Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Медико-биологическое обоснование использования моделей ASPICULURIS TETRAPTERA и SYPHACIA OBVEUTA для поиска и создания новых препаратов

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Медико-биологическое обоснование использования моделей ASPICULURIS TETRAPTERA и SYPHACIA OBVEUTA для поиска и создания новых препаратов"

^ £ О Д ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КШТЕТ

САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

ги.'Т

" 1 ■1 ' • ■': ' РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ И ТРОПИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ имени Е.И.МАРЦИНОВСКОГО

На правах рукописи

ЛЫКОВА НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОДЕЛЕЙ АБРГСШШБ ТЕТ{?АРТЕКА И БУРНАСМ ОВУЕЬАТА ДЛЯ ПОИСКА И СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.19 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1994

Ра5ота выполнена в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Ыарциновского Госкомсанэ.пидкадзора России.

Научные руководители:. доктор медицинских наук Лебедева Ы.Н. кандидат биологических наук Тимонов Е.В.

Офицальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Озерецковская H.H. доктор ветеринарных наук, ведущий н.с. Успенский A.B.

Ведущая организация : 1-я ША им. Сеченова

Защита состоится ОСгГий,-ёфл 1994 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.074.39.01 при Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Ыарциновского .по адресу: 119830, г. Москва, ул. Малая Пироговская, д.' 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан 1994г.

Ученый секретарь специализированного совета

Фролова A.A.

Актуальность темы

Среди широко распространенных нематодозов на первом месте стоит энтеробиоз, на долю которого в СНГ приходится 67,1' выявленных случаев гельминтозов ( Сергиев В.П. и соавт., 1989). Несмотря на достигнутые успехи в снижении заболеваемости паразитарными болезнями, число их превышает количество зарегестрированных случаез вирусных и бактериальных заболеваний ( Сергиев В.П. и соавт,1989).

В настоящее время достигнуты определенные успехи в химиотерапии нематодозов, синтезирован ряд новых противонематодных препаратов, таких как мебендазол, медамин, альбендазол и др., которые выгодно отличаются от препаратов первого поколения ( сантонин, пипе-раэин) по простоте применения и низким дозировкам. Однако, новые препараты, главным образом карбаматбензимидазолы, обладают тяжелыми побочными эффектами - в частности, тератогенным, а при длительном курсе - лейкопеническим, в связи с чем поиск новых препаратов остается актуальной проблемой.

Поиск новых противонематодных препаратов производится на моделях трихинеллеза, трихоцефалеза, ниппостронгилеза и др. Между тем, эти модели трудоемки, поэтому для поиска препаратов важно иметь более простую, с коротким циклом развития, модель. В этом плане одной из удобных является модель оксиурозов - аспикулуроза и сифациоза.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы было дать медико-биологическое'обоснование пригодности моделей оксиурозов для поиска противонематодных препаратов.

В соответствие с поставленной целью нами решались следующие задачи:

1. Определить параметры моделирования оксиурозов: 1.1 Выяснить сроки развития яиц А.1е1гарЬега и Б. оЬуе1аЪа до инвазионной стадии в различных средах;

1.8 Установить сроки послеяйцевых линек и достижения половой зрелости паразитами АЛеЬгарЬега и Б.оЬуе1а1а

1.3 Проследить динамику элиминации паразитов после дегельминтизации современными противонематодными средствами.

2. Дать полную химиотералевтическую характеристику медамина, , альбендазола и эмбовина.

2.1 Изучить временную ( для медамина ) и дозовую зависимость химиотерапевтического действия известных противонематодных препаратов - вдьбендаэола, медамина, змбовина в сравнительном аспекте.

2.2 Количественно оценить эффективность медамина, альбендазо-ла и змбовина на разных стадиях развития паразитов АЛе1гарЬега и 5.оЬуе1аЬа.

3. Провести скрининг новых препаратов среди патентночистых соединений с потенциальной активностью, относящихся к оригинальным рядам бензкмидазолов и Оензамидов.

4. Оценить пригодность метода люминесцентной микроскопии как

%

экспресс-метода для изучения характера действия препаратов на организм оксиурид в динамике.

Научнач новизна Получены стабильные модели энтеробиоза на основе определения сроков эмбрионального развития и послеяйцевых линек А.Ье1гар1ега и 5.оЬуе1а1а и уточнения сроков достижения паразитами обоих видов половой зрелости.

В сравнительном аспекте дана полная количественная оценка эффективности медамина, альбендазола и змбовина на разных стадиях развития АЛе1гарЬега и 3,оЬуе1а1а.

Проведен скрининг новых соединений и среди них отобраны высокоактивные препараты, перспективные для широких химиотерапевтичес-ких исследований. Проанализирована зависимость активности от химического строения в патентночистых рядах бензамидов'и бенэимидазо-лов.

Определены условия флуорохромирования целостной структуры паразитов и изолированных органов и описан характер люминесценции ик-тактных А.1е1гар1ега и 5.оЬуе1а1а и после воздействия препаратов, и на основе этого метода впервые показан характер повреждающего действия медамина на этих видах гельминтов.

Практическая значимость работы Предложены две модели оксиуро-зов - А^еЬгарЬега и 5.оЬуе1а1а для проведения скрининга новых про-тивонематодных препаратов, а также для их широкого доклинического химиотерапевтического изучения.

Экспериментально обоснована целесообразность одноразового применения медамина для лечения знтеробиоза, что позволило внести изменения в инструкцию на применение медамина, утвержденную Фармакологическим комитетом 29 апреля 1993 г.

Положения диссертации, выносимые на заддату

1. Модели А.1е1гарЬега и Э.оЬуе1аЬа пригодны для поиска проти-вонемзтодных препаратов.

2. Метод люминесцентной микроскопии (как один из методов) позволяет определить в динамике повреждающее действие препаратов на внутренние органы паразитов.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы.доложены и обсуждены на научной конференции профессорско-преподавательского состава Курского государственного педагогического института' (11-12 апреля. 1992г), на Всесоюзной конференции "Легочные и желудочно-кишечные нематодози человека и животных и меры борьбы с ними" (Москва,5-6 октября 1993г).

Публикации По материалам диссертации Опубликовано 5 печатных работ в центральной печати. Сдано в печать 3 статьи.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глаз собственных исследований, общего заключения, выводов и списка литературы.Работа изложена на /50 страницах

машинописного текста, включая g таблиц, 22 рисунка. Список литературы содержит У/ отечественную и ¥0 иностранных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Острицы были получены нами из толстых кишок экспериментально зараженных белых мышей.

Для изучения скорости развития яиц в различных средах их помещали при 37 С в физиологический раствор и в водопроводную воду.

При изучении эмбрионального развития оксиурид яйца помещали в висящей капле воды при 37°С в термостатный столик и вели наблюдение до развития в них личинки.

При изучении сроков линек и развития паразитов до половозрелой стадии от беременных самок остриц выделяли яйца и инкубировали г воде при 37°С в течение 24 часов до развития в них личинки, после чего по 100 яиц вводили интактным мышам per os.Для установлена сроков линек животных вскрывали через каждые 24 часа. Время полового созревания остриц определяли по содержанию в матках у самок • паразитов созревших яиц, способных к дальнейшему развитию во внешне! среде.

При изучении спонтанного заражения молодых мышей-реципиенто весом 10-12 г подсаживали к половозрелым мышам-донорам с интенсив ной инвазией. Животных вскрывали на 13, 20 и 27 дни после подсадк и подсчитывали количество гельминтов для изучения равномерност распределения инвазии. При лабораторном способе ведения модели мы шей заражали по 100 инвазионных яиц на мышь и вскрывали на 11-1 дни инвазии для подсчета половозрелых гельминтов.

Для изучения характера люминесценции в норме и после действ? химиопрепаратов червей флуорохромировали в растворах акридиново!

оранжевого, родамина С, флуоресцеина натрия и др.

Растворы флуорохромов готовили по общепринятой методике из ■ концентрированных растворов, порошок для очистки предварительно пере крис таллизо вывали.

Продолжительность флуорохромирования зависела от характера изучаемых структур и колебалась от нескольких секунд до 20 часов.

При изучении целостной структуры паразитов прижизненное окрашивание проводили в 0.01Х растворе акридинового оранжевого в течение 18-20 часов при 37°С. В тех случаях, когда планировалось изучение отдельных органов или их систем, мы применили разработанную нами методику, которая позволяет очень быстро производить их окраску. Для этого нужно, очень осторожно разрезав кутикулу, освободить внутренние органы паразита. В этом случае они в течение 2-4 минут прокрашивались 0,001%-ным раствором акридинового оранжевого.

После окрашивания паразитов отмывали физиологическим раствором, что значительно снижало выцветание препарата под действием возбуждающего облучения. Препараты герметизировали окантовкой покровного стекла вазилиновым маслом, что позволяло сохранить его в течение нескольких часов для проведения всех необходимых исследований и фотографирования.

При фотографировании длительность выдержки зависела от яркости и чувствительности фотопленки и колебалась от 5 секунд до 4-5 минут.

При изучении скорости выведения паразитов после введения хими-опрепаратов ( медамин в дозе 100 мг/кг; альбендазол - 100 мг/кг; змбовин - 50 мг/кг) животных вскрывали через 24, 48, 72, 96 часов после последнего введения и подсчитывали количество гельминтов по сравнению с таковым у животных, не получавших препаратов.

При изучении химиотерапевтической активности препаратов их вводили мышам ( по 20 животных в каждой группе) в виде взвеси в крахмальном клейстере в пищевод при помощи канюли в различных дозах: медамин от 5 мг/кг до 1000 мг/кг в различных схемах; альбенда-зол от 5 мг/кг до 500 мг/кг; эмбовин от 1 мг/кг до 100 мг/кг.

Животных вскрывали на 3 день после введения препаратов и подсчитывали количество гельминтов по сравнению с контролем. Контролем служили зараженные животные, не получавшие препаратов.

Результаты химиотерапевтических исследований обрабатывали статистически методом пробит-анализа по Личфилду-Уилкоксону.

В исследованиях использовали микроскопы ЛШАМ-ИЗ, МБИ-15.

2. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ АБРЮЛЛШБ ТЕТГгАРТЕ!^ И БУРНАС1А ОВУЕЬАТА , МОРФОЛОГИИ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ ОКСИУРИД И УСЛОВИЙ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИНВАЗИЙ ЭТИХ ГЕЛЬМИНТОЗОВ 2.1 ИЗУЧЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ А.ТЕТ1?АРТЕ[?А И З.ОЗУЕЬАТА

В наших исследованиях уточнены сроки эмбрионального развития яиц АЛе1гар1ега и 5.оЬуе1а1з до инвазионной стадии. •

Результаты исследований по изучению сроков развития яиц оксиу-рид до инвазионной стадии показали, что в физиологическом растворе при 37° С яйца АЛеЬгар1ега и Б.оЬуеШа развиваются почти вдвое дольше ( 45-48 часов для яиц АЛеЬгарЬега и 35-40 часов для Б.оЬ'/егаЬа ), чем при содержаний их в водопроводной воде при той же температуре ( 23 -24 часа для яиц А.ЬеЬгарЪега и 20-22 часа для яиц Б.оЬуеШа) . Указанные различия условий содержания не отразились на жизнеспособности яиц - процент приживаемости оказался одинаковым и в том, и в другом случаях составил 95-97 X.

Таким образом, в лабораторном ведении модели более целесообразно использовать для развития яиц до инвазионной стадии не физиологический раствор, а воду.

2.2 УСТАНОВЛЕНИЕ СРОКОВ ЛИНЕК И ДОСТИЖЕНИЯ ПАРАЗИТАМИ А. ТЕТЯАРТЕЙА И Б.ОВУЕЬАТА ПОЛОВОЙ ЗРЕЛОСТИ Результаты наших исследований показали, что самки А.1е1гар1ега содержат зрелые яйца на 10-12 дни инвазии.

Известно, что для оксиурид характерно 4 линьки - две их происходят в яйце . При выходе из яйца личинка претерпевает еще две линьки. Наши исследования показали, что личинки АЛе^арЬега третью линьку совершают на 3-4 дни после заражения, а четвертая происходит на 6-7 дни после заражения.

У личинок Б.оЬУе1а1а третья линька происходит на 2-3, четвертая - 4-5 сутки после заражения.

Таким образом, при изучении активности против личинок оксиурид, необходимо введение химиопрепаратов на 4-5 дни после заражения аспикулурозом и на 3-4 дни при использовании модели сифациоза. Для исследования химиотерапевтической активности препаратов на половозрелой стадии необходимо их введение на 10-11 дни инвазии в случае использования модели А.1е1гар1ега и на 8-9 дни при использовании модели сифациоза.

2.3 ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИНВАЗИИ А. ТЕТ(?АРТЕ??А И Б-ОВУЕША Сравнительно изучены возможности использования спонтанно зараженных животных А.Ье1гар1ега и Б.оЬуе^а и животных лабораторного заражения этими гельминтозами для поиска новых противонекатодных препаратов.

Нашими исследованиями показано, что оптимальным методом для этих целей более эффективным является метод лабораторного ведения моделей А.ЬеЬгар1ега и Б.оЬуе1аЬа.

3. ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА МОДЕЛЯХ ОКСЙУОД 3.1 ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ ОТХОДА ПАРАЗИТОВ ПОСЛЕ ОДНОКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ НА МОДЕЛЯХ СИФАЦИОЗА И АСПИКУЛУРСбА Проведенные исследования показали, что после перорального введения препаратов группы карбаматбензимидазолов -медамина и альбен-дазола максимум отхода паразитов наблюдался через 3 суток. После введения эмбовина, относящегося к группе пиримидинов, максимум отхода начинался раньше :со второго дня и продолжался до третьего. Далее, после третьего дня , так же, как и в случае воздействия медамина, наблюдался быстрый спад количества покидающих хозяина гельминтов. Обнаруженные различия в динамике отхода паразитов можно объяснить различными фармакологическими свойствами препаратов ряда карбаматбензимидазола и эмбовина, относящегося к группе пиримидинов.

В связи с полученными результатами, учет эффективности при широких хиыиотерапевтических исследованиях целесообразно проводит! через 3 суток после введения антигельминтиков , как ряда карбаматбензимидазола, так и ряда пиримидина.

3.2 ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕДАМИНА, АЛЬбЕНДАЗОЛА И ЭМООВИНА НА МОДЕЛЯХ СИФАЦИОЗА И АСПИКУЛУРСБА

3.2.1 МОДЕЛЬ СИФАЦИОЗА Результаты исследования показали ( табл.1), что альбендазо.» так жа, как и медамин, менее эффективен на личиночной стадии разв! тня S.obvelata, чем на половозрелой, хотя в обоих случаях актю

Таблица 1

ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ШИРОТА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕДАМИНА, АЛЬВЕНДАЗОЛА И ЭМВОВИНА НА МОДЕЛИ СИФАЦИША МШЕЙ (1-личиночная, 2- половозрелая стадии)

препараты ЕД 50 с доверительными границами ЕД 84 лд 16 ХТИ

МГ/К]

медамин 1 2 альбендазол 1 2 змбовин 1 2 60 (76.2-4-47,24) 10 (15 -т- 6,67) 52 (58,76^46,02) 2.6(5,2-*- 1,3) 39 (93.6-f-16.25) 2,7(4,05-5-1,8) 180 31 68 15,5 76 5,8 4500 4500 6200 6200 6300 6300 25 145 91 400 83

Таблица 2

ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ШИРОТА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕДАМИНА, АЛЬБЕНДАЗОЛА И ЭМВОВИНА НА МОДЕЛИ АСПИКУЛУРСХЗА МЫШЕЙ (1-личиночная, 2-половозрелая стадии)

Препараты ЕД50 с доверительными границами ЕД 84 М16 ХТИ

мг/кг

медамин 33(51,15-т-21,29) 70 4500 64

24(50,4-г-11.43) 78 4500 53

альбендазол 6.2 (*) 60 6200 103

3,2(4,8-7-2,13) 10 6200 620

эмбовин 5 (*) 32 6300 199

1,55(2,10841,14) 3,2 6300 1969

Примечание: * - доверительные границу не определяются ЕД -эффективная доза;ДД - летальная доза; Хш- хи-миотералевтический индекс

ность этих препаратов достаточно велика .

Эмбозин,являющийся представителем класса пиримидинов, так же, как и препараты из группы бензимидазолов, на личиночной стадии си-фациоза проявил меньшую эффективность, чем на половозрелой.

3.2.2 МОДЕЛЬ АСПИКУЛУРОВА Как показали результаты исследования ( табл.2), медамин оказался примерно в 2 раза менее эффективным на данной модели, чем при сифациозе и одинаково эффективным как на половозрелой, так и на личиночной стадии развития паразита.

Альбендазол проявил на данной модели такую же высокую эффективность , как и на модели сифациоза; но на личиночной стадии развития паразита оказался менее эффективным, чем на половозрелой.

Эмбовин на модели аепикулуроза проявил очень высокую активность, хотя, так же, как и препараты ряда карбаматбензимидазоло* (медамин и альбендазол), на личиночной стадии аепикулуроза показал меньшую эффективность, чем на половозрелой.

3.2.3 ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕДАМИНА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СХЕМАХ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА НА МОДЕЛИ АСГОПШ1УР03А ЫЬШЕЙ. Медамин применяли в различных дозах : от 5 мг/кг до 1000 мг/к и были использованы три схемы введения препарата: одноразово ( т.е 1 раз в сутки ) ; дробно 2 или 3 раза в сутки и 3 раза в сутки течение трех последовательных дней,последняя схема соответствовал инструкции по применению препарата для лечения знтеробиоза человек Наиболее интересной по всем показателям оказалась схема одра зового введения . при применении которой медамин показал самую вь

сокую эффективность и быстрое ее нарастание с увеличением дозы: ЕЛЛ составила 24 (36-=-16 )мг/кг, ЕД^, - 78 мг/кг, тогда как при испЬльзо-вании схемы дробного введения в течение суток ЕД^ составила 20 (Зб-г 11,1 ) мг/кг, ЕДу^ - 120 мг/кг, а при введении медамина 3 раза в сут!си в течение трех дней ЕДа оказалась равной 46 (70,38— 30,06) мг/кг,223 мг/кг.

Следует отметить, что один из наиболее важных показателей действия препарата, а именно широта его терапевтического действия, также повышалась за счет, увеличения эффективности при переходе от схем повторного введения к одноразовой , ХТИ равен соответственно 20, 37, 58.

3.2.4 СКРИНИНГ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ■ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АСШКУЛУРО0Е ШЛЕЙ

Производные карбаматбензимидазола

Проведенные исследования показали, что все восемь изученных соединений, относящихся к новому ряду бенэимидазола, проявили разной степени активность в пределах 40 %- 90' .

Наши исследования показали, что.введение нафтоксигруппы в остаток карбаматбензимидазола не дало заметного выигрыша в эффективности. Не целесообразно введение метилтиогруппы вместо карбаматкой группы в положение 2 бензимидазольного кольца при наличии нафтоксигруппы.

В автореферате мы не имели возможности дать все.таблицу по изучению активности соединений, поэтому в качестве примера приводим одну таблицу по изучению производных полигалоидбензамида.

Производные полигалоидбензамида

При синтезе соединений этого ряда варьировали атомы галоидов в остатке салициловой кислоты, наличие или отсутствие атома хлора в

Таблица 3

ПРОТИВОНЕМАТОДСВНАЯ АКТИВНОСТЬ РЯДА ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗАМИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОСТАТОК ХИНОЛИНА Общая структурная формула:

Хб

XI он Х2

^¿Ь С О/^Н

N шифр заместители Брутто-формула Доза мг/кг интен эффек ность

Х1 Х2 Хз Хц Х5

1 Г-1570 Вг С1 н С1 С1 С^Н12 Вг С13^0з 5 927.

25 987.

50 1.007.

2 Г-1575 Вг Вг н С1 С1 С22Н|2.В^С12^0З 75 1007.

3 Г-1579 Вг Вг н С1 н С22Н13В12С1 N¿05 75 . 367.

4 Г-1610 I С1 н С1 н СагНиС^! N¿03 25 777.

5 Г-1611 I С1 н С1 С1 С2гН12с13; N¿03 25 74%

б Г-1612 Вг С1 С1 С1 н СдяНиВг С13Мд03 50 42%

7 Г-1613 Вг С1 н С1 н СггНиВг 01^05 5 70

25 74

50 85

8 Г-1652 Н н н С1 С1 С2ДН,ЦС12 ИД 03 5 56

25 в;

50 8Е

хинолиновой части молекулы. В одном соединении ( Г-1612) введен дополнительный атом хлора в фенильный заместитель при отсутствии атома хлора в хинолиновой части молекулы.

Рассмотрение полученных результатов испытаний на модели аспи-кулуроза некоторых полигалоидбензамидов, содержащих остаток хиноли-на в И-фенильном заместителе, показывает, что вся эта группа веществ проявила активность в пределах 42£-100Х ( Табл.3).

Замена атома брома на атом йода в молекуле веществ умеренно снижает активность, а снятие атома хлора в хинолиновом остатке молекулы приводит к резкому снижению активности. В свою очередь замена остатка салициловой кислоты на остаток бензойной или пара-нитро-бензойной кислоты привела к полной потере активности вещества Г-1652.

Следует отметить, что у соединений этого ряда впервые выявлена противонематодная активность, причем, у двух производных активность оказалась более высокая, чем у эталонного препарата медамина.

4. ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРА ЛХМИНЕСЦЕНЦИИ ИНТАКТНЫХ АБРЮиШШБ ТЕТКЛРТЕРА И БУРНАС1А ОВУЕЬАТА 4.1 ВЫБОР ФЛУОРОХРОМА

Нами был изучен характер люминесценции A.tetrгptera и 3.оЬ\-е1аЬа после флуорохромирования различными флуорохромалш. Показано, что родамин С, родамин 6Ж, флуоресцеин натрия, корнфосфин не дают яркой полихромной люминесценции, при их использовании не выявляются физиологически активные органы , не наблюдается различий . з характере люминесценции живых и поврежденных структур.

При окрашивании акридиновым оранжевым наблюдается яркая палих-ромная люминесценция всех внутренних органов гельминта , хорошо прослеживаются все морфологические детали, что позволяет использовать данное соединение для выявления функционального состояния от-

дельных органов, наблюдения тонких деталей морфологии. При обработке акридиновым оранжевым по-разному люминесцируют живые и мертвые ткани паразитов, поврежденные органы и системы.

Таким образом, акридиновый оранжевый оказался единственным флуорохромом, дающим полихромное свечение внутренних органов взятых нами видов гельминтов в сочетании с четким выявлением тонких морфологических деталей ,

4.2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ФЛУОРОХРОШРОВАНЙЯ

Нами показано, что оптимальное свечение наступает при содержании гельминтоз в 0,01Х-ном растворе акридинового оранжевого при температуре 37° С в течение 18-20 часов. В этих условиях паразиты остаются живши.

Попытка увеличить концентрацию флуорохрома не изменила скорости флуорохромирования, но вызывала неравномерное свечение отдельных органов. Пищеварительный тракт, особенно передний его отдел , сильно перекрашивался, и при этом большинство паразитов погибало, что недопустимо как для изучения деталей морфологии, так и Для оценки действия химиопрепаратов. Исходя из этих наблюдений, в качестве экспресс-метода ломинесцентно-микроскопического изучения морфологии отдельных систем органов, а в последствии оценки действия на них химиотерапевтических препаратов, мы остановились на фрагментарном их изучении ( см.Материалы и методы)

4.3 ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ А.ТЕИ?АРШ?А И Б.ОВУЕиТА ПРИ ФЛУ0Р0ХР0ЖР0ВАНИИ АКРИДИНОВЫМ ОРАНЖЕВЫМ

А. 1е1гар1ега

По нашим наблюдениям, внутренние органы интактного паразита, кроме половых, имеют у самцов и самок сходный характер люминесцен-

ции. Кутикула.и латеральные крылья светятся бледным, темно-зеленым цветом. Гиподерма переднего отдела острицы имеет мьолество оранжевых клеток с зелеными ядрами, расположенных в виде продольных полос; в остальных отделах таких клеток не наблюдается.

Окологлоточное нервное кольцо темно-зеленое. Губные папиллы бледно-розовые. Просвет глотки и пищевод зеленый, бульбус ярко-дел-тый. Отдельные его клетки в передней части имеют общую темно-зеленую люминесценцию с ярко-зелеными ядрами. Расширенная часть кишечника, следующая за бульбусом, ярко-зеленая. Клетки имеют здесь вытянутую форму, ядро тоже вытянутое, расположено в центре, светится темно-зеленым, а цитоплазма - светло-зеленым цветом. Ректальные железы у самок светятся чаще ярко-зеленым, у самцов - красным цветем. Содержимое каналов выделительной системы люминесцирует темно- красным цветом. У самцов каналы выделяются более четко, так кзк не стеснены органами половой системы, как у самок.

В целом большинство органов половой системы самок люминесцирует зеленым цветом. Яичники ярко-зеленые. В их герминативной зоне хорошо просматривается множество овогоний: цитоплазма их светится светло-зеленым, ядро круглой формы и люминесцирует темно-зеленым, а ядрышко смещено к одному из полюсов ядра и имеет ярко-зеленую люминесценцию. В конце герминативной зоны на стенках яичника имеются крупные, светящиеся ярко-красным,гранулы . В зоне роста яичников ядра клеток'начинают вытягиваться, приобретая веретенообразную форму, а ядрышко занимает центральное положение. В зоне созревания клетки увеличиваются в размере, ядра их опять сжимаются, свечение их остается темно-зеленым.

При. переходе яичников в яйцеводы характер люминесценции меняется с ярко- зеленого на темно- зеленый . Место перехода в матку -ампула - всегда люминесцирует оранжевым цветом. Стенки матки ломи-

несцируют менее ярко, чем яйцеводы, содержат множество мелких гранул, расположенных в виде "россыпи" и светящихся темно - красным и зеленым цветом.

, Внутри матки флуорохромируются только яйца, наружняя оболочка которых еще не сформировалась. Перед ее образованием на полюсах яиц видны светящиеся оранжевым крупные гранулы, число которых колеблется от 2-х до б-8-ми . Полностью сформировавшиеся яйца, в том числе и выделенные нами из маток, и отложенные самками, в живом состоянии акридиновым оранжевым не прокрашиваются, что может служить критерием при определении их жизнеспособности. У погибших яиц при флуорох-ромирозании акридиновым оранжевым прокрашивается внутренняя структура, светящаяся оранжевым цветом .

Общее свечение половой системы самцов ярко- зеленое. Герминативная зона семенника имеет тот же характер люминесценции, что и аналогичная зона яичников у самки. Форма сперматогониев округлая, цитоплазма их светится светлозеленым цветом. Ядро расположено у одного из полюсов клетки и светится темно- зеленым, ядрышко ярко -зеленое, круглое, смещено от центра ядра . При переходе в зону созревания спермы семенник резко сужается , и в этом участке по поверхности расположены ярко- красные крупные гранулы. В этой зоне характер люминесценции меняется с ярко- на темно-зеленый.Перед семя1 роводом семенник образует второе сужение, свечение здесь тоже темно-зеленое. Сперматозоиды светятся темно- зеленым цветом. На переднем конце их у A.tetraptera имеется вздутие в виде полушара, хвост превышает длину головки в 15-20 раз.

S.obvelata имеют сходный с A.tetraptera характер люминесценции, хотя немного отличаются по морфологии и скорости флуорохроми-рования. Целые паразиты в тех же условиях флуорохромирования, что и для A.tetraptera, приобретают яркое свечение за 15-18 часов содер-

жания в растворе акридинового оранжевого. Наибольшие различия с А.ЬеЬгарЬега наблюдаются в строении половой системы.

. 5. ЛШИНЕСЦБНТНСШКРОСКОГШЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА ОРГАНИЗМ ОКСИУРИД Через 12 часов после введения медамина характер люминесценции A.tetraptera соответствовал норме. Через 24 часа после 1ведения препарата у паразитов наблюдались незначительные отклонения от нормы- просвет глотки • и пищевода люминеецирует оранжевым цветом ( в норме - зеленым). Ядра клеток, образующих бульбус, люминесцируит не так ярко, как в норме. Люминесценция остальных отделов пндеверительной системы соответствует норме.

Через 48 часов после введения препарата деструктивные изменения в организме паразита оказались более выраженными. Передний и задний концы тела сильно перекрашены 'и люминееиируют ярко-красным цветом. Окологлоточное нервное кольцо, в норме темно-зеленое, не просматривается. Просвет глотки и пищевод люминесцирутот ярким оранжевым цветом. Границы между клетками бульбуса становятся неразличимыми, сам он люминеецирует оранжевым цветом. Расширенная в норме часть кишечника, следующая за бульбусом - сужена и люминеецирует оранжевым цветом. Кроме пищеварительной, к этому времени повреждается и половая система паразита. У самок герминативная зона яичников люминеецирует красным цветом. В овогониях становятся неразличимыми ядра и ядрышки, все клетки люминеецирует оранжевым цветем. В зоне роста яичника характер люминесценции меняется с темно-зеленого в норме на оранжевый. В матке зародыши тех яиц, оболочки которых еще не сформировались, люминесцируют оранжевым цветом. У полностью сформировавшихся яиц внутренняя структура не просматривается. У самцов половая система также люминеецирует оранжевым цветом.

Альбендазол.

Через 12 часов после введения альбендазола у паразитов наблюдаются незначительные изменения в характере люминесценции. Передние отделы пищеварительной системы паразита люминесцируют оранжевым цветом. Следующая за бульбусом расширенная часть кишечника, в норме ярко-зеленая, люминесцирует оранжевым. Через 24 часа после введения препарата у паразитов наблюдается утодщение кутикулы в 2,5 - 3 раза и отслоение ее от субкутикулярного слоя. Б пищеварительной системе происходят крупные деструктивные изменения, все отделы ее перекрашиваются и люминесцируют красным цветом. В половой системе паразито происходит утолщение кутикулы яичников и семенников, их герминативные зоны люминесцируют ярким красным цветом. Содержимое несформиро-вавзихся яиц также люминесцирует красным. Через 48 часов после введения альбендазола большинство паразитов погибает и выводится из ор ганизма хозяина.

Змбовин

Нзрувения в организме паразитов после воздействия эмбовина довольно значительны уже через 12 часов после введения препарата. Так, к этому времени происходит утолщение к отслоение кутикулы от субкутикулярного слоя. Все отделы пищеварительной системы люминесцируют красным, отделы клеточных границ не просматриваются. Кромчатого, происходит деформация передних отделов пищеварительной системы, в некоторых местах наблюдается разбухание и разрыв кишечника. Анальное отверстие раскрыто, задний отдел тела паразита перекраше! и тоже люминесцирует красным.

Половая система паразитов тоже в очень сильной степени подвергается воздействию эмбовина. Герминативные зоны яичников и семенни ков выглядят набухшими, клеточные границы в них на просматриваются люминесценция здесь красная. В несозревших яйцах зародыш люминесци

гет красным . Незначительное количество яиц остается непрокрашен-¡м.

ВЫВОДЫ

1.Получены две стабильные модели энтеробиоза на основе изуче-!я сроков эмбрионального развития , послеяйцевых линек Ле1гар1ега и Б.оЬуе!аЬа и изучения эффективности использования юнтанного или лабораторного дозированного заражения.

2.На этих моделях впервые изучена эффективность оригинального гечественного антгельминтика медамина, а также воспроизведенных арубежных средств змбовина ( пирантеля) и альбендазола против по-эвозрелых и личиночных форм паразитов А.1еЬгарЬега и 3.оЬуе]аЬа. оказана близкая эффективность всех трех препаратов на модели' сифа-иоза. На модели аспикулуроза наиболее эффективным оказался эмбо-ин. Медамин более активен против личиночных форм А.ЬеЬгарЬега по равнению с 5.оЬуе1а1а.

3. Установлено, что высокая эффективность медамина сохраняется ри одноразовом введении и тем самым экспериментально обоснована олее простая схема применения медамина для лечения энтеробиоза че-овека.

4. Показано, что из пяти изученных флуорохромов акридиновый ранжевый оптимален для выявления отдельных деталей морфологии, ункционального состояния и активности отдельных органов и их сис-ем.Отработаны экспозиции окрашивания для изучения целостной струк-уры паразитов ( в течение 38-20 часов 0,01% раствором акридинового ранжевого), и для изучения изолированных органов паразитов 0,001Х-ным флуорохромом в течение 2-4 минут).

5. Модели оксиурид предложены для скрининга новых противонема-одкых препаратов. Среди 24 патентночистых соединений рядов бензи-¡идазола и бензамида отобраны два перспективных высокоактивных пре-

парата, имеючше преимущество по активности и широте терапевтического действия перед известными противонематодными средствами эмбови-ном и медамином.

0. Методом люминесцентной микроскопии установлены скорость ! характер нарушений в организме оксиурид под действием медамина альбендазола и эмбовина . Показано, что в первую очередь повреждае-ся пищеварительная система, а затем покровные ткани и половая сис' тема.

ВНЕДРЕН® РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПРАКТИКУ Модели сифациоза и аспикулуроза введены в практику работы ШПиТМ им. Е.И.Марциковского для поиска и создания новых препаратов (внедрение подтверждено актами)

Результаты исследовании биологии паразитов внедрены в учебный процесс Курского государственного педагогического института (внедрение подтверждено актами)

Полученными данными по изучению эффективности медамина пр различных схемах введения обоснована целесообразность одноразовог применения препарата, на основании чего внесены изменения в инс трукци» на применение медамина, утвержденную Фармакологическим кс митетом 29 апреля 1993 г ( Регистрационный номер 88/409/£ 88/409/6).

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лыкова Н.И., Веретенникова Н.Л., Лебедева М.Н., Тимонс Е.В., Дьяченко Г.Н. Изучение эффективности нового отечественно! препарата метиазола при экспериментальном аспикулурозе мышей,- Ме; паразитол. и паразитар. болезни., 1993.- N 3,- с. 25-26.

2. Лыкова Н.И., Веретенникова Н.Л., Лебедева М.Н. Эффекта ность медамина при экспериментальном аспикулурозе белых мышей. Материалы докл. научн. конф. " Легочные и желудочно-кишечные нем.

тодозы человека и животных и меры борьбы с ними". Москеэ, 5-6 октября 1993г. М., 1993,. с. 50.

3.Лыкова Н.И., Тимонов Е.В. Фрагментарное изучение характера люминесценции Aspiculurls tetraptera ( Schulz,1924). - Там же, с. 51

4.Хонкаров Х.Ж., СевбоД.П., Михайлицын Ф.С., Веретенникова Н.Л., Лыкова Н.И., Лебедева М.Н., Лычко Н.Д. Синтез,изучение острой токсичности и противогельминтной активности салицилакилидов, содержащих остаток хинолина. - Мед. паразитол. и паразитар. болезни, 1994. - N 1. - с. 52-53.

5. Лыкова Н.И., Тимонов Е.В., Веретенникова Н.Л. Люминесцент-но-микроскопический метод изучения функционального состояния органов Aspiculurls tetraptera ( Schulz,1924). - Мед. паразитол. и паразитар. болезни. - 1994. - N 2. - с. 29-32.