Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм конкурентного блокирования никотиновых холинорецепторов нейронов верхнего шейного ганглия крысы

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Механизм конкурентного блокирования никотиновых холинорецепторов нейронов верхнего шейного ганглия крысы"

ïib

a \ ' \ ) : i * •* " t ■ i • •-

НАЦЮНАЛЫIA АКАДЕМШ НАУК УКРЛШИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ПРАПОРА 1НСТИТУТ ФВЮЛОГП ш.О.О.ЕОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

ВОЙТЕНКО Cepriíí Валетииошгт

МЕХАШЗМ КОНКУРЕНТНОГО БЛОКУ ВЛИЯЯ ШКОТШЮВИХ ХОЛИЮРЕЦЕПТОРIB НЕЙРОШВ BEPXI1ЬОГО ШИЙПОГО ГЛШЛ1Я ЩУРА

03.00.05 - бю(}изика

АВТОРЕФЕРАТ дисертшщ на здобуття отеного ступени кандидата бюлоггпшх наук

KHÍB - 1995

Дпсертафею с рукопис -

Роботу виконано у шдд^л! физиологи вегетативно! iiepnoDoi системи (эавиуючий - академж HAU Украиш Володимир Гванович Ckqic) 1нстшугу ф1зюлогп ¡м.О.О.Согомольця HAH Укра'ши

Иауковий KepiuiniK: академик HAH Украши,

Офщйпи опоненти: академик HAH Укрвши,

доктор бюлопчних наук Михайло Федорович Шуба доктор бюлопчиих наук Мнкола Серпйоинч Веселопський

Пронина усганова: Науково-досмдиий тстнтут ф131ологи Кшиського

зовано'1 ради Д-01.13.01 при IncTirryTi ф1зюлош ¡м.О.О.П.гомольця HAH Украиш (Kuiu, вул.Богомольця 4).

3 дисертащею можна ознайомигися в öiÖAioreni 1иститугу ф1зюлош 1м.О,О.Богомольця HAH Украащ

доктор бюлопчнпх наук Володимир 1вшюга1ч Скок

университету Тараса Шевченка

Автореферат роз1слан

_1995 ]юку

Вчсший секретар Спец1ал1эовано1 ради доктор бюлопчиих наук

З.О.Сорокша-Марина

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальтсть проблеми. Нисотякова холшерпчна передача збуджешш являе собою одну з найб1льш розповсюджеиих в оргашзмх та досл!Дже1гу найкраще за Bei шли види xiMiira«. передач.

При вивченш мехагазму да pisimx блокатор1в на нейрональш НХР було встаноилено, що деяга речовшги, paniine ¿дентифцсовагп як конкурентш (гекса- та пентаметошй), блокують йотгмй канал (Ascher et al., 1979, Selyanko et al., 1981b). Каналоблокуючий мехатзм да буп истаиоилений також для ряду когок моно-амошевих сполук (Жоров, 1989; Zorov, 1991) i пох)дних пентаетошя (Гмиро и соавт., 1987). Детально були досл1джст pi^rn типи блокупашт йонного каналу, тага як блокування гпдкритого йонного каналу, (Ascher et al., 1979; Selyanko et al., 1982; Rang, 1982; Skok et al., 1983, 1984), блокування закрытого йонного каналу (Adam3, 1977; Adams, Feltz. 1980a), блокування тину "пастки" (Liugle, 1983). Ha 6asi одержаного материалу виянилося можлнвкм нобудувати Tcopiro блокування йонного каналу нейроналыпос НХР (Скок, 1987; Skok et al., 1989). В той же час, мехатзм копкуретгшого блокування нейроналыгих НХР був досйджений недостатпъо. Чисто конкурентна блокуюча дтя на кейропальн! НХР встаноплола лише для триметафану i суругатоксину (Ascher et al., 1979; Бобрыгпев, Скок 1987). Не дослЦжешгй i вплив р1зних факгор!вна блокування центру зв'язування ацетиосолнгу (АХ).

Мета роботи. Виходячи з цього метою неявно! роботи було електрофшолопчне внвчення мехашзмш дп ганглюблокатор1э на центр зв'язування АХ НХР нейротв симпатичного гангмя ссавця,

Голота завдания. 1 Досмдити мехатзм ,\i'i класичпих блокаторт конкурентного (триметафан) та канального (тубокурарин, гексаметотйй) титв на НХР нейротв верхнього шийного гагтая (ВШГ) щура для подалыного викорисгання ix як критерйо портняння при дооидженгп пшгнгх блокатор!В. 2.Досл1дггги мехашзм дü на НХР

речовин, можливо взаемодйочих з центром зв'язування АХ, таких як тетраеэтламонш (TEA) (гхсшдне холшомиметика тетраметиамотя/ i нахикаршн (ПХ)(розм1ри молекулн якого бглыш за розшри нерер1зу М1сцй' зв'язування блокатор!в каналу). З.Досмдити ефектившсть та мехашзм дн на НХР нохадшх ПХ з р1зшши розшрами молекул.

Иаукова новизна. На нейронах ВШГ щура встаноплеио, що TEA, ПХ, а також його похудш IEM1820, IEM1821, IEM1773 та 1ЕМ1787 блокують центр зв'язування АХ нейрональних НХР. Для ПХ, IEM1820 та IEM1821 виявлено достов1рне посилення блокуючо! д1Т i3 збш>шенням posMipiB молекули блокатора. Вперте встановлено, що ефективтсть конкурентно!' блокуючо! дй може залежати в^д мембраного потенщалу (МП). Робип.ся припущення, що i3 змшою МП в1дбувшоться конформацйш! змши молекули НХР, що впливае на u спорЦнетсть ло блокатора. Для TEA i ПХ вперше визначеш шгиб1Торш констанги при pisimx р1внях МП.

I

Практично значения робота. Результата дооиджень становлягь штерес для бюф1зшив, ф1зюлопв та фармаколопв,. осгальки дають нову шформащю про будову i молекулярш мехашзми робота нейрональних НХР, i можуть бути використаш для ношуку нових фармако-лог1ч1£их препарапв, задЬших у лшуванш гшертотчно'£ хвор оби.

Апробащя робота. Матер1али дисертацн допошдалися та обговорювалися на семшарах 1Пдд1лу ф1зтлот вегетатшшо'1 нервово! системи Ьютшугу ф1зшлога ¿м.О.О.Богомольця HAH Укра'ши, загалыюшсттугськюс семшарах 1нституту ф!зюлогп

¡м,О.О.Богомольца HAH Украйш, та на XIV з'Тздi украшського ф1зюлопчного товариства im.I.П.Павлова (1994, Кххш).

Об "см та структура лисертацп, Робота викрнана на 114 сторшках машинописного тексту та складаеться з встуну, огляду лггератури, опису метод1в, ексиориментально! частини, обговорешы,

7 висновкш та списку л1тератури э 118 найменувань. Робота шострована 30 малюнками.

ОБ'ЕКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ. Дооидження проводили на нейронах ВШГ бмих тритижневих mypin. Тварин наркотиэували еф!ром i вбитзали уколом в серце. Зразу видЬяли обидпа ВШГ i клали Тх у зовшшньоюйтишпш роз'пш. Поим мехатчио зтмали оболонхи i обробляли г<шслш розчином, що мостив 0,5% колагенази ("CirMa" CI11A, тип 1А) i 0,1% протбази ("Босрингер Манхейн" ФРН). Час обробки - 30-40 хп. ГНсш цього ганглш переносили в експеримстггальну камеру i фжсували вольфромоиими голоч-ками (о 40 мкм) до дна, вкритого силгардом ("силгард 184" США). Робочий об*см камери буи 2 мл. ГПд час експерименту ганглш погай-но омивзися свЪкгш зовтш1п>оклпгишшм розчинем. Експеримети проводились. при шмпатнш температур!. Досл1джуваш речовшм в необх1дних ко1щентрац1ях додавались у зовшшньоклгоппгий розчин.

Зовтгтшоклп-игашй розчин (розчин Кребса) micthh (в ммоль/л): NaCl - 133; КС1 - 5,9; CaCl2 - 2,5; MgCl2 - 1,2; трис-HCl - 10; глюкозу • 11 (рН = 7,4). BtiyrpimfttOKAirHHHinr розчин, запотпогочий петч-пшетку, йктии (п ммоль/л): КС1 - 140; CaCl2 - 1; EGTA'KOH -И; HEPES'KOH - 10 (рН = 7,2). В деяккх експерименгах, коли було потребно довго утримувати клгггагу в облает! МП, близьких до нуля, для усунегаш калено? пров1дносп, йони калда, у шгутршппю-клггшпгому розчиш замщували ионами цезпо.

АХ аплщирували йонофоретично. Йонофоретичттй мжроелектрод заповшовали розчином АХ-хлор1ду в когщептрацп 1,5 моли/л. Onip м!кроелектрода склада« 61ля 50 Мом,

Метод "patch-clamp", або метод локально! фп;см\и потетщшлу, використовувався для реестрацп струшв щлоУ клптпш (т.з. конфиурагуя "whole-cell"), викликаних йопофоретичною анл1кац1Сю АХ (Hainill et al., 1981). Петч тп етки виготавляли з nipOKCQ. Кшчик

пшетки оплавлювали, що покращувало настунний контакт з клииною. Ошр шпеток був В1Д 2 до 5 МОм. Кшчик шпетки тдводили до поверши клггини за дономогою мжроманшулятора (Карл Цейс, Йена, НДР) шд в1зуальним контролем (пггерференщйний мнсроскоп "Бюлар" ПНР). Пшетку притискували до поверхш клтши. ГКсля створення у шпетщ В1д' емного тиску формувався контакт з опором б1ля 1 ГОм. Повторним створенням вЦ'емного тиску кмтину проривали, завдяки чому розчин, який заповнював пшетку проникав всередину клггини- 1 з'являлась можлитсть фцссаци потенщалу. Електрична схема виконана за Отвсрсом (Сигворс, 1987).

Експерименти проводились на електроф1зюлопчш установив з1брашй на баз! мшро-ЕОМ "Елекгротка-85", в натвавтоматичному режш>п по програм! розробленШ к.б.н. Пурнинем С.Л.

Виклчкаш АХ трансмембрани струм и (АХ-струми) шдсилювали шдсилювачем, сигнал з якого подавався на вх1д аналогово-цифрового перетворювача УВВ-1 1 оцифровувався з частотою 0,1-1 кГц. Оцифрован! данш вводили в гощ>гть ЕОМ "Електрошка-85" 1 записували на магттт диски для наступного аналгзу,

Мехшизм да гантлюблокатор1в визначали за допомогою стандарт!мх методичних шдхо^в: вплив дози агошста ("доза-ефект"), попсредньо! активацп НХР ("частотна залежшсть") та МП (анайз вольт амперно! характеристики) на блокуючу д1ю досмджуваних речонин, а також Тх вплив на "час життя" йошюго каналу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛ1ДЖЕНБ. Залсжнкть величин АХ-струмш глл лози АХ. Коефщ1ент Х1ла. Осильки в якосгп аготсту ми використовунали тальки АХ, була тфоведоиа сср!я експерименпв по визначенню характеру його да на НХР нейротв ВШГ щура.

Визначиги число молекул речовини, як1 зв'язуготься з одною молекулою рецептора, можна по нахилу графша залежносп. "доза-ефект" в подв^шшх логарифмхчних координатах. Величина тангенса кута нахилу буде виповЦати илькосп молекул. Ця величина називаеться коефпцснтом (або числом) XiAa (Dixon, Webb, 1964).

Досл1ди по визначенню коефнцента Х>ла проводились нами при достатньо довгих (б1\я 1 с) аплнсащях АХ, яга викликали стацюнарш АХ-струми. Для визначення числа Х1ла взбирались нейрони з ста-бшыпт плато АХ-струму, що вказувало на в^дсугшстъ десенситизаци.

У досуиджених нейронах граф1ки добре апроксимувались нря-мими. Величина коефпрента Х5ла дор1вшовала 0,9^.0,1 (п —8), тобто була близькою до 1. Таким чином було визначено, що в наших умовах для активаци одного НХР нейрошв ВШГ необх1дна одна молекула АХ.

Ддг. класичгмх конкурентних i канальних блокаторш. Змша залежносп "доза-ефекг" шд впливом триметафану, тубокурарину i гексаметонпо - класичних блокаторш НХР в1диов1Дно конкурентного i канального тшнв, була досиджена в наших умовах з використанням методичнйх п1дход1в, пикористаних для иоделыпого досл1дження ¡нших, ранаше недоел]джених, блокатор1в.

Тримстафан (2*10 6 М/л)- ефективно i обернено блокував АХ-струми. Величина пригшчення Х-1 (Л = 1/1» I - амплиуда струму в контроле Ib - п присутносп блокатора) при -50 мВ дор1вшовала 1,63^0,-17 (а- 4). В ycix чотирьох випадках блокуючий ефект послаблювався is зросташшм дози АХ, що вказувало на вшискання триметафану АХ 13 Miau> зв'язування, тобто говорило про конкурентний тип Ai'i.

Мехашзм блокування найкраще за все визначати за допомогою координат Лайну1вера-Берка. По-перше, найбмьше значения, в pa3i використання цих координат, .мають величини струм in, одержаних при достатньо великих концентрациях аготста, при яких помилка визначення амплпуди . струм1в найменша. По друге, критерш

конкурентного або канального тишв блокувашы - перегин контрольного графжа i графжа, одержаного в присутност! блокатора в райош нуля nid абсцис або, в1дп0в1дгю, паралельшсть цих прямих, дозвляе чггко встановиги тип блокувашш.

В ycix випадках аиалдэ эалежност! "доза-ефект" для триметафа-пу вказував на конкурентник тип взаемоди блокатора з НХР. В координатах Лайну1вера-Берка точка перетину граф1юв завжди зна-ходилась в райош щля sici абсцис. Середнс значения доршшопало 0,04±.1,1 мкА1 (п = 4). Х-тест теж вказував на конкуренгшсть Aiï - бло-куюЧй ЭАати1с1Ъ триметафану зменшувалась 1з збш>шенням дози АХ.

ШдтверАжуволась конкурешшсть блокуючо! Aiï триметафану i шишми тестами, а саме впливом блокатора на вольт-амперну характеристику i эалежшстю блоку biA попереднъо! активавд НХР. Як i повинно було бути для блокатоР1в взасмодпочих з центром зв язувашвд АХ, блокуюча здатшсть триметафану не залежала BiA МП i ne змнповалась при попередщй активаци! НХР.

Протилежио поводили себе блокатори йониого каналу - тубоху-рарин i гексаметошй. Ефекгивно блокуючи нейрональш НХР (для тубокурарину, наприклад, Х-1 = 1,26*0,30 (n = 3J) вони, в обернених координатах, паралельно зшщували аряму "доза-ефект" тдносио контрольно». Блокуюча д1я носилювалась 1з збкьшешшм дози АХ.

Валив МП на блокуючу л|ю гексаметошю " (5 мкмоль/л) характеризуемся посиленнян блоку при Пперполяризаци мембрани, що характер/го для блокатер^в йошгого каналу.

M&imtt3ii_AiLXEAl IRA - класичний блокатор синаптичжя пере-дач1 в воготативних гашлшх (див. Barlow, 1964). Але мехатзм його Aiï не. НХР ядносно детально шипений лише на скел^них м'язах^ де його д1я була эшшана (конкурентно i канальнаДАсЛег et al., 1979).

В наших експершентах ГБА (2*105 М/л) при МП -50 мВ обернено пригшчував амплитуду АХ-струму „л 57,0*8,2% (п-5).

6

А

Б

I/I-50

В

V1 2

30-

«В -70 -30

. Мал.1. Залежтсть викликаного TEA (20 мкмоль/л) пригтчення АХ-стуму в!д мембранного потенщалу. А - зллва АХ-струми, зареестроваш в одному й тому ж нейрот в нормальному .розчит та в присутносп блокатора при -90 мВ (згори) i при -30 мВ (знизу). Правше - залежтсть стандартизовано! по в1дпов1д1 при -50 мВ амшитуди АХ-струму (Bicb ординат), в1д мембранного потенщалу (nici, абсцис) в нормальному розчит (1) i в присутносп блокатора (2), Використовувався внутриклтшний розчин на основ1 КС1. Б - те ж, що i А, але використовувався внутрикл1тинний розчян на ocHosi СзС1. В - залежтсть в1д мембранного потенщалу (вкь абсцис) величини пригтчення А.-1 (в1сь ординат).

Блокуючий ефекг розвивався виродовж 2 - 3 хв, i зникав через 5 - 8 хв. теля початку шдмиву, що в основному визначалось часом змши розчину в камер!.

Вплив МП на блокуючу здатшеть TEA був дослЦжоний при двох р!зних внутрикллтинних розчинах - один стандартсшй, на ocitoni каллю, а в нштому КС1 було эамйцено екв1молярнок> к)льк1стю CsCJ. При першому розчггт блокуюча дш ТЕЛ в д1апазош МП в1д 0 до -50

мВ практично не змнповалась. Посилення блоку з иперполяризащею мембрани з'являлось лише при МП -70 мВ i бьлып в1д'емних (мал.1.А). Як уже вЦмтчалось, вважаеться, що В1дсутшсть потешиалозалежносп характеризуе конкурента сть блокування, а посилення блокуючого ефекту з гшерполяризагрею мембрани говорить про появу канал-.; блокуючого компонента. Для можливосп б1льш детально вивчити дно TEA в облает! додатнЬс МП був використаний внутриклтшний розчин з Сы+ як основным катюном. Вольт-амперна характеристика, яка була одержана в таких умовах, показуе шдсутшсть потенщало-залежносп дi'i TEA в д1апазощ в1д 0 до -50 мВ, потенциалозалежтсть блокування при бшшй гшерполяризади мембрани i практично повну юдсуттсть блокування при додаттх МП (мал.1.Б i В).

KpmepicM наявносп в дп речосини каналоблокуго чого компонента е посилення блоку теля попередньо'£ активацн рецептора, i поступове зменшешш його при збьлыпешц штераала м!ж кондицюнугочою (першою) i тестуточою (другою) аплисащями АХ в napi (Ascher et al., 1978). В наших .умовах нарт АХ-струми викликались короткими (20-100мс) йонофоретиташми аплисащями АХ з мнпмальнигш ifrrepпалами м!ж ¡мпульсами приблизно 0,5 с. Експерименти проводились лише на тих нейронах, у котрих була в1дсутня десенсигизагуя НХР. Досидження дп TEA (Г10'3 - 5'10'5 М/л) проводились при piainix МП (в1д +10 до^ -70 мВ)с, в жадному з досл1джених нейрошв (п = 7) не було знайдено AOCTonipnoI pismmi в амплитудах м1ж першим та другим импульсами, що говорить на кориегь конкурс!иного мехагазму дп TEA

Ще одшею р1зницею в дii' конкурентних i каналоблокатор1в е ix вплии на час жиггя «¡дкртого стану йонного каналу - якхцо nepuii nirtK не вплипшоть на нього, то друп повишй скорочувати його (Skok et al., 1989). Визначити час жита в1дкритого стану йонного каналу

можна piair. ш методами. Ми використали метод спектрального анализу флугауащй АХ-струму, викликаного довгою аплпсацисю АХ.

Спехтри потужносп флyкгyaцiй АХ-струму, одержат в1д 4 КгМтин, задов1лыю апроксимуиались одним лорешцаном. Среднш пас житгя п1дкритого стану ймшого каналу НХР при -70 мВ, пизначений по частой зрюу цього лорешцана, в нормальному розчиш складов 10,0J^2,0 мс. В npiicymocTi 2*10'5 М/л TEA практично не в1дбувалось тяко!' змши - 10,2 1-3,6 мс, що теж вказуе на конкурентний тип блокуючо1 дп TEA.

Для пор1вняння на двох нейронах цим же методом було досл1джено ддю гексиметошю. Для цих нейрощв середт часи в?дкритого стану йонного каналу дор1вшовали 23,3 мс и 11,8 мс в нормальному розчиш, i змсншувались до 7,5 мс i 2,9 мс в присутносп 20 мкмоль/л i 30 мкмоль/л гексаметошю в1дпов1дно.

Перев1рка впливу TEA на АХ-струми при ршгих значениях йонофоретичного струму проводилось при р1зних piBirax МП. Виявилось, що d ycix трьох областях МП, видшших при доаидженга потешцалозалежносп дн TEA (область додаттх МП, область В1Д 0 до -50 мВ та область бьлып шд'смних тж -50 мВ), характер залсжносп "доза-ефект" говорим про конкурентний тип взасмодн блокатора з НХР, осгальки з 19 вЦведень, одержоних при ршних конценгращях TEA (шд 10 до 100 мкмоль/л), лише в трьох випадках (один при -70 мВ i два при -50 мВ) не було достошрного витискання блокатора aroiricroM (мал. 2). Треба особливо звернуги увагу на поведнжу залежиосп "доза-ефект" в облает! потешралоэалежного блокування. В координатах Лайну1вера-Берка розташування точки перетину кош-рольного графпса i графша, одержаного в присутносп TEA (МП -70 мВ), характерно для чисто конкурентного мехагазма блокування. Значешш точки перетиНу по ОХ склада с l,55J-_l,fi мкА1 (п=6).'

А нА"'

о

*

100 200 мкА"'

в

В

3

• -

V

20 АО нА

Мал.2. Залежи!сть блокуючо! Ai'i TEA (20 мкмоль/л) В1Д дози АХ при мембранному потенц1ши -70 мВ. А - 1 - граф]'к. "доза-ефект" побудований для одше! клггини в контроле 2 - те ж, але в присутнлсп блокатора. По Bici абсцис - обернет величины струм1в адлжаци; по Bid ординат,- обернет величини амплггуд АХ-струшв. Трикутниками позначен! точки перетину граф!к1в 1 и 2 для шших нейрогав. Б - АХ-струми, одержат в контроле та в присутносгп блокатора для максималыих (зл1ва) i миимальних (зправа) значень йонофоретичних струмхв. В - залежшсть величины пригшчення Я-1 шд величйни йоиофоретичного струму.

Таким чшгом, незважаючи на потенщалозалежтсть блокуючоТ Aii, ця ,уя у noix трьох досл1джених областях МП, BiporiAHO, е конкурентною. Одним з можливих нояснень потенщалозалежного конкурентного блокування може бути зб1лыпення спор!дненост1 центру зв'яэувадшя АХ до TEA з гшерполяризащею мемОрани. Найкращим способом визначення константа спор1дненосп (або iHni6iTopHo'i константи - KJ с граф!чний метод Диссона (Dixon, Webb, 1964), який дозво.\яс в один i той же час виэначиги i мехатзм

взаемодн блокатора з рецептором. На мал.З показан) приклади таких граф5юв, одержаних для р1зних нейротв при трьох pi3m<x МП ( + 10, -30, -70 мВ). Рсзташування точки перетину двох прямих в^дносно Bici абсцнс, вказуе на тип взаемодн. Яйцо точка перетину лежить вшце Bici абсцис, то це конкурентна, а ягацо на Bici - то неконкурентна взаемодхя. К( чисельно дор!вшос значению точки перетину по Bici абсцис, взятому 13 звороттм знаком. Характер одержаних bîa 10 китин залежностей вказуе ка конкуренгний тип взаемодн TEA з НХР, осшльки в ycix випадках точка перетину двох лшш лежала вище Bici абсцис. Значения точок перетину по Bici OY при МП +10, -30 i -70 мВ складали 1,18±0,43 нА'1 (п=4), 1,62^0,96 нА"1 (n = 3) i 0,61 +0,37 нА'1 (n=3) BiAnoEiAHO. Треба В1дзначити, що обернет величини цих значень глдпов^ають максим альнш АХ-вгдповщ i в данному вхтадку складають 0,85 нА, 0,62 нА i 1,64 нА BiAnoBiAiro, що дуже близько до реалымх величин максимальних АХ-струм1в. Величини Kj для МП +10, -30 i -70 мВ складали з]дшлпдно 65,8 +12,6 мкмоль/л (п — -i), 26.3 + 5,8 мкмоль/л (n =3j i 13,9^1,6 мкмоль/л (il-3). Таким чином, на ochobî поведноси залежноеп "доэа-ефект", одержано!' ргзними способами, можна скаоати, що механизм пзаемодп TEA з. НХР е конкурентним, але константа i нгиб i ров ai гня залежить В1д МП.

Мехагазм Ait ПХ. ПХ - шдомий алкалсид, широко використову-вавшийся в медицин! (Машковский, 1977). В наших умовах в концен-траци 2*10'6 М/л ПХ обернено зменшував амплиуду АХ-струму до 43Jil9% (n =7) BiA контрольно!' при -50 мВ. Вплие МП на блокугочу здаттсть ПХ був дуже схожий на вплив TEA Так само при МП bîa 0 до -50 мВ його блокуточа Aiя була потенщалонезалежна i лише при бмьнпй гшерполяризацн посилювалась 1з зйлыленням МП. Амплитуда АХ-струму при МП -90 мВ с клад ала лшпе 63% величини, оч1кувано'£ для потешналонезалежного блокування. Аналгэ вольт-омперпо!' прово-

дився як при р1зних кондеигроцгях ПХ (в1д 0,5 до 10 мкмоль/л), так 1 при р1зних дозах АХ, але цринципово! р1зкшц при цьому не було.

Схожим на ТЕЛ був 1 вплив ПХ на час життя в1дкритого стану йонного каналу НХР. Д\я п'яти нейрогав, при -90 мВ, були одержат спекгри потужиост*1 викликаних АХ флуктуащй струму в нормальному розчиш 1 в присутносп. 2 мкмоль/л ПХ. Середтй час життя в1дкритого стану йонного каналу в нормальному розчит становив 14,0*1,7 мс, а в присутносп ПХ вш був 13,7+2.0 мс (п =5).

Дооидження залежносй блокуючог дй ПХ в!д попередньо! активацп ЫХР дало такий результат. В б досмдох ¡з 12 величина пригнмення другого АХ-струму (1г-12)/11, (де ^ - амплиуда першого, 12 - амнлггуда другого АХ-струму) в коитро.-и перевшцувала 0,1, 1 зменпгувалась при зб!льшешп пггервала часу м1ж аплжащйми АХ, що вказувало на десенсигизащю рецептор!в. Додавання 2 мкмоль/л ПХ виклихало посилення пригшчення другого АХ-струму. Величини поспйно! часу вЦтворетш друг ого АХ-струму в контрол1 \ при ПХ в кожному дослад майже не В1др1знялись м1ж собою 1 в середньому становили в1дпошдно 11,3*3,6 с 1 12,3*4,6 с (п~6). В тих тести експерименгах, де в контроле не було виражено'1 десенситизацП, лише в диох достцдах до давания блокатора викликало эначне зменшення другого АХ-струму. Величини пригшчення (1г12)/1, складали 0,30 1 0,43 при штервал1 часу муж 1мпульсами в 1 секунду v змешпувались при його з61льщеннз - постшш часу т&иовлатя другого АХ-струму складали 19,7 с та 3,7 с, що схоже на посттйш часу в1дновлення другого АХ-струму при десеисиизацн рецепторов. В рент експерименпв додавання ПХ, при значному блокуючому ефекп, не викликало приппчення другого АХ-струму в поршнянш з першим.

Визначення впливу р1зних доз АХ на блокуючу здатшеть ПХ (2*106 М/л) проводилось при МП -50 мВ (область потенщало-незалежного блокування) 1 при МП 90 мВ (область потенциало-

залежного блокування). I при -50 мВ, 1 при -90 мВ 1з збмыпенням дози АХ приггачешш АХ-струшв ПХ змешпувалось. Граф1ки залежносп "доза-ефект" в обернених координатах добре апроксимувались прямими, котр1 в 12 инпадках 13 13 перепшались в области нуля в1а абсцис. С ередтп значегага абсцис точок перетину графМв для МП -50 1 -90 мВ складали 2,99^.2,65 мкА"1 (п = 8) 1 9,50^.4,81 мкА"1 (п=5). Дгя ПХ в конценграцн 5 мкмоль/л (-90 мВ) дало схожий результат, а значения абсциси точок перетину складало 0,03^1,77 мкА"1 (п=4).

Методом Джсона було досл1джено 9 нейрошв (4 при -30 мВ 1 5 при -90 мВ). У вс1х випадках одержаний характер залежносп вказував на кош<уренгний тип взаемодп ПХ з НХР. Середт значения К, и'мкмоль/л при МП -30 мВ и -90 мВ складали в1дпов!дно 0,62^Ь0,15 1 0,28^1^0,08. 1'1зшщя була статистнчно достоверна.

/\,1и пох1диих та аналог!» 1ТХ, В наявшй л1тератур1 описано дно лише одного 110x1 дного ПХ - лтопаннгу (Vо\-о ее а1., 1984). В наших експериментах Пули використат шшдш ШМ1820 та 1ЕМ1821, яга яяляють собою четверташи aмilш ¡3 збь\ьшеними, поршшпю з ПХ, розм!рами молекул. 1ЕМ1820 являс собою Ы-мет1ллох1дне, а у 1ЕМ-1821 один з азоттв зв'язашш з шестиатомним вглеводневим гильцем.

Обидв1 речовшш обернено блокупали АХ-струми. Ефективтсть блокування носилювалась гз збшлиенням розм1р1в молекули блокатора. Величини €Сдо для ПХ, 1ЕМ1820 та 1ЕМ1821 складалн В1дпошдно 2, (№±0,38 (п =3), 1,6-1±0,41 (п-4) I 0,С5_±0,1? (п=3) '(все в мкмоль/л). ГПдтримуваний МП дор1вшоиаы -50 мВ.

Перевфка мехашзму блокуючо'1 дн пох1дних ИХ проводилась за допомогою вищезгадуваних методтчних шдход1п. На баз1 аналшу частотно'1 залежносп 1 зачежиоеп "доза-ефект" було встановлено, що обидв1 речовшш конкурентно блокують нейроимлып НХР. Анализ вольт-амперно! показав схож!сть дн 1ЕМ1820 1 1ЕМ1821 з д1ею ПХ та

нА"1'

А 20 •у/

10 Xs

конц.ТЭА,мкМ

20 40 60 60

Мал.3. Вплив мембранного потенщалу на константу дисощацп в реакцп взаемо-ди TEA з шкотиновим xoai-

30 60 90 120 норецептором (координата концХЭА.мкМ Диксона). Шдтримуват на

мембраш погенщали -70 мВ (А), -30 мВ (Б) и +10 мВ (В). По Bid абсцис - конценгращя TEA, по Bici ординат - обернет величини ампл1туд АХ-струм1в. 1 - графики, одержат при струм! аплжацп, викликавшем миомальт BiAnoBui, 2 - при збьльшент струму аплжацп в 3,5 рази.

Мал.4. Перев1рка можливосг! маскування канального компонента конкурент ним при аналгэ1 залежносп "доза-ефект". 1 и 2 ■ графики "доза-ефект", побудова-ш по реальним даним, одержа-ним в1д одте! клтши в контрол! V в присугносп пахикаршна (? мкмоль/л) при мембранному по-тешцал! -90 мВ. 3 - графж, зображуючий чисто конкурент-ний компонент блокування. 4 -график зображуючий змнпане блокуваня.

TEA - при МП бЬлыц шд'емних шж -50 мВ блокуюча здатшсть посилювалась, хоча i не так знатно як у ПХ та TEA.

OKpiM 1ЕМ1820 та 1ЕМ1821, буди доомджет речовини, яга лише за загальною структурою иагадуваш ПХ. Це IEM1788, IEM1787 та IEM1773. Два з них, 1ЕМ1787 (шрол1з1дш) та IEM1773 (N-метшпрол1з1дш), в концентрацшх 10"5 - 10"4 М/л в iiepini хвилнни перфузп викликали в нейронах ВШГ щура струм. Осильки цей струм не вишшан якщо в розчит перебував тубокурарин (5*106 М/л), в1ропд1пше за псе, що IEM1787 i IEM1773 активували НХР. А\е через галька хвилин шсля введошш речовин в розчин, ïx акгивуюча д1я припинялась. При цьому АХ-струми ставали Memni по амплггуд1, шж були до введения IEM1787 та IEM1773, Тобго, ni речовини з активaTopiB НХР перетворговались на блокатори, причому блокатори, виходячи з шьшзу залежност! "доза-ефект", центру зв'язування АХ, Bei ni факти також св1дчать на корпеть того, що речовини ряду ПХ можуть ефективно пзаемодЬгш з центром зв'язування АХ.

ОБГОВОРЕННЯ.

В наших досл1дах особлипу увагу було придхлено вгошву триметафану, тубокурарину та гексаметош'ю на залежтсть "доза-ефект", пк клаенчпому тесту для виэначення механизму блокування. Осгальки значения числа Xwa показувало, що для активування одного НХР нейротв ВШГ щура достатньо одте!" молекули АХ, виявилось можливим використати для анализа координаты Лайну1вера-Перка, Графши, побудовага для вотденазваних речовин, добре апроксиму-валися прямими, що шдтверджувало можлшнегь використашгя цих координат для анализу механизму дн блокатор1в. Bei тести вказуиалн, на те, що триметафан конхурентний, а тубокурарин i гексаметотай -канальга блокатори. Таким чином, у нас не було причт от сумгаватися

в можливосп подалыпого використшшя коорди нат ЛайнутераБерка для визначення механизму да штих блокатор1в.

Зпдно класичних уявлень, конкуренте блокування не залежить BiA МП (Skok, 1987), Досыдження да TEA (20 мкмоль/л) у областт додаттх МП показало, що блокування, НХР у щй обласп практично не було. В той же час блокуючий ефекг дри в/д'емних МП був достатньо великим. Це могло б бути доказом чисто канального мехатзму блокування. Але характер змши кривих "доза-ефект*" при в1д'емних МП, вказуе на конкуреюний мехашзм дн TEA. Навиъ яйцо припустит, гцо блокування не чисто конкуренте, а зм1шане, все piB-но, в облает!. додаттх МП блокуючий ефект, з точки зору класичних уявлень, не повинен був повтетю зникнути - конкурентний компонент првинен був залишитись. Повне ж зникнення блока свЦчить про можлктсть потенциалозалежносп конкурентного блокування.

Одним з можливих пояснень потенщалозалежносп конкуретгг-но! да TEA може бути змша спор1дненост! рецептора до блокатора в залежносп в!д МП, що i було годтверджено методом Джсона. Зпдно цьому тесту, при МП +10, -30 и -70 мВ TEA конкурентно блокував нейрональт НХР. Величина константи ппиб1рування сильно залежала BiA МП i зметпувалась з гшерполяризащеш мембрани.

Таке припущеняя повтетю гидтвердилссь i при доамдженш ПХ та його пох1дних, У ПХ також було знайдено иотенщалозалежшеть конкурентно! дн, яка вгдпошдала зм!т констанги шгиб!рування.

Однак, залишалось припущення, що каналоблокуючий компонент, який, з'являеться в да ПХ i TEA при МП бииып в)д'смних шж -50 мВ, i обумоылюючий потенщалозадежтсть да блокатора, може маскуватися конкурентним i не проявлятиси в TecTi "доза-ефект". Д\я перешрки щс! ппотези була змодельована наступна ситуащя. Як приклад були взяп реальш дант, одержан! для ПХ (2 мкмоль/л) при МП -90 мВ. В координатах Лайну^вераБерка дан! одержат в контро-

м (мал.4.1.) ! в присутносп ПХ (мал.4.2) добре апроксимувалися прямими, котр! перетинались в райот нуля в1а абсцнс. Як вже говорилось вище амхьитуда АХ-струму, одержаного при максимальному значеннт йонофоретичного струму, в присутносп ПХ складала 63% в)д очжувано! для потенщалонезалежного (тобто чисто конкурентного) блокування. 1з цього неважко розрахувати в1ропдну величину АХ-струму кошсурентнсго компонента для такого ж йонофоретичного струму. Пряма, яка зображуе цей чисто конкурентний компонент блокування повинна пройти кр1зь розраховну точку 1 точку перешну контрольно! прямо!' (мал.4.1) з тс'ю ординат (Уильяме, Уильяме, 1976). На малюнку ця пряма позначена цифрою 3. Теперь визначим як повинна пройти пряма яка описуе змппане блокування, що включе в себе розрахований нами конкурентний компоненг 1 канальний. Для останнього виомо, що при максимальному йонофоретичному струм! вш додатково приггачуе амптитуду конкурентного компонента на 37% (100% - 63%). Вклад канального компонента при шших йонофоретич-них струмах буде змпповатись пропорщйно кхлькосп в!дкритих йон-них кана^йв, тобто пропорщйно амплпуд! струму, розраховано! для чисто конкурентного блокування. Одержан! таким чином величтш АХ-струмш при р!зггих струмах ашикацн добре апроксимувалися прямою (мал.4.4). Якщо було б в^ршгм припущення, що каналоблокуючий компонент в тест! "доза-ефект" може маскуватися конкурент-ним, то прям! 2 ! 4 не повинт були б сильно в!др!знятися одна в)д одно!. Як бачимо (мал.4), р!зниця дуже значна. Точка перетину контрольно! прямо! х прямо! розраховано! для зм1шаного блокування значно зм!стилася вл!во ! достоверно вказус на наявшеть в да блокатора каналоблокугочого компонента.

Таким чином нами було встановлено, що ефектипшеть блокування центру зв'язуватш АХ, або конкурентного блокувагаш також, як ! блокування йонного каналу, може заложати шд неличини МП.

Вищезгадупаш факта i припущення шдтпсрджують морфоло-пчш досл1джешш по виявленшо розташування i мехашзму акт ив ув алия НХР (Unwin, 1993, 1995). Центр зп'язувашм АХ нейрональногс ЫХР siропдн1ше за все знаходиться не на поиерхш, а в товпц рецептора, що ишчкае з потенциалозалежносп взаемодн конкуретгг-них блокаторхв i заложносп величшш блокуючо'{ да речовин IEM1821, IEM1820 та ПХ в1д po3MipiB ix молекули. В1дсуппст1. потешрало-залсжносп блокуючо? дi'i тримстафапу i суругатоксину можо бути пояснена надто великим?! розм'фами молекул цих речовин. Це ускладнюе 'кожлишсть ix занурешш в тошцу мембрани, однак не перегакоджас ефективЕЮ блокувати ИХР заважаючи АХ шдходити до центру його зв'язування.

ВИСНОВКИ.

1. За допомогою методу "петч-клемп" п коифпураци "щла KAiTHiia" були доамджет мехатзми дн класичних ганглюблокатор1в -тетрает1\амошя (TEA), пахикарпша (ПХ) та його пох]дних - на HiKOTHHOBi холшорецеатори (НХР) нейротв верхнього шийного симпатичного гоштия ; щура. Для визначення типу блокувшшя, викликалого цими речовинами, його поршнювали по ряду показншав (потет^алозалежншть, вплив на залсжтсть "доза-ефекг" i T.i.) з блокуванням в1домим конкурентним ганглюблокатором триметафаном, з одшс! сторони, та в1домими блокаторами йо!Шого каналу нейрональних НХР - гексаметошем i тубокурарином,

2. Завдяки визначенню коефццента Xuva встановлено, що для активувашш одного НХР нейрошв верхнього шийного ганг/ия щура в наших умовах достатньо одшв! молекули ацеплхол1ггу (осюлыси число Х1ла дор1вкювало 0,9_£0,1), що дозволило використати для визначення мехашзма блокуючо! дн речовин анал!3 залежносп "доза-ефекг" методом Лайну1вера-Берка.

3, Ha 6a3i cepi'i теепв (ана/из частотно? заложносп, залежностт блокуючо!' да В1д мембранного погенщалу (МП);. пор1вняння часу жштя вЦкритого стану йонного каналу в HopMi та в присутносп блокатора, а також анализ залежносп "доза-ефект" методами Лайну1вера-Берка, Дшсона i А.-теста) встановлено, що TEA конкурентно блокус нейрональш НХР. Вперше виявлена залежшсть конкурентно! блокуючо! дп вЦ МП. Методом Диксона показана залежшсть константа шгиб1рування (К() в1д МП. Величини К, при +710, -30 та -70 мВ становили BiAnoBiAno 65,0*12,6 мкмоль/л, 26,3*5,8 мкмоль/л та 13, 9*1,6 мкмоль/л, що вказуе на змшу сиориненосп рецептора до блокагора в залежгюсп в!д величини МП.

• 4. За допомогою тих же тёспв був дослщкений мехашзм блокуючо! дп на нейрональш НХР шшо! речовшш - ПХ. Встановлено, що ПХ, як i TEA, с конкурентним блокатором, KpiM того його блокуюча д1я також залежить BiA МП. Середш значения К( при МП -30 мВ га -90 мВ складали в1дпов1дно 0,62*0,15 мхмоль/л та 0,28*0,08 мкмоль/л. Показано, що ПХ може сприяти десенатзацн рецепторов,

5. При досмдженш Ai'i на нейрональш НХР пох1Аних ПХ знойдена здатшсть деяких речоиин (IEM1773 та IEM1787) здШснювати акгивуючу, i сл1дом за цим блокуючу, Д1Ю на НХР, що також гпдтверджуе можлив^сть речовин ряду ПХ ефективно зв'язуватись з цешром зв'язування АХ у НХР. На речовинах ряду: ПХ, IEM1C20 та IEM1821 знайдено ефект посилешм блокуючо! дй' при зб1лыденш poaMipiB молекули блокатора.

6. Зроблеио припущення, що центр зв'язування АХ нейронального НХР розтанюваний в тошщ рецептора i, таким чшюм, вплив МП на блокуючу Д!Ю коикурентних блокаторгв може залежатн BiA швидкост; дисощацн молекули блокатора, котра при шаемодн з центром зв'язувашш АХ запурюеться в товщу мембрани i таким чином тдпадае iiiA нилин елокгричного ноля.

7. Bci дооиджет речошши, що конкурентно блокували нейроналыа НХР (триметафан, TEA, ПХ, IEM1820, IEM1821) мали мпамальт розьнри молекули, перевищуюш розкнри профиуя йонного каналу в м1сщ переважного зв'язування блокатор!в йонного каналу(б, Г8,3 А). Досл1джеш конкурентна блоктори могли бути як азотвмпцуючими, так i арковмнцуючими i могли мати як повний так i неповний заряд.

ПЕРЕЛ1К РОБ1Т, ОПУБЛ1КОВАНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАЦИ!

1. Пурныш, С.Л., Войгенко С.В. Механизм действия иахикар-пина на никотиновые холинорецепторы нейронов симпатического ганглия крысы// Нейрофизиология.- 1989.- 21, №5.- С.701-704.

2. Voiteako, S., Purnyn, S., Oraeltchenko, 1., Dyadyusha, G., Zorov,

B., Brovtsina, N., and Skok V.I., Effect of ( + )-sparteine on nicotinic acetylcholine receptors in the neurons of rat superior cervical ganglion// Molecular Pharmacology.- 1991.- 40, P.180-185.

3. Voitenko, S.V., Bobrishev, A.U., and Skok, V.I., Effect of tetra-ethylummonium on nicotinic acetylcholine receptors in rat sympathetic ganglion neurones/ZMolecuiar Neuropharmacology.'- 1993.- 3, P. 153-160.

- 4. Войгенко C.B., Пурнынь С.Л., Скок В.И. Действие d-спарте-ина на i ппсотиновые холинорецепторы нейронов верхнего шейного ганглия крысы// Нейрофизиология/Neurophysiolcgy.- 1993.- 25, №4.-

C.266-272.

-5. BoHxeiiKO С.В., Гмиро В.Е., Аргеменко М.И., Скок В.И. Блокирование нейрональных холинорецепторов производными d-спарте-ина// Нейрофизиология/Neurophysiology.- 1994,- 26, №4.-С.266-269.

6. Войтенко С.В. Потенциалозависимое действие тетраэтил-аМмония на никотиновые холинорецепторы нейронов верхнего шейного ганглия крысы// Нейрофизиология/ Neurophysiology.- 1995,27, N»1.- С.63 66.

Войтенко C.B. "Механизм конкурентного блокирования никотиновых холинорецептороо нейронов верхнего шейного ганглия крысы". Диссертация на соискатге ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.05 - "биофизика", Институт физиологии им.Л.Л.Богомольца HAIT Украшал, Киеи, 1995.

Защищается б научных работ. Методом "пэтч-клэмп" установлен конкурентный механизм блокирования нейрональнмх iгикоттюных холшюрецентороБ тетраэтиламмоннем, пахикорнином и его производными. Показано, что конкурентное блокирующее действие может зависеть от мембранного потенциала. Данный эффект вероятнее всего связан с изменением сродства рецептора к блокатору в зависимости от мембранного потенциала.

Voitenko S.V. "The mechanism of competitive blocking action on nicotinic acetylcholine receptors in rat cervical ganglion neurones". Thesis on candidat degree (PhD!, spetiality 03.00.05 - "biophysics", Bogomoletz Institute of Physiology NAN Ukraine, Kiev, 1995. G articles. Competitive action of tel.raethylanmionium, pacliicarpine and its derivatives on nicotinic cholinoreceptors of rat cervical ganglion neurones were found using patch-clamp recording. It was shown that the competitive blocking action may be voltage-dependent. Peril ops this elfect is connected with the decrease in velosity of dissociation of blockator from receptor.

KAi040ni слова: шкотнношгй холшорецептор (ИКР), конкуренте блокування, 1 етраетмамоша (TEA), пахикаршн (ПХ).

Заказ _Тир. и>о эsa. 19Э5~_г.Укрспец^онтажпроект