Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции мембранного потенциала клеток контактного эндотелия

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции мембранного потенциала клеток контактного эндотелия"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Бондаренко Олександр Іванович

УДК 577.352

МЕХАНІЗМИ РЕГУЛЯЦІЇ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦІАЛУ КЛІТИН ІНТАКТНОГО ЕНДОТЕЛІЮ

03.00.13-Фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЮ-1998

Робота виконана у відділі фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця

Науковий керівник: чл.-кор. НАН України, доктор медичних наук, професор

САҐАЧ Вадим Федорович

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України зав. відділом фізіології кровообігу

Оііційні опоненти:

доктор біологічних наук ВАСИЛЕНКО Дмитро Артурович Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України провідний науковий співробітник відділу фізіології руху

доктор медичних наук СОЛОВЙОВ Анатолій Іванович Інститут фармакології та токсикології АМН України головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії

Провідна установа: Національний медичний університет ім. 0.0. Богомоли кафедра фізіології, м. Киів.

Захист відбудеться $

1998 р. о -Іі- “ годи

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01. при Інституті фізіології і

О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології і

О.О.Богомольця НАН України за адресою:252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий

1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3.0.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми. Дослідження механізмів регуляції судинного тонусу є одним з найбільш важливих та актуальних розділів фізіології кровообігу. Необхідність вивчення даної проблеми обумовлена широким розповсюдженням захворювань серцево-сосудинної системи, в основі багатьох з яких має місце порушення функції ендотелія. Ендотеліальний моношар синтезує велику кількість біологічно активних речовин, які мають вплив як на інші типи клітин, так і на самі ендотеліальні клітини (ЕК). Продукція цих речовин в значній мірі стимулюється гуморальними стимулами.

Синтез та вивільнення ендотелієм багатьох метаболитів тісно пов’язані з підвищенням концентрації внутрішньоклітинного кальція [Ca2+]t. Відомо, що в ЕК відсутні потенціалзалежні кальцієві канали. Регуляція надходження іонів кальція в ендотелій в значній мірі здійснюється коливаннями мембранного потенціалу (МП), які змінюють електрохімічний градієнт для кальцію. Показано, що у збагаченому калієм розчині зменшується [Ca2+]j та пригнічуються кальцієві транзієнти, що виникають у відповідь на дію ендотелійзалежних вазоактивних речовин (Cannel & Sage, 198Э), а також пригнічується продукція ендотелієм оксиду азоту (II) (NO) (Luchoff & Busse, 1990). Встановлено, що надходження в ендотелій L-аргініну, що є субстратом для синтеза NO, також знаходиться в залежності від значень МП ЕК; це надходження посилюється під час гіперполяризації та послаблюється під час деполяризації (Bogle et al., 1996). Крім того, зміни МП ЕК завдяки наявності міоендотеліальних контактів безпосередньо можуть передаватися підлеглим гладеньком’язевим клітинам, впливаючи на їх тонус. Таким чином, МП ЕК є фактором, що в значній мірі обумовлює функціональну активність ЕК

Большість робіт, які присвячені дослідженню впливу вазоактивних речовин на електричні відповіді ЕК, виконано на культивованих або ізольованих клітинах. Реакції таких клітин можуть бути порушені внаслідок їх ферментативної обробки, самого процеса культивування, а також відсутності у них міжклітинних контактів (Marchenko & Sage, 1993). Відомо, наприклад, що ацетилхолін не викликає підвищення [Са 2+]І, електричних відповідей та вивільнення NO культивованими ЕК (Loeb et al., 1987). Тому найбільш адекватним підходом у вивченні механізмів впливу вазоактивних речовин на МП ЕК є застосування препаратів інтактного ендотелію, що дозволяє досліджувати електричні властивості ЕК в умовах,

найбільш наближених до фізіологічних. Дія вазоактивних речовин на ЕК, я відомо, супроводжується не тільки вивільненням внутрішньоклітинного кальціі та активацією надходження його ззовні, але й активацією Ыа+-Н+- обмінника, як веде ДО підвищення внутрішньоклітинного pH (рНі). Роль ЗМІН рНі електричних реакціях ЕК на теперішній час не досліджено. Клітини інтактног ендотелію є зручним об’єктом для дослідження залежності електричних реакці ЕК від активності На+-Н+ обмінника та змін pH], оскільки рНх ендотеліальног моношара в значно меншій мірі модифікується надходженням вміста мікропіпет в порівнянні з ізольованими клітинами.

Мета дослідження полягала у визначенні ролі різних видів іонне провідності в регуляції мембранного потенціалу клітин інтактного ендотелію умовах спокою, а також під впливом ендотелійзалежних вазоактивних речовин т змін pH.

Головні задачі:

1. Розробити методику реєстрації електричних реакцій інтактного ендотелія.

2. З'ясувати внесок різних видів іонної провідності в регуляції мембранног потенціалу нестимульованих та стимульованих агоністами ендотеліальних клітин.

3. З’ясувати роль змін рНі в регуляції мембранного потенціалу нестимульовани ендотеліальних клітин.

4. Дослідити залежність АТФ-індукованих електричних відповідей від змі внутрішньо- та зовнішньоклітинного pH (рН0).

5. Дослідити вплив агентів, що змінюють рНь на ендотелійзалежні скорочували реакції судинних смужок.

Наукова новизна одержаних результатів. З'ясовано, що у підтримань МП ЕК аорти морської свинки залучені натрієва, кальцієва та калієЕ провідності. Вперше показано, що зміни МП інтактних ЕК під впливом АТ< зумовлені активністю не тільки кальційзалежних калієвих та кальційпровідни каналів, а й натрійпровідних каналів. Припущено, що в інтактних ЕК присуті Р2Х -пуринорецептори. Вперше досліджено електричні реакції ендотелію під чг змін рНі та рНо, а також модуляцію АТФ-індукованих електричних відповіде змінами pH. Показано, що тривалість АТФ-індукованої гіперполяризації, яї залежить від надходження кальція в ендотелій, суттєво збільшується пр зниженні рНі- Зниження ж рНо призводило до протилежного ефекту. Показан»

іодулюючий вплив агентів, що змінюють рН„ на евдогелійзалежні скорочувальні «акції судинних смужок.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати (озволяють сформувати нові уявлення про механізми регуляції МП ЕК та у іерспективі нові підходи до корекції патологічних станів, що супроводжуються юрушенням функції ендотелій. Продемонстровано роль змін рНі та рН0, що іають місце при багатьох патологічних станах, в регуляції МП нестимульованих ігоністами ЕК та в АТФ-індукованих електричних відповідях ЕК.

Особистий внесок здобувана. Здобувачем особисто виконано

всю експериментальну частину. Здобувач брав активну участь у

обговоренні результатів дослідів та формулюванні висновків. Вперше здобувачем юказано залежність надходження кальцію в ендотелій від pHt та ¡характеризовано АТФ-івдуковані електричні відповіді інтактних ЕК. Чодернізацію установки, що дозволяє реєструвати електричні реакції судинних слітин та механічні реакції судинних смужок, було проведено за активною участю нж. I.A. Назарука.

Апробація дисертації. Основні положення роботи викладались та обговорювались на семинарах відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця (Київ, 1996, 1997), семинарі Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ (Київ, 1998), II Національному конгресі патофізіологів України (Київ, 1996), ХХХІІІ-му Міжнародному конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, 1997), засіданні сектору фізіології вісцеральних систем Інститута фізіології ім. О.О. Богомольця НАНУ (1998).

Публікації. За результатами роботи опубліковано чотири статті та тези двох доповідей.

Структура та обсяъ дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, заключения, висновків та списку використаних джерел з 133 найменувань. Роботу викладено на 120 сторінках та ілюстровано 27 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень. Експерименти проводились на морських свинках масою 300-350 г. Грудну аорту занурювали у насичений карбогеном (95% Оа + 5% С02 ) модифікований розчин Кребса наведеного нижче складу.

Аорту нарізали на кільцеві сегменти довжиною 3-4 мм. Перед експерименте сегмент розрізався і полоску фіксували в експериментальній камері ендотеліє догори об'ємом біля 100 мкл, яку перфузували розчином Кребса швидкістю 1 мл/хв. '

Електрофізіологічні вимірювання. МП відводили від інтактно) ендотелія аорти за допомогою методу петч-клемп у режимі фіксації стру» (Marchenko & Sage, 1993). Електричний контакт з цитозолем забезпечували : допомогою ністатину або амфотерицину Б, концентрація яких у піпетці склада.1 200 мкг/мл. Піпетки заповнювали розчином такого складу (мМ): КС1- 14 HEPES- 10, NaCl- 5, ЕГТА- 0,5, pH 7,3. Опір піпеток після заповнення складав 7 МОм. В деяких експериментах МП відводили від механічно ізольованої ендотелія. В цьому випадку інтима аорти механічно відокремлювалась від ме/ та у вигляді прозорої плівки фіксувалася в експериментальній камері.

Реєстрація механичних реакцій судинних смужок. Вимірювані скорочувальних реакцій смужок аорти проводилося у тій сам експериментальній камері, що і у випадку реєстрації МП. Для реєстраї механічної активності один кінець смужки фіксувався до гумового дна камери, інший чіплявся до гачка, з'єднаного з механотроном 6МХ-ЗС. Полосі навантажувалась вагою 10 мН. Після навантаження смужки експеримент проводилися через 30-40 хв. Електричні сигнали за допомоглю АЦП записували пам'яті комп'ютера з періодом дискретизації 100 мс, а також одночасі виводили на самописець Н3030-4. Подальша обробка сигналів проводилася : допомогою пакета програм Global Lab, версія 2.4 (Data Translation, Inc., СІЛА) Розчини. Базовим зовнішньоклітинним розчином, який застосовувався процесі ізолювання, очистки та зберігання аорти був модифікований розчг Кребса, що мав такий склад (мМ): NaCl-118,3; NaHC03 -25; KCl-4,7; MgSO 1,2; CaCl2-2,5; NaH2POt-l,2; глюкоза-11,1; NaH2P04 -1,2 , феноловий червони

0,02 ( pH після насичення карбогеном складав 7,4). Розчин на буфері тр готували за таким складом (у мМ): NaCl-125, KCl-4,7, MgS04-l,2; СаСІ2-2, глюкоза 11,1; тріс-НСІ-15 , тріс-Н3 Р04 -1,2, pH доводили до 7,4 :

допомогою тріс та насичували 100% 02- У безнатрієвому розчині Na< замінювали трісом. Внутрішньоклітинну алкалинізацію викликали додавані« у зовнішньоклітинний розчин 10 мМ NH4C1 (еквімолярна заміна NaCl) а< переключенням суперфузуючого розчину, насиченого 10% С02+ 90% 02, і

розчин на буфері тріс. У розчині, що насичувався 10% С02+ 90% 02, концентрацію NaHC03 доводили до 50 мМ (відповідно зменшуючи концентрацію NaCl). Внутрішньоклітинну ацидіфікацію індукували додаванням у зовнішньоклітинний розчин 20 мМ ацетата натрія (еквімолярна заміна NaCl), або переключенням розчину з тріс-буфером на модифікований розчин Кребса. В експериментах із змінами рНо НСІ додавався в суперфузат. У безкальцієвому розчині Са2+ еквімолярио замінювали на Mg^ із додаванням 0,5 мМ ЕГТА. Внутрішньоклітинний кальцій ЕК хелатували за допомогою преінкубації смужки в розчині Dulbecco's PBS (Sigma, США) з додаванням 1 мМ ЕГТА та 20 мкМ ВАРТА-АМ при 37° С протягом 25 хв.

Результати досліджень.

Роль різних видів іонної провідності в регуляції МП клітин нестиму льованого ендотелій. Вхідний опір інтактних ЕК був відносно низьким і звичайно дорівнював 30-70 МОм, що вказує на наявність між клітинами електричних контактів. Потенціал спокою ЕК складав в середньому -40,8 ± 4,3 мВ (п-108). В ЕК ідентифіковані чотири типи калієвих каналів: 1) калієві канали аномального випрямлення (Кга), що блокуються Ва2+ (100 мкМ), 2) АТФ-чутливі калієві (КАТР) канали, що блокуються глібенкламідом (100 нМ), 3) кальційзалежні калієві (Кс») канали, що блокуються ноксиустоксином (1 мкМ), тетраетіламмонієм (5 мМ) або тетрабутіламмонієм (5 мМ) та 4) потенціалзалежні калієві канали, що блокуються 4- амінопірідином (1 мМ). Для з'ясування ролі цих каналів в регуляції МП інтактних ЕК в нашій роботі застосовувалися вищенаведені блокатори. Суперфузія розчином, що містив 100 мкМ Ва2+, викликала деполяризацію ЕК в середньому від -53 ± 1,6 мВ до -44 ± 1,9 мВ (п=4). Деполяризація при додавнні у розчин Ва2+ (100 мкМ), спостерігалась тільки у тих клітин, які мали більш негативні значення МП, ніж -50 мВ (рис.1,А). Інші клітини не відповідали на суперфузію розчином, що містив 100 мкМ Ва2+. Це свідчить про те, що Кт-канали залучені у підтримання МП лише тих ЕК, що мають досить високі негативні значення МП. Суперфузія розчином, що містив TEA також вела до деполяризації ЕК, що дозволяє припустити залучення К^-каналів у підтримання МП ЕК. Ке* -канали можна також інгібувати (завдяки зниженню [Ca2+]j) зниженням надходження зовнішньоклігинмого Са2+ в ецдотелій. Відомо, що в умовах спокою має місце базальне надходження Са2+ в ЕК, яке забезпечує базальний рівень вивільнення

б

N0. У безкальцієвому розчині спостерігалась поступова деполяризація ЕК (від •38 ± 1,4 до -29 ±1,4 мВ; п=7). (рис.1,Б). Деполяризацію у безкальцієвом розчині можна пояснити усуненням базального надходження Са2+ в ЕК і, я наслідок, зменшенням активності Кс»- каналів. Блокатор потенціалзалежни: калієвих каналів 4-амінопірідин ( 2,0 мМ, п=3), а також блокатор КАТр-каналі глібенкламід (100 нМ) не викликали змін МП ЕК. Дані факти свідчать про те що ці типи калієвих каналів не вносять суттєвого вкладу в підтримання МП Е1 за нормальних умов. Оскільки значення МП спокою ЕК є досить далекими ві, калієвого рівноважного потенціалу, можна припустити, що у підтримання МП Е1 залучено не тільки Кш- та Кс,- канали. Суперфузія безнатрієвим розчином вел до гіперполяризації ЕК (середня амплітуда 6,3 ± 1,0 мВ ( п=10 ) (рис.1, В) Таким чином, можна зробити висновок, що в регуляцію МП нестимульовани: агоністами ЕК залучені КІЕ- та КСі- канали, а також кальцієва та натрієв провідності.

без кальцієвим розчином. В- зміни МП ЕК пі час суперфузії безнатрієвим розчином

АТФ-інду ковані електричні відповіді інтактних ЕК. Дослідження АТФ-індукованих електричних відповідей ЕК раніше проводилося головнш чином на культивованих ЕК. Було показано, що АТФ виклика гіперполяризацію ЕК (МеЬгке & Баиі, 1990), а також активацію Кса. каналі

(Sauve et al., 1988). Однак, на теперішній час дані про АТФ-індуковані електричні реакції інтактних ЕК практично відсутні. На рис. 2 зображені типові зміни МП інтактних ЕК при додаванні у розчин АТФ. У відповідь спостерігалась гіперполяризація клітин, перед якою могла спостерігатися фаза деполяризації амплітудою у декілька мВ (рис. 2 Б). Амплітуда гіперполяризації при

концентрації АТФ 100 мкМ складала в середньому 19,4 ± 1,8 мВ, (п=12). Цей параметр був концентраційно-залежним. В безкальцієвому розчині, а також у присутності 2 мМ Ni2+ тривалість АТФ-індукованої гіперполяризації скорочувалась (рис. 2, В), що збігається з даними, отриманими раніше. Досить часто у безкальцієвому розчині після гіперполяризації МП встановлювався на значеннях, менших за початкові (рис. 2, В). Подальше додавання кальцію у розчин викликало гіперполяризацію ЕК (до початкового рівня МП). Це свідчить про те, що надходження кальцію в ЕК веде до пролонгованої гіперполяризації. Після хелатування внутрішньоклітинного кальцію суперфузія 100 мкМ АТФ викликала деполяризацію ЕК амплітудою 4,7 + 0,5 мВ (п=7) (рис. З, А). В цих умовах у відсутності у розчині Са2+ та Na+ змін МП при стимуляції АТФ не спостерігалось (рис. З, Б). Таким чином, АТФ- індуковані електричні реакції інтактних ЕК відрізняються від реакцій культивованих клітин, в яких відсутня фаза Na+ -залежної деполяризації. Цей факт можна пояснити присутністю Р2х-пуринорецепторів в ЕК інтактних судин.

Наведені результати, таким чином, свідчать про тісний взаємозв'язок між МП

Em (mV)

за

А

r EGTA

-20-1 РГТД + ATP

ECTA 0Na+

-30

-40-

-401-

200 400

time (s)

loo -5Q0

350 tíme (s)

700

Рис.З. АТФ-індуковані зміни МП ЕК в умовах хелатування зовнішньо- та внутрішньоклітинного кальцію. A-у присутності Na+. Б- у відсутності Na+.

та [Са2+ ]j у ЕК. Початковий пік та" фаза плато гіперполяризації корелюють г двофазним підвищенням [Са2+ ]] у відповідь на АТФ. Можна дійти висновку, ще регуляція МП інтактних ЕК при стимуляції АТФ здійснюється активністю Кс» каналів, що забезпечує мембранну гіперполяризацію, а також Са2+- та Na+ ■ провідних каналів, які забезпечують, відповідно, пролонговану гілерполяризацік та деполяризацію.

Кофеїн- індуковані електричні відповіді інтактних ЕК. Добре відомо що в основі вивільнення кальцію з ендоплазматичного ретикулума ЕК під дієк АТФ та багатьох інших вазоактивних речовин лежить активації інозитолтрифосфат (ІР3 ) -чутливих кальцієвих каналів. Хоча нещодавно буле продемонстровано присутність в ЕК ріанодинчутливих внутрішньоклітинна кальцієвих депо, однак ріанодин, як і кофеїн, викликав лише незначн підвищення [Ca2+]¡ в культивованих (Corda et al., 1995) та свіжоізольованк: (Wang et al., 1995) ЕК. З іншого боку, відомо, що кофеїн викликаї ендотелійзалежне розслаблення ізольованих судин (Hatano et al., 1995), щі дозволяє передбачити присутність функціонально активних кофеїнчутливих деп< в нативних ЕК. Результати експерименів показали, що кофеїн (10 - 20 мМ викликав електричні реакції ЕК двох типів - гіперполяризацію (88 з 9! досліджених клітин) та деполяризацію (рис. 4, А, Б). Тип реакції знаходився : залежності від рівня МП. Гіперполяризація спостерігалась у клітинах, що малі середнє значення МП -35,3 ± 1,6 мВ (п=14), у -випадках відповЦ

делоляризаційного типу МП складав - 52,3 ± 1,6 мВ (п=11). Для виключення

Рис.4. Кофеїн-індуковані зміни МП ЕК.

можливого впливу електричних сигналів, що передаються до ендотелію від підлеглих гладеньких м'язів, інтиму аорти механічно відокремлювали від медії та МП відводили від ізольованого ендотелію. В цих випадках АТФ та кофеїн також викликали електричні реакції ЕК, що є доказом того, що АТФ- та кофеїн-

іццукована гіперполяризація інтактного ендотелію є наслідком вивільнення внутрішньоклітинного кальцію саме в ЕК, а не індукується внаслідок передачі сигналів від гладеньких м'язів. У присутності 25 мМ зовнішньоклітинного К+ аіталікація 10 мМ кофеіну не викликала змін МП ЕК. Послідовні аплікації АТФ та кофеїну в безкальцієвому розчині викликали послідовні електричні відповіді ЕК. Повторні аплікації цих агентів у безкальцієвому розчині викликали гіперполяризацію меншої амплитуди, або гіперполяризації не спостерігалося взагалі. Наступна суперфузія розчином, що містить Са2+, викликала

гіперполяризацію ЕК, яка відзеркалюе надходження Са2+ у клітини. Подальші апплікації АТФ та кофеіну в безкальцієвому розчині знову викликали гіперполяризаційні відповіді. Це є свідченням того, що АТФ- та кофеїн-індукована гіперполяризація є наслідком вивільнення внутрішньоклітинного Са 2* із відповідних депо та активації Кс»- каналів. Таким чином, можна зробити висновок про гетерогенність внутрішньоклітинних кальцієвих депо в ЕК і, відповідно, двох механізмів мобилізації внутрішньоклітинного кальцію - ІРз -залежного та ІР3 -незалежного.

Регуляція МП ЕК під час змін рН. Відомо, що стимуляція ЕК

рецептор-залежними стимулами і, зокрема, АТФ, супроводжується не тільки підвищенням в них [Са2+]і і змінами МП, але й активацією \та+ -Н+ обмінника і підвищенням рНі (Кйагопо еЬ аі., 1988). Зміни рНі ЕК спостерігаються також при гіпоксії (Роу еі аі., 1997) та механічних стимулах (Zeigelstem ек аі., 1993). Це

дозволяє припустити, що рНі поряд з [Са2+]£ є важливим фактором внутрішньоклітинної сигналізації ЕК. Для з'ясування можливої ролі змін рН в електричних відповідях ЕК нами було досліджено вплив агентів, що викликають зміни рНі, на МП ЕК. Додавання у розчин 10 мМ МН4СІ, тобто агента, що викликає внутрішньоклітинну алкалинізацію, вело до гіперполяризації ЕК середньою амплітудою 3,9 ± 0,6 мВ (п=21) (рис.5, А). Переключення

суперфузуючого розчину, насиченого 10% С02 +90% 02 , на розчин, що був насичений 100% 02 при незмінному рНо 7, 4, також викликало гіперполяризацію.

Рис.5. Модуляція МП ЕК внутрішньоклітинною алкалиніаацією. А- вплив №Ї4СІ на МП ЕК. Б'вплив послідовних аплікацій АТФ та КН4С1. В-відсутність гіперполяризації у відповідь на аплікацію ИН4С1 після попередньої аплікації кофеїна. Г-зменшення амплітуди кофеш-індукованої гіперполяризації після попередньої аплікації ЬЩ4СІ.

Як відомо, обидва згадані методи застосовуються для індукування внутрішньоклітинної алкалинізації. Це дає можливість зробити висновок, ще ефект, який спостерігається, не є специфічним для одного з агентів, і в основі змін МП в цих експериметах лежить саме підвищення рНі. ЬГН4С1-індукована гіперполяризація спостерігалась також у безкальцієвому розчині. В умоваг хелатування внутрішньоклітинного кальцію амплітуда КН4С1 -індуковано' гіперполяризації суттєво зменшувалась і складала в середньому 0,7±0,3 мВ, ще свідчить про залученім внутрішньоклітинного кальцію в електричні реакції у відповідь на підвищення рНі ЕК. Для з’ясування питання про існування

ремого рН-чутливого внутрішньоклітинного депо в ЕК, або залучення у аерацію відповіді на підвищення рНі ІР3- або ріанодинчутливих запасників Са2+, оводились наступні експерименти. Попередня аплікація 100 мкМ АТФ не ключала гіперполяризації у відповідь на МН4С1 (рис. 5, Б). Навпаки, після передньої апплікації кофеїна МН4СІ не викликав гіперполяризації ЕК (рис. 5,

І. Після попередньої аплікації МН4С1 кофеїн (10 мМ) викликав гіперполяризацію { меншої амплітуди (7,0 ±0,6 мВ, п=5), ніж в контролі (9,5 ± 0,6 мВ, п=8, =0,05) (рис. 5, Г). Одержані результати надають підстави припустити, що у :вільнення внутрішньоклітинного кальція під час підвищення рНі ЕК залучені реважно кофеїн-чутливих депо.

Відомо, що підвищення р^ ЕК у відповідь на дію вазоактивних речовин збувається завдяки активності Ма+-Н+-обмінника. В наступних експериментах ісліджувалась можлива роль змін рНі, а також активності Ма+-Н+-обміиника в ГФ- індукованих електричних відповідях ЕК. У безнатрієвому розчині, тобто за гов блокування активності згаданого обмінника, амплітуда гіперполяризації при перфузії 100 мкМ АТФ суттєво зменшувалась в той час як її тривалість ільшувалась. Для блокування На+-Н+-обмінника застосовували також фуросемід. гаерфузія судинної смужки розчином, що містив фуросемід (500 мкМ), не ¡кликала змін МП ЕК. У присутності фуросеміда тривалість АТФ-індукованої терполяризації у присутності Са2+суттєво збільшувалась (рис.6, А), в той час як безкальцієвому розчині довготривалої гіперполяризації у присутності фуросеміда ! спостерігалось (рис.6, Б). Це може пояснюватись тим, що в умовах блокування ї+ - Н^ -обмінника має місце посилення надходження Са2+ в ЕК. В присутності ;етата натрія тривалість АТФ-індукованої гіперполяризації також збільшувалась. іис.7, В). В присутності 10 мМ КТН4С1 тривалість АТФ-індукованої терполяризації зменшувалась (рис.6, Г). Таким чином, отримані результати ідчать про те, що внутрішньоклітинна ацидіфікація, викликана ацетатом натрія блокадою - Н+ -обмінника, подовжує АТФ-індуковану гіперполяризацію :аслідок стимуляції надходження зовнішньоклітинного кальція в ендотелій, іутрішньоклитинна алкалинізація справляє протилежний ефект. Ми дослідили кож модуляцію ендотелійзалежного розслаблення судинних смужок агентами, що іішоють рНі- Було установлено, що внутрішньоклітинна алкалинізація веде до мгнічення АТФ- індукованого розслаблення, в той час як ацидіфікація вела до льш тривалого розслаблення. Відомо, що зниження рН0 викликає вазодилятацію,

але роль ендотелію в цьому ефекті остаточна не з'ясовано (Aalkjaer & Post 1997). Тому чималий інтерес викликає також дослідження ролі зниження pH

регуляції МП ЕК. Суперфузія судинної смужки розчином Кребса із зниженим (6,9) та С02-НС03' буфером викликала деполяризацію ЕК в середньому на ±1,0 мВ (п=5). Після деполяризації у безкальцієвому розчині та встановлення 1

Рис.6. Модуляція АТФ-індукованих змін МП ЕК агентами, що змінюють рНі.

А,Б- АТФ- індукованих змін МП ЕК в присутності 500 мкМ фуросеміда; А- в розч що містить 2,5 мМ Са2+, Б- у безкальцієвому розчині. В- подовження тривалості А індукованої гіперполяризації в присутності 20 мМ ацетату натрія. Г- модуляція А індукованих змін МП ЕК в контрольних умовах (Ю та в присутності N1 (нормалізований вигляд).

АТР

Рис. 7. Модуляція АТФ-індукованих змін МП ЕК зовнішньоклітинною ацидіфікацієи А- pH середовища 7, 4. Б- pH середовища 6,9.

стаціонарному рівні суперфузія розчином з pH 6,9 не викликала змін МП.Такий ижг можна пояснити пригнічувальним впливом ацидіфікації на базальне дходження кальцію в ЕК. У розчині на тріс- буфері зниження pH до 6,9 не «зводило до змін МП ЕК. Подальша суперфузія розчином, що містив С02. З03" буфер при незмінному pH (6,9) викликала деполяризацію ЕК. Тривалість ГФ-індукованої гіперполяризації ЕК при pH 6,9 значно зменшувалась у рівнянні з контролем при pH 7,4 (рис. 7, А, Б). Оскільки тривалість АТФ-цукованої гіперполяризації відзеркалює надходження в ЕК Са2+^ можна «пустити, що воно пригнічується в умовах зниженого рН0. Таким чином, можна обити висновок, що як рНо, так і pHj є факторами, що модулюють МП ЕК.

Заключения.

В даній роботі було проведено дослідження основних механізмів регуляції МП ітин інтактного ендотелія в умовах спокою, стимуляції АТФ та кофеїном, та під ливом змін рН0 та pHj. Досліджено також вплив агентів, що змінюють pH], на дотелійзалежні скорочувальні реакції судинних смужок. Як відомо, АТФ, а кож зміни pH та pCOj є потужними факторами, що модулюють судинний тонус, іму, дослідження їх впливу на електричні відповіді різних типів судинних клітин зажливим у розумінні механізмів, що залучені в таку регуляцію.

В роботах, проведених раніше, показано, що потенціал спокою ЕК умовлений головним чином активністю К[Я каналів (Vaca & Possani, 1997). В тих експериментах іони Ва в низьких концентраціях, які є блокатором цих налів, викликали деполяризацію тільки тих клітин, які мають досить високі ачення МП (більш негативні, ніж - 50 мВ). У більшості ж клітин, що мають МП межах -ЗО - -40 мВ, Ва2+ не викликав амін МП, що може бути пов'язано з ісутністю Кін -каналів у цих клітинах. Фізіологічне значення таких відмінностей ж клітинами або їх групами на сьогодні не є зрозумілим. Із результатів наших сліджень можна зробити висновок, що рівень надходження Са 2+ в ЕК по налам витоку відносно великий і в умовах спокою має місце фонова активність ;а -каналів. Результати роботи свідчать також про те, що одним із факторів, який гулює базальне надходження Са 2+ в ЕК, є зміни pH, оскільки у безкальцієвому ізчині деполяризації при зниженні рН0 не спостерігалося. В роботі вперше ведено, що зміни МП інтактних ЕК під впливом АТФ зумовлені активністю не іьки кальційзалежних калієвих та кальційпровідних каналів, а й натрійпровідних

тільки кальційзалежних калієвих та кальційпровідних каналів, а й натрійпровідш каналів, що може бути пояснено присутністю Р2х-пуринорецепторів. Нами тако вперше продемонстровано, що підвищення рНі у відсутності взаємодії агоністів рецепторами плазматичної мембрани викликає гіперполяризацію ЕК внаслідс вивільнення внутрішньоклітинного кальцію із депо, чутливих до кофеїну. Буі встановлено, що зниження рНі за допомогою ацетата натрію, а також блокування Иа+-Н+ -обмінника пролонгує АТФ-індуковану гіперполяризацію, що, напевно, наслідком стимуляції надходження Са2+ в ЕК. Підвищення ж рНі має протилежні ефект. Це свідчить про важливу роль, яку відіграють зміни рНі в регуляї надходження кальцію в ендотелій, а також в розвитку еццотелійзалежні механічних реакціях судинних смужок. Результати дослідження свідчать про т що рН0 також є фактором, який модулює надходження кальція в ЕК. А. зниження рНо, навпаки, скорочувало тривалість АТФ- індукован гіперполяризації. На підставі отриманих результатів можна запропонувати таї схему регуляції МП ЕК (рис. 8). У підтримання МП залучені К,*- та Кт-

канали аномального випрямлення, Cateak -кальцієві канали витоку, ER ендоплазматичний ретикулум, NOS - NO синтаза, RyR - ріанодююві рецептори, ІР3 інозитолтрифосфатчутливі рецептори, CRAC - кальційпровідні канали, що активують вивільненням Са * із депо. CIF-фактор, що опосередковує активацію CRAC. Познач (+) - посилення реакції, позначка (-) - послаблення.

шали, а також натрієва та кальцієва провідності. Оскільки селективне зниження •Ґ], при підвищенні рС02 викликає деполяризацію, можна припустити,

0 саме зниження pHt пригнічує базальне надходження Са2+ в ЕК. Стимуляція 2х-пуринорецепторів веде до гіперполяризації ЕК внаслідок вивільнення іутрішньоклітинного кальцію із ІР3 - чутливих депо та стимуляції Км-каналів. ивільнення внутрішньоклітинного кальцію активує Icrac (від calcium release-:tivated current) - струм через кальційпровідні канали, які активуються івільненням внутрішньоклітинного кальцію із депо. Це забезпечує фазу плато перполяризації. АТФ активує також Р2х-пуринорецептори, що забезпечує фазу атрійзалежної деполяризації. Підвищення pHt внаслідок активації Na+-H^ 5мінника потенціює гіперполяризацію внаслідок вивільнення Са2+ із іутрішньоклітипних депо, чутливих до підвищення pHj , а також до [Са2+ ]L ктивація №+-Н+-обмінника та внутрішньоклітинна алкалинізація пригнічують ТФ-індуковане надходження кальція в ЕК, яке також пригнічується зниженням Н0. Таким чином, проведені дослідження показали роль різних видів іонної ровідності в регуляції МП інтактних ЕК, а також роль змін pHj та рН0 в одуляції електричних відповідей ЕК, що дозволяє розширити існуючи уявлення ро іонні механізми регуляції МП цих клітин.

ВИСНОВКИ

продемонстровано можливість застосування метода петч-клемп для вивчення іектрофізіологічних характеристик клітин інтактного ендотелія ізольованих гдин. Досліджені іонні механізми регуляції МП інтактних ендотеліальних клітин умовах спокою, а також при дії ендотелійзалежних вазоактивних речовин та яінах pH. '

1 регуляцію мембранного потенціалу нестимульованих агоністами ендотеліальних літин аорти морської свинки залучені калієва провідність, що забезпечена ктивністю кальційзалежних калієвих каналів та калієвих каналів аномального ипрямлення, а також натрієва та кальцієва провідності.

міни мембранного потенціалу інтактних ендотеліальних клітин, викликані дією ТФ, обумовлені активністю кальційзалежних калієвих каналів, яка забезпечує іперполяризацію мембрани, а також активністю кальцій- та натрійпровідних аналів, які забезпечують, відповідно, пролонговану гіперполяризацію та еполяризацію.

[оказана гетерогенність внутрішньоклітинних кальцієвих депо в інтактних вдотеліальних клітинах. При значеннях мембранного потенціалу менше -45 мВ офеїн викликає гіперполяризацію ендотеліальних клітин. При більш негативних

значеннях мембранного потенціалу кофеїн деполяризуе такі клітин Гіперполяризація обумовлена вивільненням кальція із кофеїн-чутливі внутрішньоклітинних депо і подальшою активацією кальційзалежних калієві каналів.

5і Алкалинізація цитозоля ендотеліальних клітин в результаті замії суперфузуючого розчину, насиченого газовою сумішшю з 10 % С02 , на такий, б не містив С02, а також за допомогою хлорида аммонія викликає гілерполяризац: ендотеліальних клітин, яка є наслідком вивільнення кальцію внутрішньоклітинних депо, чутливих до кофеїну. Ацидіфікація цитозо. переключенням суперфузуючого розчину що, не містив COj, на такий, що місті 5% С02, викликає деполяризацію ендотеліальних клітин.

6. Зовнішньоклітинна ацидіфікація та внутрішньоклітинна алкалинізація зменшую тривалість АТФ- індукованої гіперполяризації внаслідок пригнічення надходжен кальція в ендотелій.

7і Внутрішньоклітинна ацидіфікація під дією ацетата натрія або за допомогс блокування Na+ -Н+ -обмінника подовжують АТФ-індуковану гіперполяризац внаслідок збільшення надходженя зовнішньоклітинного кальція в ендотелій.

g. Внутрішньоклітинна алкалинізація пригнічує едотелійзалежне розслаблен судинних гладеньких м' язів.

9. Зовнішньо- та внутрішньоклітинна концентрація іонів водню є суттєвим факторе що модулює електричні реакції ендотеліальних клітин та ендотелійзалея скорочувальні реакції судинних гладеньких м'язів.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації:

1. Бондаренко А.И., Сагач В.Ф. Модуляция мембранного потенциала клет интактного эндотелия аорты морской свинки //Нейрофизиология.- 1996.- Т\ №6,- с.260-266.

2. Бондаренко А.И. Влияние ацидоза на мембранный потенциал эндотелиальк клеток аорты морской свинки// Нейрофизиология.- 1997.-т2Э.- №2.- с. 131-135

3. Бондаренко А.И., Сагач В.Ф. Кофенниндуцированные электрические отве клеток интактного эндотелия/ / Нейрофизиология.- 1997.-т.29.- №3.- с.198-204.

4. Бондаренко А.И., Сагач В.Ф. Модуляция мембранного потенциа эндотелиальных клеток аорты морской свинки внутриклеточв алкалинизацией// Нейрофизиология.- 1998,- т.30.-№2.-с.88-95.

5. Бондаренко 0.1., Сагач В.Ф. pH-залежна модуляція мембранного потенції ендотеліальних клітин// Фізіологічний журнал,- 1998.-t.44.-Ns3. с.57.

6. Bondarenko A.I, Sagach V.F. ATP- and caffeine- induced electrical responses of int; endothelium from guinea pig aorta//Abstracts of XXXIII International Congr of Physiological Sciences.- 1997.

ондаренко 0.1 Механізми регуляції мембранного потенціалу клітин ітактного ендотелію. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за іеціальністю 03.00.13-фізіологія людини та тварин.-Інститут фізіології ім. >. О. Богомольця НАН України, Київ, 1998.

В роботі досліджено роль різних видів іонної провідності в регуляції ембранного потенціалу (МП) ендотеліальних клітин (ЕК) інтактних судин в мовах спокою, а також під впливом ендотелійзалежних вазоактивних речовин та -гін pH. Показано, що зміни МП ЕК, викликані дією АТФ, обумовлені активністю s тільки кальційзалежних калієвих та кальційпровідних каналів, але й атрійпровідних каналів, яка забезпечує деполяризацію мембрани. Показано, що звнішньо- та внутрішньоклітинна концентрація іонів водню є фактором, що одулюе електричні реакції ЕК та ендотелійзалежні механічні реакції судинних таденьких м'язів. Встановлено, що алкалинізація цитозоля ЕК викликає перполяризацію, яка є наслідком вивільнення кальцію із внутрішньоклітинних это. Зовнішньоклітинна ацидіфікація та внутрішньоклітинна алкалинізація ченшують тривалість гіперполяризації ЕК під час стимуляції АТФ. нутрішньоклітинна ацидіфікація веде до більш тривалої гіперполяризації у дповідь на АТФ, що може бути пояснено стимуляцією надходження кальцію в К.

Ключові слова: інтактний ендотелій, іонна провідність, мембранний потенціал, їльцій, pH, АТФ.

ондаренко А.И. Механизмы регуляции мембранного потенциала клеток нтактного эндотелия. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по гециальности 03.00.13- физиология человека и животных.-Институт физиологии м. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1998.

В работе исследована роль различных видов ионной проводимости в регуляции гмбранного потенциала (МП) эндотелиальных клеток (ЭК) интактных сосудов в зловиях покоя, а также при действии эндотелийзазисимых вазоактивных веществ смещении pH. Изменения МП ЭК при действии АТФ обусловлены активностью г только кальцийзависимых и кальцийпроводящих каналов, но и атрийпро водящих каналов, которая обеспечивает деполяризацию мембраны, оказано, что вне- и внутриклеточная концентрация ионов водорода является актором, модулирующим электрические реакции ЭК и эндотелийзависимые гханические ответы сосудистых гладких мышц. Установлено, что алкалинизация ггозоля ЭК вызывает гиперполяризацию, которая является следствием освобождения кальция из внутриклеточных депо. Внеклеточная ацидификация и гутрикдеточная алкалинизация уменьшают длительность АТФ- индуцированной отерполяризации. Внутриклеточная ацидификация вызывает более длительную гперполяризацию при действии АТФ, что является следствием стимуляции хлупления кальция в ЭК.

Ключевые слова: интактный эндотелий, ионная проводимость, мембранный этенциал, кальций, pH, АТФ.

ondareriko A. I. Mechanisms of the membrane potential regulation in intact idothelial cells.-Manuscript.

Thesis for the candidate's degree by speciality 03.00.13.-Physiology of humans id animals.-Bogomolets Institute of Physiology of the National Academy of Sciences ' Ukraine, Kyiv, 1998.

The role of different types of ion conductances in regulation of the membr potential of endothelial cells of intact guinea pig aorta was studied under rest conditions, at stimulation by endothelium-dependent vasoactive substances and at changes in pHt and pH0 . Changes in the membrane potential under ATP stimulat are mediated by calcium-activated potassium channel activity, which contributes membrane hyperpolarization, and also by sodium- and calcium-conductive chann which contribute to initial depolarization and sustained hyperpolarizat

respectively. It was shown that extra- and intracellular [H+] is a significant fa< that modulate endothelial electrical responses and endothelial-dependent dilation vascular smooth muscles. Intracellular alkalinization induced endothe

hyperpolarization due to intracellular calcium release. Extracellular acidification intracellular alkalinization reduced the duration of ATP-induced hyperpolarizat The ATP-induced dilation of vascular strips was reduced by the procedi

alkalinizing the cytosol. Intracellular acidification made ATP-indi;

hyperpolarization longer due to prolongation of calcium entry into the endotheliur Key words: intact endothelium, ion conductances, membrane potential, calci pH, ATP.