Механизмы повреждения и защита нейронов головного мозга при экспериментальном моделировании ишемии

Стельмашук, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы повреждения и защита нейронов головного мозга при экспериментальном моделировании ишемии
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы повреждения и защита нейронов головного мозга при экспериментальном моделировании ишемии"

На правах рукописи

СТЕЛЬМАШУК ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТА НЕЙРОНОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ИШЕМИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2012

-8 НОЯ 2012

005054525

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научный центр неврологии" Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор биологических наук Хаспеков Леонид Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Александрова Мария Анатольевна

(лаб. экспериментальной нейробиологии ФГБУН Институт биологии разватия им. Н.К. Кольцова РАН, зав. лабораторией)

доктор биологических наук, профессор Савельев Сергей Вячеславович (отдел эмбриологии ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН, зав. отделом)

доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич

(отдел электронной микроскопии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, зав. отделом)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук

Защита состоится " д^/пЗ^/ил 2012 г. в {1/ ч. на заседании

диссертационного совета (Д 001.004.01) Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт морфологии человека" Российской академии медицинских наук.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН по адресу. 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

Автореферат разослан "_"_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

КуУЦ Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рост распространенности сосудистых заболеваний привел к увеличению частоты нарушений мозгового кровообращения, являющихся причиной смертности и инвалидизации трудоспособного населения (Суслина, Пирадов, 2008). Один из путей решения проблемы снижения повреждений и смертности от инсультов - изучение механизмов ишемии с помощью моделирования ее повреждающих факторов на животных и культивированных нейронах.

При нарушении кровоснабжения головного мозга возникает одновременный дефицит глюкозы и кислорода. Истощение запасов глюкозы ведет к снижению скорости гликолиза и, как следствие, к уменьшению поступления пирувата в цикл трикарбоновых кислот, протекающий в митохондриях, и к снижению генерации ими АТР. В результате кислородного голодания митохондрии клеток мозга в процессе окислительного фосфорилирования не могут эффективно использовать имеющиеся запасы энергетических субстратов, что ведет к накоплению лактата и развитию ацидоза (Katsura, et al., 1992), который является одним из факторов, повреждающих нейроны (Yermolaieva et al., 2004; Xiang et al., 2004; Xiong et al., 2004). Однако полной ясности в вопросе о характере влияния ацидоза на развитие гибели нейронов при ишемии пока нет.

В многочисленных исследованиях показано, что одним из важных патогенетических факторов повреждения нейронов при энергетическом дефиците является гиперстимуляция глутаматных рецепторов, связанная с внеклеточным накоплением глутамата, происходящим в результате нарушения энергозависимого обратного захвата глутамата нервными и глиальными клетками, а также активации митохондриальной глутаминазы (Huang and Hertz, 1994; Lipton, 1999; Guo et al., 2009). Гиперактивированные глутаматные рецепторы длительно удерживают в открытом состоянии управляемые ими ионные каналы, через которые в нейрон начинают избыточно поступать ионы Na+ и Са2+ и выходить в межклеточное пространство ионы К+. Деполяризация мембраны приводит к открытию потенциал-зависимых Са2+-каналов. Именно повышение внутриклеточной концентрации Са2+ запускает сложный каскад процессов, повреждающих нейроны при ряде патологических состояний головного мозга (Matute, 2010) и, в частности, в результате цитотоксического действия возбуждающих аминокислот (Choi, 1985). Избыток Са2+ накапливается в митохондриях, нарушая их нормальное функционирование (Isaev et al., 1994; Dirnagl et al., 1999; Kunz et al., 2010). Деструктивный эффект при нарушении ионного баланса в клетках и межклеточной среде в периоды кислородо-глюкозного дефицита и реперфузии усугубляется тем, что во время ишемии и в постишемический период снижается активность Na+/K+-ATPa3bi - важнейшей системы поддержания в клетках ионного гомеостаза (Kaur and Arora, 1994;

Mrsic-Pelcic et al., 2004). Исходя из этого, мы предположили возможность индукции толерантности нейронов к составляющим ишемического повреждения - апоптотичеекому стимулу и окислительному стрессу -транзиторным ингибированием Na+/K+-ATPa3bi. *

Как глюкозная, так и кислородо-глюкозная депривация сопровождаются снижением активности антиоксидантных систем (Homi et al., 2002; Singh et al., 2004; Jung et al., 2009), что в период реперфузии приводит к повышению образования свободных радикалов (Dirnagl et al., 199В; McGowan et al., 2006; Hernandez-Fonseca et al., 2008) и развитию окислитщьного стресса, который является важным патогенетическим фактором, усиливающим ишемическое повреждение нейронов. Известно, что митохондри£льная цепь транспорта электронов является основным источником активных' форм кислорода (АФК), которые даже в условиях нормального метаболизма генерируются митохондриями, а при кальциевой перегрузке, вызываемой ишемией и гипогликемией, их образование может значительно возрастать в результате снижения активности митохондриальных антиоксидаЬтов (Homi et al., 2002, Singh et al., 2004; Jung et al., 2009). Поэтому исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и защите от него в периоды кислородного и глюкозного дефицита, а также при реперфузии является особо актуальным. Особое внимание необходимо уделить поиску и тестированию антиоксидантов, направленных в митохондрии для удаления избытка свободных радикалов.

Важным направлением в исследовании ишемического и гипогликемического повреждения нейронов является изучение возможности использования нейронами отличных от глюкозы энергетических субстратов и в первую очередь глутамина, так как его концентрация, по сравнению с другими аминокислотами, в головном мозге довольно высока (Ашмарин с соавт. 1999), и он способен утилизироваться митохондриями (Peng et al., 2007). В настоящее время значение альтернативных глюкозе и пирувату энергетических субстратов в поддержании ионного баланса нейронов в патологических условиях мало изучено, а сохранение функциональной активности (Мембранного потенциала) митохондрий с помощью глутамина до наших исследований прямо показано не было. Этот пробел был в значительной степени восполнен данной диссертационной работой. Таким образом, выяснение значения митохондрий, кальциевой перегрузки нейронов при патологических состояниях головного мозга, их взаимосвязи и взаимозависимости является актуальным направлением исследования и требует использования различных экспериментальных моделей. Это позволит выделить ключевые звенья в механизмах повреждения нейронов и прогнозировать возможности фармакологической коррекции ишемических нейродеструктивных процессов.

отсутствием или низкой экспрессией рецепторов к возбуждающим медиаторам, а также незрелостью систем антиоксидантной защиты и поддержания ионного гомеостаза. Механизмы развития повреждений в зрелых и незрелых нейронах также могут существенно различаться. Так, при гипоксии/ишемии мозга новорожденных крыс апоптотическая гибель нейронов происходит в значительной степени с участием апоптоз-индуцирующего фактора, тогда как у взрослых животных апоптоз развивается по пути, связанному с активацией каспаз (Zhu et al., 2003). Однако знания о чувствительности нейронов различной нейрохимической зрелости к повреждающим факторам ишемии были отрывочны и фрагментарны, что требовало дальнейшего исследования.

Особый интерес представляет вопрос сопоставления морфологических и функциональных изменений митохондрий, а также их обратимости при энергетическом голодании.

Исходя из многоплановости повреждения нейронов при ишемии, ясно, что нельзя создать универсальный нейропротектор, поэтому поиск новых веществ с нейропротекторной активностью, которая реализуется в основных звеньях каскада повреждения нейронов (окислительный стресс, глутаматная токсичность, повреждение митохондрий), особо актуален. В работе исследовалось нескольких потенциальных нейропротекторов с сопоставлением их влияния на выживаемость нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro и in vivo.

Целью исследования явилось изучение внутриклеточных механизмов ишемических нейродеструктивных процессов, выяснение роли митохондрий, ионов кальция и цинка, глутамина, снижения активности Na7K+-ATPa3bi и проверка возможности эффективной защиты нейронов с помощью белково-пептидных комплексов и матохондриально-адресованных антиоксидантов.

Задачи исследования

1. Изучить и сопоставить морфологические ультраструктурные изменения митохондрий с их функциональным состоянием в культивированных зернистых нейронах мозжечка крыс при глкжозной депривации.

2. Выявить зависимость выживаемости зернистых нейронов мозжечка при действии глутамата, глюкозной депривации, окислительного стресса и ацидоза от сроков культивирования.

3. Исследовать роль митохондрий в изменении концентрации свободного внутриклеточного кальция при глюкозной депривации.

4. Выявить в культивированных нейронах механизм инициации окислительного стресса, вызванного паракватом (ингибиторный анализ).

5. Выяснить механизм гибели зернистых нейронов при закислении среды культивирования (ацидозе) путем сопоставления изменения уровня внутриклеточного кальция, цинка, функциональной активности митохондрий и экспрессии кислоточувствительных каналов, проницаемых для ионов Са2+ .

6. Исследовать роль глутамина в гибели нейронов, вызванной глюкозной депривацией, ацидозом, окислительным стрессом, а также митохондриальными ингибиторами (химическая гипоксия).

7. Изучить влияние умеренной транзиторной блокады Na7K+-ATPa3bi на выживаемость нейронов при действии окислительного стресса и индуктора апоптоза стауроспорина.

8. Исследовать внутриклеточную локализацию нового класса антиоксидантов и влияние предполагаемых нейропротекторов на выживаемость нейронов при действии повреждающих факторов ишемии in vitro (окислительный стресс и глутаматная токсичность) и на объем зоны повреждения при моделировании ишемии in vivo (фотоиндуцированный тромбоз или компрессионная ишемия).

Научная новизна исследования. Изучены внутриклеточные механизмы, ведущие к гибели нейронов при ишемии, на основе моделирования в глионейрональных культурах ее повреждающих факторов: цитотоксичности глутамата, ацидоза, окислительного стресса, глюкозной депривации, выявлении роли митохондрий, глутамина, ионов кальция и цинка и сопоставлении полученных данных in vitro и in vivo.

В результате работы получены новые фундаментальные данные, раскрывающие механизмы ишемических нейродеструктивных процессов и свидетельствующие об их тесной взаимосвязи с дисфункцией митохондрий и нарушением ионного баланса нейронов.

♦ Впервые установлено, что глутамат и глюкозная депривация культивированных зернистых нейронов мозжечка ведут к кальцийзависимому падению мембранного потенциала митохондрий этих клеток, которое при часовой глюкозной депривации было обратимым.

♦ При сопоставлении функциональной активности и ультраструктуры митохондрий нейронов впервые выявлено, что часовая глюкозная депривация ведет к снижению мембранного потенциала у всей популяции митохондрий, однако их морфология варьирует от полностью интактных до органелл с конденсированным матриксом или с локальными набуханиями и потерей крист.

♦ Впервые показано, что кальциевая перегрузка и снижение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации более выражено в зрелых зернистых нейронах, культивированных 7 суток.

♦ Обнаружено, что ингибирование митохондриальных функций (белковых комплексов цепи переноса электронов или АТРсинтазы, разобщение дыхания и фосфорилирования) в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы, но снижает уровень АФК культивированных нейронов.

♦ Выявлено, что в условиях глюкозной депривации глутамин поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует клеточной гибели, но потенцирует ее, если причиной повреждения нейронов является нарушение функционирования митохондрий.

♦ Открыт новый механизм гибели нейронов при закислении среды

культивирования. Незрелые зернистые нейроны мозжечка in vitro характеризуются низким уровнем экспрессии кислоточувствительных каналов (ASIC la), поэтому внеклеточный ацидоз сопровождается не повышением уровня внутриклеточного кальция в этих клетках, а его снижением. Токсическое действие ацидоза на такие культуры обусловлено повышением в цитоплазме нейронов уровня свободного цинка, что вызывает ингибирование первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и развитие окислительного стресса.

♦ Впервые показано, что шунтирование первого комплекса цепи переноса электронов митохондрий менадионом при действии параквата оказывает нейропротекторный эффект.

♦ Фармакологическое прекондиционирование (умеренная транзиторная блокада Na+/K+-ATPa3bi) препятствует гибели нейронов, вызванной окислительным стрессом и индуктором апоптоза стауроспорином;

♦ Белковый комплекс целлекс, аналог фактора роста нервов ГК-2 и новый класс митохондриально-адресованных антиоксиданов SkQ проявляют выраженные нейропротекторные свойства при моделировании ишемии in vitro и in vivo, повышая выживаемость культур и уменьшая объем зоны повреждения головного мозга.

Научно-практическое значение работы

Представленные данные оригинальны и приоритетны, они расширяют представления фундаментальной нейробиологии как о внутриклеточных механизмах ишемического повреждения мозга, так и возможностях повышения ишемической толерантности ЦНС. В ходе работы обнаружен новый механизм развития гибели незрелых нейронов, вызванной внеклеточным ацидозом, показана возможность обратимости процесса деэнергизации митохондрий при глюкозной депривации. Полученные в работе экспериментальные данные и теоретические выводы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, патофизиологии при обучении студентов биологических и медицинских специальностей.

Показанная эффективная коррекция ишемических повреждений белковым комплексом целлекс, пептидным аналогом фактора роста нервов ГК-2, митохондриально-аднесованными антиоксидантами семейства SkQ является экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных нейропротекторов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выживаемость зернистых нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro зависит от сроков культивирования: при глюкозной депривации и токсическом действии, опосредованном гиперактивацией глутаматных рецепторов, гибнет больший процент зрелых клеток-зерен, а при окислительном стрессе и ацидозе — незрелых.

2. При глюкозной депривации в культивированных зернистых нейронах мозжечка происходит увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция и падение мембранного потенциала митохондрий, которое не всегда сопровождается необратимым изменением их ультраструктуры. Деэнергизация большинства митохондрий является обратимой при короткой (1 ч) глюкозной депривации. Ингибирование комплексов цепи переноса электронов митохондрий в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы нейронов. Глутамин в условиях глюкозной депривации поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует их гибели, но потенцирует ее при нарушении функционирования митохондрий.

3. Нейроцитотоксическое действие ацидоза и параквата на культивированные зернистые нейроны мозжечка происходит с нарушением функционирования комплекса 1 цепи переноса электронов митохондрий, которое может корректироваться шунтированием этого комплекса менадионом. Гибель зернистых нейронов мозжечка при ацидозе происходит в результате повышения уровня цитоплазматического цинка.

4. Повысить выживаемость нейронов можно путем применения нейропротекторов - аналогов факторов роста или митохондриально-адресованными антиоксидантами, которые действуют на такие повреждающие факторы ишемии, как глутаматная токсичность или окислительный стресс.

Апробация диссертационного материала

международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 2м международном форуме по нанотехнологиям, научно-техническая секция "Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств" (Москва, 2009), VI и VII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2010, 2011), X конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), межлабораторной конференции отдела исследований мозга НЦН РАМН (2009, 2011), научной конференции НЦН РАМН (2010), семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (2012).

Внедрение в практику

Результаты исследования используются в учебном процессе при чтении лекций на кафедре клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, научно-исследовательской работе и при обучении студентов и аспирантов в лаборатории структуры и функции митохондрий НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, внедрены в практику исследований лаборатории ишемических повреждений мозга ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН.

Конкретное личное участие автора в получении результатов

Автору принадлежит определяющая роль в выработке цели исследования, постановке задач и обосновании путей их достижения, проведен анализ 535 источников литературы. Основная часть экспериментов, анализ и статистическая обработка результатов и формулировка на их основе выводов о механизмах повреждения нейронов выполнены лично автором.

По теме диссертации опубликовано 73 работы, в том числе 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ (15 в отечественных и 12 в зарубежных).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 280 страницах, построена по традиционному плану и состоит из 7 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы и список литературы, включающий 535 источников. Работа иллюстрирована 87 рисунками: диаграммами, фотографиями, схемами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали диссоциированные монослойные культуры (3-4 и 7-8 суток in vitro, DIV) клеток мозжечка 7-8-суточных крыс Вистар, полученных методом ферментно-механической диссоциации (Викторов с соавт., 1990, Лозиер с соавт., 2012). Конечная плотность клеток на субстрате 3-5 х103 клеток на мм2. На 2е сутки культивирования концентрацию К+ в среде повышали до 25 мМ, что оказывает трофическое действие на культивированные зернистые нейроны (КЗН) (Favaron et al., 1993). Для сравнения использовались диссоциированные культуры гиппокампа и новой коры (10-12 DIV) 17-18-суточных крысиных эмбрионов, выращенные в тех же условиях в бессывороточной нейробазальной среде с добавкой В-27 (Brewer, 1995). Прижизненное наблюдение проводили с помощью инвертированного микроскопа ("Olympus", Япония) и высокочувствительной цифровой камеры СС12. Воздействия веществ на культуры мозжечка выполнялись в сбалансированном солевом растворе, содержащем (в мМ): 154 NaCl, 25 KCl, 2,3 СаС12, 1 MgCl2 3,6 NaHC03, 0,35 Na2HP04, 5,6 глюкозы, 10 HEPES (pH 7,2-7,4). В исследовании было использовано свыше 2500 культур.

Ишемию головного мозга in vivo моделировали на 150 самцах массой 150-200 г под хлоралгидратным наркозом с помощью фотоиндуцированного тромбоза (Watson et al., 1985) или компрессии (40 мм рт. ст., 15 мин) участка коры головного мозга тефлоновым стержнем (Rosenorn and Diemer, 1982; Барсков и Викторов, 1994). Эксперименты на животных проводились совместно с к.м.н. Барсковым И.В. и д.б.н. Романовой Г.А. Ишемию in vitro моделировали с помощью факторов ишемического повреждения: эксайтотоксичности глутамата (Glu, 25-100 мкМ, 15 мин или 24 ч) и NMDA (50 мкМ, 15 мин), окислительного стресса, инициированного воздействием параквата (75-200 мкМ, 24 ч), или перекиси водорода (100 и 150 мкМ, 20 мин), химической гипоксии, вызванной путем нарушения клеточного дыхания ингибиторами цепи транспорта электронов митохондрий ротеноном (0,1-5 мкМ, 2 ч), 3-НПА (1 мМ, 20 ч), антимицином (0,1 мкМ, 90 мин) азидом натрия (1 мМ, 9 ч), глюкозной депривацией (ГД, 1-3, 24 ч, в растворе без глюкозы), закислением среды инкубации (30 мин, 3, 24 ч), индуктором апоптоза стауроспорином (100 нМ, 24 ч) или сочетанным воздействием различных повреждающих факторов.

Культуры фиксировали 5 мин, смесью спирта, формалина и ледяной уксусной кислоты в отношении 7:2:1 (ФСУ), соответственно (Лилли, 1969), и окрашивали 2-5% трипановым синим или ванадиевым гематоксилином (Викторов, 1990). Выживаемость КЗН определяли подсчетом количества интактных и поврежденных КЗН (темноокрашенных пикнотических ядер) или МТТ-методом по интенсивности превращения тетразолиум бромида в формазан. Для определения объема очага ишемического повреждения мозг экспериментальных животных фиксировали 24 ч фиксатором ФСУ на 7е сутки после операции, резали на вибратоме NVSLM1 World Precision Instruments с

шагом 100 мкм, окрашивали 0,2% раствором метилеиового синего, сканировали на слайд-приставке сканера Epson perfection VI00 PHOTO. Площадь ишемического повреждения измеряли с помощью программы анализа компьютерного изображения «Image J» в мм2, объем очага вычисляли по формуле цилиндра. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента или ANOVA (Bonferroni post test) и представляли в виде M±S.E.M. Защитный эффект нейропротекторов соотносили по коэффициенту эффективности защиты (КЭЗ) по формуле: КЭЗ(%)= 100x(VE-Vo)/Vo, где V0 -объем очага ишемического повреждения без коррекции, VE - объем очага ишемического повреждения с лечением.

Мембранный потенциал митохондрий (ДЧ'т) определяли с помощью окрашивания родамином 123 (Р123, 5 мкг/мл, 10 мин) или эфиром тетраметил родамина (ТМРЭ, 0,1-0,2 мкМ, 15 мин) (Johnson et al., 1981). Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и Zn2+ проводили при помощи флуоресцентных красителей Fluo-3 (или 4) AM и FluoZin-3 AM (5 мкМ, 30 мин), соответственно. Электронную микроскопию проводили по стандартной методике (Боголепов, 1976; Скибо, 1988) совместно с д.б.н. Р.Э. Узбековым. Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР, Quantitative real-time PCR) экспрессии мРНК ASIC la проводилась как описано в статье Прусса с соавторами (Pruss et al., 2008) совместно с Д. Фрайер и Ф. Мергенталером.

Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. Протокол исследования, выполняемого в рамках диссертационной работы, одобрен этическим комитетом ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН (протокол № 05/10 от 05.05.10).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Диссоциированные культуры зернистых нейронов мозжечка как

объект исследования механизмов ишемического повреждения нейронов

Нейронная популяция культур, полученных из мозжечка 7-8-суточных крыс, располагается на астроцитарном подслое и состоит практически из одного типа нейронов — зернистых клеток, которые можно легко идентифицировать как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровнях как небольшие округлые или овальные нейроны, большую часть тела которых занимает ядро, окруженное тонким ободком цитоплазмы, утолщающимся в местах отхождения отростков (рис. 1). Об этом свидетельствуют не только полученные нами данные, но и результаты работ других исследователей, показавших с помощью иммуноцитохимических методов, что нейронная популяция в таких культурах содержит до 95%

глутаматцептивными, так и глутаматергическими (Shepherd, 1979; Stone, 1979; Levi et al., 1988). Было показано, что у КЗН мозжечка NMDA-рецепторы экспрессируются между 5м и 8м сутками in vitro (Frandsen and Schousboe, 1990).

Поскольку глутамат играет исключительно

важную роль в ишемическом повреждении головного мозга, культивированные зернистые нейроны мозжечка, которые вырабатывают Glu и экспрессируют Glu рецепторы, а также морфологически и нейрохимически однородны, являются удобной и адекватной моделью для исследования клеточных и молекулярных механизмов церебральной ишемии.

Рис. 1. Ультраструктура зернистого нейрона мозжечка в культуре (7 DIV). Масштаб: А - 2 мкм, Б — 0,2 мкм.

зернистых нейронов (Gallo et al., 1982; McCaslin, Morgan, 1987), которые не только морфологически идентичны, но и нейрохимически гомогенны. Известно, что зернистые нейроны мозжечка являются как

КОНТРОЛЬ

ГЛУТАМАТ

о о. >s О) X

ф о.

со

J3 X

о о.

>s ф

X <1> J3

о.

от ф

v,' • V ' • 1: 1. ' ■ . . _ N : <

• С ь ■' г.: с.; ;/. : T-; w :J ■ f 1 iK jiï ' У' '""■y ' .... 1 _ LuäoOÄ "V* f4 ВВШМ 4 1 Vi.;',:.®i

з глутамат (цМ ) 0

глутамат {цМ ) О

Рис. 2. Токсическое действие Glu на КЗН в различные сроки культивирования. Живые культуры, светлое поле. Стрелками обозначены ядра погибших нейронов. Масштаб 10 мкм. * - р<0,05 по сравнению с контролем без Glu, для каждого столбца, п=45.

глутамат -

Рис. 3. Уровень внутриклеточного кальция в зернистых нейронах в контроле (А) и при действии глутамата (100 мкМ, 15 мин, Б). Живые культуры, 7 Д/К Масштаб 15 мкм. Уровень флуоресценции Пио 3 в зрелых (7-8 ОIV, В) или незрелых (3-4 ОЩ Г) КЗН. *-р<0,01, п =90.

Рис. 4. Живые зернистые нейроны, 8 DIV. А и В -контроль, Б и Г после действия глутамата (100 мкМ, 15 мин), А и Б - свечение Р123 в митохондриях зернистых нейронов, митохондрии без потенциала на мембране указаны стрелками. В и Г - фазовый контраст тех же клеток, соответственно. Масштаб 10 мкм.

Исследование механизмов патологических процессов, вызываемых ишемическим повреждением

культивированных нейронов

Механизмы цитотоксического повреждения нейронов

глутаматом

Степень цитотоксического эффекта Glu зависела от уровня морфохимической дифференцировки КЗН (рис. 2). После обработки токсической дозой глутамата (100 мкМ) в течение 24х часов в среде культивирования, почти все нейроны в зрелых культурах (7-8 DIV) погибали (выживает только 6,0±0,8% КЗН), в незрелых культурах (3-4 DIV) мостъ 96±3%), даже при 1 мМ Glu 24 ч выживало 90±3%. Концентрация

внутриклеточного кальция ([Са2+}), измеренная с использованием

флуоресцентного зонда Fluo-3, повышается при действии в течение 60 мин 100 мкМ Glu, как в молодых, так и зрелых КЗН (рис. 3). Однако относительное повышение [Ca2+]i в зрелых нейронах было почти в 2 раза выше, чем в незрелых (на 121 + 15 и 62+6%, соответственно). В

соответствии с этим для сравнительного исследования нейроцитотоксичности нами были выбраны эти сроки использования зрелых и незрелых КЗН.

Зрелые КЗН мозжечка быстро реагируют на кратковременное,

воздействие доз Glu. митохондрии накапливают 15-минутное

токсических В норме КЗН активно Р123. Однако воздействие

Рис. 5. Ультраструктурные изменения зернистого нейрона мозжечка (7 1)1 V) при действии глутамата (50 мкМ, 15 мин). Видны конденсированные митохондрии (указаны треугольниками),

митохондрии с отеком (стрелки), набухшие цистерны ЭПР и аппарата Гольджи (стрелки с чертой сверху). Масштаб А - 0,4 мкм, Б, В -0,2 мкм.

100 мкМ Glu в 7-8-суточных культурах ослабляет

накопление родамина

митохондриями и

инициирует отек

цитоплазмы нейронов, видимый в фазовом контрасте (рис. 4). Блокада канала, управляемого

NMDA подтипом Glu рецепторов, селективным неконкурентным антагонистом МК-801 (10 мкМ) полностью

предотвращала падение А*Рт и цитоплазматический отек КЗН, вызываемые Glu. С другой стороны,

ингибирование транспорта избытка Са2+ в митохондрии рутениевым красным (100 мкМ, 1 ч) сохраняло способность митохондрий активно накапливать Р123 при последующем действии Glu, т.е. препятствовало падению ДЧР™, значения которого были сравнимы с его значениями в митохондриях контрольных (не подвергнутых действию Glu) культур.

После кратковременной токсической обработки Glu происходили не только функциональные (падение АТт), но и значительные ультраструктурные нарушения митохондрий КЗН (рис. 5). В таких нейронах наблюдались митохондрии как с конденсированным матриксом, так и набухшие, со сниженной электронной плотностью, в которых большая часть крист была разрушена. Подобное набухание митохондрий, при котором сохраняется часть крист и мембран, или интенсивное набухание, заканчивающееся превращением органелл в вакуоли с электронно-прозрачным матриксом, отмечалась Боголеповым (1979) при исследовании гипоксических повреждений ткани мозга. Возможно, вначале происходит конденсация митохондрий, а затем наступает стадия их набухания и разрушения крист. Подобная динамика наблюдается при воздействии ингибиторов дыхательной цепи митохондрий

% А 100

• il

+глюкоза 5 мин 15 мин 30 мин 60 мин

-глюкоза

СО

з _|

и.

3" X

ш =г

о ф

о >

-е-

о -ю |-20 -30

+глюкоза 5 мин 15 мин 30 мин 60 мин Рис. 6. Динамика изменения /С а2*/, (флуоресценция !1ио-3, А) и АЧ>т (флуоресценция ТМРЭ, Б) в КЗН (7 при ГД. Изменения флуоресценции Пио-З и ТМРЭ были вычислены как: (1-1:[,)/1-\лИ10'Ц1, где 1-флуоресценция красителя в культурах клеток, инкубированных в растворе с глюкозой, а Р - в отсутствие глюкозы. * р<0,01. По оси абсцисс - продолжительность ГД.

% Б

(Полякова, 1991). Однако, возможно, что наличие в клетках конденсированных и набухших митохондрий может указывать на гетерогенность повреждения их популяции.

Таким образом, используя модель эксайтотоксического повреждения КЗН, мы показали, что при перегрузке цитоплазмы нейронов ионами кальция, вызванной гиперактивацией Glu рецепторов, избыток [Са2+]| электрогенно транспортируется в митохондрии, вызывая снижение ДТт, которое сопровождается повреждением их ультраструктуры. Токсическое действие глутамата на КЗН, развивающиеся в культуре 3-4 суток, гораздо менее выражено, чем на нейроны, развивающиеся в культуре более 7 суток.

Механизмы нейронов при

депривации

повреждения глюкозной

Глюкозная депривация (1 ч) в присутствии блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов (МК-801, 10 мкМ и NBQX, 10 мкМ), добавленных для исключения возможного действия эндогенного Glu, вызывала постепенное повышение в нейронах [Ca2+]i (рис. 6), регистрируемое с помощью флуоресцентного зонда Fluo-3. В то же время было обнаружено снижение Alfm после такой ГД (рис. 6). Кроме того, ГД вызывала усиление флуоресценции гидроэтидина в КЗН, что свидетельствовало об интенсивной продукции АФК. Блокада ионотропных Glu рецепторов их антагонистами (МК-801 и NBQX) не препятствовала возрастанию продукции АФК, которое, следовательно, не опосредуется активацией этих рецепторов. Известно, что митохондрии, как основные органеллы, генерирующие АФК и депонирующие ионы Са2+, транспортируемые в них за счет энергии A"Fm, играют важную роль в развитии окислительного стресса. В наших экспериментах ингибиторы комплексов дыхательной цепи I, III и IV (ротенон, антимицин А и азид натрия, соответственно), а также ингибитор АТР-синтазы олигомицин и

разобщитель окислительного фосфорилирования СССР (carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone), добавленные в раствор, лишенный глюкозы и содержащий МК-801 и NBQX, повышали [Ca2+]i и снижали продукцию АФК, что свидетельствует об участии митохондрий в регуляции этих показателей при ГД (табл. 1). Это может быть связано с прекращением электрогенного транспорта Са2+ в митохондрии и с выходом накопленного Са2+ из их матрикса, а также с более быстрым снижением уровня АТР.

Добавление при ГД в солевой раствор, содержащий МК-801 и NBQX, хелатора внутриклеточного кальция ВАРТА или ингибирование транспорта Са2+ в митохондрии рутениевым красным препятствовало индуцированным ГД повышению [Ca2+]i и усилению продукции АФК, что указывает на прямую зависимость гиперпродукции АФК от перегрузки КЗН ионами Са2+. Аналогичный эффект оказывал субстрат аэробной продукции АТР пируват (табл. 2). Пируват и рутениевый красный, добавленные в начале ГД в инкубационный раствор, содержащий МК-801 и NBQX, в значительной степени предотвращали снижение A^Fm и, таким образом, препятствовали деэнергизации митохондрий нейронов, вызываемой ГД (рис. 7).

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что 1 ч ГД вызывает значительное повышение [Ca2+]i при одновременном снижении Д^Рт. Однако даже через 24 часа после часовой ГД существенной гибели нейронов не происходит. Это может быть обусловлено обратимостью указанных выше изменений [Ca2+]i и Д*Рт.

Рис. 7. Изменение флуоресценции ТМРЭ (Л Ч'т, верхняя панель) и соответствующие

поля зрения в фазовом контрасте (нижняя панель) после 1 ч инкубации культур в растворе с глюкозой и без нее (ГД) в присутствии рутениевого красного (100 мкМ) и пирувата (10 мМ). Живые культуры, 7 01К Масштаб 20 мкм.

Таблица 1. Влияние митохондриальных ингибиторов на [Са2+/: и продукцию АФК в КЗН

при глюкозной депривации (ГД)

Обработка Флуоресценция Флуоресценция продукта

Пио-З, % окисления гидроэтидина, %

ГД 100±1* 100+5*

Контроль (с глюкозой) 42+1 32+4

ГД+ротенон 2 мкМ 328+34** 54+4**

ГД+антимицин А 0,054 мкг/мл 324+32** 39+3**

ГД+азид натрия 5 мМ 117+4** 52+4**

ГД + СССР 10 мкМ 347+29** 51+3**

ГД+ олигомицин 4 мкг/мл 155+9** 39+3**

* р<0,001, по сравнению с контролем, ** р<0,001 по сравнению с ГД, п=12.

Таблица 2. Влияние ВАРТА, рутениевого красного и пирувата на [Са2+1, и АФК при ГД

Обработка Флуоресценция Пио-З, % Флуоресценция продукта окисления гидроэтидина, %

Контроль 43±1 29±2

ГД 100±1* 100±1*

ГД + ВАРТА 0,05 мМ 69±2** 36±3**

ГД+рутениевый красный 0,1 мМ 58±2** 34±7**

ГД + пируват 10 мМ 44±3** 25±2**

*р<0,001 по сравнению с контролем, **р<0,001 по сравнению с ГД, п=12.

Повышение [Са24} при ГД (1 ч) в нейронах 3-4-суточных культур было менее выраженным по сравнению с нейронами в 7-8-суточных культурах и составляло, соответственно, 151±5 и 191±5% от исходного уровня. Вызванная ГД кальциевая перегрузка как в зрелых, так и в незрелых культурах была обратимой: восстановление нормального содержания глюкозы в среде инкубации полностью возвращало [Са2+]| к исходному уровню.

В нейронах незрелых культур после ГД (1 ч) ДУ,,, снижался до 65±2%, а зрелых — до 18±2% от исходного уровня. При восстановлении нормального содержания глюкозы ДЧ-1,,, незрелых КЗН полностью восстанавливался, тогда как в зрелых даже после 1 ч инкубации в растворе с восстановленной нормальной концентрацией глюкозы этот показатель был на 10±2% ниже исходного уровня. Поскольку изменения ДТ,,, и [Са2+} были наиболее выражены у зрелых нейронов, для исследования ультраструктуры нейронов при ГД мы использовали 7-8-суточные культуры.

В нейронах контрольных культур, инкубированных с глюкозой в течение 2х часов, при ультраструктурном исследовании выявлялись некрупные, округлые или немного вытянутые митохондрии, содержащие митохондриальный матрикс большей, по сравнению с окружающей цитоплазмой, электронной плотности (рис. 8). Популяция митохондрий как в контроле, так и при ГД, а также в период восстановления доступа глюкозы к клеткам содержит как нормальные митохондрии, так и митохондрии с электронноплотным матриксом (рис. 8, 9). Наиболее выраженным проявлением действия ГД являлось увеличение количества митохондрий с локальным

Рис. 8. Ультраструктура митохондрий культивированных зернистых нейронов после 2х часовой инкубации в сбалансированном солевом растворе, содержащем глюкозу. Клетки содержат как нормальные митохондрии (треугольник), так и митохондрии со слабо различимыми кристами (стрелка). Масштаб 0,2 мкм.

набуханием и разрушением крист. Так, нейроны контрольных культур содержали менее 5% митохондрий с локальными набуханиями, тогда как при ГД их количество увеличивалось до 12%. В остальных митохондриях после ГД кристы были видны менее отчетливо, чем в контроле. Этот период ГД соответствовал снижению A^Fm и повышению [Ca2+]i. В период восстановления доступа глюкозы к нейронам некоторые митохондрии в них оставались набухшими с локальной потерей крист, их число составляло в среднем 14% от всех исследованных митохондрий. Видимо, именно митохондрии с набуханиями и потерей крист не способны к восстановлению нормальной ультраструктуры, а снижение Л^Рт, вызванное ГД, в значительной мере обратимо и не приводит к значительным ультраструктурным изменениям. Эти данные коррелируют с выживаемостью нейронов через 24 ч после часовой ГД (86% от контроля).

Таким образом, впервые было показано, что несмотря на выраженную кальциевую перегрузку нейронов и снижение ATm при 1 ч ГД большая часть нейронов сохраняет жизнеспособность, а ультраструктура изменяется незначительно, несколько увеличивается лишь процент митохондрий с локальным набуханием и потерей крист. Это подтверждают полученные ранее данные о том, что высокий уровень [Ca2+]i, возникающий непосредственно после патологического воздействия, не обязательно является признаком последующей клеточной гибели (Dubinsky and Rothman, 1991). Возможно, что на первых этапах ГД снижение A4fm выполняет защитную функцию, предотвращая критическую аккумуляцию Са2+ в митохондриях, превышение которой приводит к их набуханию и деструкции, а в дальнейшем и к гибели нейронов.

■Гш

iMtir

В-'.*-«

I ЯЖ'.'

леж г г-«!'- .....

Ш- - Ш \\йЛ ■

Рис. 9. Ультраструктура митохондрий зернистых нейронов при ГД (1 ч, А, Б), и инкубированных 1 ч без глюкозы, а затем -1 час в таком же растворе, но с глюкозой (В, Г). Клетки содержит как неизмененные морфологически (А, В) митохондрии, так и измененные (Б, Г), с локальными набуханиями (треугольники) и конденсированную (стрелка). Масштаб 0,2 мкМ

Окислительный стресс

Цитотоксическое действие параквата на нейрохимически зрелые и незрелые культивированные зернистые нейроны и значение глутамина для развития цитотоксичности

Окислительный стресс инициировали паракватом, токсичность которого при попадании в нейрон опосредована интенсивной продукцией АФК (Gonzalez-Polo et al., 2004; Miranda-Contreras et al., 2005). Добавление в среду культивирования параквата (0,2 мМ) вызывало интенсивную гибель нейронов, при этом в течение 24х часов в зрелых и незрелых культурах выживало примерно одинаковое количество клеток (33±3% и 38±3%, соответственно). Присутствие в среде блокаторов ионотропных Glu рецепторов (МК-801 10 мкМ и CNQX 10 мкМ) почти полностью защищало КЗН от токсического действия параквата. В зрелых культурах выживало 82±3% клеток (с блокаторами без параквата - 85±2%), в незрелых - 88±2% (с блокаторами без параквата -

95±2%). Гибель клеток, индуцированная паракватом, происходила лишь тогда, когда среда инкубации содержала глутамин, из которого может синтезироваться Glu. Деструкции нейронов, индуцированной паракватом, в зрелых культурах препятствовал менадион (витамин КЗ).

Таким образом, мы впервые показали, что нейродеструктивный эффект параквата опосредуется цитотоксическим действием глутамата, выброс которого из клеток стимулируется окислительным стрессом, но, возможно, АФК стимулируют и синтез Glu из глутамина митохондриальной глутаминазой.

Для оценки антиоксидантного статуса КЗН окислительный стресс индуцировали добавлением в инкубационную среду перекиси водорода (Н2О2) в концентрации 25-250 мкМ в присутствии МК-801 и CNQX. В этих экспериментах нейрохимически незрелые КЗН при концентрациях Н202 50 и 100 мкМ оказались более чувствительными к окислительному стрессу, чем клетки, достигшие нейрохимической зрелости.

Известно, что в период развития ЦНС происходят пластические перестройки, которые характеризуются как дифференцировкой вновь образованных нейронов, так и их апоптотической гибелью. Индукция апоптоза неспецифическим блокатором протеинкиназ стауроспорином в концентрации от 5 до 1000 нМ в течение 24 часов в 3-4-суточных культурах вызывает дозозависимую гибель КЗН. Однако в 7-8-суточных культурах низкие концентрации стауроспорина (100-330 нМ) оказались более токсичными, чем высокая (1000 нМ). Так, при концентрации стауроспорина 330 нМ выживало на 65,7% меньше КЗН, чем при 1000 нМ, что может быть связано с участием в развитии апоптоза зрелых нейронов протеинкиназ, имеющих низкое сродство к стауроспорину, действие которых (в развитии апоптоза) и блокируется стауроспорином в высокой концентрации. Кроме того, незрелые культуры оказались более устойчивы к апоптотическому сигналу стауроспорина, по сравнению со зрелыми, в которых при действии 330 нМ стауроспорина выживало на 36% меньше КЗН.

Влияние закисления среды на жизнеспособность нейронов

Для понижения внеклеточного рН среду культивирования заменяли бессывороточной средой с кислым (6,5 и 6,0) или нормальным (7,2-7,3) рН на 24 ч, что индуцировало гибель зернистых нейронов как в молодых, так и в зрелых культурах, которая была прямо пропорциональна интенсивности внеклеточного ацидоза: в зрелых культурах при рН 6,5 выживало 78,0±3,6% КЗН, а при рН 6,0 - 67,0±3,9%, тогда как в молодых - 57,5±4,5% и 34,0±4,6%, соответственно.

Закисление среды культивирования в течение 3-4 ч вызывало снижение [Ca2+]i как в зрелых, так и незрелых КЗН, которое в последних было прямо пропорционально интенсивности наружного ацидоза, достигая при рН 6,0 43±1,1% относительно базального уровня (рН 7,3). В зрелых КЗН рН 6,5 вызывал в отдельных экспериментах более сильное снижение [Ca2+]i, чем рН 6,0,

при котором [Ca2+]i уменьшалась лишь на 18,0±1,5%. В культурах клеток гиппокампа гибели нейронов от ацидоза предшествовало не снижение, а достоверное повышение [Са2']|. Кроме того, 3-часовой внеклеточный ацидоз при рН 6,5 и 6,0 снижал ДЧ'п, в молодых КЗН на 13,0±1,8% и 27,0±1,8%, а в зрелых -на 7,0±1,5% и 12,0±1,4%, соответственно, что коррелировало с изменениями [Ca2+]i. В то же время показано, что в культивированных нейронах коры внеклеточный ацидоз вызывает повышение уровня [Ca2+]i за счет входа Са2+ в нейрон через чувствительный к Н+ ионный канал типа la (ASICla) (Xiong et al., 2006). Блокада нами кислоточувствительных каналов ASICla в незрелых КЗН с помощью специфического блокатора амилорида (30 мкМ, 24 ч) не предотвращала вызываемое ацидозом снижение выживаемости КЗН. Экспрессия мРНК к ASICla в незрелых КЗН составила 11,6% от значений в первичных культурах коры, взятых в качестве положительного контроля и принятых за 100%. Следовательно, вклад ASICla в регуляцию внутриклеточного Са2+ при ацидозе КЗН должен быть незначительным, а одной из причин повреждения КЗН является обнаруженное нами снижение [Ca2+]i, поскольку такое уменьшение концентрации кальция в цитоплазме, вызванное редукцией уровня внеклеточного калия, является сигналом развития апоптоза (Galli et al., 1995).

Более короткое (30 мин) закисление также приводило к редукции уровня [Ca2+]i в незрелых КЗН до 89±4% и 70±3% при рН 6,5 и 6,0, соответственно, но и к возрастанию концентрации свободного внутриклеточного цинка ([Zn2+];), определяемому с помощью специфического флуоресцентного зонда FluoZin-3 AM, до 115±5% при рН 6,5 и 146±9% при рН 6,0 (рис. 10). Во многих работах обсуждается роль цинка как фактора, индуцирующего апоптоз (Jiang et al., 2001;

рН 7,3 рН6,0 вь Я *<* 1 рН 7,3+TPEN рН 6,0+TPEN

ш Щ щ ц

Рис. 10. Хелатор ионов цинка TPEN (5 мкМ, 30 мин) предотвращает возрастание флуоресценции Р1ио2Ы-3 (верхний ряд) при ацидозе. Нижний ряд - фазовый контраст соответствующего поля зрения. Живые незрелые КЗН. Масштаб 10 мкм.

Bossy-Wetzel et al., 2004; Malaiyandi et al., 2005; Gazaryan et al., 2007). Специфический внутриклеточный хелатор ионов цинка TPEN (5 мкМ, 30 мин) предотвращал возрастание [Zn2+]-, в КЗН (рис. 10). Добавление в среду культивирования хелатора Zn2+ TPEN (5 мкМ, 24 ч), или антиоксидата тролокса (100 мкМ, 24 ч), повышало выживаемость КЗН при рН 6,0 (24 ч). Менадион (витамин КЗ, 3 мкМ, 24 ч), который в низких концентрациях шунтирует перенос электронов с NADH на Q-цикл, минуя комплекс I (Dedukhova et al., 1986; Wijburg et al., 1990), значительно увеличивает выживаемость КЗН при кислых значениях рНе (с 30±3 и 61±5 до 69±7 и 91±6 % при рНе 6,0 и 6,5, соответственно). Подобный эффект менадион оказывает и на токсическое действие экзогенного цинка (ZnCh, 0,04, 0,05, 0,06 мМ), препятствуя гибели КЗН. Выживаемость при этом повышалась с 55±6 до 95±8; с 24±4 до 75±10; и с 9±2 до 56±13 %, соответственно.

Добавленный за 30 мин до воздействия менадион (3 мкМ) достоверно повышал выживаемость КЗН при химической гипоксии, индуцированной ингибитором комплекса I цепи транспорта электронов митохондрий ротеноном (5 мкМ, 1 ч) с 58±2% до 83±3%. Однако при блокаде других комплексов дыхательной цепи, 2го - 3-нитропропионовой кислотой (3-НПА, 1 мМ 20 ч), Зго - антимицином А (0,1 мкМ 1,5 ч), и 4го - азидом натрия (1 мМ 9 ч), менадион не защищал КЗН от гибели.

Таким образом, мы впервые показали, что менадион селективно проявляет защитное действие только в случае, если химическая гипоксия вызвана блокадой комплекса 1 дыхательной цепи митохондрий, и может служить маркером повреждений, связанных с блокадой этого комплекса. Следовательно, нейродеструктивное действие ацидоза на КЗН связано с индуцируемым Zn2+ снижением активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий и избыточной продукцией АФК этим комплексом.

Особенности действия глутамииа на зернистые нейроны

После 3 ч инкубации в содержащем глюкозу растворе митохондрии КЗН активно накапливали ТМРЭ. В сестринских культурах при ГД свечение ТМРЭ в митохондриях было в 2 раза слабее. Добавление глутамина или пирувата (2 мМ) в безглюкозный раствор предотвращало снижение AlPm. Следует отметить, что защита пируватом митохондрий КЗН от деэнергизации в условиях ГД была более эффективна, чем глутамином. В присутствии глюкозы инкубация культур в растворе в течение 24 ч не вызывала заметной гибели нейронов, тогда как без глюкозы (ГД) за то же время погибали почти все нейроны. Блокада ионотропных Glu рецепторов МК-801 (10 мкм) и NBQX (10 мкм) не устраняла нейродеструктивный эффект ГД. Пируват в концентрации 2-5 мМ эффективно препятствовал нейрональной гибели при ГД (24 ч) (табл. 3). Присутствие глутамина в концентрации 2 мМ также полностью предотвращало гибель КЗН при ГД (табл. 4). Добавление глутамина в раствор, содержащий глюкозу, не

влияло на жизнеспособность нейронов. В условиях ГД глутамин в концентрации 5 мМ оказывал менее выраженный защитный эффект, который полностью отсутствовал при концентрации глутамина 10 мМ. В то же время, блокаторы ионотропных Glu рецепторов МК-801 и NBQX препятствовали негативным эффектам повышенных концентраций глутамина. Следовательно, о снижение эффективности защиты КЗН при повышении концентрации глутамина связано с эксайтотоксичностью глутамата. Повышение концентрации внеклеточного Glu в нервной ткани при ишемии может быть опосредовано усилением его высвобождения из аксонных терминалей и активацией синтеза из глутамина с участием митохондриальной глутаминазы, а при гипоксии/ишемии активность глутаминазы может значительно возрастать (Newcomb et al., 1997, 1998), что и показывают наши эксперименты.

При химической гипоксии, инициированной ингибитором комплекса 1 дыхательной цепи митохондрий ротеноном (1 мкМ, 2 ч), выживаемость КЗН 7-9 DIV снижалась лишь до 89±3,7%, а 3-4 DIV - до 41±4,8%, однако при добавлении глутамина (2 мМ) этот показатель уменьшался до 31±6% и 10,0±1,3%, соответственно. Конкурентный антагонист ионотропных глутаматных рецепторов APV (0,2 мМ) полностью предотвращал гибель КЗН,

Табл. 3. Влияние пирувата и блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов MK-801+NBQX на выживаемость КЗН в норме и при ГД (24 ч)

Добавки инкубационного раствора Выживаемость нейронов в %

Без блокаторов +MK-801+NBQX

Контроль 100±2 1И±3

ГД 12±2 21 ±4*

ГД+ пируват 2 иМ 83±6** 85±7**

ГД+ пируват 5 мМ 94±6** 93±6**

*р<0,01 по сравнению с контролем, **р<0,01 по сравнению с ГД, п=45, где п - количество полей зрения.

Табл. 4. Влияние глутамина и блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов MK-801+NBQX на выживаемость КЗН в норме и при ГД (24 ч)

Добавки инкубационного раствора Выживаемость нейронов в %

С глюкозой ГД

Нет добавок(контроль) 100±3 10±2*

MK-801+NBQX (10 мкМ) 106±4 15±4*

Глутамина (2 мМ) 89±4 97±6**

Глутамин (2 mM)+MK-801+NBQX 96±5 114±5**

Глутамин (5 мМ) 82±4 47±4*, **,s

Глутамин (5 mM)+MK-801+NBQX 94±4 117±6*V

Глутамин (10 мМ) 54±5* 2±0,3*,$

Глутамин (10 мМ) +MK-801+NBQX 78±3" lOiô**,^

*р<0,01 по сравнению с контролем с глюкозой, **р<0,01 по сравнению с ГД, *р<0,01 по сравнению с 5 мМ глутамина при ГД, **р<0,01 по сравнению с 10 мМ глутамина при ГД, *р<0,01 по сравнению с 2 мМ глутамина при ГД, "р<0,01 по сравнению с 10 мМ глутамина с глюкозой. п=45, где п - количество полей зрения на точку.

вызванную совместным действием ротенона и глутамина. Удаление глюкозы потенцировало действие ротенона на незрелые КЗН: выживаемость уменьшалась до 11,0±0,8%. ГД значительно снижала защитное действие блокатора ионотропных Glu рецепторов от клеточной гибели, индуцированной ротеноном. ГД за 2 ч нейроны не повреждала. Кроме того обнаружено повышение [Ca2+]i в КЗН при действии ротенона (1 мкМ, 20 мин). Глутамин не влиял на индуцированный ротеноном подъем [Ca2+]i, тогда как блокаторы Glu рецепторов полностью его предотвращали. Удаление глюкозы потенцировало вызванное ротеноном повышение [Ca2+]i и снижало эффективность защитного действия блокаторов, тогда как ГД за 20 мин [Са2+];не изменяла.

В присутствии глюкозы блокирование Na+/K+-ATPa3bi уабаином (Уа 1 мМ, 3 ч) вызывало незначительную гибель незрелых КЗН как в отсутствие, так и в присутствии 2 мМ глутамина (85±4% и 89±4% выживших КЗН, соответственно). При действии Уа на фоне ГД выживаемость КЗН снижалась до 34±3%, однако глутамин повышал ее до 81±3%. Конкурентный блокатор NMDA-подтипа Glu рецепторов (APV, 0,25 мМ) защищал нейроны от токсического эффекта Уа при ГД. 30-минутная экспозиция с Уа вызывала возрастание [Ca2+]i в КЗН. Глутамин не снижал индуцированный Уа подъем [Ca2f]i при нормальном содержании глюкозы, а ГД его потенцировала. В условиях ГД глутамин снижал, а блокаторы ионотропных Glu рецепторов (МК-801 и NBQX, 01 мкМ) предотвращали кальциевую перегрузку КЗН, индуцированную Уа.

В растворе с глюкозой активация NMDA-подтипа Glu рецепторов (NMDA 50 мкМ, 2 ч) вызывала незначительную гибель нейронов: выживало 78±3%, в присутствии глутамина (2 мМ) - 73±4%. ГД потенцировала действие NMDA, снижая выживаемость КЗН до 40±2%, которая в присутствии глутамина повышалась до 79±5%. NMDA (50 мкМ, 20 мин) вызывал возрастание [Ca2+]i и снижение AvPm, которые потенцировались ГД. Глутамин в условиях ГД препятствовал изменениям [Ca2+]i и Д*Рт, индуцированным NMDA.

Ишемическое воздействие (кислородно-глюкозная депривация, КГД, 3 ч, глюкозная депривация (ГД, 6 ч), нормобарическая гипоксия (кислородная депривация, 6 ч), химическая гипоксия (ротенон 0,15-1,5 мкМ, 1 ч) с последующей инкубацией в условиях нормоксии в среде (24 ч) вызывали интенсивную гибель культивируемых нейронов коры головного мозга эмбрионов крыс (10 DIV), степень которой определяли по содержанию лактатдегидрогеназы в питательной среде. Под воздействием глутамина (0,5 мМ) выживаемость нейронов после нормобарической гипоксии и КГД не изменялась, однако при химической гипоксии достоверно снижалась. Отсутствие глюкозы потенцировало действие химической гипоксии, но и в этом случае прослеживалось негативное влияние глутамина на выживаемость нейронов коры. Однако при действии только ГД глутамин достоверно снижал на 30% клеточную гибель, а в присутствии блокаторов ионотропных Glu рецепторов (МК-801 и CNQX) полностью защищал культивированные нейроны

коры от ГД. Сами блокаторы в отсутствие глутамина не защищали нейроны и не предупреждали вызванное ГД повышение [Ca2+]i.

Следовательно, влияние глутамина на выживаемость нейронов зависит от функциональной активности митохондрий. Так, при ГД он способен поддерживать ДЧ'т, синтез АТР, нормальный уровень [Ca2+]i и, в конечном итоге, выживание нейронов (рис. 11 — левая часть). Вероятно, это связано с тем, что митохондрии нейронов для поддержания окислительного фосфорилирования при ГД используют глутамат, образующийся из глутамина при участии глутаминазы (Shtherland et al., 2008). Однако при блокаде функций митохондрий, например, при аноксии, ишемии, химической гипоксии, индуцированной ротеноном, присутствие глутамина в среде культивирования усиливает гибель нейронов даже при наличии глюкозы. При этих воздействиях и, как мы показали, видимо, при окислительном стрессе глутаминаза может интенсивно производить глутамат из глутамина (Goldberg et al., 1988; Newcomb et al., 1997, 1998). При этом цикл трикарбоновых кислот (Кребса) не способен активно метаболизировать глутамат, что ведет к его накоплению и вызывает гибель нейронов (рис. 11, правая часть). В других случаях, когда гибель нейронов не связана с Glu токсичностью, глутамин, как мы показали, например, на модели повреждения нейронов ацидозом, не оказывает на нее заметного влияния.

Результаты наших экспериментов показали, что при блокаде

Рис. 11. Схема работы митохондрий при гипогликемии и ишемии. При гипогликемии (левая часть схемы) митохондрия интаюпна, глутаминаза, локализованная на внешней стороне внутренней мембраны, преобразует глутамин (Gin) в аммоний (NH4) и глутамат (Glu), который может утилизироваться в цикле трикарбоновых кислот (Кребса) с образованием аспартата (Asp), что дает возможность поддерживать ЛЧ'т и синтезировать АТР. При ишемии, аноксии, химической гипоксии (правая часть схемы), из-за отсутствия кислорода или вследствие химической блокады белковых комплексов, перенос электронов по дыхательной цепи прекращается, поэтому синтеза АТР не происходит, Л '/',„ падает, работа цикла трикарбоновых кислот нарушается, однако глутаминаза продолжает функционировать, дезаминируя глутамин до глутамата и вызывая накопление последнего.

накопление

гипогликемия

ишемия

митохондриальных функций, в условиях полного выключения митохондрий из процесса генерации АТР, глутамин стимулирует процессы развития повреждения нейронов. Однако, если митохондрии функционально активны, то глутамин в условиях дефицита глюкозы может использоваться митохондриями КЗН как субстрат для поддержания клеточной энергетики, и способствовать выживанию нейронов.

Совместное действие повреждающих факторов ишемии

При совместном действии в течение 24 ч нетоксических концентраций Glu (0,1 мМ) и индуктора окислительного стресса параквата (0,075 мМ) на незрелые КЗН 3-4 DIV выживало только 56±3% нейронов. В зрелых культурах (7-9 DIV) такого потенцирующего эффекта параквата на токсичность Glu (0,025-0,1 мМ) не обнаружено. В такой концентрации паракваг за 60 мин не изменял ни базальный уровень, ни вызванное Glu возрастание [Са2+]*.

В зрелых культурах уменьшение рНе в течение 24 ч с контрольного значения (7,2) до 6,5 и 6,0 снижало выживаемость нейронов на 12±3% и 18±3%, соответственно, но повышало ее при токсическом действии 150 мкМ параквата на 50±3% и 53±2%, соответственно. В незрелых культурах лишь умеренный ацидоз (рН 6,5) вызывал небольшое повышение выживаемости нейронов при действии параквата, по сравнению с его действием при рН 7,2. Следует напомнить, что ацидоз сам по себе вызывал интенсивную гибель нейронов в незрелых культурах.

При индукции апоптоза стауроспорином (100 нМ, 24 ч) в среде с нормальным (7,3) и сниженным (6,5) рНе выживаемость зрелых КЗН составляла, соответственно, 70±2 и 67±2%, тогда как незрелых - лишь 18±2 и 10±1%. Следовательно, защитный эффект ацидоза при индукции апоптоза стауроспорином не проявляется.

Рассмотренные выше патологические процессы, вовлеченные в развитие ишемии головного мозга, практически все связаны с изменениями уровня внутриклеточного кальция и митохондриями. Как было показано нами, снижение функциональной активности митохондрий происходит и при Glu токсичности, и при ацидозе, и при ГД. Вероятно, эти нарушения имеют место и при окислительном стрессе, так как митохондрии являются не только основными продуцентами свободных радикалов, но и мишенями для повреждающего действия АФК (Chen et al., 2011). Изменение [Ca2+]i является результатом взаимодействия транспортных систем, многие из которых энергозависимы, поэтому на их работу влияет состояние энергетики клетки, в первую очередь продукция АТР митохондриями. К тому же митохондрии являются одной из важнейших систем, депонирующих кальций. При ГД, Glu токсичности, так же, как и при ишемии происходит нарушение кальциевого гомеостаза вследствие перегрузки цитоплазмы нейронов ионами Са2+. Внеклеточный ацидоз может приводить как к снижению, так и к повышению

[Ca2+]i, что, по-видимому, зависит от наличия ASIC 1а каналов у нейрона. Следует отметить, что даже при однонаправленности этого процесса механизмы повышения [Ca2+]i при действии различных повреждающих факторов также различаются. Если при ишемии и Glu токсичности повышение [Са2+]/ и гибель нейронов опосредуются Glu рецепторами, то при ГД и ацидозе эта зависимость менее выражена, а в клеточных культурах может вовсе не прослеживаться. Глутамин по-разному влияет на выживаемость нейронов при моделировании ишемии и ГД. Если в первом случае он выступает как фактор, потенцирующий нейрональную гибель, то во втором может ее предотвращать.

Все рассматриваемые процессы находятся в жесткой взаимосвязи. Так, если Glu может участвовать в развитии окислительного стресса и инициировать ацидоз цитоплазмы нейронов, то ацидоз, в свою очередь, может влиять на активность Glu рецепторов и каскад Glu токсичности, а также инициировать окислительный стресс. ГД может усиливать токсическое действие Glu и продукцию АФК в нейронах. Поэтому данные, полученные при моделировании отдельных звеньев ишемического нейродеструктивного процесса, таких как ГД, ацидоз, глутаматная токсичность, окислительный стресс, нельзя упрощенно суммировать и их следует экстраполировать на ишемию с большой осторожностью.

Защита нейронов от ишемии

Индукция нейропротекции транзиторным снижением активности

Na7K+-ATPa3bi

В качестве защитного воздействия при окислительном стрессе была использована предобработка культур блокатором Ыа+/К+-АТРазы уабаином. Уа (100 мкМ) в контрольных культурах за 24 ч не влиял на жизнеспособность КЗН (табл. 5), но достоверно повышал количество живых нейронов при последующей индукции окислительного стресса, как паракватом, так и H2Ô2. При этом выживаемость в зрелых культурах была значительно выше, чем в Таблица 5. Влияние уабаина (Уа) на жизнеспособность КЗН в зрелых и незрелых

культурах при окислительном стрессе, индуцированном паракватом.

Воздействие 7-8 DIV 3-4 DIV

Контроль 100,0±2,5 100,0±2,0

Уа 0,1 мМ 104,0±2,6 98,0±2,3

Паракват 0,15 мМ 61,0±5,4 44,0±2,5

Уа+паракват 0,15 мМ 96,0±3,9** 65,0±3**

Паракват 0,2 мМ 33,0±3,5 38,0±2,7

Уа + паракват 0,2 мМ 78,0±3,1** 55,0±2,6**

Н202 0,05 мМ 49,0±6,8 49,0±2,6

Уа+Н202 0,05 мМ 82,0±5,9** 70,0±3**

Н202 0,075 мМ 7,9±1,1 32,0±1,9

Уа+Н202 0,075 мМ 52,0±5,3** 59,0±2,7**

** р<0,001 по сравнению с действием соответствующего индуктора окислительного

стресса, п=45, где п - количество полей зрения на точку.

незрелых.

Полученные данные позволяют заключить, что предобработка Уа является гораздо более эффективной защитой от окислительного стресса для зрелых нейронов, чем для незрелых. Добавление Уа (0,1 мМ) защищало КЗН 7-8 DIV от апоптоза, индуцированного через 24 ч стауроспорином, однако не оказывало защитного эффекта на КЗН 3-4 DIV, что может быть связано с разной степенью активности Ыа+/К+-АТРазы в зрелых и незрелых КЗН (Inoue et al., 1988). Мы предполагаем, что защитное действие Уа опосредуется ингибированием высокоаффинной изоформы Ыа+/К+-АТРазы, так как активность именно этой изоформы повышается на поздних стадиях развития нейронов. Зрелые и незрелые нейроны различаются по активности Na7K+-ATPa3bi и экспрессируют разные изоформы этого транспортера. У нейрональных предшественников и незрелых нейронов экспрессирована в основном изоформа Ыа7К+-АТРазы, слабо чувствительная к Уа, тогда как общая активность этой транспортной системы и активность высокочувствительной к Уа изоформы возрастают по мере развития нейронов (Inoue et al., 1988; Corthésy-Theulaz et al., 1990; Habiba et al., 2000). Показано, что Уа активирует Akt-киназу (Zhou et al., 2001), идентифицированную как ключевой фермент, опосредующий антиапоптотический эффект многих ростовых факторов (Burgess et al., 1999). Мы установили, что NMDA-подтип Glu рецепторов не вовлечен в защитное действие Уа при апоптозе КЗН, вызванном понижением концентрации калия, поскольку нейропротекция проявляется даже на фоне его блокады (Isaev et al., 2000).

Ишемическую толерантность можно индуцировать, имитируя отдельные звенья развития ишемического каскада субтоксическими воздействиями, а именно: сублетальными концентрациями Glu или NMDA, высокой концентрацией К+ (Grabb and Choi, 1999; Schurr et al., 2001; van Rensburg et al., 2009), умеренным окислительным стрессом (Ohtsuki et al., 1992), транзиторной деполяризацией (Taga et al., 1997). Высвобождение и накопление Glu в нервной ткани при окислительном стрессе авторы многих работ связывает с нарушением его обратного захвата, обусловленным негативным воздействием АФК и арахидоновой кислоты на работу Na7K+-ATPa3bi (Chan et al., 1983; Volterra et al., 1994). Одним из признаков повреждения нейронов при гипоксии и Glu токсичности является снижение активности Na+/K+-ATPa3bi (Pylova et al., 1989; Jamme et al., 1999), поэтому индуцировать эндогенные защитные антиишемические механизмы можно также ингибированием этой транспортной системы (Bruer et al., 1997).

Защитное действие препаратов семейства SkQ in vitro и in vivo

Как указывалось нами выше, окислительный стресс, индуцируемый усилением продукции АФК, рассматривается как критический фактор ишемического повреждения нейронов, при котором митохондрии являются не

-, ^ фазовый контраст* ... , ^ митотрекер зеленый

X \ 1 Ч.

» . 1 » ч • . - V .

SkQRl колокализация

только одними из главных генераторов АФК, но и сами повреждаются ими.

Поэтому эти органеллы должны быть одной из основных мишеней

фармакологической нейропротекторной терапии. В связи с этим были проведены исследования in vivo и in vitro нового класса веществ, синтезированных в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского под

руководством акад. В.П. Скулачева и являющихся митохондриально-адресованными антиоксидантами семейства SkQ (Skulachev, 2007). Эти молекулы состоят из восстановителя — пластохинона, соединенного углеводородной цепочкой с катионом (трифенилфосфонием в SkQl или родамином в SkQRl), проникающим через митохондриальную мембрану в отрицательно заряженный матрикс функционально активных митохондрий. Локализация SkQRl в митохондриях КЗН, выявленных с помощью потенциалнезависимого красителя митотрекера зеленого показана на рис. 12.

Вещества семейства SkQ не оказывали влияния на жизнеспособность КЗН в концентрациях ниже 100 нМ. При индукции окислительного стресса (Н2О2 100 мкМ, 20 мин) защитный эффекта SkQRl, SkQl и SkQRB не превышал 20% (р<0,05, п=45). Однако если для SkQl и SkQRB достоверное защитное действие наблюдалось в интервале концентраций 12-50 нМ, то для SkQRl этот интервал был шире (12-100 нМ). Следует отметить, что в данной модельной системе C12R19, лишенный антиоксиданта аналог SkQ, защитных свойств не проявлял.

Для in vivo исследований на модели компрессионной ишемии был выбран SkQRl, проявляющий защитный эффект в широком диапазоне концентраций. Объем очага ишемического повреждения теменной области коры на 7й день после операции составлял от 0,5 до 27,7 мм3 (среднее значение - 11±2 мм3), а у получавших внутрибрюшинно за сутки до ишемии SkQRl (1 мкмоль/кг веса) -до 12,0 мм3 (среднее значение - 3,7±0,9 мм3, р<0,005, п=15). Таким образом, препарат значительно снижал все три параметра: минимальное, максимальное и среднее значение объема ишемического очага. КЭЗ был 67%. Защитный эффект SkQRl был хорошо выражен независимо от локализации ишемического очага.

Рис. 12. Накопление ¿¡((¿Ш и митотрекера зеленого в митохондриях культивированных зернистых нейронов. Живая культура. Масштаб 10 мкм.

Так, размер и протяженность зоны повреждения заметно снижались при его инициации не только в теменной, но и в лобной области головного мозга, где защитный эффект составлял 56%.

При других патологических состояниях, связанных с действием окислительного стресса in vivo, также показана высокая эффективность применения препаратов этого класса (Antonenko et al., 2008). Эти проникающие катионы можно также использовать как средства терапии для лечения целого ряда возрастных заболеваний, которые опосредованы АФК, таких как сердечная аритмия, инфаркт миокарда и почки, а так же болезнь Апьцгеймера (Skulachev et al., 2009, Skulachev et al., 2011). Следует подчеркнуть, что защитные свойства могут быть связаны не только с антиоксидантной активностью исследуемых веществ. Мы не исключаем возможность нейропротекторного действия SkQRl путем индукции ишемической толерантности. Эффекты ишемической толерантности могут опосредоваться рядом каскадных реакций, участниками которых, в частности, является эритропоэитин (Prass et al., 2003), обладающий мощным нейропротекгорным эффектом (Grasso et al., 2007; McPherson and Juul, 2008), а также белок GSK-3b (Dirnagl and Meisel, 2008; Juhaszova et al., 2009). Основным местом синтеза эритропоэитина во взрослом организме является почка (Tan et al., 1991), хотя его заметная продукция происходит и в головном мозге (Noguchi et al., 2007). Плотников с соавторами показали увеличение содержания эритропоэитина в почке и фосфорилированной формы GSK-ЗЬ в мозге и почке при введении животным SkQRl (Plotnikov et al., 2011). Поэтому можно предположить, что нейропротекторный эффект SkQRl при его введении за 1 сутки до ишемии опосредован способностью этого препарата усиливать продукцию эритропоэитина и фосфорилирование GSK-ЗЬ, индуцируя тем самым ишемическую толерантность.

Соединения класса SkQ, особенно SkQRl, могут быть использованы для защиты нервной ткани во время плановых операций на мозге, при которых он подвержен значительной травматизации (Jadhav et al., 2007; Jadhav and Zhang, 2008).

Фармакологическая коррекция ишемических повреждений помощью

препарата Целлекс

В качестве нового нейропротекторного препарата был использован разработанный в ЗАО «Фарм-Синтез» целлекс, представляющий собой комплекс органоспецифических сигнальных слабокислых белков массой от 10 до 140 кДа. Защитный эффект целлекса при введении после токсического воздействия Glu (25 мкМ) на КЗН (7 DIV) носил стабильный и дозозависимый характер, увеличивая выживаемость с 59+4% до 69+4, 79+5 и 78+4 % при 0,01, 0,05 и 0,11 мг/мл целлекса, соответственно (в двух последних р<0,05, п=45). Сам препарат в таких концентрациях не оказывал токсического влияния на культуры нейронов. При окислительном стрессе, индуцированном перекисью

водорода, защитного действия целлекса выявлено не было.

Хроническое и даже одноразовое (через 1 час после операции) внутрибрюшинное введение препарата (0,4, 3 мг/кг) значительно уменьшало объем очага ишемического повреждения коры головного мозга крыс при фотоиндуцированном тромбозе (рис. 13). КЭЗ(0,4 мг/кг)=29%; КЭЭ(3,0 мг/кг)=52%. В то же время, предварительное введение целлекса в течение 4х суток до фототромбоза было менее эффективным.

В основе обнаруженных эффектов этого нового белково-пептидного комплекса может лежать его способность оказывать прямое нейрорепаративное действие, снижать активацию провоспалительных реакций, стимулировать синтез нейротрофинов и предотвращать гибель нейронов после ишемии, а также уменьшать степень эксайтотоксического повреждения, поскольку в наших экспериментах in vitro целлекс эффективно препятствовал нейротоксическому действию Glu.

Защитное действие препарата ГК-2 при моделировании ишемии

Низкомолекулярный аналог фактора роста нервов, синтезированный в ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Середенин С.Б., Гудашева Т.А.// Заявка на изобретение реп № 2009105176, приоритет от 16.02.2009.) -пептид ГК-2 (гексаметилендиамид бис-М-моносукцинил-аспарагинил-лизин), способный проникать через гематоэнцефалический барьер (Гудашева, 2011), препятствовал повреждению КЗН, подвергнутых окислительному стрессу, индуцированному перекисью водорода. Выживаемость КЗН повышалась с 34,1±3,6% без коррекции до 44,1±3,7, 48,2±4,6 и 52,9±4,2 при добавлении 0,5, 1 и 1,5 мг/л ГК-2, соответственно (р<0,001, п=45). Сам ГК-2 в указанных концентрациях не влиял на выживаемость КЗН.

Выраженные нейропротекторные и антиамнестические свойства препарата были продемонстрированы и в экспериментах на животных. Внутрибрюшинное введение ГК-2 после двустороннего фокального фотоиндуцированного тромбоза (ишемии) префронтальной коры головного мозга крыс приводило к уменьшению объема ишемического очага на 7е сутки после операции с 14,0±6,0 мм3, до 5,5±1,0 мм3 (р<0,05, п=9), КЭЗ 62% (рис. 14) и сохранению условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Это хорошо согласуются с данными о роли фактора роста нервов в нейропластичности и репарации мозга (Varon and Conner, 1994; Heñi, 1994; Frade and Barde, 1998; Lessmann, 1998; Spedding and Gressens, 2008; Alleva and Francia, 2009). В последствии наши данные были подтверждены и на других моделях фокальной ишемии головного мозга

0 0,4 3 мг/кг

Рис. 13. Средние значения объема очага ишемического повреждения в зависимости от концентрации целлекса.

Без лечения с ГК-2 (1мг/кг)

Рис. 14. Объемная реконструкция очага ишемического повреждения при двустороннем фотоиндуцированном тромбозе без коррекции и с коррекцией препаратом ГК-2 (1 мг/кг). Окраска метиленовым синим. Масштаб 0,6 см

(Середенин с соавт., 2011), были обнаружены антипаркинсонные свойства ГК-2 (Гудашева с соавт., 2010, Поварнина с соавт., 2011), способность увеличивать синтез белков теплового шока (Антипова, 2010).

В таблицах 6 и 7 приведены значения средних размеров очагов ишемического

повреждения коры головного мозга и выживаемости КЗН при использовании новых

нейропротекторов in vivo и in vitro. Все представленные вещества оказывали выраженный защитный эффект с

коэффициентом защиты выше 50 %, действуя на разные звенья ишемического процесса.

Таблица 6. Действие ГК-2, целлекса и SKQR1 на объем очага ишемического повреждения____

Объем очага ишемического повреждения ГК-2, 1 мг/кг в/б при фототромбозе, т=4 Целлекс, 3 мг/кг в/б при фототромбозе, ш=4 SKQR1, 1 мкмоль/кг в/б при компрессионной ишемии, ш=1

Без коррекции, У0 мм3 14,0 8,3 11,2

С коррекцией, Уе мм3 5,5* 4,0 3,7*

Эффективность защиты, Е (%) 60,7 51,9 67,0

Примечания, в/б - внутрибрюшинно, т- число дней введения препарата. Эффективность лечения рассчитывалась по формуле Е(%)= 100*(Уе-У„) /У0. *р<0,05 по сравнению с ишемией без коррекции, п=9-15.

Таблица 7. Нейропротекторное действие ГК-2, целлекса и ЗК()111 на КЗН при

Выживаемость КЗН ГК-2, 1,5 мг/мл после окислительного стресса Целлекс, 0,7 мг/мл после глутаматного воздействия SKQR1, 50 нМ перед окислительным стрессом

Без коррекции, 50(%) 34,1 58,5 31,8

С коррекцией, В, (%) 52,9* 78,8 53,1*

Эффективность защиты, Е (%) 18,8 20,3 21,3

Эффективность лечения рассчитывалась по формуле (%) Е= Вк-В0,. р<0,05 по сравнению с повреждающим воздействием без коррекции, п=45.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе, при моделировании in vitro патогенетических факторов ишемии (цитотоксичности глутамата, глюкозной депривации, окислительного стресса, ацидоза), было обнаружено, что эксайтотоксическое повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция в нейронах приводит к электрогенному транспорту избытка Са2+ в митохондрии и снижению мембранного потенциала митохондрий, которое сопровождается повреждением их ультраструктуры. При этом нейротоксическое действие глутамата в незрелых культурах (3-4 суток in vitro), по сравнению со зрелыми, 7-8-суточными культурами, выражено гораздо слабее. Однако эта толерантность к глутамату резко снижается, если его воздействие сочетается с глюкозной депривацией или окислительным стрессом.

При кратковременной глюкозной депривации большая часть нейронов, несмотря на выраженную кальциевую перегрузку и снижение АЧ^, сохраняет жизнеспособность. Это свидетельствует о том, что повышение [Ca2+]j непосредственно после повреждающего воздействия не является обязательным признаком последующей клеточной гибели. Вероятно, первоначальное снижение АЧ'ГП выполняет защитную функцию, предотвращая аккумуляцию Са2+ в митохондриях до критического уровня, превышение которого приводит к набуханию и деструкции митохондрий, а в дальнейшем и к гибели нейронов. Показано, что нейрохимически зрелые нейроны сильнее, чем незрелые, подвержены деструктивному действию глюкозной депривации.

При глюкозной депривации, не нарушающей функциональную активность дыхательная цепи митохондрий, глутамин может использоваться в качестве энергетического субстрата, восстанавливая синтез АТР, что способствует выживанию нейронов. Однако при цитотоксическом воздействии, приводящем к блокаде дыхательной цепи митохондрий, добавление глутамина активирует синтез глутамата глутаминазой, что способствует повреждению нейронов.

Нейродеструктивный эффект параквата опосредуется цитотоксическим действием эндогенного глутамата. Окислительный стресс стимулирует высвобождение последнего из нейронов. Кроме того, при окислительном стрессе, возможно, стимулируется синтез глутамата из глутамина митохондриальной глутаминазой. На фоне блокады глутаматных рецепторов окислительным стрессом повреждаются прежде всего незрелые нейроны.

вызываемым Zn2+ ингибированием комплекса I, который при этом усиленно продуцирует активные формы кислорода. Однако не стоит забывать, что одной из причин повреждения этого типа нейронов может являться обнаруженное нами снижение [Ca2+]¡, поскольку это может служить сигналом развития каскада, индуцирующего апоптоз. Незрелые зернистые нейроны сильнее повреждаются ацидозом, чем достигшие нейрохимической зрелости.

Исходя из вышесказанного, можно заключить, что если токсичность повреждающих факторов ишемии связана с гиперактивацией глутаматных рецепторов или же с глюкозной депривацией, то сильнее повреждаются зрелые нейроны, а если с окислительным стрессом или ацидозом — то незрелые. Подверженность нейрохимически незрелых культивированных зернистых нейронов глутаматной токсичности резко возрастает, если она сопряжена с другими повреждающими факторами, глюкозной депривацией или окислительным стрессом.

Действие всех повреждающих факторов ишемии сопряжено с нарушением ионного баланса и повреждением митохондрий. Снижение функциональной активности митохондрий происходит при глутаматном воздействии, ацидозе, глюкозной депривации и, вероятно, при окислительном стрессе. Митохондрии являются не только основными источниками АТР клеток, но и продуцентами свободных радикалов, а также важнейшей системой депонирования кальция, перегрузка которым может вызвать дисфункцию и деструкцию этих органелл. В то же время транспортные системы поддержания ионного баланса в основном энергозависимы и, следовательно, также напрямую связаны с функционированием митохондрий.

Анализ полученных нами данных указывает на неоднозначность и многоплановость ишемических патобиохимических реакций. Поэтому получение универсального нейропротекторного средства, направленного на коррекцию ишемических повреждений головного мозга, маловероятно. Наиболее перспективной представляется разработка принципиально новых подходов к поиску препаратов, направленных на стимуляцию эндогенных нейропротекторных и репаративных процессов (Суслина и Пирадов, 2008).

В основу таких разработок может быть положено использование существующих эндогенных нейропротекторов, их синтетических аналогов с заданными свойствами или получение препаратов, стимулирующих эндогенную продукцию нейропротекторов. К таким веществам, несомненно, относятся соединения, использованные в нашей работе. Так, показана возможность индукции ишемической толерантности путем снижения активности Na+/K+-АТРазы уабаином, предобработка которым является эффективной защитой зрелых нейронов in vitro от окислительного стресса и апоптоза, опосредуемой, вероятно, ингибированием высокоаффинной формы Na+/K+-ATPa3bi, активацией Akt-киназ и усилением антиоксидантной защиты. Кроме того, ярко выраженным нейропротекторным действием in vivo и in vitro обладают исследованные нами белковый комплекс целлекс, дипептид ГК-2 и

митохондриально-адресованный антиоксидант БкХЗШ, что указывает на перспективность их использования в дальнейших предклинических и клинических испытаниях при ишемических формах церебральной патологии.

Таким образом, полученные результаты, с одной стороны, раскрывают новые механизмы ишемических нейродеструктивных процессов и свидетельствуют об их тесной взаимосвязи с дисфункцией митохондрий и нарушением ионного баланса нейронов, а с другой служат экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных нейропротекторов в неврологической клинике.

ВЫВОДЫ

1. Степень повреждения культур зернистых нейронов мозжечка под влиянием

повреждающих факторов ишемии зависит от сроков культивирования: деструкция зрелых нейронов (7-8 дней in vitro) наиболее выражена при глюкозной депривации и гиперактивации глутаматных рецепторов, тогда как незрелых (3-4 дня in vitro) - при окислительном стрессе и ацидозе.

2. Кратковременная (в течение часа) глюкозная депривация, приводящая к

снижению мембранного потенциала митохондрий, указывающему на их дисфункцию, сопровождается гетерогенным изменением ультраструктуры митохондрий, популяция которых содержит как интактные, так и конденсированные органеллы, а также митохондрии с локальными набуханиями и разрушением крист.

3. Повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция после кратковременной (1 ч) глюкозной депривации в зрелых нейронах обратимо при восстановлении нормального уровня глюкозы в инкубационной среде, но восстановление мембранного потенциала митохондрий происходит не полностью (90%), чему соответствует число митохондрий, содержащих локальные набухания, и гибель 14% нейронов через 24 ч после часовой глюкозной депривации.

4. Вызываемое глюкозной депривацией снижение митохондриального мембранного потенциала предотвращается ингибированием транспорта Са2+ в митохондрии или добавлением пирувата, а кальциевая перегрузка цитоплазмы нейронов усиливается ингибиторами дыхательной цепи, что указывает на вовлечение митохондрий в каскад внутриклеточных нейродеструктивных процессов вследствие снижения мембранного потенциала митохондрий и синтеза АТР, нарушения аккумуляции кальция и усиления продукции активных форм кислорода этими органеллами.

5. Снижение мембранного потенциала митохондрий и гибель нейронов при

глюкозной депривации предотвращаются глутамином, который в отсутствие глюкозы может служить энергетическим субстратом окислительного фосфорилирования. В то же время, при дисфункции митохондрий, вызванной цитотоксическим воздействием, глутамин снижает выживаемость нейронов в результате гиперактивации глутаматных рецепторов синтезируемым из него глутаматом.

6. Гибель культивированных зернистых нейронов при окислительном стрессе, индуцированном паракватом, происходит вследствие блокады комплекса I дыхательной цепи митохондрий, поскольку его шунтирование менадионом, минуя комплекс I дыхательной цепи митохондрий, повышает выживаемость культур. Кроме того, в каскаде нейродеструктивного действия параквата принимает участие эндогенный глутамат, поскольку блокада ионотропных глутаматных рецепторов или удаление глутамина из инкубационной среды защищает нейроны.

7. Гибель культивированных зернистых нейронов мозжечка от умеренного внеклеточного ацидоза опосредована снижением внутриклеточной концентрации Са2+, возрастанием внутриклеточной концентрации Zn2+, снижением мембранного потенциала митохондрий и усилением продукции свободных радикалов, о чем свидетельствует защитное действие хелатора цинка TPEN, менадиона, шунтирующего I комплекс дыхательной цепи, и антиоксиданта тролокса.

8. Предобработка уабаином является эффективной защитой зернистых нейронов мозжечка зрелых культур от окислительного стресса и апоптоза, что указывает на возможность индукции ишемической толерантности путем умеренной транзиторной блокады Na+/K+-ATPa3bi.

9. Новые фармакологические препараты повышают выживаемость нейронов в

культурах, подвергнутых действию повреждающих факторов ишемии: белковый комплекс целлекс - при токсическом действии глутамата, пептид ГК-2 и митохондриально-адресованные антиоксиданты семейства SkQ - при окислительном стрессе. Указанные препараты препятствуют увеличению объема ишемического очага и функциональным нарушениям при моделировании фокальной ишемии коры головного мозга in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К., Зоров Д.Б., Викторов И.В. Кальций вызывает

снижение мембранного потенциала митохондрий клеток зерен мозжечка крыс при токсическом воздействии глутамата. //Бюлл. эксперим. биол. мед.

1997. т. 123. №4. с. 378-380.

2. Захарова И.О., Стельмашук Е.В.. Викторов И.В., Тюрин В.А., Аврова Н.Ф.

Защитный и модуляторный эффект различных концентраций ганглиозидов в клетках-зернах мозжечка и в синаптосомах мозга крыс. //Нейрохимия.

1998. т. 15. вып. 2. с. 117-125.

3. Avrova N.F., Victorov I.V., Tyurin V.A., Zakharova I.O., Sokolova T.V., Andreeva

N.A., Stelmaschuk E.V.. Tyurina Y.Y., Gonchar V.S. Inhibition of glutamate-induced intensification of free radical reactions by gangliosides: possible role in their protective effect in rat cerebellar granule cells and brain synaptosomes. //Neurochemical Research. 1998. v. 23. № 7. p. 945-952.

4. Isaev N.K., Stelmashook E.V.. Alexandrova O.P., Andreeva N.A., Polyakova I.A.,

Victorov I.V., Zorov D.B. The lack of extracellular Na+ exacerbates Ca2+-dependent damage of cultured cerebellar granule cells. //FEBS Letters. 1998. v. 434. p. 188-192.

5. Stelmashook E.V.. Weih M., Zorov D., Victorov I., Dirnagl U., Isaev N. Short-term

block of Na+/K+-ATPase in neuro-glial cell cultures of cerebellum induces glutamate dependent damage of granule cells. //FEBS letters. 1999. v. 456. p. 41-44.

6. Стельмашук E.B.. Исаев H.K., Александрова О.П., Андреева Н.А., Зоров Д.Б,

Викторов И.В. Влияние изоосмотического раствора с пониженным содержанием натрия на состояние митохондрий культивированных клеток-зерен мозжечка. //Бюлл. эксперим. биол. мед. 2000. т. 129. № 1. с. 41-44.

7. Isaev N.K.. Stelmashook E.V.. Halle A., Harms С., Lautenschlager М., Weih М.,

Dirnagl U., Victorov I.V., Zorov D.B. Inhibition of Na+,K+-ATPase activity in cultured rats cerebellar granule cells prevents the onset apoptosis induced by low potassium. //Neuroscience Letters. 2000. v. 283. № 1. p. 41-44.

8. Андреева H.A., Стельмашук E.B.. Исаев H.K., Островская Р.У., Гудашева Т.А.,

Викторов И.В. Нейропротекторные эффекты ноотропного дипептида ГВС-111 при кислородно-глюкозной депривации, глутаматной токсичности и оксидатовном стрессе in vitro. //Бюлл. эксперим. биол. мед. 2000. т. 130. № 10. с. 418-421.

9. Стельмашук Е.В.. Андреева Н.А, Манухова JI.A., Зоров Д.Б., Исаев Н.К.

Бифоназол модулирует гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс, индуцированную глутаматом и кислородно-глюкозной депривацией. // Бюлл. эксперим. биол. мед.,2001. т. 132. № 11. с. 542-544.

10. Isaev N.K, Stelmashook E.V.. Dirnagl U., Andreeva N.A., Manuhova L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Skrebitsky V.G., Victorov I.V., Katchanov J., Weih M., Zorov D.B. Neuroprotective effects of the antifungal drug clortimazole. //Neurosci. 2002. v. 113. № 1. p. 47-53.

11. Стельмашук E.B.. Андреева Н.А, Исаев Н.К. Различие действия стауроспорина на зрелые и незрелые культуры клеток-зерен мозжечка крыс. //Нейрохимия. 2004. т. 21. № 1. с. 68-71.

12. Isaev N.K., Stelmashook E.V.. Ruscher К., Andreeva N.A., Zorov D.B. Menadione reduces rotenone-induced cell death in cerebellar granule neurons. // Neuroreport. - 2004. - v. 15(14).- P. 2227-2231.

13. Стельмашук E.B.. Беляева E.A., Исаев Н.К. Влияние ацидоза, окислительного стресса и глутаматной токсичкости на жизнеспособность клеток-зерен в зрелых и незрелых клеточных культурах. //Нейрохимия. -2006. - т. 23. - № 2. - с. 131-135.

14. Исаев Н.К.. Стельмашук Е.В.. Дирнагл У., Плотников Е.Ю., Кувшинова Е.А., Зоров Д.Б. Глюкозная депривация стимулирует продукцию свободных радикалов в митохондриях культивированных зернистых нейронов мозжечка. //Биохимия. - 2008. - т. 73. - в. 2. - С. 185-195.

15. Stelmashook E.V.. Isaev N.K., Zorov D.B. Paraquat potentiates glutamate toxicity in immature cultures of cerebellar granule neurons. //Toxicology Letters. - 2007. -v. 174.-№ 1-3.-p. 82-88.

16. Бакеева JI.E., Барсков И.В., Егоров M.B., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Козловский С.В., Лакомкин В.Л., Левина С.В., Писаренко О.И., Плотников Е.Ю., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В.. Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К., Викторов И.В., Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 2. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга). //Биохимия. - 2008. -т. 73.-в. 12.-С. 1607-1621.

17. Лозиер Е.Р., Джанибекова А.И., Стельмашук Е.В.. Граф А.В., Зоров Д.Б., Соколова Н.А., Исаев Н.К. Глюкозная депривация потенцирует токсичность уабаина и глутамата в кортикальных нейронах различных сроков культивирования. //Нейрохимия. - 2009. т. 26. № 3. с. 1-5.

18. Stelmashook E.V.. Isaev N.K., Plotnikov E.Y., Uzbekov R.E., Alieva I.B., Arbeille В., Zorov D.B. Effect of transitory glucose deprivation on mitochondrial structure and functions in cultured cerebellar granule neurons. //Neurosci Lett. 2009. v. 461. p. 140-144.

19. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Чупыркина А.А., Даньшина М.И., Янкаускас

C.C., Моросанова М.А., Стельмашук Е.В.. Васильева А.К., Горячева Е.С., Пирогов Ю.А., Исаев Н.К., Зоров Д.Б. Новое поколение скулачевионов, обладающих выраженным нефро и нейропротекторным действием. //Биохимия. - 2010. - т. 75. - в. 2. - С. 177 - 184.

20. Isaev N.K.. Stelmashook E.V.. Lukin S.V., Freyer D., Mergenthaler Ph., Zorov

D.B. Acidosis-Induced Zinc-dependent death of cultured cerebellar granule neurons. //Cellular and Molecular Neurobiology. 2010. v. 30. № 6. 877-883.

21. Стельмашук E.B.. Новикова C.B., Исаев H.K. Влияние глутамина на гибель культивированных зернистых нейронов, индуцированную глюкозной депривацией и химической гипоксией. //Биохимия. - 2010. - т. 75. в. 8. с. 1150-1156.

22. Stelmashook E.V.. Lozier E.R., Goryacheva E.S., Mergenthaler P., Novikova S.V., Zorov D.B., Isaev N.K. Glutamine-mediated protection from neuronal cell death depends on mitochondrial activity. //Neurosci. Lett. 2010. v. 482. p. 151-155.

23. Середенин С.Б., Романова Г.А., Гудашева T.A., Шакова Ф.М., Барсков И.В., Стельмашук Е.В.. Антипова Т.А.. Нейропротективное и антиамнестическое действие дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 при экспериментальном ишемичесом инфаркте коры головного мозга. //Бюлл. эксперим. биол. мед. 2010. т. 150. № 10. с. 406-410.

24. Романова Г.А., Шакова Ф.М., Барсков И.В.. Стельмашук Е.В.. Петров Т.В., Соколов М.А. Функциональные и морфологические повреждения при фокальной ишемии префронтальной коры головного мозга крыс; коррекция с помощью нового оригинального препарата Целлекс. //Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2010. № 9(2). с. 52-56.

25. Капай Н.А., Исаев Н.К.. Стельмашук Е.В.. Попова О.В., Зоров Д.Б., Скребицкий В.Г., Скулачев В.П. Митохондриальноцадресованное производное пластохинона, антиоксидант SkQRl, введенный in vivo, предотвращает нарушение длительной потенциации, вызванное |J-амилоидом в срезах гиппокампа. //Биохимия. 2011. т. 76. № 12. с. 1695 -1699.

26. Lozier E.R., Stelmashook E.V.. Uzbekov R.E., Novikova S.V., Zorov S.D., Alieva I.B., Arbeille B, Zorov DB, Isaev NK. Stimulation of kainate toxicity by zinc in cultured cerebellar granule neurons and the role of mitochondria in this process. // Toxicol. Lett. 2012. v. 208. p. 36-40.

27. Isaev N.K., Lozier E.R., Novikova S.V., Silachev D.N., Zorov S.D., Stelmashook E.V. Glucose starvation stimulates Zn2+ toxicity in cultures of cerebellar granule neurons. //Brain Research Bulletin. 2012. v. 87. p.80-84.

Статьи в других изданиях

28. Стельмашук Е.В., Андреева H.A., Манухова Л.А., Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Антигрибковые препараты клотримазол и бифоназол предотвращают гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс при глутаматной токсичности и кислородно-глюкозной депривации. //Сборник статей «Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования.» /Науч. Ред. В.Н. Гурин, В.В. Солтанов. - Мн.: Бизнесофсет. 2001. с. 173-175.

29. Андреева H.A.. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К., Ходоров Б.И. Влияние блокады АТР-зависимого транспорта Са2+ и Na+ на глутаматную токсичность в культурах клеток-зерен мозжечка крысы. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» ГУ НИИ мозга РАМН. - М., 2005. -с. 21-24.

30. Стельмашук Е.В.. Андреева H.A., Белоусов В.В., Исаев Н.К. Уабаин уменьшает повреждающее действие окислительного стресса in vitro, //Всероссийская научная конференция с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга». ГУ НИИ мозга РАМН. - М., 2005. - с. 267-270.

31. Исаев Н.К.. Стельмашук Е.В.. Беляева Е., Зоров Д.Б. Глюкозная депривация стимулирует продукцию активных форм кислорода в культивированных нейронах мозжечка. //Сборник статей Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Московская область г. Пущино Институт биофизики клетки РАН. 2005 -с. 130-132.

32. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К. Влияние предобработки уабаином на жизнеспособность клеток-зерен в зрелых и незрелых клеточных культурах при окислительном стрессе. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием. ГУ НИИ мозга РАМН. «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга-2006». - М., 2006. - с. 310-313.

33. Стельмашук Е.В.. Андреева H.A., Манухова J1.A., Захарова Е.И., Белоусов В., Зоров Д.Б., Викторов И.В., Исаев Н.К. Формирование ишемической толерантности в культурах клеток-зерен можзечка с помощью гипероксигенации. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием ГУ НИИ мозга РАМН «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга -2006». - М., 2006. - с. 313-317.

34. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В.. Манухова Л.А., Зоров Д.Б. Клотримазол снижает активность комплекса I дыхательной цепи митохондрий в культивированных астроцитах. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием. ГУ НИИ мозга РАМН «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга - 2006» - М., 2006. - с. 123-126.

35. Левина C.B., Стельмашук Е.В.. Барсков И.В., Исаев Н.К., Зоров Д.Б., Викторов И.В. Исследование влияния односторонней ретракционной ишемии головного мозга на

горизонтальную активность крыс. //Сборник статей конференции ГУ НЦ неврологии РАМН "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга". - М., 2007. с. 340-344.

36. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К. Влияние параквата и pH среды на выживаемость зернистых

нейронов мозжечка различных сроков культивирования. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности", - М., 2008. - с. 647-651.

37. Лукин C.B., Джанибекова H.A., Лозиер Е.Р., Стельмашук Е.В.. Трофимова Л.К., Граф A.B., Зоров Д.Б., Соколова H.A., Исаев Н.К. Влияние ацидоза и амилорида на жизнеспособность нейронов коры головного мозга различных сроков культивирования. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности". - М., - 2008, с. 591-595.

38. Стельмашук Е.В.. Новикова C.B., Исаев Н.К. Глутамин защищает зернистые нейроны мозжечка при глюкозной депривации и токсическом действии NMDA in vitro. //Сборник статей Всероссийской конференции с международным участием «Современные направления исследований функциональной межполушарной асимметрии и пластичности мозга. Экспериментальные и теоретические аспекты нейропластичности». -М., 2010.-с. 498-501.

Тезисы докладов

39. Зоров Д.Б., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Кузьминова А.Е., Мешков К.И., Самсонов А.К., Стельмашук Е.В. Структура и функция митохондриальной поры. //2й съезд биохимического общества РАН. - Пущино, -1997. - С. 378-379.

40. Викторов И.В., Андреева H.A., Дупин A.M., Исаев Н.К., Лыжин A.A., Стельмашук E.B.f Хаспеков Л.Г. Исследование механизмов гипоксических/ишемических повреждений нейронов в культуре клеток головного мозга. //Материалы Зй международной конференции «Колосовские чтения 97». - С-Пб. - 1997. - С. 23.

41. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Полякова И.А., Викторов И.В., Зоров Д.Б. Ультраструктурные изменения митохондрий культивированных клеток-зерен мозжечка после воздействия токсических доз глутамата. //Всероссийская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» М., -1997. - С. 116-117.

42. Zakharova I.O., Victorov I.V., Tyurin V.A., Stelmaschuk E.V.. Sokolova T.V., Tyurina Yu.Yu., Avrova N.F. Inhibition of glutamate-induced enhancement of free radical reactions by gangliosides: possible role in their protective effect in rat cerebellar granule cells and brain synaptosomes. //33 International congressof phisiological sciences. - St. Peterburg, - 1997. -P093.34.

43. Александрова О.П., Стельмашук E.B.. Исаев H.K., Викторов И.В. Исследование морфологических изменений культивированных клеток-зерен мозжечка при действии глутамата. //Hypoxia Med. J., - 1998. - V. 6. - № 2. - P. 26.

44. Avrova N.F., Victorov I.V., Tyurina Y.Y.,Sokolova T.V., Shestak K.I., Zakharova I.O., Andreeva N.A., Stelmaschuk E.V. Tyurin V.A., Protective effect of gangliosides in hypoxic dysfunction of the nerve cells. //J. of Neurochemistry. "12th Meeting of the European Society for

Neuroscience",- 1998. - 71 Suppl: S 32.

45. Андреева H.A., Стельмашук E.B.. Исаев Н.К., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Викторов И.В. Исследование защитного действия пептида ГВС-111 при моделировании гипоксии in vitro. //Материалы 2-й Всероссийской конференции «Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция». - М., - 1999. - С. 5-6.

46. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В.. Викторов И.В. Влияние снижения активности Na7 К+АТФазы на жизнеспособность клеток-зерен в диссоциированных нейроглиальных культурах мозжечка крыс. //Материалы конференции «Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга». - М., - 1999. - С. 41.

47. Isaev N.K., Stelmashook E.V.. Krasnikov B.F., Viktorov I.V., Zorov D.B. Short-term block of Na7K+ ATPase induces glutamate-dependent damage of cultured cerebellar granule cells. //Biophysical Journal. - 1999. - v. 76. - № 2. - Part 2. A378.

48. Стельмашук E.B.. Андреева H.A., Исаев Н.К., Викторов И.В. Ходоров Б.И. Влияние блокады Ca2* насосов плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума на нейротоксичность глутамата в культуре клеток-зерен мозжечка крысы. //11 Российский конгресс по патофизиологии. - 2000. - С. 179.

49. Маркова Е.Г., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Избирательное влияние фактора роста нервов на дифференцировку дендритов различных морфологических типов холинергических нейронов септума мозга крысы при культивировании. // Конференция "Новое в изучении пластичности мозга",- М., - 2000. - С. 56.

50. Стельмашук Е.В.. Андреева H.A., Манухова Л.А., Захарова Е.И., Белоусов В.В., Зоров Д.Б., Викторов И.В., Исаев Н.К. Повышение устойчивости к гипоксии клеток-зерен мозжечка с помощью кислорода. //Материалы 3 Всероссийской конференции: «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция». - М. - 2002. - С. 117.

51. Стельмашук Е.В.. Андреева H.A., Белоусов В.В., Исаев Н.К. Фармакологическое прекондиционирование уабаином при моделировании гипоксии in vitro. //Материалы 3 Всероссийской конференции: «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция». - М. - 2002. -С. 116.

52. Стельмашук Е.В.. Андреева H.A., Исаев Н.К. Влияние снижения активности NaTK'-АТФазы на индуцированный стауроспорином апоптоз культивированных клеток-зерен. // Материалы конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга». - М. - 2003. - С. 86.

53. Стельмашук Е.В.. Беляева Е.А., Андреева H.A., Исаев Н.К. Влияние стауроспорина и снижения внеклеточного pH на жизнеспособность клеток-зерен мозжечка в зрелых и незрелых клеточных культурах. //Материалы конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи». - М. - 2004. - С. 90.

54. Манухова J1.A, Стельмашук Е.В.. Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Исследование влияния токсического действия клотримазола на культивированные клетки мозжечка крыс. //Материалы конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи». - М. -2004. - с. 55.

55. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В.. Андреева H.A., Беляева К.А., Зоров Д.Б. Защитное действие витамина КЗ при химической гипоксии культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. //3 Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием. - М. - 2004. - С. 214.

56. Беляева Е.А., Стельмашук Е.В.. Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Сурамин и базиленовый синий снижают продукцию свободных радикалов, индуцированную глюкозной депривацией в клетках-зернах мозжечка. //4 Всероссийская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». - 2005. - С. 13.

57. Стельмашук Е.В.. Беляева Е.А., Андреева H.A., Исаев Н.К. Снижение жизнеспособности культивированных клеток-зерен мозжечка при ацидозе. //V Международная конференция по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения — 2006». - С.Пб. -Морфология. - 2006. - т. 129. - № 2. - С. 91.

58. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К. Совместное влияние окислительного стресса и ацидоза на жизнеспособность гранулярных нейронов мозжечка в зрелых и незрелых клеточных культурах. //Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. -М. -2007. - С. 432.

59. Исаев Н.К.. Стельмашук Е.В. Окислительный стресс усиливает токсичность глутамата в незрелых культурах зернистых нейронов мозжечка. Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - М. - 2007. - С. 42.

60. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К. Ацидоз вызывает снижение уровня цитоплазматического кальция и мембранного потенциала митохондрий в культивированных клетках-зернах мозжечка. //Неврологический вестник. - 2007. - 39, в. 1 (приложение к журналу) Материалы научного конгресса «Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность». - с. 239.

61. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Исследование изменений кальциевого баланса и энергетического состояния митохондрий в незрелых клетках-зернах мозжечка при глюкозной депривации. //Неврологический вестник. - 2007. - т. 39, в. 1 (приложение к журналу) Материалы научного конгресса «Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность». - С. 131.

62. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Форсколин защищает незрелые культивированные зернистые нейроны мозжечка от гибели, индуцированной ацидозом. //Тезисы докладов конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - С-Пб. -2008. - С. 61.

63. Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К. Исследование влияния глутамина на жизнеспособность незрелых культивированных зернистых нейронов мозжечка при химической гипоксии. //Тезисы докладов конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - 2008. - СПб. - С. 136.

64. Лозиер Е.Р., Джанибекова Н.А, Стельмашук Е.В.. Исаев Н.К. Глюкозная депривация потенцирует токсическое воздействие уабаина и глутамата на культивированные нейроны различных сроков культивирования. //Тезисы докладов конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - Спб. - 2008. - с 81.

65. Романова Г.А., Шакова Ф.М., Барсков И.В., Стельмашук Е.В.. Назаренко М.Е., Соколов М.А. Ишемические очаговые повреждения коры; коррекция когнитивных расстройств и объема повреждения целлексом". //Патогенез. 3. 2008. с. 84 (Тезисы докладов 5ой конференции "Гиппоксия: механизмы, адаптация,коррекция". - М. - 2008.)

66. Плотников Е.Ю.,. Бакеева JI.E, Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И.,

Казаченко A.B., Кирпатовский В.И., Козловский C.B., Лакомкин B.JL, Левина C.B., Писаренко О.И., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Силачев Д.Н., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В.. Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К.,. Викторов И.В, Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга). //Второй Международный форум по нанотехнологиям (научно-технической секции «Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств») Тезисы докладов. - М. - 2009. Сайт тезисов: http://msnanotech09.msnanofomm.ru/Post.aspx/Show/23687.

67. Исаев Н.К., Мергентхалер Ф., Фраер Д., Стельмашук Е.В.. Маизел А. Роль глутамина в нейрональной гибели, индуцированной ишемией, гипогликемией и гипоксией. //Шестой Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». - Судак. - 2010. Труды /под ред. Лосевой Е.В. Логиновой H.A. Синельниковой B.B. М.: МАКС Пресс. 2010. - С. 143-144.

68. Горячева Е.С., Лозиер Е.Р., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Глутамин модулирует токсическое воздействие ротенона, уабаина и NMDA на незрелые культивированные зернистые нейроны мозжечка. //XXI Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Тезисы докладов. - М. - Калуга: Типография ООО "БЭСТ-принт". 2010. - С. 156-157.

69. Стельмашук Е.В.. Новикова C.B., Алиева И.Б., Узбеков Р.Э., Исаев Н.К. Морфо-функциональное состояние культивированных зернистых нейронов мозжечка крыс при глюкозной депривации и влияние глутамина на их жизнеспособность. //Материалы докладов X конгресса международной ассоциации морфологов. Ярославль, 29-30 сентября 2010 г. Морфология — 2010. - т. 137. - №4. - С. 86.

70. Zorov D.B., Isaev N.K., Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Chupyrkina A.A., Pevzner I.B., Khryapenkova T.G., Jankauskas S.S., Morosanova M.A., Danshina M.I., Goryacheva E.S., Lozier E.R.. Stelmashook E.V. Effects of SkQs on oxidative stress-mediated injuries of kidney and brain. //International Workshop "From Homo sapiens to Homo sapiens liberatus". - M.-

2010.-p. 8-9.

71. Стельмашук E.B.. Новикова, Исаев H.K. Роль Zn2+ и Ca2+ в гибели нейронов, индуцированной ацидозом. Нейронаука для медицины и психологии: 7-й Международный междисциплинарный конгресс. Судак, Крым, Украина, 3-13 июня 2011 г.: Труды /под ред. Лосевой Е.В. Логиновой H.A. - М.: МАКС Пресс. - 2010. - С. 404.

72. Силачев Д.Н., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В.. Барсков И.В., Новикова C.B., Певзнер И.Б., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., гуляев М.В., Пирогов Ю.А., Горячева Е.С., Лоизер Е.Р., Скулачев В.П., Зоров Д.Б. Новое поколение митохондриальнонаправленных антиоксидантов обладает нейропротекторным действием. //Материалы Седьмой национальной научно-практической конференци с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Смоленск.- 2011.-С. 260-262.

73. Лозиер Е.Р., Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Алиева И.Б., Новикова C.B. Стельмашук Е.В. Цинк потенцирует токсическое действие каината на культивированные зернистые нейроны мозжечка. //Тезисы докладов 6й Российской конференции с международным участием "Гиппоксия: механизмы, адаптация,коррекция", Москва 11-13 октября 2011 г. Патогенез. -

2011. - т. 9. - № 3. - С. 43.

Жирным шрифтом выделены журналы, рекомендованные ВАК РФ.

Обзорные статьи

Исаев Н.К., Андреева H.A., Стельмашук Е.В.. Зоров Д.Б. Роль митохондрий в механизмах токсического действия глутамата. //Биохимия. - 2005. - т. 70. в. 6. с. 741-750.

Исаев Н.К., Стельмашук Е.В.. Зоров Д.Б. Клеточные механизмы гипогликемии. //Биохимия. - 2007. - т. 72. - в. 5. - С. 586-595.

Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д.. Стельмашук Е.В.. Васильева А.К., Архангельская A.A., Хряпенкова Т.Г. Митохондрия как многоликий Янус. //Биохимия. - 2007. - т. 72. - в. 10. - С. 1371-1384.

Исаев Н.К.. Стельмашук Е.В.. Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Лозиер Е.Р., Долудин Ю.В., Силачев Д.Н., Зоров Д.Б. Роль ацидоза, NMDA-подтипа глутаматных рецепторов и кислоточувствительных каналов (ASIC 1а) в развитии нейрональной гибели при ишемии. //Биохимия. 2008. т. 73. в. 11. с. 1461-1466.

Stelmashook E.V.. Isaev N.K., Lozier E.R., Goryacheva E.S., Khaspekov L.G. Role of glutamine in neuronal survival and death during brain ischemia and hypoglycemia. Hint. J. Neurosci. 2011. v. 121 N 8. p. 415-422.

Список сокращений.

АФК - активные формы кислорода

ГД - глюкозная депривация

КЗН - культивированные зернистые нейроны

МК-801 - (+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо(а,с1)цикло-гептен-5,10-имин малеат Р123 - родамин 123

ТМРЭ - этиловый эфир тетраэтилродамина Уа - уабаин

АТР - аденозин три фосфат

ВАРТА- 1Д-бис(о-а\шнофепокси)етан-М,Ы,Ы',ЬГ-тетрауксусная кислота [Са2+]е, [Ca2+]i - внеклеточная и внутриклеточная концентрация Са2+, соответственно СССР - карбонил-1-цианид-З-хлорофенил гидрозон DIV - сутки in vitro

EIPA - 5-(Ы-этил-К-изопропил)амилорид Glu - глутамат

NMDA - N-метил-О-аспартат

рНе, pHi - внеклеточный, внутриклеточный рН (отрицательный десятичный логарифм

концентрации ионов Н+), соответственно

SkQRl - Ю-(б-пластохинонил) додецилродамина

TPEN - тетракис-(2-пиридилметил)этилендиамин

AIV - митохондриальный мембранный потенциал

Заказ № 11-П/07/2012 Подписано в печать 05.07.2012 Тираж 120 экз. Усл. п.л.2,4

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Стельмашук, Елена Викторовна

Список сокращений.

Глава 1. Введение.

Глава 2. Обзор литературных данных

2.1. Экспериментальные подходы к моделированию ишемического повреждения нейронов головного мозга.

2.1.1. Моделирование ишемии in vivo.

2.1.2. Моделирование ишемии in vitro.

2.2. Развитие ишемического повреждения нейронов головного мозга.

2.2.1. Нейроцитотоксический эффект глутамата и роль митохондрий в его развитии.

2.2.2. Депривация по глюкозе.

2.2.3. Свободнорадикальное повреждение нейронов.

2.2.4. Нарушение кислотно-щелочного равновесия.

2.3. Роль глутамина в выживании и гибели нейронов.

2.4. Фармакологическая защита нейронов от ишемического повреждения.

2.5. Защита нейронов головного мозга от ишемического повреждения путем воздействия на эндогенные нейропротекторные системы.

Глава 3. Материал и методы исследования

3.1. Объект исследования.

3.2. Получение диссоциированных монослойных культур.

3.3. Приготовление субстратов для культивирования.

3.4. Схемы экспериментальных воздействий.

3.4.1. Моделирование факторов ишемического повреждения нейронов in vitro.

3.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии.

3.6. Методы количественного анализа культур и оценки выживаемости.

3.7. Флуресцентная микроскопия.

3.7.1. Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и Хп2+.

3.7.2. Определение мембранного потенциала митохондрий с помощью родамина.

3.7.3. Определение активных форм кислорода гидроэтидином.

3.8. Электронная микроскопия.

3.9. Количественное определение мРНК к А81С1а методом ПЦР.

3.10. Фотоиндуцированный тромбоз.

3.11. Фокальная компрессионная ишемия.

3.12. Измерение объема очага ишемического повреждения.

3.13. Условный рефлекс пассивного избегания.

Глава 4. Результаты исследования

4.1. Морфология культивированных зернистых нейронов мозжечка.

4.2. Цитотоксическое действие глутамата.

4.2.1. Сравнительный анализ цитотоксического действия глутамата на зернистые нейроны в различные сроки культивирования.

4.3. Нейродеструктивное действие глюкозной депривации.

4.3.1. Жизнеспособность нейронов при глюкозной депривации.

4.3.2. Изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Са2+],) и мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации

4.3.3. Возрастание продукции активных форм кислорода в культивированных зернистых нейронах при глюкозной депривации.

4.3.4. Влияние митохондриальных ингибиторов на [Ca2+]i и продукцию активных форм кислорода при глюкозной депривации.

4.3.5. Влияние рутениевого красного и пиру вата на изменение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации.

4.3.6. Зависимость действия глюкозной депривации от степени морфохимической дифференцировки культивированных зернистых нейронов in vitro. Обратимость эффекта глюкозной депривации.

4.4. Окислительный стресс.

4.4.1. Цитотоксическое действие параквата на нейрохимически зрелые и незрелые культивированные зернистые нейроны и значение глутамина для развития цитотоксичности.

4.4.2. Антиоксидантный статус культивированных зернистых нейронов в различные сроки культивирования.

4.4.3. Влияние предобработки уабаином зрелых и незрелых культивированных зернистых нейронов на окислительный стресс и нейрональный апоптоз.

4.5. Ацидоз.

4.5.1. Влияние ацидоза на жизнеспособность нейронов.

4.5.2. Механизмы действия ацидоза на незрелые культивированные зернистые нейроны.

4.5.3. Исследование механизма защитного действия менадиона.

4.6. Особенности действия глутамина на культивированные зернистые нейроны.

4.6.1 Влияние глутамина на мембранный потенциал митохондрий зрелых культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации.

4.6.2. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов в норме и условиях глюкозной депривации.

4.6.3. Влияние пирувата на жизнеспособность культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации.

4.6.4. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов при химической гипоксии, индуцированной ротеноном.

4.6.5. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+], незрелых культивированных зернистых нейронов при действии ротенона.

4.6.6. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+], в незрелых культивированных зернистых нейронах при ингибированиии Na+/K+-АТРазы уабаином.

4.6.7. Влияние глутамина на выживаемость, [Са2+], и мембранный потенциал митохондрий незрелых культивированных зернистых нейронов при гиперстимуляции NMDA-рецепторов.

4.6.8. Влияние глутамина на гибель культивированных нейронов коры головного мозга при ишемии, гипоксии, глюкозной депривации.

4.7. Совместное действие повреждающих факторов ишемии.

4.7.1. Паракват потенцирует токсическое действие глутамата в незрелых культивированных зернистых нейронах.

4.7.2. Совместное действие ацидоза и параквата.

4.7.3. Совместное действие стауроспорина и умеренного ацидоза.

4.8. Защита нейронов от повреждения с применением нейропротекторов.

4.8.1. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов препаратами семейства SkQ in vitro.

4.8.2. Влияние SkQRl на объем очага повреждения коры головного мозга крысы, индуцированного компрессионной ишемией.

4.8.3. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов при моделировании ишемии in vitro с помощью препарата цел леке.

4.8.4. Изменение объема ишемического очага, индуцированного фототромбозом, при действии целлекса.

4.8.5. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов с помощью препарата ГК-2.

4.8.6. Изменение объема очага ишемического повреждения фотоиндуцированным тромбозом при действии ГК-2.

Глава 5. Обсуждение результатов

5.1. Диссоциированные культуры клеток головного мозга как объект исследования механизмов ишемического повреждения нейронов.

5.2. Исследование механизмов патологических процессов, вызываемых ишемическим повреждением культивированных нейронов.

5.2.1. Механизмы цитотоксического повреждения нейронов, вызываемого глутаматом.

5.2.2. Механизмы повреждения нейронов при глюкозной недостаточности.

5.2.3. Обратимость морфофункциональных изменений культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации.

5.2.4. Ацидоз.

5.2.5. Окислительный стресс.

5.2.6. Влияние глутамина на повреждение нейронов.

5.3. Сравнение токсического воздействия на зернистые нейроны различных сроков культивирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы повреждения и защита нейронов головного мозга при экспериментальном моделировании ишемии"

Актуальность темы

Гомеостаз глюкозы и кислорода в крови и клетке является одним из определяющих факторов нормальной жизнедеятельности всех органов в целом и нервной системы в частности. Необычайная зависимость функционирования головного мозга от притока глюкозы из крови объясняется, прежде всего, тем, что собственные запасы данного углевода в ткани мозга чрезвычайно малы по сравнению с высокой интенсивностью его потребления. Если учесть, что вся глюкоза в мозге используется только для окисления, то ее запасы могут быть полностью исчерпаны за 4-6 минут (Ашмарин с соавт., 1999). Истощение запасов глюкозы ведет к снижению скорости гликолиза и, как следствие, к уменьшению поступления пирувата в цикл трикарбоновых кислот, протекающий в митохондриях, и к снижению генерации АТР. Еще более губителен для нейронов одновременный дефицит глюкозы и кислорода, что происходит при нарушении кровоснабжения головного мозга или его участка. В результате кислородного голодания митохондрии клеток мозга в процессе окислительного фосфорилирования не могут эффективно использовать имеющиеся запасы энергетических субстратов, что ведет к накоплению лактата и развитию ацидоза, который является одним из факторов, повреждающим нейроны (Katsura, et al., 1992; Yermolaieva et al., 2004; Xiang et al., 2004; Xiong et al., 2004). Однако полной ясности в вопросе о характере влияния ацидоза на развитие гибели нейронов при ишемии пока нет.

В многочисленных исследованиях показано, что одним из важных патогенетических факторов повреждения нейронов при энергетическом дефиците является гиперстимуляция глутаматных рецепторов, связанная с внеклеточным накоплением глутамата, происходящим в результате нарушения энергозависимого обратного захвата глутамата нервными и глиальными клетками, а также активации митохондриальной глутаминазы (Huang and Hertz, 1994; Lipton, 1999; Guo et al., 2009). Гиперактивированные глутаматные рецепторы длительно удерживают в открытом состоянии управляемые ими ионные каналы, через которые в нейрон начинают избыточно поступать ионы Na+ и Са2+ и выходить в межклеточное пространство ионы К+. Деполяризация мембраны приводит к открытию потенциал-зависимых Са2+-каналов. Именно повышение внутриклеточной концентрации Са2+ запускает сложный каскад процессов, повреждающих нейроны при ряде патологических состояний головного мозга (Matute, 2010) и, в частности, в результате цитотоксического действия возбуждающих аминокислот (Choi, 1985). Деструктивный эффект при нарушении ионного баланса в клетках и межклеточной среде в периоды кислородно-глюкозного дефицита и реперфузии усугубляется тем, что во время ишемии и в постишемический период снижается активность №7К+-АТРазы - важнейшей системы поддержания в клетках ионного гомеостаза (Kaur and Arora, 1994; Mrsic-Pelcic et al., 2004). Исходя из этого, мы предположили возможность индукции толерантности нейронов к составляющим ишемического повреждения - апоптотическому стимулу и окислительному стрессу -транзиторным ингибированием Ыа7К+-АТРазы.

Как глюкозная, так и кислородо-глюкозная депривация сопровождается снижением активности антиоксидантных систем (Homi et al., 2002; Singh et al.,

2004; Jung et al., 2009), что в период реперфузии приводит к возрастанию образования свободных радикалов (Dirnagl et al., 1995; McGowan et al., 2006; Hernandez-Fonseca et al., 2008) и развитию окислительного стресса, который является еще одним важным патогенетическим фактором, усиливающим ишемическое повреждение нейронов. Известно, что митохондриальная цепь транспорта электронов является основным источником активных форм кислорода (АФК), которые даже в условиях нормального метаболизма генерируются митохондриями, а при кальциевой перегрузке, вызываемой ишемией и гипогликемией, их образование может значительно возрастать в результате снижения активности митохондриальных антиоксидантов (Homi et al., 2002, Singh et al., 2004; Jung et al., 2009). Поэтому исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и защите от него в периоды кислородного и глюкозного дефицита, а также при реперфузии является особо актуальным. Особое внимание необходимо уделить поиску и тестированию антиоксидантов, направленных в митохондрии для удаления избытка свободных радикалов.

Важным направлением в исследовании ишемического и гипогликемического повреждения нейронов является изучение возможности использования нейронами отличных от глюкозы энергетических субстратов и в первую очередь глутамина, так как его концентрация, по сравнению с другими аминокислотами, в головном мозге довольно высока (Ашмарин с соавт. 1999), и он способен утилизироваться митохондриями (Peng et al., 2007). В настоящее время значение альтернативных глюкозе и пирувату энергетических субстратов в поддержании ионного баланса нейронов в патологических условиях мало изучено, а сохранение функциональной активности (мембранного потенциала) митохондрий с помощью глутамина до наших исследований прямо показано не было. Таким образом, выяснение значения митохондрий, кальциевой перегрузки нейронов при патологических состояниях головного мозга, их взаимосвязи и взаимозависимости является актуальным направлением исследования и требует использования различных экспериментальных моделей. Это позволит выделить ключевые звенья в механизмах повреждения нейронов и прогнозировать возможности фармакологической коррекции ишемических нейродеструктивных процессов.

Наряду с исследованием патогенетических процессов во взрослом организме, связанных с энергетическим дефицитом, для развивающегося мозга существует такая проблема, как пренатальная гипоксия. Нейроны развивающегося мозга значительно отличаются от зрелых нейронов отсутствием или низкой экспрессией рецепторов к возбуждающим медиаторам, а также незрелостью систем антиоксидантной защиты и поддержания ионного гомеостаза. Механизмы развития повреждений у зрелых и незрелых нейронов также могут существенно различаться. Так, при гипоксии/ишемии мозга новорожденных крыс апоптотическая гибель нейронов происходит в значительной степени с участием апоптоз-индуцирующего фактора {ХЪи е1 а1., 2003), тогда как у взрослых животных апоптоз развивается по пути, связанному с активацией каспаз. Однако знания о чувствительности нейронов различной нейрохимической зрелости к повреждающим факторам ишемии были отрывочны и фрагментарны, что требовало дальнейшего исследования.

Целью исследования явилось изучение внутриклеточных механизмов ишемических нейродеструктивных процессов, выяснение роли митохондрий, ионов кальция и цинка, глутамина, снижения активности №7К+-АТРазы и проверка возможности эффективной защиты нейронов с помощью белково-пептидных комплексов и матохондриально-адресованных антиоксидантов.

Задачи исследования

7. Изучить влияние умеренной транзиторной блокады Na+/K+-ATPa3bi на выживаемость нейронов при действии окислительного стресса и индуктора апоптоза стауроспорина.

Впервые установлено, что глутамат и глюкозная депривация культивированных зернистых нейронов мозжечка ведут к кальцийзависимому падению мембранного потенциала митохондрий этих клеток, которое при часовой глюкозной депривации было обратимым.

При сопоставлении функциональной активности и ультраструктуры митохондрий нейронов впервые выявлено, что часовая глюкозная депривация ведет к снижению мембранного потенциала у всей популяции митохондрий, однако их морфология варьирует от полностью интактных до органелл с конденсированным матриксом или с локальными набуханиями и потерей крист.

Впервые показано, что кальциевая перегрузка и снижение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации более выражено в зрелых зернистых нейронах, культивированных 7 суток.

Обнаружено, что ингибирование митохондриальных функций (белковых комплексов цепи переноса электронов или АТРсинтазы, разобщение дыхания и фосфорилирования) в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы, но снижает уровень АФК культивированных нейронов.

Выявлено, что в условиях глюкозной депривации глутамин поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует клеточной гибели, но потенцирует ее, если причиной повреждения нейронов является нарушение функционирования митохондрий.

Открыт новый механизм гибели нейронов при закислении среды культивирования. Незрелые зернистые нейроны мозжечка in vitro характеризуются низким уровнем экспрессии кислоточувствительных каналов (ASIC la), поэтому внеклеточный ацидоз сопровождается не повышением уровня внутриклеточного кальция в этих клетках, а его снижением. Токсическое действие ацидоза на такие культуры обусловлено повышением в цитоплазме нейронов уровня свободного цинка, что вызывает ингибирование первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и развитие окислительного стресса.

Впервые показано, что шунтирование первого комплекса цепи переноса электронов митохондрий менадионом при действии параквата оказывает нейропротекторный эффект.

Фармакологическое прекондиционирование (умеренная транзиторная блокада Na+/K+-ATPa3bi) препятствует гибели нейронов, вызванной окислительным стрессом и индуктором апоптоза стауроспорином.

Белковый комплекс целлекс, аналог фактора роста нервов ГК-2 и новый класс митохондриально-адресованных антиоксиданов SkQ проявляют выраженные нейропротекторные свойства при моделировании ишемии in vitro и in vivo, повышая выживаемость культур и уменьшая объем зоны повреждения головного мозга.

Научно-практическое значение работы

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выживаемость зернистых нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro зависит от сроков культивирования: при глюкозной депривации и токсическом действии, опосредованном гиперактивацией глутаматиых рецепторов, гибнет больший процент зрелых клеток-зерен, а при окислительном стрессе и ацидозе — незрелых.

Апробация диссертационного материала

Основные положения диссертации были представлены на 2м съезде биохимического общества РАН (Пущино, 1997), Зй международной конференции «Колосовские чтения 97» (Санкт-Петербург, 1997), 33м международном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997), Международной конференции «Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования» (Минск, 2001), 2й - 6й Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция» (Москва, 1997, 2002, 2005, 2008, 2011), на 2м и Зм конгрессах по патофизиологии (Москва, 2000, 2004), Конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (Москва, 2003), Конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), Всероссийских научных конференциях с международным участием НИИ мозга и НЦН РАМН по проблеме «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 1999, 2000, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010), 5й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения -2006» (Санкт-Петербург, 2006), XX и XXI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), Научном конгрессе «Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007), Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 2м международном форуме по нанотехнологиям, научно-техническая секция "Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств" (Москва, 2009), VI и VII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2010, 2011), X конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), межлабораторной конференции отдела исследований мозга НЦН РАМН (2009, 2011), научной конференции НЦН РАМН (2010), семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (2012).

Конкретное личное участие автора в получении результатов

По теме диссертации опубликовано 73 работы, в том числе 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ (15 в отечественных и 12 в зарубежных), в которых достаточно полно представлены результаты исследования. Кроме того, по теме диссертации опубликовано 5 обзоров в ведущих рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 280 страницах, построена по традиционному плану и состоит из 7 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы и список литературы, включающий 535 источника. Работа иллюстрирована 87 рисунками: диаграммами, фотографиями, схемами.

Глава 2. Обзор литературных данных

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Стельмашук, Елена Викторовна

6. ВЫВОДЫ

1. Степень повреждения культур зернистых нейронов мозжечка под влиянием повреждающих факторов ишемии зависит от сроков культивирования: деструкция зрелых нейронов (7-8 дней in vitro) наиболее выражена при глюкозной депривации и гиперактивации глутаматных рецепторов, тогда как незрелых (3-4 дня in vitro) - при окислительном стрессе и ацидозе.

2. Кратковременная (в течение часа) глюкозная депривация, приводящая к снижению мембранного потенциала митохондрий, указывающему на их дисфункцию, сопровождается гетерогенным изменением ультраструктуры митохондрий, популяция которых содержит как интактные, так и конденсированные органеллы, а также митохондрии с локальными набуханиями и разрушением крист.

5. Снижение мембранного потенциала митохондрий и гибель нейронов при глюкозной депривации предотвращаются глутамином, который в отсутствие глюкозы может служить энергетическим субстратом окислительного фосфорилирования. В то же время, при дисфункции митохондрий, вызванной цитотоксическим воздействием, глутамин снижает выживаемость нейронов в результате гиперактивации глутаматных рецепторов синтезируемым из него глутаматом.

9. Новые фармакологические препараты повышают выживаемость нейронов в культурах, подвергнутых действию повреждающих факторов ишемии: белковый комплекс целлекс - при токсическом действии глутамата, пептид ГК-2 и митохондриально-адресованные антиоксиданты семейства SkQ -при окислительном стрессе. Указанные препараты препятствуют увеличению объема ишемического очага и функциональным нарушениям при моделировании фокальной ишемии коры головного мозга in vivo.

5.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При кратковременной глюкозной депривации большая часть нейронов, несмотря на выраженную кальциевую перегрузку и снижение Д^щ, сохраняет жизнеспособность. Это свидетельствует о том, что повышение [Ca2+]i непосредственно после повреждающего воздействия не является обязательным признаком последующей клеточной гибели. Вероятно, первоначальное снижение Д¥т выполняет защитную функцию, предотвращая аккумуляцию Са2+ в митохондриях до критического уровня, превышение которого приводит к набуханию и деструкции митохондрий, а в дальнейшем и к гибели нейронов. Показано, что нейрохимически зрелые нейроны сильнее, чем незрелые, подвержены деструктивному действию глюкозной депривации.

Обнаруженное нами нейропротекторное действие менадиона проявляется только в случае, если химическая гипоксия вызвана блокадой комплекса I дыхательной цепи митохондрий, и может служить маркером повреждений, связанных с нарушением его функционирования. Следовательно, вышеописанное нейродеструктивное действие параквата, уменьшаемое менадионом, повреждает этот комплекс. Поскольку защитный эффект менадиона наблюдается и при внеклеточном ацидозе, то повреждение культивированных зернистых нейронов под влиянием ацидоза связано с вызываемым Zn2+ ингибированием комплекса I, который при этом усиленно продуцирует активные формы кислорода. Однако не стоит забывать, что одной из причин повреждения этого типа нейронов может являться обнаруженное нами снижение [Са2+]1; поскольку это может служить сигналом развития каскада, индуцирующего апоптоз. Незрелые зернистые нейроны сильнее повреждаются ацидозом, чем достигшие нейрохимической зрелости.

В основу таких разработок может быть положено использование существующих эндогенных нейропротекторов, их синтетических аналогов с заданными свойствами или получение препаратов, стимулирующих эндогенную продукцию нейропротекторов. К таким веществам, несомненно, относятся соединения, использованные в нашей работе. Так, показана возможность индукции ишемической толерантности путем снижения активности Na+/K+-ATPa3bi уабаином, предобработка которым является эффективной защитой зрелых нейронов in vitro от окислительного стресса и апоптоза, опосредуемой, вероятно, ингибированием высокоаффинной формы

Na+/K+-ATPa3bi, активацией Akt-киназ и усилением антиоксидантной защиты. Кроме того, ярко выраженным нейропротекторным действием in vivo и in vitro обладают исследованные нами белковый комплекс целлекс, дипептид ГК-2 и митохондриально-адресованный антиоксидант SkQRl, что указывает на перспективность их использования в дальнейших предклинических и клинических испытаниях при ишемических формах церебральной патологии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Стельмашук, Елена Викторовна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж.// Молекулярная биология клетки. /М: Мир. 1987.

2. Антоненко Ю.Н., Аветисян A.B., Бакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Клишин С.С., Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина O.K., Пашковская

3. B.П. 1. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 1. Катионные производные пластохинона: Синтез и исследование in vitro. // Биохимия. 2008. - Т. 73. -№ 12.-С. 1589-1606.

4. Ашмарин, И.П., Стукалова, П.В., Ещенко, Н.Д. Биохимия мозга /под ред. Ашмарин, И.П., Стукалова, П.В., Ещенко, Н.Д. СПб: СпбГУ. -1999. - С. 124-159.

5. Барсков И.В. Морфо-функциональное исследование и фармакологическая коррекция фокальных ишемических повреждений коры головного мозга крыс на моделях компрессионной ишемии и фотоиндуцированного тромбоза.// Канд. Дис. Москва. - 2000.

6. Барсков И.В., Викторов И.В. Локальный компрессионный инфаркт коры головного мозга крыс как как экспериментальная модель фокальной ишемии. // Патологии. Физиол. и эксперим. Терапия. 1994. - № 2. - С. 57-59.

7. Боголепов H.H. Ультраструктура мозга при гипоксии./ М: Медицина, 1979.

8. Викторов И.В. Развитие и пластичность нейронов в тканевых и клеточных культурах. // Док. дисс. Москва.- 1987.

9. Викторов И.В., Шунгская В.Е. Методы культивирования. Руководство по культивированию нервной ткани. / М.: Наука. 1988.

10. Викторов И.В., Андреева H.A., Исаев Н.К. // Цитология. 1990. - т. 32. - N 7. - с. 81-84.

11. Витвицкий В.Н. Регулирование генетических процессов в природе и в эксперименте. // М,- 2005.

12. Воробьев А.И. Справочник практического врача. // М.: Медицина. 1991.

13. Ганнушкина И.В., Шафранова В.П., Рясина Т.В. Функциональная ангиоархитектоника головного мозга. / АМН СССР М.: Медицина. - 1977. - 240 с.

14. Гудашева Т.А., Середенин С.Б., Антипова Т.А. Исследование in vitro нейропротективных свойств нового оригинального миметика фактора роста нервов ГК-2. // Бюллетень экс. биол. и мед. 2010. - № 11. - С. 537-540.

15. Колтовер А.Н., Верещагин Н.В., Людковская И.Г., Моргунов В.А. Патологическая анатомия нарушений мозгового кровообращения . // М.: Медицина, 1975, 255 с.

16. Левитина Е.В. Влияние мексидола на клинико-биохимические проявления перинатальной гипоксии у новорожденных детей. // Эксперим. и клинич. фармакология. 2001. - Т. 64. - №2. - С. 34-36.

17. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир. 1969. - с. 40.

18. Литинская Л.Л., Векслер A.M., Туровецкий В.Б. Пространственно-временная гетерогенность внутриклеточного рН как способ регуляции функционального состояния клетки. М. 1987. 29е.- Деп. в ВИНИТИ 25.03.87, №2144-В87.

19. Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Мор Ю.Е. Трансмембранный потенциал регулирует неспецифическую проницаемость внутренней митохонд-риальной мембраны. // Биол. мембраны. 1989. - № 6. - С. 1053-1062.

20. Питере А., Палей С., Уэбстер Г. Ультраструктура нервной системы."Мир". М. 1972.

21. Поварнина П.Ю., Гудашева Т.А., Воронцова О.Н., Бондаренко H.A., Середенин С.Б. Антипаркинсонические свойства дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 в экспериментах in vivo. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2011. - Т. 151. - № 6. - С. 634-638.

22. Полежаев J1.B. Утрата и восстановление регенерационной способности органов и тканей у животных. М.- 1968.

23. Полякова И.А. Структурные и функциональные изменения клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма. // Канд. дис. М. 1991.

24. Попова Э. Н., Лапин С.К., Кривицкая Г.Н. Морфология приспособительных изменений нервных структур. // М.¡"Медицина". 1976. - 263 с.

25. Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты. М.: Медицина. - 1986. 240 с.

26. Середенин С.Б., Гудашева Т.А. // Заявка на изобретение per. № 2009105176 приоритет от 16.02.2009.

27. Серов В.В., Пауков B.C. Ультраструктурная патология./ М.: Медицина 1975.

28. Скворцова И., Стаховская JI.B., Ефремова Н.М., Платонова И.А., Шамалов. H.A. Применениепрепарата нейропептидной природы семакса в первые часы и дни острого церебрального инсульта. Методические рекомендации. М. 2003.

29. Скибо Г.Г. Приготовление препаратов культивируемой нервной ткани для исследования в электронном микроскопе./ Руководство по культивированию нервной ткани. М., Наука. 1988.

30. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «мегапроект» по проникающим ионам. Итоги и перспективы. // Биохимия. -2007. в. 72. № 12. - с. 1700-1714.

31. Суслина З.А., Пирадов М.А. (Под ред.) Инсульт: диагностика, лечение, профилактика. // М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 288 с.

32. Турпаев, К.Т. Активные формы кислорода и экспрессия генов. // Биохимия. 2002. - Т. 67. - С. 339-352.

33. Ходоров Б.И, Пинелис В.Г., Головина В.А., Фаюк Д.А., Уварова Т.М., Андреева Н.А., Хаспеков Л.Г., Викторов И.В. О природе «кальциевой перегрузки» нейрона после токсического воздействия глутамата. // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9. - №10. - С. 1045-1049.

34. Яглова Л.Г., Имашева Э.С., Коссова Г.В., Озрина Р.Д. Основы радиоиндикаторного метода и его применение в биологии. 4.1, "Издательство Московского университета". М. 1985.

35. Abdul-Ghani AS, Ghneim Н, el-Lati S, Saca'an A. Changes in the activity of glutamate related enzymes in cerebral cortex, during insulin-induced seizures. // Int. J. Neurosci. 1989. - v. 44(1-2). - p. 67-74.

36. Ahmad I.M., Aykin-Burns N, Sim J.E., Walsh S.A., Higashikubo R., Buettner G.R., Venkataraman S., Mackey M.A., Flanagan S.W., Oberley L.W. and Spitz D.R. // J. Biol. Chem. 2005. - v. 280.p. 4254-4263.

37. Aksenov M.Yu., Aksenova M.V., Harris M.E., Hensley K., Butterfield D.A. and Carney J.M. Enhancement of beta-amyloid peptide A beta(l-40)-mediated neurotoxicity by glutamine synthetase. // J. Neurochem. 1995. -v. 65. p. 1899-1902.

38. Albers A., Broer A., Wagner C.A., Setiawan I., Lang P.A., Kranz E.U., Lang F. and Broer S. Na+ transport by the neural glutamine transporter ATA1. // Pflugers. Arch.-2001.-v. 443. p. 92-101.

39. Allerand D.C.Pattern of neuronal differentiation in developing cultures of neonatal mouse cerabellum./ J.Comp. Neurol. 1971, v. 142, p. 167-204.

40. Alleva E. and Francia N. Psychiatric vulnerability: suggestions from animal models and role of neurotrophins. // Neurosci. Biobehav. Rev. 2009. - v. 33. -p. 525-536.

41. Almaas R., Pytte M., Lindstad J.K., Wright M., Saugstad O.D., Pleasure D. and Rootwelt T. Acidosis has opposite effects on neuronal survival during hypoxia and reoxygenation. // J. Neurochem. 2003. -v. 84. p. 1018-1027.

42. Alvarez de la Rosa D., Krueger S.R., Kolar A., Shao D., Fitzsimonds R.M., Canessa C.M. Distribution, subcellular localization and ontogeny of ASIC1 in the mammalian central nervous system. // J.Physiol. 2003. v. 546. p. 77-87.

43. Amaral A.I., Teixeira A.P., Sonnewald U., Alves P.M. Estimation of intracellular fluxes in cerebellar neurons after hypoglycemia: importance of the pyruvate recycling pathway and glutamine oxidation. // J. Neurosci Res. 2011. -v. 89(5). - p. 700-710.

44. Amaro S., Soy D., Obach V., Cervera A., Planas A.M. and Chamorro A. A pilot study of dual treatment with recombinant tissue plasminogen activator and uric acid in acute ischemic stroke. // Stroke. 2007. - v. 38. - p. 2173-2175.

45. Andrews R. and Muto R. Retraction brain ischaemia: cerebral blood flow,evoked potentials, hypotension and hyperventilation in a new animal model. //Neurol. Res. 1992(a). - v. 14, p. 12-18.

46. Andrews R. and Muto R. Retraction brain ischemia : mannitol plus nimodipine preserves both cerebral blood flow and evoked potentials duringnormoventilation and hyperventilation. // Neurol. Research, 1992(b), v. 14, p. 19-25.

47. Andrews R.J., Bringas J.R. A review of brain retraction and recommendations for minimizing intraoperative brain injury. // Neurosurgery. 1993. - v. 33(6). p. 1052-1063.

48. Aral Y.Z., Gucuyener K., Atalay Y., Hasanoglu A., Turkyilmaz C., Sayal A., Biberoglu G. Role of excitatory aminoacids in neonatal hypoglycemia. //Acta Paediatr Jpn. 1998. - v. 40. - N 4. - p. 303-306.

49. Ascher P. and Nowak L. Electrophysiological studies on NMDA receptors. // Trends in Neurosci. 1987. - v. 10. - p. 284-288.

50. Astrup J., Siesjo B.K., Symon L. Thresholds in cerebral ischemia. The ischemia penumbra. // Stroke. 1981. - v. 12. - p. 723-725.

51. Auer R.N., Siesjo B.K. Hypoglycaemia: brain neurochemistry and neuropathology. // Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 1993 - v. 7. N 3. - p. 611-625.

52. Auer R.N., Siesjo B.K. Biological differences between ischemia, hypoglycemia, and epilepsy. // Ann Neurol. 1988. - v. 24. - N 6. - p. 699-707.

53. Auer R.N. Hypoglycemic brain damage. // Metab. Brain Disease. 2004. - v. 19. p. 169-175.

54. Ballesteros J.R., Mishra O.P., McGowan J.E. Alterations in cerebral mitochondria during acute hypoglycemia. // Biol. Neonate. 2003. - v. 84. - N 2. -p. 159-163.

55. Batandier C., Leverve X. and Fontaine E. Opening of the itochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. // J. Biol. Chem. 2004. - v. 279. - p. 17197-17204.

56. Beckman J.S., Koppenol W.H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly. // Am. J. Physiol. 1996. - v. 271. - N 5,.- p. C1424-C1437.

57. Behrens P.F., Franz P., Woodman B., Lindenberg K.S. and Landwehrmeyer G.B. Impaired glutamate transport and glutamate-glutamine cycling: downstream effects of the Huntington mutation. // Brain. 2002. - v. 125. - p. 1908-1922.

58. Bengtsson F., Boris-Moller F., Hansen A.J., Siesjo B.K. Extracellular pH in the rat brain during hypoglycemic coma and recovery. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - v. 10. - N 2. - p. 262-269.

59. Benjamin, A.M. Control of glutaminase activity in rat brain cortex in vitro: influence ofglutamate, phosphate, ammonium, calcium and hydrogen ions. // Brain Res. 1981. - v. 208. p. 363-377.

60. Benov L., Sztejnberg L. and Fridovich I. Critical evaluation of the use of hydroethidine as a measure of superoxide anion radical. // Free Radic. Biol. Med. 1998. - v. 25. - p. 826-831.

61. Bernaudin M., Bellail A., Marti H.H., Yvon A., Vivien D., Duchatelle I., Mackenzie E.T., Petit E. Neurons and astrocytes express EPO mRNA: oxygen-sensing mechanisms that involve the redox-state of the brain. // Glia. 2000. v. 30. - p. 271-278.

62. Berthet C., Lei H., Gruetter R., Hirt L. Early predictive biomarkers for lesion after transient cerebral ischemia. // Stroke. 2011. - v. 42. - N 3. - p. 799-805.

63. Bigdeli M.R. Preconditioning with prolonged normobaric hyperoxia induces ischemic tolerance partly by upregulation of antioxidant enzymes in rat brain tissue. // Brain Res. 2009. - v. 1260. - p. 47-54.

64. Bigdeli M.R. Neuroprotection caused by hyperoxia preconditioning in animal stroke models. // Scientific World J. 2011. - v. 11. - p. 403-421.

65. Bindokas V.P. and Miller R.J. Excitotoxic degeneration is initiated at non-random sites in cultured rat cerebellar neurons. // J. Neurosci. 1995. - v. 15. - p. 6999-7011.

66. Bindokas V.P., Jordan J., Lee C.C. and Miller R.J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. // J. Neurosci. -1996. v. 16. - p. 1324-1336.

67. Blake J.F., Brown M.W., Collingridge G.L. CNQX blocks acidic amino acid induced depolarizations and synaptic components mediated by non-NMDA receptors in rat hippocampal slices. // Neurosci. Lett. 1988. - v. 89. - N 2. - p. 182-186.

68. Boron WF. Regulation of intracellular pH. // Adv Physiol Educ. 2004. - v. 28. --N 1-4.-p. 160-179.

69. Bouvier M., Szatkowsk, M., Amato A. and Attwell D. The glial cell glutamate uptake carrier countertransports pH-changing anions. // Nature. 1992. -v. 360. -p. 471-474.

70. Boveris A., Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. // Biochem. J. 1973. - v. 134.-N3. - p. 707-716.

71. Boveris A., Oshino N., Chance B. The cellular production of hydrogen peroxide. // Biochem. J. 1972. v. 128. - N 3. - p.617-630.

72. Brady N.R., Hamacher-Brady A., Westerhoff and H.V., Gottlieb R.A. A wave of reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release in a sea of excitable mitochondria. // Antioxid Redox Signal. 2006. - v. 8. - p. 651-665.

73. Brewer G.J. Espinosa J., Mcllhaney M.P., Pencek T.P., Kesslak J.P., Cotman C., Viel J., McManus D.C. Culter and regeneration of human neurons after brain surgery. // J. Neurosci. Methods.- 2001.- № 1, 2,- p. 15 23.

74. Brewer G.J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. // J. Neurosci. Res. 1995. - v. 42. - p. 674-683.

75. Brorson J.R., Schumacker P.T., Zhang H. Nitric oxide acutely inhibits neuronal energy production. The Committees on Neurobiology and Cell Physiology. // J. Neurosci. 1999. - v. 19. - N 1. - p. 147-158.

76. Brown G.C. Regulation of mitochondrial respiration by nitric oxide inhibition of cytochrome c oxidase. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - v. 504.- p. 46-57.

77. Bruer U., Weih M.K., Isaev N.K., Meisel A., Ruscher K., Bergk A., Trendelenburg G., Wiegand F., Victorov I.V., Dirnagl U. Induction of tolerance in rat cortical neurons: hypoxic preconditioning. // FEBS Lett. 1997. - v. 414. -Nl.-p. 117-121.

78. Brustovetsky N., Dubinsky J.M. Dual responses of CNS mitochondria to elevated calcium. // J. Neurosci. 2000. - v. 20. N 1. - p. 103-113.

79. Budd S.L. and Nicholls D.G. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. // J. Neurochem. -1996.-v. 67.-p. 2282-2291.

80. Burgess W, Liu Q, Zhou J, Tang Q, Ozawa A, VanHoy R, Arkins S, Dantzer R, Kelley K. W. The immune-endocrine loop during aging: role of growth hormone and insulin-like growth factor-I. // Neuroimmunomodulation. 1999. - v. 6. N 1-2. - p. 56-68.

81. Busa W.B. and Nuccitelli R. Metabolic regulation via intracellular pH. // Am. J. Physiol. 1984. - v. 246. - R409-448.

82. Butcher S.P., Sandberg M., Hagberg H. and Hamberger A. Cellular origins of endogenous amino acids released into the extracellular fluid of the rat striatum during severe insulin-induced hypoglycemia. // J. Neurochem. 1987. - v. 48. p. 722-728.

83. Buytendijk F.J.J, and Woerdeman M.W. // Wilhelm Roux Arch. Entwicklungsmech. Org. 1927. - v. 112. - p 387-410.

84. Carter, C.J. Glutamine synthetase and fructose-1, 6-diphosphatase activity in the putamen of control and Huntington's disease brain post mortem. (1983) Life Sci.,32, 1949-1955.

85. Castilho R.F., Ward M.W., and Nicholls D.G. Oxidative stress, mitochondrial function, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. // J. Neurochem. 1999. v. 72. p. 1394-1401.

86. Chan P.H., Kerlan R., Fishman R.A. Reductions of gamma-aminobutyric acid and glutamate uptake and (Na+,K+)-ATPase activity in brain slices and synaptosomes by arachidonic acid. // J. Neurochem. 1983. - v. 40. - N 2. - p. 309-316.

87. Chatagner A., Hiippi P.S., Ha-Vinh Leuchter R., Sizonenko S. Erythropoietin and neuroprotection. // Arch. Pediatr. 2010. - v. 17. Suppl. 3:S78-S84.

88. Chavez E., Rodriguez J.S., Garcia G., Garcia N. and Correa F. Oligomycin strengthens the effect of cyclosporin A on mitochondrial permeability transition by inducing phosphate uptake. // Cell. Biol. Int. 2005. - v. 29. - p. 551-558.

89. Chen Z.L., Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalyzed degradation of laminin. // Cell. 1997. - v. 91. - N 7. - p. 917-925.

90. Chen S.D., Yang D.I., Lin T.K., Shaw F.Z., Liou C.W., Chuang Y.C. Roles of Oxidative Stress, Apoptosis, PGC-la and Mitochondrial Biogenesis in Cerebral Ischemia. // Int. J. Mol. Sci. 2011. - v. 12. - N 10. - p. 7199-7215.

91. Cheng B., Mattson M.P. Glucose deprivation elicits neurofibrillary tangle-like antigenic changes in hippocampal neurons: prevention by NGF and bFGF. // Exp. Neurol. 1992. - v. 117. - N 2. - p. 114-123.

92. Chinopoulos C., Adam-Vizi V. Calcium, mitochondria and oxidative stress in neuronal pathology. Novel aspects of an enduring theme. // FEBS J. 2006. - v. 273. -N3. - p. 433-450.

93. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent. //Neurosci. Lett. 1985. - v. 58. - p. 293-297.

94. Choi DW. Dextrorphan and dextromethorphan attenuate glutamate eurotoxicity. // Brain Res. 1987a. - v. 403. - N 2. - p. 333-336.

95. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neuro toxicity. // J. Neurosci. -1987b.-v. 7. N 2. - p.369-379.

96. Choi D.W. Calcium-mediated neurotoxicity: relationship to specific channel types and role in ischemic damag. // Treds/ Neurosci. 1988. - v. 11. - N 10. - p. 465-469.

97. Choi D.W. Cerebral hypoxia: some new approaches and unanswered questions. // J. Neurosci. 1990. - v. 10. p. 2493-2501.

98. Ciardo A., Meldolesi J. Regulation of intracellular calcium in cerebellar granule neurons: effects of depolarization and of glutamatergic and holinergic stimulation. // J. Neurochem. 1991. - v. 56. - N 1. - p. 184-191.

99. Cicchetti F., Drouin-Ouellet J., Gross R.E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models? // Trends Pharmacol. Sci. 2009. - v. 30. -№ 9. - p. 475-483.

100. Cingolani C., Rogers B., Lu L., Kachi S. and Shen J. Retinal degeneration from oxidative damage. // Campochiaro P.A. / Free Radic. Biol. Med. 2006. - v. 40. -p. 660-669.

101. Colvin R.A. pH dependence and compartmentalization of zinc transported across plasma membrane of rat cortical neurons. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. -2002.-v. 282.-p. C317-29.

102. Correia S.C., Carvalho C., Cardoso S., Santos R.X., Santos M.S., Oliveira C.R., Perry G., Zhu X., Smith M.A., Moreira P.I. Mitochondrial preconditioning: a potential neuroprotective strategy. // Front Aging Neurosci. 2010. - v. 26. - N 2. -p. 138.

103. Corthesy-Theulaz I., Merillat A.M., Honegger P., Rossier B.C. Na+-K+-ATPase gene expression during in vitro development of rat fetal forebrain. // Am. J. Physiol. 1990. - v. 258(6 Pt 1). -:C1062-C10629.

104. Crumrine R.C.,and Lamanna J.C. Regional cerebral metabolites, blood flow, plasma volume, and mean transit time in total cerebral ischemia in the rat. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1991. - v. 11. - p. 272-282.

105. Curthoys N.P. and Watford M. Regulation of glutaminase activity and glutamine metabolism. // Annu. Rev. Nutr. 1995. - v. 15. - p. 133-159.

106. Darsalia V., Heldmann U., Lindvall O., Kokaia Z. Stroke induced neurogenesis in aged brain. // Stroke.- 2005. № 36,- p. 1790 - 1795.

107. Dawson, V.L., Kizushi V.M., Huang P.L., Snyder S.H. and Dawson T.M. Resistance to neurotoxicity in cortical cultures from neuronal nitric oxide synthase-deficient mice. // J. Neurosci. 1996. - v. 16. - p. 2479-2487.

108. Dedukhova V.I., Kirillova G.P., Mokhova E.N., Rozovskaia I.A., Skulachev V.P. Effect of menadione and vicasol on mitochondrial energy during inhibition of initiation sites of the respiration chain. // Biokhimiia. 1986. - v. 51. - N 4. -p. 567-573.

109. Deitmer J.W., Broer A. and Broer S. Glutamine efflux from astrocytes is mediated by multiple pathways. // J. Neurochem. 2003. -v. 87. - p. 127-135.

110. Delgado-Esteban M., Almeida A., Bolanos .JP. D-Glucose prevents glutathione oxidation and mitochondrial damage after glutamate receptor stimulation in rat cortical primary neurons. // J. Neurochem. 2000. - v. 75. - N 4. - p. 1618-1624.

111. Dietrich W.D., Prado R., Watson B.D. Photochemically stimulated blood -borne factors induce blood-brain barrier alterations in rats. // Stroke. 1988. v. 19. - p. 857-862.

112. Digicaylioglu M., Bichet S., Marti H.H., Wenger R.H., Rivas L.A., Bauer C., Gassmann M. Localization of specific erythropoietin binding sites in defined areas of the mouse brain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - v. 92. - p. 3717-3720.

113. Dineley K.E., Votyakova T.V., Reynolds IJ. Zinc inhibition of cellular energy: production: implications for mitochondria and neurodegeneration. // J. Neurochem. 2003. - v. 85. - N 3. - p. 563-570.

114. Ding D., Moskowitz S.I., Li R., Lee S.B., Esteban M., Tomaselli K., Chan J., and Bergold P.J. Acidosis induces necrosis and apoptosis of cultured hippocampal neurons. // Exp. Neurol. 2000. - v. 162. - p. 1-12.

115. DiPolo R. and Beauge L. Ca2+ transport in nerve fibers. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - v. 947. - p. 549-569.

116. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M.A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. // Trends Neurosci. 1999. - v. 22. - N 9. - p. 391-397.

117. Dirnagl U. and Meisel A. Endogenous neuroprotection: mitochondria as gateways to cerebral preconditioning? // Neuropharmacology. 2008. - v. 55. - p. 334-344.

118. D'Mello S.R., Anelli R., Calissano P. Lithium induces apoptosis in immature cerebellar granule cells but promotes survival of mature neurons. // Exp. Cell Res. 1994. - v. 211. -N 2. - p. 332-338.

119. Dong H., Xiong L., Zhu Z., Chen S., Hou L., Sakabe T. Preconditioning with hyperbaric oxygen and hyperoxia induces tolerance against spinal cord ischemia in rabbits. // Anesthesiology. 2002. - v. 96. - N 4. - p. 907-912.

120. Dubinsky J.M., Rothman S.M. Intracellular calcium concentrations during chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. // J Neurosci. 1991. - v. 11. - N 8. - p. 2545-2551.

121. Dykens J.A. Isolated cerebral and cerebellar mitochondria produce free radicals when exposed to elevated Ca2+ and Na+: implications for neurodegeneration. // J. Neurochem. 1994. - v. 63. - p. 584-591.

122. Eimerl S. and Schramm M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. // J. Neurochem. 1994. - v. 62. - p. 1223-1226.

123. Ekholm A., Asplund B. and Siesjo B.K. Perturbation of cellular energy state in complete ischemia: relationship to dissipative ion fluxes. // Exp. Brain Res. -1992. v. 90. - p. 47-53.

124. Eklof B. and Siesjo B.K. The effect of bilateral carotid artery ligation upon acid-base parameters and substrate levels in the brain. // Acta Physiol. Scand. -1972. v. 86. - p. 528-538.

125. Endres M., Wang Z.Q., Namura S., Waeber C. and Moskowitz M.A. Ischemic brain injury is mediated by the activation of poly(ADP- ribose)polymerase. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1997.-v. 17.-p. 1143-1151.

126. Ereciriska M., Zaleska M.M., Nelson D., Nissim I. and Yudkoff M. Neuronal glutamine utilization: glutamine/glutamate homeostasis in synaptosomes. // J. Neurochem. 1990. - v. 54. - p. 2057-2069.

127. Escartin C., Valette J., Lebon V. and Bonvento G. Neuron-astrocyte interactions in the regulation of brain energy metabolism: a focus on NMR spectroscopy. // J. Neurochem. 2006. - v. 99. - p. 393^401.

128. Facci L., Leon A., Skaper S.D. Hypoglycemic neurotoxicity in vitro: involvement of excitatory amino acid receptors and attenuation by monosialoganglioside GM1. //Neuroscience. 1990. - v. 37. - N 3. - p. 709-716.

129. Farooqui A.A., Ong W.-Yi., Horrocks L.A. Neurochemical Aspects of Excitoxicity. // New York: Springer Science and Business Media. 2008.

130. Favaron M., Manev M., Rimland J. M., Candeo P., Beccaro M. and Manev H. NMDA-stimulated expression of BDNF mRNA in cultured cerebellar granule neurones. // NeuroRepot. 1993. - v. 4. - p. 1171-1174/

131. Fedorovich S.V., Kaler G.V. and Konev S.V. Effect of low pH on glutamate uptake and release in isolated presynaptic endings from rat brain. // Neurochem. Res.-2003.-v. 28. p. 715-721.

132. Fieschi C., Sakurada O., Sokoloff L. Local cerebral glucose utilization during resolution of embolic experimental ischemia. // Adv. Neurol. 1978. - v. 20. -p. 223-229.

133. Frade J.M. and Barde Y.A. Nerve growth factor: two receptors, multiple functions. // Bioessays. 1998. - v. 20. - p. 137-145.

134. Frandsen A., Schousboe A. Development of excitatory amino acid induced cytotoxicity in cultured neurons. // Int. J. Dev. Neurosci. 1990. - v. 8. - p. 209-216.

135. Frederickson C.J., Moncrieff D.W. Zinc-containing neurons. // Biol. Signals. -1994. v. 3. -N3. - p. 127-139.

136. Froyland, E., Wibrand, F., Almaas, R., Dalen, I., Lindstad, J.K. and Rootwelt, T. Acidosis during reoxygenation has an early detrimental effect on neuronal metabolic activity. // Pediatr. Res. 2005. - v. 57. - p. 488-493.

137. Fukushima T., Yamada K., Isobe A., Shiwaku K., Yamane Y. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. I. NADH oxidation and paraquat radical formation via complex I. // Exp. Toxicol. Pathol. 1993. - v. 45. - N 5-6. - p. 345-349.

138. Futrell N. An improved photochemical model of embolic cerebral infarction in rats. // Stroke, 1991, v.22, p. 225-232.

139. Futrell N., Riddle J.M. The ultrastructure of photochemically induced thrombi with embolization in a rat model. // Stroke, 1993, v. 24, p. 1983-1992.

140. Galli C., Meucci O., Scorziello A., Werge T.M., Calissano P. and Schettini G. Apoptosis in cerebellar granule cells is blocked by high KC1, forskolin, and

141. F-1 through distinct mechanisms of action: the involvement of intracellular calcium and RNA synthesis. // J. Neurosci. 1995. - v. 15. - p. 1172-1179.

142. Gallo V., Ciotti M.T., Aloisi F., Levi G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differen tiating in culture. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1982. v. 79. - p. 7919-7923.

143. Gao J., Duan B., Wang D.G., Deng X.H., Zhang G.Y., Xu L. and Xu T.L. Coupling between NMDA receptor and acid-sensing ion channel contributes to ischemic neuronal death. //Neuron. 2005. - v. 48. - p. 635-646.

144. Garcia J., Kai-Feng Liu, Khang-Loon Ho. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in wistar rats. Progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. // Stroke. 1995. - v. 26. - N 4. - p. 636-643.

145. Gazaryan I.G., Krasinskaya I.P., Kristal B.S., Brown A.M. Zinc irreversibly damages major enzymes of energy production and antioxidant defense prior to mitochondrial permeability transition. // J. Biol. Chem. 2007. -v. 282. -N 33. -p. 24373-24380.

146. Gilland E, Puka-Sundvall M, Hillered L, Hagberg H. Mitochondrial function and energy metabolism after hypoxia-ischemia in the immature rat brain: involvement of NMDA-receptors. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1998. - v. 18. - N 3. - p. 297-304.

147. Ginsberg M. and Busto R. Rodent models of cerebral ischemia. // Stroke. -1989. v. 20. - p. 1627-1642.

148. Ginsberg M.D. Neuroprotection for ischemic stroke: past, present and future. // Neuropharmacology. 2008. - v. 55. - N 3. - p. 363-389.

149. Giulivi C. Characterization and function of mitochondrial nitric-oxide synthase. // Free Radic Biol Med. 2003. - v. 34. - N 4. - p. 397-408.

150. Goldberg, M.P., and Choi D.W. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury. // J. Neurosci. 1993. - v. 13. - p. 3510-3524.

151. Goldberg M.P., Monyer H. and Choi D.W. Hypoxic neuronal injury in vitro depends on extracellular glutamine. //Neurosci. Lett. 1988. - v. 94. - p. 52-57.

152. Golgi C. Sulla fine anatomia degli organi centrali del sistema nervoso. -Milano: Hocpli. 1886.

153. Gonzalez-Polo R.A., Rodriguez-Martin A., Moran J.M., Niso M., Soler G., Fuentes J.M. Paraquat-induced apoptotic cell death in cerebellar granule cells. // Brain Res.- 2004. v. 1011, - p.170-176.

154. Grabb M.C., Choi D.W. Ischemic tolerance in murine cortical cell culture: critical role for NMD A receptors. // J. Neurosci. 1999. - v. 19. - N 5. - p. 1657-1662.

155. Grasso G., Sfacteria A., Meli F., Fodale V., Buemi M. and Iacopino D.G. Neuroprotection by erythropoietin administration after experimental traumatic brain injury. // Brain Res. 2007. - v. 1182. - p. 99-105.

156. Gu L., Liu X., Yang Y., Luo D., Zheng X. ASICs aggravate acidosis-induced injuries during ischemic reperfusion. // Neurosci. Lett. 2010. -v. 479. - N 1. - p. 63-68.

157. Gundersen V., Fonnum F., Ottersen O.P. and Storm-Mathisen J. Redistribution of neuroactive amino acids in hippocampus and striatum during hypoglycemia: a quantitative immunogold study. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2001. - v. 21. -p. 41-51.

158. Guo Z.H, Li F., Wang W.Z. The mechanisms of brain ischemic insult and potential protective interventions. // Neurosci Bull. 2009. - v. 25. - N 3. - p. 1391-1352.

159. Guo M.F., Yu J.Z., Ma C.G. Mechanisms related to neuron injury and death in cerebral hypoxic ischaemia. // Folia Neuropathol. 2011. - v. 49. - N 2. - p. 78-87.

160. Habiba A., Blanco G., Mercer R.W. Expression, activity and distribution of Na,K-ATPase subunits during in vitro neuronal induction. // Brain Res. 2000. -v. 875. -N 1-2. - p. 1-13.

161. Hajos F., Garthwaite G., Garthwaite J. Reversible and irreversible euronal damage caused by excitatory amino acid analogues in rat cerebellar slices./ Neurosci. 1986, v.18, N2, p.417-436.

162. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H. and Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration. // J. Neurosci. 1993. - v. 13. - p. 1993-2000.

163. Haser W.G., Shapiro R.A. and Curthoys N.P. Comparison of the phosphate-dependent glutaminase obtained from rat brain and kidney. // Biochem. J. 1985. -v. 229. - p. 399-408.

164. Haworth R.A., Hunter D.R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. // Arch. Biochem. Biophys. -1979. v. 195. - p. 460-467.

165. Hefti F. Neurotrophic factor therapy for nervous system degenerative diseases. // J. Neurobiol. 1994. - v. 25. - p. 1418-1435.

166. Hernandez-Fonseca K, Massieu L. Disruption of endoplasmic reticulum calcium stores is involved in neuronal death induced by glycolysis inhibition in cultured hippocampal neurons. // J. Neurosci. Res. 2005. - v. 82. - N 2. - p. 196-205.

167. Hertz L., Dringen R., Schousboe A. and Robinson S.R. Astrocytes: glutamate producers for neurons. // J. Neurosci. Res. 1999. - v. 57. - p. 417-428.

168. Heyes M.P., Papagapiou M., Leonard C., Markey S.P., Auer R.N. Brain and plasma quinolinic acid in profound insulin-induced hypoglycemia. // J. Neurochem. 1990. -v. 54. - N 3. - p. 1027-1033.

169. Hoffman T.L., LaManna J.C., Pundik S., Selman,W.R., Whittingham T.S., Ratcheson R,A. and Lust W.D. Early reversal of acidosis and metabolic recovery following ischemia. // J. Neurosurg. 1994. - v. 81. - p. 567-573.

170. Holownia A., Chwiecko M., and Farbiszewski R. Accumulation of ammonia and changes in the activity of some ammonia metabolizing enzymes during brain ischemia/reperfusion injury in rats. // Mater. Med. Pol. 1994. - v. 26. - p. 25-27.

171. Homi H.M., Freitas J.J., Curi R., Velasco I.T., Junior B.A. Changes in superoxide dismutase and catalase activities of rat brain regions during early global transient ischemia/reperfusion. // Neurosci. Lett. 2002. - v. 333. - N 1. -p. 37-40.

172. Honegger P., Braissant O., Henry H., Boulat O., Bachmann C., Zurich M.G. and Pardo B. Alteration of amino acid metabolism in neuronal aggregate cultures exposed to hypoglycaemic conditions. // J. Neurochem. 2002. - v. 81. p. 1141-1151.

173. Honore T., Davies S.N., Drejer J., Fletcher E.J., Jacobsen P., Lodge D., Nielsen F.E. Quinoxalinediones: potent competitive non-NMDA glutamate receptor antagonists. // Science. 1988. - v. 241. - N 4866. - p. 701-703.

174. Hossmann K.-A. et al. Pathophysiology of cerebral infarction. In: Handbook of clinical neurology. // Eds. Vinken P.J., Bruyn G., Klawans H., New York, Elsevier Science. 1988. - p. 107-153.

175. Hoyer S. Brain glucose and energy metabolism abnormalities in sporadic Alzheimer disease. Causes and consequences: an update. // Exp. Gerontol. -2000. v. 35. - p. 1363-1372.

176. Hu R., Duan B., Wang D., Yu Y., Li W., Luo H., Lu P., Lin J, Zhu G., Wan Q., Feng H. Role of acid-sensing ion channel la in the secondary damage of traumatic spinal cord injury. // Ann Surg. 2011. - v. 254. -N 2. - p. 353-362.

177. Huang R. and Hertz L. Effect of anoxia on glutamate formation from glutamine in cultured neurons: dependence on neuronal subtype. // Brain Res. 1994. v. 660. - p. 129-137.

178. Hunter A.J., Green A.R., Cross A.J. Animal models of acute ischemic stroke: can they predict clinically successful neuroprotective drugs. // TiPS. 1995. - v. 16. - p. 123-128.

179. Iadecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. // Trends Neurosci. 1997. - v. 20. - N 3. - p. 132-139.

180. Ichord R.N., Johnston M.V., Traystman R.J. MK801 decreases glutamate release and oxidative metabolism during hypoglycemic coma in piglets. // Brain Res. Dev. Brain. Res. 2001. - v. 128. N 2. - p. 139-148.

181. Inoue N., Matsui H., Tsukui H., Hatanaka H. The appearance of a highly digitalis-sensitive isoform of Na+,K+-ATPase during maturation in vitro of primary cultured rat cerebral neurons. // J. Biochem. 1988. - v. 104. - N3. - p. 349-354.

182. Ioudina M., Uemura E., Greenlee H.W. Glucose insufficiency alters neuronal viability and increases susceptibility to glutamate toxicity. // Brain Res. 2004. -v. 1004.-N 1-2. - p. 188-192.

183. Irwin R.P., Lin S.-Z., Long R.T., Paul S.M. N-methyl-D-aspartate induces a rapid, reversible, and calcium-dependent intracellular acidosis in cultured fetal rat hippocampal neurons. // J. Neurosci. 1994. - v. 14. - p. 1352-1357.

184. Izumi Y., Roussel S., Pinard E., Seylaz J. Reduction of infarct volume by magnesium after middle cerebral artery occlusion in rats. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1991.-v. 11,- N6. -p. 1025-1030.

185. Jadhav V. and Zhang J.H. Surgical brain injury: prevention is better than cure. // Front Biosci. 2008. - v. 13. - p. 3793-3797.

186. Jang H.J., Kwak J.H., Cho E.Y., We Y.M., Lee Y.H., Kim S.C. and Han D.J. Glutamine induces heat-shock protein-70 and glutathione expression and attenuates ischemic damage in rat islets. // Transplant. Proc. 2008. - v. 4. - p. 2581-2584.

187. Jayakumar A.R., Rama Rao K.V., and Norenberg M.D. Glutamine-induced free radical production in cultured astrocytes. // Glia. 2004. - v. 46. - p. 296-301.

188. Jayakumar A.R., Rao K.V., Murthy Ch.R.,and Norenberg M.D. Glutamine in the mechanism of ammonia-induced astrocyte swelling. // Neurochem. Int. -2006. v. 48. p. 623-628.

189. Jekabsons M.B. and Nicholls D.G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. // Cell Death Differ. 2006. - v. 13. - p. 1595-1610.

190. Jelkmann W. Regulation of erythropoietin production. // J Physiol. 2011. - v. 589(Pt 6). - p. 1251-1258.

191. Jiang D., Sullivan P.G., Sensi S.L., Steward O. and Weiss J.H. Zn2+ induces permeability transition pore opening and release of pro-apoptotic peptides from neuronal mitochondria. // J. Biol. Chem. 2001. - v. 276. - p. 47524-47529.

192. Johnson L.V., Walsh M.L., Bockus B.j., Chen L.B. Monitoring of relative mitochondrial membrane potential in living cell by fluorescence microscopy. // J. Cell Biol. 1981. - v. 88. - p. 526-535.

193. Juhaszova M., Zorov D.B., Yaniv Y., Nuss H.B., Wang S. and Sollott S.J. Role of glycogen synthase kinase-3beta in cardioprotection. // Circ. Res. 2009. - v. 104. - p. 1240-1252.

194. Jung J.E., Kim G.S., Narasimhan P., Song Y.S., Chan P.H. Regulation of Mn-superoxide dismutase activity and neuroprotection by STAT3 in mice after cerebral ischemia. // J. Neurosci. 2009. - v. 29. - N 21. - p. 7003-7014.

195. Kahlert S., Zundorf G. and Reiser G. Glutamate-mediated influx of extracellular Ca2+ is coupled with reactive oxygen species generation in cultured hippocampal neurons but not in astrocytes. // J. Neurosci. Res. 2005. - v. 79. -p. 262-271.

196. Kamal A., A1 Shaibani T., Ramakers G. Erythropoietin decreases the excitatory neurotransmitter release probability and enhances synaptic plasticity in mice hippocampal slices. // Brain Res. 2011. - v. 1410. - p. 33-37.

197. Kannurpatti S.S., Sanganahalli B.G., Mishra S., Joshi P.G. and Joshi N.B. Glutamate-induced differential mitochondrial response in young and adult rats. // Neurochem. Int. 2004. - v. 44. - p. 361-369.

198. Katsura K., Kristian T., Siesjo B.K. Energy metabolism, ion homeostasis, and cell damage in the brain. // Biochem. Soc. Trans. 1994. - v. 22. - N 4. - p. 991-996.

199. Katsura K.-I., Ekholm A. and Siesjo B.K. Coupling among changes in energy metabolism, acid-base homeostasis, and ion fluxes in ischemia. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1992. - v. 70. - S170-S175.

200. Kaur G., Arora S.K. Acetylcholinesterase and Na+,K+-ATPase activities in different regions of rat brain during insulin-induced hypoglycemia. // Mol. Chem. Neuropathol. 1994. - v. 21. -N 1. - p. 83-93.

201. Kawai K.,. Nitecka L, Joo F., Saito N. and Klatzo I. Global cerebral ischemia associated with cardiac arrest in the rat. I. Dynamics of early neuronal changes. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1992. - v. 12. - p. 238-249.

202. Kellenberger S. and Schild L. Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. // Physiol. Rev. 2002. -v. 82. - p. 735-767.

203. Kemp J.A., Foster A.C., Wong E.H.F. Non-competitive antagonists of excitatory amino acid receptors. // Trends in Neurosci. 1987. - v. 10. - p. 294-298.

204. Kessler M., Terramani T., Lynch G., Baudry M. A glycine site associated with N-methyl-D-aspartic acid receptors: characterization and identification of a new class of antagonists. // J .Neurochem. 1989. v. 52. - N 4. - p. 1319-1328.

205. Kiedrowski L. N-methyl-D-aspartate excitotoxicity: relationships among plasma membrane potential, Na+/Ca2+ exchange, mitochondrial Ca2+ overload,and cytoplasmic concentrations of Ca2+, H+, and K+. // Mol. Pharmacol. 1999. -v. 56.-p. 619-632.

206. Kiedrowski L., Brooker G., Costa E.,and Wroblewski J.T. Glutamate impairs neuronal calcium extrusion while reducing sodium gradient. // Neuron, 1994. -v. 12. p. 295-300.

207. Kiedrowski L., Costa E. Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. // Mol Pharmacol. 1995. - v. 47. - N 1. - p. 140-147.

208. Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia./ Brain Res. 1982, v.239, p. 57-69.

209. Kitagawa K., Matsumoto M., Kuwabara K., Tagaya M., Ohtsuki T., Hata R., Ueda H., Handa N., Kimura K., Kamada T. 'Ischemic tolerance' phenomenon detected in various brain regions. // Brain Res. 1991. - v. 561. - N 2. - p. 203-211.

210. Kitagawa K., Matsumoto M., Tagaya M., Hata R., Ueda H., Niinobe M., Handa N., Fukunaga R., Kimura K., Mikoshiba K., et al. 'Ischemic tolerance' phenomenon found in the brain. // Brain. Res. 1990. - v. 528. - N 1. - p. 21-24.

211. Koh J.Y., Suh S.W., Gwag B.J., He Y.Y., Hsu C.Y., Choi D.W. The role of zinc in selective neuronal death after transient global cerebral ischemia. // Science. 1996. - v. 272. - N 5264. - p. 1013-1016.

212. Koinig • H., Vornik V., Rueda C., Zornow M.H. Lubeluzole inhibits accumulation of extracellular glutamate in the hippocampus during transient global cerebral ischemia. // Brain Res. 2001. v. 898. - N 2. - p. 297-302.

213. Kristian T., Gido G. and Siesjo B.K. Brain calcium metabolism in hypoglycemic coma. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1993. - v. 13 - N 6. - p. 955-961.

214. Kudo M., Aoyama A., Ichimori S., Fukunaga N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. // Stroke. 1982.- v. 13. - N 4. -p. 505-508.

215. Kudo Y., Ogura A. Glutamate-induced increase in intracellular Ca2+ concentration in isolated hippocampal neurons. // Br. J. Pharmacol. 1986. - v. 89. - p.191-198.

216. Kunz A., Dirnagl U., Mergenthaler P. Acute pathophysiological processes after ischaemic and traumatic brain injury. // Best Pract. Res. Clin. Anaesthesiol. -2010. v. 24. - N4-p. 495-509.

217. Kuroda S., Tsuchidate R., Smith M.L., Maples K.R., Siesjo B.K. Neuroprotective effects of a novel nitrone, NXY-059, after transient focalcerebral schemia in the rat. // J. Cereb .Blood Flow Metab. 1999. - v. 19. - N7. -p. 778-787.

218. Kurth M.C., Weiss J.H. and Choi D.W. Relationship between glutamate-induced 4:>Ca influx and resultant neuronal injury in cultured cortical neurons. // Neurology. 1989. - v. 39. - p. 217.

219. Kvamme E. and Lenda K. Regulation of glutaminase by endogenous glutamate, ammonia and 2-oxoglutarate in synaptosomal enriched preparation from rat brain. // Neurochem. Res. 1982. - v. 7. - p. 667- 678.

220. Kvamme E., Svenneby G., Hertz L. and Schousboe A. Properties of phosphate activated glutaminase in astrocytes cultured from mouse brain. // Neurochem. Res. 1982. - v. 7. - p. 761-770.

221. Lafon-Cazal M., Pietri S., Culcasi M., Bockaert J. NMDA-dependent superoxide production and neurotoxicity. //Nature. 1993. - v. 364. - p. 535-537.

222. Larsen G.A., Skjellegrind H.K., Berg-Johnsen J., Moe M.C. and Vinje M.L. Depolarization of mitochondria in isolated CA1 neurons during hypoxia, glucose deprivation and glutamate excitotoxicity. // Brain Res. 2006. - v. 1077. - p. 153-160.

223. Lauersen H., Hansen A„ Sheardown M. Cerebrovascular permeability and brain edema after cortical photochemical infarcts in the rat. // Acta Neuropathol. -1993. -v.86. p. 378-385.

224. Lei H., Gruetter R. Effect of chronic hypoglycaemia on glucose concentration and glycogen content in rat brain: A localized 13C NMR study. // J. Neurochem. 2006. - v. 99. - N 1. - p. 260-268.

225. Lesnefsky E.J., Moghaddas S., Tandler B., Kerner J., Hoppel C.L. Mitochondrial dysfunction in cardiac disease: ischemia-reperfusion, aging, and heart failure. // J. Mol. Cell Cardiol. 2001. - v. 33. - N 6. - p. 1065-1089.

226. Lessmann V. Neurotrophin-dependent modulation of glutamatergic synaptic transmission in the mammalian CNS. // Gen Pharmacol. 1998. - v. 31. - p. 667-674.

227. Levin B.E., Routh V.H., Kang L., Sanders N.M. and Dunn-Meynell A.A. Neuronal glucosensing: what do we know after 50 years? // Diabetes. 2004. - v. 53. - p. 2521-2528.

228. Li M.IT., Inoue K., Si H.F., Xiong Z.G. Calcium-permeable ion channels involved in glutamate receptor-independent ischemic brain injury. // Acta Pharmacol. Sin. 2011. - v. 32. - N 6. - p. 734-740.

229. Link T.A., von Jagow G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bcl complex by blocking a protonatable group. // J. Biol. Chem. -1995. v. 270. - N 42. - p. 25001-25006.

230. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons. // Physiol Rev. -1999. v. 79. -N4.-p. 1431-1568.

231. Lipton P. and Whittingham T.S. Energy metabolism and brain slice function. /In: Brain Slices, edited by R. Dingledine. New York: Academic.- 1984. p. 113-154.

232. Liu C., Shen K., Liu Z., Noguchi C.T. Regulated human erythropoietin receptor expression in mouse brain. // J. Biol. Chem. 1997. - v. 272. - p. 32395-32400.

233. Liu Y., Song X.D., Liu W., Zhang T.Y. and Zuo J. Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC 12 cell line. // J. Cell Mol. Med.-2003.-v. 7. p. 49-56.

234. Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S. and Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. // Stroke. 1989. - v. 20. -p. 84-91.

235. Lorusso M., Cocco T., Sardanelli A.M., Minuto M., Bonomi F., Papa S. Interaction of Zn2+ with the bovine-heart mitochondrial bcl complex. // Eur. J. Biochem. 1991. - v. 197. -N 2. - p. 555-561.

236. Loschen G., Azzi A. and Flohe L. Mitochondrial H2O2 formation: relationship with energy conservation. // FEBS Lett. 1973. - v. 33. - p. 84-87.

237. Lucas D.R., Newhouse J.P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina. // Arch. Ophtalmol. 1957. - v. 58. - p. 193-201.

238. Lundgren J., Zhang H., Agardh C.D,. Smith M.L., Evans P.J., Halliwell B., Siesjo B.K. Acidosis-induced ischemic brain damage: are free radicals involved?//J. Cereb. Blood Met. 1991. - v. 11. -p. 587-596.

239. Luo J., Chen LI., Kintner D.B., Shull G.E. and Sun D. Decreased neuronal death in Na+/H+ exchanger isoform 1-null mice after in vitro and in vivo ischemia. // J. Neurosci. 2005. - v. 25. - p. 11256-11268.

240. Ly J.V., Zavala J.A. and Donnan G.A. Neuroprotection and thrombolysis: combination therapy in acute ischaemic stroke. // Expert. Opin Pharmacother. -2006. v. 7. - p. 1571-1581.

241. Lysko P.G., Cox J.A., Vigano A., Henneberry R.C. Excitatory amino acid neurotoxicity at the N-methyl-D aspartate receptor in cultured neurons: pharmacological characterization./ Brain Res. 1989, v.499, p.258-266.

242. Madl J.E. and Royer S.M. Glutamate in synaptic terminals is reduced by lack of glucose but not hypoxia in rat hippocampal slices. // Neurosci. 1999. - v. 94. -p. 417-430.

243. Malaiyandi L.M., Vergun O., Dineley K.E. and Reynolds I.J. Direct visualization of mitochondrial zinc accumulation reveals uniporter-dependent and -independent transport mechanisms. // J. Neurochem. 2005. - v. 93. - p. 12421250.

244. Manev H., Favaron M., Guidotti A., Costa E. Delayed increase of Ca2+ influx elicited by glutamate: role in neuronal death. // Mol. Pharmacol. 1989. - v. 36. -N 1. -p. 106-112.

245. Mark R.J., Pang Z., Geddes J.W., Uchida K., Mattson M.P. Amyloid beta-peptide impairs glucose transport in hippocampal and cortical neurons:involvement of membrane lipid peroxidation. // J. Neurosci. 1997. - v. 17. - N 3. -p. 1046-1054.

246. Marshall J.W., Cross A.J., Jackson D.M., Green A.R., Baker H.F., Ridley R.M. Clomethiazole protects against hemineglect in a primate model of stroke. // Brain Res. Bull. 2000. - v. 52. - N 1. - p. 21-29.

247. Marshall J.W., Duffm K.J., Green A.R., Ridley R.M. NXY-059, a free radical —trapping agent, substantially lessens the functional disability resulting from cerebral ischemia in a primate species. // Stroke. 2001. -v. 32. - N 1. - p. 190-198.

248. Marti H.H., Wenger R.H., Rivas L.A., Straumann U., Digicaylioglu M., Henn V., Yonekawa Y., Bauer C., Gassmann M. Erythropoietin gene expression in human, monkey and murine brain. // Eur. J. Neurosci. 1996. - v. 8. - p. 666-676.

249. Martin N.A., Doberstein C. Cerebral blood flow measurement in neurosurgical intensive care. // Neurosurg Clin. N Am. 1994. - v. 5. - N 4. - p. 607-618.

250. Masuda S, Okano M, Yamagishi K, Nagao M, Ueda M, Sasaki R. A novel site of erythropoietin production. Oxygen-dependent production in cultured rat astrocytes. // J. Biol. Chem. 1994. - v. 269. - N 30. - p. 19488-19493.

251. Mates, J.M., Segura, J.A., Alonso, F.J., and Marquez J. Pathways from glutamine to apoptosis. // Front Biosci. 2006. - v. 11. - p. 3164-3180.

252. Mattson M.P., Zhang Y., Bose S. Growth factors prevent mitochondrial dysfunction, loss of calcium homeostasis, and cell injury, but not ATP depletion in hippocampal neurons deprived of glucose. // Exp. Neurol. 1993. - v. 121. - N l.-p. 1-13.

253. Matute C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. // Cell Calcium. -2010. v. 47. -N2. - p. 150-157.

254. Mauler F., Horvath E. Neuroprotective efficacy of repinotan HC1, a 5-HT1A receptor agonist, in animal models of stroke and traumatic brain injury. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2005. - v. 25. - N 4. - p. 451-459.

255. McCaslin P.P., Morgan W.W. Cultured cerebellar cells as an in vitro model of excitatory amino acid receptor function. // Brain Res. 1987. - v. 417. - p. 380-384.

256. McCord J.M., Roy R.S., Schaffer S.W. Free radicals and myocardial ischemia. The role of xanthine oxidase. // Adv. Myocardiol. 1985. - v. 5. - p. 183-189.

257. McDermott E., de Silva P. Impaired neuronal glucose uptake in pathogenesis of schizophrenia can GLUT 1 and GLUT 3 deficits explain imaging, postmortem and pharmacological findings? // Med. Hypotheses. 2005. - v. 65. - N 6. -p. 1076-1081.

258. McGowan J.E., Chen L., Gao D., Trush M., Wei C. Increased mitochondrial reactive oxygen species production in newborn brain during hypoglycemia. // Neurosci. Lett. 2006. - v. 399. - p. 111-114.

259. McKena M.C. The glutamate-glutamine cycle is not stoichiometric: fates of glutamate in brain. // J. Neurosci. Res. 2007. - v. 85. - p. 3347-3358.

260. McPherson R.J. and Juul S.E. Recent trends in erythropoietinmediated neuroprotection. // Int. J. Dev. Neurosci. 2008. - v. 26. - p. 103-11.

261. Mellergard P. Acid-Base Homeostasis in the Mammalian Brain. Lund. 1993. -p. 9-89.

262. Merelli A., Caltana L., Lazarowski A., Brusco A. Experimental evidence of the potential use of erythropoietin by intranasal administration as a neuroprotective agent in cerebral hypoxia. // Drug Metabol. Drug Interact. 2011. - v. 26. - N 2. -p. 65-69.

263. Messer A., Smith D.M. In vitro behavior of granule cell from staggeres and weaver mutant of mice./ Brain Res., 1977, v. 130, p. 13-23.

264. Miller B., Sarantis M., Traynelis F.S. and Attwell D. Potentiation of NMDA receptor currents by arachidonic acid. //Nature. 1992. - v. 355. - p. 722-725.

265. Miller G.W. Paraquat: the red herring of Parkinson's disease research. // Toxicol. Sci. 2007. - v. 100. - P. 1-2.

266. Minnerup J., Heidrich J., Rogalewski A., Schabitz W.R., Wellmann J. The efficacy of erythropoietin and its analogues in animal stroke models: a metaanalysis. //Stroke. 2009. - v. 40. -N9. - p. 3113-3120.

267. Miyabe M., Kirsch J.R., Nishikawa T., Koehler R.C., Traystman R.J. Comparative analysis of brain protection by N-methyl-D-aspartate receptor antagonists after transient focal ischemia in cats. // Crit. Care Med. 1997. - v. 25. -N6. - p. 1037-1043.

268. Molchanova S., Koobi P., Oja S.S. and Saransaari P. Interstitial concentrations of amino acids in the rat striatum during global forebrain ischemia and potassium-evoked spreading depression. // Neurochem. Res. 2004. - v. 29. - p. 1519-1527.

269. Moley K.H., Mueckler M.M. Glucose transport and apoptosis. // Apoptosis. -2000.-v. 5,-N2.-p. 99-105.

270. Monyer H., Goldberg M.P., Choi D.W. Glucose deprivation neuronal injury in cortical culture. // Brain Res. 1989. - v. 483. - N 2. - p. 347-354.

271. Monyer H. and Choi D.W. Glucose deprivation neuronal injury in vitro is modified by withdrawal of extracellular glutamine. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - v. 10. - p. 337-342.

272. Moore C.L. Specific inhibition of mitochondrial calcium transport by ruthenium red. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. - v. 42. - p. 298-305.

273. Moro MA, Almeida A, Bolanos JP, Lizasoain I. Mitochondrial respiratory chain and free radical generation in stroke. // Free Radic. Biol. Med. 2005. - v. 39. -N 10. -p. 1291-1304.

274. Moro M.A., Leza J.C., Lorenzo P., Lizasoain I. Peroxynitrite causes aspartate release from dissociated rat cerebellar granule neurones. // Free Radic. Res.1998. v. 28. -N2. - p. 193-204.

275. Musleh W., Bruce A., Malfroy B. and Baudry M. Effects of EUK-8, a synthetic catalytic superoxide scavenger, on hypoxia- and acidosis-induced damage in hippocampal slices. //Neuropharm. 1994. - v. 33. - p. 929-934.

276. Myers K.M., Fiskum G., Liu Y., Simmens S.J.,, bredesen D.E and Murphy A.N. Bcl-2 protects neural cells from cyanide/aglycemia-induced lipid oxidation, mitochondrial injury and loss of viability. // J. Neurochem. 1995. - v. 65. - p. 2432-2440.

277. Nakano S., Kogure K., Abe K., Yae T. Ischemia-induced alterations in lipid metabolism of the gerbil cerebral cortex: I. Changes in free fatty acid liberation. // J. Neurochem. 1990. - v. 54. - N 6. - p. 1911-1916.

278. Nakase H., Heimann A., Uranishi R., Riepe M.W., Kempski O.Early-onset tolerance in rat global cerebral ischemia induced by a mitochondrial inhibitor. // Neurosc. Lett. 2000. - v. 290. - N2. - p. 105-108.

279. Nakata N., Kato H. and Kogure K. Effects of repeated cerebral ischemia on extracellular amino acid concentrations measured with intracerebral microdialysis in the gerbil hippocampus. // Stroke. 1993. - v. 24. - p. 458-463.

280. Nedergaard M., Kraig R.P., Tanabe J. and Pulsinelli W.A. Dynamics of interstitial and intracellular pH in evolving brain infarct. // Am. J. Physiol. -1991. v. 260. - R581-588.

281. Newcomb R., Sun X.,Taylor L., Curthoys N. and Giffard R.G. Increased production of extracellular glutamate by the mitochondrial glutaminase following neuronal death. // J. Biol. Chem. 1997. - v. 272. - p. 11276-11282.

282. Nicholls D.G. and Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival. // Physiol. Rev. 2000. - v. 80. - p. 315-360.

283. Nicholls D.G., Vesce S., Kirk L. and Chalmers S. Interactions between mitochondrial bioenergetics and cytoplasmic calcium in cultured cerebellar granule cells. // Cell Calcium. 2003. - v. 34. - p. 407-424.

284. Noguchi C.T., Asavaritikrai P., Teng R. and Jia Y. Role of erythropoietin in the brain. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2007. - v. 64. - p. 159-171.

285. Nohl H., Staniek K., Sobhian B., Bahrami S., Redl H. and Kozlov A.V. Mitochondria recycle nitrite back to the bioregulator nitric monoxide. // Acta Biochim. Pol. 2000. - v. 47. - p. 913-921.

286. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Kushnareva Y.E., Zorov D.B. and Kudrjashov Y.B. Effect of cyclosporine A and oligomycin on non-specific permeability of the inner mitochondrial membrane. // FEBS Lett. 1990. - v. 270. - p. 108-110.

287. Ogura A., Miyamoto M., Kudo Y. Neuronal death in vitro: parallelism between survivability of hippocampal neurons and sustained elevation of cytosolic Ca2+ after ex posure to glutamate receptor agonists. // Exp. Brain Res. 1988. - v. 73. -p. 447-458.

288. Ohtsuki T., Matsumoto M., Kuwabara K. Kitagawa K., Suzuki K., Taniguchi N., Kamada T. Influence of oxidative stress on induced tolerance to ischemia in gerbil hippocampal neurons. // Brain Res. 1992. - v. 599. - N 2. - p. 246-252.

289. Olney J.W. Brain lesions, obesity and other dis turbances in mice treated with monosodium glutamate. // Science. 1969. - v. 164. - p. 719-721.

290. Olney J.W. Neurotoxicity of excitatory amino acids./ In: Kainic Acid as a Tool in Neurobiology. Eds. McGeer et al., N.-Y., Raven Press. 1978. - p. 95-121.

291. Olney J.W., de Gubareff T., Labruyere J. amino-adipate blocks the neurotoxic action of N-methyl aspartate. // Life Sci. 1979. - v.25. - p. 537-540.

292. Olney J.W., Ho Oi Lan, Rhee V. Cytotoxic effects of acidic and sulphur containing amino acids on the infant mouse central nervous system. // Exp. Brain Res. -1971. v. 14. - p. 61-76.

293. Olney J.W., Labruyere J., Collins J.F., Curry K. D-aminophosphonovalerate is 100-fold more powerful than D-alpha-aminoadipate in blocking N-methylaspartate neurotoxicity. // Brain Res. 1981. - v. 221. - N1. - p. 207-210.

294. Ou-Yang Y., Mellergad P. and Siejo B.K. Regulation of intracellular pH in single rat cortical neurons in vitro: a microspectrofluorometric study. J. // Cerebr. Blood Flow Metab. 1993. - v. 13. - p. 827-840.

295. Ou-Yang, Y., Kristian, T., Mellergarg, P. and Siejo, B.K. The influence of pH on glutamate- and depolarization-induced increases of intracellular calcium concentration in cortical neurons in primary culture. // Brain. Res. 1994. - v. 646. - p. 65-72.

296. Pan J., Konstas A.A., Bateman B., Ortolano G.A. and Pile-Spellman J. Reperfusion injury following cerebral ischemia: pathophysiology, MR imaging, and potential therapies. // Neuroradiol. 2007. - v. 49. - p. 93-102.

297. Papagapiou M.P., Auer R.N. Regional neuroprotective effects of the NMDA receptor antagonist MK-801 (dizocilpine) in hypoglycemic brain damage. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - v. 10. - N 2. - p. 270-276.

298. Pascual J.M., Carceller F., Roda J.M. and Cerdan S. Glutamate, glutamine, and GABA as substrates for the neuronal and glial compartments after focal cerebral ischemia in rats. // Stroke. 1998. - v. 29. - p. 1048-1056.

299. Patockova J., Marhol P., Tumova E., Krsiak M., Rokyta R., Stipek S., Crkovska J., Andel M. Oxidative stress in the brain tissue of laboratory mice with acute post insulin hypoglycemia. // Physiol. Res. 2003 - v. 52. - N 1. - p. 131-135.

300. Paxinos G., Watson S. Atlas of anatomy of rat brain. The rat brain in stereotaxic coordinates. // San Diego: Academic Press.- 1986.

301. Pellegrini-Giampietro D.E., Cherici G., Alesiani M., Carla V., Moroni F. Excitatory amino acid release from rat hippocampal slices as a consequence of free-radical formation. // J. Neurochem. 1988. - v. 51. - N 6. - p. 1960-1963.

302. Pelligrino D., Almquist L.O., Siesjo B.K. Effects of insulin-induced hypoglycemia on intracellular pH and impedance in the cerebral cortex of the rat. //BrainRes. 1981. - v. 221. -N 1. - p. 129-147.

303. Peng L., Gu L., Zhang H., Huang X., Hertz E. and Hertz L. Glutamine as an energy substrate in cultured neurons during glucose deprivation. // J. Neurosci. Res. 2007. - v. 85. - p. 3480-3486.

304. Petito C.K., Chung M.C., Verkhovsky L.M. and Cooper A.J. Brain glutamine synthetase increases following cerebral ischemia in the rat. // Brain Res. 1992. -v. 569. - p. 275-280.

305. Petroff O.A., Errante L.D., Rothman D.L., Kim J.H. and Spencer D.D. Glutamate-glutamine cycling in the epileptic human hippocampus. // Epilepsia. -2002.-v. 43.-p. 703-710.

306. Petronilli V., Cola C., Massari S., Colonna R., Bernardi P. Physiological effectors modify voltage sensing by the cyclosporin A- sensitive permeability transition pore of mitochondria. // J.Biol.Chem. 1993. - v. 268 - p. 21939-21945.

307. Philippe T. Neural progenitor and stem cells in the adult central nervous system. // Ann. Acad. Med. Singapor.- 2006,- № 35,- p. 814 820.

308. Phillis J.W., Estevez A.Y., Guyot L.L. and O'Regan M.H. 5-(N-Ethyl-N-isopropyl)-amiloride, an Na+-H+ exchange inhibitor, protects gerbil hippocampal neurons from ischemic injury. // Brain Res. 1999. - v. 839. - p. 199-202.

309. Pignataro G., Simon R. and Xiong Z.-G. Prolonged activation of ASIC la and the time window for neuroprotection in cerebral ischaemia. // Brain.- 2007. v. 130. -p. 151-158.

310. Pluta R.,. Lossinsky A.S, Mossakowski M.J., Faso L. and Wisniewski H.M. Reassessment of a new model of complete cerebral ischemia in rats. // Acta Neuropathol. 1991. - v. 83. - p. 1-11.

311. Prass K., Scharff A., Ruscher K., Lówl D., Muselmann C., Victorov I., Kapinya K., Dirnagl U., Meisel A. Hypoxia-induced stroke tolerance in themouse is mediated by erythropoietin. // Stroke. 2003. - v. 34. - N 8. - p. 1981-1986.

312. Prochiant A. Neurogenesis in the adult brain: hope for brain repair? // Bull. Acad. Natl. Med.- 2000,- № 6,- p. 1181 1189.

313. Puka-Sundvall M., Hallin U., Zhu C., Wang X., Karlsson J.O., Blomgren K., Hagberg H. NMDA blockade attenuates caspase-3 activation and DNA fragmentation after neonatal hypoxia-ischemia. // Neuroreport. 2000. - v. 11.-N 13. - p. 2833-2836.

314. Pulsinelli W., Brierley J.B., Plupi F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischaemia. // Ann. Neurol. 1982. - v. 11. - p. 491-498.

315. Pulsinelli W.A. and Buchan A.M. The four-vessel occlusion rat model: method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation. // Stroke. 1988. - v. 19. - p. 913-914.

316. Pylova S.I., Majkowska J., Hilgier W., Kapuscinski A., Albrecht J. Rapid decrease of high affinity ouabain binding sites in hippocampal CA1 regionfollowing short-term global cerebral ischemia in rat. // Brain Res. 1989. - v. 490. -N 1. - p. 170-173.

317. Radi R., Rodriguez M., Castro L., Telleri R. Inhibition of mitochondrial electron transport by peroxynitrite. // Arch. Biochem. Biophys. 1994. - v. 308. -N 1. - p. 89-95.

318. Rae M.G., Martin D.J., Collingridge G.L. and Irving A.J. Role of Ca2+ stores in metabotropic L-glutamate receptor-mediated supralinear Ca2+ signaling in rat hippocampal neurons. // J. Neurosci. 2000. - v. 20. - p. 8628-8636.

319. Rama Rao K.V., Jayakumar A.R. and Norenberg M.D. Differential response of glutamine in cultured neurons and astrocytes. // J. Neurosci. Res. 2005. -v. 79. -p. 193-199.

320. Rama Rao K.V., Jayakumar A.R. and Norenberg M.D. Induction of the mitochondrial permeability transition in cultured astrocytes by glutamine. // Neurochem. Int. 2003. - v. 43. - p. 517-523.

321. Rao R., Ennis K., Long J.D., Ugurbil K., Gruetter R., Tkac I. Neurochemical changes in the developing rat hippocampus during prolonged hypoglycemia. // J. Neurochem. 2010. - v. 114. - N 3. - p. 728-738.

322. Regli L., Anderson R.E. and Meyer F.B. Effects of intermittent reperfusion on brain pHi, rCBF, and NADH during rabbit focal cerebral ischemia. // Stroke. -1995. v. 26. - p. 1444-1451.

323. Rego A.C., Santos M.S., Oliveira C.R. Influence of the antioxidants vitamin E and idebenone on retinal cell injury mediated by chemical ischemia,hypoglycemia, or oxidative stress. // Free Radie. Biol. Med. 1999. - v. 26. - N 11-12. - p. 1405-1417.

324. Rehncrona S. Brain acidosis. // Ann. Emerg. Med. 1985. - v. 14. - p. 770-776.

325. Rehncrona S., Hauge H. and Siejo B.K. Enhancement of iron-catalyzed free radical formation by acidosis in brain homogenates: differences in effect by lactic acid and C02. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1989. - v. 9. - p. 65-70.

326. Reiner P.B., Laycock A.G., Doll C.J. A pharmacological model of ischemia in the hippocampal slice.//Neurosci. Lett. 1990.-v. 119.-N 2.-p. 175-178.

327. Reynolds I.J. and Hastings T.G. Glutamate induces the production of oxygen species in cultured forebrain neurons following NMDA receptor activation. // J. Neurosci. 1995. - v. 15. - p. 3318-3327.

328. Riepe M.W., Nakase H., Esclaire F., Kasischke K., Schreiber S., Ludolph A.C., Dirnagl U. Chemical preconditioning a novel neuroprotective strategy. // In: 1 Kongress der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft in Berlin. 1996. - p. 182.

329. Robinson S.R. Neuronal expression of glutamine synthetase in Alzheimer's disease indicates a profound impairment of metabolic interactions with astrocytes. // Neurochem. Int. 2000. - v. 36. p. 471-482.

330. Rodrigo J., Fernández A.P., Serrano J., Peinado M.A., Martínez A. The role of free radicals in cerebral hypoxia and ischemia. // Free Radie. Biol. Med. 2005. -v. 39. -N 1. - p. 26-50.

331. Rodrigo R. and Felipo V. Control of brain glutamine synthesis by NMDA receptors. // Front Biosci. 2007. - v. 12. - p. 883-890.

332. Roos A. and Boron W.F. Intracellular pH. // Physiol. Rev. 1981. - v. 61. - p. 296-434.

333. Rosenorn J., Diemer N.H. Reduction of regional cerebral blood flow during brain retraction pressure in the rat. // J. Neurosurg. 1982. - v. 56. - N 6. - p. 826-829.

334. Rothman S. Synaptic release of excitatory amino acid neurotransmitter mediates anoxic neuronal death. // J. Neurosci. 1984. - v. 4. - p. 1884-1891.

335. Rothman S.M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. // J. Neurosci. 1985. - v. 5. - p. 1483-1489.

336. Rothman S.M, Thurston J.H., Hauhart R.E., Clark G.D., Solomon J.S. Ketamine rotects hippocampal neurons from anoxia in vitro. // Neurosci. 1987. -v. 1. -N3. - p. 673-678.

337. Rothwell N.J., Hopkins S.J. Cytokines and the nervous system II: Actions and mechanisms of action. // Trends Neurosci. 1995. - v. 18. - N 3. - p. 130-136.

338. Sakanaka M., Wen T.C., Matsuda S,. Masuda S., Morishita E., Nagao M., Sasaki R. In vivo evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - v. 95. - N 8. - p. 4635-4640.

339. Samouilov A., Kuppusamy P. and Zweier J.L. Evaluation of the magnitude and rate of nitric oxide oduction from nitrite in biological systems. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - v. 357. - p. 1-7.

340. Sandberg M., Butcher S.P. and Hagberg H. Extracellular overflow of neuroactive amino acids during severe insulin-induced hypoglycemia: in vivo dialysis of the rat hippocampus. // J. Neurochem. 1986. - v. 47. - p. 178-184.

341. Satoh T., Enokido Y., Kubo T., Yamada M., Hatanaka H. Oxygen toxicity induces apoptosis in neuronal cells. // Cell. Mol. Neurobiol. 1998. - v. 18. - p. 649-666.

342. Scanion J.M., Reynolds I.J. Effects of oxidants and glutamate receptor ctivation on mitochondrial membrane potential in rat forebrain neurons. // J. Neurochem. 1998. - v. 71. - N 6. - p. 2392-2400.

343. Schinder A.F., Olson E.C., Spitzer N.C., Montal M. Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity. // J. Neurosci. 1996. - v. 16. - p. 6125-6133.

344. Scholz W. Störungen des Blutkreislaufes und ihre Folgen fur das Zentnervensystems. // In: Hadbuch der speziellen pathologischen Anatomie und Histologie. Bd. 13, T.l. Berlin. 1957. - S. 1326-1376.

345. Schousboe A., Westergaard N., Waagepetersen H.S., Larsson O.M., Bakken I.J. and Sonnewald U. Trafficking between glia and neurons of TCA cycle intermediates and related metabolites. // Glia. 1997. - v. 21. - p. 99-105.

346. Schurr A., Payne R.S., Tseng M.T., Gozal E., Gozal D. Excitotoxic preconditioning elicited by both glutamate and hypoxia and abolished by lactate transport inhibition in rat hippocampal slices. // Neurosci. Lett. 2001. - v. 307. -N3. -p. 151-154.

347. Schurr A., Payne R.S., Tseng M.T., Gozal E., Gozal D. Excitotoxic preconditioning elicited by both glutamate and hypoxia and abolished by lactatetransport inhibition in rat hippocampal slices. // Neurosci. Lett. 2001. - v. 307. -N3. -p. 151-154.

348. Sciamanna M.A., Zinkel J., Fabi A.Y., Lee C.P. Ischemic injury to rat forebrain mitochondria and cellular calcium homeostasis. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - v. 1134. - N 3. - p. 223-232.

349. Semenza G.L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. //J. Appl. Physiol. 2000. - v. 88. - N 4. - p. 1474-1480.

350. Sengpiel B., Preis E., Kriglstein J., Prehn J.H. NMDA induced superoxide production and neurotoxicity in cultured rat hippocampal neurons: role of mitochondria. // Eur. J. Neurosci. 1998. - v. 10. - p. 1903-1910.

351. Sensi S.L., Ton-That D., Sullivan P.G., Jonas E.A., Gee K.R., Kaczmarek L.K., Weiss J.H. Modulation of mitochondrial function by endogenous Zn2+ pools. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - v. 100. - N 10. - p. 6157-6162.

352. Sensi S.L., Yin H.Z., Carriedo S.G., Rao S.S. and Weiss J.H. Preferential Zn2+ influx through Ca2+-permeable AMPA/kainate channels triggers prolonged mitochondrial superoxide production. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. - v. 96. - p. 2414- 2419.

353. Shapiro R.A., Haser W.G. and Curthoys N.P. The orientation of phosphate-dependent glutaminase on the inner membrane of rat renal mitochondria. // Arch. Biochem. Biophys. 1985. - v. 243. - p. 1-7.

354. Sharpley M.S., Hirst J. The inhibition of mitochondrial complex I (NADHrubiquinone oxidoreductase) by Zn2+. // J. Biol. Chem. 2006. - v. 281. -N46. - p. 34803-34809.

355. Shen H., Chan,J., Kass I.S. and Bergold P.J. Transient acidosis induces delayed neurotoxicity in cultured hippocampal slices. // Neurosci. Lett. 1995. - v. 185. -p. 115-118.

356. Shepherd G.M. The Synaptic Organization of the Brain. // New York, Oxford, Oxford Univ. Press, 1979.

357. Shi H. and Liu K.J. Cerebral tissue oxygenation and oxidativebrain injury during ischemia and reperfusion. // Front. Biosci. 2007. - v. 12. - p. 1318-1328.

358. Shimada N., Graf R., Rosner G. and Heiss W.D. Ischemia-induced accumulation of extracellular amino acids in cerebral cortex, white matter, and cerebrospinal fluid. // J. Neurochem. 1993. - v. 60. - p. 66-71.

359. Shiralcawa H., Katsuki H., Kume T., Kaneko S., Akaike A. Aminoglutethimide prevents excitotoxic and ischemic injuries in cortical neurons. //Br. J. Pharmacol.- 2006. v. 147. - N 7. - p. 729-736.

360. Shpargel K.B., Jalabi W., Jin Y., Dadabayev A., Penn M.S., Trapp B.D. Preconditioning paradigms and pathways in the brain. // Cleve Clin. J. Med. -2008.-v. 75. Suppl 2:S77-82.

361. Silverstein F.S., Buchanan K., Johnston M.V. Perinatal hypoxia-ischemia disrupts high-affinity 3H.-glutamate uptake into synaptosomes. // J. Neurochem.- 1986. v. 47. - p. 1614-1619.

362. Silverstein F.S., Simpson J. and Gordon K.E. Hypoglycemia alters striatal amino acid efflux in perinatal rats: an in vivo microdialysis study. // Ann. Neurol. 1990. - v. 28. - p. 516-521.

363. Simon R.P., Schmidley J.W., Meldrum B.S., Swan J.H., Chapman A.G. Excitotoxic mechanisms in hypoglycaemic hippocampal injury. // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1986. - v. 12. - N 6. - p. 567-576.

364. Simon R.P., Swan J.H., Griffiths T., Meldrum B.S. Blockade of N-methyl-D-aspartate receptors may protect against ischemic damage in the brain. // Science. -1984. v. 226. - N 4676. - p. 850-852.

365. Singh P., Jain A., Kaur G. Impact of hypoglycemia and diabetes on CNS: correlation of mitochondrial oxidative stress with DNA damage. // Mol. Cell Biochem. 2004. - v. 260. - N 1-2. - p. 153-159.

366. Sipos I., Tretter L. and Adam-Vizi V. The production of reactive oxygen species in intact isolated nerve terminals is independent of the mitochondrial membrane potential. //Neurochem. Res. 2003. - v. 28. - p. 1575-1581.

367. Skulachev V.P., Anisimov V.N., Antonenko Y.N., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Erichev V.P,. Filenko O.F., Kalinina N.I., Kapelko V.I., Kolosova N.G,.

368. Skulachev V.P. Mitochondria-Targeted Antioxidants as Promising Drugs for Treatment of Age-Related Brain Diseases. // J. Alzheimers Dis. 2011 (in press).

369. Sladeczek, F., Pin, J.P., Recasens, M., Bockaert J., and Weiss, S. Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones. // Nature. 1985. -v. 317. - p. 717-719.

370. Sonnewald U., Westergaard N. and Schousboe A. Glutamate transport and metabolism in astrocytes. // Glia. 1997. - v. 21. - p. 56-63.

371. Spedding M. and Gressens P. Neurotrophins and cytokines in neuronal plasticity. // Novartis. Found Symp. 2008. - v. 289.- p. 222-240.

372. Stone T.W. Glutamate as the neurotransmitter of cerebellar granule cells in the rat: electrophysiological evidence. // Br. J. Pharmacol. 1979. - v. 66. - p. 291-296.

373. Storozhevykh T., Grigortsevich N., Sorokina E., Vinskaya N., Vergun O., Pinelis V. and Khodorov B. Role of Na+/Ca2+ exchange in regulation of neuronal Ca2+ homeostasis requires re-evaluation. // FEBS Lett. 1998. - v. 431. - p. 215-218.

374. Stout A.K., Raphael H.M., Kanterewicz B.I., Klann E. and Reynolds I.J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. // Nat. Neurosci. 1998. - v. 1. - p. 366-373.

375. Strasser U. and Fischer G. Protection from neuronal damage induced by combined oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures by glutamate receptor antagonists. // Brain Res. 1995. - v. 687. - p. 167-174.

376. Stringaris A.K., Bruck W., Tumani H., Schmidt H. and Nau R. Increased glutamine synthetase immunoreactivity in experimental pneumococcal meningitis. // Acta Neuropathol. 1997. - v. 93. - p. 215-218.

377. Strosznajder R.P., Jesko H. and Dziewulska J. Effect of carvedilol on neuronal survival and poly(ADP-ribose) polymerase activity in hippocampus after transient forebrain ischemia. // ActaNeurobiol. Exp. 2005. - v. 65. - p. 137-143.

378. Suarez I., Bodega G. and Fern6ndez B. Glutamine synthetase in brain: effect of ammonia. //Neurochem. Int. 2002. - v. 41. - p. 123-142.

379. Subbalakshmi, G. Y., & Murthy, C. R. (1985). Isolation of astrocytes, neurons and synaptosomes of rat brain cortex: Distribution of enzymes of glutamate metabolism. //Neurochemical Research. 10, 239-250.

380. Sugino T., Nozaki K., Takagi Y., Hashimoto N. 3-Nitropropionic acid induces ischemic tolerance in gerbil hippocampus in vivo. // Neurosci. Lett. 1999. - v. 259. -N 1. - p. 9-12.

381. Suh S.W., Chen J.W., Motamedi M., Bell B., Listiak K., Pons N.F., Danscher G., Frederickson C.J. Evidence that synaptically-released zinc contributes toneuronal injury after traumatic brain injury. // Brain Res. 2000. - v. 852. - N 2. -p. 268-273.

382. Suh S.W., Aoyama K., Matsumori Y., Liu J., and Swanson R.A. Pyruvate administered after severe hypoglycemia reduces neuronal death and cognitive impairment. // Diabetes. 2005. - v. 54. - p. 1452-1458.

383. Suh S.W., Gamier P., Aoyama K., Chen Y. and Swanson R.A. Zinc release contributes to hypoglycemia-nduced neuronal death. // Neurobiol. Disease. -2004. v. 16. - p. 538- 545.

384. Sutherland G.R., Tyson R.L., Auer R.N. Truncation of the krebs cycle during hypoglycemic coma. // Med. Chem. 2008. - v. 4. - N 4. - p. 379-385.

385. Swain M., Butterworth R.F. and Blei A.T. Ammonia and related amino acids in the pathogenesis of brain edema in acute ischemic liver failure in rats. // Hepatol. 1992. - v. 15. - p. 449-453.

386. Taga K., Patel P.M., Drummond J.C., Cole D.J., Kelly P.J. Transient neuronal depolarization induces tolerance to subsequent forebrain ischemia in rats. // Anesthesiol. 1997. - v. 87. - N 4. - p. 918-925.

387. Takeda A. Zinc homeostasis and functions of zinc in the brain. // Biometals. -2001. v. 14. - N 3-4. - p. 343-351.

388. Tan C.C., Eckardt K.U. and Ratcliffe P.J. Organ distribution of erythropoietin messenger RNA in normal and uremic rats. // Kidney Int. 1991. - v. 40. - p. 69-76.

389. Tang X.C., Rao M.R., Hu G. and Wang H. Alterations of amino acid levels from striatum, hippocampus, and cerebral cortex induced by global cerebral ischemia in gerbil. // Acta Pharmacol. Sin. 2000. - v. 21. - p. 819-823.

390. Tasker R.C., Coyle J.T., Vornov J.J. The regional vulnerability to hypoglycemia-induced neurotoxicity in organotypic hippocampal culture: protection by early tetrodotoxin or delayed MK-801. // J. Neurosci. 1992. - v. 12. -N 11. - p. 4298-4308.

391. Thoren A.E., Helps S.C., Nilsson M. and Sims,N.R. The metabolism of C-glucose by neurons and astrocytes in brain subregions following focal cerebral ischemia in rats. // J. Neurochem. 2006. - v. 97. - p. 968-978.

392. Tokime T., Nozaki K., Sugino T., Kikuchi H., Hashimoto N. and Ueda K. Enhanced poly(ADP-ribosyl)ation after focal ischemia in rat brain. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1998.-v. 18.-N9.-p. 991-997.

393. Tombaugh G.C. and Sapolsky R.M. Mechanistic distinctions between excitotoxic and acidotic hippocampal damage in an in vitro model of ischemia. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - v. 10. - p. 527-535.

394. Tombaugh G.C. and Somjen G.G. Effects of extracellular pH on voltage-gated Na+, K+ and Ca2+ currents in isolated rat CA1 neurons. // J. Physiol. 1996. - v. 493,-p. 719-732.

395. Tomlinson F.H., Anderson R.E. and Meyer F.B. Brain pHi, cerebral blood flow, and NADH fluorescence during severe incomplete global ischemia in rabbits. // Stroke. 1993. - v. 24. - p. 435-443.

396. Traaseth N., Elfering S., Solien J., Haynes V. and Giulivi C. Role of calcium signaling in the activation of mitochondrial nitric oxide synthase and citric acid cycle. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - v. 1658. - p. 64-71.

397. Tsacopoulos M. and Magistretti P.J. Metebolic coupling between glia and neurons // J. Neurocsi. 1996. - v. 16. - 877-885.

398. Turner D.A. and Adamson D.C. Neuronal-astrocyte metabolic interactions: understanding the transition into abnormal astrocytoma metabolism. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2011. - v. 70. - № 3. - p. 167-176.

399. Uchiyama-Tsuyuki Y., Araki H., Yae T. and Otomo S. Changes in the extracellular concentrations of amino acids in the rat striatum during transient focal cerebral ischemia. // J. Neurochem. 1994. - v. 62. - p. 1074-1078.

400. Uematsu D., Greenberg J.H., Reivich M., Karp A. Cytosolic free calcium, NAD/NADH redox state and hemodynamic changes in the cat cortex during severe hypoglycemia. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1989. v. 9. - N 2. - p. 149-155.

401. Valdez L.B., Zaobornyj T., Alvarez S., Bustamante J., Costa L.E., Boveris A. Heart mitochondrial nitric oxide synthase. Effects of hypoxia and aging. // Mol. Aspects Med. 2004. - v. 25. - N 1-2. - p. 49-59.

402. Varon S. and Conner J.M. Nerve growth factor in CNS repair. // J Neurotrauma 1994. - v. 11. - p. 473-486.

403. Vergun O., Han Y.Y., Reynolds I.J. Glucose deprivation produces a prolonged increase in sensitivity to glutamate in cultured rat cortical neurons. // Exp. Neurol. 2003. - v. 183. - N 2. - p. 682-694.

404. Vergun O., Sobolevsky A.I., Yelshansky M.V., Keelan J., Khodorov B.I. and Duchen M.R. Exploration of the role of reactive oxygen species in glutamate neurotoxicity in rat hippocampal neurones in culture. // J. Physiol. 2001. - v. 531. - p. 147-163.

405. Vesce S., Kirk L. and Nicholls D.G. Relationships between superoxide levels and delayed calcium deregulation in cultured cerebellar granule cells exposed continuously to glutamate. // J. Neurochem. 2004. - v. 90. - p. 683-693.

406. Waagepetersen H.S., Qu H., Schousboe A., and Sonnewald U. Elucidation of the quantitative significance of pyruvate carboxylation in cultured cerebellar neurons and astrocytes. // J. Neurosci. Res. 2001. - v. 66. - p. 763-770.

407. Wada K., Miyazawa T., Nomura N., Yano A., Tsuzuki N., Nawashiro H., Shima K. Mn-SOD and Bcl-2 expression after repeated hyperbaric oxygenation. // Acta Neurochir. Suppl. 2000. - v. 76. - p. 285-290.

408. Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., Heurteaux C. and Lazdunski M. A proton-gated cation channel involved in acid-sensing. // Nature. 1997. - v. 386. -p. 173-177.

409. Walev I., Reske K., Palmer M. Valeva A., Bhakdi S. Potassium-inhibited processing of IL-1 beta in human monocytes. // EMBO J. 1995. - v. 14. - N 8. -p. 1607-1614.

410. Wallace D.C. Mitochondrial defects in cardiomyopathy and neuromuscular disease. // Am Heart J.- 2000. v. 139(2 Pt 3). - p. S70-85.

411. Walton H.S. and Dodd P.R. Glutamate-glutamine cycling in Alzheimer's disease. //Neurochem. Int. 2007. - v. 50. - p. 1052-1066.

412. Wang G.I., Randall R.D., Thayer S.A. Glutamate-induced intracellular acidification of cultured hippocampal neurons demonstrates altered energy metaboism resulting from Ca2+ loads. // J. Neurophysioll. 1994. - v. 72. - N 6. -p. 2563-2569.

413. Wang G.J., Jackson J.G. and Thayer S.A. Altered distribution of mitochondria impairs calcium homeostasis in rat hippocampal neurons in culture. // J. Neurochem. 2003. - v. 87. - p. 85-94.

414. Waniewski R.A. Physiological levels of ammonia regulate glutamine synthesis from extracellular glutamate in astrocyte cultures. // J. Neurochem. 1992. - v. 58. - p. 167-174.

415. Watkins J.C., Olverman H.J. Agonists and antagonists for excitatory amino acid receptors. // Trends in Neurosci. 1987. - v. 10. - p. 265-272.

416. Watson B.D., Dietrich W.D., Busto R., Wachtel M.S., Ginsberg MD. Induction of Reproducible Brain Infarction by Photochemically Initiated Trombosis. // Ann. Neurol. 1985 - v. 17. - p. 497-504.

417. Watson B.D., Dietrich W.D., Prado R., Ginsberg M.D. Argon laser-induced arterial photothrombosis: characterisation and possible application to therapy of arteriovenous malformations. // J. Neurosurg. 1987. - v. 66. - p. 748-754.

418. Weih M., Prass K., Ruscher K., Trendelenburg G., Dirnagl U., Riepe M.W., Meisel A. Ischemia tolerance; model for research, hope for clinical practice? // Nervenarzt. 2001. - v. 72. - N 4. - p. 255-260.

419. Weiss J., Golderg M.P. and Choi D.W. Ketamine protects cultured neocortical neurons from hypoxic injury. // Brain Res. 1986. - v. 380. - p. 186-190.

420. Wemmie J.A., Askwith C.C., Lamani E., Cassell M.D., Freeman J.H. Jr., Welsh M.J. Acid-sensing ion channel 1 is localized in brain regions with high synaptic density and contributes to fear conditioning. // J. Neurosci. 2003. - v. 23. - p. 5496-5502.

421. Wemmie J.A., Chen J., Askwith C.C., Hruska-Hageman A.M., Price M.P., Nolan B.C., Yoder P.G., Lamani E., Hoshi T., Freeman .J.H. Jr. and Welsh M.J.

422. The acid-activated ion channel ASIC contributes to synaptic plasticity, learning, and memory. //Neuron. 2002. - 34. p. 463-477.

423. Westergaard N., Sonnewald U. and Schousboe A. Metabolic trafficking between neurons and astrocytes: the glutamate/glutamine cycle revisited. // Dev. Neurosci. 1995. - v. 17. - p. 203-211.

424. White R.J. and Reynolds I.J. Mitochondria and Na+/Ca2+ exchange buffer glutamate-induced calcium loads in cultured cortical neurons. // J. Neurosci. -1995. v. 15. - p. 1318-1328.

425. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondrial depolarization in glutamate-stimulated neurons: an early signal specific to excitotoxin exposure. // J. Neurosci. 1996. -v. 16. -N 18. - p. 5688-5697.

426. Wieloch T. Hypoglycemia-induced neuronal damage prevented by an N-methyl-D-aspartate antagonist. // Science. 1985. - v. 230. - N 4726. - p. 681-683.

427. Wijburg F.A., Feller N., de Groot C.J. and Wanders R.J. Menadione partially restores NADH-oxidation and ATP-synthesis in complex I deficient fibroblasts. // Biochem. Int. 1990. - v. 22. - p.303-309.

428. Wilson J.E. Hexokinases. // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1995. - v. 126.-p. 65-198.

429. Wu D. Neuroprotection in experimental stroke with targeted neurotrophins. // NeuroRx. -2005. v. 2. - p. 120-128.

430. Wu M.L., Chen J.H., Chen W.H., Chen Y.J. and Chu K.C. NMDA-induced intracellular acidification. // Am. J. Physiol. 1999. - v. 277. - C717-C727.

431. Xiang Z., Yuan M., Hassen G.W., Gampel M., Bergold P.J. Lactate induced excitotoxicity in hippocampal slice cultures. // Exp. Neurol. 2004. - v. 186. - N 1. - p. 70-77.

432. Xiang Z. and Bergold P.J. Synaptic depression and neuronal loss in transiently acidic hippocampal slice cultures. // Brain Res. 2000. - v. 881. - p. 77-87.

433. Xiong Z.G., Chu X.P. and Simon R.P. Ca2+ -permeable acid-sensing ion channels and ischemic brain injury. // J. Membrane Biol. 2006. - v. 209. - p. 59-68.

434. Xiong Z.G., Zhu X.M., Chu X.P., Minami M., Hey J., Wei W.L., MacDonald J.F., Wemmie J.A., Price M.P., Welsh M.J. and Simon R.P. Neuroprotection in ischemia: blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels. // Cell. 2004. -v. 118. - p. 687-698.

435. Xu L., Glassford A.J.M., Giaccia A.J. and Giffard R.G. Acidosis reduces neuronal apoptosis. // Mol. Neurosci. 1998. - v. 9. - p. 875-879.

436. Yagi K., Kitazato K.T., Uno M., Tada Y., Kinouchi T., Shimada K. and Nagahiro S. Edaravone, a free radical scavenger, inhibits MMP-9-related brain hemorrhage in rats treated with tissue plasminogen activator. // Stroke. 2009. -v. 40. - p. 626-631.

437. Yang Z.J., Ni X., Carter E.L., Kibler K., Martin L.J., Koehler R.C. Neuroprotective effect of acid-sensing ion channel inhibitor psalmotoxin-1 after hypoxia-ischemia in newborn piglet striatum. // Neurobiol. Dis. 2011. - v. 43. -N 2. - p. 446-454.

438. Yalcin A., Koulich E., Mohamed S., Liu L., D'Mello S.R. Apoptosis in cerebellar granule neurons is associated with reduced interaction between CREB-binding protein and NF-kappaB. // J. Neurochem. 2003. - v. 84. № 2. - p. 397-408.

439. Yao H., Haddad G.G. Calcium and pH homeostasis in neurons during hypoxia and ischemia.// Cell Calcium. 2004. - v. 36. - p. 247-255.

440. Yermolaieva O., Leonard A.S., Schnizler M.K., Abboud F.M. and Welsh M.J. Extracellular acidosis increases neuronal cell calcium by activating acid-sensing ion channel la. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. - v. 101. - p. 6752-6757.

441. Ying, W., Alano, C.C., Gamier, P., and Swanson, R.A. NAD+ as a metabolic link between DNA damage and cell death. // J. Neurosci. Res. 2005. - v. 79. - p. 216-223.

442. Ying W., Chen Y., Alano C.C. and Swanson R.A. Tricarboxylic acid cycle substrates prevent PARP-mediated death of neurons and astrocytes. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002. - v. 22. - p. 774-779.

443. Ying W., Han S.K., Miller J.W. and Swanson R.A. FAS-mediated apoptosis and its relation to intrinsic pathway activation in an experimental model of retinal detachment. // J. Neurochem. 1999. - v. 73. - p. 1549-1556.

444. Ying W., Xiong Z.G. Oxidative stress and NAD+ in ischemic brain injury: current advances and future perspectives. // Curr. Med. Chem. 2010. - v. 17. - N 20. - p. 2152-2158.

445. Yu S.P., Yeh C.-H., Strasser U., Tian M., Choi D.W. NMDA receptor-mediated K+ efflux and neuronal apoptosis. // Science. 1999. - v. 284. - p. 336-339.

446. Zaidan E. and Sims N.R. The calcium content of mitochondria from brain subregions following short-term forebrain ischemia and recirculation in the rat. // J. Neurochem. 1994. - v. 63. - p. 1812-1819.

447. Zeevalk G.D. and Nicklas W.J. Lactate prevents the alterations in tissue amino acids, decline in ATP, and cell damage due to aglycemia in retina. // J. Neurochem. 2000. - v. 75. - p. 1027-1034.

448. Zhang E.T., Hansen A.J., Wieloch T. Lauritzen M.Influence of MK-801 on brain extracellular calcium and potassium activities in severe hypoglycemia. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - v. 10. - p. 136-139.

449. Zhang J.P., Sun G.Y. Free fatty acids, neutral glycerides, and phosphoglycerides in transient focal cerebral ischemia. // J. Neurochem. 1995. -v. 64. -N4. - p. 1688-1695.

450. Zhou X., Jiang G., Zhao A., Bondeva T., Hirszel P., Balla T. Inhibition of Na,K-ATPase activates PI3 kinase and inhibits apoptosis in LLC-PK1 cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - v. 285. -N 1. - p. 46-51.

451. Zhu C., Qiu L., Wang X., Hallin U., Candé C., Kroemer G., Hagberg H., Blomgren K. Involvement of apoptosis-inducing factor in neuronal death after hypoxia-ischemiain the neonatal rat brain. // J. Neurochem. 2003. - v. 86. - N 2. -p. 306-317.

452. Zhu Y., Xu H., Huang K., Mitochondrial permeability transition and cytochrome c release induced by selenite. // J. Inorg. Biochem. 2002. - v. 90. -p. 43-50.

453. Zorov D.B., Juhaszova M. and Sollott S.J. Mitochondrial ROS induced ROS release: an update and review. // Biochim. Biophys Acta. 2006. - v. 1757. - p. 509-517.

Информация о работе

Стельмашук, Елена Викторовна
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Механизмы повреждения и защита нейронов головного мозга при экспериментальном моделировании ишемии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы