Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы действия нейропептидов аллатостатина и проктолина на активность моторных синапсов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия нейропептидов аллатостатина и проктолина на активность моторных синапсов"

На правахрукописи

ГАЙДУКОВ АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ НЕЙРОПЕПТИДОВ АЛЛАТОСТАТИНА И ПРОКТОЛИНА НА АКТИВНОСТЬ МОТОРНЫХ СИНАПСОВ

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М.В Ломоносова (заведующий кафедрой - академик РАМН И.П. Ашмарин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук О.П. Балезина

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук А.С. Пивоваров доктор биологических наук Ю.Б. Шмуклер

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Защита диссертации состоится 31 мая 2004 года в 1530 на заседании диссертационного совета Д501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ им.Ломоносова, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 30 апреля 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В современной физиологии большой интерес вызывают исследования новых регуляторных пептидов, выделяемых из нервной ткани разных групп беспозвоночных животных. К их числу относятся аллатостатин и проктолин. Аллатостатины - семейство структурно сходных пептидов, состоящих из 6-18 аминокислот - экстрагированных из мозга таракана Diploptera punctata (Woodhead et al., 1989; Pratt et al., 1991), где они тормозят синтез ювенильного гормона в железистом органе таракана corpora allata (Stay et al., 1994). Проктолин - пентапептид, известный как «кишечный фактор», усиливающий сокращения висцеральной мускулатуры у таракана Periplaneta americana (Brown, 1967). Оба пептида недавно описаны и у ракообразных, где они выполняют сходные функции - модулируют работу висцеральной мускулатуры. Кроме того, и аллатостатин, и проктолин обнаружены в составе разных групп мотонейронов, иннервирующих скелетные мышечные волокна раков (Rathmayer et al, 2002). Таким образом, несмотря на структурные различия аллатостатина и проктолина, общность их локализации (в составе мотонейронов скелетных волокон) позволяет предположить, что у ракообразных оба пептида могут действовать на одну и ту же мишень -скелетные мышечные волокна. В чем особенности миотропного действия каждого из пептидов, и как их эффекты взаимодействуют на уровне моторных синапсов скелетной мускулатуры ракообразных, остается не ясным.

Еще менее изучен вопрос о представительстве этих пептидов (и их рецепторов) у позвоночных животных, в том числе - млекопитающих. Имеются данные о способности и проктолина, и аллатостатина потенциировать сокращение желудка и кишечника у крысы и мыши (Schulz et al., 1981; Gaydukov et al., 1998). Возможность миомодулирующих воздействий на уровне моторных синапсов скелетных мышц млекопитающих остается не изученной. Правомочность и актуальность исследований в этом направлении основаны на известных примерах, когда пептиды беспозвоночных впоследствии оказывались переоткрытыми уже как эндогенные регуляторы позвоночных, где они могут иметь физиологическую активность, сходную либо отличную от таковой у низших животных (Ашмарин, Каменская, 1988; Гомазков, 1995; Nassel, 2002).

Цели и задачи исследования. Целью работы был анализ возможного действия нейропептидов аллатостатина и проктолина на моторные синапсы скелетных мышечных волокон ракообразных и млекопитающих. Для этого в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать эффекты аллатостатина и проктолина как возможных модуляторов сократительной активности скелетных мышечных волокон морского рака Idotea baltica.

2. Сопоставить характер действия аллатостатина и проктолина на моторные синапсы краба Eriphia spinifrons и попытаться в^ярцдойодзду^кодшддеханизмм

реализации эффектов пептидов.

| С.П«т«рбург

03 с\

3. Выявить влияния аллатостатина и проктолина на спонтанную и вызванную активность моторных синапсов диафрагмы мыши.

4. Понять, на каком - пре- или постсинаптическом уровне реализуются возможные эффекты проктолина и аллатостатина в моторных синапсах мыши; выявить возможные механизмы действия пептидов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нейропептиды проктолин и аллатостатин демонстрируют противоположно направленные миотропные эффекты: аллатостатин тормозит, а проктолин -усиливает работу нервно-мышечных синапсов и сокращение скелетных мышц ракообразных.

2. В моторных нервных терминалях ракообразных (краба ЕпрЫа врт/гонв) сосуществуют два типа Са2+-каналов - Р/()- и ^типа, из которых лишь Р/С^-тип вовлечен в потенциирование проктолином вызванного выброса медиатора.

3. Проктолин и аллатостатин действуют облегчающе на работу холинэргических моторных синапсов мыши. Проктолин усиливает выброс медиатора, стимулируя работу -каналов -типа терминали; аллатостатин вызывает увеличение размера квантов АХ, путем активации, внутриклеточных каскадов с участием протеинкиназы А нервной терминали мыши.

Научная новизна. В работе впервые установлена способность аллатостатина тормозить сокращение и работу моторных синапсов скелетных мышечных волокон ракообразных. Впервые показано, что в составе мембраны моторных нервных терминален краба ЕпрЫа имеются Са2+-каналы двух типов - Р/(3- и ^типа, по-разному вовлеченные в запуск, секреции медиатора. Установлен ранее не известный факт облегчающего действия проктолина на выброс медиатора через модуляцию активности Са2+-каналов Р/(}-типа. Впервые описаны особенности взаимодействия тормозных эффектов аллатостатина и потенциирующих эффектов проктолина в отношении синаптической активности и сокращений скелетной мускулатуры ракообразных. Установлены ранее не известные облегчающие влияния проктолина и аллатостатина на спонтанную и вызванную синаптическую активность моторных синапсов диафрагмы мыши.

Впервые описана способность аллатостатина - при аппликации в низких концентрациях - увеличивать размер одиночных квантов медиатора в холинэргическом синапсе, действуя через активацию пресинаптической протеинкиназы А.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе факты содержат новую важную информацию о модуляторном действии нейропептидов беспозвоночных - проктолина и аллатостатина - на уровне моторных синапсов и скелетных мышечных волокон ракообразных и млекопитающих (мыши). Данные имеют общетеоретическое значение для синаптической физиологии и понимания особенностей пептидной регуляции работы синапсов. Научную ценность для синаптологии имеет впервые описанный факт значительного увеличения размера кванта медиатора в

холинэргических моторных синапсах мыши под действием аллатостатина. Это может оказаться перспективным для клинической практики - при разработках новых классов фармакологических препаратов, облегчающих синаптическую передачу в моторных синапсах млекопитающих.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были доложены на конференции молодых ученых (Москва, 1999), 26th European Peptide Symposium (Монпелье, Франция, 2000), VIII Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения X. С. Коштоянца (Москва, 2000), 27th European Peptide Symposium (Сорренто, Италия, 2002).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, изложение экспериментальных результатов и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Основной материал изложен на 110 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков. Библиография включает 233 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первая часть экспериментов выполнена на изолированных мышечных волокнах мышц-экстензоров брюшка равноногого рака Ыо1ва ЬаШеа. Для анализа сокращений мышечных волокон изолированные волокна помещали в камерку объемом 0,5 см3, перфузируемую физиологическим раствором для ракообразных. Состав раствора (в мМ): №С1 - 490; КС1 - 8; СаС^ - 10; М^Ь -12; HEPES - 10 (рН раствора доводили до 7,4). Один конец волокна фиксировали на держателе, а другой - подсоединяли к тензодатчику. Одновременно в волокно вводили два микроэлектрода, один - для регистрации сдвигов мембранного потенциала волокна, а второй - для пропускания прямоугольных импульсов электрического тока, вызывавших локальное сокращение волокна. Импульсы тока имели длительность 100-200 мсек и амплитуду -0,1-0,5 мкА. Эксперименты проводили при температуре 18°С.

Исследование модуляторного действия нейропептидов на синаптическую передачу у ракообразных проведено на нервно-мышечных синапсах скелетных мышечных волокон мышцы-закрывателя в составе проподита конечности морского краба, ЕпрМа зрШ/гот. Отделяли конечность посредством аутотомии, отпрепаровывали кутикулу дорзальной части проподита до образования миниатюрной «экспериментальной камеры» объемом около 1 мл, стенками которой являлась кутикула. Внутри такой «камеры» на ее дне оказывались волокна мышцы-закрывателя. Для регистрации возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) использовали метод macropatch-clamp'a. Особенностью данной техники является использование специального macropatch-электрода (диаметр кончика - около 10 мкМ; сопротивление 0.1-0.3 МОм). Прижимание данного электрода к поверхности индивидуальных мышечных волокон приводит к образованию между macropatch-электродом и

мембраной мышечного волокна неплотного контакта (т.н. «макропэтча» с сопротивлением порядка 1 МОм). Это позволяет одновременно стимулировать вызванный выброс медиатора, локально деполяризуя (амплитуда стимула 1-4 мкА, длительность - 0,05-0,2 мсек, частота 0,5 Гц) синаптические бутоны, находящиеся под macropatch-электродом, и внеклеточно регистрировать возникающие при этом постсинаптические токи через тот же самый macropatch-электрод.

Третий объект, использованный в работе - нервно-мышечные синапсы волокон диафрагмы мыши. Готовили изолированный диафрагмальный препарат и помещали его в экспериментальную камеру, перфузируемую раствором Лайли для теплокровных животных. Состав раствора (в мМ): -

135; КС1 - 4; ЫаН2Р04 - 0,9; СаСЬ - 2,2; М§С12 - 1; ИаНСОз - 16,3; глюкоза -11. Раствор аэрировали карбогеном (95%02/5%С02), рН раствора доводили до 7,4. Эксперименты проводили при комнатной температуре 21-22°С. В опытах на изолированной диафрагмальной мышце мыши использовали стандартную микроэлектродную технику для регистрации спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП), а также метод двухэлектродной фиксации потенциала для регистрации спонтанных и вызванных токов концевой пластинки мыши (МТКП и ТКП).

Статистическую обработку проводили с помощью ^критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние аллатостатина и проктолина на сократительные ответы изолированных мышечных волокон рака МоТеа ЬаШса

1.1. Эффекты аллатостатина.

При регистрации сократительных и электрических ответов волокна (на раздражение электрическим током) мы установили, что аллатостатин не влияет на сдвиги мембранного потенциала, но подавляет сократительные ответы мышечного волокна. Тормозный эффект был дозо- и время-зависимым. При аппликации 10-8М аллатостатина амплитуда сокращений снижалась на 20-25% (р<0,05, п=8), в более высоких концентрациях (10-7 - 10-6М аллатостатина) снижалась на 30-40% (п=10). Тормозный эффект сохранялся на протяжении всего времени экспозиции аллатостатина (30-40мин). Отмывка мышечных волокон от действия аллатостатина приводила к восстановлению сократительных ответов до контрольных значений.

1.2. Эффекты проктолина.

Проктолин вызывал дозозависимое увеличение сократительных ответов и не влиял на электрические параметры волокна. Степень прироста амплитуды сокращений была от 1,5 до 18-тикратной в ответ на действие проктолина в диапазоне концентраций

1.3. Взаимодействие пептидов.

При аппликации одного из пептидов на фоне другого они действовали антагонистически: введение аллатостатина (10-6М) на фоне прироста силы сокращения, вызываемого аппликацией проктолина (10-6М), приводило к элиминации увеличения сократительного ответа, а затем (спустя 20-30 минут от начала введения аллатостатина в перфузат) - к подавлению сокращений на 2530% ниже контрольного уровня. При обратной последовательности нанесения пептидов на мышечное волокно мы установили, что проктолин - на фоне сниженной аллатостатином силы сокращений - приводил сначала к возврату сокращений до контрольного уровня, а затем - к приросту до 30-40% выше контроля.

Таким образом, исследуемые пептиды оказались способными действовать на сократительную активность мышечных волоки рака Idotea антагонистически и независимо друг от друга. Это позволяет предположить, что модулирующие воздействия двух пептидов на сокращение происходят, по-видимому, по независимым путям и механизмам, которые не конкурируют между собой.

Имея в виду возможность системного действия проктолина и аллатостатина при их высвобождении по ходу аксонов в организме ракообразных, нельзя исключить, что их эффекты не ограничиваются лишь прямым действием на мышечные волокна, но могут быть адресованы и моторным синапсам мышечных волокон ракообразных. Исследованию этого вопроса были посвящены следующие серии нашей работы.

2. Воздействие аллатостатина и проктолина на работу моторных синапсов нервно-мышечного препарата краба Eriphia spinifrons

Анализ влияний проктолина и аллатостатина проводили на «быстрых» мышечных волокнах в составе мышц-закрывателей ходильных конечностей краба. Волокна иннервированы аксональными разветвлениями одного фазного мотонейрона - «быстрого возбуждающего мотонейрона мышцы-закрывателя» (англ. «fast closer excitoo» - FCE) (Rathmayer, Maier 1987). Регистрацию возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) моторных синапсов проводили с помощью метода macropatch-clamp'a (Dudel, 1989), Критерием удачного выявления зоны синапса - т.н. синаптического «бутона» - служило появление стабильного постсинаптического тока в ответ на локальную деполяризацию синаптического бутона через macrapateh-электрод. В каждом моторном синапсе краба регистрировали вызванные ВПСТ и одноквантовые спонтанные, или «миниатюрные ВПСТ» (мВПСТ). Вызванные ВПСТ имели мультиквантовый характер и отличались высокой степенью асинхронности (типичной для моторных синапсов ракообразных). Спонтанная же активность выражена слабо, и средняя частота мВПСТ составляла ~ 0.1-0,01 Гц.

2.1. Эффекты аллатостатина.

Амплитуда вызванных ВПСТ в контроле варьировала у разных нервно-мышечных препаратов от 0,5 до 7 нА, (что связано с особенностями

морфологии отдельных бутонов). Временные параметры ВПСТ составляли: время нарастания ВПСТ - О,96±0,13 мс; время полуспада ВПСТ- 1,19+0,08 мс (п=5). Аллатостатин в концентрации 106М вызывал в течение 30 минут уменьшение амплитуды ВПСТ, в среднем до 66,97+10,82% от контроля при фокальном раздражении варикоз (р<0,05; п-5) (рис. 1).

Рис. 1. Действие аллатостатина (10-6М) на амплитуду вызванных и спонтанных ВПСТ краба - пример в одном синапсе (вверху) и среднее значение амплитуды вызванных ВПСТ в контроле и на фоне аллатостатина (п=5) (внизу).

Временной ход вызванных ВПСТ оставался при этом без изменений -средние время нарастания и время полуспада ВПСТ составили 0,93+0,08мс и 1,16+0,07мс, соответственно {р>0,05; п=5). В отличие от вызванных сигналов, спонтанные мВПСТ - судя по амплитудно-временным параметрам и средней частоте следования - оставались без изменений под действием аллатостатина (10-6М). Полученные факты созвучны данным Крейссль и соавторов, описавших падение амплитуды и квантового состава ВПСТ в моторных синапсах равноного рака Ыа1ва Ьа1Иса под действием другого представителя семейства аллатостатинов - аллатостатина 3 (Б1рри-Ай 8). При этом

характеристики спонтанной секреции, так же, как и в наших экспериментах, не менялись (Kreissl et al., 1999).

Тормозное действие аллатостатина на вызванную синаптическую активность имеет, по всей видимости, пресинаптическую природу, и направлено на уменьшение вызванного выброса медиатора (глутамата). Примечательно, что мы обнаружили снижение аллатостатином вызванного выброса медиатора на тех мышечных волокнах краба, которые не имеют тормозной ГАМКэргической иннервации (Rathmayer, Maier, 1987; Rathmayer et al., 2002). Это означает, что, помимо хорошо изученной системы пресинаптического торможения, реализуемой посредством ГАМКэргических синапсов на глутаматсодержащих возбуждающих моторных аксонах, у ракообразных имеет место еще один эффективный способ подавления синаптической активности — за счет пептидного модулятора аллатостатина. При этом, аллатостатин у краба может быть и котрансмиттером глутамата, но может выделяться и из нейрохемальных органов и достигать скелетной мускулатуры и синапсов гуморальным путем - посредством циркуляции гемолимфы (Rathmayer et al., 2002).

2.2. Эффекты проктолина.

При аппликации проктолина (10-6М) на мышечные волокна краба, наблюдали эффект, прямо противоположный действию аллатостатина -увеличение амплитуды вызванных ВПСТ. Увеличение амплитуды ВПСТ варьировало от препарата к препарату и к 30-ой минуте инкубации в растворе проктолина достигало в среднем 136,27+7,52% от контроля {р<0,05; п=8) (рис.2). В отличие от амплитуды, временные характеристики вызванных ВПСТ - время нарастания и полуспада - на фоне проктолина достоверно не изменялись по отношению к контролю. Не обнаружено и изменений параметров спонтанной секреции глутамата: в присутствии проктолина средняя амплитуда, временной ход и частота мВПСТ не отличались от контрольных значений.

Учитывая, что прирост амплитуды вызванных ВПСТ происходил на фоне неизменной амплитуды мВПСТ, можно предполагать, что потенциирующее действие проктолина на синаптическую передачу реализуется на пресинаптическом уровне и направлено на увеличение квантового состава вызванной секреции глутамата в моторных синапсах краба.

Таким образом, мы установили, что и проктолин, и аллатостатин оказывают выраженное пресинаптическое действие, прямо противоположное по знаку. Считается, что эти пептиды запасаются в разных типах нейронов и/или нейрохемальных органов у краба и других ракообразных и могут высвобождаться не только локально в синапсах, но и дистантно - в гемолимфу (Christie et al., 1995; Skiebe et al., 1999). Поэтому не исключена возможность перекрывания во времени их действия на мышцы и моторные синапсы. В связи с этим, представляло интерес исследовать в эксперименте характер взаимодействия пресинаптических эффектов проктолина и аллатостатина.

Рис. Т. Действие проктолина (10-6 М) на амплитуду вызванных и спонтанных ВПСТ краба - пример в одном синапсе (вверху) и среднее значение амплитуды вызванных ВПСТ в контроле и на фоне проктолина (п =8) (внизу).

2.3 Взаимодействие эффектов аллатостатина и проктолина.

Исследования взаимодействий аллатостатина и проктолина проводили по следующей схеме. В экспериментальную камеру с нервно-мышечным препаратом краба апплицировали проктолин (10-6М), а затем, спустя 30 минут, на фоне проктолина добавляли аллатостатин в той же концентрации (10-6М). При первоначальном введении в перфузат проктолина происходил прирост амплитуды ВПСТ в среднем до 135,08+14,47% от контроля (р<0,05; п=4). Последующее введение аллатостатина приводило в первые 10-15 минут к элиминации потенциирующих эффектов проктолина и возврату амплитуды ВПСТ до контрольных значений, а затем - на 20-30-ой минуте - к снижению амплитуды ВПСТ ниже контрольных значений в среднем на 25,73+8,88% (р<0,05; п=4). Отмывка мышцы от пептидов приводила к восстановлению исходной амплитуды ВПСТ.

Таким образом, пресинаптическое тормозное действие аллатостатина на фоне проктолина сохраняется. Эти данные свидетельствуют о том, что пептиды, по-видимому, действуют на секрецию медиатора независимо, через разные рецепторы и механизмы. Какие именно это механизмы, остается пока не ясным. В дальнейших экспериментах нам удалось отчасти прояснить, каким образом действует проктолин. Мы предположили, что вероятным посредником облегчающего действия проктолина на вызванный выброс медиатора может быть его влияние на работу Са2+-каналов наружной мембраны нервных терминалей краба. Следующая серия экспериментов была посвящена проверке этой гипотезы с использованием избирательных блокаторов разных типов каналов.

3. Исследование роли разных типов пресинаптических Саг+-каналов в реализации облегчающих эффектов проктолина в моторных синапсах

краба Eriphia spinifrons

Были исследованы изменения амплитуды ВПСТ на фоне действия трех типов блокаторов: избирательного блокатора Са2*-каналов L-типа нифедипина, избирательного блокатора N-типа каналов - со-конотоксина GIVÄ (co-CgTx) и селективного блокатора P/Q-типа каналов, - со-агатоксина IVA (<»-AgaTx). Далее рассматривали, как изменятся эффекты проктолина в отношении амплитуды вызванных ВПСТ на фоне действия соответствующих блокаторов -каналов.

3.1. Изменения ВПСТ на фоне нифедипина.

На фоне нифедипина (10-6М) в течение 40 минут мы не обнаружили достоверных изменений амплитуды, времени нарастания и времени полуспада ВПСТ по сравнению с контрольными значениями (р>0,05; п=5). В тех экспериментах, где на фоне нифедипина (10-6М) удалось зарегистрировать, наряду с вызванными ВПСТ, и спонтанную активность (мВПСТ) - ни средняя амплитуда, ни времена нарастания и полуспада, ни частота мВПСТ достоверно не изменялись по отношению к контролю. Неспособность нифедипина изменять амплитудно-временные характеристики спонтанных и вызванных иостсинаптических токов позволяет предположить, что потенциалзависимые кальциевые каналы L-типа либо вообще отсутствуют на пресинаптической мембране исследуемых нервных окончаний, либо - в нормальных условиях - не участвуют в запуске выброса медиатора глутамата из синаптических варикоз.

3.1.1. Эффекты проктолина на фоне нифедипина.

Проктолин (1мкМ) на фоне нифедипина вызывал развивающееся в течение нескольких минут увеличение амплитуды ВПСТ, сохраняющееся на протяжении всего времени аппликации пептида (30-40 минут), и достигавшее 129,5+5,6% от контроля (р<0,05; n=5). Такое увеличение амплитуды ВПСТ практически совпадает с приростом амплитуды ВПСТ на фоне проктолина в отсутствие нифедипина.

3.2. Изменения ВПСТ на фоне ю-CgTx.

Блокатор N-типа Са2+-каналов - ю-CgTx - мы использовали в трех разных

концентрациях - 0,2 мкМ, 1 мкМ и 10 мкМ. Было установлено, что амплитуда,

частота и временные параметры спонтанных мВПСТ не изменяются при

добавлении во всем диапазоне концентраций. При анализе вызванных

ВПСТ оказалось, что их временные параметры не меняются, тогда как

амплитуда снижалась на фоне co-CgTx дозозависимым образом. На фоне 0,2

мкМ <o-CgTx амплитуда ВПСТ снизилась на 6,1±3,0% от контрольных значений

(р>0,05; п=3); на фоне 1 мкМ co-CgTx - на 24,9+6,0% {р>0,05; п=3), а на фоне

10 мкМ co-CgTx - на 27,1+5,0% (р<0,05; п=3). До настоящего времени

_ 2+

возможное присутствие N-типа потенциалзависимых Са -каналов у ракообразных было описано только в моторных нервных терминалях брюшных мышечных волокон омара (Grossman et al., 1991). В недавних работах на моторных синапсах различных видов ракообразных не выявлено блокирующих эффектов (O-CgTx на синаптическую передачу (Araque et al., 1994; Wright et al., 1996; Hurley and Graubard, 1998). Поэтому общепринятым было представление, что пресинаптические Са2+-каналы N-типа не задействованы в нервно-мышечной передаче у ракообразных. Однако результаты наших экспериментов позволяют утверждать, что у краба Eriphia spinifrons запуск вызванного выброса медиатора из синаптических бутонов опосредуется - по крайней мере -частично - работой N-типа Са2+-каналов.

3.2.1 Эффекты проктолина на фоне са-СрТх.

В условиях сниженного вызванного выброса медиатора, благодаря присутствию в растворе 10-6М аппликация проктолина в концентрации

10-6М приводила к достоверному увеличению средней амплитуды вызванных ВПСТ. К 30-й минуте инкубации нервно-мышечного препарата в растворе, содержащем и проктолин, прирост средней амплитуды вызванных

ВПСТ составил 17.6+1,1% (р<0,05; п=3).

Таким образом, проведенные исследования впервые показали, что запуск вызванного выброса медиатора из синаптических варикоз, образуемых фазным мотонейроном FCE на мышечных волокнах краба, частично обусловлен работой потенциалзависимых Са2* -каналов N-типа. Однако этот тип каналов не участвует в реализации потенциирующих эффектов проктолина на синаптическую передачу в нервно-мышечном синапсе краба.

3.3 Изменения ВПСТ на фоне со-АраТх.

В следующей серии экспериментов был использован блокатор Са2+ -каналов P/Q-типа co-AgaTx- и исследована дозозависимость его эффектов. Добавление в перфузат 5 нМ o-AgaTx вызывало уменьшение амплитуды ВПСТ к 30-й минуте инкубации в среднем до 66,4+8,0% от контроля (р<0,05; п=3). Увеличение концентрации co-AgaTx до 10-8М привело к снижению амплитуды ВПСТ до 22,2+6,1% от контроля (р<0,001; п=10). Дальнейшее увеличение

концентрации co-AgaTx до 1(Г7М приводило к насыщению эффекта блокирования каналов - средняя амплитуда вызванных ВПСТ

уменьшалась до 13,9+3,5% от контроля (р<0,001; п=6). Таким образом, даже в присутствии в перфузате насыщающей концентрации со-ЛеаТх вызванный выброс медиатора из синаптических варикоз блокируется не полностью.

3.3.1 Эффекты проктолина на фоне ю-АсаТх.

Аппликация 10-6М проктолина на фоне <й-А§аТх не приводила к достоверному приросту амплитуды вызванных ВПСТ. Средняя амплитуда вызванных ВПСТ на фоне проктолина в присутствии 5 нМ составляла

67,4+8,4% от контроля (р<0,05; п=3), то есть сохранялась на том же уровне, что и до введения проктолина - на фоне 5 нМ ю-А§аТх (66,4+8,0% от контроля (р<0,05; п=3)). На фоне 10-8М c¡)-AgaTx средняя амплитуда ВПСТ снижалась до 14,7+1,6% от контроля, и последующая аппликация проктолина (10-6М) не вызывала прироста средней амплитуды вызванных постсинаптических токов -средняя амплитуда вызванных ВПСТ после получаса инкубации проктолина на фоне 10-8М о-А§аТх составила 14,0+3,7% от контроля (р<0,05; п=3) (рис.3).

О 10 20 30 45 60 и» ОиМ) (1шМ)

Рис.3. Блокирование РЛ^-типа Са2+-каналов to-AgaTx полностью предотвращает развитие потенциирующего эффекта 10-6М проктолина на амплитуду вызванных ВПСТ краба.

В ходе опыта (на фоне и проктолина) достоверно не изменялись

ни временные параметры вызванного выброса, ни амплитудно-временные характеристики и частота миниатюрных ВПСТ.

Проведенные исследования показали, что в мембране аксональных синаптических бутонов краба присутствуют потенциалзависимые Са2+-каналы не только Р/(}-, но и 1Ч-типа, причем каналы Р/(}-типа играют ключевую роль в запуске выброса нейротрансмиттсра, так как их блокирование приводит к уменьшению амплитуды вызванных ВПСТ примерно на 85%.

Анализ потенциирующего действия проктолина на выброс медиатора глутамата в условиях блокады L-, N-, и P/Q-типов Са2*-каналов показал, что проктолин сохраняет свои эффекты на фоне блокаторов L- и N-типа каналов -нифедипина и co-CgTx, и теряет - на фоне блокады P/Q-типа Са2+-каналов. По-видимому, проктолин способствует облегчению работы именно P/Q-типа каналов, что в свою очередь приводит к увеличению входа кальция в терминаль и увеличению квантового состава вызванного выброса медиатора под действием проктолина.

В целом, представленные в первых трех разделах данные исследований эффектов аллатостатина и проктолина в скелетной мускулатуре ракообразных демонстрируют целый ряд ранее не известных характеристик пептидов. Во-первых, оказалось, что оба пептида имеют, как минимум, два разных уровня миотропной активности - способны модулировать как само сокращение, так и работу моторных синапсов. Причем, в обоих случаях (и на уровне мышц, и на уровне нервно-мышечных синапсов) имеет место одинаковая направленность модуляторного действия пептидов: аллатостатин тормозит и сокращение, и вызванный выброс медиатора в моторных синапсах, а проктолин, напротив, действует как облегчающий, потенциирующий модулятор и сокращения, и вызванного выброса. Во-вторых, наши исследования обнаружили независимый характер действия обоих пептидов, возможность взаимодействия их эффектов на уровне мышечного волокна и моторного синапса.

Это позволяет предполагать наличие разных, независимых рецепторов и механизмов, с помощью которых осуществляют свое модулирующее действие аллатостатин и проктолин и на сокращение, и на секрецию медиатора.

В целом, проведенные исследования позволили лучше представить спектр и механизмы миотропного действия обоих пептидов на уровне периферической скелетной мускулатуры ракообразных.

В следующих сериях была исследована возможность модулирующего действия аллатостатина и проктолина на моторные синапсы мыши.

4. Анализ воздействий проктолина на работу моторных синапсов мыши

В данной серии экспериментов в качестве объекта служил изолированный нервно-мышечный препарат диафрагмы мыши. Миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) и вызванные токи концевой пластинки (ТКП) регистрировали при помощи метода двухэлектродной фиксации потенциала постсинаптической мембраны мышечного волокна (voltage-clamp). Потенциал фиксации составлял -70 мВ.

4.1. Влияние проктолина на спонтанную активность нервно-мышечных синапсов диафрагмы мыши.

В контроле средняя амплитуда МТКП равнялась 8,71 ±0,67 нА; частота МТКП составила 0,79±0,16 Гц; время нарастания было равно 1,16±0,05 мсек и постоянная времени спада - 1,49±0,09 мсек (п=16).

На фоне проктолина (10-6М) нам не удалось зарегистрировать достоверных изменений ни одного из анализируемых параметров спонтанного выброса в течение всею времени инкубации. Средняя амплитуда МТКП составила 8,73+0,57 нА (0-60 минут инкубации), частота МТКП снизилась недостоверно до 0,59+0,16 Гц. Время нарастания и постоянная времени спада также не претерпели достоверных изменений на фоне 10-6М проктолина и составили 1,17+0,05 мсек и 1,42+0,06 мсек соответственно (р>0,05; п=22).

Неспособность проктолина воздействовать на параметры МТКП в моторном синапсе мыши сходна с его индифферентностью в отношении спонтанной активности моторных синапсов краба (см. выше) - проктолин не оказывал воздействия на уровень спонтанной секреции: амплитудно-временные характеристики и частота миниатюрных ВПСТ краба не менялись по отношению к контролю. Если предположить, что в нервно-мышечном синапсах мыши проктолин реализует свое модулирующее воздействие на секрецию медиатора по механизму, сходному с обнаруженным нами в синаптических бутонах краба (то есть облегчает работу Р/^-типа потенциалзависимых Са2+ каналов), то отсутствие изменений параметров спонтанной секреции АХ под действием проктолина становится объяснимым. Известно, что в зрелых нервно-мышечных синапсах мыши частота спонтанной секреции определяется входом ионов кальция в терминаль через потенциалзависимые Са2+-каналы Ь- и 1М-, но не Р/^-типа (Ьозаую, МисШк, 1998). Что касается Са2+ -каналов -типа, то они могут активироваться лишь в условиях калиевой деполяризации терминали. Учитывая эти данные, мы решили исследовать, способен ли проктолин изменять частоту МТКП в условиях калиевой деполяризации, приводящей к активации пресинаптических -каналов

4.2. Эффекты проктолина в отношении частоты спонтанной секреции медиатора в условиях калиевой деполяризации терминали.

В ходе экспериментов на фоне калиевой деполяризации и последующего действия проктолина (10-6М) не было выявлено достоверных изменений амплитудно-временных характеристик МТКП по сравнению с контрольными значениями.

Частота миниатюрных токов в контроле составила 0,57+0,05 Гц (п=16). При увеличении до 20 мМ происходил быстрый, более чем 10-кратный,

прирост частоты МТКП, сохранявшийся в течение последующих 30 и более минут. К 60-й минуте инкубации препарата в растворе с повышенным уровнем [К ]нар средняя частота МТКП составила 7,90+0,77 Гц (р<0.05; п=7).

Добавление 10~6М проктолина в перфузирующий раствор (на фоне 20 мМ [К+]нар) вызывало дальнейший прирост частоты МТКП - на 70%. Средняя частота МТКП на фоне проктолина в условиях калиевой деполяризации (40-60 минут инкубации) составляла 13,57+2,94 Гц (р<0.05; п=9). Потенциирующий эффект проктолина на частоту МТКП на фоне калиевой деполяризации развивался в течение получаса, и далее выходил на плато.

Таким образом, проктолин на фоне деполяризации нервных терминалей 20мМ [К+]иар оказался способен усиливать частоту спонтанной секреции

квантов ацетилхолина (АХ). Зная, что при данном уровне калиевой деполяризации терминали происходит активация P/Q-типа Саг+-каналов, мы решили проверить, будет ли проктолин увеличивать частоту МТКП на фоне блокады этого типа каналов ö-AgaTx.

Средняя частота МТКП в контроле составила 0,90+0,10 Гц в контроле (п=15).При аппликации 10~7М ю-AgaTx на фоне нормального раствора Лайли ([К+]„ар = 2мМ) мы не наблюдали достоверных изменений частоты спонтанной секреции АХ - средняя частота МТКП за 30 минут инкубации с co-AgaTx составила 1,06+0,38 Гц (р>0.05; п=8). Увеличение [К.+]иар до 20мМ в условиях блокады P/Q-типа Ca2' -каналов вызывало достоверный прирост частоты МТКП до 2,73±0,78 Гц {п-6). Эта степень прироста спонтанной секреции (в 3 раза) значительно меньше, чем мы наблюдали при данном уровне калиевой деполяризации и незаблокированных Са^-каналах P/Q-типа, когда частота МТКП возрастала примерно в 10 раз (см. выше). Проктолин (10~6М) в присутствии 10~7М ш-AgaTx теряет способность вызывать прирост частоты МТКП на фоне калиевой деполяризации - в течение 60 минут инкубации средняя частота МТКП составила 2,71±0,45 Гц (р>0.05; п=16).

Результаты данной серии экспериментов свидетельствуют, что в условиях калиевой деполяризации, когда имеет место активация P/Q-типа кальциевых каналов наружной мембраны терминали, проктолин значительно увеличивает частоту МТКП, причем этот эффект пептида можно заблокировать o-AgaTx. Это позволяет предположить, что проктолин способен облегчать активность P/Q-типа Са2+ -каналов в моторных синапсах мыши - как и в случае с синапсами краба.

Учитывая, что в моторных синапсах млекопитающих (мыши) именно P/Q-тип -каналов играет основную роль в запуске вызванного выброса медиатора (Van der Kloot, Molgo, 1996; Зефиров, Черанов, 2000), важно было выяснить, как проктолин будет менять вызванную активность моторных синапсов диафрагмы мыши? Этот вопрос был исследован в следующей серии экспериментов.

4.3. Влияние проктолина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов диафрагмы мыши.

Регистрацию ТКП осуществляли в условиях частичной блокады нервно-мышечной передачи d-тубокурарином в концентрации 1-2 мкМ. Для вызова ТКП проводили электрическое раздражение диафрагмального нерва сверхпороговыми стимулами длительностью 0,1-0,2 мсек с частотой 0,3 Гц.

В контроле средняя амплитуда ТКП равнялась 3,44±0,36 нА; квантовый состав был равен 42,81 +3,89; время нарастания (R,) составляло 1,82+0,09 мсек; постоянная времени спада (тспада)- 2,43+0,18 мсек (п=75).

Проктолин (10-6М) за первые 30 минут инкубации достоверно увеличивал амплитуду ТКП до 6,04±0,98 нА - на 75,6% от контроля. Квантовый состав ТКП также возрастал под действием проктолина - до 66,16+11,26 - на 54,6% от контроля (р<0.05 п=7) (рис.4). При этом R, и тСПааа достоверно не изменились

под действием проктолина и составили 1,94+0,39 мсек и 2,54+0,39 мсек, соответственно {р >0.05, п=7).

Рис. 4. Влияние проктолина (10 М) на амплитуду и квантовый состав одиночных ТКП мыши (в контроле п=15; на фоне проктолина п=14).

Отсутствие достоверных изменений времени нарастания и постоянной времени спада ТКП, а также амплитуды МТКП на фоне действия проктолина позволяет нам предположить отсутствие выраженных постсинаптических эффектов проктолина в моторных синапсах мыши. Полученные нами данные позволяют предполагать, что увеличение средней амплитуды ТКП, вызываемое проктолином, происходит за счет увеличения квантового состава вызванного выброса, то есть имеет пресинаптическую природу.

Таким образом, особенности воздействия проктолина на вызванный выброс медиатора в скелетной мускулатуре мыши оказались принципиально сходными и по характеру, и по возможным механизмам с таковыми в моторных синапсах краба. Увеличение амплитуды вызванных ВПСТ (у краба) и ТКП (у мыши) под действием проктолина отражает возрастание квантового состава вызванного выброса медиатора. В моторных синапсах мыши проктолин оказался способен вызвать значительный прирост частоты МТКП, но только в условиях предварительной деполяризации термина ли, причем этот эффект предотвращался введением в раствор блокатора Са2+-каналов РД)-типа оо-А§аТх. Учитывая, что и при калиевой деполяризации, и при вызванной активности синапса имеет место активизация РД)-типа Са2+-каналов (ис11Йе1 й а1., 1992; РгоШ, ИсЫ1е1, 1993), наиболее вероятно, что на моторные синапсы мыши проктолин действует путем облегчения активности именно этого типа Са2+-каналов. Аналогичная картина наблюдается и в моторных синапсах краба.

5. Влияние аллатостатина на активность моторных синапсов диафрагмы

мыши

5.1 Влияние аллатостатина на спонтанную активность синапсов.

Параметры МТКП в контроле (при потенциале фиксации -70 мВ) были следующими: средняя амплитуда - 3,52+0,38 нА; время нарастания - 1,11+0,06 мсек; постоянная времени спада МТКП (тспада) - 1,42+0,08 мсек.

Единственным достоверным эффектом аллатостатина (10-6М) на МТКП было постепенное увеличение средней амплитуды МТКП. К 30-й минуте инкубации амплитуда МТКП возрастала до 5,37+0,50 нА (165,7+14,5% от контроля (р<0.01; п=11)), а в период с 30-й по 60-ю минуты после аппликации 1 мкМ аллатостатина амплитуда миниатюрных токов увеличивалась более чем в 2 раза по сравнению с контролем - до 7,35+0,76 нА (208,8+25,6% от контроля (р<0.001; п=11)) (рис. 5).

контроль

аштатостатин(1 мкМ) |знА

10 сек

Рис. 5. Пример оригинальных записей МТКП в контроле и на фоне действия аллатостатина (10-6М).

На фоне аллатостатина (10-6М) время нарастания и тспада достоверно не изменились по отношению к контролю и составили 1,14+0,08 мсек и 1,54+0,09 мсек, соответственно (30-60 минут инкубации (р>0.05; п=11)).

Полученные нами данные позволяют сделать вывод, что аллатостатин увеличивает амплитуду постсинаптических токов, не изменяя их длительности.

Далее было решено исследовать, оказывает ли аллатостатин какое-либо воздействие на вызванный выброс АХ из нервной терминали мыши.

5.2.Влияние аллатостатина на амплитуду и квантовый состав одиночных ТКП

В контроле средняя амплитуда одиночных ТКП равнялась 3,24+0,17 нА; время нарастания (Л,) было равно 1,61+0,10 мсек; постоянная времени спада (Тспала)" 1,92+0,13 мсек (п=11). Под действием аллатостатина (10-6М) мы не зарегистрировали достоверных изменений временного хода ТКП (0-60 минут инкубации): Л, ТКП равнялось 1,6210,07 мсек; тсгаш - 1.79+0,09 мсек (р>0.05, п=10).

Амплитуда ТКП под действием аллатостатина (10-6М) постепенно увеличивалась. К ЗО-й минуте инкубации средняя амплитуда ТКП возросла до 5,05+0,66 нА, что составило 159,2±20,4 % от контроля (0-30 минут инкубации, р<0.05, п=5). С 30-й по 60-ю минуты инкубации нервно-мышечного препарата с аллатостатином мы зарегистрировали двукратный прирост средней амплитуды ТКП по сравнению с контролем- до 7,63+1,11 нА (235,6134,3% от контроля, р<0.05, п=5).

Квантовый состав ТКП в контроле был равен 33,75±4,73. Под действием 10-6М аллатостатина (0-60 минут инкубации) наблюдалось увеличение квантового состава до 41,15+7,50, однако этот эффект не был достоверным {р>0.05, п=10)(рис.6).

Полученные результаты свидетельствуют, что увеличение средней амплитуды ТКП под влиянием аллатостатина происходит не за счет прироста квантового состава ТКП. Мы заметили, что развитие эффекта прироста амплитуды ТКП во времени, и степень его выраженности - коррелируют с динамикой и величиной прироста амплитуды МТКП на фоне 10-6М аллатостатина (рис.6). Эти данные позволяют заключить, что наблюдаемый прирост амплитуды ТКП является следствием прироста амплитуды МТКП, сумма которых и составляет амплитуду ТКП. Это, в свою очередь означает, что единственным пресинаптическим эффектом аллатостатина, облегчающим синаптическую передачу в моторных синапсах мыши, является его способность вызывать достоверный и значительный (в 2 раза) прирост амплитуды МТКП.

Рис. 6. Сравнительная динамика увеличения средних амплитуд МТКП и одиночных ТКП на фоне действия 10-6М аллатостатина (слева) и квантовый состав одиночных ТКП - в контроле и на фоне 10-6М аллатостатина (справа).

5.3. Влияние аллатостатина на состояние постсинаптической мембраны.

В связи с обнаружением прироста амплитуды МТКП на фоне аллатостатина, важно было понять, чем обусловен этот эффект - изменениями, возникающими на пост- либо - пресинаптическом уровне нервно-мышечных

синапсов диафрагмы. С этой целью были исследованы параметры пассивной проводимости постсинаптической мембраны и состояние ее холинорецепторных каналов - потенциалозависимость их проводимости.

Для оценки входного сопротивления постсинаптической мембраны два микроэлектрода вводили в одно и то же мышечное волокно. С помощью одного из них отслеживали мембранный потенциал (МП), а через другой пропускали градуальные симметричные короткие импульсы тока (100-300 нА) и регистрировали изменения МП. В контроле среднее значение МП составило -59+1 мВ; входное сопротивление равнялось 0,61+0,04 МОм {п=40). Аллатостатин (10-6М) не оказывал никакого воздействия на уровень МП - на фоне действия пептида МП составлял -60+1 мВ (30-60 минут инкубации (р>0.05; п=28)). Что касается входного сопротивления мембраны, то на фоне аллатостатина мы зарегистрировали не увеличение, а наоборот, его постепенное достоверное уменьшение до 0,45+0,05 МОм (30-60 минут инкубации (р<0.01; п=28)).

Далее были проанализированы эффекты аллатостатина на МТКП в условиях фиксации потенциала мышечных волокон на уровне -70 мВ и -100 мВ для определения потенциалозависимости работы каналов холинорецепторов. Как и в предыдущей серии экспериментов, аллатостатин (10-6М) в течение 60 минут инкубации вызывал достоверное двукратное увеличение амплитуды МТКП. Однако нам не удалось обнаружить достоверных изменений степени прироста амплитуды МТКП с возрастанием МП на фоне действия аллатостатина.

Постоянная времени спада МТКП (величина, характеризующая время открытого состояния канала холинорецептора) возрастает с увеличением МП с -70 до -100 мВ, однако аллатостатин не вызывал достоверных изменений прироста этого параметра по сравнению с контролем.

Таким образом, наши исследования показали, что прирост амплитуды МТКП не связан с увеличеним входного сопротивления мембраны (оно напротив, падает под действием аллатостатина). Не было обнаружено под действием аллатостатина и изменений сдвигов проводимости холинорецепторов - в зависимости от уровня МП.

Отсутствие предполагаемых постсинаптических эффектов, способных объяснить увеличение амплитуды спонтанных и вызванных токов концевой пластинки на фоне аллатостатина, подвигло нас на исследование возможного пресинаптического действия пептида.

Мы предположили, что аллатостатин вызывает увеличение амплитуды МТКП через увеличение размера кванта ацетилхолина, например, стимулируя процесс поступления медиатора - АХ - в синаптические везикулы. Для проверки этого предположения мы использовали избирательный блокатор транспорта АХ в везикулу - везамикол.

5.4 Анализ эффектов аллатостатина на фоне действия везамикола.

По данным литературы, везамикол в концентрациях порядка 1 мкМ способен проходить внутрь терминали и связываться с молекулой-

транспортером АХ в мембране синаптических везикул, блокируя накачку в них ЛХ (Van der Kloot, 1991; Parsons et al., 1993).

Мы установили, что сам везамикол (10-6М) практически не влиял на среднюю амплитуду и амплитудное распределение МПКП интактных синапсов. Однако в присутствии везамикола аллатостатин (10-6М) терял способность увеличивать амплитуду МПКП. Неспособность аллатостатина на фоне действия везамикола в указанной концентрации увеличивать среднюю амплитуду МПКП находит отражение в неизменности формы амплитудных распределений МПКП (рис.7).

Рис. 7. Влияние 10-6М аллатостатина на распределение амплитуд МПКП на фоне блокатора накачки ацетилхолина в везикулы - везамикола (10-6М).

Аналогичная ситуация наблюдается в нервно-мышечном синапсе амфибий, где везамикол (1-5 мкМ) предотвращает увеличение амплитуды МТКП вызываемое пресинаптическим действием пептида ко-кальцигенина (КГРП) (Van der Kloot etal., 1998).

Таким образом, везамикол блокировал увеличение амплитуды МПКП, вызываемое аллатостатином. Это позволяет нам предположить, что увеличение амплитуды МПКП на фоне аллатостатина действительно отражает факт прироста размера одиночных квантов (т.е. концентрации АХ в синаптических везикулах) под действием данного пептида.

Факт модуляции пептидом беспозвоночных (аллатостатином) размера кванта у млекопитающих (мыши) является новым и не имеет аналогов в доступной нам литературе.

При обсуждении необычного эффекта аллатостатина в моторных синапсах мыши возникает вопрос, каким образом, через какие внутриклеточные каскады может реализовываться действие аллатостатина, приводящее к увеличению накачки АХ в синаптические холинергические везикулы моторных синапсов мыши? Попытка ответить на этот вопрос была предпринята в следующей части нашей работы.

5.5.Анализ эффектов аллатостатина в присутствии блокатора протеинкиназы А - Н- 89.

Недавно показано, что в регуляции размера кванта АХ в моторных синапсах позвоночных может участвовать протеинкиназа А (ПКА) нервных терминален (Van der Kloot, Branisteanu, 1992; Van der Kloot et al, 1998; Van der Kloot, 2003). В связи с этим, мы решили исследовать, сохранится ли у аллатостатина способность увеличивать амплитуду миниатюрных токов на фоне инактивации ПКА се специфическим блокатором - Н-89 - в концентрации 5*10-8М. Аппликация Н-89 не приводила к достоверным изменениям амплитуды МТКП по сравнению с контролем. Средние значения амплитуды МТКП составляли - 4,16+0,44 нА в контроле (п=15) и 4,47±0,46 нА на фоне 30 минут действия 5*10-8М Н-89 (р >0,05; п =8).

Мы установили, что прирост амплитуды МТКП на фоне аллатостатина (10-6М) не проявляется в присутствии блокатора ПКА - Н-89. Средняя амплитуда МТКП на фоне аллатостатина (60 минут инкубации) в присутствии Н-89 была равна 4,16±0,34 нА (р>0,05; п=12). Полученный нам факт созвучен имеющимся в литературе данным. Ранее в отношении нервно-мышечного синапса млекопитающих было показано, что увеличение размера кванта АХ, наблюдаемое при действии гипертонического раствора, блокируется ингибиторами ПКА (Van der Kloot, Branisteanu, 1992; Van der Kloot, 2003). Увеличение амплитуды МПКП вазоактивным пептидом уротензином II в моторных синапсах лягушки также снимается предварительным введением Н-89 (5*10-8М) (Brailoiu et al., 2003).

Сопоставление полученных нами результатов с данными литературы позволяет предполагать, что увеличение размера кванта, вызываемое аллатостатином, опосредуется внутриклеточным каскадом реакций с участием ПКА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что пептиды беспозвоночных -аллатостатин и проктолин - действуют антагонистически на скелетные мышцы ракообразных: аллатостатин ингибирует, а проктолин - потенциирует мышечную деятельность. При этом действие обоих пептидов проявляется на двух уровнях - моторных синапсов и собственно мышечных волокон. До сих пор антагонистическая пептидэргическая регуляция была известна лишь для мышечных сокращений моллюсков (мышц радулы, буккальных мышц (Brczina et al., 1994). В наших исследованиях - наряду с прямым действием на мышечные волокна - впервые описана возможность и другого типа дуальной пепгидергической модуляции мышечной активности у беспозвоночных — на уровне возбуждающих моторных синапсов, запускающих сокращение скелетных мышц. При этом оба пептида действуют пресинаптически, но по-видимому, через разные рецепторы и внутриклеточные регуляторные каскады. Можно заключить, что у ракообразных in vivo эффективность синаптических

входов, отвечающих за мышечную деятельность, может быть усилена либо снижена, в зависимости от типа и комбинации высвобождаемых пептидных модуляторов - аллатостатина и проктолина.

Возможность сохранения модулирующих воздействий аллатостатина и проктолина на уровне моторных синапсов млекопитающих кажется, на первый взгляд, маловероятной, учитывая отсутствие данных об экспрессии генов препрогормонов аллатостатина и проктолина у млекопитающих. Остается открытым и вопрос о возможности сохранения рецепторов к этим пептидам в организме млекопитающих, далеко отставленных от ракообразных в эволюционном ряду животных. Вместе с тем, уже имеются указания на присутствие некоторых эффектов проктолина. и аллатостатина у мыши, в частности, на уровне висцеральной мускулатуры и ЦНС млекопитающих (Schulz et al., 1981; Holets et al., 1987; Konopinska, 1997; Gaydukov et al., 1998).

Наши исследования показали, что на уровне моторных синапсов млекопитающих (мыши) оба пептида, хотя и сохраняют миотропную активность, но действуют не антагонистически (как у ракообразных), а однонаправленно: и проктолин, и аллатостатин облегчают нервно-мышечную передачу у мыши, при этом задействованы разные структуры и механизмы регуляции моторных синапсов. Проктолин усиливает секрецию АХ через активацию P/Q-типа Са2+-каналов терминалей, тогда как аллатостатин способен увеличивать размер квантов АХ - путем активации пресинаптической протеинкиназы А. Наличие специфических миотропных эффектов пептидов беспозвоночных - аллатостатина и проктолина - в моторных синапсах мыши является, на наш взгляд, основанием для более систематического изучения пептидэргической регуляции моторных синапсов млекопитающих.

выводы

1. Анализ миотропных эффектов пептидов беспозвоночных аллатостатина и проктолина показал, что аллатостатин (10-8-10-6М) подавляет в 1,5-2,5 раза, а проктолин (10-8-10-6М) - усиливает в 1,5-18 раз электрически индуцированные сокращения изолированных скелетных мышечных волокон рака Ыо1ва ЪаШеа.

2. Аллатостатин (10-6М) тормозит вызванный выброс медиатора в моторных синапсах краба ЕпрМа spinifrons, уменьшая амплитуду ВПСТ на 33%. Проктолин (10-6М) облегчает вызванный выброс медиатора, увеличивая амплитуду вызванных ВПСТ в моторных синапсах краба на 36%.

3. С помощью фармакологического анализа показано, что в составе моторных синапсов краба ЕпрЫа эрт/гот отсутствует Ь-тип, но представлены Р/С>- и К-типы -каналов. Проктолин усиливает синаптическую передачу через облегчение работы пресинаптических Са2+-каналов Р/р-типа.

4. Оба пептида оказывают однонаправленное облегчающее действие на синаптическую передачу в моторных синапсах диафрагмы мыши: проктолин (10-6М) увеличивает амплитуду ТКП в среднем в 1,5 раза, а аллатостатин (10-6М) увеличивает амплитуду МТКП и ТКП, в среднем, в 2 раза.

5. Прирост амплитуды ТКП под действием проктолина (10-6М) связан с его пресинаптическим действием, направленным на увеличение квантового состава ТКП, предположительно, через облегчение работы Р/р-типа Са2+-каналов моторных терминалей мыши.

6. Индуцируемый аллатостатином (10-6 М) двукратный прирост амплитуды ТКП, сходный по динамике и величине с приростом амплитуды МТКП, не сопровождается достоверными изменениямиквантового состава ТКП в моторных синапсах мыши.

7. Прирост амплитуды МПКП и МТКП, вызываемый аллатостатином (10-6 М), предотвращается везамиколом (10-6 М) - блокатором накачки ацетилхолина в везикулы, и Н-89 (5*10-8М) - блокатором протеинкиназы А. Это позволяет предполагать, что в моторных синапсах мыши аллатостатин действует на пресинаптическом уровне и запускает каскад реакций с участием протеинкиназы А, направленный на увеличение размера кванта медиатора.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Rathmayer W., Erxleben С, Djokaj S., Gaydukov A., Kreissl S., Weiss T. Antagonistic modulation of neuromuscular parameters in crustaceans by the peptides proctolin and allatostatin, contained in identified motor neurons. // In: Crustacean nervous system NY, Springer (Wiese K, ed., 2001), pp 2-19.

2. Rathmayer W., Djokaj S., Gaydukov A. and Kreissl S. The Neuromuscular Junctions of the Slow and the Fast Excitatory Axon in the Closer of the Crab Eriphia spinifrons Are Endowed with Different Ca2+ Channel Types and Allow Neuron-Specific Modulation of Transmitter Release by Two Neuropeptides // J. Neurosci. -2002-V.22,pp.708-717.

3. Gaydukov A., Balezina O. Modulation of spontaneous activity of mouse neuromuscular synapse by peptide allatostatin. Abstracts of 26th European Peptide Symposium, Montpellier, France 11-15 Sept. 2000 P274

4. Gaydukov A., Balezina O, Rathmayer W. Opposite modulation of evoked postsynaptic currents in crab by the peptides proctolin and allatostatin. Abstracts of 26th European Peptide Symposium, Montpellier, France 11-15 Sept. 2000 P275

5. Гайдуков А.Е., Балезина О.П. Медиатор беспозвоночных аллатостатин-1 видоизменяет спонтанную активность моторных синапсов мыши. Физиология нейротрансмиттеров. Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика армянской ССР, члена-корреспондента Академии наук СССР Хачатура Седраковича Коштоянца // Москва, 25-27 октября 2000, стр. 23.

6. Gaydukov A., Balezina О. Two neuropeptides from invertebrates - allatostatin and proctolin modulate spontaneous neurotransmitter release in mouse neuromuscular junction. Abstracts of 27th European Peptide Symposium, Sorrento, Italy 31 Aug.-06Sept. 2002 P183.

Подписано в печать 29.04.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 96 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

* - 9 1 6 t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайдуков, Александр Евгеньевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Аллатостатины: структура, представительство, функциональные свойства.

1.1 Характеристика пептидного семейства аллатостатинов.

1.2 Доменная организация молекул аллатостатинов.

1.3 Аллатостатины у насекомых и других беспозвоночных.

1.4 Локализация и функциональные свойства аллатостатинов.

1.4.1 Блокада синтеза ювенильного гормона.

1.4.2 Торможение сокращения висцеральной мускулатуры.

1.5 Возможность присутствия аллатостатинов у позвоночных.

1.6 Аллатостатиновые рецепторы.

2. Проктолин — структура, представительство, функциональные свойства.

2.1 Структура молекулы проктолина.

2.2 Локализация и функциональная активность проктолина у членистоногих.

2.2.1 Действие проктолина на активность нейронов членистоногих.

2.2.2 Миостимулирующее действие проктолина на висцеральную мускулатуру членистоногих.

2.2.3 Стимулирующее действие проктолина на сокращение скелетной мускулатуры членистоногих.

2.3 Проктолиновые рецепторы.

2.4 Локализация и физиологическая активность проктолина у млекопитающих.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

1. Скелетные мышечные волокна равноного морского рака Ыогеа ЬаШса.

1.1 Методика получения изолированных мышечных волокон /. ЬаШса.

1.2 Регистрация сократительных ответов изолированных мышечных волокон I. ЬаШса.

2. Нервно-мышечный синапс краба ЕНрЫа БрШ/гот.

2.1 Методика получения изолированного нервно-мышечного препарата Е. ярШ/гопя.

2.2 Внеклеточная регистрация вызванных постсинаптических токов в нервно-мышечном синапсе Е. Бртф-от.

3. Нервно-мышечный синапс диафрагмы мыши.

3.1 Приготовление изолированного нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши.

3.2 Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов и токов концевой пластинки.

4. Статистическая обработка экспериментальных данных.

5. Используемые в работе вещества.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Действие аллатостатина и проктолина на сокращение изолированных мышечных волокон рака Ыо1еа ЪаЫса.

1.1 Воздействие аллатостатина на сократительную активность скелетных мышечных волокон рака I. ЪаЫса.

1.2 Воздействие проктолина на сократительную активность мышечных волокон I. ЪаЫса и его взаимодействие с аллатостатином.

2. Воздействие аллатостатина и проктолина на синаптическую активность нервно-мышечного препарата краба ЕпрЫа Брш/гот.

2.1. Влияние аллатостатина на вызванные и спонтанные постсинаптические токи краба Е. ярш/гопя.

2.2. Влияние проктолина на вызванную активность моторных синапсов краба Е. зрШ/гоп5.

2.3. Анализ взаимодействия эффектов аллатостатина и проктолина на уровне моторных синапсов Е. зрМ/гопБ.

3. Исследование роли пресинаптических Са2+-каналов в реализации облегчающих эффектов проктолина в моторных синапсах краба.

3.1. Исследование роли Са2+-каналов Ь-типа в эффектах проктолина.

3.2. Исследование роли Са2+-каналов И-типа в эффектах проктолина.

3.3. Исследование роли Са2+-каналов Р/С^-типа в эффектах проктолина.

4. Анализ структурного сходства проктолина и аллатостатина с белками млекопитающих и данных биотестирования пептидов у млекопитающих.

5. Анализ воздействий проктолина на работу моторных синапсов мыши.

5.1. Влияние проктолина на спонтанную активность нервно-мышечных синапсов диафрагмы мыши.

5.2 Влияние проктолина на частоту миниатюрных токов концевой пластинки в условиях калиевой деполяризации терминали с помощью

20 мМ [К+]нар.

5.3. Действие проктолина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов мыши.

6. Действие аллатостатина на спонтанную и вызванную активность активность нервно-мышечных синапсов мыши.

6.1 Дозозависимое воздействие аллатостатина на амплитуду и временной ход миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши.

6.2 Анализ возможных постсинаптических эффектов аллатостатина на примере миниатюрных токов концевой пластинки мыши.

6.3. Действие аллатостатина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов диафрагмы мыши.

6.4 Анализ изменений амплитуды МПКП, вызываемых аллатостатином, на фоне предварительного введения везамикола (АН5183).

6.5 Влияние аллатостатина на амплитуду МТКП на фоне действия ингибитора протеинкиназы А (ПКА) - Н-89.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы действия нейропептидов аллатостатина и проктолина на активность моторных синапсов"

Актуальность исследования. В современной физиологии большой интерес вызывают исследования новых регуляторных пептидов, выделяемых из нервной ткани разных групп беспозвоночных и позвоночных животных. К их числу относятся аллатостатины - семейство структурно сходных пептидов, экстрагированных из мозга таракана Diploptera punctata (Woodhead et al., 1989; Pratt et al., 1991). У двукрылых насекомых аллатостатины регулируют метаморфоз, тормозя синтез ювенильного гормона в corpora allata (Stay et al., 1994). Однако у других групп членистоногих - насекомых и ракообразных - эти же пептиды выполняют иные функции, в частности, модулируют моторику кишечника (Skiebe, Schneider, 1994), активность ганглиев (Lange et al., 1993). Реальный спектр функциональной активности и представительства этой новой группы пептидов в животном царстве остается пока не изученным.

Аналогичная картина характерна и для проктолина - пентапептида, впервые выделенного как «кишечный фактор» у таракана Periplaneta americana (Brown, 1967). Впоследствии удалось установить, что проктолин присутствует и у других членистоногих, в частности, в составе мотонейронов ракообразных, и способен усиливать тонус висцеральной и скелетной мускулатуры ракообразных (Schwarz 1980; Pastzor, Golas, 1993).

Несмотря на данные о миотропных эффектах проктолина и аллатостатинов, систематический анализ особенностей их действия на мускулатуру и моторные синапсы членистоногих до сих пор не проводился. Не ясны и пути дальнейшей эволюции этих пептидов - в частности, возможность сохранения самих пептидов либо их рецепторов в составе нервной системы позвоночных. Имеются данные о способности проктолина и аллатостатина потенциировать сокращение желудка и кишечника у млекопитающих (Schulz et al., 1981; Gaydukov et al., 1998). Возможность же модулирующих воздействий этих пептидов на моторные синапсы млекопитающих остается не изученной. Подобные сравнительные исследования представляются весьма актуальными в связи с ростом случаев обнаружения нейропептидов беспозвоночных и в нервной системе высших позвоночных, где они могут иметь физиологическую активность, сходную либо отличную от таковой у низших животных (Ашмарин, Каменская, 1988; Schoofs et al., 1993; Гомазков, 1995).

Цели и задачи исследования. Целью данной работы был сравнительный анализ действия аллатостатина и проктолина на мускулатуру и моторные синапсы ракообразных и млекопитающих. Для этого в работе решались следующие конкретные задачи:

1. исследовать эффекты аллатостатина и проктолина как модуляторов сократительной активности скелетных мышечных волокон ракообразных (морского рака Idotea báltico).

2. сопоставить характер воздействия аллатостатина и проктолина на моторные синапсы ракообразных и механизмы противоположно направленных синаптических эффектов пептидов.

3. выявить влияния аллатостатина и проктолина на моторные синапсы млекопитающих - на примере спонтанной и вызванной активности синапсов диафрагмы мыши.

4. изучить механизмы облегчающего действия проктолина на частоту спонтанных и амплитуду вызванных сигналов моторных синапсов диафрагмы мыши.

5. понять: пре- или постсинаптические структуры ответственны за прирост амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши, вызываемый действием аллатостатина?

6. рассмотреть вклад пресинаптических внутриклеточных каскадов (с участием протеинкиназы А и других факторов) в увеличение размера кванта медиатора, вызываемое аллатостатином.

Положения, выносимые на защиту.

1. Нейропептиды беспозвоночных проктолин и аллатостатин демонстрируют противоположно направленные миотропные эффекты: аллатостатин тормозит, а проктолин — усиливает работу нервно-мышечных синапсов и сокращение скелетных мышц ракообразных.

2. В моторных нервных терминалях ракообразных (краба ЕпрЫа зрШ/гою)

2+ сосуществуют два типа Са -каналов — РА^- и И-типа, из которых лишь РЛ^-тип вовлечен в потенциирование проктолином вызванного выброса медиатора.

3. Проктолин и аллатостатин действуют облегчающе на работу холинэргических моторных синапсов мыши. Проктолин усиливает выброс медиатора, стимулируя работу 2+

Са -каналов Р/С^-типа терминали; аллатостатин вызывает увеличение размера квантов АХ, путем активации протеинкиназы А нервной терминали мыши.

Научная новизна.

В работе впервые установлена способность аллатостатина тормозить сокращение и работу моторных синапсов скелетных мышечных волокон ракообразных.

Впервые показано, что в составе мембраны моторных нервных терминалей краба ЕпрМа имеются Са2+-каналы двух типов - Р/С)- и М-типа, по-разному вовлеченные в запуск секреции медиатора. Установлен ранее не известный факт облегчающего действия проктолина на выброс медиатора через модуляцию активности Са2+-каналов Р\С2-типа. Впервые описаны особенности взаимодействия тормозных эффектов аллатостатина и потенциирующих эффектов проктолина в отношении синаптической активности и сокращений скелетной мускулатуры ракообразных. Установлены ранее не известные облегчающие влияния проктолина и аллатостатина на спонтанную и вызванную синаптическую активность моторных синапсов диафрагмы мыши.

Впервые описана способность аллатостатина - при аппликации в низких концентрациях - увеличивать размер одиночных квантов медиатора в холинэргическом синапсе, действуя через активацию пресинаптической протеинкиназы А.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе факты содержат новую важную информацию о возможных путях эволюции нейропептидов беспозвоночных - проктолина и аллатостатина, а также - их мембранных рецепторов. Данные имеют общетеоретическое значение для сравнительной и эволюционной физиологии и понимания особенностей пептидной регуляции синапсов. Научную ценность для синаптологии имеет впервые описанный факт значительного увеличения размера кванта медиатора в холинэргических моторных синапах мыши под действием аллатостатина. Это может оказаться перспективным для клинической практики - при разработках новых классов фармакологических препаратов, облегчающих синаптическую передачу в моторных синапсах млекопитающих.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В связи с тем, что данная работа посвящена выявлению и сравнительному анализу ранее не известных миотропных эффектов аллатостатина и проктолина, мы провели обзор данных литературы, касающихся строения, миотропной и другой функциональной активности каждого из пептидов. Будут рассмотрены представленность каждого из пептидов в разных группах животных, а также -свойства мембранных рецепторов к аллатостатину и проктолину и возможные внутриклеточные механизмы их действия.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Гайдуков, Александр Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Анализ миотропных эффектов пептидов беспозвоночных аллатостатина и о s проктолина показал, что аллатостатин (10 -10 М) подавляет в 1,5-2,5 раза, а проктолин (10"8-10~6М) - усиливает в 1,5-18 раз электрически индуцированные сокращения изолированных скелетных мышечных волокон рака Idotea baldea.

2. Аллатостатин (10"6М) тормозит вызванный выброс медиатора в моторных синапсах краба Eriphia spinifrons, уменьшая амплитуду ВПСТ на 33%. Проктолин (10"6М) облегчает вызванный выброс медиатора, увеличивая амплитуду вызванных ВПСТ в моторных синапсах краба на 36%.

3. С помощью фармакологического анализа показано, что в составе моторных синапсов краба Eriphia spinifrons отсутствует L-тип, но представлены P/Q- и N-типы Са2+-каналов. Проктолин усиливает синаптическую передачу через

•у . облегчение работы пресинаптических Са -каналов P/Q-типа.

4. Оба пептида оказывают однонаправленное облегчающее действие на синаптическую передачу в моторных синапсах диафрагмы мыши: проктолин (10 6М) увеличивает амплитуду ТКП в среднем в 1,5 раза, а аллатостатин (10~6М) увеличивает амплитуду МТКП и ТКП, в среднем, в 2 раза.

5. Прирост амплитуды ТКП под действием проктолина (10 6М) связан с его пресинаптическим действием, направленным на увеличение квантового состава ТКП, предположительно, через облегчение работы P/Q-типа Са2+-каналов моторных терминалей мыши.

6. Индуцируемый аллатостатином (10"6М) двукратный прирост амплитуды ТКП, сходный по динамике и величине с приростом амплитуды МТКП, не сопровождается достоверными изменениямиквантового состава ТКП в моторных синапсах мыши.

7. Прирост амплитуды МПКП и МТКП, вызываемый аллатостатином (ЮМ), предотвращается везамиколом (10 6М) - блокатором накачки ацетилхолина в

-8 везикулы, и Н-89 (5*10 М) - блокатором протеинкиназы А. Это позволяет предполагать, что в моторных синапсах мыши аллатостатин действует на пресинаптическом уровне и запускает каскад реакций с участием протеинкиназы А, направленный на увеличение размера кванта

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа была посвящена сравнительному анализу миотропных эффектов двух нейропептидов - проктолина и аллатостатина - на уровне синапсов и скелетной мускулатуры ракообразных и млекопитающих. Выбор пептидов объяснялся их обнаружением в мотонейронах (Witten, O'Shea, 1985; Bishop et al., 1987), ганглиях (Nusbaum et al., 1992), corpora allata (Stay, Woodhead, 1990) и некоторых других структурах членистоногих, а также указаниями о наличии у них миотропных эффектов, в основном - на уровне висцеральной мускулатуры (Bishop et al., 1984; Stay, Woodhead, 1990; Cook, Holman, 1980; Baines et al., 1990). Учитывая плейотропность действия большинства пептидных модуляторов беспозвоночных (Schoofs et al., 1993; Nassel, 2002), представляло интерес изучить эффекты проктолина и аллатостатина на уровне скелетной мускулатуры и моторных синапсов ракообразных.

Проведенные нами исследования показали, что проктолин в концентрациях

7 X

10 - 10"° м - оказывает эффективное потенциирующее действие на сокращение мышечных волокон равноногого рака Idoíea baltica, при этом не меняя входное сопротивление мембраны мышечного волокна, и действуя, предположительно (с учетом данных литературы) на уровне белков сократительного аппарата скелетных мышечных волокон (Brustle et al., 2001; Rathmayer et al., 2002). Полученные нами факты созвучны данным литературы о способности проктолина оказывать прямое потенциирующее действие на скелетные мышцы других ракообразных и насекомых (Schwartz et al., 1980; Baines et al., 1990). При этом в работах 80-ых -начала 90-х годов подчеркивалась неспособность проктолина облегчать работу моторных синапсов, и высказывалось мнение, что проктолин действует непосредственно на мышечное волокно, минуя моторные синапсы (несмотря на то, что было показано высвобождение проктолина из периферических аксонов) (Bishop et al., 1987). В нашей работе мы обнаружили выраженное пресинаптическое действие проктолина, облегчающее передачу основного медиатора - глутамата. Проведенный анализ этого эффекта на терминалях краба Eriphia spinifrons позволил обнаружить в составе терминален рака как минимум, два типа Са-каналов, активирующихся в ответ на нервный импульс, обеспечивающих вход Са2+ в терминаль и запуск вызванной секреции глутамата - это P/Q- и N-тип потенциалзависимых Са-каналов. До сих пор в литературе существовало мнение, что нервные окончания ракообразных содержат лишь P/Q-тип Са-каналов, который и участвует в инициации ^¿вванной секреции глутамата (Araque et al., 1994). Наши исследования эффектов проктолина на фоне блокаторов кальциевых каналов L-, P/Q-, и N-типа показали, что проктолин опосредует свои пресинаптические потенциирующие эффекты через облегчение работы P/Q-типа Са-каналов нервных терминалей краба. Еще более неожиданным оказалась способность проктолина «работать» и в моторных синапсах диафрагмы мыши, увеличивая квантовый состав ТКП на 40-50%. Причем, согласно проведенному анализу, проктолин и в скелетной мускулатуре млекопитающих облегчает синаптическую передачу, действуя, по-видимому, через увеличение активности P/Q-типа Са-каналов нервной терминали диафрагмы мыши.

В отличие от проктолина (открытого в 1967 году как «кишечный пептид» насекомых), аллатостатин является более новым, недавно открытым пептидом, впервые описанным в начале 90х годов 20го столетия как ингибитор выработки ювенильного гормона в corpora allata у таракана (Woodhead et al., 1989). Аллатостатин, до сих пор известный лишь у членистоногих, моллюсков и червей, остается малоизученым с точки зрения реального спектра его физиологических эффектов и представленности в царстве животных (Bendena et al., 1999). В наших исследованиях эффектов аллатостатина на уровне мышечных волокон и моторных синапсов ракообразных (Idotea báltica, Eriphia spinifrons) обнаружилась способность этого пептида выступать в роли тормозного модулятора моторной активности ракообразных. Показано, что аллатостатин дозозависимо подавляет электрически индуцируемое сокращение скелетных мышечных волокон рака, а также - амплитуду вызванных ВПСТ в моторных синапсах краба. Оказалось, что тормозные эффекты аллатостатина отличаются от потенциирующих эффектов проктолина не только по знаку, но и по механизмам действия. Проведенные эксперименты, в совокупности с немногочисленными данными литературы, позволяют предполагать, что тормозное действие аллатостатина осуществляется на уровне мембраны мышечных волокон. Действие же аллатостатина на пресинаптическом уровне может происходить с участием его мембранных рецепторов и включать модуляцию калиевых (либо кальциевых) каналов пресинаптической мембраны. Таким образом, мы установили, что разнонаправленные модулирующие воздействия аллатостатина и проктолина на моторику скелетных мышц ракообразных реализуются как минимум, на двух разных уровнях: самих скелетных мышечных волокон и на уровне терминален моторных синапсов. До сих пор антагонистическая пептидэргическая регуляция была известна лишь для случая контроля мышечных сокращений моллюска Aplysia - мышц радулы, буккальных мышц (Brezina et al., 1994). В наших исследованиях, наряду с прямым действием на мышечные волокна - впервые описана возможность и другого типа дуальной пептидэргической модуляции мышечной активности у беспозвоночных - на уровне возбуждающих моторных синапсов, запускающих сокращение скелетных мышц. Имея в виду, что эндогенные аллатостатин и проктолин выбрасываются в гемолимфу из разных источников (нейрохемальных органов и/или аксонов), можно заключить, что у ракообразных in vivo эффективность синаптических входов, отвечающих за мышечную деятельность, может быть усилена либо снижена, в зависимости от типа и комбинации высвобождаемых пептидных модуляторов. В целом, совокупность полученных фактов представляет новый пример сложной дуальной пептидной регуляции работы скелетной мускулатуры со стороны нейропептидов у беспозвоночных животных.

Во второй части нашей работы мы предприняли попытку выявить миотропные эффекты аллатостатина и проктолина в моторных синапсах мыши, с тем, чтобы сопоставить их с аналогичными эффектами у ракообразных. На первый взгляд, поиски в данном направлении могут показаться малообещающими. Действительно, традиционное подразделение регуляторных пептидов на "пептиды беспозвоночных" и "позвоночных", предполагает разобщение и пространственно-временную изоляцию пептидов и их рецепторов у эволюционно далеко отстоящих групп животных (Ашмарин, Каменская, 1988; Nassel, 2002). Однако в последнее время подобные представления, как и сама классификация пептидов, все чаще оказываются условными, так как основаны главным образом лишь на факте первоначального обнаружения пептида у той или иной группы - беспозвоночных либо позвоночных - животных. Ярким примером являются FMRF-амиды. Первоначальную характеристику FMRF-амидов как пептидов беспозвоночных пришлось недавно пересмотреть в связи с обнаружением FMRF-амидов (а также их рецепторов) в различных структурах ЦНС млекопитающих и человека. Подобный же феномен, на наш взгляд, может оказаться характерным и для исследуемых нами проктолина и аллатостатина. Действительно, нам впервые удалось выявить целый ряд специфических миотропных эффектов проктолина и аллатостатина на уровне моторных синапсов млекопитающих. При этом у млекопитающих оба пептида действуют однонаправленно - облегчают синаптическую передачу, однако характер и механизмы действия пептидов, очевидно - разные.

Оказалось, что проктолин действует в моторных синапсах мыши сходно с тем, как это имело место у ракообразных - увеличивает квантовый состав ТКП

Ч L путем облегчения активности P/Q -типа Са -каналов нервной терминалы диафрагмы мыши. Характер и механизмы облегчающего действия аллатостатина в моторных синапсах мыши оказались совсем другими. Мы впервые установили, что аллатостатин способен увеличивать размер кванта медиатора (АХ), и, тем самым, приводить к увеличению амплитуды многоквантового вызванного потенциала концевой пластинки. Удалось также выявить роль протеинкиназы А в реализации потенциирующего эффекта аллатостатина в отношении размера кванта АХ.

В настоящее время известен фактически лишь один пример избирательной модуляции размера кванта АХ в моторных синапсах. Это - действие КГРП, запасающегося в составе dence-core везикул моторных терминалей лягушки (Van der Kloot et al., 1998). Описанная нами необходимость активации пресинаптической протеинкиназы А для реализации эффекта аллатостатина созвучна с данными Ван дер Клоота и соавторов, также показавшими, что в цепи реакций, запускаемых КГРП и приводящих к увеличению размера кванта АХ, участвует протеинкиназа А (Van der Kloot et al., 1998).

Обнаружение эффектов экзогенного проктолина и аллатостатина в моторных синапсах млекопитающих неизбежно порождает вопрос, может ли подобная модуляция иметь место в действительности в организме мыши? Как мы отмечали, проктолиноподобная иммунореактивность выявлена с помощью антител в организме млекопитающих; обнаружен и целый ряд эффектов проктолина в ЖКТ и на уровне ЦНС. В нашей работе впервые апробирована и выявлена возможность миотропного действия проктолина на уровне моторных синапсов. Учитывая присутствие проктолина в ЖКТ мыши, нельзя исключить возможность его системного, дистантного действия через кровь на моторные синапсы скелетных мышц мыши. Присутствует ли проктолин на периферии - в холинэргических моторных терминалях, либо в составе клеток окружения моторных синапсов - еще предстоит выяснить. Можно надеяться, что это - лишь вопрос времени, учитывая имеющиеся данные о структурном сходстве предшественника проктолина с хромогранином, локализованном в составе с1епсе-соге везикул моторных нервных терминалей млекопитающих (мыши, крысы). В любом случае, на наш взгляд, обнаружение потенциирующих эффектов проктолина в нервно-мышечных синапсах млекопитающих представляет интерес для дальнейшей разработки этих эффектов - как с научно-теоретической, так, возможно, и практической точки зрения - для создания новых пептидных фармакологических средств, облегчающих передачу на периферическом уровне.

Высказанные выше соображения, в общем, приложимы и к оценке эффектов аллатостатина. Наши исследования являются первыми доказательствами в пользу сохранения миотропных (а возможно - и других) физиологических эффектов аллатостатинов в организме млекопитающих. В настоящее время в литературе отсутствуют какие-либо данные о присутствии аллатостатинов либо их рецепторов в нервной системе млекопитающих. Поэтому аллатостатины все еще считаются пептидами беспозвоночных. Однако на наш взгляд - на основании полученных нами данных, а также общетеоретических соображений эволюционной физиологии - нельзя полностью исключить возможность сохранения аллатостатиновых рецепторов и специфических миотропных эффектов аллатостатинов (либо аналогичных пептидных регуляторов) у высших позвоночных - млекопитающих. Кроме того, способность экзогенного аллатостатина (при действии в низких концентрациях) вызывать прирост размера кванта АХ в синапсах млекопитающих представляет, на наш взгляд, большой интерес как модель для изучения механизмов регуляции кванта медиатора. Нельзя исключить и перспективу использования пептида либо его аналогов для разработки новых средств фармакологической коррекции дефектов нервно-мышечной передачи млекопитающих и человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайдуков, Александр Евгеньевич, Москва

1. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче // Итоги науки и техники, сер. Физиол. чел и жив. 1988 — 34, стр. 3-8, 77, 108, 111.

2. Воронин JI.JI. Анализ пластических свойств центральной нервной системы // Тбилиси: Мецниереба-1982-стр. 110-123, 131-135, 160-181.

3. Гиниатуллин Р.А., Зефиров A.J1., Магазаник Л.Г., Ощепкова С.Ф. Постсинаптические эффекты субстанции Р в нервно-мышечное синапсе лягушки // Нейрофизиология 1991 -Т.23(4), стр. 436-441.

4. Гомазков О.А. Физиологически активные пептиды. Справочное руководство. // М. ИПГМ- 1995-стр. 9-10, 126-127.

5. Зефиров A.JL, Черанов С.Ю. Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе // Усп. Физиол. Наук 2000- Т.31 (3) - стр. 3-22.

6. Каменская М.А. Современные представления о механизме квантового освобождения медиатора из моторных нервных окончаний скелетной мышцы // Успехи Физиол. Наук 1972 - Т.З(З), стр. 22-63.

7. Adams М.Е., O'Shea М. Peptide cotransmitter at a neuromuscular junction // Science 1983 - V.221(4607), pp.286-289.

8. Adelsberger H., von Beckerath N., Parzefall F., Dudel J. A molecular scheme for the reaction between gamma-aminobutyric acid and the most abundant chloride channel on crayfish deep extensor abdominal muscle // Pflugers Arch. 1996 - V.431(5), pp.680-689.

9. Anderson M.S., Halpern M.E., Keshishian H. Identification of the neuropeptide transmitter proctolin in Drosophila larvae: characterization of muscle fiber-specific neuromuscular endings // J. Neurosci. 1988 - V.8(l), pp. 242-255.

10. Araque A., Clarac F., Buno W. P-type Ca2+ channels mediate excitatory and inhibitory synaptic transmitter release in crayfish muscle // Proc Natl Acad Sci USA -1994-V.91, pp. 4224-4228.

11. Atwood HL. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems // Prog. Neurobiol. 1976 - V.7(4), pp. 291-391.

12. Auerswald L., Birgiil N., Gade G., Kreienkamp H.J., Richter D. Structural, functional, and evolutionary characterization of novel members of the allatostatin receptor family from insects // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001 - V.282, pp. 904-909.

13. Bahr BA, Parsons SM. Acetylcholine transport and drug inhibition kinetics in Torpedo synaptic vesicles // J. Neurochem. 1986 - 46(4), pp. 1214-1218.

14. Baines R.A., Downer R.G. Comparative studies on the mode of action of proctolin and phorbol-12,13-dibutyrate in their ability to contract the locust mandibular closer muscle // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1992 - V.20(3), pp.215-229.

15. Baines R.A., Lange A.B., Downer R.G. Proctolin in the innervation of the locust mandibular closer muscle modulates contractions through the elevation of inositol trisphosphate // J. Comp. Neurol. 1990 - V.297(4), pp. 479-486.

16. Baines R.A., Walther C., Hinton J.M., Osborne R.H., Konopinska D. Selective activity of a proctolin analogue reveals the existence of two receptor subtypes // J. Neurophysiol. 1996 - V.75(6), pp.2647-2650.

17. Bartos M., Allgauer C., Eckert M., Honegger H.W. The antennal motor system of crickets: proctolin in slow and fast motoneurons as revealed by double labelling // Eur. J. Neurosci. 1994 - V.6(5), pp.825-836.

18. Beilin S.A., Pasztor V.M. Modulation of a rhythmically active crayfish muscle by the neuropeptide proctolin // Can. J. Zool. 1989 - V.67, pp. 73-81.

19. Belles X., Graham L.A., Bendena W.G., Ding Q., Edwards J.P., Weaver R.J., Tobe S.S. The molecular evolution of the allatostatin precursor in cockroaches // Peptides -1999 V.20( 11), pp. 11 -22.

20. Beltz B.S., Pontes M., Helluy S.M., Kravitz E.A. Patterns of appearance of serotonin and proctolin immunoreactivities in the developing nervous system of the American lobster // J. Neurobiol. 1990 - V.21(4), pp. 521-42.

21. Bendena W.G., Donly B.C., Tobe S.S. Allatostatins: a growing family of neuropeptides with structural and functional diversity Review // Ann. NY Acad. Sci. - 1999-V.897, pp.311-329.

22. Benquet P, Le Guen J, Dayanithi G, Pichon Y, Tiaho F. omega-AgalVA-sensitive (P/Q-type) and -resistant (R-type) high-voltage-activated Ba2+ currents in embryonic cockroach brain neurons // J Neurophysiol 1999 - V.82, pp.2284-2293

23. Benson J.A., Sullivan R.E., Watson W.H., Augustine G.J. The neuropeptide proctolin acts directly on Limulus cardiac muscle to increase the amplitude of contraction // Brain Res. 1981 - V.213(2), pp.449-454.

24. Bernstein H.G., Eckert M., Penzlin H., Dorn A. Proctolin-related material in the mouse brain as revealed by immunohistochemistry //Neurosci Lett. 1984 - V.45(2), pp. 229-232.

25. Bernstein H.G., Eckert M., Penzlin H., Vieweg U., Rose I., Dorn A. Proctolin immunoreactive neurons in the human brain stem // Acta Histochem. 1986 -V.80(l), pp.111-114.

26. Birmingham J.T., Billimoria C.P., DeKlotz T.R., Stewart R.A., Marder E. Differential and history-dependent modulation of a stretch receptor in the stomatogastric system of the crab, Cancer borealis II J. Neurophysiol. 2003 - 90(6), pp. 3608-3616.

27. Bishop C.A., Krouse M.E., Wine J.J. Peptide cotransmitter potentiates calcium channel activity in crayfish skeletal muscle // J. Neurosci. 1991 - V.l 1(1), pp. 269276.

28. Bishop C.A., O'Shea M. Neuropeptide proctolin (H-Arg-Try-Leu-Pro-Thr-OH): immunocytochemical mapping of neurons in the central nervous system of the cockroach // J. Comp. Neurol. 1982- 207(3), pp. 223-38.

29. Bishop C.A., Wine J.J., Nagy F., O'Shea M. Physiological consequences of a peptide cotransmitter in a crayfish nerve-muscle preparation // J. Neurosci. 1987 - V.7(6), pp. 1769-79.

30. Bishop C.A., Wine J.J., O'Shea M. Neuropeptide proctolin in postural motoneurons of the crayfish // J. Neurosci. 1984 - V.4., pp. 2001-2009.

31. Bittar E.E., Nwoga J. Further observations on the behaviour of ouabain-insensitive sodium efflux towards proctolin in barnacle muscle fibres // J. Physiol. 1989 -V.419, pp. 435-453.

32. Blitz D.M., Christie A.E, Coleman M.J, Norris B.J, Marder E., Nusbaum M.P. Different proctolin neurons elicit distinct motor patterns from a multifunctional neuronal network // J. Neurosci. 1999 - V. 19(13), pp. 5449-5463.

33. Blitz D.M., Nusbaum M.P. Distinct functions for cotransmitters mediating motor pattern selection//J. Neurosci. 1999 - 19(16), pp. 6774-6783.

34. Blundon J.A., Wright S.N., Brodwick M.S., Bittner G.D. Presynaptic calcium-activated potassium channels and calcium channels at a crayfish neuromuscular junction. // J. Neurophysiol. 1995 - V.73, pp. 178-189.

35. Brailoiu E, Brailoiu GC, Miyamoto MD, Dun NJ. The vasoactive peptide urotensin II stimulates spontaneous release from frog motor nerve terminals // Br. J. Pharmacol. -2003-V. 13 8(8), pp. 1580-1588.

36. Brailoiu E, Miyamoto MD. Inositol trisphosphate and cyclic adenosine diphosphate-ribose increase quantal transmitter release at frog motor nerve terminals: possible involvement of smooth endoplasmic reticulum // Neuroscience 2000 - V.95(4), pp.927-931.

37. Breidbach O., Dircksen H. Proctolin-immunoreactive neurons persist during metamorphosis of an insect: a developmental study of the ventral cord of Tenebrio molitor (Coleoptera) // Cell Tissue Res. 1989 - V.257, pp.217-225.

38. Brezina V, Evans CG, Weiss KR. Enhancement of Ca current in the accessory radula closer muscle of Aplysia californica by neuromodulators that potentiate its contractions // J. Neurosci. 1994 - V.14(7), pp.4393-4411.

39. Brown B.E. Neuromuscular transmitter substance in insect visceral muscle // Science -1967- V.155, pp.595-596.

40. Brown B.E., Starrat A.N. Isolation of proctolin, a myotropic peptide from Periplaneta americana II J. Insect Physiol. 1975 - V.21, pp. 1879-1881.

41. Brustle B., Kreissl S., Mykles D.L., Rathmayer W. The neuropeptide proctolin induces phosphorylation of a 30 kDa protein associated with the thin filament in crustacean muscle // J. Exp. Biol. 2001 - V.204(15), pp. 2627-2635.

42. Chrachri A. Ionic currents in identified swimmeret motor neurones of the crayfish Pacifastacus leniusculus II J. Exp. Biol. 1995 - V.198(7), pp.1483-1492.

43. Christie A.E., Skiebe P., Marder E. Matrix of neuromodulators in neurosecretory structures of the crab Cancer borealis II J.Exp. Biol. 1995 - V.198(12), pp. 24312439.

44. Claeys I., Simonet G., Poels J., Van Loy T., Vercammen L., De Loof A., Vanden Broeck J. Insulin-related peptides and their conserved signal transduction pathway // Peptides 2002 - V.23, pp.807-816.

45. Cook B.J, Holman G.M. Activation of potassium depolarized visceral muscles by proctolin and caffeine in the cockroach Leucophaea maderae II Comp. Biochem. Physiol. (C) 1980 - V.67C(2), pp. 115-120.

46. Cook BJ, Holman G.M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle // Comp. Biochem. Physiol. (C) 1985 - V.80(l), pp. 65-73.

47. Cook B.J., Wagner R.M. Some pharmacological properties of the oviduct muscularis of the stable fly Stomoxys calcitrans II Comp. Biochem. Physiol. (C) 1992 -V. 102(2), pp. 273-280.

48. Cooke I.M. Studies on the crustacean cardiac ganglion Review // Comp Biochem Physiol (C) - 1988 - V.91(l), pp.205-218.

49. Crawley JN. Biological actions of galanin. // Regul Pept. 1995 - V.59(l), pp. 1-16.

50. Crawley JN. Coexistence of neuropeptides and "classical" neurotransmitters. Functional interactions between galanin and acetylcholine // Ann NY Acad Sci. -1990 V.579, pp.233-245.

51. Crawley JN. Functional interactions of galanin and acetylcholine: relevance to memory and Alzheimer's disease // Behav Brain Res. 1993 - V.57(2), pp.133-141.

52. Cusson M., Prestwich G.D., Stay B., Tobe S.S. Photoaffinity labeling of allatostatin receptor proteins in the corpora allata of the cockroach, Diploptera punctata II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991 - 181(2), pp.736-742.

53. Cusson M., Yagi K.J., Guan X.C., Tobe S.S. Assessment of the role of cyclic nucleotides in allatostatin-induced inhibition of juvenile hormone biosynthesis in Diploptera punctata// Mol Cell Endocrinol. 1992 - V.89(l-2), pp. 121-125.

54. Dal Belo C.A., Leite G.B., Fontana M.D., Corrado A.P., Zanandrea Baso A.C., Moreno Serra C.S., Oliveira A.C., Rodrigues-Simioni L. New evidence for a presynaptic action of prednisolone at neuromuscular junctions // Muscle Nerve 2002 - V.26, pp. 37-43.

55. Ding Q., Donly B.C., Tobe S.S., Bendena W.G. Comparison of the allatostatin neuropeptide precursors in the distantly related cockroaches Periplaneta americana and Diploptera punctata II Eur. J. Biochem. 1995 - V.234(3), pp. 737-746.

56. Dircksen H., Skiebe P., Abel B., Agricola H., Buchner K., Muren J.E., Nässei D.R. Structure, distribution, and biological activity of novel members of the allatostatin family in the crayfish Orconectes limosus II Peptides 1999 - V.20, pp. 695-712.

57. Dolphin AC. L-type calcium channel modulation // Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1999 - V.33, pp.153-177.

58. Donly B.C., Ding Q., Tobe S.S., Bendena W.G. Molecular cloning of the gene for the allatostatin superfamily of neuropeptides from the cockroach Diploptera punctata II Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993 - V. 90(19), pp. 8807-8811.

59. Dudel J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. // Pflugers Arch. 1981 - V.391, pp.35-40

60. Duve H. and Thorpe A., Distribution and functional significance of Leu-callatostatins in the blowfly Calliphora vomitoria II Cell Tissue Res. 1994 - V.276 , pp. 367-379.

61. Duve H., Johnsen A.H., Maestro J.L., Scott A.G., Jaros P.P., Thorpe A. Isolation and identification of multiple neuropeptides of the allatostatin superfamily in the shore crab Carcinus maenas II Eur. J. Biochem. 1997b - V.250, pp. 727-734.

62. Duve H., Wren P., Thorpe A. Innervation of the foregut of the cockroach Leucophaea maderae and inhibition of spontaneous contractile activity by allatostatin neuropeptides II Physiol. Entomol. 1995 - V.20, pp.33-44.

63. Erxleben C., Rathmayer W. A dihydropyridine-sensitive voltage-dependent calcium channel in the sarcolemmal membrane of crustacean muscle // J. Gen. Physiol. 1997 -V. 109(3), pp.313-326.

64. Erxleben C.F., deSantis A., Rathmayer W. Effects of proctolin on contractions, membrane resistance, and non-voltage-dependent sarcolemmal ion channels in crustacean muscle fibers // J. Neurosci. 1995 - V.15(6), pp. 4356-4369.

65. Filipeanu CM, Brailoiu E, Le Dun S, Dun NJ. Urotensin-II regulates intracellular calcium in dissociated rat spinal cord neurons // J. Neurochem. 2002 - V.83(4), pp.879-884.

66. Fone K.C., Johnson J.V., Putland A.P., Bennett G.W. Ventral horn neuropeptides modulate the release of noradrenaline from tissue slices of rat brainstem and ventralthoracic spinal cord // J. Neurochem. 1991 - V.57(3), pp. 845-851.i

67. Fossier P, Baux G, Tauc L. N- and P-type Ca channels are involved in acetylcholine release at a neuroneuronal synapse: only the N-type channel is the target of neuromodulators // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 - V.91, pp. 4771-4775.

68. Fuse M., Orchard I. The muscular contractions of the midgut of the cockroach, Diploptera punctata: effects of the insect neuropeptides proctolin and leucomyosuppressin // Regul. Pept. 1998 - 77(1-3), pp. 163-168.

69. Garside C.S., Koladich P.M., Bendena W.G., Tobe S.S. Expression of allatostatin in the oviducts of the cockroach Diploptera punctata // Insect Biochem. Mol. Biol. -2002 V.32(9),pp. 1089-1099.

70. Gaydukov A.E., Balezina O.P., Lapteva V.I. Modulatory action of neuropeptide allatostatin-1 on the contractile activity of stomach smooth musculature of mice. // J. Neurochem. 1998 - V.71(Suppl.), pp P.22B.21. 58-66

71. Golowasch J., Marder E. Proctolin activates an inward current whose voltage dependence is modified by extracellular Ca2+ // J. Neurosci. 1992 - V.12(3), pp. 810-817.

72. Goy M.F., Schwarz T.L., Kravitz E.A. Serotonin-induced protein phosphorylation in a lobster neuromuscular preparation // J. Neurosci. 1984 - V.4(3), pp. 611-626.

73. Groome J.R., deTschaschell M., Watson W.H. Peptidergic regulation of the Limulus midgut//J. Comp. Physiol.(A) 1992 - 170(5),pp.631-643.

74. Groome JR, Watson WH. Second-messenger systems underlying amine and peptide actions on cardiac muscle in the horseshoe crab Limulus polyphemus II J. Exp Biol. -1989 -V. 145, pp.419-437.

75. Grossman Y, Colton JS, Gilman SC. Interaction of Ca-channel blockers and high pressure at the crustacean neuromuscular junction. // Neurosci Lett 1991- V.125, pp. 53-56.

76. H. Van Wilgenburg, The effect of prednisolone on neuromuscular transmission in the rat diaphragm // Eur. J. Pharmacol 1979 - V.55, pp. 355-361.

77. Hertel W., Penzlin H. Function and modulation of the antennal heart of Periplaneta americana (L.) // Acta Biol. Hung. 1992 - V.43(l-4); pp.113-125.

78. Hertel W., Richter M., Rapus J., Eckert M., Penzlin H. The role of proctolin in the antenna-heart beat acceleration of Periplaneta americana (L.) // Acta Biol. Hung. -1995 V.46(2-4), pp.491-506.

79. Holman G.M, Cook B.J. Proctolin, its presence in and action on the oviduct of an insect. Comp. Biochem. Physiol. (C) 1985 - V.80(l), pp. 61-64.

80. Hooper S.L., Marder E. Modulation of the lobster pyloric rhythm by the peptide proctolin. // J. Neurosci. 1987 - V.7(7), 2097-2112.

81. Hurley LM, Graubard K Pharmacologically and functionally distinct calcium currents of stomatogastric neurons // J Neurophysiol. 1998- V.79,pp. 2070-2081.

82. Jorge-Rivera J.C., Marder E. Allatostatin decreases stomatogastric neuromuscular transmission in the crab Cancer borealis. II J. Exp. Biol. 1997 - V.200(23), pp.29372946.

83. Jorge-Rivera J.C., Sen K., Birmingham J.T., Abbott L.F, Marder E. Temporal dynamics of convergent modulation at a crustacean neuromuscular junction // J. Neurophysiol. 1998 - V.80(5), pp.2559-2570.

84. Keshishian H, O'Shea M. The distribution of a peptide neurotransmitter in the postembryonic grasshopper central nervous system // J. Neurosci. 1985 - V.5(4), pp. 992-1004.

85. King L.E., Sevala V.M., Loughton B.G. The effect of substitutions at position three on the binding and bioactivity of proctolin in locust hindgut and oviduct // Insect Biochem. Mol Biol. 1995 - V.25(2), pp.293-301.

86. Kobierski L.A., Beltz B.S., Trimmer B.A., Kravitz E.A. FMRFamidelike peptides of Homarus americanus: distribution, immunocytochemical mapping, and ultrastructural localization in terminal varicosities //J. Comp. Neurol. 1987 - V.266(l), pp. 1-15.

87. Kramer S.J., Toschi A., Miller C.A., Kataoka H., Quistad G.B., Li J.P., Carney R.L., Schooley D.A. Identification of an allatostatin from the tobacco hornworm Manduca sexta. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991 - V.88, pp. 9458-9462.

88. Kravitz E.A, Glusman S., Harris-Warrick RM, Livingstone M.S., Schwarz T., Goy M.F. Amines and a peptide as neurohormones in lobsters: actions on neuromuscular preparations and preliminary behavioural studies // J. Exp. Biol. 1980 - V.89, pp. 159-175.

89. Kreienkamp H.J. Molecular biology of the receptors for somatostatin and cortistatin Review // Results Probl. Cell Differ. - 1999 - V.26, pp. 215-237.

90. Kreienkamp H.J., Honck H.H., Richter D. Coupling of rat somatostatin receptor subtypes to a G-protein gated inwardly rectifying potassium channel (GIRK1) // FEBS Lett. 1997 - V.419(l), pp. 92-94.

91. Kreissl S., Schulte C.C., Agricola H.J., Rathmayer W. A single allatostatin-immunoreactive neuron innervates skeletal muscles of several segments in the locust // J. Comp. Neurol. 1999a - V.413(4), pp.507-519.

92. Kreissl S., Weiss T., Djokaj S., Balezina O.P., Rathmayer W. Allatostatin modulates skeletal muscle performance in crustaceans through pre- and postsynaptic effects // Eur. J. Neurosci. 1999b - V.l 1(7), pp. 2519-2530.

93. Kupfermann I. Functional studies of cotransmission // Physiol Rev. -1991 — V.71(3), pp. 683-732.

94. Kwok R., Orchard I. Central effects of the peptides, SchistoFLRFamide and proctolin, on locust oviduct contraction // Peptides 2002 - V.23(l 1), pp. 1925-1932.

95. Lange A.B, Orchard I., Adams M.E. Peptidergic innervation of insect reproductive tissue: the association of proctolin with oviduct visceral musculature // J. Comp. Neurol. 1986 - 254(3), pp. 279-286.

96. Lange A.B. A review of the involvement of proctolin as a cotransmitter and local neurohormone in the oviduct of the locust, Locusta migratoria Review.// Peptides -2002 - 23(11), pp. 2063-2070.

97. Lange A.B. Inositol phospholipid hydrolysis may mediate the action of proctolin in insect visceral muscle. Arch. Insect Biochem. Physiol. 1988 - V.l, pp. 201-209.

98. Lange A.B., Bendena W.G., Tobe S.S. The effect of 13 Dip-allatostatins on myogenic and induced contractions of the cockroach (Diploptera punctata) hindgut. J. Insect Physiol. 1995 - V.41, pp.581-588.

99. Lange A.B., Chan K.K., Stay B. Effects of allatostatin and proctolin on antennal pulsatile organ and hindgut muscle in the cockroach Diploptera punctata II Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1993 - V. 24, pip.19-92.

100. Lange A.B., Orchard I. The effects of SchistoFLRFamide on contractions of locust midgut// Peptides 1998- V.19(3), pp. 459-467.

101. Lange A.B., Orchard I., Adams M.E. Peptidergic innervation of insect reproductive tissue: the association of proctolin with oviduct visceral musculature // J. Comp. Neurol. 1986 - V.254(3), pp.279-286.

102. Lengvari I., Csoknya M., Merchenthaler I., Hamori J. Immunohistochemical study of the nervous system in earthworm (Lumbricus terrestris L.) // Acta Biol. Hung. -1992 V.43( 1-4), pp.253-258.

103. Lenz C., Sondergaard L., Grimmelikhuijzen C.J.P. Molecular cloning and genomic organization of a novel receptor from Drosophila melanogaster structurally related to mammalian galanin receptors // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000b - V.269,pp. 91-96.

104. Lenz C., Williamson M., Grimmelikhuijzen C.J.P. Molecular cloning and genomic organization of an allatostatin preprohormone from Drosophila melanogaster II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000a - V.273, pp. 1126-1131.

105. Liu G. Presynaptic control of quantal size: kinetic mechanisms and implications for synaptic transmission and plasticity // Curr. Opin. Neurobiol. 2003 - V.13(3), pp. 324-331.

106. Lloyd G.T., Woodhead A.P., Stay B. Release of neurosecretory granules within the corpus allatum in relation to the regulation of juvenile hormone synthesis in Diploptera punctata II Insect Biochem Mol Biol. 2000 - V.30(8-9), pp. 739-746.

107. Losavio A, Muchnik S. Role of L-type and N-type voltage-dependent calcium channels (VDCCs) on spontaneous acetylcholine release at the mammalian neuromuscular junction // Ann NY Acad. Sci. 1998 - V.841, pp. 636-645.

108. Losavio A, Muchnik S. Spontaneous acetylcholine release in mammalian neuromuscular junctions // Am. J. Physiol. 1997-V.273(6Pt. l),pp. C1835-1841.

109. Losavio A., Muchnik S. Facilitation of spontaneous acetylcholine release induced by activation of cAMP in rat neuromuscular junctions // Life Sci. 2000 - V.66(26), pp. 2543-2556.

110. Lundquist C.T., Nassel D.R. Peptidergic activation of locust dorsal unpaired median (DUM) neurons: depolarization induced by locustatachykinins may be mediated by cyclic AMP // J. Neurobiol. 1997 - V.33, pp. 297-315.

111. Maeno T, Shibuya Y. Effects of 2-(4-phenylpiperidino)cyclohexanol (AH5183) and barium ions on frog neuromuscular transmission // J. Physiol. 1988 - V.401, pp.671-685.

112. Martin D., Piulachs M.D., Belles X. Inhibition of vitellogenin production by allatostatin in the German cockroach // Mol. Cell. Endocrinol. 1996 - V.121, pp.191-196.

113. Mazzocco-Manneval C., Kuczer M., Konopinska D., Fournier B., Loughton B.G., Puiroux J. Pharmacological studies of proctolin receptors on foregut and hindgut of Blaberus craniifer II Peptides 1998 - V. 19(10), pp. 1641-1651.

114. Meir A, Ginsburg S, Butkevich A, Kachalsky SG, Kaiserman I, Ahdut R, Demirgoren S, Rahamimoff R. Ion channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release // Physiol. Rev. 1999 - V.79(3), pp. 1019-1088.

115. Merchenthaler I, Lopez FJ, Negro-Vilar A. Anatomy and physiology of central galanin-containing pathways // Prog. Neurobiol. 1993 - V.40(6), pp.711-769.

116. Mercier A.J., Lee J. Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut // Peptides 2002 - V.23(10), pp. 1751-1757.

117. Mercier A.J., Wilkens J.L. Modulatory effects of proctolin on a crab ventilatory muscle // J. Neurobiol. 1985 - V.16(5), pp.401-408.

118. Nassel D.R, O'Shea M. Proctolin-like immunoreactive neurons in the blowfly central nervous system // J. Comp. Neurol. 1987 - V.265(3), pp. 437-454.

119. Nassel D.R. Neuropeptides in the nervous system of Drosophila and other insects: multiple roles as neuromodulators and neurohormones Review // Prog. Neurobiol. -2002 - V.68(l), pp. 1-84.

120. Naves L.A., Van der Kloot W. Repetitive nerve stimulation decreases the acetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. -2001- V.532(3), pp. 637-647.

121. Noronha K.F., Lange A.B. Proctolin's role in neurally evoked contractions of the locust oviducts // J. Neurobiol. 1997 - V.33(2), pp. 139-150.

122. Nudler S., Piriz J., Urbano FJ, Rosato-Siri M.D, Renteria ES, Uchitel OD. Ca2+ channels and synaptic transmission at the adult, neonatal, and P/Q-type deficient neuromuscular junction // Ann. NY Acad Sei. 2003 - V.998:l 1-17.

123. Nusbaum M.P., Blitz D.M., Swensen A.M., Wood D., Marder E. The roles of cotransmission in neural network modulation // Trends Neurosci. 2001 - V.24, pp. 146-154.

124. Nusbaum M.P., Marder E. A modulatory proctolin-containing neuron (MPN). I. Identification and characterization // J. Neurosci. 1989 - V.9(5), pp.1591-1599.

125. Nwoga J., Bittar E.E. Stimulation by proctolin of the ouabain-insensitive sodium efflux in single barnacle muscle fibers // Comp Biochem Physiol (C) 1985 -V.81(2), pp. 345-350.

126. Orchard I., Belanger J.H., Lange A.B. Proctolin: a review with emphasis on insects // J. Neurobiol. 198<T- Vpp. 470-496.

127. Orchard I., Lange A.B. Neuromuscular transmission in an insect visceral muscle. J Neurobiol. 1986 - V.17(5), pp. 359-372.

128. Orchard I., Lange A.B. The release of octopamine and proctolin from an insect visceral muscle: effects of high-potassium saline and neural stimulation // Brain Res. -1987 -V.413(2), pp.251-258.

129. Osborne R.H. Insect neurotransmission: neurotransmitters and their receptors -Review // Pharmacol Ther. 1996 - V.69(2), pp. 117-142.

130. O'Shea M, Schaffer M. Neuropeptide function: the invertebrate contribution // Ann. Rev. Neurosci. 1985 - V.8, pp. 171-198.

131. O'Shea M., Adams M.E., Bishop C., Witten J., Worden M.K. Model peptidergic systems at the insect neuromuscular junction // Peptides 1985 - V.6(Suppl 3), pp.417-424.

132. O'Shea M., Bishop C.A. Neuropeptide proctolin associated with an identified skeletal motoneuron // J. Neurosci. 1982 - V.2(9), pp. 1242-1251.

133. Parsons SM, Prior C, Marshall IG. Acetylcholine transport, storage, and release // Int. Rev Neurobiol. 1993 - V.35, pp.279-390.

134. Pasztor V.M., Golas L.B. The modulatory effects of serotonin, neuropeptide Fl and proctolin on the receptor muscles of the lobster abdominal stretch receptor and their exoskeletal muscle homologues // J. Exp. Biol. 1993 - V. 174, pp. 363-374.

135. Predel R., Rapus J., Eckert M. Myoinhibitory neuropeptides in the American cockroach // Peptides 2001 - V.22(2), pp. 199-208.

136. Protti DA, Sanchez VA, Cherksey BD, Sugimori M, Llinas R, Uchitel OD. Mammalian neuromuscular transmission blocked by funnel web toxin // Ann. NY Acad. Sei. 1993 - V.681, pp.405-407.

137. Protti DA, Uchitel OD. Transmitter release and presynaptic Ca2+ currents blocked by the spider toxin omega-Aga-IVA // Neuroreport 1993 - V.5(3), pp333-336.

138. Puiroux J., Pedelaborde A., Loughton B.G. The effect of proctolin analogues and other peptides on locust oviduct muscle contractions // Peptides 1993 - V.14(6), pp.1103-1109.L

139. Qian J, Noebels JL. Presynaptic Ca channels, neurotransmitter release at the terminal of a mouse cortical neuron // J. Neurosci. 2001 - V.21 pp. 3721-3728.

140. Quinonez M, Romero PJ, Rojas L. Action of protein kinase A activators on the caudal neuromuscular junction of toad tadpoles, recorded on synaptic spots // Brain Res. 1996 - V.737(l-2), pp.327-330.

141. Rachinsky A., Zhang J., Tobe S.S. Signal transduction in the inhibition of juvenile hormone biosynthesis by allatostatins: roles of diacylglycerol and calcium // Mol. Cell Endocrinol. 1994-V.105(l), pp.89-96.

142. Randall A.D., Tsien R.W. Pharmacological dissection of multiple types of Ca2+ channel currents in rat cerebellar granule neurons // J. Neurosci. 1995 - V.15, pp.2995-3012

143. Rane S.G., Gerlach P.H., Wyse G.A. Neuromuscular modulation in Limulus by both octopamine and proctolin // J. Neurobiol. 1984 - V.15(3), pp.207-220.

144. Rathmayer W., Maier L. Muscle fiber types in crabs: studies on single identified muscle fibers II Am. Zool. 1987 - V.27, pp. 1067-1077.

145. Rudolph PH, Stay B. Cockroach allatostatin-like immunoreactivity in the central nervous system of the freshwater snails Bulinus globosus (Planorbidae) and Stagnicola elodes (Lymnaeidae) // Gen. Comp. Endocrinology 1997 - V. 106(2), pp. 241-250.

146. Saver M.A., Wilkens J.L., Syed N.I. In situ and in vitro identification and characterization of cardiac ganglion neurons in the crab, Carcinus maenas II J. Neurophysiol. 1999 - V.81(6), pp. 2964-2976.

147. Schoofs L. Veelaert D., Vanden Broeck J., De Loof A. Peptides in the locusts, Locusta migratoria and Schistocerca gregaria II Peptides 1997 - V.18(l), pp.14556.

148. Schoofs L., Holman G.M., Hayes T.K., Nachman R.J. Isolation, identification and synthesis of locustamyoinhibiting peptide (LOM-MIP), a novel biologically active neuropeptide from Locusta migratoria. II Regul. Pept. 1991 - V.36, pp. 111-119.

149. Schoofs L.,Vanden Broeck J., De Loof A. The myotropic peptides of Locusta migratoria: structures, distribution, functions and receptors // Insect Biochem. Mol. Biol. 1993 - V. 23(8), pp. 859-881.

150. Schulz H., Schwarzberg H., Penzlin H. The insect neuropeptide proctolin can affect the CNS and the smooth muscle of mammals // Acta Biol. Med. Ger. 1981 -V.40(2), pp.Kl-5.

151. Schwarz T.L., Harris-Warrick R.M., Glusman S., Kravitz E.A. A peptide action in a lobster neuromuscular preparation // J. Neurobiol. 1980 - V. 11, pp. 623-628.

152. Schwarzberg H., Pross M. Neurppeptides in the cerebrospinal fluid and regulation of behavior // Prog. Brain Res. 1992 - V.91, p.455-457.

153. Siwicki K.K., Beltz B.S., Schwarz T.L., Kravitz E.A. Proctolin in the lobster nervous system // Peptides 1985 - V6(Suppl 3), pp.393-402.

154. Siwicki K.K., Bishop C.A. Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervous systems of lobster and crayfish // J. Comp. Neurol. 1986 - 243(4):435-453.

155. Skiebe P. Neuropeptides are ubiquitous chemical mediators: Using the stomatogastric nervous system as a model system Review // J. Exp. Biol. - 2001 -V.204(12), pp.2035-2048.

156. Skiebe P., Schneider H. Allatostatin peptides in the crab stomatogastric nervous system-inhibition of the pyloric motor pattern and distribution of allatostatin-like immunoreactivity // J. Exp. Biol. 1994 - V.194, pp.195-208.

157. Skiebe-Corrette P., Jorge-Rivera J.C., Marder E. The allatostatins influence the gastric system of the crab, Cancer borealis II Soc. Neurosci. Abstr. 1993 - V.19, p.931.

158. Skinner JR, Fairbaim SE, Woodhead AP, Bendena WG, Stay B. Allatostatin in hemocytes of the cockroach Diploptera punctata II Cell Tissue Res. 1997 -V.290(l), pp. 119-28.

159. Smart D., Johnston C.F., Maule A.G., Halton D.W., Hrckova G., Shaw C., Buchanan K.D. Localization of Diploptera punctata allatostatin-like immunoreactivity in helminths: an immunocytochemical study // Parasitology 1995 - V. 110(1), pp. 87-96.

160. Stangier J., Dircksen H., Keller R. Identification and immunocytochemical localization of proctolin in pericardial organs of the shore crab, Carcinus maenas II Peptides 1986 -V.7(l), pp. 67-72.

161. Starrat A.N., Brown B.E. Structure of the pentapeptide proctolin, a proposed neurotransmitter in insects // Life Sei. 1975 - V.17, pp. 1253-1256.

162. Stay B., Chan K.K., Woodhead A.P. Allatostatin-immunoreactive neurons projecting to the corpora allata of adult Diploptera punctata II Cell Tissue Res. -1992 V.270, pp. 15-23.

163. Stay B., Fairbairn S., Yu C.G. Role of allatostatins in the regulation of juvenile hormone synthesis Review // Arch. Insect Biochem. Physiol. - 1996 - V.32(3-4), pp. 287-297.

164. Stay B., Tobe S.S., Bendenna W.G. Allatostatins: identification, primary structure, functions and distribution // Adv. Insect Physiol. -1994 V. 25, pp. 267-338.

165. Stay B., Woodhead A.P. Neuropeptide regulators of insect corpora allata II Am. Zool. 1993 -V. 33, pp. 357-364.

166. Stefano G.B., M. Salzet M. Invertebrate opioid precursors: evolutionary conservation and the significance of enzymatic processing // Int. Rev. Cytol. 1999 -V.187, pp.261-286.

167. Sullivan R.E., Miller M.W. Dual effects of proctolin on the rhythmic burst activity of the cardiac ganglion II J. Neurobiol. 1984 - V.15(3), pp. 173-196.

168. Sullivan R.E., Newcomb R.W. Structure function analysis of an arthropod peptide hormone: proctolin and synthetic analogues compared on the cockroach hindgut receptor II Peptides 1982 - V.3(3), pp.337-344.

169. Swales L.S., Evans P.D. Histochemical localization of octopamine- and proctolin-sensitive adenylate cyclase activity in a locust skeletal muscle // Histochemistry -1988 V.90(3), pp. 233-239.

170. Tobe S.S., Stay. B. Structure and regulation of the corpus allatum. // Adv. Insect Physiol. 1985 -V. 18, pp. 305-432.

171. Trudeau LE, Baux G, Fossier P, Tauc L. Transmitter release and calcium currents at an Aplysia buccal ganglion synapse~I. Characterization. // Neuroscience. 1993 -V.53(2), pp.571-80.

172. Uchitel OD, Protti DA, Sanchez V, Cherksey BD, Sugimori M, Llinas R. P-type voltage-dependent calcium channel mediates presynaptic calcium influx and transmitter release in mammalian synapses // Proc Natl Acad Sci USA. 1992 -V.89(8), pp.3330-3333.

173. Urbano FJ, Depetris RS, Uchitel OD. Coupling of L-type calcium channels to neurotransmitter release at mouse motor nerve terminals // Pflugers Arch. 2001 -V.441(6), pp.824-831.

174. Urbano FJ, Uchitel OD. L-type calcium channels unmasked by cell-permeant Ca2+ buffer at mouse motor nerve terminals // Pflugers Arch. 1999 - V.437(4), pp.523528.

175. Van der Kloot W, Benjamin WB, Balezina OP. Calcitonin gene-related peptide acts presynaptically to increase quantal size and output at frog neuromuscular junctions // J. Physiol. 1998 - V.507 (Pt 3), pp. 689-695.

176. Van der Kloot W, Van der Kloot TE. Catecholamines, insulin and ACTH increase quantal size at the frog neuromuscular junction // Brain Res. 1986 - V.376(2), pp. 378-381.

177. Van der Kloot W. Loading and recycling of synaptic vesicles in the Torpedo electric organ and the vertebrate neuromuscular junction // Prog Neurobiol. 2003 -V.71(4), pp. 269-303.

178. Van der Kloot W. The regulation of quantal size // Prog Neurobiol. 1991-V.36(2), pp. 93-130.

179. Van der Kloot W., Branisteanu DD. Effects of activators and inhibitors of protein kinase A on increases in quantal size at the frog neuromuscular junction // Pflugers Arch. 1992 - V.420(3-4), pp.336-341.

180. Van der Kloot W., Molgo J. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction // Physiol Rev. 1994 - V.74(4), pp. 899-991.

181. Vanden Broeck J., Veelaert D., Bendena W.G., Tobe S.S., De Loof A. Molecular cloning of the precursor cDNA for schistostatins, locust allatostatin-like peptides with myoinhibiting properties// Mol. Cell. Endocrinol. 1996 - V.122, pp. 191-198.

182. Veenstra J.A., Noriega F.G., Graf R., Feyereisen R. Identification of three allatostatins and their cDNA from the mosquito Aedes aegypti II Peptides 1997 -V. 18(7), pp. 937-942.

183. Washio H. Effects of putative neurotransmitters on dorsal unpaired median neurons of cockroach (Periplaneta americana) thoracic ganglia // J. Insect Physiol. -1994- V.40, pp. 841-847.

184. Watson W.H., Augustine G.J., Benson J.A., Sullivan R.E. Proctolin and an endogenious proctolin-like peptide enhance the contractility of the Limulus heart // J. Exp. Biol. 1983 - V.103, pp. 55-73.

185. Watson W.H., Hoshi T. Proctolin induces rhythmic contractions and spikes in Limulus heart muscle // Am. J. Physiol. 1985 - V.249(4 Pt. 2), pp. R490-495.

186. Wegener C. and Nassel D.R., Peptide-induced Ca movements in a tonic insect muscle: effects of proctolin and periviscerokinin-2 // J. Neurophysiol. 2000 - V.84, pp. 3056-3066.

187. Weiss T, Kreissl S, Rathmayer W. Localization of a FMRFamide-related peptide in efferent neurons and analysis of neuromuscular effects of DRNFLRFamide (DF2) in the crustacean Idotea emarginata // Eur. J. Neurosci. 2003 - V.17(2), pp.239-248.

188. Wilcox C.L, Lange A.B. Role of extracellular and intracellular calcium on proctolin-induced contractions in an insect visceral muscle // Regul Pept. 1995 -V.56(l), pp.49-59.

189. Witten J.L., O'Shea M. Peptidergic innervation of insect skeletal muscle: immunochemical observations // J. Comp. Neurol. 1985 - V.242(l), pp.93-101.

190. Wood D.E., Stein W., Nusbaum M.P. Projection neurons with shared cotransmitters elicit different motor patterns from the same neural circuit // J. Neurosci. 2000-V.20(23); 8943-8953.

191. Woodhead A.P., Khan M.A., Stay B., Tobe S.S. Two new allatostatins from the brain of Diploptera punctata II Insect Biochem. Mol. Biol. 1994 - V. 24(3), pp. 257-263.

192. Woodhead A.P., Stay B., Seidel S.L., Khan M.A., Tobe S.S. Primary structure of four allatostatins: neuropeptide inhibitors of juvenile hormone biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989 - V. 86(15), pp. 5997-6001.

193. Woodhead A.P., Stoltzman C.A., Stay. B. Allatostatins in the nerves of the ' antennal pulsatile organ muscle of the cockroach Diploptera punctata II Arch. Insect

194. Biochem. Physiol. 1992 - V.20, pp.253-263

195. Woodhead, A.P., Asano W.Y., Stay B. Allatostatins in the hemolymph of Diploptera punctata and their effect in vivo // J. Insect Physiol. 1993 - V.39, pp. 1001-1005.

196. Wright SN, Brodwick MS, Bittner GD. Presynaptic calcium currents at voltage-clamped excitor and inhibitor nerve terminals of crayfish. // J Physiol (Lond). 1996 -V.496, pp.347-361.

197. Wu LG, Westenbroek RE, Borst JGG, Catterall WA, Sakmann B. Calcium channel types with distinct presynaptic localization couple differentially to transmitter release in single calyx-type synapses // J Neurosci. 1999 - V.19, pp.726-736

198. Yu SP, Van der Kloot W. Increasing quantal size at the mouse neuromuscular junction and the role of choline // J Physiol. 1991 - V.433, pp.677-704.

199. Zhu X.X., Oliver J.H. Cockroach allatostatin-like immunoreactivity in the synganglion of the American dog tick Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae) // Exp. Appl. Acarol. 2001 - V.25(10), pp. 1005-1013.

200. Zitnan D., Kingan T.G., Kramer S.J. and Beckage N.E. Accumulation of neuropeptides in the cerebral neurosecretory system of Manduca sexta larvae parasitized by the braconid wasp Cotesia congregata II J. Comp. Neurol. 1995 -V.356, pp. 83-100.