и сигнальных молекул в ß-клетках при стимуляции их глюкозой.

5. Выявить полиморфизмы генов, связанных с функционированием митохондрий в ß-клетках и риском развития СД2.

6. Изучить сигнальные пути инсулинотропного действия некоторых имидазолиновых соединений и некоторых классов биологически активных соединений природного происхождения в ß-клетках.

7. Исследовать протективные свойства некоторых имидазолиновых соединений и супрессора цитокинового сигнального пути-1 в отношении цитотоксического действия провоспалительных цитокинов на ß-клетки.

8. Изучить роль в секреции инсулина ряда белковых молекул, которые в ß-клетках ранее не исследовались.

Научная новизна исследования

Проведенное исследование впервые показало, что одним из механизмов снижения чувствительности к глюкозе клональных ß-клеток является стабилизация (т.е. индукция транскрипционной активности) транскрипционного фактора HIF-la (индуцированного гипоксией фактора-la). В этих клетках HIF-la вызывает нарушение метаболизма глюкозы

за счет разобщения гликолиза и метаболизма пирувата в митохондриях, которое приводит к подавлению глюкозостимулированной секреции инсулина.

Известно, что при СД2 наблюдается гипергликемия и повышение в крови концентрации ФНО-а, которые участвуют в развитии осложнений СД2 и в том числе снижают инсулиносекреторную активность ß-клеток. Впервые на модели клональных ß-клеток in vitro установлено, что пролонгированное воздействие глюкозы или ФНО-а в повышенной концентрации приводит к стабилизации HIF-la и, соответственно, к снижению глюкозостимулированной секреции инсулина. При этом обнаружено H1F-la-контролируемое ингибирование метаболизма пирувата в реакциях пируватдегидрогеназного комплекса и активация анаэробного гликолиза. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизмов снижения чувствительности ß-клеток к глюкозе при прогрессировании СД2.

При пролонгированном действии глюкозы в повышенной концентрации на ß-клетки возрастает экспрессия гена-мишени HIF-la - Pdkl и его белкового продукта - киназы-1 пируватдегидрогеназы (PDK1). Показано, что выключение PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина клональными ß-клетками за счет увеличения митохондриального метаболизма пирувата, дыхания и продукции АТФ митохондриями.

Установлено, что пентозофосфатный цикл участвует в амплифицирующем механизме секреции инсулина ß-клетками за счет синтеза NADPH, выступающего в этом процессе в качестве сигнальной молекулы, играющей важную роль в экзоцитозе инсулина.

Используя базу данных GWAS (а genome-wide association study) установлено, что полиморфизм гена (rs950994; G—>А) фактора трансляции митохондрии B1 (TFB1M; митохондриальная 5-аденозилметионин-6->1,Ы-аденозил(рРНК)диметилтрансфераза-1) ассоциируется со снижением секреции инсулина, повышением постпрандиального уровня глюкозы и риском развития СД2. Установлен механизм, посредством которого ослабление трансляции за счет снижения диметилирования 12S рРНК в митохондриях ß-клеток приводит к снижению продукции АТФ в митохондриях и подавлению секреции инсулина.

Изучены некоторые биохимические механизмы действия имидазолинового соединения BLU282, обладающего выраженным инсулинотропным эффектом. BL11282 потенцирует секрецию инсулина путем воздействия на сигнальный путь: АТФ => uAM®+GEFlI Rim2 (GEFII Rim2 - цАМФ-активируемый белковый комплекс, участвующий в экзоцитозе инсулина) => uAMO-GEFII'Rim2, контролируемый аденилатциклазой и сигнальный путь: фосфолипид => арахидоновая кислота => эпоксиэйкозатриеновая кислота, контролируемый кальций-независимой фосфолипазой Л2 (iPLAi) и цитохромом Р450.

Обнаружены протективные свойства имидазолина RX871024 (уменьшение продукции N0) и S0CS-1 (снижение активности каспаз и апоптоза), частично снижающие цитотоксическое действие провоспалительных цитокинов на ß-клетки.

Идентифицированы белок GAS6 и его рецептор AXL в ß-клетках и показана их функциональная роль в ß-клетках, заключающаяся в контроле секреции инсулина и синтеза ФНО-а. Установлен один из механизмов внутриклеточной передачи сигнала в ß-клетках при действии GAS6: GAS6 => аутофосфорилирование AXL => фосфорилирование PI3-

киназы => фосфорилирование Akt =>......=> фосфорилирование GAPDH и GRP78=>......=>

эффекторные системы.

Усовершенствована модель субстратно-энзиматических и сигнальных процессов, объясняющая регуляцию секреции инсулина ß-клетками.

Научно-практическое значение работы

Данное исследование относится к разряду фундаментально-прикладных работ. Применяя вышеперечисленные подходы (модели) нам удалось получить новую информацию о некоторых механизмах функционирования ß-клеток в норме и патологии, выявить новые белки, являющиеся потенциальными мишенями для фармакологического или молекулярно-генетического воздействия, а также предложить способы коррекции

3

функциональных нарушений р-клеток при СД. Полученные результаты углубляют представления о фундаментальных молекулярных механизмах, лежащих в основе регуляции секреции инсулина под действием глюкозы, инсулинотропных соединений класса имидазолинов (на примере BL11282 и RX871024) и биологически активных веществах растительного происхождения (на примере экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia). Данная информация может быть полезна при разработке новых способов управления функциональной активностью р-клеток и коррекции метаболических нарушений при СД2. На использование экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат "Ягель") в коррекции метаболических нарушений при СД2 подана заявка на патент РФ.

Изучение имидазолиновых соединений продемонстрировало возможность использования имидазолинов в качестве инструмента для изучения путей передачи сигнала в р-клетках островков поджелудочной железы, и перспективность дальнейшего комплексного исследования имидазолинов с целью разработки фармацевтических препаратов для лечения СД2.

Ингибирование PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина в р-клетках, поэтому создание селективных ингибиторов данного фермента может рассматриваться как одно из направлений фармакологической терапии СД2 при секреторной дисфункции р-клеток.

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза СД2, а также в создании новых подходов для диагностики. Исследование ведущей роли трансляционного фактора TFB1M в механизме секреции инсулина показало, что он является важным компонентом в патогенезе СД2, связанным с нарушением функционирования митохондрий.

Генотипирование полиморфизма (rs950994) гена TFB1M внедрено в панель генов-риска для диагностики предрасположенности к развитию СД2. Полученная информация позволяет проводить анализ нарушений отдельных звеньев в механизме секреции инсулина, связанных с дисфункцией митохондрий.

В качестве in vitro модели для изучения механизмов секреции инсулина в норме и при патологии предложены постоянные клеточные линии глюкозочувствительных и глюкозонечувствительных Р-клеток.

Показано, что экстракт из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат "Ягель") стимулирует глюкозозависимую секрецию инсулина in vitro и обладает глюкозонормализующим действием у пациентов, страдающих СД2.

Результаты исследований используются автором при чтении лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Личный вклад автора. Работа выполнена на базе следующих научно-исследовательских учреждений: Лаборатория Экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск, РФ), Центр исследований диабета и эндокринологии им. Рольфа Люфта Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция), Лаборатория молекулярного метаболизма центра исследований диабета Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция). Экспериментальные данные получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии. Планирование и проведение экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов и написание статей осуществлялось самим автором, либо при его активном участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Метаболомный анализ р-клеток проводился совместно с Петером Шпегелем и Хиндриком Мульдером. Протеомный анализ островков и р-клеток проводилась в тесном взаимодействии с Томасом Коком и Терезой Ягербринк. LS/MS-MS и MALDI-trap анализ пептидов выполнялся в центре протеомных исследований Лундского университета. Генотипирование производилось в лаборатории центра секвенирования Лундского университета. Анализ данных из GWAS проводился совместно с Валерией

Лысенко и Шарлот Линг. Исследование апоптоза осуществлялось совместно с Ириной Зайцевой, Иохимом Сторлингом и Сергеем Зайцевым. Отдельные этапы работы проводились совместно с Борисом Кершенгольцем.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разобщение аэробного гликолиза и митохондриалыюго метаболизма пирувата играет ведущую роль в прогрессировании инсулиносекреторной дисфункции р-клеток.

2. Пролонгированное действие глюкозы в повышенной концентрации и фактора некроза опухоли-a (ФНО-а) на р-клетки вызывают стабилизацию фактора, индуцированного гипоксией-1 a (HIF-la), приводя к снижению чувствительности р-клеток к глюкозе.

3. Пентозофосфатный цикл, в ходе которого генерируется НАДФН, вовлечен в амплифицирующий механизм секреции инсулина р-клетками.

4. Полиморфизм гена фактора трансляции митохондрии B1 (tfblnr, rs950994, G—>А) ассоциируется с дефектом секреции инсулина и с риском развития СД2.

5. Инсулинотропное действие имидазолинового соединения BL11282 опосредовано цАМФ-зависимым механизмом, взаимодействием цАМФ с комплексом GEFII-Rim2 и метаболизмом арахидоновой кислоты в эпоксиэйкозатриеновые кислоты. Кроме того, BL11282 повышает чувствительность Р-клеток к глюкозе.

6. Имидазолиновое соединение RX871024 и ингибитор внутриклеточной передачи сигнала цитокинов-1 (SOCS-1) снижают цитотоксическое действие провоспалительных цитокинов.

7. Белок "growth arrest-specific protein" (GAS6) и его рецептор AXL экспрессируются в р-клетках. Подавление экспрессии рецептора AXL снижает секрецию инсулина.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах кафедры биологической химии Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова (г. Якутск), Лаборатории экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, Лаборатории молекулярного метаболизма Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция), Лаборатории диабета и эндокринологии Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция).

Отдельные аспекты работы были представлены на следующих международных конференциях: "European Association for the Study of Diabetes" (Rom, Italy, 2008; Vienna, Austria, 2009; Stockholm, Sweden, 2010); "Gordon Research Conférences: Molecular & Cellular Bioenergetics" (Andover, USA, 2009); "What's next" (Malmô, Sweden, 2009); "Islet Study Group", (Steinschaler Dôrfl, Austria, 2009); "World Diabetes Congress, IDF" (Montréal, Canada 2009); "Scandinavian Society for the Study of Diabetes" (Malmô, Sweden, 2010).

Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 30 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, из них 16 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Благодарности. Я выражаю искреннюю благодарность моим прежним и настоящим коллегам вышеуказанных лабораторий, в которых была выполнена диссертационная работа, за сотрудничество, общение, понимание и поддержку. Выражаю особую признательность моим учителям, профессорам Борису Моисеевичу Кершенгольцу и Алле Николаевне Журавской (ИБПК СО РАН, г. Якутск).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав "Обзор литературы" (глава 1), "Материалы и методы" (глава 2), изложения полученных результатов (главы 3-10), обсуждения результатов (глава И), выводов, списка литературы, включающего i^источников, и 4 приложений. Диссертация изложена на j ¿^границах текста и включает_£таблиц и /¿¡рисунков.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (РФ), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", фармацевтической компании Ново Нордиск (Дания), Шведского Совета по исследованиям (Швеция).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методология исследования

Материалы. В работе использовались островки или кластеры ß-клеток, изолированные из поджелудочных желез крыс линии Вистар, диабетических крыс Гото-Какизаки, мышей C57BL/6J, NMRI, SOCS-1 Tg, ob/ob, SUR1 у'\ Tfilm (+/° и ß-Tfilm <"'") и донорские островки человека. Эксперименты с животными были выполнены в соответствии с международными правилами обращения с экспериментальными животными и одобрены локальными этическими комитетами. Островки Лангерганса из поджелудочных желез человека были получены при аутопсии лиц контрольной группы (п=55; возраст 56,7±9,8 лет; ИМТ 25,9±3,6 кг/м2; HbAic 5,7 ± 0,8 %) и больных СД2 (п=9; возраст 57,0 ± 13,1 лет, ИМТ 28,5 ± 4,7 кг/м2, НЬА1с 7,3 ± 1,2 %); в обеих выборках соотношение доноров мужского и женского полов составляло примерно 1:1.

Изолирование островков Лангерганса у грызунов проводилось путем введения коллагеназы (Roche, 0,8 мг/мл) в поджелудочную железу через желчный проток (Gregory et al., 2007) или путем экстирпации поджелудочной железы с последующей ее диссоциацией коллагеназой (0,8 мг/мл) в среде Хенкса (Lacy and Kostianovsky, 1967). Изолированные островки грызунов инкубировались при 37°С и концентрации ССЬ в инкубаторе 5% в среде RPMI1640 (Sigma), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина сульфата (Sigma). Островки человека инкубировались при 37°С и концентрации СОг в инкубаторе 5% в среде CMRL1066 (ICN Biomedicals) с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина (Sigma), 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона, 20 мкг/мл ципрофлоксацина и 10 мМ никотинамида (Invitrogen). Затем островки использовали для проведения экспериментов. Кластеры ß-клеток получали путем диссоциации островков в среде, не содержащей ионов Са2+ и Mg2+ (Lernmark, 1974). Кроме того, в процессе исследования были использованы культуры ß-клеток инсулиномы мыши - MIN6, инсулиномы крысы - INS-1 832/13 и INS-1 832/2. Клетки линии MIN6 и INS-1 культивировались в средах DMEM и RPMI1640, соответственно. Все использованные реактивы были аналитической степени чистоты (марки ЧДА).

Методология исследования. Основной экспериментальный подход в данной работе заключался в моделировании диабетических условий при действии высоких концентраций глюкозы, цитокинов, siRNA, в использовании нокаутных мышей, глкжозочувствительных и глюкозонечувствительных культивируемых ß-клеток и в однократном введении стрептозотоцина мышам интраперитонеально (75 мг/кг).

Для измерения секреции инсулина в статических условиях в присутствии глюкозы, ингибиторов и стимуляторов секреции инсулина, островки Лангерганса и клональные ß-клетки инкубировались в буфере Кребса (114 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ КН2РО4, 1,16 мМ MgSOi, 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, 2,5 мМ СаСЬ, 25,5 мМ NaHC03,0,2% БСА, pH 7,2; Sharoyko et al., 2007). Для изучения секреции инсулина в динамических условиях ß-клетки в количестве 3-Ю6 помещались в 4 перфузионные камеры, через которые инфузировался буфер со скоростью 1 мл/мин. Пробы отбирались каждые 2 мин (Straub et al., 1996). Концентрация инсулина и общее содержание инсулина измерялось радиоиммунным (Coat-A-Count, Siemens) или иммуноферментным (Ultrasensitive Mercodia) методами с использованием крысиного или человеческого инсулина в качестве стандарта (Malmgren et al., 2009). Высвобождение арахидоновой кислоты в островках измерялось методом радиометрических индикаторов (Simonsson et al., 1998), с использованием островков преинкубированных с [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15-3Н]-арахидоновой кислотой (удельная активность 180-240 Ci/ммоль; PerkinElmer Life Sciences). Концентрация гликозилированного гемоглобина, фракция НЬА]С, в крови доноров определялась методом ионно-обменной хроматографии, используя Mono-S протокол (Jeppsson et al., 2002). Выделение митохондрий из ß-клеток проводилось методом

дифференциального центрифугирования (Rabilloud at al., 2008). Активности комплексов I, II, III, и IV цепи транспорта электронов в изолированных митохондриях регистрировали в присутствии субстратов НАДН/убихинонаь 2,6-дихлорфенолиндофенола/убихинона1, цитохрома С(Ш)/убихинола1 и цитохрома С(Н), соответственно (Birch-Machin et al., 2001). Активность АТФсинтазы определялась путем измерения количества фосфат-анионов, образовавшихся в результате обратной АТФазной реакции, используя набор реактивов фирмы Novus (Zeqiraj et al., 2009). Измерялись также некоторые параметры метаболизма в островках и ß-клетках. Скорость потребления кислорода ß-клетками регистрировалась на приборе Seahorse Extracellular Flux Analyzer XF24, оборудованном кислород-чувствительным флуоресцентным зондом (Malmgren et al., 2009). Скорость утилизации глюкозы измерялась методом радиометрических индикаторов по продукции 3НгО из [5-3Н]-глюкозы (удельная активность 19,63 Ci/ммоль; PerkinElmer Life Sciences; Hirose et al., 1996). Концентрация лактата измерялась энзимологическим методом в присутствии НАД+, 1-метокси-5-метилфетазин метилсульфата и тетранитротетразолиевого синего (Biovision). Активность цитратсинтазы регистрировалась с использованием в качестве индикаторной реакции превращение 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты в 5-тио-2-нитробензойную кислоту (Sigma). Концентрация и кинетика синтеза АТФ измерялась в нашей модификации люминометрическим методом с использованием люциферазы светляков (Malmgren et al., 2009). Концентрации NADPH и NADP+ измерялись энзимологическим методом с использованием циклической реакции с участием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и индикаторной реакции с участием глюконатдегидрогелазы (Passonneau and Lowry, 1993). Активность окислительного декарбоксилирования пиру вата измерялась спектрофотометрически при длине волны 450 нм в экстракте митохондрий ß-клеток с использованием иммобилизованных антител к пируватдегидрогеназе и индикаторной реакции с участием 1-метокси-5-метилфетазин метилсульфата и тетранитротетразолиевого синего (Mitosciences Inc.).

Молекулярно-биологическая часть работы проводилась с использованием методов генной инженерии, клонирования, бактериальной трансформации, изоляции нуклеиновых кислот (DNA/RNAeasy DNA/RNA purification kit; Qiagen), обратной транскрипции (RevertAid™ First-Strand cDNA synthesis kit; Fermentas), амплификации специфичных последовательностей методом полимеразной цепной реакции, секвенирование нуклеотидных последовательностей (набор реактивов от Applied Biosystems), ДНК-микрочипирования (TaqMan LDAs; Applied Biosystems) для анализа экспрессии генов, кодирующих ферменты метаболизма, ДНК-микрочипирования (Affymetrix Inc) для анализа глобальной экспрессии генов в островках человека. Генотипирование проводили, используя Affimetrix 500К микрочип или MALDI-TOF масс-спектрометрию. Содержание митохондриальной ДНК (мтДНК) измерялось методом ПЦР, используя соотношение числа копий ß-глобина (кодируется ядерной ДНК) к числу копий ND1 (кодируется мтДНК), primer-extension assay для определения активности TFB1M.

Бридинг мышей с Tß>lm осуществлялся путем скрещивания Tfblm с C57BL/6J мышами. Генерация мышей с полным нокаутом Tfolm в ß-клетках ф-Tjblm проводилась с использованием rip-cre-loxP системы.

Методы клеточной биологии включали трансфекцию плазмид (pRcCMVi.EGFP, pRcCMVi.Rhes, pB.rlnsl.EGFP, pB.rlnsl.Rhes-antisense, мутант pSRa-cAMP-GEFII (G114E, G422D) и мутант CMV-HA-Rim2AA (193-830) с использованием трансфекционного реагента LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), трансфекцию малых интерферирующих РНК -siPHK с использованием трансфекционного реагента DharmaFECT® 1 (Dharmacon), измерение активности каспаз-3, -8 (Oncoge) и -9 (R&D), апоптоза (TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling; TUNEL; Roche) и выживаемости (реагент - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбосиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2#-тетразолий; Promega) ß-клеток, обработанных смесью провоспалительных цитокинов ИЛ-lß (Calbiochem), ФНО-а (Sigma, Peprotech), ИФ-у (Life Technologies). Оптимизированные нами условия десенситизации

ответа островков Лангерганса к имидазолиновым соединениям и трансфекция плазмид использовалась как метод для изучения механизма действия имидазолиновых соединений. Концентрация ЫОг'-анионов в экспериментах по обработке островков цитокинами и/или имидазолиновыми соединениями определялась реагентом Гриса (Alexis Corporation). Конфокальная микроскопия проводилась на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS-NT (Leica Microsystems) и Carl Zeiss Laser Scanning System LSM 5 PASCAL (Carl Zeiss GmbH). PMPI и метиловый эфир тетраметилродамина использовались для измерения плазматического и митохондриального потенциалов, соответственно.

Протеомные исследования включали SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) использованием I2C614Ni Leu и l3C615Ni Leu, иммуноблоттинг с использованием moho- и поликлональных антител для идентификации белков: ND5, ND6, NDUFB8, SDHB, core2, V-a, СОХ1, АТРА, QCR2, Cytb (Mitosciences), фосфо-ЖК1/2, фосфо-р38, фосфо-ERK1/2 (Cell Signaling), PDK1, LDHA (Cell Signalling), HIF-la (R&D), TFB1M, ß-тубулин (Santa Cruz); 1-D и 2-D полиакриламидный гель-электрофорез и жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией (MALDI-trap, LS/MS/MS). Идентификация белков проводилась с помощью базы данных MASCOT MS/MS Ion Search. Фосфотрансферазная активность с субстратами GST-c-jun, GST-Elk-1 (Calbiochem), Hsp25 (Stressgen) проводилась в клеточных лизатах методом in vitro с использованием [у-32Р]АТР (3000 Ки/ммоль; Amersham). Концентрация общего белка измерялась бицинхониновым методом (Pierce).

Профиль низкомолекулярных метаболитов в ß-клетках измерялся на газовом хроматографе Agilent 689N (Agilent), соединенном с масс-спектрометром Leco Pegasus III TOFMS (Leco Corp.). Для анализа метаболиты экстрагировались смесью хлороформ/вода (1:1, об/об) с последующей дериватизацией метоксиамин гидрохлоридом в среде сухого пиридина (Fluka). Анализ первичных данных, идентификация пиков и нормирование, проводились с использованием внутренних стандартов, содержащих стабильный изотоп 1 С. Метаболиты идентифицировались по их масс-спеетрам и индексам удерживания, с использованием базы NIST или путем сопоставления их со стандартными соединениями.

Физиологические методы включали интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе, который выполнялся на мышах предварительно голодающих в течение 5 часов (Fex et al., 2007). Образцы крови получали у анестезированных мышей (мидазолам 0,4 мг/мышь, в комбинации с флуанизоном 0,9 мг/мышь и фентанилом 0,02 мг/мышь) ретроорбитально через 0, 10, 30, 60 и 120 минут после введения глюкозы (2 г/кг массы тела). Концентрации глюкозы и инсулина плазмы крови определялись с использованием наборов реагентов Infinity Glucose Oxidase Liquid Stable Reagent и Ultrasensitive Mercodia, соответственно.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Сравнение нескольких независимых выборок выполнялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Бонферони. В случае нормального распределения измерений величин результаты представлены как среднее ± доверительный интервал среднего для указанного числа экспериментов. В случае отклонения от нормального распределения измерений величин результаты представлены как медиана и интерквартильный размах - нижний 25%-ный и верхний 75%-ный интервалы (указаны в подписи к рисункам). Достоверность полученных результатов оценивали с использованием соответствующих статистических коэффициентов при уровне значимости тестируемой гипотезыр < 0,05. Метод главных компонент и дискриминационный анализ с регрессией на латентные структуры применялись для выявления различий в профиле метаболитов анализируемых образцов. Количественный анализ пептидов проводился с использованием программного обеспечения MaxQuant, опция "significant-outlier strategy". Вклад различных генотипов в риск развития СД2 определялся с помощью критерия "odds ratio" (OR).

РЕЗУЛЬТАТЫ

###

I 2.8 mM glucose 3 16,7 mM glucose

Ü && Lin

832/13 832/2

35 mM KCl + 250 mM diazoxide

###

**

Ii

Рис. 1. А. Секреция инсулина клональными Р-клетками, независимая и зависимая (КС1+ диазоксид) от активности КАТф-каналов, п=3.

**р<0,01, ***р<0,001 относительно 2,8 мМ глюкозы в клетках 832/13, **р<0,001 относительно 16,7 мМ глюкозы в клетках 832/13, ир<0,01, шр<0,01 относительно 2,8 мМ глюкозы в клетках 832/2, газр<0,01 относительно 16,7 мМ глюкозы в клетках 832/2. В. Утилизация глюкозы, п=7. **р<0,01,

***р<0,001 относительно 2,8 мМ глюкозы в клетках 832/13, ***р<0,001 относительно 16,7 мМ глюкозы в клетках 832/13. С. Продукция лактата, п=7.

1. Метаболизм глюкозы и его роль в секреции инсулина глюкозо-чувствительными и глюкозоне-чувствительными клональными В-клетками крысы и островками Лангерганса человека

На первом этапе исследования ß-клеток изучались те метаболические процессы, которые вовлечены в механизм регуляции глюкозостимулированной секреции инсулина. Предметом изучения были две клональные ß-клеточные линии INS-1, которые являются глкжозо-чувствительными (832/13; модель "здоровых" клеток) и

глюкозонечувствительными (832/2;

модель "диабетических" клеток), соответственно. Данные клоны были получены из одного родительского клона инсулиномы крысы INS-1.

Секреция инсулина. In vitro глюкозочувствительные клетки INS-1 832/13 секретировали инсулин в 11,9 раза больше (р<0,01) при высокой концентрации глюкозы (16,7 мМ), чем при низкой (2,8 мМ), а глюкозонечувствитель-ные клетки INS-1 832/2 не увеличивали секрецию инсулина при повышении концентрации глюкозы в инкубационной среде (рис. 1А). Следует отметить, что в условиях in vitro для ß-клеток 2,8 мМ концентрация глюкозы считается

оптимальной для поддержания базального уровня секреции инсулина, а 16,7 мМ -оптимальной для стимуляции секреции инсулина. Активация КАтр-независимого механизма в ß-клетках 832/13 приводила к увеличению базальной (при действии 2,8 мМ глюкозы) секреции инсулина в 9,6 раза (р<0,001). Добавление 16,7 мМ глюкозы при этих же условиях далее увеличивало секрецию инсулина в клетках 832/13. В клетках 832/2 активация КАтр-независисмого механизма приводила к увеличению базальной секреции инсулина в 4,2 раза (р<0,01), а добавление высокой концентрации глюкозы не приводило к дальнейшему увеличении секреции инсулина (рис. 1А). Смесь 35 мМ KCl и

250 мкМ диазоксида независимо от концентрации глюкозы в среде увеличивала секрецию инсулина в клетках 832/2 с «10 до »60 нг/мг белка/ч, что свидетельствует об интактности экзоцитотического аппарата при деполяризации плазматической мембраны.

Утилизация глюкозы. Интенсивность гликолиза оценивали по скорости продукции [3Н]ОН из В-[5-3Н]-глюкозы; одна молекула [3Н]ОН образуется при превращении 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват под действием енолазы. Примечательно, что базальная скорость утилизации 0-[5-3Н]-глюкозы (2,8 мМ глюкозы) в клетках 832/2 была а priori в 11,6 раза больше, чем в 832/13 (рис. 2В; р<0,001). Более того, в отличие от клеток 832/13, скорость утилизации глюкозы в клетках 832/2 при увеличении концентрации глюкозы в среде не возрастала. При 16,7 мМ глюкозы 832/13 клетки использовали в 3,8 раза больше глюкозы, чем при 2,8 мМ (рис. 1В). Высокая скорость гликолиза в 832/2 клетках, требующая регенерации НАД+ для поддержания гликолиза (то есть превращения глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бифосфоглицерат), сопровождается восстановлением пирувата в лактат, катализируемым лактатдегидрогеназой (ЛДГ).

Продукция лактата. Действительно, наблюдалось образование лактата, который высвобождался в инкубационную среду в клетках 832/2, но не детектировался в клетках 832/13 (рис. 1С). В клетках 832/2 продукция лактата отражает скорость утилизации глюкозы и, соответственно, активность анаэробного гликолиза в этих клетках.

Скорость потребления кислорода. Исследование скорости потребления кислорода показало её прогрессирующее нарастание в клетках 832/13 после добавления 16,7 мМ глюкозы по сравнению с базальной скоростью при 2,8 мМ глюкозы. Это свидетельствует об увеличении доступности субстратов, образовавшихся в ходе гликолиза, для цикла Кребса и стимуляции окислительного фосфорилирования (рис. 2А; р<0,05). С другой стороны, клетки 832/2 демонстрировали повышение базальной скорости клеточного дыхания в 1,6 раза по сравнению с клетками 832/13 (р<0,05), а увеличения скорости потребления кислорода не наблюдалось при повышении концентрации глюкозы до 16,7 мМ (рис. 2В).

Рис. 2. Скорость поглощения кислорода в (3-клетках А. 832/13, п=4. В. 832/2, n=4. *р<0,05. OCR -скорость потребления кислорода. FCCP - карбонил цианид-п-трифторметоксифенилгидразон.

Скорость продукции АТФ в митохондриях. АТФ - ключевой компонент в механизме секреции инсулина. Для оценки способности клеток 832/13 и 832/2 синтезировать АТФ была измерена скорость её митохондриальной продукции в пермебиализованных дигитонином клональных р-клетках в присутствии смеси глутамата и сукцината. При таких условиях не учитывается респираторные ограничения в виду лимитирующих концентраций субстратов. Оказалось, что скорость синтеза АТФ в глюкозочувствительных клетках 832/13 была в 2,5 раза выше, чем в глюкозонечувствительных клетках 832/2 (р<0,05).

Активность комплексов ЭТС. Для выяснения причины различий в скоростях митохондриальной продукции АТФ была измерена активность комплексов I, III и IV электронотранспортной системы в изолированных митохондриях. Снижение

10

респираторного ответа при повышении концентрации глюкозы в глюкозонечувствительных клетках 832/2 коррелировало со снижением активности исследованных комплексов в 2,7-, 3,0- и 2,9-раза по сравнению с глюкозочувствительными клетками 832/13 (р<0,05, р<0,001, р<0,01, соответственно).

Экспрессия субъединиц комплексов ЭТС. Для дальнейшего изучения нарушений работы митохондрий в глюкозонечувствительных клетках 832/2 был измерен уровень экспрессии некоторых субъединиц комплексов электронотранспортной системы в сравнении с клетками 832/13: кодируемые мтДНК ND6 (комплекс I) и СОХ I (комплекс IV) субъединицы, кодируемые яДНК Core 2 (комплекс III) и V-a (комплекс V) субъединицы. Экспрессия субъединиц ND6, Core 2, СОХ I и V-a в клетках 832/2 была в 3,4-, 1,4-, 2,5-, и 1,4-раза ниже, чем в клетках 832/13 (р<0,01, р<0,05, р<0,01, р<0,05, соответственно).

Анализ экспрессии генов энергетического метаболизма в ß-клетках. С целью выяснения причин пониженной секреции инсулина клетками 832/2 мы провели сравнительный анализ экспрессии мРНК генов, участвующих в энергетическом метаболизме клетки (гликолиз, цикл Кребса, электронотранспортная система) в клетках 832/13 и 832/2. Экспрессия 26 генов из 46 проанализированных различалась в клетках 832/13 и 832/2. Уровень мРНК 16 генов был снижен, а шести генов повышен в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13. Следует отметить значительное снижение экспрессии гена Slc2a2, кодирующего белок транспорта глюкозы GLUT2 и глюкозо-фосфорилирующего фермента с высокой константой Михаэлиса-Ментен (Кт) глюкокиназы. С другой стороны, ген фермента с низкой Кт - гексокиназа I - экспрессировался в клетках 832/2 и не детектировался в клетках 832/13. Также ген фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ-А) экспрессировался в клоне 832/2, но не был детектирован в клетках 832/13. Таким образом, было выявлено, что отсутствие глюкозостимулированной секреции инсулина в клетках 832/2 коррелировало с увеличением экспрессии генов гликолиза и снижением экспрессии генов, участвующих в функционировании митохондрий. В научной литературе отмечается, что при моделировании СД2 у крыс в островках Лангерганса повышался уровень экспрессии ЛДГ-А, гексокиназы I и снижался уровень экспрессии транспортера глюкозы GLUT2, глюкокиназы, что сопровождалось снижением продукции АТФ и глюкозостимулированной секреции инсулина (Jonas et al., 1999; Laybutt, et al., 2002). Далее мы попытались ответить на вопрос: "происходят ли подобные изменения в профиле экспрессии генов в островках Лангерганса человека, обнаруженные в глюкозонечувствительных клональных ß-клетках"?

Взаимосвязь_экспрессии_генов

энергетического метаболизма в островках Лангерганса здоровых людей с уровнем гликозилированного гемоглобина. Был проведен корреляционный анализ экспрессии некоторых генов, участвующих в энергетическом метаболизме островков Лангерганса человека с уровнем HbAic (гликозилированный гемоглобин) плазмы крови. Уровень HbAic — отражает гипергликемию, имевшую место на протяжении периода жизни эритроцитов; широко используется в клинической практике. Нами была установлена отрицательная корреляция между уровнем HbAic плазмы крови и величиной

глюкозостимулированной секрецией инсулина (отношение секреции инсулина при 16,7 мМ глюкозы к секреции при 2,8 мМ глюкозы) островков Лангерганса в условиях in vitro (г =-0,64; р <0,01; п=23). В островках Ланрегранса

Рис. 3. Метаболиты цикла Кребса в |3-клетках 832/13 и 832/2, п=20. ■ - 832/13, 2,8 мМ глюкозы; □ - 832/13, 16,7 мМ глюкозы; И - 832/2, 2,8 мМ глюкозы; Ш -832/2, 16,7 мМ глюкозы.

человека уровень экспрессии генов 51с2а2 (транспортер глюкозы), декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (г=—0,59; р<0,01) и митохондриальной глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (г =-0,48; р <0,05) отрицательно коррелировали с уровнем НЬА^ (г=-0,63, р<0,01) и был также снижен в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13. Уровень экспрессии генов, таких, как гексокиназы I (г=0,40, р<0,05) триозофосфат изомеразы-1 (г=0,43, р<0,05) и ЛДГ-А (г=0,64, р<0,01) положительно коррелировали с показателем НЬА]Си был повышен в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13. Таким образом, установлен сходный характер экспрессии генов ферментов гликолиза и митохондриального метаболизма, а также снижение инсулиносекреторного ответа в глюкозонечувствительных клональных Р-клетках и островках Лангерганса доноров с более высоким уровнем НЬА1С.

Метаболомикс. На следующем этапе был проведен анализ метаболитов (метаболомикс) в р-клетках. Метод газовой хроматографии в комбинации с масс-спектрометрией (ГХ/МС) является информативным и более чувствительным инструментом для одновременной детекции большого числа метаболитов в одном анализируемом образце по сравнению с измерением концентрации каждого метаболита в отдельности классическими этимологическими методами. Наиболее интересным представляется сравнение профиля метаболитов клеток, секретирующих инсулин при повышении концентрации глюкозы (832/13), и клеток, не отвечающих на стимуляцию глюкозой (832/2). При сравнении этих клеток было детектировано 164 низкомолекуляриых метаболита, из которых было идентифицировано 44. Бьии найдены существенные отличия в профиле метаболитов; в частности промежуточных и конечных стадий гликолиза и цикла Кребса (рис. 3). Концентрации метаболитов цикла Кребса (цитрат, аконитат, а-кетоглутарат, сукцинат, фумарат и мапат) в клетках 832/13 увеличивались с повышением концентрации глюкозы в среде; обратный эффект наблюдался в клетках 832/2. Как упоминалось выше, в клетках 832/2 снижена экспрессия глюкокиназы и экспрессируется гексокиназа I, фермент с низкой Кщ, вследствие чего концентрация глюкозо-6-фосфата повышена в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13 при базальной концентрации глюкозы в среде. Из данных анализа метаболитов видно, что гликолиз в клетках 832/2 нарушен между стадиями, катализируемыми фосфоглицераткиназой, фосфоглицератмутазой,

фосфопируватгидратазой и пируваткиназой. При увеличении концентрации глюкозы в инкубационной среде возрастания уровня метаболитов не происходило, т.е. можно предположить, что активность вышеуказанных ферментов максимальна уже при базальной концентрации глюкозы. Следствием этого является недостаточный перенос цитозольных метаболитов (малата и глицерол 3-фосфата) в митохондрии клеток 832/2, что подтверждается снижением экспрессии переносчиков этих метаболитов -митохондриальных малатдегидрогеназы и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы. Ситуацию также усугубляет увеличение продукции лактата. Эти наблюдения согласуются со значительно сниженной экспрессией пируваткарбоксилазы (в 3,5±0,4 раза; р<0,001) в глюкозонечувствительных клетках 832/2 и более низкой скоростью пируватного цикла (Ьи е1 а1., 2002). Метаболомикс также показал активацию полиольного шунта в глюкозонечувствительных клетках 832/2. Для проверки факта нарушения входа метаболитов гликолиза в митохондрии в глюкозонечувствительных клетках 832/2 была измерена скорость потребления кислорода и секреция инсулина в ответ на действие субстратов, которые метаболизируются в гликолизе (на примере глюкозы) или минуют стадию гликолиза и их метаболизм происходит непосредственно в цикле Кребса (на примере лейцина и глутамина). Лейцин и глутамин увеличивали скорость потребления кислорода и секрецию инсулина, что указывает на функционально активные митохондрии в Р-клетках 832/2, тогда как введение глюкозы не влияло на эти параметры. Эти наблюдения свидетельствуют о недостаточной эффективности сопряжения гликолиза и митохондриального метаболизма в Р-клетках линии 832/2, которое и приводит к их неспособности усиливать секрецию инсулина в ответ на повышение концентрации глюкозы.

Таким образом, необходимым условием глюкозостимулированной секреции инсулина ¡5-клстками является синтез АТФ в их митохондриях. В совокупности наши данные показывают, что в глкжозонечувствительных клетках 832/2 митохондрии не повреждены, но синтез АТФ в них лимитирован вследствие снижения притока восстановительных эквивалентов для дыхательной цепи. Снижение притока субстратов для дыхательной цепи вызвано нарушениями утилизации глюкозы и функционирования челночных систем. Использование субстратов, отличных от глюкозы, нормализует инсулиносекреторную функцию клеток 832/2 за счет активации митохондриального дыхания и образования АТФ.

Стабилизация HIF-lg. В совокупности, вышеописанные наблюдения и тот факт, что исследуемые клональные р-клетки являются инсулиномами, т.е. имеют опухолевое происхождение, позволяют предположить участие в вышеупомянутых процессах

транскрипционного фактора-1а, индуцируемого гипоксией (HlF-la). Стабилизация (т.е. ингибирование протеосомалъной деградации) HIF-la, приводящая к 832/13 832/2 активации его транскрипционной активности,

обеспечивает переключение клеточного метаболизма в Рис. 4. Иммуноблотгинг HIF-la в зависимость от анаэробного гликолиза и, клональных В-клетках 832/13 и „ „_ D

832/2 п~2 соответственно, повышение продукции лактата. В

данном случае имеет место так называемый эффект Варбурга (Warburg, 1956), присущий опухолевым клеткам. Для проверки этой возможности был проведен иммуноблотгинг белка HIF-la. В глкжозонечувствительных клетках р-клетках 832/2 происходит стабилизация HIF-la путем дегидроксилирования его остатков пролина (рис. 4), который активирует экспрессию генов гликолиза и подавляет экспрессию PDK1, контролирующей вход пирувата в цикл Кребса. В то время как в р-клетках 832/13 стабилизация HIF-la практически не происходит (рис. 4). Из литературных данных известно, что отношение концентраций a-кетоглутарата к сукцинату контролирует стабилизацию HIF-la (Mole et al., 2003; MacKenzie et al., 2007). При [a-кетоглутарат]/[сукцинат] >1 (в клетках 832/13) HIF-la гидроксилируется пролилгидроксилазой и подвергается протеосомалъной деградации с участием белка фон Хиппель-Линдау (VHL); при [а-кетоглутарат]/[сукцинат]<1 (в клетках 832/2) пролилгидроксилаза ингибируется избытком сукцината, тем самым HIF-la стабилизируется и транслоцируется в ядро клетки. В ядре HIF-la образует димер с ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) и связывается с промоторной областью генов-мишеней и транскрипционным коактиватором рЗОО, необходимым для запуска транскрипции генов, кодирующих ферменты гликолиза (Carroll et al., 2005).

При ингибировании ЛДГ-А, экспрессия которой контролируется HIF-la, оксаматом натрия (500мкМ) в р-клетках 832/2 происходило частичное восстановление секреции инсулина, стимулированное глюкозой, с 18,7±4,8 (контроль) до 38,2±2,6 (оксамат натрия) (нг инсулина)/(мг белка/час) (р<0,05, п=3). В норме при стимуляции глюкозой Р-клетки 832/13 секретировали 102,1±15,4 (нг инсулина)/(мг белка/час). Вероятно, это вызвано увеличением концентрации пирувата и его последующим метаболизмом в митохондриях.

Результаты сравнительного анализа глюкозочувствительных и

глкжозонечувствительных р-клеток обобщены в виде схемы, представленной на рис. 5. Различие в ответе на стимуляцию глюкозой в близкородственных клонах 832/13 и 832/2 позволяет их использовать в качестве модели нормальных и диабетических р-клеток. Изучение различий между такими клетками дает возможность получить информацию о молекуярных механизмах регуляции секреции инсулина р-клетками при моделировании нормальных и патологических условий. Существенным недостатком разработанной модели является канцероподобный фенотип изученных линий р-клеток, поэтому они не могут быть использованы для исследования механизмов апоптоза и пролиферации р-клеток в условиях in vitro.

Глюкоза Глюкоза

832/13 832/2

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая метаболические и сигнальные пути в глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2) р-клетках.

УНЬ-белок фон Хиппель-Линдау; [а-КС]/[8ис]-соотношение концентраций а-кетоглутарата и сукцината; К+АТФ-АТФ-чувствительные калиевые каналы; Са2+-потенциалзависимые кальциевые каналы Ь-типа.

2. Изменение профиля метаболитов и роль пентозофосфатного цикла в контроле секреции инсулина при стимуляции глюкозой клонапьных в-клеток 832/13 и островков Лангерганса человека

Секреция инсулина тесно сопряжена с динамическими изменениями метаболизма в р-клетках. Метаболическая регуляция секреции инсулина является сложным процессом, вовлекающим гликолиз, цикл Кребса, метаболизм аминокислот и жирных кислот и (Prentki et al., 1992). В данной части работы нами было проведено комплексное исследование профиля метаболитов в Р-клетках 832/13 в комбинации с динамическим анализом секреции инсулина в ходе стимуляции Р-клеток глюкозой.

Перфузия В-клеток. Перфузия р-клеток проводилась в присутствии 2,8 мМ глюкозы, затем на 12 минуте уровень глюкозы был повышен до 16,7 мМ. Пик секреции инсулина наблюдался через ~12 мин (рис. 6) после повышения концентрации глюкозы до 16,7 мМ в перфузионной камере. Таким образом, были определены временные рамки (0-15 мин после добавления 16,7 мМ глюкозы) для более детального динамического анализа метаболизма,

контролирующего глюкозостимулированную

секрецию инсулина в р-клетках 832/13 in vitro.

Митохондриальное дыхание. Исходя из полученных результатов, для секреции инсулина важен уровень митохондриального дыхания. Действительно, через 15 мин после повышения концентрации глюкозы (с 2,8 до 16,7 мМ) наблюдалось повышение дыхания на 30% по сравнению с базальным уровнем (р<0,001).

Метаболомикс. Метаболомный анализ показал, что значительные изменения профиля метаболитов происходят в первые 15 минут после стимуляции Р-клеток глюкозой (16,7

12000 -I

аг с 10000 ■

с о 1 8000 ■

о О) .а Е 6000 ■

(Л го

с .с 4000 •

"5 D)

(Л с 3 2000 -

0 -

} мМ глюкозы

16,7 мМ глюкозы

Mi

Hi

О 10 20 30 40 Time (min)

Рис. 6. Секреция инсулина в ходе перфузии клональных ß-клеток 832/13, п=7.

мм) и этот промежуток времени практически совпадает с пиком секреции инсулина. Методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии было обнаружено 195 метаболитов, из них 61 был идентифицирован. На рис. 7 А представлен score plot, показывающий кластеризацию метаболитов через 0, 3, 6, 10 и 15 мин от начала стимуляции Р-клеток глюкозой (Y-вектор показывает время от начала стимуляции), а на рис. 7В - loading plot, демонстрирующий снижение концентрации длинноцепочечных жирных кислот и аминокислот и повышение концентрации интермедиатов гликолиза и цикла Кребса.

(А)

Рис. 7. A. Score plo!, показывающий кластеризацию метаболитов через 0 (А), 3( А), 6(A), 10( ) и 15( ) мин от начала стимуляции Р-клеток глюкозой. В. Loading plot, демонстрирующий снижение уровня длинноцепочечных жирных кислот и аминокислот и повышение уровня интермедиатов гликолиза и цикла Кребса в клетках 832/13.

» NADPH/(NADPH+NADP+)

J

4

I Ribose 5-phosphate

Рис. 8. Изменения концентрации рибозо-5-фосфата и соотношения концентраций [ЫАОРН]/([ЫАРОН]+[ЫАОН+]) в ходе стимуляции клонапьных р-клеток 832/13 глюкозой (¡6.7мМ). п=4.

Особого внимания заслуживает идентификация метаболита пентозофосфатного цикла - рибозо 5-фосфата. Концентрация рибозо 5-фосфата достигает максимума через 6 мин после стимуляции р-клеток глюкозой (увеличивается в 2,5 раза по сравнению с базальным уровнем; р<0,001) и возвращается к исходному уровню на 15 мин (рис. 8). В связи с этим, можно предположить, что пентозофосфатный цикл участвует в амплифицирующем механизме секреции инсулина путем синтеза ИАОРН, который известен как сопрягающий фактор в механизме секреции инсулина (КетЬоШе е1 а1., 2009). Интересно, что изменение концентрации рибозо 5-фосфата имело тот же параболический характер, что и соотношение [ЫАОРН]/( [НАРОН]+[КАБН+], которое увеличивается в 8 раз по сравнению с базальным уровнем (р<0,001; рис. 8). Причем изменение концентрации других идентифицированных метаболитов не имело такой параболической формы.

Из данных литературы известно, что активность пентозофосфатного цикла в р-клетках ингибируется через 30 мин от начала стимуляции р-клеток глюкозой в результате увеличения [ИАОРН] в реакции, катализируемой декарбоксилирующей малатдегидрогеназой (БЬиН е1 а1., 1997). В связи с этим, роль пентозофосфатного цикла в секреции инсулина отрицалась (ЗсЬиЦ е1 а1., 1997). В других исследованиях было установлено, что подавление активности цикла Кребса в р-клетках сопровождается увеличением скорости пентозофосфатного цикла (МасЭопаЮ, 1993). Тем не менее,

совокупность этих фактов доказывает ключевую роль NADPH во взаиморегуляции митохондриального метаболизма и пентозофосфатного цикла в р-клетках.

В пентозофосфатном цикле NADPH является продуктом реакций, катализируемых глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и 6-фосфоглюконатдегидрогеназой. При использовании ингибитора глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - дегидроэпиандростерона (100 мкМ) -наблюдалось подавление глюкозостимулированной секреции инсулина р-клетками 832/13 на »20% (t=15 мин; п=4). Подобный эффект наблюдался при проведении эксперимента с островками Лангерганса человека, где глюкозостимулированная секреция инсулина при действии дегидроэпиандростерона ингибировалась на ^30% (t=15 мин; п=4). Максимумы концентраций рибозо 5-фосфага и NADPH предшествовали пику секреции инсулина, что свидетельствует о важной роли пентозофосфатного цикла в ранней фазе секреции инсулина.

3. Пролонгированный эффект повышенной концентрации глюкозы и ФНО-а на клональные В-клетки 832/13

Известно, что при СД2 наблюдается гипергликемия и повышение в крови концентраций ФНО-а (Майоров, 2007). Для выяснения механизмов действия глюкозы и ФНО-а в повышенных концентрациях на Р-клетки, мы провели моделирование условий, имитирующих СД2, т.е. присутствие 16,7 мМ глюкозы или 25 иг/мл ФНО-а в культуральной среде, где находятся р-клетки 832/13. После инкубации р-клеток в присутствии глюкозы или ФНО-а наблюдалось снижение глюкозостимулированной секреции инсулина на ~75 и ~50%, соответственно. Интересно отметить, что после воздействия глюкозы и ФНО-а на Р-клетки, культуральная среда приобретала желтоватый оттенок в результате накопления лактата. Действительно, концентрация лактата возрастала с 5,0±0,05 нмоль/(мг белка/24 ч) в контроле до 44,55±3,4 мкмоль/(мг белка/24 ч) в присутствии 16,7 мМ глюкозы и 52,65±4,02 мкмоль/(мг белка/24 ч) в присутствии 25 нг/мл ФНО-а. Вероятно, повышение активности ЛДГ-А вызвано повышением экспрессии этого фермента. Более того, активность пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) снижалась в 2,9±0,6 раза после инкубации р-клеток с 16,7 мМ глюкозы и 2,3±0,4 раза после инкубации с 25 нг/мл ФНО-а, соответственно. Из данных литературы известно, что увеличение экспрессии ЛДГ-А и PDK1 (ингибирует ПДК путем фосфорилирования) контролируется транскрипционным фактором HIF-la (Semenza et al., 1994). В предыдущем разделе было показано, что в Р-клетках 832/13 HIF-la практически не детектируется, поэтому транскрипционно неактивен (рис. 4). Эти наблюдения позволили предположить, что при действии на р-клетки глюкозы и ФНО-a в повышенных концентрациях происходит стабилизация HIF-la, запускающая транскрипцию его генов-мишеней. Методом иммуноблоттинга, регистрировалась стабилизация HIF-la в присутствии глюкозы или ФНО-a. Полученные результаты позволили выявить HIF-la - важнейших молекулярный компонент, участвующий в развитии инсулиносекреторной дисфункции р-клеток. HIF-la стабилизируется при эпизодах гипергликемии и/или при действии ФНО-a. Это состояние можно назвать псевдогипоксия или химическая гипоксия под действием глюкозы или ФНО-а. Данные факты еще раз демонстрируют необходимость строгого контроля уровня глюкозы в крови у больных СД2, а также роль повышенного уровня ФНО-a не только в развитии инсулинорезистентности при СД2 (Hotamisligil et. al., 1999), но и инсулиносекреторной дисфункции р-клеток. Примечательно, что характер экспрессии некоторых мРНК клональных р-клеток 832/13, инкубированных в присутствии глюкозы в повышенной концентрации, совпадает с таковым для островков Лангерганса контрольной группы и с СД2. В островках Лангерганса человека уровень экспрессии некоторых генов-мишеней HIF-la: ЛДГ-А, гексокиназы 2, фосфофруктокиназы ВЗ - был достоверно выше в группе с СД2 по сравнению с контрольной группой (рис. 9).

4. Подавление экспрессии РРК1 и активность лируватдегидрогеназы в клональных В-клетках 832/13

Рис. 9. Экспрессия мРНК генов-мишеней Н1Р-1а в островках Лангерганса контрольной группы, п=55 и больных СД2, п=9. *р<0,05, **р<0,01, и-критерий Манна-Уитни. Медианы

экспрессия мРНК, прямоугольники интерквартильные интервалы (25-75%), отрезки - минимальные и максимальные значения.

Более детальному исследованию мы подвергли одну из мишеней для НПМа -РЭК1. При воздействии глюкозы в повышенной концентрации на р-клетки повышалась экспрессия гена рс1к 1 и его белкового продукта РЭК1, Можно предположить, что увеличение экспрессии РОК1, сопровождающееся снижением глюкозостимулированной секреции

инсулина, происходит при длительных эпизодах гипергликемии. Действительно, РЭК1, фос^орилируя субъединицу Е1а по

11

stPOKI

üi

остатку Эег^, ингибирует активность ПДК. а значит метаболизм пирувата, что в конечном итоге подавляет секрецию инсулина. Роль РБК1 в

глюкозостимулированной секреции была исследована с использованием малых интерферирующих РНК - з1РНК. Трансфекция з1РБК1 приводила к 80% уменьшению экспрессии мРНК РОК1 (рис. 10А) и к уменьшению экспрессии РЭК1 на 40 % на уровне белка (рис. 10В). Соответственно, активность ПДК повышалась (рис. 1 ОС).

Секреция инсулина после подавления экспрессии РРК1. Выключение Р1Ж1 не влияло на базальную секрецию инсулина, но увеличивало глюкозостимулированную секрецию в 5 раз по сравнению с базальным уровнем секреции (рис. 11). При этом секреция инсулина, стимулированная лейцином и диметилсукцинатом, веществами, которые метаболизируются в митохондрии без участия ПДК, не различалась в контрольных и 51РОК1 клетках (рис. 11).

Профиль метаболитов. В клетках, трансфецированных з1РОК1, методом ГХ/МС было выявлено повышение уровня интермедиатов цикла Кребса - малата, фумарата и а-кетоглутарата, а также глицерол 3-фосфата. При этом в р-клетках, трансфецированных 51РЭК1, уровень Р-гидроксибутирата был ниже, чем в контроле. Подобный результат можно

интерпретировать как возрастание синтеза цитрата при конденсации ацетил-КоА, который синтезируется в реакциях ПДК, и оксалоацетата. В результате уровень ацетил-КоА, как предшественника р-гидроксибутирата, уменьшается. Наблюдая повышения концентраций интермедиатов цикла Кребса можно предположить, что активность цикла Кребса увеличивается в результате частичного выключения РЭК1. Повышение концентрации

i

PDK1 I ¡Mubutin Í, Л . »- POK1

¡olilán

siNC sIPDKI

Рис. 10. Выключение PDK1 в клональных р-клетках 832/13. А. Экспрессия мРНК PDK1. В. Иммуноблоггинг PDK1. С. Активность ПДК, n=4. **р<0,01, ***р<0,001, HPRT гипоксантингуанинфосфорибозил-трансфераза (housekeeping gene).

глицерол 3-фосфата, субстрата для глицерофосфатного переносчика, вызывает увеличение

потока восстановительных эквивалентов для окислительного фосфорилирования.

Скорость потребления кислорода. Измерение скорости потребления Сь показало, что интактные (5-клетки 832/13 увеличивают потребление СЬ в среднем до 7,33±0,13 нмоль Ог /мин/мг белка при стимуляции глюкозой, по сравнению с базальной концентрацией глюкозы (5,03±0,10 нмоль Ог /мин/мг белка). В трансфецированных клетках скорость потребления Ог возрастала до 8,08±0,30 нмоль Ог/мин/мг белка (р<0,05; п=5). Полученные данные можно обобщить в виде схемы представленной на рис. 12.

Рис. 12. Схема, иллюстрирующая метаболические изменения, приводящие к повышению секреции инсулина при выключении РОК1 в (З-клетках. РОК1-киназа 1 пируватдегидрогеназы; ПДК-пируватдегидрогеназный комплекс; ЕТС-электронотранспортная система; ОКСФОС-окислительное фосфорилирование.

Подавление экспрессии PDK1 снижает фосфорилирование сайта 3 (остаток Ser232) субъединицы Е1а ПДК, тем самым повышая активность ПДК, способствует увеличению входа ацетил-КоА в цикл Кребса, накоплению восстановительных эквивалентов НАДН и ФАДНг и, как следствие, увеличение скорости окислительного фосфорилирования и дыхания. Результатом перечисленных событий является повышение митохондриальной продукции АТФ, необходимой для секреции инсулина.

5. Фактор трансляции митохондрии В1 в островках Лангерганса человека и мышей и клональных (В-клетках 832/13 и его роль в патогенезе СД2

Недавно было показано, что TFB1M играет ведущую роль в трансляционном контроле митохондриальных белков, в особенности белков электронотранспортной системы, обладая диметилтрансферазной активностью (Metodiev et al., 2009). В свете важной роли митохондриальной продукции АТФ митохондриями в метаболическом гомеостазе мы проанализировали, ассоциируются ли полиморфизмы генов системы окислительного фосфорилирования, транскрипционного и трансляционного аппарата мтДНК с дисфункцией р-клеток и развитием СД2? С этой целью мы изучили базу данных геном-ассоциированных исследований (a genome-wide association study; GWAS), the Diabetes Genetics Initiative (DGI) (Saxena et ai., 2007). Нами был идентифицирован полиморфизм rs950994 гена Tfbltn, кодирующего фактор трансляции митохондрии Bl - TFBIM (рис. 13А). TFB1M является митохондриальной 8-аденозилметионин-6-Ы,Н-аденозил(рРНК)диметилтрансферазой-1, диметилирующей два консервативных соседних аденина на З'-конце 12S рРНК; играет важную роль в процессе трансляции в митохондрии. Ковалентная модификация (метилирование) 12S рРНК необходима для поддержания

Рис. 11. Секреция инсулина клонапьными |}-клетками 832/13 (белые столбцы -в^Контроль, черные столбцы - 81РОК1), п=8-15. **р<0,01. относительно 16.7 мМ глюкозы в контроле.

Гликолиз Пирувлт

РОК1|_» ПДК|—«>СН,СОКоА цикла KpeqgjH^ I

НАДН^ФДДН;

Дь1*.1НиГ_ЕТС"оК?ЬоС

Сопряжение стимулов -и сскрсции

Complet IINDUFB8) Complex I (N01) Compte* I (NDfi) Complex III (ÛCR2) Complex IV 1C0X1) ATP synthase ÍATPA) ¡•-Tubulin

целостности малой митохондриальной рнбосомной субъединицы и ее функциональной активности (Metodicv et al., 2009). Нами было установлено, что полиморфизм rs950994 гена Tfblm ассоциируется со сниженной секрецией инсулина в ответ на действие глюкозы, повышением уровнем глюкозы в ходе теста толерантности к глюкозе, повышенным риском развития СД2 (OR = 1,12 (р=0,002) и сниженной экспрессией TFB1M в островках Лангерганса поджелудочной железы человека на уровне мРНК (рис. 13В) и белка (рис. 13С), соответственно. TFB1M контролирует трансляцию 13 субъединиц цепи транспорта электронов и АТФ-синтазы митохондрий, а также 2 гРНК и 22 tPHK, кодируемых мтДНК (Scarpuüa et al., 2008). Как видно из рис. 13Е, уровень экспрессии субъединиц цепи транспорта электронов ND1 и ND5 (комплекс I), кодируемых мтДНК, был снижен (рис. 13Е); их трансляция контролируется TFB1M. Присутствие риск-аллеля А вместо G в

rs950994 нарушает несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов в

Ъ-i-j-м-1-t-я' интроне 2 гена Tfblm, которые

предположительно могут влиять на экспрессию TFB1M. Эти результаты показывают, что снижение экспрессии TFB1M на уровне мРНК и белка в человеческих островках

ассоциируется со значительным снижением экспрессии других белков комплекса I, кодируемых мтДНК. При потере или снижении экспрессии субъединицы ND1 происходит нарушение процесса модульной сборки комплекса I, поскольку ND1 играет решающую роль именно на ранних стадиях формирования молекулярного ансамбля комплекса I (Cardol et al., 2002; Chomyn, 2001; Perales-Clemente et al.). Далее мы продолжили исследование на мышах, гетерозиготных по Tfblm (рис. 14А) с целью моделирования ситуации, наблюдаемой в человеческом организме. На Tfblm*'' мышах был проведен интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе (IPGTT) для исследования толерантности к глюкозе и секреции инсулина in vivo. Как видно из рис. 14В, уровень глюкозы плазмы бьш выше у Tfblm*' мышей после введения глюкозы (16,1 ±0,7 против 18,7±0,7 мМ глюкозы, t= 10 мин, р<0,05; 16,5+1,1

Рис. 13. TFB1M в островках Лангерганса человека. А. Карта гена Tfblm человека. В. Экспрессия мРНК TFB1M, носители А-аллеля, п=24; носители G/G, п=26. *р<0,05, U-критерий Манна-Уитни. Медианы -экспрессия мРНК, прямоугольники - интер-квартильные интервалы (25-75%), отрезки минимальные и максимальные значения. С. Иммуноблоттинг TFBIM, n=4. D. Иммуноблоггинг белков электронотранспортной системы, n=4. Е. Денситометрический анализ экспрессии белков электронотранспортной системы, п=4. *р<0,01 относительно G/G.

против 19,5±0,8 мМ глюкозы, t=30 min, р<0,05; 14,2+0,6 против 16,2+0,6 мМ глюкозы, t=60 min, р<0,05; 1754+65 усл.ед. против 1984+70 усл. ед, площадь под кривой (glCAuc), р<0,05). При этом секреция инсулина была в группе Tfblm*'' мышей практически не отличалась от секреции в группе Tfblm* * мышей (рис. 14С). Вместе с тем, когда общая секреция инсулина (insAuc-площадь под кривой) в течение глюкозной нагрузки была поделена на участки возрастания глюкозы

19

^сдис-площадь под кривой), было обнаружено, что инсулина недостаточно для компенсации возросшего уровня глюкозы у Т/Ыт*'~ мышей (44,5+3,0 против 32,5+4,1, р<0,05; рис. 140).

Эти данные свидетельствуют о том, что дефицит ТБВШ ассоциируется с инсулинорезистентностью и интолерантностью к глюкозе у Т/Ытмышей. Если бы у Т/Ыт*'~ мышей была бы необходимая секреторная емкость островков Лангерганса, то они бы могли эффективно компенсировать инсулинорезистентность путем повышения секреции инсулина. Для более детального ответа на вопрос, вызваны ли эти нарушения дисфункцией островков, мы выделили островки из генетически модифицированных мышей. Было обнаружено, что секреция инсулина в ответ на действие глюкозы снижается в островках Т)Ъ1т+,~ мышей (1,36+0,19 против 0,87±0,14 нг инсулина/островок/ч, р<0,05; рис. 14Е).

Tfblm Tfblm

2.8 mM Gfc !6.7mMGIc ЮтМа-KIC

ТГЫт Tfblm

Tfblm Ttblm

Рис. 14. TFB1M в островках Лангерганса мышей C57BL/6J. А. Иммуноблоттинг экспрессии белка TFB1M, п=4. В. Глюкоза плазмы и С. Уровень инсулина плазмы у Tfblmv+ (n=10) and Tjblm*'' (n=ll) мышей в ходе интраперитонеального теста толерантности к глюкозе. D. Соотношение площадей под кривой для инсулина и глюкозы. Е. Секреция инсулина в ходе статической инкубации островков, n=4. F. Денситометрический анализ экспрессии ND5, n=4. G. Продукция АТФ митохондриями, п=6. *р<0,01, **р<0,001 относительно Tfblm .

Более того, секреция инсулина при действии а-кетоизокапроновой кислоты (а-К1С), вещества, которое непосредственно стимулирует митохондрии, также была снижена (2,28+0,32 против 1,07+0,13 нг инсулина/островок/ч, р<0,01; рис. 14Е). Эти данные позволяют предположить, что снижение секреции инсулина в островках TJblm+~ мышей вызвано нарушением функции митохондрий. Для подтверждения этого факта, был измерен уровень экспрессии в островках субъединицы комплекса 1, ND5, которая кодируется мтДНК и поэтому ее биосинтез контролируется TFB1M. Иммуноблотгинг-анализ показал, что уровень ND5 был ниже в митохондриях Tfblm*' мышей (рис. 14F). Была также измерена кинетика продукции АТФ, конечного продукта митохондриального метаболизма, который контролирует секрецию инсулина, закрывая АТФ-чувствительные К+-каналы.

Действительно, скорость продукции АТФ в изолированных пермеабилизованных островках в ответ на действие митохондриапьных метаболических субстратов (глутамата и сукцината) была снижена в островках Tfblm+/" мышей по сравнению с контролем Т/Ыт** (34,1±2,5 против 25,4±0,9 пмоль АТФ/мин/островок, р<0,05; рис. 14G). Нами была также использована модель мышей с кондиционным нокаутом Т/Ыт в р-клетках ф-Т/Ыт ( /")). В первые 1,5-3,5 месяца жизни нокаутные и контрольные мыши имеют одинаковый базальный уровень глюкозы, однако, в ходе исследования толерантности к глюкозе у нокаутных мышей была выявлена интолерантность к глюкозе, которая значительно выше, чем у мышей, гетерозиготных по Т/Ыт. В возрасте 4-х месяцев у этих животных наблюдалась гипергликемия, уровень глюкозы плазмы крови был у контрольных 8,3±0,3 мМ (¡Í-Tfblm <Ч )) и трансгенных мышей19,6±1,9 мМ (fi-TJblm соответственно (р<0,001).

Для моделирования ситуации в островках Лангерганса человека и мышей мы провели выключение TFB1M в глюкозочувствительных р-клетках 832/13, используя siPHK. Это позволило нам выявить механизмы, при которых снижение TFB1M вызывает нарушение функции митохондрий и секрецию инсулина. Аналогично с островками человека и мыши, дефицит TFB1M в р-клетках приводил к подавлению глюкозостимулированной секреции инсулина (181,5+5,5 против 110,0±5,2 нг/мг белка/час, р<0,001). Также наблюдалось существенное снижение секреции инсулина в ответ на действие а-К1С (116,0+9,3 против 55,0±5,2 нг/мг белка /час, р<0,001). Экспрессии субъединиц комплекса I - ND5 и NDUFB8, комплекса III - Cyt b и комплекса IV - СОХ1 были значительно снижены в клетках с дефицитом TFB1M. Негативная роль дефицита TFB1M также сказывалась на снижении активности комплексов I, III и IV электронотранспортной системы. Активность комплекса I была наиболее снижена при выключении TFB1M (3,98±0,26 против 1,73+0,15 мкмоль/мин/мг белка, р<0,001). Это сопровождалось уменьшением скорости потребления кислорода и синтеза АТФ. Потеря кодируемой мтДНК субъединицы ND5 и кодируемой яДНК субъединицы NDUFB8 комплекса I в р-клетках в результате дефицита TFB1M объясняется нарушением модульной сборки комплекса I. Из литературных данных известно, что сборка комплекса I контролируется именно субъединицами, кодируемыми мтДНК, которые выполняют ключевую роль в формировании молекулярного ансамбля комплекса I (Cardol et al., 2002; Chomyn, 2001; Perales-Clemente et al., 2010). Метаболомный анализ р-клеток, трансфецированных siTFBlM также выявил накопление метаболитов гликолиза и лактата. Это согласуется с предыдущими результатами о накоплении лактата в глюкозонечувствительных Р-клетках. Вышеприведенные результаты можно представить в виде модели, описывающей роль TFB1M в патогенезе СД2 (рис. 15).

Рис. 15. Схема,

иллюстрирующая роль

TFB1M в развитии СД2. TFB1 М-фактор трансляции митохондрии В1; ОКФОС-окислительное фосфорилирование.

6. Эффект имидазолинового соединения В1-11282 на секрецию инсулина островками Лангерганса крыс Вистар и клональными В-клетками !\Ш6 и механизм его инсулинотропной активности

Следующая глава раздела "Результаты" посвящена изучению механизмов инсулинотропной активности имидазолиновых соединений. Этот класс соединений, с одной стороны, является перспективным с точки зрения разработки новых препаратов для лечения СД2, с другой, - инструментом для изучения в Р-клетках сигнальных путей, участвующих в

секреции инсулина. Производные сульфонилмочевины широко применяются для лечения СД2. Механизм их действия заключается в блокировании субъединицы SURI АТФ-чувствительных К+-каналов, которое приводит к их закрытию и деполяризации мембран ß-клеток. Это вызывает открытие Са2+-каналов и быстрое поступление ионов Са2+ внутрь клеток, стимулируя тем самым секрецию инсулина. Побочным эффектом производных сульфонилмочевины могут быть эпизоды гипогликемии, поскольку эти производные способны потенцировать секрецию инсулина и при нормальной концентрации глюкозы в крови из-за высокой аффиности сульфонилмочевины к субъединице К+-канала SURI. В связи с этим представляет интерес новое имидазолиновое производное 5-хлор-3-(4,5-дигидро-1Н-имидазол-2-ил)-2-метилиндол (ВЫ 1282), которое, в отличие от производных сульфонилмочевины, потенцирует секрецию инсулина только при повышенной концентрации глюкозы, и следовательно, минимизирует риск развития гипогликемии. Следует отметить, что, в отличие от других имидазолинов, BL11282 не взаимодействует с 0.2-адренорецепторами, поэтому не влияет на уровень артериального давления.

Эффект BL11282 на секрецию инсулина. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе эффекта BL11282 на секрецию инсулина, осложняется отсутствием селективного антагониста этого соединения. Поэтому, создание экспериментальных условий, при которых BL11282 не обладает инсулинотропной активностью и сопоставление их с условиями, при которых BL11282 стимулирует секрецию инсулина, может пролить свет на возможный механизм действия BL11282. В данном исследовании был использован подход, включающий десенситизацию ß-клеток к инсулиностимулирующему действию BL11282 после 18-24 ч инкубации с этим же соединением (рис. 16). Например, был проведен сравнительный анализ десенситизационных эффектов двух имидазолиновых соединений BL11282 и эфароксана (2-[2-(2-этил-2,3-дигидробензофуранил)]-2-имидазол гидрохлорид). Эфароксан является имидазолиновым соединением первого поколения (Efendic et al., 2002), который стимулирует секрецию инсулина в островках по двум

механизмам: по Кдтр-зависимому, блокируя субъединицу Kir6.2 КАтр канала (Jonas et al., 1992) и, как позже было показано, по Кдтр-независимому механизму, влияя на дистальные компоненты экзоцитотического аппарата (Chan et al., 2001). Результаты наших исследований показали, что BL11282 и эфароксан десенситизируют островки по альтернативным путям и стимулируют секрецию инсулина по различным К-Атр-независимым механизмам.

Протеомный анализ островков Лангерганса после пролонгированного воздействия BL11282. Анализ секреции инсулина показал, что после инкубации островков в течение 18-24 ч с BL11282 наблюдалалось увеличение секреции инсулина при стимуляции этих островков глюкозой по сравнению с островками, инкубированными без BL11282 (рис. 16). Это увеличение глюкозостимулированной секреции инсулина, позволяет предположить, что BL11282-индуцированная десенситизация не приводит к истощению секретируемых запасов инсулина. Островки Лангерганса крыс Вистар, преинкубированные с BL11282, были в состоянии секретировать больше инсулина даже при действии других агентов, стимулирующих секрецию инсулина, как это было установлено нами на примере глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1). В наших экспериментах было показано, что в отличие от BL11282, предварительная инкубация

ДШ 16,7 mM glucose + 50 jiM BL11282

Рис. 16. Эффект пролонгированной инкубации островков Лангерганса крыс Вистар с ВЫ 1282 на глюкозо-и В|_1 1282-стимулированную

секрецию инсулина, п=4. *"р<0,001 и по сравнению с 3,3 мМ глюкозы; "р<0,05 и шр<0,001 по сравнению с 16.7 мМ глюкозы.

островков с эфароксаном даже имеет тенденцию к уменьшению секреторного ответа при добавлении глюкозы. Для ответа на вопрос, почему островки, предварительно инкубированные с BL11282, становятся более чувствительными к последующему

воздействию стимулирующей

концентрации глюкозы, мы провели их протеомный анализ. Увеличение глюкозостимулированной секреции

инсулина после длительной инкубации с BL11282 можно объяснить изменением в экспрессии ряда белков. Нами было проведено сравнение белкового спектра методом 20-полиакриламидного гель-электрофореза контрольных островков и островков, инкубированных с BL11282.

Рис. 17. Пример 2Б-гель электофореза лизатов островков Лангерганса крыс Вистар (п=6). Белки, уровень экспрессии которых повышен после обработки BL11282 обозначены окружностью, уровень которых снижен - квадратом. Обе группы приведены в Таблице 1.

Разделение и идентификация пептидов после воздействия трипсина на белки проводилась методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Изображения гелей анализировались с помощью

программного обеспечения PDQuest ТМ. В среднем на каждом геле было обнаружено около 600 индивидуальных белков, из них 53 имели различный уровень экспрессии: 30 имели повышенный уровень экспрессии (более чем в 1,5 раза) в островках, инкубированных с BL11282, и 23 имели пониженный уровень экспрессии. Из них 22 белка было идентифицировано (рис. 17, таблица 1). Из этих белков три, участвующие в фолдинге белков, имели повышенный уровень экспрессии в островках, обработанных BL11282: Hsp60 (рис. 17, пятна 6 и 7), calreticulin (рис. 17, пятно 5) и протеин дисульфид изомераза (пятна 2 и 3). Идентифицированы четыре Са2+-связывающих белка: кальциклин (рис. 17, пятно 14), аннексии 1 (рис. 17, пятно 11), кальретикулин (рис. 17, пятно 5) и кальциззарин (рис. 17, пятно 4). Данные белки участвуют в секреции инсулина. Также было обнаружено повышение уровня ферментов, контролирующих метаболизм глюкозы: пируват киназа (рис. 16, пятно 9), а-енолаза (пятно 8), изоцитратдегидрогеназа (рис. 17, пятно 16), транскетолаза (рис. 16, пятно 15). Белки внутриклеточной сигнализации: RhoA (рис. 17, пятно 19) и ингибитор 1 протеин киназы С (РКС; рис. 17, пятно 21).

Мишени воздействия BL11282. В данном разделе работы была изучена роль ранее известных мишеней для имидазолинов (КАтр-каналы, cb-adreno- и Ii-имидазолиновые рецепторы, мономерный G-белок Rhes) в секреции инсулина, стимулированной BL11282. Инсулинотропные свойства имидазолинового соединения BL11282 не связаны с активацией КАтр-каналов (Efanov et al., 2001). Для дополнительной проверки этого факта, была использована модель мышей с удаленной SURI субъединицей КАтр-каналов (Shiota et al., 2002). Удаление субъединицы SURI блокирует трансформацию комплекса с субъединицей Kir6.2 в функционально активный К -канал и транспорт его из эндоплазматического ретикулума (Zerangue et al., 1999, Seghers et al., 2000). Нами было установлено, что BL11282 увеличивал секрецию инсулина в островках контрольных NMRI и SUR1{',") нокаутных

Г . .-»-MSÍ

%

Mw

<kDá)

»«

. , .. Л • •

• * i

tíM

Sí?!

мышей по сравнению с островками ЫМШ и мышей, инкубированными в

присутствии 16,7 мМ глюкозы (рис. 18). Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что инсулинотропный эффект ВЫ 1282 не опосредуется через его воздействие на Кдтр-каналы.

Таблица 1. Эффект ВЫ 1282*' на экспрессию некоторых белков в островках Лангерганса крыс Вистар____

Пятно BL11282/ контроль Белок Accession number Расчетные Mw/pl LC MS/MS сикненс

1 1.84 Гликопротеин GC1QBP 035796 23596/4.39 204-216

2 2.75 Протеин дисульфид изомераза Р04785 54983/4.77 455-463,427-438

3 2.47 Протеин дисульфид изомераза Р04785 54983/4.77 319-328,378-387

4 2.27 Кальциззарин (Calgizzarin; S100 кальций-связывающий белок All) Q6B345 11065/5.60 32-47

5 2.61 Кальрстикулин (Calreticulin) Р18418 46348/4.33 112-120,74-80

6 2.13 Белок теплового шока 60 (Hsp60) Р63039 57926/5.35 345-352,406-417

7 1.68 Белок теплового шока 60 (Hsp60) Р63039 57926/5.35 143-156, 293-101

8 1.77 а-енолаза Р04764 46997/6.16 71-79,412-419,406-412

9 1.61 Пируват киназа М1/М2 PI 1980 57687/6.69 106-114,141-150

10 1.62 Глицинамидинотрансфераза Р50442 44183/6.15 370-381,190-194

11 1.83 Аннексии А1 Р07150 38698/7.13 113-123,166-176

12 1.66 Глутамат дегидрогеназа 1 Р10860 55948/6.71 536-545, 163-171, 192200,172-183,152-162

13 1.46 Глутамат дегидрогеназа 1 Р10860 55948/6.71 536-545, 192-200, 172183,152-162

14 1.72 Кальциклин (Calcyclin) Р05964 10035/5.30 2-17

15 238 Транскстолаза Р50137 67644/7.22 472-493,187-204

15 2.38 Гетерогенный ядерный рибо-нуклеопротеин Q (hnRNP-Q) Q7TP47 59711/8.86 82-94

16 1.72 3-Кетоацил-КоА тиолаза PI 3437 41871/8.09 26-38, 159-171

16 1.72 Изоцитратдегидрогеназа P56574 50967/8.88 51-67, 250-260, 362-374

Б 17 0.65 Кератин тип 2, кератин цитоскелста тип 8 Q10758 53854/5.82 252-263, 264-272, 285294,316-324, 372-380

18 0.61 Ретинолсвязываюший белок P02696 15703/5.11 69-80

19 0.66 Трансформирующий белок RhoA P61589 21443/5.83 85-98

20 0.58 Протеосомная субъединица р тип 3 P40112 22965/6.15 71-77

20 0.58 40S Рибосомальный белок SA P38983 32693/4.80 120-127, 89-101

21 0.50 Ингибитор протеин киназы С 1 P62959 13660/6.65 7-20, 30-36

22 0.62 Протеосомная субъединица а тин 6 P60901 27399/6.35 31^13

' Белки, уровень экспрессии которых увеличен (А) или снижен (Б). Локализация белков на 2D-icjic представлена на рис. 17. Молекулярный вес (Mw) и изоэлсктрические точки (pi) даны в таблице и соответствуют исходному белку. Номера в колонке LC MS/MS сиквенс показывают стартовые и конечные позиции сиквснсов идентифицированных пептидов, соответствующих исходному белку.

Антагонизм (ъ-адрснорецепторов является одним из механизмов действия соединения фентоламина, относящегося к классу имидазолинов (Robertson et al., 1973, Efendic et al., 1975). Для выяснения, обладает ли BL11282 аг-адренергической активностью, использовался съ-адренергический антагонист иохимбин (метиловый эфир 16а-карбокси-17а-гидроксииохимбана). Было показано, что иохимбин в комбинации с BL11282 не влияли на секрецию инсулина, что свидетельствует об отсутствии у BL11282 оь-адренергической активности. Некоторые имидазолины могут взаимодействовать с Ii-имидазолиновыми рецепторами, активируя фосфатидитхолин-специфическую. фосфолипазу С (PC-PLC;

Separovic et a!., 1997). Это наблюдение основывалось на том, что моксонидин, селективный агонист 1]-имидазолиновых рецепторов, увеличивал концентрацию диацилглицерола и фосфохолина в нейронах и РС12 клетках (Separovic et al., 1996), a D609 (трициклодекан-9-ил ксантат), ингибитор PC-PLC, блокировал эффект моксонидина и, соответственно, повышал концентрацию диациглицерола (Separovic et al., 1996). Для проверки, задействует ли BL11282 сигнальный путь, связанный с активацией li-имидазолиновых рецепторов и PC-PLC, был использован селективный антагонист AGN192403 (2-эндо-амино-З-едго-изопропилбицикло[2.2.1]-гептан гидрохлорид; Munk et al., 1996) и ингибитор PC-PLC — D609 (Efanov et al., 2001). Полученные результаты показали, что ингибирование Ii-рецептора с помощью AGN192403 и фермента PC-PLC с помощью D609 не влияет на секрецию инсулина, стимулированную BLI 1282. Полученные данные не подтвердили роль Ir рецептор/PC-PLC сигнального пути в эффекте BL11282 на секрецию инсулина.

Ранее сообщалось, что Rhes G-белок, .striatum, является белком

JCL

**

#

I

3J тМ glucn.se 16.7 тМ £ Inen.« 10 цЛ1 BL11282

Рис. 18. BL1 1282 потенцирует глюкозо-стимулированную секрецию инсулина в островках Лангерганса контрольных мышей NMRI (черные столбцы) и SURI*"'"1 мышей (белые столбцы), п=3. "р<0,01 и р<0,001 по сравнению с NMRI при 3,3 мМ глюкозы; *р<0,05 и #*р<0,01 по сравнению с NMR1 при 16,7 мМ глюкозы,&р<0,05 по сравнению с SURI'"'"1 при 16,7 мМ глюкозы.

мономерный G-белок

(гуанидинсвязывающий находящийся в corpus гомолог белка Ras) имидазолин-регулируемым (Chan et al., 2002) и вовлечен в Кдтр-канал независимый путь секреции инсулина имидазолиновым

производным эфароксаном. Для проверки гипотезы, вовлечен ли белок Rhes в регуляцию секреции инсулина другим имидазолиновым соединением — BL11282, было проведено измерение уровня экспрессии мРНК Rhes после воздействия BL11282, трансфекция ß-клеток плазмидами, кодирующими Rhes и antiRhes и секреции инсулина. При этом не было обнаружено изменений уровня экспрессии мРНК Rhes в островках, инкубированных с BL11282, а также трансфекция плазмид с Rhes и antiRhes не влияла на BL11282-стимулированную секрецию инсулина. Таким образом, полученные результаты не подтвердили предположение, что Rhes является имидазолин-регулируемым белком и не соответствуют предположению, что белок Rhes отвечает за экзоцитоз инсулина в присутствии BL11282.

BL11282 и сигнальный путь глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1). Имидазолиновое соединение BL11282 было синтезировано с целью имитации глюкозозависимого инсулинотропного действия пептида ГПП-1. Поэтому на данном этапе работы мы, используя метод десенситизации ответа островков к BL11282, выяснили, имеют ли эти два соединения сходный механизм действия. цАМФ играет ключевую роль в механизме глюкозозависимой инсулинотропной активности ГПП-1. ГПП-1 является пептидом, который взаимодействуя с G-белок связанным с рецептором, активирует Gs-аденилатциклаза-цАМФ сигнальный путь (Gromada et al., 1998. MacDonald et al., 2002). Это приводит к накоплению цАМФ и, как следствие, к активации РКА и uAM®-GEFII-Rim2-зависимых сигнальных путей, вовлеченных в экзоцитоз инсулина (Seino et al., 2005, Doyle et al., 2007). Поэтому было важным проверить, пересекаются ли сигнальные пути известного пептида ГПП-1 и BL11282? Десенситизация островков к BL11282 не снижала способность ГПП-1 потенцировать глюкозостимулированную секрецию инсулина при условиях, когда пептид добавлялся в отсутствии или присутствии BL11282. При этом десенситизация островков к BL11282 уменьшала в два раза эффект потенцирования

глюкозостимулированной секреции инсулина в присутствии ГПП-1. Это значит, что В1Л1282 задействует внтутриклеточный путь передачи сигнала пептидом ГПП-1 и пролонгированная инкубация с имидазолином приводит к снижению активности этого сигнального пути. Экспрессия мутантных белков цАМР-ОЕШ (0114Е, 04220) и Шт2ДА в Р-клетках М1Ы6 приводила к снижению секреции инсулина в присутствии ВИ1282 на -22% и = 42%, соответственно, по сравнению с контролем (трансфекция рСМУ-ЕСГР).

ВЫ 1282 и сигнальный путь арахидоновой кислоты. Бьшо показано, что ВЫ 1282 стимулирует экзоцитоз инсулина через сигнальные пути, не сопровождающиеся увеличением внутриклеточной концентрации - [Са21 (ЕГапоу е1 а1., 2001). Также есть сообщения о том, что арахидоновая кислота и ее метаболиты вовлечены в механизм регуляции секреции инсулина в р-клетках, который активируется без увеличения [Са2+], (Ыо\уа1гке е1 а1., 1998). Эти пути включают как саму арахидоновую кислоту, так и ее биологически активные метаболиты - эпоксиэйкозотриеновые кислоты, генерируемые цитохромом Р450 (ЫеесПетап й а1., 1986, Jones с1: а1., 1993). В островках арахидоновая кислота высвобождается из мембранных фосфолипидов при активации фосфолипазы Аг (РЬА2; СЬакгаЬогП е1 а1., 2003, ВаГчтёе е1 а1., 2002). Применяя фармакологические ингибиторы, был изучен сигнальный путь арахидоновой кислоты в эффекте ВЫ 1282 на секрецию инсулина. Для изучения эффекта ВЫ 1282 на секрецию инсулина, была исследована роль [Са2^.-независимой изоформы РЬАзр, которая экспрессируется в островках и участвует в процессе секреции инсулина Р-клетками (КатапасЗЬат й а1., 2003). Нами было установлено снижение уровня экспрессии ¡РЬАгр в островках диабетических крыс Гото-Какизаки в сравнении с островками контрольных крыс Вистар, что согласуется с данными о снижении инсулинового ответа в островках крыс Гото-Какизаки (ЕГапоу е1 а1., 2002). Поэтому данный факт свидетельствует об участии ¡РЬАгР в процессе секреции инсулина и снижение ее экспрессии может быть одной из причин снижения секреции инсулина при СД. Используя специфический ингибитор РЬАгР, ВЕЬ (бромоеноллактон), было показано, что ВЕЬ ингибирует ВЫ 1282-стимулированную секрецию инсулина при нормальных и деполяризованных условиях, т.е. когда [Са2+]( постоянна. Таким образом, генерация арахидоновой кислоты через активацию ¡РЬАг является одним из механизмов инсулинотропного действия ВЫ 1282. Действительно, нами было показано, что ВЫ 1282 стимулировал высвобождение [3Н]-арахидоновой кислоты в островках в присутствии глюкозы и этот эффект полностью блокировался ВЕЬ.

Цитохром Р450, генерирующий эпоксиэйкозатриеновые кислоты, вовлечен в механизм глюкозостимулированной секреции инсулина (Ра1ск е1: а1., 1983). Нами было оценено влияние ингибитора цитохрома Р450 МВ-1-АВТ (метилбензил-1-аминобензотриазол; Ра1ск й а1., 1983) на секрецию инсулина в присутствии глюкозы и ВЫ 1282. Инкубация с МВ-1-АВТ частично снижала глюкозоиндуцированную секрецию инсулина. Кроме того, ингибитор полностью блокировал имидазолин-потенцированную секрецию инсулина в присутствии глюкозы. Наши данные указывают на то, что метаболизм арахидоновой кислоты через цитохром Р450, приводящий к образованию эпоксиэйкозатриеновых кислот, участвует в механизме глюкозостимулированной секреции инсулина ВЫ 1282. Полученные результаты свидетельствуют о том, что потенцирование глюкозостимулированной секреции инсулина при действии ВЫ 1282, независимо от изменений [Са включает стадии высвобождения арахидоновой кислоты при участии ¡РЬАг и её превращение в эпоксиэйкозатриеновые кислоты при участии цитохрома Р450. Результаты исследования молекулярных механизмов инсулинотропной активности ВЫ 1282 обобщены на рис. 19.

7. Эффект экстракта из слоевищ лишайника рода С/ае/оп/а на секрецию инсулина

Лишайник рода СЫота давно применяется в традиционной медицине; известны его антиоксидантные, антимикробные и детоксикационные свойства. В состав С1ас1ота входят

широким спектр соединении, такие как амино-Р-поли- и -олигосахариды, усниновые, орселиновые, леканоровые, гирофоровые и хиастовые кислоты, гидроксинафтохиноны гидроксиантрахиноновые и другие ароматические пигменты, депсидоны, антранорины, полиненасыщенные жирные кислоты и т.д. (Телятьев, 1987).

Рис. 19. Схема, иллюстрирующая метаболические и сигнальные пути, вовлеченные в механизм инсулинотропной активности имидазолинового соединения BL11282 в Р-клетках.

Kir6.2 и SURl-субъеденицы АТФ-чувствительных К* каналов; сь-адренорецепторы второго типа; Ii-имидазолиновые рецепторы 1 типа; Rhes, мономерный G-белок, гомолог Ras; АС-аденилат цнклаза; GLP-1 R-рецептор для глюкагоноподобного пептида 1; GEFÍI, сАМФ-рсгулируемыГг фактор обмена гуаниновых нуклеотидов типа И; К™2-молекула, взаимодействующая с белком Rab3; ¡РЬА^-Са^-кальций независимая фосфолипаза А2; PL-фосфолипиды; LPL-лизофосфолипиды; АА-арахидоновая кислота; ЕЕА-эпоксиэйкозатреновые кислоты; Р450-цитохром Р-450.

Нами были изучена способность водноспиртового экстракта (этанол: вода=1:1, об/об) Cladonia улучшать инсулиносекреторную функцию Р-клеток. В эксперименте клональные р-клетки 832/13 культивировались в стандартной среде RPMI1640 в присутствии экстракта (разведение 1:100) в течение 1-30 дней. После инкубации клональных р-клеток с экстрактом измерялась секреция инсулина в присутствии 16,7 мМ глюкозы, которая увеличивалась с 120,2±5,9 нг/ч/мг белка (контроль) до 230,1±15,6 нг/ч/мг белка (экстракт). При этом отмечалось повышение общего уровня АТФ в клональных р-клетках, инкубированных с экстрактом, в ходе 1 ч стимуляции с 16,7 мМ глюкозы (111,3±5,4 и 149,3±7,5 нмоль/ч/мг белка, соответственно; р<0,01). Общее содержание АТФ в присутствии 40 мкМ FCCP и 4 мкг/мл олигомицина не отличалось в контрольных Р-клетках и р-клетках, культивированных с экстрактом (25,9±2,0 и 23,8±1,9 нмоль/ч/мг белка, соответственно). Это свидетельствует о том, что разница в содержании АТФ обусловлена повышением митохондриальной продукции АТФ в клональных Р-клетках 832/13, культивированных с экстрактом.

8. Снижение цитотоксического действия провоспалительных цитокинов на В-клетки островков Лангерганса мышей

Воздействие цитокинов и/или RX871024 на [i-клетки. Ранее было установлено, что имидазолиновое соединение RX871024 снижает ИЛ-1р-стимулированную активацию ¡NOS (NO-синтаза) и соответственно ИЛ-1 p-индуцированный апоптоз р-клеток (Zaitsev et al., 2001). Поэтому в данном исследовании было изучено, предотвращают ли имидазолиновые соединения RX871024 и эфароксан гибель р-клеток островков Лангерганса мышей в

условиях, моделирующих воспаление при СД1, т.е. в присутствии комбинации провоспалительных цитокинов ИЛ-1(5, ФНО-а и ИФ-у? Последнее является более близким аналогом условий in vivo, чем присутствие только одного ИЛ-1(3. Имидазолиновое соединение RX871024 потенцирует глюкозостимулированную секрецию инсулина и не обладают аг-адренергической активностью (Zaitsev et al., 1999).

Проведенные эксперименты показали, что имидазолиновое соединение RX871024 не модулирует цитокин-индуцированную гибель (3-клеток. Было установлено, что RX871024 ингибирует продукцию N0 в островках и Р-клетках в присутствии цитокинов; данный эффект сопровождался снижением фосфорилирования митогенактивированной протеинкиназы р38. В совокупности, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что комбинация провоспалительных цитокинов ИЛ-ip, ФНО-а и ИФ-у, т.е. условия, имеющие место при развитии СД1, индуцируют NO-независимую гибель р-клеток, и данный процесс происходит независимо от присутствия имидазолиновых соединений (рис. 20), т.е. последние не влияют на цитокин-стимулированную гибель Р-клеток.

SOCS-1 в механизме повышения устойчивости р-клеток к воспалению. На примере трансгенных мышей мы изучили эффект увеличения экспрессии супрессора цитокинового сигналлинга 1 (SOCS-1) на гибель Р-клеток в присутствии смеси провоспалительных цитокинов ИЛ-1р, ФНО-а и ИФ-у. Было установлено, что повышение экспрессии SOCS-1 не воздействует на продукцию N0 и глюкозостимулированную секрецию инсулина в присутствии смеси ИЛ-ip, ФНО-а и ИФ-у. Тем не менее, SOCS-1 снижал активность каспаз-3, -8 и -9, что сопровождалось ингибированием апоптоза р-клеток. Полученные результаты позволяют предположить, что увеличение экспрессии SOCS-1 не достаточно для снижения биологической активности ИФ-у в р-клетках и существует другой путь передачи сигнала, не зависимый от JAK/STAT сигнального пути (рис. 21).

имидазолинового

RX871024.

iNO-синтаза-индуцибельная N0-синтаза.

Рис. 20. Схема, иллюстрирующая механизм снижения цитокин-индуцированной продукции N0 в (3-клетках в присутствии

клетках

соединения

инсдан

№кВ - ядерный фактор транскрипции кВ; 50С81 - супрессор цитокинового пути передачи сигнала; 8ТАТ1 переносчик сигнала и активатор транскрипции.

Рис. 21. Схема, иллюстрирующая механизм снижения цитокин-индуцированного апоптоза р-клеток в островках Лангерганса ЭОСЭ-1 трансгенных мышей.

JAK - тирозинкиназа Янус-симейства;

Инсулин

9. Белок GAS6 и его рецептор AXL: экспрессия и механизм действия в клональных В-клетках 832/13 и в островках Лангерганса человека

Белок GAS6 известен как активатор роста гладкомышечных клеток, в англоязычной литераторе он называется как "growth arrest-specific protein 6". GAS6 принадлежит к группе витамин К-зависимых у-карбоксилированных белков. GAS6 является лигандом для рецептора AXL, принадлежащим к семейству рецепторов класса тирозинкиназ. На примере других типов клеток было показано, что система GAS6/AXL участвует в процессах воспаления, иммунного ответа, апоптоза, клеточного деления и продукции цитокинов. Однако ранее не сообщалось о GAS6 или его рецепторе AXL в островках поджелудочной железы. Учитывая широкий спектр вышеперечисленных процессов, в которые вовлечена система GAS6/AXL, является перспективным изучение ее роли в островках Лангерганса поджелудочной железы.

Экспрессия GAS6/AXL. Используя различные методы детекции (ПЦР, иммуноблотгинг и иммуноцитохимия) нами была обнаружена экспрессия белка GAS6 (75 кД) и его рецептора AXL (140 кД) в островках Лангерганса человека, крысы и мыши, а также в клональных (3-клетках 832/13. На рис. 22 приведен пример детекции GAS6 и AXL методом иммуноблоттинга в клетках 832/13 и островках Лангерганса человека.

СА86-индуцированная передача сигнала в В-клетках. Добавление экзогенного GAS6 к клональным (3-клеткам 832/13 приводило к активации аутофосфорилирования рецептора AXL (через 5, 30 и 60 мин), которое измерялось методом иммуноблоттинга, используя антитела к pY779 (рис. 23А). ОА86-индуцированное аутофосфорилирование AXL снижалось в присутствии избытка растворимой формы рецептора AXL (рис. 23А). Полученные данные доказывают наличие функционально активного рецептора AXL в р-клетках.

GAS6 76 kD

Рис. 22. Иммуноблотгинг белка GAS6 и его рецептора AXL (hrGASö - человеческий рекомбинантный белок GAS6, позитивный контроль; AXL-ED - экстрацеллюлярный домен, растворимая форма рецептора AXL). А. Экспрессия белка GAS6 в ß-клетках 832/13. В. Экспрессия рецептора AXL в островках Лангерганса человека.

Одним из возможных путей передачи сигнала в результате аутофосфорилирования AXI является активация сигнального пути Р13-киназа/Ак1. Используя фосфосеринспецифические антитела к Akt (pS473), было обнаружено фосфорилирование Akt, которое блокировалось в присутствии вортманина (рис. 23В). Для выявления фосфорилирования других белков при стимуляции ß-клеток GAS6 был выполнен протеомный анализ. Анализ фосфорилирования белков по остатку тирозина показал наличие 23 модифицированных белков. Методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического секвенирования пептидов было доказано фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и глюкозо-регулируемого белка 78 (GRP78/BiP). Из результатов, полученных другими авторами, известно, что GAPDH,

являясь ключевым гликолитическим ферментом, при его ковалентной модификации (фосфорилирование, нитрование, окисление) может также проявлять другие свойства, например, транскрипционного фактора, регулятора апоптоза, участвовать в слиянии клеточных мембран и т.д. (ТаИоп е1 а!., 2000; ТлБсЫе й а!., 2001).

АХ1_ [рУ779]

В.

Ак1/РКВ[рЗ'173]

Рис. 23. вАБб индуцирует сигнальный путь в (5-клетках 832/13 через АХЬ/Р13-киназу/Ак1/РКВ

A. Аутофосфорилирование рецептора АХЬ в присутствии 400 нг/мл ОА56. Присутствие растворимой формы 400 мкг/мл АХЬ снижает аутофосфорилирование рецептора АХЬ.

B. Фосфорилирование Акг/РКВ. Добавление 100 нМ вортманина (ингибитор Р13-киназы) блокирует САБв-стимулированное фосфорилирование Ак1/РКВ.

Фосфорилирование АХЬ/Р13-киназы/Ак1 предшествует фосфорилированию остатков тирозина белков БАРОН и 011Р78/В1Р и является одним из направлений ответа р-клеток при стимуляции их ОАЭб.

Эффект СА86/АХЬ на В-клстки. Для выяснения участия САЭб/АХЬ в секреции инсулина в р-клетках было проведено частичное подавление экспрессии рецептора АХЬ с использованием 81РНК. Нокаутирование рецептора АХЬ вызывало частичное ингибирование глюкозостимулированной секреции инсулина в р-клетках (рис. 24).

А.

1

Рис. 24. Роль рецептора АХЬ в глюкозостимулированной секреции инсулина в р-клетках 832/13.

A. Экспрессия рецептора АХЬ ^¡АХЬ 60 нМ), п=3. *р<0,05 по сравнению с контролем.

B. Глюкозостимулированная секреция инсулина, п=3. *р<0,05, **р<0,01 по сравнению с контролем.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На модели клональных р-клеток, чувствительных и нечувствительных к глюкозе показано, что в глюкозочувствительных Р-клетках секрецию инсулина обеспечивает тесное сопряжение гликолиза и митохондриального метаболизма пирувата. Это сопряжение проявляется в усилении митохондриального дыхания и ограничении гликолиза и продукции лактата. Установлен сходный характер экспрессии генов ферментов гликолиза и митохондриального метаболизма в клональных р-клетках и островках Лангерганса человека. При этом повышение уровня глюкозы крови может нарушать координированную экспрессию генов гликолиза и митохондриального метаболизма в островках Лангерганса человека, которая необходима для глюкозостимулированной секреции инсулина.

2. Установлено, что пролонгированное действие глюкозы и фактора некроза опухоли-а в повышенных концентрациях на р-клетки вызывает стабилизацию индуцированного гипоксией транскрипционного фактора-1а. Это подавляет глюкозостимулированную

секрецию инсулина и открывает возможность целенаправленно ингибировать стабилизацию индуцированного гипоксией транскрипционного фактор-1а в [¡-клетках для поддержания их инсулиносекреторной функции при сахарном диабете 2 типа.

3. Показано, что концентрация ЫАЭРН достигает максимума через 6 мин после начала стимуляции р-клеток глюкозой и предшествует пику секреции инсулина. Так как ЫАОРН, генерируемый в пентозофосфатном цикле, является необходимым сопрягающим фактором в амплифицирующем механизме секреции инсулина Р-клетками, это позволило пересмотреть роль пентозофосфатного цикла в Р-клетках, участие которого в механизме секреции инсулина ранее недооценивалось.

4. Установлено, что вариант полиморфизма гена фактора трансляции митохондрии В1 «950994 (О—>А) ассоциируется со снижением его экспрессии в р-клетках островков Лангерганса человека. Это приводит к ограничению трансляции субъединиц системы окислительного фосфорилирования и уменьшению продукции АТФ, что является одной из причин снижения секреции инсулина и увеличения риска развития сахарного диабета 2 типа. На основании этого анализ полиморфизма гена 1/Ыт рекомендован к внедрению в клиническую практику для выявления предрасположенности к развитию сахарного диабета 2 типа.

5. Изучен механизм инсулинотропной активности нового имидазолинового соединения ВЫ 1282. Установлено, что инсулинотропная активность ВЫ 1282 не опосредована его влиянием на АТФ-чувствителные К+-каналы, белок Мее, аг-адрено- и имидазолиновые 1]-рецепторы. Предложен механизм инсулинотропного действия ВЫ 1282 через цАМФ-зависимый сигнальный путь и комплекс ОЕРН-Шш2 и сигнальный путь арахидоновой кислоты, активируемый кальцийнезависимой фосфолипазой А; и ее последующий метаболизм цитохромом Р450 до эпоксиэйкозатриеновый кислоты. Также показано, что пролонгированное воздействие ВЬ И 282 на р-клетки увеличивает их чувствительность к последующей стимуляции глюкозой, что сопровождается повышением экспрессии белков, участвующих в фолдинге, связывании ионов Са2+, метаболизме и снижением уровня экспрессии ингибитора протеин киназы С. Полученная информация о сигнальных путях инсулинотропного действия ВЫ 1282, которые активируются только при повышении концентрации глюкозы, позволяет разрабатывать принципиально новые препараты глюкозозависимого действия для лечения сахарного диабета 2 типа.

6. При моделировании воспаления при сахарном диабете 1 типа показано, что цитотоксическое действие комбинации провоспалительных цитокинов ИЛ-1Р, ФНО-а и ИФ-у на р-клетки островков Лангерганса частично снижается при действии имидазолинового соединения 11X871024 или повышении экспрессии супрессора цитокинового пути передачи сигнала-1 в р-клетках. При этом 11X871024 или повышенная экспрессия супрессора цитокинового пути передачи сигнала-1 не предотвращали цитокин-индуцированное подавление глюкозостимулированной секреции инсулина. Это дает основания предполагать, что в р-клетках существует МК/ЭТАТ-независимый сигнальный путь цитотоксического действия ИФ-у.

7. Изучен биологически активный комплекс веществ из слоевищ лишайника С1ас1оп1а. улучшающий инсулиносекреторную функцию р-клеток за счет увеличения митохондриальной продукции АТФ. Использование комплекса веществ из слоевищ лишайника С1ас1ота может рассматриваться как один из дополнительных способов поддержания нормогликемии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

8. Впервые в Р-клетках идентифицированы белок вАБб и его рецептор АХЬ. Определен один из механизмов ОА56-стимулированной внутриклеточной передачи сигнала в р-клетках, включающий фосфорилирование АХ17Р13-киназы/АкЬ'(ОАРОН и ОЛР78) и ингибирование секреции инсулина при нокаутировании АХЬ рецептора. Полученные новые данные об экспрессии и сигнальных путях системы "СтАЯй-АХЬ" позволяют приступить к более глубокому изучению их роли в функционировании р-клеток островков Лангерганса.

9. Предложены белки-мишени, которые могут представлять интерес для фармакологического воздействия с целью нормализации функциональной активности ß-клеток при сахарном диабете.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах ВАК

1. Vladimir V. Sharoyko, Irina I. Zaitseva, Mark Varsanyi, Neil Portwood, Barbara Leibiger, Ingo Leibiger, Per-Olof Berggren, Suad Efcndii and Sergei V. Zaitsev. Monomeric G-protcin, Rhes, is not an imidazoline-rcgulated protein in pancreatic ß-cclls. Biochem Biophys Res Commun. 338(3): 1455-1459,2005.

2. Irina I. Zaitseva, Vladimir V. Sharoyko, Joachim Sterling, Suad Efendic, Christopher Guerin, Thomas Mandrup-Poulsen, Pierluigi Nicotera, Per-Olof Berggren and Sergei V. Zaitsev. RX871024 reduccs NO production but does not protect against pancreatic ß-cell death induced by proinflammatory cytokines. Biochem Biophys Res Commun. 347(4): 1121-1128, 2006.

3. Theres Jägerbrink, Helena Lexandcr, Carina Palmbcrg, Jawed Shafqat, Vladimir V. Sharoyko, Per-Olof Berggren, Suad Efcndic, Sergei V. Zaitsev and Hans Jörnvall. Differential protein expression in pancreatic islets after treatment with an imidazoline compound. Cellular and Molecular Life Sciences. 64(10): 1310-1316,2007.

4. Vladimir V. Sharoyko, Irina I. Zaitseva, Barbara Leibiger, Suad Efendic, Per-Olof Berggren and Sergei V. Zaitsev. Arachidonic acid signaling is involved in the mechanism of imidazoline-induccd Katp channel-independent stimulation of insulin secretion. Cellular and Molecular Life Sciences. 64: 2985-2993, 2007.

5. Irina I. Zaitseva, Monica Hultcrantz, Vladimir V. Sharoyko, Malin Flodström-Tullbcrg, Sergei V. Zaitsev, Per-Olof Berggren. Supressor of cytokine signalling-1 inhibits caspase activation and protects from cytokine-induccd ß-cell death. Cellular and Molecular Life Sciences. 66(23):3787-3795, 2009

6. Siri Malmgren, David G. Nicholls, Jalal Taneera, Karl Bacos, Ashkan Tamaddon, Rolf Vibom, Leif Groop, Charlotte Ling Hindrik Mulder, Vladimir V. Sharoyko. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal ß-cells is required for robust insulin sccrction. Journal of Biological Chemistry. 284(47):32395-32404,2009.

7. Thomas Koeck, Anders H Olsson, Vladimir V. Sharoyko, Marlocs Dckkcr Nitert, Claes Ladcnvall, Olga Kotova, Erwin Reiling, Tina Rönn, Hemang Parikh, Jalal Taneera, Johan G Eriksson, Holgcr Luthman, Alena Stancakova, Johanna Kuusisto, Markku Laakso, Pernille Poulsen, Allan Vaag, Leif Groop, Valeriya Lysscnko, Hindrik Mulder, Charlotte Ling. A common variant in TFB1M is associated with reduced insulin secretion and increased future risk of type 2 diabetes. Cell metabolism. 13(1):80-91, 2011.

8. В. Шаройко, Б. Ксршенгольц. Экспрессия некоторых генов энергетического метаболизма в панкреатических островках человека коррелирует с уровнем гликозилированного гемоглобина. Дальневосточный медицинский журнал. 4: 32-37,2009.

9. В. Шаройко, В. Чуркин, Б. Кершенгольц. uAMO-GEFII-Rim2 путь в iC-канал-независимом механизме инсулинотропной активности нового имидазолинового соединения. Сибирский медицинский журнал. 3: 48-51,2010.

10. В. Шаройко, В. Чуркин, Б. Ксршенгольц. Усиление гликолиза и подавление митохондриального метаболизма приводит к утрате глюкозостимулированной секреции инсулина в ß-клетках. Сибирский медицинский журнал. 5: 90-92 , 2010.

11. Ulrika Brybom, Olga Kotova, Peter Spegel, Vladimir V. Sharoyko, Elna Hallgard, Anna Vedin, Thomas Moritz, Mary C. Sugden, Thomas Köck, Hindrik Mulder. Pyruvate dehydrogenase kinase 1 controls mitochondrial metabolism and insulin secretion in INS-1 832/13 clonal ß-cells. Biochemical journal. 429,1:205-213, 2010.

12. В. Шаройко, E. Ляшенко, E. Чуркина, В. Чуркин. Физиолого-биохимичсские механизмы инсулин-секреторной дисфункции ß-клеток островков поджелудочной железы. Медицинский академический журнал. №5. Том 10:69, 2010.

13. Е. Ляшенко, Е. Чуркина, В. Шаройко. Кальций-зависимые изоформы диациглицерол киназ и их роль в секреции инсулина ß-клетками островков поджелудочной железы. Медицинский академический журнал. №5. Том 10:58,2010.

14. Peter Spegel, Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, Philip Nesholme, Hindrik Mulder. Glucose-responsive (832/13) and -unresponsive (832/2) ß-cell lines exhibit profound differences in glycolitic and tricarboxylic acid cycle metabolism. Biochemical journal, 435(l):277-284, 2011.

15. E. Чуркина, Б. Кершенгольц, В. Шаройко. Эффект препарата «Ягель» из слоевищ лишайника рода Cladonia на секрецию инсулина. Дальневосточный медицинский журнал. 2: 30-34,2011.

16. Peter Spegel, Andrs Р.Н. Danielssonl, Vladimir V. Sharoyko, Siri Malmgren, Cecilia Nagorny, Isabel Goehring, G.W.S. Sharp, S. Straub, Tomas Kocck and Hindrik Mulder. Time-resolved mctabolomics analysys of insulin-producing clonal ß-cells implicates the pentose phosphate pathway in control of insulin release. FASEB, 2011, 296(54): 15396-15408.

Публикации в других изданиях

17. Б. Ксршснгольц, П. Рсмигайло, Е. Хлебный, В. Шаройко, А. Шсин, М. Шашурин, Г. Филиппова, А. Журавская, В. Аныиакова. Биоактивные добавки из природного сырья Якутии. Материалы выездного заседания Ученого Совета РАМН "Проблемы питания населения Арктики". Якутск. С. 79-9!, 2010.

18. Б. Ксршснгольц, П. Рсмигайло, Е. Хлебный, В. Шаройко, А. Шсин, М. Шашурин, Г. Филиппова, А. Журавская, В. Аньшакова. Зачем нужны и что могут дать биотехнологии российскому Северу. Наука из первых рук. Новосибирск. № J. С. 48-60, 2011.

Тезисы конференций

19. Vladimir V. Sharoyko, Karl Bacos, Avinash Abhynkar, Cecilia L. F. Nagorny, Hindrik Mulder. A metabolic comparison of glucose-rcsponsive INS-1 832/13 and glucose- nonrcsponsivc INS-1 832/2 ß-cclls. European Association for the Study of Diabetes, 44,h Annual Meeting, Rom, Italy, 51: 203-204,2008.

20. Vladimir V. Sharoyko, Carl Ekman, Nils Wierup Frank Sundlcr, Björn Dahlbäck, Hindrik Mulder. Protein GAS6 and its reccptor Ax! arc expressed and operate in pancreatic ß-cells. European Association for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Vienna, Austria, 52:448, 2009.

21. В. Шаройко. Метаболический и генетический сравнительный анализ ß-клеток поджелудочной железы, чувствительных и нечувствительных к повышению концентрации глюкозы: новая модель для изучения патогенеза сахарного диабета 2 типа. Конференция молодых ученых: Лаврснтъевские чтения, Якутск, Россия. 13:56, 2009.

22. Vladimir V. Sharoyko, Siri Malmgrcn, David G. Nicholls, Karl Bacos, Ashkan Tamaddon, Rolf Wibom, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal ß-cclls is required for robust insulin secretion. Gordon Research Conference: Molccular & Cellular Biocncrgctics, Andover, USA. 15:22-23, 2009.

23. Siri Malmgrcn, Vladimir V. Sharoyko, David G. Nicholls, Cccilia Nagorny, Peter Spcgel, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Swimming with lipids: A liptoxicity model in the INS-1 ß-cclls: the physiological and cpigenctic alterations induced by it. Scientific Symposium: "What's next", Malmö, Sweden. 1:15-16, 2009.

24. Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, David G. Nicholls, Karl Bacos, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Differences in metabolic regulation between two sister clonal rat ß-cc)l line INS-1 832 decides their ß-ccll functionality. 20lh World Diabetes Congress, IDF, Montreal, Canada. 52:454,2009.

25. Vladimir V. Sharoyko, Tomas Kocck, Carl Ekman, Nils Wierup, Frank Sundler, Björn Dahlbäck, Hindrik Mulder. Protein GAS6 and its receptors AXL, TYR03 and MER are expressed and operate in pancreatic ß-cclls. Scandinavian Socicty for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Malmö, Sweden. 45:45-46,2010.

26. Jelcna A. Stamcnkovich, Cecilia LF Nagorny, Charlotte Ling, Albert Salchi, Vladimir V. Sharoyko, Hindrik Mulder. Melatonin cffccts on insulin secretion and clock genes expression. European Association for the Study of Diabetes, 46,b Annual Meeting, Stockholm, Sweden, 53:93, 2010.

27. Vladimir V. Sharoyko, Tomas Kocck, Carl Ekman, Nils Wierup, Frank Sundler, Björn Dahlbäck, Hindrik Mulder. Growth arrest specific protein 6 (GAS6) and its receptors expression and signalling in ß-cclls. European Association for the Study of Diabetes, 46th Annual Meeting, Stockholm, Sweden, 53:530, 2010.

28. Thomas Kocck, Peter Spcgel, Vladimir V. Sharoyko, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Oxdative phosphorylation-dcpcndent insulin secretion in pancreatic ß-cclls: New insights by disrupting TFBlm. European Association for the Study of Diabetes, 46,h Annual Meeting, Stockholm, Sweden. 53:491, 2010.

29. Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, David G. Nicholls, Cecilia Nagorny, Peter Spcgel, Marlocs Dckkcr Nitcrt, Hindrik Mulder, Charlotte Ling. A lipotoxity model in the INS-1 832/13 ß-cclls lines and the cpigenctic alterations induced by it. Scandinavian Society for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Malmö, Sweden, 53:348,2010.

30. Peter Spcgel, Anders P.H. Danielsson, Vladimir V. Sharoyko, Cccilia Nagorny, Geoffrey Sharp, Susan Straub, Hindrik Mulder. Metabolite profiling of clonal INS-1 832/13 ß-cells after glucose stimulation. Scandinavian Socicty for the Study of Diabetes, 45,h Annual Meeting, Malmö, Sweden. 45:31-32, 2010.

Подписано в печать 12.05.11 Формат 60х84!/1б Цифровая Печ. л. 2

Уч.-изд.л. 2 Тираж 120 Заказ 06/05 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 8)

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шаройко, Владимир Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Сахарный диабет.

1.2. Молекулярные механизмы секреции инсулина.

1.3. Метаболизм пирувата в (3-клетках.

1.4. Роль фактора трансляции митохондрии 1 В в секреции инсулина.

1.5. Роль фактора транскрипции 1а, индуцируемого гипоксией, в секреции инсулина.

1.6. Имидазолиновые соединения.

1.7. Провоспалительные цитокины и их эффект на р-клетки.

1.8. Белок вАБб и его рецепторы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболические и сигнальные пути, контролирующие секрецию инсулина бета-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, и их роль в норме и при сахарном диабете"

Актуальность проблемы. По определению Международной Диабетической Федерации, сахарный диабет (СД) характеризуется как эпидемия. Предполагаемый показатель распространенности этого заболевания к 2025 году может составить около 330 миллионов человек [1]. Уже сегодня СД является большой медицинской и социально-экономической проблемой общества [2]. 1015% от общего числа больных СД.составляют люди, страдающие СД первого типа (СД1), тогда как остальная часть приходится на СД второго типа (СД2) [1]: СД1 связан с прогрессивной деструкцией Р-клеток в результате аутоиммунных процессов в островках Лангерганса поджелудочной железы, индуцированных макрофагами и Т-лимфоцитами [3, 4]. Провоспалительные цитокины, в особенности интерлейкин-1|3 (ИЛ-1р), фактор* некроза опухоли-а (ФНО-а) и интерферон-у (ИФ-у), играют важную роль в патогенезе СД1, вызывая некротическую или апоптотическую гибель р-клеток островков Лангерганса [5].

СД2 является метаболическим заболеванием, в патогенезе которого выделяют два главных компонента: инсулинорезистентность периферических тканей и снижение секреции инсулина Р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Установлено, что генетические- факторы и факторы внешней среды вовлечены в патогенез СД2 [6]. При действии этих факторов Р-клетки островков Лангерганса не способны компенсировать повышение концентрации глюкозы в крови адекватным увеличением секреции инсулина [7], приводя к развитию гипергликемии и других метаболических нарушений. Подавление инсулиносекреторной функции р-клеток является признаком СД2 и рассматривается как один из вероятных механизмов снижения толерантности инсулинозависимых тканей к глюкозе [8-11]. При СД гипергликемия и воздействие провоспалительных цитокинов вызывают дефицит инсулина как минимум по двум механизмам: снижение секреции инсулина и уменьшение популяции Р-клеток в результате индукции апоптоза или некроза [12]. В связи с этим, разработка стратегии протекции р-клеток в отношении цитотоксического пролонгированного действия глюкозы в повышенной концентрации и провоспалительных цитокинов заслуживает особого внимания.

Глюкоза - главный физиологический стимул секреции инсулина р-клетками. В норме, повышение её концентрации в крови приводит к активации транспорта глюкозы в р-клетки. Последующий метаболизм глюкозы генерирует метаболические и сигнальные каскады реакций, которые вызывают секрецию инсулина по двум основным механизмам: инициирующий и амплифицирующий [13]. Первый из них запускается путем закрытия АТФ-зависимых К+-каналов вследствие увеличения отношения [АТФ] к [АДФ] в результате метаболизма глюкозы. При закрытии К+-каналов клеточная мембрана деполяризуется, приводя к открытию потенциалзависимых Са2+ -каналов Ь-типа. Последующее увеличение внутриклеточной* концентрации ионов Са2+ запускает экзоцитоз инсулина. Инициирующий механизм изучен достаточно хорошо [1'4], тогда как амплифицирующий механизм секреции инсулина изучен недостаточно. Более того, остаются до конца невыясненными особенности генной и метаболической регуляции секреции инсулина, а также полиморфных- модификаций генов, изменения уровней метаболитов, вторичных посредников, активности трансляционных и транскрипционных факторов в этом процессе.

Для лечения пациентов с СД2 используется широкий спектр фармакологических препаратов с различным механизмом действия, направленных на улучшение гомеостаза глюкозы. В течение многих лет препараты сульфонилмочевины, мишенью воздействия которых являются р-клетки, доминируют на фармацевтическом рынке [15, 16]. Недостатком препаратов этого класса являются эпизоды гипогликемий [17, 18] и стимуляция апоптоза р-клеток [19]. Кроме того, большинство пациентов, получающих лечение производными сульфонилмочевины в течение 3-10 лет, становятся нечувствительными к данному классу препаратов [20]. В этой связи представляют интерес новые классы соединений, синтезированные химическим путем или биологически активные соединения природного происхождения, обладающие глюкозонормализующим эффектом и пониженной токсичностью.

Таким образом, независимо от инициирующих факторов, на начальных и последующих этапах развития СД, в островках Лангерганса наблюдается деструкция и прогрессирующее уменьшение количества Р-клеток вплоть до полного их исчезновения и развития абсолютной инсулиновой недостаточности при СД1-, так и при СД2 [21-23], поэтому перспективным направлением в лечении СД1 является разработка методов сохранения имеющихся Р-клеток на ранней стадии заболевания, а при СД2 - на всех стадиях заболевания. В данной работе обобщены результаты цикла исследований, направленных на выяснение физиолого-биохимических механизмов функционирования Р-клеток в норме и при патологии, результаты которых могут быть использованы при разработке фармакологических и молекулярно-генетических. методов протекции р-клеток не только для предотвращения развития СД, но и уже при развившемся СД.

Цель и задачи исследования

Цель работы. Изучение метаболических и сигнальных путей, участвующих в секреции инсулина Р-клетками островков Лангерганса в норме и при патологии с целью разработки стратегии воздействия на эти пути с помощью фармакологических и молекулярно-генетических методов для нормализации функциональной активности этих клеток.

В ходе исследования решались следующие основные задачи

1. Разработать экспериментальную модель для исследования механизмов секреции инсулина р-клетками в условиях in vitro.

2. Используя разработанную модель, изучить особенности метаболизма в р-клетках с нормальной и сниженной секрецией инсулина in vitro.

3. Изучить эффект глюкозы в повышенной концентрации и цитокинов на метаболизм и секрецию инсулина в Р-клетках in vitro.

4. Исследовать изменение профиля метаболитов и сигнальных молекул в Р-клетках при стимуляции их глюкозой in vitro.

5. Выявить полиморфизм генов, связанных с функционированием митохондрий в Р-клетках и риском развития СД2.

6. Изучить сигнальные пути инсулинотропного действия некоторых имидазолиновых соединений и некоторых классов биологически активных соединений природного происхождения в Р-клетках.

7. Исследовать протективные свойства некоторых имидазолиновых соединений и супрессора цитокинового сигнального пути 1 в отношении цитотоксического действия провоспалительных цитокинов на р-клетки.

8. Изучить роль в секреции инсулина ряда белковых молекул, которые в р~ клетках ранее не исследовались.

Научная новизна исследования

Проведенное исследование впервые показало, что одним из механизмов снижения чувствительности к глюкозе клональных р-клеток является стабилизация (т.е. ингибирование протеосомальной деградации) транскрипционного фактора HIF-la (фактора la, индуцированного гипоксией). В этих клетках HIF-la вызывает нарушение метаболизма глюкозы за счет разобщения гликолиза и метаболизма пирувата в митохондриях, которое приводит к подавлению глюкозостимулированной секреции инсулина.

Известно, что при СД2 наблюдается гипергликемия и повышение в крови концентрации ФНО-а, которые участвуют в развитии осложнений СД2 и в том числе снижают инсулиносекреторную активность ß-клеток. Впервые на модели клональных ß-клеток и островках Лангерганса человека in vitro установлено, что пролонгированное воздействие глюкозы или ФНО-а в повышенной концентрации приводит к стабилизации HIF-la и, соответственно, к снижению глюкозостимулированной секреции инсулина. При этом обнаружено HIF-la-контролируемое ингибирование метаболизма пирувата в реакциях пируватдегидрогеназного комплекса и активация анаэробного гликолиза. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизмов снижения чувствительности ß-клеток к глюкозе при прогрессировании СД2.

При пролонгированном действии глюкозы в повышенной концентрации на ß-клетки возрастает экспрессия гена-мишени HIF-la - Pdkl и его белкового продукта - киназы 1 пируватдегидрогеназы (PDK1). Показано, что выключение PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина клональными ß-клетками за счет увеличения митохондриального метаболизма пирувата, дыхания и продукции АТФ митохондриями.

Установлено, что пентозофосфатный цикл участвует в амплифицирующем механизме секреции инсулина ß-клетками и в островках Лангерганса человека за счет синтеза NADPH, выступающего в этом процессе в качестве сигнальной молекулы, играющей важную роль в экзоцитозе инсулина.

Используя базу данных полногеномных исследований GWAS (а genome-wide association study) установлено, что полиморфизм гена (rs950994; G—>А) фактора трансляции митохондрии B1 (TFB1M; митохондриальная S-аденозилметионин-б-К,К-аденозил(рРНК)диметилтрансфераза-1) ассоциируется со снижением секреции инсулина, повышением постпрандиального уровня глюкозы и риском развития СД2. Установлен механизм, посредством которого ослабление общей трансляции в митохондриях ß-клеток за счет снижения диметилирования 12S рРНК приводит к снижению продукции АТФ в митохондриях и подавлению секреции инсулина.

Изучены некоторые биохимические механизмы действия имидазолинового соединения BL11282, обладающего выраженным инсулинотропным'эффектом. BL11282 потенцирует секрецию инсулина путем воздействия на сигнальный путь: АТФ => цАМФ+ОЕК[1-Шт2 (СЕЕП-Шт2-цАМФ-активируемый белковый комплекс, участвующий в экзоцитозе инсулина) ==> цАМФ-СЕЕП-Шт2, контролируемый аденилатциклазой и сигнальный путь: фосфолипид => арахидоновая кислота => эпоксиэйкозатриеновая кислота, контролируемый кальций-независимой фосфолипазой А2 (iPLA2) и цитохромом Р450.

Обнаружены протективные свойства имидазолина RX871024 (уменьшение продукции NO) и SOCS-1 (снижение активности каспаз и апоптоза), частично снижающие цитотоксическое -действие провоспалительных цитокинов на ß-клетки.

Идентифицированы белок GAS 6 и его рецептор AXL в ß-клетках и показана их функциональная роль в ß-клетках, заключающаяся в контроле секреции инсулина и синтеза ФНО-а. Установлен один из механизмов внутриклеточной передачи сигнала - в ß-клетках при действии GAS 6: GAS 6 аутофосфорилирование AXL => фосфорилирование Р13-киназы => фосфорилирование Akt =>.фосфорилирование GAPDH и GRP78=>.:=> эффекторные системы.

Усовершенствована модель субстратно-энзиматических и сигнальных процессов, объясняющая регуляцию секреции инсулина ß-клетками.

Научно-практическое значение работы

Данное исследование относится к разряду фундаментально-прикладных работ. Применяя вышеперечисленные подходы (модели) нам удалось получить новую информацию о некоторых механизмах функционирования Р-клеток в норме и патологии, выявить новые белки, являющиеся потенциальными мишенями для фармакологического или молекулярно-генетического воздействия, а также предложить способы коррекции функциональных нарушений р-клеток при СД. Полученные результаты углубляют представления о фундаментальных молекулярных механизмах, лежащих в основе регуляции секреции инсулина под действием глюкозы, инсулинотропных. соединений класса имидазолинов (на примере В1Л1282 и КХ871024) и- биологически активных веществах растительного происхождения (на примере экстракта из слоевищ лишайника рода С1ас1ота). Данная информация может быть полезна при разработке новых способов управления функциональной активностью' р-клеток и^ коррекции метаболических нарушений при СД2. На использование экстракта из слоевищ лишайника рода С1айота (препарат "Ягель") в коррекции метаболических нарушений при СД2 подана заявка на патент РФ.

Изучение имидазолиновых соединений продемонстрировало возможность использования имидазолинов в качестве инструмента для изучения путей передачи сигнала в Р-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, и перспективность дальнейшего комплексного исследования имидазолинов с целью разработки фармацевтических препаратов для лечения СД2.

Ингибирование РОК1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина, в р-клетках, поэтому создание- селективных ингибиторов данного фермента может рассматриваться как. одно * из направлений фармакологической терапии СД2 при секреторной дисфункции р-клеток.

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза СД2, а также в создании новых подходов для диагностики. Исследование ведущей роли трансляционного фактора TFB1M в механизме секреции инсулина показало, что он является важным компонентом в патогенезе СД2, связанным с нарушением функционирования митохондрий.

Генотипирование полиморфизма (rs950994) гена TFB1M внедрено в панель генов-риска для диагностики предрасположенности к развитию СД2. Полученная информация позволяет проводить анализ нарушений отдельных звеньев в механизме секреции инсулина, связанных с дисфункцией митохондрий.

В качестве in vitro модели для изучения механизмов секреции инсулина в норме и при патологии предложены постоянные клеточные линии глюкозочувствительных и глюкозонечувствительных (3-клеток.

Показано; что экстракт из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат "Ягель") стимулирует глюкозозависимую секрецию инсулина in vitro и обладает глюкозонормализующим» действием у пациентов, страдающих СД2.

Результаты, исследований используются автором при чтении лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Личный вклад автора. Работа выполнена на базе следующих научно-исследовательских учреждений: Лаборатория Экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск, РФ), Центр исследований диабета и эндокринологии им. Рольфа Люфта Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция), Лаборатория молекулярного метаболизма' центра исследований диабета Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция). Экспериментальные данные получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии. Планирование и проведение экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов и написание статей осуществлялось самим автором, либо при его активном участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Метаболомный анализ (3-клеток проводился совместно с Петером Шпегелем и Хиндриком Мульдером. Протеомный анализ островков и Р-клеток проводилась в тесном взаимодействии с Томасом Коком и Терезой Ягербринк. ЬБ/МБ-МБ и МАЬШЧгар анализ пептидов выполнялся в центре протеомных исследований Лундского университета. Генотипирование производилось в лаборатории центра секвенирования Лундского университета. Анализ данных из в\УА8 проводился совместно с Валерией Лысенко и Шарлот Линг. Исследование апоптоза осуществлялось совместно с Ириной Зайцевой, Иохимом Сторлингом и Сергеем Зайцевым. Отдельные этапы работы проводились совместно с Борисом Кершенгольцем.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разобщение аэробного гликолиза и митохондриального метаболизма пирувата играет ведущую роль в прогрессировании инсулиносекреторной дисфункции Р-клеток.

2. Пролонгированное действие глюкозы в повышенной концентрации и фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) на Р-клетки вызывают стабилизацию фактора, индуцированного гипоксией-1 а (НИМ а), приводя к снижению чувствительности р-клеток к глюкозе.

3. Пентозофосфатный цикл, в ходе которого генерируется ИАОРН, вовлечен в амплифицирующий механизм секреции инсулина р-клетками.

4. Полиморфизм О—>А гена фактора трансляции митохондрии В1 (//Ь7га; Г8950994) ассоциируется с дефектом секреции инсулина и с риском развития СД2.

5. Инсулинотропное действие имидазолинового соединения BL11282 опосредовано цАМФ-зависимым механизмом, взаимодействием цАМФ с комплексом GEFII*Rim2 и метаболизмом арахидоновой кислоты в эпоксиэйкозатриеновые кислоты. Кроме того, BL11282 повышает чувствительность (3-клеток к глюкозе.

6. Имидазолиновое соединение RX871024 и ингибитор внутриклеточной передачи сигнала цитокинов-1 (SOCS-1) снижают цитотоксическое действие провоспалительных цитокинов.

7. Белок "growth arrest-specific protein" (GAS6) и его рецептор AXL синтезируются в (3-клетках. Подавление экспрессии рецептора AXL снижает секрецию инсулина.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах кафедры биологической химии СевероВосточного федерального университета им. М.К. Аммосова (г. Якутск), Лаборатории экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, Лаборатории молекулярного метаболизма Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция), Лаборатории диабета и эндокринологии Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция).

Отдельные аспекты работы были представлены на следующих международных конференциях: "European Association for the Study of Diabetes" (Rom, Italy, 2008; Vienna, Austria, 2009; Stockholm, Sweden, 2010; Lisbon, Portugal, 2011); "Gordon Research Conferences: Molecular & Cellular Bioenergetics" (Andover, USA, 2009); "What's next" (Malmo, Sweden, 2009); "Islet Study Group", (Steinschaler Dorfl, Austria, 2009); "World Diabetes Congress, IDF" (Montreal, Canada 2009); "Scandinavian Society for the Study of Diabetes" (Malmo, Sweden, 2010).

Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 30 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, из них 16 работ в журналах, рекомендованных-ВАК РФ.

Благодарности. Я выражаю искреннюю благодарность моим прежним и настоящим коллегам вышеуказанных лабораторий, в которых была выполнена диссертационная работа, за сотрудничество, общение, понимание и поддержку. Выражаю особую признательность моим учителям, профессорам Борису Моисеевичу Кершенгольцу и Алле Николаевне Журавской (Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, г. Якутск).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (РФ), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" (РФ), фармацевтической компании Ново Нордиск (Дания), Шведского Совета по исследованиям (Швеция), гранты на исследования Stiftelsen Lars Hiertas Minne (Швеция), Albert Pählssons stifteise för forskning och välgörenhet (Швеция), O.E och Edla Johanssons stifteisen (Швеция), Crafoordska stifteisen (Швеция).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шаройко, Владимир Владимирович

294 ВЫВОДЫ

1. На модели клональных р-клеток, чувствительных и нечувствительных к глюкозе показано, что в глюкозочувствительных Р-клетках секрецию инсулина обеспечивает тесное сопряжение гликолиза и митохондриального метаболизма пиру вата. Это сопряжение проявляется в усилении митохондриального дыхания и ограничении гликолиза и продукции лактага. Установлен сходный; характер; экспрессии генов ферментов? гликолиза и: митохондриального метаболизма, в клональных Р-клетках и островках Лангерганса. человека. Прш этом; повышение: уровня! глюкозы крови может нарушать координированную экспрессию генов гликолиза: и митохондриального метаболизма, в островках Лангерганса человека, которая необходима для глюкозостимулированной секреции инсулина.

2. Установлено, что пролонгированное действие: глюкозы и фактора некрозам опухоли-а в повышенных концентрациях на Р-клетки- вызывает стабилизацию индуцированного; гипоксиеш транскрипционного фактора-1а. Это> подавляет глюкозостимулированную секрецию* инсулина и открывает возможность» целенаправленно? ингибировать стабилизацию* индуцированного' гипоксией транскрипционного фактор-1а в: Р-клетках для поддержания- их инсулиносекреторной: функции при сахарном диабете 2 типа.

3. Показано, что - концентрация; КАБРН достигает максимума через 6 мин после начала стимуляции р-клеток глюкозой и предшествует- пику секреции инсулина- Так как КАОРН; генерируемый; в пентозофосфатном цикле; является необходимым сопрягающим фактором в амплифицирующем механизме секреции инсулина Р-клетками; это?позволило пересмотреть-роль пентозофосфатного цикла в Р-клетках, участие . которого: в механизме секреции; инсулина ранее; недооценивалось.

4. Установлено; что вариант полиморфизма гена фактора трансляции митохондрии В Г ^950994 (в—> А) ассоциируется со снижением его экспрессии в

-клетках островков Лангерганса человека. Это приводит к ограничению трансляции субъединиц системы окислительного фосфорилирования и уменьшению продукции АТФ, что является одной из причин снижения секреции инсулина и увеличения риска развития сахарного диабета 2 типа. На основании этого анализ полиморфизма гена (/bim рекомендован к внедрению в клиническую практику для; выявления предрасположенности к развитию сахарного? диабета 2 типа. '

5; Изучен механизм, инсулинотропной активности нового имидазолинового соединения» ВЫ1282!. Установлено; что^инсулинотропная? активность ВЕВ^в^не: опосредована: его влиянием? на АТФ-чувствителные К+-каналы, белок RHes, 6.2-адрено- и имидазолиновые Iir-рецепторы. Предложен механизм инсулинотропного действия BL11282 через цАМФ-зависимыШ сигнальный путь и комплекс GEFII-Rim2 и сигнальный путь арахидоновой. кислоты, активируемый кальцийнезависимош фосфолипазош А2 и- ее: последующий-, метаболизм-цитохромом Р450 до эпоксиэйкозагриеновый кислоты. Также показано, что пролонгированное воздействие BL11282 на ß-клетки увеличивает их: чувствительность к последующей стимуляции глюкозой, что сопровождается повышением экспрессии белков, участвующих в фолдинге, связывании ионов гу, ' '

Ga , метаболизме и-снижением уровня экспрессии; ингибитора» протеин киназы С." Полученная информация о сигнальных путях инсулинотропного действия BL11282, которые активируются только при повышении концентрации глюкозы, позволяет разрабатывать принципиально1 новые: препараты глюкозозависимого действия для лечения сахарного диабета 2 типа. .

6. При моделировании воспалениягпри сахарномщиабете;1' типа показано; что цйтотоксическое действие , комбинации провоспалительных цитокинов ИЛ-lß, ФНО-а и ИФ-у на ß-клетки островков Лангерганса частично снижается при действии имидазолинового соединения RX871024 или повышении экспрессии супрессора цитокинового пути передачи сигнала-1 в Р-клетках. При этом RX871024 или повышенная экспрессия супрессора цитокинового пути передачи сигнала-1 не предотвращали цитокин-индуцированное подавление глюкозостимулированной секреции инсулина. Это дает основания предполагать, что в Р-клетках существует JAK/STAT-независимый сигнальный путь цитотоксического действия ИФ-у.

7. Изучен биологически активный комплекс веществ из слоевищ лишайника Cladonia, улучшающий инсулиносекреторную функцию р-клеток за счет увеличения митохондриальной продукции АТФ. Использование комплекса веществ из слоевищ лишайника Cladonia может рассматриваться как один из дополнительных способов поддержания нормогликемии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

8. Впервые в Р-клетках идентифицированы белок GAS6 и его рецептор AXL. Определен один из механизмов САБб-стимулированной внутриклеточной передачи сигнала в р-клетках, включающий фосфорилирование AXL/PI3-KHHa3bi/Akt/(GAPDH и GRP78) и ингибирование секреции инсулина при нокаутировании AXL рецептора. Полученные новые данные о синтезе и сигнальных путях системы "GAS6-AXL" позволяют приступить к более глубокому изучению их роли в функционировании Р-клеток островков Лангерганса.

9. Предложены белки-мишени, которые могут представлять интерес для фармакологического воздействия с целью нормализации функциональной активности р-клеток при сахарном диабете.

ГЛАВА 11. ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного НИ7-1а сигнального механизма в |3-клетках, который активируется при действии глюкозы в повышенной концентрации или ФНО-а. Стабилизация и транскрипционная активация НШ-1а в Р-клетках вызывает переключение митохондриального метаболизма, на гликолиз, что сопровождается увеличением продукции лактата и снижением глюкозостимулированной секреции инсулина. Полученные данные* расширяют современные представления о механизме токсического действия глюкозы, и ФНО-а, которые при пролонгированном воздействии на Р-клетки вызывают их инсулиносекреторную дисфункцию. Наши результаты еще раз демонстрируют необходимость строгого- контроля концентрации глюкозы в крови у пациентов с СД2, а также роль ФНО-а не только в развитии • инсулинорезистентности- при СД2, но и инсулиносекреторной дисфункции Р-клеток.

Полученные в работе данные доказывают важность пентозофосфатного цикла1 как источника ИАОРН, ключевого' сопрягающего фактора, участвующего в амплифицирующем механизме секреции инсулина. До наших исследований в литературе существовала точка зрения, что только пируват-малатный цикл является источником КАБРН.

Используя базу данных полногеномных исследований установлено, что полиморфизм гена (гз950994) Т]Ыт ассоциируется с риском развития СД2. При изучении Р-клеток островков Лангерганса с дефицитом ТБВ1М установлено его действие на такие фундаментальные* клеточные процессы как секреция инсулина р-клетками (ингибирование) и гибель Р-клеток (стимуляция). Таким образом, Т]Ыт может быть добавлен к растущему списку генов, ответственных за риск развития СД2.

В нашем исследовании было показано, что ингибирование глюкозостимулированной секреции инсулина при действии цитокинов ИЛ-lß, ФНО-а и ИФ-у коррелирует с увеличением продукции NO. Основываясь на этих результатах и сообщениях других лабораторий, можно предположить, что цитокин-индуцированное снижение глюкозостимулированной секреции инсулина является следствием увеличения продукции N0, контролируемое ИФ-у через JAK/STAT- независимый сигнальный путь. Ингибирование этого сигнального пути позволит более эффективно снижать токсическое действие ИФ-у наз ß-клетки.

Исследование имидазолиновых соединений (на примере BL11282) и i биологически активных веществах растительного происхождения (на примере экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia) продемонстрировало их перспективность как веществ инсулинотропного действия. Полученная информация может быть полезна'для разработки нового класса инсулинотропных фармпрепаратов для лечения СД2 и коррекции метаболических нарушений при СД2.

Впервые в клональных островках Лангерганса* идентифицирован белок GAS6 с его рецептором^ AXL и, установлено стимулирующее действие GAS6 на глюкозостимулированную секрецию инсулина. На современном этапе наших исследований механизм СА86-стимулированной внутриклеточной передачи сигнала в ß-клетках выглядит следующим образом: GAS6 => аутофосфорилирование AXL ==> фосфорилирование Р13-киназы => фосфорилирование Akt =>.=> фосфорилирование GAPDH и GRP78=>.=> эффекторные системы. Таким образом; выдвинутая нами гипотеза о важной роли белка GAS6 и его рецептора AXL в глюкозостимулированной секреции инсулина ß-клетками нашла подтверждение- в наших исследованиях. Полученные нами результаты дают основания для более глубокого исследования роли GAS6 и его рецепторов в функционировании островков Лангерганса (пара- и аутокринные эффекты в островке, синтез инсулина, регуляция апоптоза).

Накопленный экспериментальный материал позволят предложить ряд белковых молекул, которые могут представлять интерес для дальнейших фармакологических и молекулярно-генетических манипуляций с целью коррекции функциональных нарушений в ¡З-клетках при СД: фактор, индуцируемый гипоксией 1а, фактор трансляции митохондрии 1В, кальций-независимая фосфолипаза А2, молекулярный шапероны Hsp60 и GRP78, ингибитор протеинкиназы С (histidine-triad nucleotide binding protein 1), супрессор цитокинового сигнального пути 1, ростозамедляющий специфический белок 6 и рецептор AXL.

Установленные и исследованные нами метаболические и сигнальные пути, контролирующие секрецию инсулина р-клеткми островков Лангерганса, можно обобщить в виде нижеприведенных схем.

Метаболические и сигнальные пути, участвующие в стимуляции секреции инсулина; глюкоза => сопряжение гликолиза и цикла Kpe6ca|=>OXPHOSf =>АТФ|=>секреция инсулина | лактат| глюкоза=> [а-кетоглутарат]/[сукцинат]> 1 =>Н1Р-а|=>секреция инсулина^ глюкоза| =>пентозофосфантый цикл|=^ЧАБРН|=>секреция инсулина |

BL11282=>Tfam,Nrfl,Pgcla=>MHT0X0HflpHHf =>АТФ| =^>секреция инсулина!

ВЬ11282^АТФ|=>цАМФ+СЕРП-Шш2=>цАМФ-ОЕРП-Шт2=>секреция инсулина|

ВЬ11282=>ингибитор РКС|=> РКС|=>секреция инсулина | ВЬ11282=> Нзр60],=> РКС|=>секреция инсулина |

ВЫ1282=>фосфолипаза А2=>фосфолипиды=>арахидоновая кислота|=> =^>эпоксиэйкозатриеновая кислота| =>секреция инсулина |

Препарат "Ягель"=>ТГат|=>митохондрии=^АТФ|=>секреция инсулина | вАБб => аутофосфорилирование АХЬ| => фосфорилирование Р13-киназы| => фосфорилирование Ак^ =>.=> фосфорилирование ОАРОН| и СКР78|=>.=> секреция инсулина |

Метаболические и сигнальные пути, участвующие в подавлении секреции инсулина: глюкоза! =>[а-кетоглутарат]/[сукцинат] < 1 =>Н1Ра! =>РОК11 =>лактат| => =>секреция инсулина I

ФНО-а|=> ШР-а|=>РВК1!=>лактат|=>секреция инсулина | гб950994 (в-* А) =>Т£Ыш4=>ТРВ1М|=>0ХРН08|=>АТФ4 ^секреция инсулина |

КХ871024==> р38-фосфоХ ^КО-синтаза=>Ж)|=>секреция инсулина |

8<ЭС8-1=> каспаза-8,9,31 =>апоптоз| и секреция инсулина |

Цитокины=>КО|=>секреция инсулина | ИФ-у=>.=>ГТО|=>секреция инсулина |

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шаройко, Владимир Владимирович, Санкт-Петербург

1. Atlas, T.LD.F.s., 2006.

2. Zimmet, P., K.G. Alberti, and J. Shaw, Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature, 2001. 414(6865): p. 782-7.

3. Chandra, J., et al., Role of apoptosis in pancreatic beta-cell death in diabetes. Diabetes, 2001.50 Suppl 1: p. S44-7.

4. Mandrup-Poulsen, Т., Beta cell death and protection. Ann N Y Acad Sci, 2003. 1005: p. 32-42.5; Mandrup-Poulsen,: Т., beta-cell'apoptosis::.sHmuWandisignalingi. Diabetes* .20011. 50 Suppl 1: p. S58-63.

5. Gloyn, A.L. and M.I. McCarthy, The genetics of type 2 diabetes. Best Pract Res , GlinEndbcrinolKMetab^200E 15(3): pi .293-3081,

6. Ahren; BV, TType2 diabetes, insulinsecretionand beta-cell mass. Guml^o^ 2005. 5(3): p. 275-86:

7. Cnop,M:,et al., Mechanisms ofpancreatic beta-cell deathintypelahd type 2 > diabetes: many dijferences, few similarities. Diabetes, 2005. 54Suppl2:pS97

8. Ю7. ,"' ' '•. ■•' ' ' ■ . v >':\ v ' .13: Henquin, J:C., Regulation of insulin secretion: a matter of phase controland amplitude modulation.Diabetologia, 2009: 52(5): p. 739-51.

9. Ashcroft, F.M:, D:E. Harrison, md&JlAshcvoft, Glucose induces closure of single potassium channels in isolated rat pancreatic beta-ce//s.:Natore, 1984-312(5993): p. 446-8.

10. Aquilante,C.L., Sulfonylureapharmacogenomics in Type 2 diabetes: the influence of drug target and diabetes risk polymorphisms. Expert Rev Cardiovase Ther. 8(3): p. 359-721

11. Polakof, S., Diabetes therapy: novel patents targeting the glucose-induced insulin-secretion. Recent Pat DNA Gene Seq. 4(1): p. 1-9.

12. Ferner, R.E. and H.A. Neil, Sulphonylureas and hypoglycaemia. Br Med J (Clin Res Ed), 1988. 296(6627): p: 949-50.

13. Shorr, R.I., et al., Antihypertensives and the risk of serious hypoglycemia in older persons using insulin or sulfonylureas. JAMA, 1997. 278(1): p. 40-3.

14. Maedler, K., et al., Sulfonylurea induced beta-cell apoptosis in cultured human islets. J Clin Endocrinol Metab, 2005. 90(1): p. 501-6.

15. Groop, L.C., Sulfonylureas in NIDDM. Diabetes Care, 1992.15(6): p. 737-54.

16. Bonora, E., C. Brangani, and I. Pichiri, Abdominal obesity and diabetes. G Ital Cardiol (Rome), 2008. 9(4 Suppl 1): p. 40S-53S.

17. Meier, J.J., Beta cell mass in diabetes: a realistic therapeutic target? Diabetologia, 2008. 51(5): p. 703-13.

18. Eizirik, D.L., M.L. Colli, and F. Ortis, The role of inflammation in insulitis and beta-cell loss in type 1 diabetes. Nat Rev Endocrinol, 2009. 5(4): p. 219-26.

19. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care, 2008. 31 Suppl 1: p. S55-60.

20. King, K.Me. and G. Rubin, A history of diabetes: from antiquity to discovering insulin. Br J Nurs, 2003.12(18): p. 1091-5.

21. Alberti, K.G. and P.Z. Zimmet, Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med, 1998. 15(7): p. 539-53.

22. Aly, H. and P. Gottlieb, The honeymoon phase: intersection of metabolism and immunology. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes, 2009.116(4): p. 286-92.

23. Karvonen, M., et al., Incidence of childhood type 1 diabetes worldwide. Diabetes Mondiale (DiaMond) Project Group. Diabetes-Care, 2000:23(10): p. 1516-26.«

24. Kahn, S;E., R.L. Hull, and K.M. Utzschneider, Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature, 2006. 444(7121): p. 840-6.

25. Burr, J.F., et al., The role of physical activity in type 2 diabetes prevention: physiological and practical perspectives. Phys Sportsmed, 2010. 38(1): p. 72-82.

26. Trevisan, R., M. Vedovato, and A. Tiengo, The epidemiology of diabetes mellitus. Nephrol Dial Transplant, 1998.13 Suppl8: p. 2-5.

27. Bonadonna, R.C., et al., Altered homeostatic adaptation of first- and second-phase beta-cell secretion in the offspring of patients with type 2 diabetes: studieswith a minimal model to assess beta-cell function. Diabetes, 2003. 52(2): p. 47080.

28. Weir, G.C. and S. Bonner-Weir, Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes, 2004. 53 Suppl 3: p. S16-21.

29. Suckale, J. and M. Solimena, Pancreas islets in metabolic signaling—focus on the beta-cell. Front Biosci, 2008.13: p. 7156-71.

30. Elayat, A.A., M.M. el-Naggar, and M. Tahir, An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. J Anat, 1995.186 ( Pt 3): p. 62937.

31. Straub, S.G. and G.W. Sharp, Glucose-stimulated signaling pathways in biphasic insulin secretion. Diabetes Metab Res Rev, 2002.18(6): p. 451-63.

32. Johnson, J.H., et al:, Underexpression of beta cell high Km glucose transporters in noninsulin-dependent diabetes. Science, 1990. 250(4980): p. 546-9.

33. De Vos, A., et ah, Human and rat beta cells differ in glucose transporter but not in glucokinase gene expression. J Clin Invest, 1995. 96(5): p. 2489-95.

34. Johnson, J.H., et al., The high Km glucose transporter of islets of Langerhans is functionally similar to the low affinity transporter of liver and has an identical primary sequence. J Biol Chem, 1990. 265(12): p. 6548-51.

35. Hedeskov, C.J., Mechanism of glucose-induced insulin secretion. Physiol Rev, 1980. 60(2): p. 442-509.

36. Hedeskov, C.J1. and.K. CapitO; Pancreatic islet metabolism of pyruvate and other potentiators of insulin release. Effects of starvation. Horm Metab Res Suppl, 1980. Suppl 10: p. 8-13.

37. Arkhammar, P., et ah, Inhibition of ATP-regulated K+ channels precedes depolarization-induced increase in cytoplasmic free Ca2+ concentration in pancreatic beta-cells. J Biol Chem, 1987. 262(12): p. 5448-54.

38. Gembal, M., et ah, Mechanisms by which glucose can control insulin release independently from its action on adenosine triphosphate-sensitive K+ channels in mouse B cells. J Clin Invest, 1993. 91(3): p. 871-80.

39. Detimary, P., J.C. Jonas, and J.C. Henquin, Stable and diffusible pools of nucleotides in pancreatic islet cells. Endocrinology, 1996.137(11): p. 4671-6.

40. Sato, Y. and J.C. Henquin, The K+-ATP channel-independent pathway of regulation of insulin secretion by glucose: in search of the underlying mechanism. Diabetes, 1998. 47(11): p. 1713-21.

41. Seino, S., et ah, Roles ofcAMP signalling in insulin granule exocytosis. Diabetes Obes Metab, 2009.11 Suppl 4: p. 180-8.

42. Sharp, G.W., The adenylate cyclase-cyclic AMP system in islets ofLangerhans and its role in the control of insulin release. Diabetologia, 1979.16(5): p. 287-96.

43. Kashima, Y., et al., Critical role of cAMP-GEFII~Rim2 complex in incretin-potentiated insulin secretion. J Biol Chem, 2001. 276(49): p. 46046-53.

44. Seino, S. and T. Shibasaki, РКА-dependent and РКА-independent pathways for с AMP-regulated exocytosis. Physiol Rev, 2005. 85(4): p. 1303-42.

45. Turk, J., R.W. Gross, and S. Ramanadham, Amplification of insulin secretion by lipid messengers. Diabetes, 1993. 42(3): p. 367-74.

46. Ramanadham, S., et ah, Mass spectrometric identification and quantitation of arachidonate-containing phospholipids in pancreatic islets: prominence of plasmenylethanolamine molecular species. Biochemistry, 1993. 32(20): p. 533951.

47. Ramanadham, S., et al., Inhibition of arachidonate release by secretagogue-stimulated pancreatic islets suppresses both insulin secretion and the rise in beta-cell cytosolic calcium ion concentration. Biochemistry, 1993. 32(1): p. 337-46.

48. Thams, P., et al., Phorbol-ester-induced down-regulation of protein kinase С in mouse pancreatic islets. Potentiation of phase I and inhibition of phase 2 of glucose-induced insulin secretion. Biochem J, 1990. 265(3): p. 777-87.

49. E. Ляшенко, Б.Ч., В. Шаройко. , Кальций-зависимые изоформы диациглгщерол киназ и их роль в секреции инсулина р-клетками островков поджелудочной железы. . Медицинский академический журнал. ,2010. • 5(10): р. 58.

50. Schuit, F., et al., Metabolic fate of glucose in purified islet cells. Glucose-regulated anaplerosis in beta cells. J Biol Chem, 1997. 272(30): p. 18572-9.

51. MacDonald, M.J., Metabolism of the insulin secretagogue methyl succinate by pancreatic islets. Arch Biochem Вiophys, 1993. 300(1): p. 201-5.

52. Prentki, M., New insights into pancreatic beta-cell metabolic signaling in insulin secretion. Eur J Endocrinol, 1996.134(3): p. 272-86.

53. Maechler, P. and C.B. Wollheim, Mitochondrial glutamate acts as a messenger in glucose-induced insulin exocytosis. Nature, 1999. 402(6762): p. 685-9.

54. Khan, A., Z.C. Ling, and B.R. Landau, Quantifying the carboxylcition of pyruvate in pancreatic islets. J Biol Chem, 1996. 271(5): p. 2539-42.

55. MacDonald, M.J., Feasibility of a mitochondrial pyruvate malate shuttle in pancreatic islets. Further implication ofcytosolic NADPH in insulin secretion. J Biol Chem, 1995. 270(34): p. 20051-8.

56. Brun, T., et al., Evidence for an anaplerotic/malonyl-CoA pathway in pancreatic beta-cell nutrient signaling. Diabetes, 1996. 45(2): p. 190-8.

57. Deeney, J.T., et al., Acute stimulation with long chain acyl-CoA enhances exocytosis in insulin-secreting cells (HITT-15 and NMRI beta-cells). J Biol Chem, 2000. 275(13): p. 9363-8.

58. Metz, S.A., et al., Modulation of insulin secretion from normal rat islets by inhibitors of the post-translational modifications of GTP-binding proteins. Biochem J«, 1993. 295 ( Pt 1): p. 31-40:

59. Yamada, S., et al., Nutrient modulation of palmitoylated 24-kilodalton protein in rat pancreatic islets. Endocrinology, 2003.144(12): p. 5232-41.

60. Chapman, E.R., et al., Fatty acylation of synaptotagmin in PC12 cells and synaptosomes. Biochem Biophys Res Commun, 1996i 225(1): p. 326-32.

61. Gonzalo, S., W.K. Greentree, and M.E. Linder, SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain. J Biol Chem, 1999: 274(30): p. 21313-8.

62. Takahashi, N., et al., Sequential exocytosis of insulin granules is associated with redistribution ofSNAP25. J Cell Biol; 2004.165(2): p. 255-62.

63. Yajima, H., et al., Cerulenin, an inhibitor of protein acylation, selectively attenuates nutrient stimulation of insulin release: a study in rat pancreatic islets. Diabetes, 2000. 49(5): p. 712-7.

64. Cheng, H., S.G. Straub, and G.W. Sharp, Protein acylation in the inhibition of insulin secretion by norepinephrine, somatostatin, galanin, and PGE2. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003. 285(2): p. E287-94.

65. Straub, S.G. and G.W. Sharp, Inhibition of insulin secretion by cerulenin might be due to impaired glucose metabolism. Diabetes Metab Res Rev, 2007. 23(2): p. 146-51.

66. Gromada, J., J J. Hoist, and P. Rorsman, Cellular regulation of islet hormone secretion by the incretin hormone glucagon-like peptide 1. Pflugers Arch, 1998. 435(5): p. 583-94.

67. MacDonald, P.E., et al., The multiple actions ofGLP-1 on the process of glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes, 2002. 51 Suppl 3: p. S434-42.

68. Zawalich, W.S. and H". Rasmussen, Control of insulin secretion: a model involving Ca2+, cAMP and diacylglycerol. Mol Cell Endocrinol, 1990. 70(2): p. 119-37.

69. McClenaghan, N.H., P.R. Flatt, and A .J. Ball, Actions of glucagon-like peptide-1 on KATP channel-dependent and -independent effects of glucose, sulphonylureas and nateglinide. J Endocrinol, 2006.190(3): p. 889-96.

70. Holz, G.G., Epac: A new cAMP-binding protein in support of glucagon-like peptide-1 receptor-mediated signal transduction in the pancreatic beta-cell. Diabetes, 2004. 53(1): p. 5-13.

71. Holz, G.G., New insights concerning the glucose-dependent insulin secretagogue action of glucagon-like peptide-1 in pancreatic beta-cells. Horm Metab Res, 2004. 36(11-12): p. 787-94.

72. Akiba, S. and T. Sato, Cellular function of calcium-independent phospholipase A2. Biol Pharm Bull, 2004. 27(8): p. 1174-8.

73. Ramanadham, S., et al., Islet complex lipids: involvement in the actions of group VIA calcium-independent phospholipase A(2) in beta-cells. Diabetes, 2004. 53 Suppl 1: p. S179-85.

74. Chakraborti, S., Phospholipase A(2) isoforms: a perspective. Cell Signal, 2003. 15(7): p: 637-65.

75. Balsinde, J., M.V. Winstead, and E.A. Dennis, Phospholipase A(2) regulation of arachidonic acid mobilization. FEBS Lett, 2002. 531(1): p. 2-6.

76. Wolf, B.A., S.M. Pasquale, and J. Turk, Free fatty acid accumulation in secretagogue-stimulated pancreatic islets and effects of arachidonate on depolarization-induced insulin sécrétion. Biochemistry,,1991. 30(26): p. 6372-9.

77. Guenifi, A., et al., Carbachol restores insulin release in diabetic GK rat islets by mechanisms largely involving hydrolysis of diacylglycerol and direct interaction with the exocytotic machinery. Pancreas, 2001. 22(2): p. 164-71.

78. Metz, S.A., Exogenous arachidonic acid promotes insulin release from intact or permeabilized rat islets by dual mechanisms. Putative activation of Ca2+ mobilization and protein kinase C. Diabetes, 1988. 37(11): p. 1453-69.

79. Knutson, K.L. and M. Hoenig, Regulation of distinct pools of protein kinase C delta in beta cells. J Cell Biochem, 1996. 60(1): p. 130-8.

80. Persaud, S.J., et al., The role of arachidonic acid and its metabolites in insulin secretion from human islets of langerhans. Diabetes, 2007. 56(1): p. 197-203.

81. Efendic, S., et al., Two generations of insulinotropic imidazoline compounds. Diabetes, 2002. 51 Suppl 3: p. S448-54.

82. Sharoyko, V.V., et al., Arachidonic acid signaling is involved in the mechanism of imidazoline-induced KATP channel-independent stimulation of insulin secretion. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(22): p. 2985-93.

83. Gembal, M., P. Gilon, and J.C. Henquin, Evidence that glucose can control insulin release independently from its action on ATP-sensitive K+ channels in mouse B cells. J Clin Invest, 1992. 89(4): p. 1288-95.

84. Sekine, N., et al., Low lactate dehydrogenase and high mitochondrial glycerol phosphate dehydrogenase in pancreatic beta-cells. Potential role in nutrient sensing. J Biol Chem, 1994. 269(7): p. 4895-902.

85. Malmgren, S., et al., Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem; 2009: 284(47): p. 32395-404.

86. Farfari, S., et al., Glucose-regulated anaplerosis and cataplerosis in pancreatic beta-cells: possible implication of a pyruvate/citrate shuttle in insulin secretion. Diabetes, 2000. 49(5): p. 718-26.

87. Fransson; U., et al., Anaplerosis via pyruvate carboxylase is required for the fuel-induced rise in the ATP:ADP ratio in rat pancreatic islets. Diabetologia, 2006. 49(7): p. 1578-86.

88. Lu, D., et al., 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated-insulin secretion (GSIS). Proc Natl* Acad Sci USA, 2002. 99(5): p. 2708-13.

89. Jensen, M.V., et al., Compensatory responses to pyruvate carboxylase suppression in islet beta-cells. Preservation of glucose-stimulated insulin secretion. J Biol Chem, 2006. 281(31): p. 22342-51.

90. Hasan, N.M., et al., Impaired anaplerosis and insulin secretion in insulinoma cells caused by small interfering RNA-mediated suppression of pyruvate carboxylase. J Biol Chem, 2008. 283(42): p. 28048-59.

91. Liu, Y.Q., T.L. Jetton, and J.L. Leahy, beta-Cell adaptation to insulin resistance. Increased pyruvate carboxylase and malate-pyruvate shuttle activity in islets of nondiabetic Zucker fatty rats. J Biol Chem, 2002: 277(42): p. 39163-8.

92. Sugden, M.C. and M.J. Holness, Recent advances in mechanisms regulating glucose oxidation at the level of the pyruvate dehydrogenase complex by PDKs. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003. 284(5): p. E855-62.

93. Sugden, M.C. andM.J. Holness, Therapeutic potential of the mammalian pyruvate dehydrogenase kinases in the prevention of hyperglycaemia. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord, 2002. 2(2): p. 151-65.

94. Gudi, R., et al., Diversity of the pyruvate dehydrogenase kinase gene family in humans. J Biol Chem, 1995. 270(48): p. 28989-94.

95. Rowles, J., et al., Cloning and characterization ofPDK4 on 7q21.3 encoding a fourth pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme in human. J Biol Chem, 1996. 271(37): p. 22376-82.

96. Xu, J., et al., Regulation ofPDK mRNA by high fatty acid and glucose in pancreatic islets. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 344(3): p. 827-33.

97. Cline, G.W., et al., 13C NMR isotopomer analysis of anapleroticpathways in INS-1 cells. J Biol Chem, 2004. 279(43): p. 44370-5.

98. Zhou, Y.P., et al., Deficiency of pyruvate dehydrogenase activity in pancreatic islets of diabetic GK rats. Endocrinology, 1995.136(8): p. 3546-51.

99. Zhou, Y.P., P.'Os Berggren, andV. Grill, At fatty acid-induced decrease in pyruvate dehydrogenase activity is an important determinant of beta-cell dysfunction in the obese diabetic db/db mouse. Diabetes, 1996. 45(5): p. 580-6.

100. Goto, Y., I. Nonaka, and S. Horai, A mutation in the tRNA(Leu)(UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies. Nature, 1990. 348(6302): p. 651-3.

101. Silva, J.P., et al., Impaired insulin secretion and beta-cell loss in tissue-specific knockout mice with mitochondrial diabetes. Nat Genet, 2000. 26(3): p. 336-40.

102. Ek, J., et al., Mutation analysis of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 (PGC-1) and relationships of identified amino acid polymorphisms to Type II diabetes mellitus. Diabetologia, 2001. 44(12): p. 22206.

103. Ling, C., et al., Epigenetic regulation of PPARGG1A in human type 2 diabetic islets and effect on insulin secretion. Diabetologia, 2008. 51(4): p. 615-22.

104. Ling, C., et al., Genetic and epigenetic factors are associated with expression of respiratory chain component NDUFB6 in human skeletal muscle. J Clin Invest, 2007.117(11): p. 3427-35.

105. Mootha, V.K., et al., PGC-1 alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nat Genet, 2003. 34(3): p. 267-73.

106. Patti, M:E., et al., Coordinated reduction of genes of oxidative metabolism in humans with insulin-resistance and diabetes: Potential role ofPGCl and NRF1. Proc Natl Acad Sei USA, 2003.100(14): p. 8466-71.

107. Ronn, T., et al., Age influences DNA methylation and gene expression ofCOX7Al in human skeletal muscle. Diabetologia, 2008. 51(7): p. 1159-68.

108. Ronn, T., et al., Genetic variation in ATPSO is associated with skeletal muscle ATP50 mRNA expression and glucose uptake in young twins. PLoS One, 2009. 4(3): p. e4793.

109. Scarpulla, R.C., Transcriptional paradigms in mammalian mitochondrial biogenesis and function. Physiol Rev, 2008. 88(2): p. 611-38.

110. Falkenberg, M., et al., Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA. Nat Genet, 2002. 31(3): p. 289-94.

111. Litonin; D., et al., Human mitochondrial transcription revisited: only TFAM and TFB2M are required for transcription of the mitochondrial genes in vitro. J Biol Chem. 285(24): p. 18129-33.

112. Metodiev, M:D., et al., Methylation of 12S rRNA is necessary for in vivo stability of the small subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Cell Metab, 2009. 9(4): p. 386-97.

113. Sologub, M., et al., TFB2 is a transient component of the catalytic site of the human mitochondrial RNA polymerase. Cell, 2009.139(5): p. 934-44.

114. Wang, G.L., et al., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension. Proc Natl Acad Sei USA, 1995. 92(12): p. 5510-4.

115. Jiang, B.H., et al., Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor I. J Biol Chem, 1996. 271(30): p. 17771-8'.

116. Forsythe, J.A., et al., Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor I. Mol CellBiol, 1996.16(9): p. 460413.137138,139,140,141142,143,144,145;146.147.148,149.150.151.

117. Epstein, A.C., et al., C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell, 2001.107(1): p. 43-54.

118. Haddad, J.J. and S.C. Land, A non-hypoxic, ROS-sensitive pathway mediates TNF-alpha-dependent regulation of HIF-1 alpha. FEBS Lett, 2001. 505(2): p. 269-74.

119. Efendic, S., E. Cerasi, and R. Luft, Effect of phentolamine andpreperfusion with glucose on insulin release from the isolated perfused pancreas from fasted and fed rats. Diabetologia, 1975.11(5): p. 407-10.

120. Ostenson, C.G., et al., Alpha-adrenoceptors and insulin release from pancreatic islets of normal and diabetic rats. Am J Physiol, 1989. 257(3 Pt 1): p. E439-43.

121. Ostenson, C.G., et al., Alpha 2-adrenoceptor blockade does not enhance glucose-induced insulin release in normal subjects or patients with noninsulin-dependent diabetes. J Clin Endocrinol Metab, 1988. 67(5): p. 1054-9.

122. Schulz, A. and A. Hasselblatt, Dual action of Clonidine on insulin release: suppression, but stimulation when alpha 2-adrenoceptors are blocked. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1989. 340(6): p. 712-4.

123. Schulz, A. and A. Hasselblatt, An insulin-releasing property of imidazoline derivatives is not limited to compounds that block alpha-adrenoceptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1989: 340(3): p. 321-7.

124. Chan, S.L., Role of alpha 2-adrenoceptors and imidazoline-binding sites in the control of insulin secretion. Clin Sci(Lond), 1993: 85(6): p. 671-7.

125. Chan, S.L., et al., The imidazoline site involved in control of insulin secretion: characteristics that distinguish it from 11- and 12-sites. Br J Pharmacol, 1994. 112(4): p. 1065-70.

126. Jonas, J.C., T.D. Plant, and J:C. Henquin; Imidazoline antagonists of alpha 2-adrenoceptors increase insulin release in vitro by inhibiting ATP-sensitive K+ channels in pancreatic beta-cells. Br P Pharmacol; .1992.107(1): p. 8^14.

127. Proks, P. and F.M. Ashcroft, Phentolamine block ofKATP channels is mediated by Kir6.2. Proc Natl AcadSci USA, 1997. 94(21): p: 11716-20.

128. Chan, S:L., et al., The alpha 2-adrenoceptor antagonist efaroxan modulates K+ATP channels in insulin-secreting cells. Eur J Pharmacol, 1991. 204(1): p. 418.

129. Rustenbeck, I., et al., Imidazoline/guanidinium binding sites and their relation to inhibition ofK(ATP) channels in pancreatic B-cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol; 1997. 356(3): p. 410-7.

130. Zaitsev, S.V., et al., Imidazoline compounds stimulate insulin release by inhibition ofK(ATP) channels and interaction with the exocytotic machinery. Diabetes, 1996. 45(11): p. 1610-8.

131. Efanov, A.M., et al., Signaling and sites of interaction for RX-871024 and sulfonylurea in the stimulation of insulin release. Am J Physiol, 1998. 274(4 Pt 1): p. E751-7.

132. Eliasson, L., et al., PKC-dependent stimulation of exocytosis by sulfonylureas in pancreatic beta cells. Science, 1996. 271(5250): p. 813-5.r

133. Chan, S.L., et al., Identification of the monomeric G-protein, Rhes, as an efaroxan-regulated protein in the pancreatic beta-cell. Br J Pharmacol, 2002. 136(1): p. 31-6.

134. Olmos, G., J. Ribera, and J. A. Garcia-Sevilla, Imidazoli(di)ne compounds interact with the phencyclidine site ofNMDA receptors in the rat brain. Eur J Pharmacol,1996. 310(2-3): p. 273-6.

135. Chan, S.L., et al., Evidence that the ability of imidazoline compounds to stimulate insulin secretion is not due to interaction with sigma receptors. Eur J Pharmacol,1997. 323(2-3): p. 241-4.

136. Yoon, J.W. and H:S. Jun, Cellular and molecular pathogenic mechanisms of insulin-dependent diabetes mellitus. Ann N Y Acad Sci, 2001. 928: p. 200-11.

137. Mauricio, D. andT. Mandrup-Poulsen, Apoptosis and the pathogenesis oflDDM: a question of life and death. Diabetes, 1998. 47(10): p. 1537-43.

138. Maedler, K., et al., Glucose-induced beta cell production oflL-lbeta contributes to glucotoxicity in human pancreatic islets. J Clin Invest, 2002.110(6): p. 851-60.

139. Corbett, JiA., et al., Nitric oxide mediates cytokine-induced inhibition of insulin secretion by human islets of Langerhans. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(5): p. 1731-5.

140. Chong, M.M., H.E. Thomas, and T.W. Kay, Suppressor of cytokine signaling-1 regulates the sensitivity of pancreatic beta cells to tumor necrosis factor. J Biol Chem, 2002. 277(31): p. 27945-52.

141. Hoorens, A., et al., Distinction between interleukin-1-induced necrosis and apoptosis of islet cells. Diabetes, 2001. 50(3): p. 551-7.

142. Wu, J J., et al., Cytokine-induced metabolic dysfunction ofMIN6 beta cells is nitric oxide independent. J Surg Res, 2001.101(2): p. 190-5.

143. Dupraz, P., et al., Dominant negative MyD88 proteins inhibit interleukin-1 beta /interferon-gamma -mediated induction of nuclear factor kappa B-dependent nitrite production and apoptosis in beta cells. J Biol Chem, 2000. 275(48): p. 37672-8.

144. Saldeen, J., Cytokines induce both necrosis and apoptosis via a cotnmon Bcl-2-inhibitable pathway in rat insulin-producing cells. Endocrinology, 2000.141(6): p. 2003-10.

145. Cetkovic-Cvrlje, M. and D.L. Eizirik, TNF-alpha and IFN-gamma potentiate the deleterious effects ofIL-1 beta on mouse pancreatic islets mainly via generation of nitric oxide. Cytokine, 1994. 6(4): p. 399-406.

146. Piro, S., et al., Bovine islets are less susceptible than human islets to damage by human cytokines. Transplantation, 2001. 71(1): p. 21-6.

147. Hadjivassiliou, V., et al., Insulin secretion, DNA damage, and apoptosis in human and rat islets of Langerhans following exposure to nitric oxide, peroxynitrite, and cytokines. Nitric Oxide, 1998. 2(6): p. 429-41.

148. Zaitsev, S.V., et al., Imidazoline compounds protect against interleukin lbeta-induced beta-cell apoptosis. Diabetes, 2001. 50 Suppl 1: p. S70-6.

149. Van de Casteele, M., et al., Specific expression ofBax-omega in pancreatic beta-cells is down-regulated by cytokines before the onset of apoptosis. Endocrinology, 2002.143(1): p. 320-6.

150. Zumsteg, U., S. Frigerio, and G.A. Hollander, Nitric oxide production and Fas surface expression mediate two independent pathways of cytokine-induced murine beta-cell damage. Diabetes, 2000. 49(1): p. 39-47.

151. Delaney, C.A., et al., Cytokines induce deoxyribonucleic acid strand breaks and apoptosis in human pancreatic islet cells. Endocrinology, 1997.138(6): p. 26104.

152. Liu, D., et al., Cytokines induce apoptosis in beta-cells isolated from mice lacking the inducible isoform of nitric oxide synthase (iNOS-/-). Diabetes, 2000. 49(7): p. 1116-22.

153. Berlin, I., et al., Reduction of hyperglycemia after oral glucose load by the new alpha 2-adrenergic receptor antagonist SL 84.0418 in healthy subjects. Clin Pharmacol Ther, 1994. 55(3): p. 338-45:

154. Cui, X., et al., Akt Signals Upstream ofL-Type Calcium Channels to Optimize Insulin Secretion. Pancreas, 2011.

155. Cechin, S.R., et al., Anti-Inflammatory Properties ofExenatide in Human Pancreatic Islets. Cell Transplant, 2011.

156. Wijesekara, N., et al., Adiponectin-induced ERK and Akt phosphorylation protects against pancreatic beta cell apoptosis and increases insulin gene expression and secretion. J Biol Chem, 2010. 285(44): p. 33623-31.

157. Widenmaier, S.B., et al., Noncanonical activation of Akt/protein kinase B in {betaj-cells by the incretin hormone glucose-dependent insulinotropic polypeptide. J Biol Chem, 2009. 284(16): p. 10764-73.

158. Wang, H., et al., EGF regulates survivin stability through the Raf-l/ERKpathway in insulin-secreting pancreatic beta-cells. BMC Mol Biol, 2010.11: p. 66.

159. Mori, H., et al., Suppression ofSOCS3 expression in the pancreatic beta-cell leads to resistance to type 1 diabetes. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 359(4): p. 952-8.

160. Bellido-Martin, L. and P.G. de Frutos, Vitamin K-dependent actions of Gas6. VitamHorm, 2008. 78: p. 185-209.

161. Huang, M., et al., Structural basis of membrane binding by Gla domains of vitamin K-dependent proteins. Nat Struct Biol, 2003.10(9): p. 751-6.

162. Stenflo, J., et al., Vitamin K dependent modifications of glutamic acid residues in prothrombin. Proc Natl Acad Sci USA, 1974. 71(7): p. 2730-3.

163. Balogh, I., et al., Analysis ofGas6 in human platelets and plasma. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2005. 25(6): p. 1280-6.

164. Cavet, M.E., et al., Gas6-axl receptor signaling is regulated by glucose in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2008. 28(5): p;886.91, /

165. Chen, J., K. Carey, and P.J. Godowski, Identification of Gas6 as a ligand for Mer, a neural cell adhesion molecule related receptor tyrosine kinase implicated in cellular transformation. Oncogene, 1997.14(17): p. 2033-9.

166. Nagata, K., et al., Identification of the product of growth arrest-specific gene 6 as a common ligand for Axl, Sky, and Mer receptor tyrosine kinases. J Biol Chem, 1996. 271(47): p. 30022-7.

167. Fisher, P.W., et alA novel site contributing to growth-arrest-specific gene 6 binding to its receptors as revealed by a human monoclonal antibody. Biochem J, 2005. 387(Pt3):p. 727-35.

168. Hafizi, S . and B ; Dahlback, Gas6 and protein S: Vitamin K-dependent ligandsfor the Axl receptor tyrosine kinase subfamily. FEBS J, 2006. 273(23): p. 5231-44.

169. Melaragno, M.G., Y.W. Fridell, and B.C. Berk, The Gas6/Axl system: a novel regulator of vascular cell function. Trends Cardiovasc Med, 1999. 9(8): p. 250-3.

170. Shankar, S.L., et al., The growth arrest-specific gene product Gas6 promotes the survival of human oligodendrocytes via a phosphatidylinositol3-kinase-dependent pathway. J Neurosci, 2003; 23(10): p. 4208-18:

171. Lemke, G. and C.V. Rothlin, Immunobiology of the TAM receptors.- Nat Rev Immunol, 2008. 8(5): p. 327-36. ; '

172. Augustine; K.A., et al., Noninsulin-dependent diabetes mellitus occurs in mice ectopically expressing the human Axl tyrosine kinase receptor. J Cell Physiol, 1999.181(3): p. 433-47.

173. Maquoi, E., et al., Role ofGas-6 in adipogenesis and nutritionally induced adipose tissue development in mice. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2005. 25(5): p. 1002-7.

174. Saxena, R., et al., Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels. Science, 2007. 316(5829): p. 1331-6.

175. Eriksson, J.G., et al., Patterns of growth among children who later develop type 2 diabetes or its risk factors. Diabetologia, 2006. 49(12): p. 2853-8.

176. Stancakova, A., et al., Changes in insulin sensitivity and insulin release in relation to glycemia and glucose tolerance in 6,414 Finnish men. Diabetes, 2009. 58(5): p. 1212-21.

177. Lyssenko, V., The transcription factor 7-like 2 gene and increased risk of type 2 diabetes: an update. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2008.11(4): p. 385-92.

178. Berglund, G., et al., Long-term outcome of the Malmo preventive project: mortality and cardiovascular morbidity. J Intern Med, 2000. 247(1): p. 19-29:

179. Lyssenko, V., et al., Clinical risk factors, DNA variants, and the development of type 2 diabetes. N Engl J Med, 2008. 359(21): p. 2220-32.

180. Poulsen, P., et al., Age-dependent impact of zygosity and birth weight on insulin secretion and insulin action in twins. Diabetologia, 2002. 45(12): p. 1649-57.

181. Postic, C., et al., Dual roles for glucokinase in glucose homeostasis as determined by liver and pancreatic beta cell-specific gene knock-outs using Cre recombinase. J Biol Chem, 1999. 274(1): p. 305-15.

182. Fex, M., et al., Rat insulin promoter 2-Cre recombinase mice bred onto a pure C57BU6J background exhibit unaltered glucose tolerance. J4Endocrinol, 2007. 194(3): p. 551-5.

183. Lacy, P.E. 'and M. Kostianovsky, Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes, 1967.16(1): p. 35-9.

184. Sharoyko, V.V., et al., Monomeric G-protein, Rhes, is not an imidazoline-regulated protein in pancreatic beta-cells. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 338(3): p. 1455-9.

185. Lernmark, A., The preparation of and studies on, free cell suspensions from mouse pancreatic islets. Diabetologia, 1974.10(5): p. 431-8.

186. Simonsson, E., S. Karlsson, and B. Ahren, Ca2+-independentphospholipase A2 contributes to the insulinotropic action of cholecystokinin-8 in rat islets: dissociation from the mechanism ofcarbachol. Diabetes, 1998. 47(9): p. 1436-43.

187. Rabilloud, T., Mitochondrial proteomics : analysis of a whole mitochondrial extract with two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol, 2008. 432: p. 83-100.

188. Szuhai, K., et al., Simultaneous A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy number quantification in myoclonus epilepsy and ragged-red fibers

189. MERRF) syndrome by a multiplex molecular beacon based real-time fluorescence PCR. Nucleic Acids Res, 2001. 29(3): p. E13.

190. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

191. Jagerbrink, T., et al., Differential protein expression in pancreatic islets after treatment with an imidazoline compound. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(10): p. 1310-6.

192. Krus, U., et al., Pyruvate dehydrogenase kinase 1 controls mitochondrial metabolism and insulin secretion in INS-1 832/13 clonal beta-cells. Biochem J, 2010. 429(1): p. 205-13.

193. Hirose, H., et al., Defective fatty acid-mediated beta-cell compensation in Zucker diabetic fatty rats. Pathogenic implications for obesity-dependent diabetes. JjBiol Chem, 1996. 271(10): p. 5633-7.

194. Kozma, L., et al., The ras signaling pathway mimics insulin action on glucose transporter translocation. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(10): p. 4460-4.

195. Malaisse, W.J., et al., 3-O-methyl-D-glucose transport in tumoral insulin-producing cells. Am J Physiol, 1986. 251(6 Pt 1): p. C841-6.

196. Birch-Machin, M'.A. and D.M. Turnbull, Assaying mitochondrial respiratory complex activity in mitochondria isolated from human cells and tissues. Methods Cell Biol, 2001. 65: p. 97-117.

197. Zeqiraj, E., et al., ATP and M025alpha regulate the conformational state of the STRADalpha pseudokinase and activation of the LKB1 tumour suppressor. PLoS Biol, 2009. 7(6): p. el000126.

198. Wibom, R., L. Hagenfeldt, andU. vonDobeln, Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Anal Biochem, 2002. 311(2): p. 139-51.

199. Zaitseva, II, et al., RX871024 reduces NO production but does not protect against pancreatic beta-cell death induced by proinflammatory cytokines. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 347(4): p. 1121-8.

200. Zaitseva, II, et al., Suppressor of cytokine signaling-1 inhibits caspase activation and protects from cytokine-induced beta cell death. Cell Mol Life Sci, 2009. 66(23): p. 3787-95.

201. Jeppsson, J.O., et al., Approved IFCC reference method for the measurement of HbAlc in human blood. Clin Chem Lab Med, 2002. 40(1): p. 78-89.

202. Matsuda, M. and R.A. DeFronzo, Insulin sensitivity indices obtained from oral glucose tolerance testing: comparison with the euglycemic insulin clamp. Diabetes Care, 1999:22(9): p. 1462-70:

203. Hanson, R.L., et al., Evaluation of simple indices of insulin sensitivity and insulin secretion for use in epidemiologic studies. Am J Epidemiol, 2000.151(2): p. 1908.

204. Montanya, E. and N. Tellez, Pancreatic remodeling: beta-cell apoptosis, proliferation and neogenesis, and the measurement of beta-cell mass and of individual beta-cell size. Methods Mol Biol, 2009. 560: p. 137-58.

205. Suzuki, K., et al., A method for estimating number and mass of islets transplanted within a membrane device. Cell Transplant, 1996. 5(6): p. 613-25.

206. Nitert, M.D., et al., CaV1.2 rather than GaV1.3 is coupled to glucose-stimulated insulin secretion in INS-1 832/13 cells. J Mol Endocrinol, 2008. 41(1): p. 1-11.

207. Hohmeier, H.E.; et al., Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes, 2000. 49(3): p, 424-30.

208. Minami, K., et al., Insulinsecretion and differentialgene expressionin glucose-responsive and -unresponsive MIN6 sublines. AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2000. 279(4): p. E773-81.

209. Eto, K., et al., Role ofNADH shuttle system in glucose-induced activation of mitochondrial metabolism and insulin secretion. Science, 1999. 283(5404): p. 981-5.

210. Koukourakis, M.I., et al., Pyruvate dehydrogenase andpyruvate dehydrogenase kinase expression in поп small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia, 2005. 7(1): p. 1-6. • .,'

211. Nicholls, D;G^ Mitochondrial membrane potential and,aging. Aging Cell; 2004.-3(1): p. 35-40.249; Warburg, O:, On the origin of cancer cells. Science, 1956. 123(3191):. p. 309-14.

212. Gribble, F.M., Intolerant of glucose and gasping for oxygen. Nat Med;: 2009; 15(3): p. 247-9;

213. Ishihara, Hi, et al., Overexpressionofmonocarboxylate transporter and lactatedehydrogenase alters insulin secretory responses to pyruvate and lactate in beta cells. J Clin Invest, 1999.104(11): p. 1621-9.

214. Zhao, C. and G.A. Rutter, Over expression of lactate dehydrogenase A attenuates glucose-induced insulin secretion in stable MIN-6 beta-cell lines. FEBS Lett, 1998. 430(3): p: 213-6. .

215. В. Шаройко, ЪЗИ.^Экспрессня некоторых генов энергетического метаболизма, в панкреатических островках человека коррелирует с уровнемгликозипированного гемоглобина. Дальневосточный медицинский журнал., 2009(4): р. 32-37.

216. Salpeter, S.J., et al., Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development, 2010.137(19): p. 3205-13.

217. Blanchet, E., et al., E2F transcription facto r-1 regulates oxidative metabolism. Nat Cell Biol, 2011.

218. Blondel, O., et al., Creation of an inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ga2+ store in secretory granules of insulin-producing cells. J Biol Chem, 1994. 269(44): p. 27167-70.

219. Wang, C., et al., Glucose inhibits GABArelease by pancreatic beta-cells through an increase in GABA shunt activity. AmJJPhysiolEndöcrinollMetab; 2006. 290(3): p. E494-9.

220. Bailey, S.J., M.A. Ravier, and;G.A. Rutter, Glucose-dependent regulation of gamma-aminobutyric acid (GABA A) receptor expression in mouse pancreatic islet alpha-cells. Diabetes, 2007. 56(2): p. 320-7.

221. Ligon, B;, et al., Regulation of pancreatic islet cell survival and replication by gamma-aminobutyric aaV/.Diabetologia, 2007. 50(4): p. 764-73.264. . Mole, D.R., et al., 2-oxoglutarate analogue inhibitors of HIE prolyl hydroxylase.

222. Bioorg Med Chem Lett, 2003.13(16): p: 2677-80.265; MacKenzie, E.D., et alt, Cell-permeating alpha-ketoglütarate derivatives alleviate pseudohypoxia in succinate dehydrogenase-deficientcells. Mol Cell Biol, 2007. 27(9): p. 3282-9.

223. Metz, S.A., J.B. Halter, and R.P. Robertson, Paradoxical inhibition of insulin secretion by glucose in human diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab, 1979: 48(5): p. 827-35.

224. Portha, B., et al., Beta-cell insensitivity to glucose in the GK rat, a spontaneous nonobese model for type II.diabetes. Diabetes, 1991. 40(4): p. 486-91.

225. Ohneda, Mi, et al., GLUT2 expression andfunction in beta-cells of GK.rats with NIDDMi Dissociation between reductions in glucose transport and glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes, 1993. 42(7): p. 1065-72.

226. Ostenson, C.G., A. Khan, and^^Si Efendic, Impaired glucose-induced insulin secretion: studies.in animal models with spontaneous NIDDM. Adv Exp Med Biol, 1993.334: p. 1-11.

227. Tsuura, Y., et al., Glucose sensitivity of ATP-sensitive K+ channels is impaired in beta-cells of the GK rat. A new genetic model ofNIDDM. Diabetes, 1993. 42(10): p. 1446-53.

228. Fernandez-Alvarez, J., et al., Enzymatic, metabolic and secretory patterns in human islets of type 2 (non-insulin-dependent) diabetic patients. Diabétologia, 1994. 37(2): p. 177-81.

229. MacDonald, M.J., J. Tang, and K.S. Polonsky, Low mitochondrial glycerol phosphate dehydrogenase and pyruvate carboxylase in pancreatic islets of Zucker diabetic fatty rats. Diabetes, 1996. 45(11): p. 1626-30.

230. Ling, Z.C., etGlucose metabolism in Goto-Kakizaki rat islets. Endocrinology, 1998.139(6): p. 2670-5.

231. Giroix, M:H., C. Saulnier, and B: "Porth^Decreasedpancreatic islet response to L-leucine in the spontaneously diabetic GK rat: enzymatic, metabolic and secretory data. Diabétologia, 1999. 42(8): p. 965-77.

232. Gunton, J.E., et al., Loss of ARNT/HIFÏbetà mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in Human type 2 diabetes. Cell, 2005.122(3): p. 33749. y

233. Watkins, D:T. and M. Moore, Uptake ofNADPH by islet secretion granule membranes. Endocrinology, 1977.100(5): p. 1461-7.

234. Pongratz, R.L., et al'., Gytosolic and mitochondrial malic enzyme isoformsdifferentially control insulin secretion. JCBioBCKem; 2007. 282(1): p. 200-7.

235. Thorsness, P.E. and D.E. Koshland, Jr., Inactivation of isocitrate dehydrogenase by phosphorylation is mediated by the negative charge of the phosphate. J Biol Chem, 1987. 262(22): p. 10422-5.

236. Patterson, G.H., et al., Separation of the glucose-stimulated cytoplasmic and mitochondrial NAD(P)H responses in pancreatic islet beta cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(10): p. 5203-7.

237. MacDonald, M.J., Estimates of glycolysis, pyruvate (decarboxylation, pentose phosphate pathway, and methyl succinate metabolism in incapacitated pancreatic islets. Arch Biochem Biophys, 1993. 305(2): p. 205-14.

238. Ammon, H.P. and J. Steinke, 6-Amnionicotinamide (6-AN) as a diabetogenic agent. In vitro and in vivo studies in the rat. Diabetes, 1972. 21(3): p. 143-8.

239. Bender, K., et al., Over expression of the malate-aspartate NADH shuttle member Aralarl in the clonal beta-cell line BRIN-BD11 enhances amino-acid-stimulated insulin secretion and cell metabolism. Clin Sci (Lond), 2009.117(9): p. 321-30.

240. Odegaard, M.L., et al., The mitochondrial 2-oxoglutarate carrier is part of a metabolic pathway that mediates glucose- and glutamine-stimulated insulin secretion. J Biol Chem, 2010. 285(22): p. 16530-7.

241. Rubi, В., et al., The malate-aspartate NADH shuttle member Aralarl determines glucose metabolic fate, mitochondrial activity, and insulin secretion in beta cells. J Biol Chem, 2004. 279(53): p. 55659-66.

242. Майоров, Состояние инсулинорезистентности в эволюции сахарного диабета 2 типа. Автореферат дисс. на соискание уч. ст. док.-ра мед.наук, 2007(Москва): р. 59.

243. Korotchkina, L.G. and M.S. Patel, Site specificity of four pyruvate dehydrogenase kinase isoenzymes toward the three phosphorylation sites of human pyruvate dehydrogenase. J Biol Chem, 2001. 276(40): p. 37223-9.

244. Wu, P., et al., Starvation and diabetes increase the amount of pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme 4 in rat heart. Biochem J, 1998. 329 ( Pt 1): p. 197-201.

245. Spriet, L.L., et al., Pyruvate dehydrogenase activation and kinase expression in human skeletal muscle during fasting. J Appl Physiol, 2004. 96(6): p. 2082-7.

246. Bowker-Kinley, M.M., et al., Evidence for existence of tissue-specific regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex. Biochem J, 1998. 329 ( Pt 1): p. 191-6.

247. В. Шаройко, E.JI., E. Чуркина, В. Чуркин. , Физиолого-биохимические механизмы инсулин-секреторной дисфункции ¡З-клеток островков поджелудочной железы. Медицинский академический журнал., 2010. 5(10): р. 69.

248. Chomyn, A., Mitochondrial genetic control of assembly and junction of complex I in mammalian cells. J Bioenerg Biomembr, 2001. 33(3): p. 251-7.

249. Perales-Clemente, E., et al., Five entry points of the mitochondrially encoded subunits in mammalian complex I assembly. Mol Cell Biol. 30(12): p. 3038-47.300301302303304305306307308309310,311.312,313.314.315,

250. Kelley, D.E., et al., Dysfunction of mitochondria in human skeletal in type2 diabetes. Diabetes, 2002. 51(10): p. 2944-50.

251. Zeggini, E., et al., Meta-analysis of genome-wide association data an<z£ large-scale replication identifies additional susceptibility loci for type 2 diabetes. ZESJat Genet, 2008. 40(5): p. 638-45.

252. Miyashita, A., et al., Genetic association ofCTNNA3 with late-onset A^Xzheimer'sdisease infernales. Hum-Mol Genet, 2007.16(23): p. 2854-69.

253. Rimol, L.M., et al'., Sex-dependent association of common variants ofmicrocephaly genes with brain structure. Proc Natl Acad Sei USA, 20 XO.107(1): p. 384-8.

254. Joyner, A.H., et al., A common MECP2 haplotype associates with redtscc^^d. cortical surface area in humans in two independent populations. Proc 2>3atl Acad Sei USA, 2009.106(36): p. 15483-8.

255. Galimberti, D., et al., Gender-specific influence of the chromosome 1(5 ¿^Hemokme gene cluster on the susceptibility to Multiple Sclerosis. J>Neurol Sei, 2008. 267(1-2): p. 86-90:

256. Ling, C., et al., Multiple environmental and genetic factors influence skeletal muscle PGC-lalpha and PGC-lbeta gene expression in twins. J Clin Invest, 2004.114(10): p. 1518-26.

257. Ritov, V.B., et al., Deficiency of subsarcolemmal mitochondria in obesity and type 2 diabetes. Diabetes, 2005. 54(1): p. 8-14.

258. Gauthier, B.R., et al., PDX1 deficiency causes mitochondrial dysfunction and defective insulin secretion through TFAM suppression. Cell Metab, 2009.10(2): p. 110-8.

259. Chan, S.L., M. Mourtada, and N.G. Morgan; Characterization of a KATP channel-independent pathway involved in potentiation of insulin secretion by efaroxan. Diabetes, 2001. 50(2): p. 340-7.

260. Shiota, C., et al., Sulfonylurea receptor type 1 knock-out mice have intact feeding-stimulated insulin secretion despite marked impairment in their response to glucose. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37176-83.

261. Zerangue, N., et al., A new ER trafficking signal regulates the subunit stoichiometry of plasma membrane K(ATP) channels. Neuron; 1999. 22(3): p. 537-48.

262. Seghers, V., et al., Surl knockout mice. A model for K(ATP) channel-independent regulation of insulin secretion. J Biol Chem, 2000. 275(13): p. 9270-7.

263. Separovic, D., M. Kester, and P. Ernsberger, Coupling of II-imidazoline receptors to diacylglyceride accumulation in PC12 rat pheochromocytoma cells. Mol Pharmacol, 1996. 49(4): p. 668-75.

264. Separovic, D., et al., Activation of phosphatidylcholine-selective phospholipase C by II-imidazoline receptors in PC12 cells and rostral ventrolateral medulla. Brain Res, 1997. 749(2): p. 335-9.

265. Munk, S.A., et al., Synthesis and pharmacologic evaluation of2-endo-amino-3-exo-isopropylbicyclo2.2.1.heptane: a potent imidazoline 1 receptor specific agent. J Med Chem, 1996. 39(6): p. 1193-5.

266. Efanov, A.M., et al., Imidazoline RX871024 raises diacylglycerol levels in rat pancreatic islets. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 281(5): p: 1070-3.

267. Doyle, M.E. and J.M. Egan, Mechanisms of action of glucagon-like peptide 1 in the pancreas. Pharmacol Ther, 2007.113(3): p. 546-93.

268. В. Шаройко, В.Ч., Б. Кершенгольц., г (А МФ-GEFII-Rim2 путь в К+-канал -независимом механизме инсулинотропной активности нового имидазолинового соединения. Сибирский медицинский журнал., 2010(3): р. 48-51.

269. Needleman, P., et al.,' Arachidonic acid metabolism. Annu Rev Biochem, 1986. 55: p. 69-102.

270. Jones, P.M. and S J. Persaud, Arachidonic acid as a second messenger in glucose-induced insulin secretion from pancreatic beta-cells. J Endocrinol, 1993:137(1):p. 7-14. • :'.■: . , ' '• '■ ; .

271. Peila, R., B.L. Rodriguez, and L.J. Launer, Type 2 diabetes, APOE gene, and the risk for dementia and related pathologies: The Honolulu-Asia Aging Study. Diabetes, 2002. 51(4): p. 1256-62;.

272. Solomon, S.S., et al., Proteome ofH-411E (liver) cells exposed to insulin and tumor necrosis factor-alpha: analysis of proteins involved in insulin resistance. J Lab Clin Med, 2005.145(5): p. 275-83.

273. Okazaki, K., et al., A role ofcalcyclin, a Ca(2+)-binding protein, on the Ca(2+)~ dependent insulin release from the pancreatic beta cell. J Biol Chem, 1994. 269(8): p. 6149-52.

274. Reddy, D., et al., Transfection and overexpression of the calcium binding protein calbindin-D28k results in a stimulatory effect on insulin synthesis in a rat beta cell line (RIN1046-38). Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(5): p. 1961-6.

275. Ohnishi, M., et al., Involvement ofannexin-I in glucose-induced insulin secretion in rat pancreatic islets. Endocrinology, 1995.136(6): p. 2421-6.

276. Shafqat, J., et al., Proteins in the insulin-secreting cell line MIN6 bind the imidazoline compound BL11282. FEBS Lett, 2008. 582(11): p. 1613-7.

277. Csermely, P., et al., The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol Ther,'1998. 79(2): p. 129-68.

278. Booth, C. and G.L. Koch, Perturbation of cellular calcium induces secretion of luminal ER proteins. Cell, 1989. 59(4): p. 729-37.

279. Dowling, P., et al., Proteomic screening of glucose-responsive and glucose non-responsive MIN-6 beta cells reveals differential expression of proteins involved in protein folding, secretion and oxidative stress. Proteomics, 2006. 6(24): p. 657887.

280. Gross, S.R. and T.G. Kinzy, Translation elongation factor 1A is essential for regulation of the actin cytoskeleton and cell morphology. Nat Struct Mol Biol, 2005.12(9): p. 772-8.

281. Lau, J., et al., Identification of elongation factor lalpha as a potential associated binding partner for Akt2. Mol Cell Biochem, 2006. 286(1-2): p. 17-22.

282. Bernal-Mizrachi, E., et al., Defective insulin secretion and increased susceptibility to experimental diabetes are induced by reduced Akt activity in pancreatic islet beta cells. J Clin Invest, 2004.114(7): p. 928-36.

283. Mandrup-Poulsen, T., Apoptotic signal transduction pathways in diabetes. Biochem Pharmacol, 2003. 66(8): p. 1433-40.

284. Storling, J., etal., Nitric oxide contributes to cytokine-induced apoptosis in pancreatic beta cells via potentiation ofJNK activity and inhibition ofAkt. Diabetologia, 2005. 48(10): p. 2039-50.

285. Larsen, C.M., et al., Interleukin-1 beta-induced rat pancreatic islet nitric oxide synthesis requires both the p38 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 mitogen-activatedprotein kinases. J Biol Chem, 1998. 273(24): p. 15294-300.

286. Suk, K., et al., IFNalpha sensitizes ME-180 human cervical cancer cells to TNFalpha-induced apoptosis by inhibiting cytoprotective NF-kappaB activation. FEBS Lett, 2001. 495(1-2): p. 66-70.

287. Flodstrom-Tullberg, Mv et al., Target cell expression of suppressor of cytokine signaling-! prevents diabetes in the NOD mouse. Diabetes, 2003. 52(1L): p; 2696700.

288. Storling, J., et al., Calcium has a permissive role in interleukin-1 beta-induced c-jun N-terminal kinase activation in insulin-secreting cells. Endocrinology, 2005. 146(7): p. 3026-36.

289. Mansell, A., et all, Suppressor of cytokine signaling 1} negatively regulatesTolllike receptor signaling by mediating Mai degradation. Nat Immunol, 2006. 7(2): p. 148-55.

290. Reed, J.G., Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol, 2000.157(5): p. 1415-30.