Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий

Анохина, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий"

На правах рукописи

Анохина Ирина Викторовна

Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003 161468

Москва 2007

003161468

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов"

Научный руководитель

кандидат медицинских наук Кравцов Эдуард Георгиевич

Научный консультант

кандидат медицинских наук Сокуренко Евгений Вениаминович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Несвижский Юрий Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Ордиянц Ирина Михайловна

Ведущая организация

Федеральное государственное учреждение науки "Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им ГН Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится Уф 2007г в }f.G£> часов на заседании

диссертационного совета Д 212 203 05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов", по адресу

117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов", по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, /¿//

кандидат биологических наук, доцент /Жл Гигани Ольга Борисовна

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В настоящее время широкое распространение дисбиотических состояи среди населения всех возрастов требует активного развития индустр препаратов и продуктов с пробиотическими свойствами

По современным представлениям дисбактериоз это не локальн заболевание, а основа, на которой строятся многие независимые друг от дру болезни На сегодняшний день большое внимание уделяется дисбактериоз! желудочно-кишечного и урогенитального трактов человека По даннв литературы, дисбактериоз в РФ определяется у 75-90% населения

Для создания колонизационной резистентности организма-хозяина ! отношению к болезнетворным микробам, а также, для поддержан метаболических процессов, протекающих в макроорганизме, важное значен имеет нормальная микрофлора различных биологических ниш органиэ человека

В свою очередь слизистая оболочка это также уникальное образование! котором различные микроорганизмы способны оказывать то или ин действие, стимулируя ответ иммунной системы на инфекцию и за сч бактериального антагонизма ингибирует колонизацию терминальных ни патогенными бактериями

Лактобациллы - одна из групп бактерий, которая естественна д терминальных ниш организма человека Пробиотики на основе лактобактер! интенсивно изучаются в экспериментальных исследованиях и клиническ практике

Существует два варианта, объясняющих механизм щ благоприятно действия на макроорганизм Согласно первому, лактобактерии, отобранные качестве лечебного и профилактического начала, адгезируют к эпителиоцшч кишечника и создают дополнительный барьер на их поверхност препятствующий транслокации условно-патогенной и патогенной кишечн! микрофлоры во внутреннюю среду макроорганизма

Второй вариант допускает интенсивное размножение пробиотическ! культур в просвете терминальной ниши, которая в этом случ рассматривается как биологический ферментер Накапливающиеся при эт( в среде культивирования бактериоцины, металпротеиназы, слущивающие с поверхности лактобактерии специфические адгезины блокируют I дезинтегрируют условно-патогенную и патогенную микрофлору, защищая и макроорганизм от потенциально способных к транслокации бактерий

Признавая право на существование обоих современных концепщ описывающих механизм действия пробиотиков на основе лактобактер^

можно предположить, что наилучшую композицию пробиотического препарата может дать комбинация штаммов-продуцентов, в которой будут присутствовать как микроорганизмы, несущие на своей поверхности слущивающиеся специфические адгезины, так и культуры, адгезивную активность которых определяют лектино-подобные структуры, плотно связанные с бактериальной стенкой

Выделение слущивающихся поверхностных адгезинов позволит микрокапсулировать эти структуры, и создать условия, в которых пробиотический препарат при отсутствие биотопозависимости будет способен экранировать сайты связывания на клетках-мишенях от представителей болезнетворной флоры

Цель и задачи исследования.

Целью исследования явилось тестирование производственных и коллекционных штаммов лактобактерий в отношении наличия на их поверхности непрочно связанных адгезинов, способных элиминироваться в среду культивирования с последующим их выделением и попыткой использования при решении конкретных ситуационных задач

По ходу достижения поставленной цели решались следующие задачи

1 Сравненительное изучение производственных штаммов лактобактерий на предмет оценки их морфологических, биохимических и физиологических свойств

2 Отбор штаммов лактобактерий, различающихся по; признаку агглютинации с конканавалином А (конА)

3 Проведение селекции полученных клонов лактобактерий с высокой агглютинационной активностью в отношении конА

4 Выделение поверхностного лектинсвязывающего компонента (ЛСК) лактобактерий и оценка его роли в феномене адгезии к эукариотическим клеткам-мишеням

Научная новизна.

Впервые коллекция различных видов лактобактерий, используемых в производстве пробиотических препаратов, а также эталонные штаммы лактобацилл были протестированы в реакции агглютинации с конА и охарактеризованы по их адгезивной активности

Впервые установлено, что экспрессия рыхлосвязанных с клеточной стенкой адгезинов характерна не для всех пробиотических культур и варьирует в пределах одного вида лактобактерий Впервые удалось выделить варианты лактобацилл с выраженной экспрессией лекинзависимых структур и варианты, не экспрессирующие их

Впервые показано, что набор адгезинов у культур разных видов лактобацилл и их активность в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами барана, морской свинки, человека IV (АВ) и I (0) Р+ групп крови вариабельны, а связь между агглютинацией лактобацилл конА и их адгезией на клетках-мишенях не может быть оценена как значимая

Установлено, что элиминируемый в среду культивирования ЛСК является гаикопротеином, включающим маннозу

Практическая значимость.

Терапевтическое действие пробиотиков рассматривается как результат конкурентного отношения между "полезными" бактериями и бактериями, вызывающими патологические процессы в макроорганизме При таком подходе к рассматриваемой ситуации всевда существует зависимость от физиологического состояния конкретной терминальной микроэкологической ниши - биотопа Использование в производстве пробиотических препаратов лактобактерии, сбрасывающие со своей поверхности ЛСК, позволит с несколько иных позиций подойти к решению проблемы дисбактериоза в терапевтической и гинекологической практике

Слущивающиеся поверхностные адгезины после микрокапсулирования могут представить собой пробиотический препарат, способный экранировать сайты связывания на клетках-мишенях от представителей болезнетворной микрофлоры

Положения, выносимые на защиту.

1 Для лактобактерий характерна вариабельность экспрессии ЛСК на поверхность клетки Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов, существуют варианты с выраженной экспрессией таких структур и варианты, их не экспрессирующие

2 Культуральная жидкость (КЖ), полученная после выращивания лактобактерий на жидкой питательной среде, представляет собой многокомпонентную систему, включающую биополимеры

3 Биополимеры КЖ некоторых видов лактобактерий способны оказывать модулирующее действие на адгезию патогенной и условно-патогенной флоры к эпителиоцитам влагалища (ЭВ)

4 КЖ, полученная при культивировании лактобацилл, в определенной степени сбалансирована, поскольку удаление из нее компонента, тормозящего адгезию, усиливает фиксацию тест-культур на клетках-мишенях

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней" (Москва, Россия, 2006г), а также на XII Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, Россия, 2007г) и на семинарах кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2006-2007гг)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано б работ

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на № стр машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов экспериментальных исследований, их обсуждения, выводов, а также библиографического указателя, включающего источник Работа иллюстрирована рисунками и /^таблицами

Материалы и методы.

В работе исследовали 38 штаммов лактобактерий, полученных из музея живых культур ГИСК им Тарасевича МЗ РФ, из национальной коллекции микроорганизмов США и немецкой национальной коллекции микроорганизмов (Deutsche Sammimg von Mikroorganismen und Zollkulturen GmbH (DSMZ)), любезно предоставленные доктором Сокуренко Е В (Университет Вашингтона, г Сиэтл, США) и штамм из коллекции кафедры микробиологии РУДН (см таблица 1)

Таблица 1

Перечень штаммов лактобактерий, использованных в работе

Коллекции № Вид Каталожный № Вид Каталожный

лактобактерий № штамма лактобактерий N° штамма

01 L ons 4864 12 L plantarum 20174

02 L vaginalis 5837 13 Lgassen 20243

Немецкая 03 L johnsonij 10533 14 L ruminis 20403

национальная 04 L mucosae 13345 15 L vituhnus 20405

коллекция 05 L gastncus 16045 16 L kefiri 20485

микроорга- 06 L apodemi 16634 17 Ljohnsony 20553

низмов 07 L corymformis 20001 18 L cnspatus 20584

(рБМ2) 08 L reuten 20016 19 L animal is 20602

09 L fermentum 20055 20 L gramims 20719

10 L delbruecku 20076 21 Leuconostoc

И L bulgancus 20081 fructosum 20349

01 L plantarum РЗ 08 L plantarum 8RA-3

02 L plantarum Р4 09 L fermentum A-4

Коллекция 03 L buchnen Р0 10 L fermentum B-2

живых культур

ГИСК 04 L fermentum 39* 11 L acidophilus NK1

им Тарасевича L acidophilus (серия 4)

05 L plantarum 38 12 ЮОаш

(серия1)

06 L casei 37 13 L acidophilus К3Ш24

(серия 1)

07 L fermentum 90 TS-4 14 L fermentum 90 TS-4 (21)

(производ-

ственный)

Американская 01 L casei 27216 02 L acidophilus 4356

национальная

коллекция

микроорга-

________ / НдомиВ )

Коллекция 01 L fermentum 90 TS-4 (21)

кафедры

микробио-

логии РУДН -

"*" - при определении биохимических свойств лактобактерий с помощью системы API-50 CHL фирмы API-System (Франция) данный штамм прошел как L plantarum, поэтому далее в тексте он будет обозначен - L plantarum*

Кроме этого в работе использованы штаммы Е coli JJB150, JJB4, JJF21, JJP114, JJV4, 89-1449 - хранящиеся в Университете штата Вашингтона, (Сиэтл, США), штаммы Е coli К12 и Е coli Kl 7 из Всероссийской коллекции микроорганизмов, а также штамм Gardnerella vaginalis CCUG 3717 (культура получена при посредничестве доктора Н Николайчук из Culture Collection, Universiti of Goteborg, Швеция), Staphylococcus aureus и Staphylococcus epider-midis (кафедра микробиологии Российского университета дружбы народов), 20 клинических изолятов дрожжеподобных грибов (ДПГ) вида Candida albicans, выделенные у женщин с бессимптомной и манифестной формой инфекции, любезно предоставленные доктором Проценко А В и 2 штамма ДПГ С albicans из коллекции кафедры микробиологии РУДН С albicans 01 1159 и С albicans - оральный изолят

Для выращивания лактобактерий использовали среды МРС-1 и МРС-4 следующего состава в г/л MnS04x4H20 - 0,05 г, цистеин солянокислый - 0,2 г, MgS04x7H20 - 0,2 г, КН2Р04 - 2,0 г, цитрат аммония - 2,0 г, ацетат натрия

- 5,0 г, глюкоза (лактоза) - 20,0 г, дрожжевой автол изат 50 мл, печеночный экстракт - 100 мл, пептон 10,0 г, твин-8 - 1 мл, микробиологический агар -20,0-25,0 г (для среды МРС-4), рН-б,2-6,6

Для выращивания ДПГ рода Candida использовали среду Сабуро следующего состава дистиллированная вода 1000 мл, дрожжевой экстракт 2,0-5,0 мг, глюкоза - 40,0 г, сухой пептон - 10,0 г, хлористый натрий - 5,0 г pH

- 7,5 Для выращивания Е coli использовали коммерческую среду Brain Heart infusion (SIGMA, Германия)

При изучении адгезивных свойств лактобактерий в качестве клеток-мишеней были использованы клетки аденокарциномы толстого кишечника (Сасо-2), клетки аденокарциномы мочевого пузыря (Т-24), а также эпителиоциты влагалища, выделенные от клинически здоровых женщин на 10-18 день менструального цикла путем смыва 5 мл забуференного физ раствора (ЗФР) с ватно-марлевого тампона (информированное согласие получено)

В реакции гемаггаютинации использовали нативные эритроциты человека IV(AB) и 1(0) Р+ групп крови, а также эритроциты барана и эритроциты морской свинки Сыворотки к L fermentum 90-TS-4 были получены путем иммунизации кроликов в возрастающих дозировках взвесью клеток в физиологическом растворе (ФР) Сухую люминесцирующую сыворотку против глобулинов кролика серии № 789 производства ИЭМ им Гамалея Н Ф использовали в реакции отмены иммунофлюоресценции (непрямой метод Кунса)

При тестировании лактобактерий на химически чистых биосубстратах, предварительно иммобилизованных на поверхности лунок полисгирольных 96-луяочных планшетов по методу Sonnenborn U [Sonnenborn U, R Greinwald Antagonismus von E coli gegen andere Mikroorganismen// In

Beziehungen zwischen Wirsorgamsmus und Darmflora, 2nd Ed 1991 Stuttgart -New York p 55-69] были использованы следующие субстраты FimH - белок связывающего домена пилей 1 типа (FimH - б) К-12 - белок пилей 1 типа (К-12 - б) РНКаза А- мономаннозный рецептор (РНК-аза А) РНКаза В- триманнозный рецептор (РНК-аза В) голубиный овальбумин (PEW) - галактозный рецептор (PEW-p) Калибровочную кривую при определении белка по методу Лоури [Методы общей бактериологии перев с ант Под ред Ф Герхарда и др // - M - Мир -1984 - т2 - с 469] строили с помощью сывороточного альбумина быка (SIGMA, Германия) Коммерческий препарат конА (SIGMA, Германия) использовали для определения лектинсвязывающей активности лактобактерий КонА - лектин, выделенный из конского боба Canavaha ensi-formis и взаимодействующий с поверхностными структурами эукариотических и прокариотических клеток по манозному остатку, вызывает агглютинацию клеточной культуры (рис 1)

КошштеазшА Gai —KÀcGte -M®

(ConA) Mao -NAcGk —R.

<M —NAeGíc -Мао Рис 1

[В В Игнатов "Углеводузнающие белки-лектины", Соросовский образовательный журнал, 1997г, №2, С 14-20 ]

Для определения биохимических свойств лактобактерий применяли системы API-50 CHL фирмы API-System (Франция), представляющие собой планшеты с микропробирками, заполненными сухими субстратами (сахарами)

Эванса синий для окрашивания мазков при реакции отмены иммунофлюорисценции по непрямому методу Кунса был получен от фирмы SIGMA (Германия)

Для выделения чистотой культуры лактобактерий выращивали на плотной питательной среде MPC в течение 24-48 ч при 37°С в С02-условиях (5%) Единичную колонию переносили б жидкую питательную среду MPC и культивировали 24 часа, при 37°С в С02-условиях (5%) С целью оптимизации биохимических свойств лактобактерий, культуру трижды выращивали на жидкой питательной среде Перед постановкой тестов бактерии трижды отмывали стерильным ЗФР при центрифугировании 10-15 мин -3000 об/мин

Изучение агглютинационных свойств лактобацилл с иммунной сывороткой и конА проводили микрометодом Реакцию ставили в микропланшетах для иммунологических реакций в объеме 50 мкл В ячейках

микропланшетов готовили серийные двукратные разведения диагностических реагентов по 25 мкл, в последнюю лунку вместо этих реагентов вносили ЗФР - "контроль"

Отбор агглютинирующих и не агглютинирующих колоний в популяции L fermentum 90-TS-4 (21) проводили в реакции агглютинации (РА) на стекле На предметное стекло наносили по 0,25 мл ЗФР (контроль) и конА Результаты РА на стекле учитывали через 2-5 мин Постоянство способности клонов агглютинировать при низких концентрациях конА контролировалось при каждом новом посеве культуры

Для постановки РГА забор крови в объеме 2-5 мл с целью получения эритроцитов осуществляли непосредственно перед проведением эксперимента Пользуясь микрометодом, в каждую лунку вносили по 25 мкл ЗФР, раститровывали культуру и добавляли по 25 мкл 1,5% взвеси эритроцитов Результат регистрировали через 2-4 часа

При изучении адгезии микробов на поверхности эукариотических клетках реакцию проводили при комнатной температуре, объединяя взвесь клеток-мишеней и микроорганизмов Учет адгезии лактобактерий проводили в 31-ом поле зрения Подсчитывали количество бактерий на одну клетку-мишень Определяли среднее значение адгезировавшихся микроорганизмов, ошибку среднего и стандартное отклонение

Выделение ЛСК проводили на ячейках фирмы AMICON (США) с использованием мембран "Диафло" и мембран с диаметром пор 0,02 мкм КЖ отделяли от биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 минут Супернатант КЖ очищали от низкомолекулярных компонентов и концентрировали путем диафильтрации на ячейках фирмы "AMICON" с использованием мембран РМ-20, ХМ-100 и ХМ-300 Полученный материал собирали и хранили при t= -20°С

С помощью реакции кольцеприципитации контролировали наличие ЛСК в КЖ Регистрировали результат следующем образом время реакции - "+" -более 15 мин, "++" - ог 5 до 15 мин, "+++" - 5-10 сек, "++++" - первые секунды Используя метод Лоури (1951 г) определяли концентрацию белка в каждом образце концентрата КЖ

Способность продуктов жизнедеятельности лактобактерий блокировать адгезию условно-патогенных и патогенных бактерий к клеткам-мишеням определяли по реакции торможения адгезии микробных клеток на ЭВ Учет торможения адгезии С albicans проводили в 31-ом поле зрения Подсчитывали количество ДПГ рода Candida на одну эпителиальную клетку Определяли среднее значение адгезировавшихся микроорганизмов, ошибку среднего и стандартное отклонение

С помощью электрофореза КЖ в агаровом геле установливали наличие в концентрате КЖ двух фракций, движущихся к катоду Разделение образца проводили при рН - 8,2, напряжении 200 В и силе тока 10 мА При проведении

исследований в условиях движения лектинзависимой фракции через "траншею", заполненную конА-сефарозой (SIGMA, США), компонент отсутствовал в фореграмме Это факт явился основанием для выделения искомого продукта методом аффинной хроматографии ("бач"-метод) Электрофорез JICK в полиакриламидном геле позволил определить молекулярную массу субстанции

Для культивирования лактобактерий использовали микроанаэростат и GasPak Anaerobic System ("BD", США) Температурный режим поддерживали с помощью термостата

При работе с культурами микроорганизмов, КЖ лактобактерий и эукариотическими клеткам использовали центрифуги "Eppendorf AG" и "ЦУМ-Г

Микроскопию мазков и изучение адгезии лактобактерий на ЭВ проводили с помощью светового микроскопа МБИ-15-2, производства JIOMO

Отмену иммунофлюоресценции регистрировали на люминесцентном микроскопе MJI-2 и на установке "ПРОТВА" Фотографировали мазки с помощью фотоаппарата NIKON COOLPIX (dpi 3,4)

Измерение оптической плотности культур проводили на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2МП

Отмывку КЖ и разделение материала КЖ проводили на ячейках фирмы AMICON (США) методом мембранной диафильтрации с использованием мембран "Диафло" марки РМ-20, ХМ-100, ХМ-300 и мембран с диаметром пор 0,02 мкм под давлением азота - 10-20 kgß'cm2

Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерной программы "BIOSTAT" (производитель McGraw-Hill, версия 4 0 0 0) и с помощью программного обеспечения MS Office Exel На основе этих программ определяли следующие показатели

- средние величины,

- ошибку среднего,

- значение сигмы для всех изучаемых показателей,

- корреляционный коэффициент

1 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ И КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

ВЫЯВЛЕНИЕ ШТАММА, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО НАИБОЛЬШЕЕ КОЛИЧЕСТВО ЛСК В СРЕДУ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

1.1. Штаммы лактобактерий экспрессирующие и не экспрессирующие ЛСК

Некоторые виды лактобактерий имеют слущивающиеся поверхностные адгезины, взаимодействующие с конА Благодаря этому свойству их можно выявлять и оценивать как в количественном, так и в качественном отношении

Таблица 2

Агглютинация различных видов лактобацилл конА

№ Виды лактобактерий Агглютинация конА

Порядок разведения Концентрация конА (1*10-%г/мл)

01 L fermentum 90 TS-4 (производственный) 8 3,5*10-3

02 L plantarum 8RA-3 6 15,0*10-3

03 L acidophilus К3Ш24 нет реакции нет реакции

04 L buchneri Р0 5 30,0*10-3

05 L case37 нет реакции нет реакции

Об LcaseiATCC 27216 «_«

07 L acidophilus ATCC 4356 н_п

08 L johnsomi 10533 5 30,0*10-3

09 L gastricus 16045 7 8,0*10-3

10 Lapodemi 16634 2 250,0*10-3

11 Lreuteri 20016 2 250,0*10-3

12 Leuconostos fructosum 20349 8 3.5*10-3

13 L ruminis 20403 3 125,0*10-3

14 L vituhnus 20405 5 30,0*10-3

15 L kefin 20485 4 60,0*10-3

16 Lgraminis 20719 1 500,0*10-3

При постановке реакции агглютинации с кокА было установлено, что экспрессия ЛСК на поверхности бактериальной клетки характерна для ряда видов лактобактерий Из данных таблицы 2 видно, что наиболее выражено это свойство у Ь ГегтепШт штамм 90 Тв-4 (производственный) и Ь {тисКюшп 20349

Среди клонов Ь АегтеШит 90 ТЭ-4, полученных при отборе агглютинирующих и не агглютинирующих колоний в популяции с помощью РА на стекле, степень экспрессии ЛСК варьировала (табл 3) Так, например,

Ь Аегтепйип А-4 агглютинировал при концентрации конА 30,0*10"3 мг/мл, а Ь £еппеп1ит 90 ТЯ-4 (21) клон 2 и клон 3 - 0,845*10"3 мг/мл Исходя из результатов этого эксперимента, дальнейший интерес был сосредоточен на этих двух клонах

Таблица 3

Агглютинация клонов L fermentum конА

Клон Агглютинация конА

L fermentum Порядок Концентрация конА

разведения (1*10"3мг/мл)

L fermentum 90 TS-4 8 3,5*10-3

(производственный)

L fermentum 90 TS-4 9 1,75*10-3

клон 1

L fermentum 90 TS-4 10 0,875*10-3

клон 2

L fermentum 90 TS-4 10 0,875*10-3

клон 3

L fermentum 90 TS-4 9 1,75*10-3

клон 4

L fermentum A-4 5 30*10-3

L fermentum B-2 8 3,5*10-3

1.2. Характеристика изучаемых культур по их адгезивной активности.

Принимая во внимание, что способность к адгезии у культур определяются разными типами адгезинов и степенью их экспрессии, была исследована способность лактобактерий из Российской коллекции и лактобактерий из Американской национальной коллекции микроорганизмов агглютинировать четыре вида эритроцитов

Активность семи культур разных видов лактобацилл в РГА с эритроцитами барана, морской свинки, человека IV(AB) и 1(0) Р+ групп крови представлена на рисунке 2, откуда следует, что набор адгезинов у культур и их активность вариабельны Среди изученных видов штамм L fermentum 90TS-4 имел узкий спектр адгезинов - он умеренно агглютинировал эритроциты барана В то же время L acidophilus К3Ш24 активно агглютинировал все три вида эритроцитов

Экспрессия разных типов адгезинов на лактобактериях 30 ТЗ-4

С. ¡ВПХЙЯЙШИ

Рисунок 2

I, саге» 37 1

-Срн

ЬЪисЬиеп Р0 I

Ь с&т АТСС272) 6

КзШм

Ь.амйорЬЬг

Обозначения к рисунку

1 - агглютинирующая активность (порядок разведения культуры)

по эритроцитам человека (1У(АВ)),

2 - агглютинирующая активность (порядок разведения культуры)

по эритроцитам барана,

3 - агглютинирующая активность (порядок разведения культуры)

по эритроцитам морской свинки,

4 - агглютинирующая активность (порядок разведения культуры)

по эритроцитам человека (1(0) Р+)

Немецкая коллекция лактобактерий была оттестирована на химически чистых биосубстратах, предварительно иммобилизованных на поверхности лунок полистирольных 96-луночных планшетов по методу Sonnenborn U

При проведении скрининга по адгезии лактобактерий на иммобилизированных субстратах установлено, что ни одна из культур выборки не адгезировалась в лунках, покрытых FimH - б и К-12 - б откуда следует, что эти штаммы лактобактерий не имеют на своей поверхности рецепторов, комплиментарных фимбриям 1 типа В свою очередь, в такой ситуации трудно было ожидать наличие коадгезии лактобактерий из немецкой коллекции, описанной в табл 1, и FimH позитивных Е coli Действительно, смешивание взвеси лактобактерий из этой выборки и Е coli штамма К-12 не приводило к появлению агрегатов Тем не менее, адгезины некоторых штаммов исследованных нами лактобактерий могли взаимодействовать с маннозным и галактозным рецепторами В частности, - на мономаннозном рецепторе представленном РНКазой А адгезировало 9 штаммов, на триманнозном рецепторе (РНКаза В) - 4, а на галактозном (PEW) - 2 (табл 4)

Таблица 4

Адгезия штаммов лактобактерий на иммобилизованных биосубстратах

Вид лактобактерий Штаммы лактобацилл субстрат

РНКаза А РНКаза В PEW

L mucosae 13345 + + +

L johnsomj 10553 + + +

L apodemi 16634 + + -

Leuconostos fructosum 20349 + + -

L reuten 20016 + - -

L plantarem 20174 + - -

L vitulinus 20405 + - -

L kefin 20485 + - -

L gramims 20719 "Г - -

1.3 Адгезивные свойства лактобактерий при взаимодействии с эукариотическими клетками

Впервые в 1961 году Brownelee А и Moss W изучая слизистую желудка крыс, обнаружили монослой лактобактерий, который не экстрагировался с поверхности клеток при интенсивной отмывке

На рис 3 представлены результаты, согласно которым, адгезивная активность культур лактобактерий в большей степени определяется не видом, а штаммовой принадлежностью

Рисунок 3

Адгезия лактобактерий на поверхности клеток-мишеней (ЭВ).

| «

за -

го -

Н F2 F3 F4 F5 F6 F?

PI рг РЗ

C1 С2 РсЗ

В А

виды ляетввшроп

Пояснения к рисунку 3: Fl-L.fermentum 90 TS-4(kjioh 4); F2-L, fermcntumi произвол.); F3-L.fermentum (В-2); F4-L fermentum 90 Т8-4(клон 2), FS-L.fermentum 90Т5-4(клон l); F6-L.fermentum 90 ТЗ-4(клон 3); F7-L.fenrcentum (A-4),

Pl-L plantarum*, P2~L.p{antamm 38, P3-L.plaiitarum 8 RA-3; CI-L.case: 37; C2-L.casei ATCC 27216, РсЗ -L. acidophil us ATCC 4356, B- L.buchnen P0; A- L acidophilus КЗШ24.

Так среди L.fermentum можно было выявить штаммы с высоким - 53,90± 4,30 (L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 4) и с низким - 5,97± 1,30 (штамм L.fermentum А-4) уровнем адгезии. Штамм L.piantanim 8 RA-3 адгезировал на эпителии со среднем показателем- 4,12±0,80, тогда как штамм L. plant arum* с показателем - 22,23±2,50.

В работах Рожковой И Ю- [ 1997-1999г] было показано, что штаммозависимая адгезия L fermentum на эпителиоцитах ассоциирована с поверхностным ЛСК, взаимодействующим с конА. При определении коэфипиента парной корреляции между титром агглютинации и средним уровнем адгезии г составляло 0,15, т.е. связь между этими показателями отсутствовала. Следует учесть, что в качестве клеток-мишеней в предыдущих исследованиях были использованы эритроциты, в то время как в описываемом случае мишенью стал вагинальный эпителий. Эти данные подтверждают заключение Fuller R. и Roach S. et al [1971г.] о том, что кроме лекгинзави-симого адгезина у лактобацилл присутствуют другие типы адгезинов, обеспечивающие их тропизм при фиксации на различных клетках мишенях.

Культуры лактобактерий немецкой коллекции были протестированы на двух стандартных перевиваемых линиях клеток Саео-2 и Т-24 Оказалось, что корреляция в адгезивной активности у изученных нами штаммов лактобактерий к этим двум линиям клеток отсутствует (г = 0,02) Так штаммы 10533 и 20584 были высоко активны при фиксации на клетках линии Сасо-2 и Т-24 В свою очередь штаммы 16045 и 20349 были высоко тропны к клеткам Т-24, но не Сасо-2 Штаммы 20055, 16634, 20485,20403 наоборот активно адгезировали на клетках линии Сасо-2, но слабо фиксировались на клетках Т-24

1.4 Выявление ЛСК в КЖ лактобактерий

В реакции кольцепреципитации с конА все изученные нами образцы КЖ демонстрировали наличие элиминирующегося в среду культивирования ЛСК (см материал, приведенный в табл 5)

Таблица 5

Реакция колцепреципитации КЖ с конА и концентрация белка в исследуемых КЖ лактобацилл

Показатель Ь ГегтепШш 90 ТБ-4 (производный) Ь ГегтепШт 90 ТБ-4 (21) клон 2 Ь ГегтепШт 90 Т8-4 (21) клон 3 Ь р1ап-1ашт 8КА-3 Ь р1ап- 1агит *

Реакция кольце-преципитации с конА 0,1% +++ +++ ++++ +++ +

Концентрация белка в КЖ, мкг/мл 1400 2100 8450 650 900

Примечание Время реакции "+" - более 15 мин,"++" - от 5 до 15 мин, "+++" - 5-Ю сек, "++++" - первые секунды

1.5. Торможение адгезии ДПГ С.аНнсадо штамм 01.1159 на поверхности ЭВ с помощью КЖ разных штаммов лактобактерий.

Если предположить, что ЛСК, поступающий в среду культивирования, является адгезином, то он должен ингибировать адгезию микробов на клетках-мишенях Это предположение было проверено в прямом опыте КЖ, полученную после выращивания штаммов с высокой экспрессией ЛСК (Ь Гег-теШит 90 Т8-4 (клон 2, 3), Ь р1аШашт 8 ЫА-3) и штаммов практически не продуцирующих ЛСК- Ь р!апатит 38, Ь р1апШгит* преинкубировали с ЭВ

Рисунок 4

Торможение адгезии С.а1Ысап8 штамма 01,1159 на поверхности ЭВ с помощью КЖ разных штаммов лактобактерий.

! ? 1,6 -11,4

фл

К £

о,е

в,4

' Г

Р1 Р2 РЗ Р1

КЖ различных видов па кто бацилл

1Ш,

Р2

РЗ

Пояснения к рисунку 4:

К- контроль (фмз.р..эпителий,С.а1Ысапз)

Р1- КЖ Ь.Гегтепгит 90 Т5-4 (производственный)

Р2-КЖ иЪппепшт 9018-4(25) клон 2

РЗ- КЖ ЬХегтепШт 90 Т8-4(21) клон 3 Р1-КЖ Ь.р1ап1агит* Р2-КЖ Ь.р1ап1атш 38 РЗ- КЖ Ь.р1атагит 8 КА-З

Как следует из рис. 4., значимое уменьшение (по сравнению с контролем) количества адгезпровавшихея ДПГ на одной клетке-мишени было отмечено в трех случаях преинкубации ЭВ с КЖ, содержащей ЛСК. При обработке клеток-мишеней содержимым КЖ культур, не продуцирующих ЛСК, ингибирование адгезии С. albicans штамма 01,1159 не было зарегистрировано.

Аналогичным образом бьша предпринята попытка заблокировать адгезию FimH-позитивного штамма E.coii на ЭВ. Оказалось, что введенный в систему ЛСК не блокирует фиксацию E.coii штамма М! 7 на ЭВ

1.6. Тестирование ЛСК с помощью иммунохнмического метода (непрямой метод Кунса)

Иммунохимический метод является специфическим способом тестирования ЛСК, так как иммунная сыворотка к штамму, экспрессирующему ЛСК, специфична именно к искомому продукту.

Прямым доказательством этого может служить опыт, в котором конА блокирует поверхностные антигены L.fermentum, в результате чего эти структуры становятся недоступными для антител (желто-зеленое свечение объектов в контроле - окраска антителами, меченными ФИТЦ, красное свечение в опыте - окраска препаратов Эванса синим).

Рисунок 5

Отмена и м му н офлю о ре сцен ци и после обработки L.fermentum 90 TS-4 (21) конА

ршотки шггивпдпнои шворгтпгои,

меченной ФИТЦ (без воздействия конА на лактобациялы)

б - окраска лактобактерий Эванса синим (после воздействия конА на

лактобациллы)

2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ КОМПОНЕНТОВ КЖ ШТАММА L.fermentum

90 TS-4 (21) КЛОН 3 И ИХ СПОСОБНОСТЬ ОКАЗЫВАТЬ МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА АДГЕЗИЮ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ С.albicans К ЭВ.

2Л. Антагонистическая активность культуры L.fermentum штамма 90 TS-4 (21)

Антагонистическую активность культуры L.fermentum штамма 90 TS-4 (21) изучали в сравнении с лактобактерия ми американской коллекции (L.casei АТСС 27216 и L.acidophilus АТСС 4356) в реакции отсроченной задержки роста E.coii В исследовании были использованы штаммы E.coii (JJB150, JJB4, JJF21, JJP! 14 и JJV4).

Рисунок 6

Антагонистическая активность лакто бактерий s тесте отсроченной задержки роста штаммов E.coii

п ___ ШТ1№№ лактоЁацкзш Т«$«№ЖМНЕ foci* ■пст-хуяьтур Е.(а£(ии)

JJDBft J,IB 4 JJF21 JJPIH JJY4

L.casei атсс -ты 26 37 24 25 231

в LJbmettiun 9вТ£4(21) 25 27 25 23 22

с L-Midephiki АТСС 43S6 7 9 И 1 6

i> KtHip«.»»' - ■ - -

" *" - без одета бдеторяй;

-нггтораюжения роста.

Оценка ш гамма ЬТегтепшт 90 Т5-4 (21) в отношении его способности к антагонизму в сравнении с другими л а кто бактер ия м и, используемыми в качестве пробиотиков представлена на рисунке 6, откуда следует, что высокой антагонистической активностью обладают штаммы: Ь.^егтепШт 90 Т5-4 (21) и Ь. сазе! АТСС 27216.

На основе штамма ЬТеппекйит 90Т8-4 (21) в РА на стекле было получено 4 клона данной культуры, обладающие высокой агглюгинаиионной активностью с конА, При этом наибольшей активность обладал клон 3 Ь.Гег-теп!ит 90 Т8-4 (21) (см. данные табл. 5).

2.2. Бактерицидная активность культуры БТегшсп^т штамма 90Т8-4 (21) клон 3

Бактерицидное действие культуры может быть обусловлено поступлением в среду лактоцинов или способностью лактобактерий к высокой

к ис л ото л роду к ци и. В свяли с этим представляло интерес выяснить, обладает ли бактерицидной активность КЖ штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 Данное свойство препаратов КЖ, освобожденных от низкомолекулярных компонентов путем диафильтрации на мембране РМ-20, оценивали по величине зоны задержки роста тест-культур вокруг лунок, содержащих исследуемый образец КЖ В ходе эксперимента изучали бактерицидную активность образца КЖ, как величину зоны задержки роста на 1мг белка (удельная активность), в отношении Е coli К12, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidenmidis и Gardnerella vaginalis CCUG 3757.

Рисунок 7

Бактерицидная активность КЖ L.fermentum штамма 90 TS-4 (21) клон 3 в отношении тест-культуры E.coh штамма К12

1 ~ 8450 мкг/мл

2 - СбсдК!,~ 4225 мкг/мл

3 - Сбг,1и1= 2112 мкг/мл

4 - С^ПК9= 1056 мкг/мл

5 - Сгхлка— 528 мкг/мл

Бактерицидность препарата КЖ, предварительно очищенного и лишенного низкомолекулярных компонентов, не была обусловлена ни уровнем киелотопродукцин, ни наличием пере кислых соединений. Из приведенных на рисунке 7 результатов одного из опытов видно, что бактерицидное действие препарата КЖ с рН-6,0 от L.fermentum штамма 90 TS-4 (21) клон 3 на тест-культуру является дозозависнмым (в лунки вносили разные разведения КЖ).

После расчета удельной бактерицидной активности препарата КЖ L.fermentum штамма 90 TS-4 (21) клон 3 на 1 мг белка относительно каждой тест-культуры оказалось (смтабл.6), что наиболее активно подавляется рост Staphylococcus epidermidis , несколько в меньшей степени - Staphylococcus aureus и в еще меньшей степени E.coSi штамма К12 (удельная активность составляла 10,4; 6,6; 0,89 соответственно), В отношении культуры Gardnerella vaginalis CCUG 3757 препарат был не активен.

При сравнении удельной бактерицидной активности препаратов КЖ (таблица 6) установление, что лактоцины, секретируемые в среду-кул ьтивирования, имеют различный спектр действия, зависящий от вида и штамма продуцента. Так L.plantarum продуцировал высокоактивные лактоцины к S aureus, но не активные в отношении E.coii штамма К12, в то время, как спектр действия КЖ штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 включал и эту тест-культуру

Таблица 6

тест-культуры Удельная бактерицидная активность препаратов КЖ (мм/мг)

L fermentum L plantarum 8RA-3 L plantarum *

произвол штамм 90TS-4 3 клон 90 TS-4(21) 2 клон 90 TS-4(21)

S aureus 12,9 6,6 3,3 20,8 8,35

S epidermidis 7,8 10,4 2,38 3,8 4,4

Е coh К12 3,6 0,89 нет результата нет реакции нет реакции

2.2 Модулирующее действие КЖ штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 на адгезию ДПГ Candida albicans к ЭВ.

При изучении адгезивной активности 20 клинических изолятов ДПГ рода С albicans к ЭВ, было установлено, что интегративный показатель (X) уровня адгезии колеблется в пределах от 2,02 до 0,10 В группе культур, выделенных от женщин с манифестной формой инфекции, только у двух штаммов (04 1567 и 1156) ДПГ показатель X был больше или равен 1,00 Среди культур с бессимптомным течением инфекции показатель X выше 1,00 был характерен для 7 из 10 изолятов (03 43,03 1676, 03 51, 04 418, 04 201,1220, 03 1904) При этом число активных ЭВ и число ДПГ на одной адгезирующей клетке оказался выше у штаммов от лиц с бессимптомной формой течения инфекции

Преинкубация ЭВ с КЖ Lfermentum штамма 90 TS-4 (21) клон 3 (Оелок=(>50мкг/мл) существенно повлияла на адгезивную активность ДПГ по отношению к клеткам-мишеням В ходе исследования было отмечено, что интегративный показатель изменился у 25% изученных штаммов, показатель активных ЭВ в 40% случаев, а по количеству адгезированных ДПГ на одном "активном" ЭВ у 15% штаммов После воздействия препарата КЖ на клетки-мишени 4 штамма С albicans дали повышение интегративного показателя, а 4 - понижение Статистически значимое снижение числа "активных" ЭВ наблюдалось в 5 случаях, а в 3 - увеличение Торможение адгезии /п п нз 1-ом "активном" ЭВ было установлено в отношении двух штаммов, а активация адгезивных свойств регистрировалась в отношении одного штамма С albicans В общей выборке исследованных штаммов выраженный эффект по одному из показателей адгезии отмечали в 50% случаев из них ингибирование и активация наблюдались с одинаковой частотой (интегративный показатель в контроле от 0,5 микробных тел/ЭВ и выше)

Рисунок 8

Торможение адгезии ДШ' С.аЛнсаш на поверхности ЭВ под действием КЖ НеттепШп штамма 90 (21) клон 3

штаммы ДПГ С.аКнсвпз

О контроль «опыт

3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЛСК

КЖ L.fermentum ШТАММ 90 TS-4 (25) КЛОН 3 И L. piantarum 8 RA-3 КАК ПЕРСПЕКТИВНОГО СОСТАВЛЯЮЩЕГО КОМПОЗИТНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

3.1 Выделение и частичная очистка искомого продукта

Для получения исходного сырья L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 и L.piantarum 8 RA-3 культивировали в стеклянных емкостях по 1 литру (без перемешивания). Супернатант КЖ очищали от низкомолекулярных компонентов и концентрировали путем диафильтрации на ячейках фирмы "AMICON" с использованием мембран РМ-20 марки "Диафло". После сгущения и удаления низкомолекулярных компонентов концентрация белка в образцах составляла 64,0 мг/мл и 50,0 мг/мл соответственно Эти образцы были лиофильно высушены. Выход сухого вещества с 1 мл концентрата L.fermentum штамма 90 TS-4 (21), клон 3 составил 82,0 мг, L piantarum штамма 8 RA-3 - 138,0 мг, при этом содержание белка в них было на уровне 85 и 93% соответственно. Оба образца КЖ преципитировали с шнА: L.fermentum штамм 90 TS-4 (21), клон 3 в дозе 32,5 мг/мл, a L.piantarum штамм 8 RA-3 - в дозе 250,0 мг/мл. Это обстоятельство позволило считать, что L.fermentum штамма 90 TS-4 (21), клон 3 является наиболее эффективным продуцентом ЛСК. Дальнейшие исследования проводили с образцами КЖ этого штамма.

Фракционирование такого концентрата, осуществленное путем ступенчатой диафильтрации на мембранах ХМ-300, ХМ-100 и РМ-20 установило, что фракция, активно преципитирующая конА, находится в образце, собранном над мембраной ХМ-100 (рис. 9). Это позволило заключить, что компонент представляет собой биополимер с молекулярной массой в пределах ЮО-ЗООкДа.

Рисунок 9

Относя тельная удельная активность фракций КЖ LJermentoni штам 90 TS-4 (21), клин 3 в реакции црецнтапаиии i 0,1% рапворомкокА

DOT 20-100 хДа

Ис-т 105-300 кДа Я белее 390 кДа

3.2 Изучение свойства лектннсвязывающего комплекса

Концентрат КЖ был исследован с помощью электрофореза в агаровом геле. Разделение образца проводили при рН - 8,2, напряжении 200 В и силе

тока 10 мА В ходе исследования установлено, что в концентрате КЖ L fer-mentum штамма 90 TS-4 (21), клон 3 присутствуют две фракции, движущихся к катоду

При проведении исследований в условиях движения лектинзависимой фракции через "траншею", заполненную конА-сефарозой, компонент отсутствовал в фореграмме Это факт явился основанием для выделения искомого продукта методом аффинной хроматографии ("бач"-метод) В ходе исследований отмечено, что хроматографически очищенный на конА-сефарозе продукт, содержащим 50,0 мкг/мл белка, агрегативно не устойчив при значениях рН выше 6,0

При установлении молекулярной массы данного компонента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле было выявлено, что она колеблется в пределах от 25 до 30 кДа и примерно такие же параметры для JICK можно найти в ранее опубликованной работе Hennksson А и Szewzyk R [Henriksson А, Szewzyk R Characteristics of the adhesive determinants of Lactbacillus fer-mentum 104 //App and Environmental Microbiol - 1991 - p 499-502]

3.3 Определение модулирующей активности ЛСК на адгезию тест-культур ДПГ С.albicans и E.coli к ЭВ клинически здоровых женщин.

Изучение модулирующих свойств супернатанта и хроматографически очищенной фракции КЖ Lfermentum штамм 90 TS-4 (21), клон 3 в тесте торможения адгезии тест-культур на ЭВ дало следующие результаты (таблица

Таблица 7

Модулирующее действие фракций концентрата КЖ L fermentum

штамм 90 TS-4 (21), клон 3 на тест-кулыуры при адгезии на ЭВ

Вид и штамм микроорганизмов Концентрат (РМ-20) КЖ L fermentum 90-TS-4 (21) клон 3 (Сделка= 150 мкг/мл)

Фракция, способная реагировать с конА Фракция, лишенная способности реагировать с конА

М±ш Mim

контроль опыт контроль опыт

С aibicansb04-703 Б (вагинальный изолят) 4,33±0,4 1,2±0,2* 1,26±0,2 0,64±0,12*

С albicans (оральный изолят) 13,04±1,8 8,62±1,12* 2,74±0,5 4,76±1,02

Е coli К-12 12,35±0,84 12,12±1,34 12,35^0,84 20,94±1,51

Е coh 89-1449 (кишечный изолят) 33,92±2,2 19,92±1,42* 13,76±1,6 23,64±2,9

* - достоверное снижение адгезии тест-культур на ЭВ

Приведенные данные свидетельствуют, о том что хромагографически очищенная фракция активно ингибирует адгезию вагинального изолята ДОГ вида С albicans штамм 04 703 Б на ЭВ и в меньшей степени влияет на адгезию орального изолята ДПГ вида С albicans На адгезию Е coli штамм К-12 фракция не оказывает никакого эффекта, но значительно блокирует адгезию Е coli штамм 89-1449 на ЭВ В тоже время, при удалении из КЖ L fermentum штамм 90 TS-4 (21), клон 3 лектинзависимого компонента усиливается адгезивная активность части тест-культур Е coli к ЭВ Адгезия вагинального изолята ДПГ вида С albicans штамм 04 703, в этой модельной системе уменьшается

Выводы

1 Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов, существуют варианты с выраженной экспрессией JICK и варианты, их не экспрессирующие Вариабельность экспрессии ЛСК регистрируется не только среди видов, но и внутри одного и того же производственного штамма лактобактерий

2 Адгезивная активность лактобактерий к клеткам-мишеням определяется не их видовой, а штаммовой принадлежностью и является функцией от многих производных

3 КЖ, полученная при выращивании L fermentum штамм 90 TS-4 (21), клон 3 на жидкой питательной среде в определенной степени сбалансирована и представляет собой многокомпонентную систему, оказывающую модулирующее действие на адгезию ДПГ к ЭВ только в том случае, когда штамм тест-культуры исходно высокоадгезивный

4 ЛСК, экспрессируемый некоторыми видами лактобактерий щ достаточно легко детектируемый с помощью конА, является адгезином, отличающимся от FimH Рецепторы к нему часто встречаются на разных эукариотических клетках, в связи с чем, клеточные модели можно считать наиболее адекватными при изучении конкурирующего действия лактобактерий с адгезинами патогенных микроорганизмов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Анохина И В , Кравцов Э Г, Яшина HB идр //Бюл Экспер Биол 2006 Т

141, №6 С.664-667

2 Анохина И В, Кравцов Э Г, Яшина HB идр //Бюл Экспер Биол 2006 Т

142, Neil С 557-561

3 Анохина И В , Кравцов Э Г, Яшина Н В идр //Бюл Экспер Биол 2007 Т

143, №3 С 557-561

4 Анохина И В , Кравцов Э Г, Яшина Н В и др // Вестник РУДН 2007 Т 35, №2 С 10-13

5 Всероссийская научно-практическая конференция "Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней", С 14-15 (Москва, Россия, 2006г)

6 XII Всероссийская научно-практическая конференция "Молодые ученые в медицине", С 103 (Казань, Россия, 2007г)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анохина, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Нормальная микрофлора. Пробиотические препараты.

Механизм действия пробиотиков: две концепции.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Коллекция микроорганизмов.

2.1.2 Характеристики лакгобактерий.

2.1.3 Питательные среды.

2.1.4 Тест-системы.

2.1.5 Сыворотки.

2.1.6 Буферные растворы и реагенты.

2.1.7 Биологический материал.

2.1.8 Оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Изучение морфологических и культуральных свойств.

2.2.2 Изучение биохимических свойств.

2.2.3 Получение иммунных сывороток.

2.2.4 Реакция агглютинации (РА).

2.2.5 Отбор агглютинирующих и не агглютинирующих колоний в популяции L.fermentum 90-TS-4 (21) проводили в РА на стекле.

2.2.6 Изучение адгезивных свойств лактобактерий.

2.2.6.1 Адгезия лакгобактерий на ЭВ.

2.2.6.2 Адгезия лакгобактерий на эритроцитах (реакция гемагглютинации -РТА).

2.2.7 Изучение антагонистических свойств культуральной жидкости (КЖ) лакгобактерий по отношению к ДПГ С.albicans и E.coli.

2.2.7.1. Реакция торможения адгезии ДПГ рода Candida и E.coli (штаммы - К12, Ml 7 и 89-1449) на клетках-мишенях под действием КЖ лакгобактерий.

2.2.7.2 Торможения реакции гемагглютинации (РГА).

2.2.8 Выделение лектинсвязывшощего компонента (ЛСК) из КЖ лакгобактерий с помощью метода мембранной диафильтрации.

2.2.9 Определение количества белка, выделенного из ЮК лакгобактерий

2.2.10 Выделение ЛСК из концентрата КЖ с помощью аффинной хроматографии («Ьа^Ь»-метод).

2.2.11 Отмена иммунофлюорисценции с использованием конА.

2.2.12 Сорбция сыворотки к L.fermentum 90 TS-4 культурой L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3.

2.2.13 Статистическая обработка полученных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Сравнительный анализ производственных и коллекционных штаммов лактобактерий.

3.1.1 Выявление штамма, экспрессирующего наибольшее количество ЛСК в среду культивирования.

3.1.1.1 Морфологические, культуральные и биохимические свойства лактобактерий.

Изучение морфологических свойств.

Изучение культуральных свойств.

Изучение биохимических свойств.

3.1.1.2 Агглютинационная активность культур по отношению к кон А.

3.1.1.3 Агглютинационная активность культур по отношению к иммуноспецифической сыворотке L.fermentum 90 TS-4 (21).

3.1.1.4 Агглютинационная активность клонов L.fermentum.

3.1.2 Характеристика изучаемых культур по их адгезивной активности.

3.1.2.1 Адгезия лактобактерий на поверхности эритроцитов барана, морской свинки, человека IV(AB) и 1(0) Р+ групп крови и химически чистых биосубстратах.

3.1.2.2 Адгезия лактобактерий на поверхности эпителиальных клеток

3.1.3 Выявление ЛСК в ЮК лактобактерий. Модулирующая активность КЖ в отношение ДПГ C.albicans и E.coli при адгезии на клетках-мишенях (ЭВ)

3.1.3.1 Реакция кольцепреципитации КЖ с конА и определение концентрации белка в исследуемых КЖ лактобацилл.

3.1.3.2 Торможение адгезии ДПГ C.albicans 01.1159 и FimH-позитивного штамма E.coli Ml7 на поверхности ЭВ с помощью КЖ разных штаммов лактобактерий.

3.1.3.3 Тестирование ЛСК с помощью иммунохимического метода (непрямой метод Кунса).

3.1.3.4 Сорбция сыворотки лактобактериями обработанными и не обработанными конА.

3.2. Изучение свойств компонентов КЖ штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 и их способность оказывать модулирующее действие на адгезию ДПГ C.albicans к ЭВ.

3.2.1. Антагонистическая активность культуры L.fermentum штамма 90 TS-4 (21).

3.2.2. Бактерицидная активность культуры L.fermentum штамма 90 TS

21)клон 3.

3.2.3 Модулирующее действие КЖ штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 на адгезию ДПГ Candida albicans к ЭВ.

3.3. Изучение свойств ЛСК КЖ L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) клон 3 и L.plantarum 8 RA-3 как перспективного составляющего композитного пробиотического препарата.

3.3.1 Выделение и частичная очистка искомого продукта.

3.3.2 Изучение свойства лектинсвязывающего комплекса.

3.3.3 Определение модулирующей активности JICK на адгезию тест-культур ДПГ C.albicans и E.coli к ЭВ клинически здоровых женщин.

ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий"

Актуальность проблемы

В настоящее время широкое распространение дисбиотических состояний среди населения всех возрастов требует активного развития индустрии препаратов и продуктов с пробиотическими свойствами.

По современным представлениям дисбактериоз это не локальное заболевание, а основа, на которой строятся многие независимые друг от друга болезни. На сегодняшний день большое внимание уделяется дисбактериозам желудочно-кишечного и урогенитального трактов человека. По данным литературы, дисбактериоз в РФ определяется у 75-90% населения.

Для создания колонизационной резистентности организма-хозяина по отношению к болезнетворным микробам, а также, для поддержания метаболических процессов, протекающих в макроорганизме, важное значение имеет нормальная микрофлора различных биологических ниш организма человека.

В свою очередь слизистая оболочка это также уникальное образование, в котором различные микроорганизмы способны оказывать то или иное действие. Контакт между микроорганизмом и слизистым слоем человека влиянием обоих сторон играет важную роль в поддержании здоровья человека, поскольку стимулирует ответ иммунной системы на инфекцию и за счёт бактериального антагонизма ингибирует колонизацию терминальных ниш патогенными бактериями.

Лактобащгллы — одна из групп бактерий, которая естественна для терминальных ниш организма человека. Пробиотики на основе лактобактерий интенсивно изучаются в экспериментальных исследованиях и клинической практике.

Существует два варианта, объясняющих механизм их благоприятного действия на макроорганизм. Согласно первому, лактобактерии, отобранные в качестве лечебного и профилактического начала, адгезируют к эпителиоцитам кишечника и создают дополнительный барьер на их поверхности, препятствующий транслокации условно-патогенной и патогенной кишечной микрофлоры во внутреннюю среду макроорганизма.

Второй вариант допускает интенсивное размножение пробиотических культур в просвете терминальной ниши, которая в этом случае рассматривается как "биологический ферментер". Накапливающиеся при этом в "среде культивирования" бактериоцины, металпротеиназы, слущивающиеся с поверхности л акто бактерии специфические адгезины блокируют и дезинтегрируют условно-патогенную и патогенную микрофлору, защищая т.о. макроорганизм от потенциально способных к транслокации бактерий.

Признавая право на существование обоих современных концепций, описывающих механизм действия пробиотиков на основе лактобактерий, можно предположить, что наилучшую композицию пробиотического препарата может дать комбинация штаммов-продуцентов, в которой будут присутствовать как микроорганизмы, несущие на своей поверхности слущивающийся с поверхности лактобактерии специфические адгезины, так и культуры, адгезивную активность которых определяют лектино-подобные структуры, плотно связанные с бактериальной стенкой.

Выделение слущивающихся поверхностных адгезинов позволит микрокапсулировать эти структуры и создать условия, в которых пробиотический препарат при отсутствие биотопозависимости будет способен экранировать сайты связывания на клетках-мишенях от представителей болезнетворной флоры.

Цель и задачи исследования.

По ходу достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1.Сравненительное изучение производственных штаммов лактобактерий на предмет оценки их морфологических, биохимических и физиологических свойств.

2.Отбор штаммов лактобактерий, различающихся по признаку агглютинации с конканавалином А (конА).

3.Проведение селекции полученных клонов лактобактерий с высокой агглютинационной активностью в отношении конА.

4.Выделение поверхностного лектинсвязывающего компонента (JICK) лактобактерий и оценка его роли в феномене адгезии к эукариотическим клеткам-мишеням.

Научная новизна.

Впервые установлено, что экспрессия рыхлосвязанных с клеточной стенкой адгезинов характерна не для всех пробиотических культур и варьирует в пределах одного вида лактобактерий. Впервые удалось выделить варианты лактобацилл с выраженной экспрессией лекинзависимых структур и варианты, не экспрессирующие их.

Впервые показано, что набор адгезинов у культур разных видов лактобацилл и их активность в реакции агглютинации с эритроцитами барана, морской свинки, человека IV (АВ) и I (0) Р+ групп крови вариабельны, а связь между агглютинацией лактобацилл конА и их адгезией на клетках-мишенях не может быть оценена как значимая.

Установлено, что элиминируемый в среду культивирования JICK является гликопротеином, включающем маннозу.

Практическая значимость.

Терапевтическое действие пробиотиков рассматривается как результат конкурентного отношения между «полезными» бактериями и бактериями, вызывающими патологические процессы в макроорганизме. При таком подходе к рассматриваемой ситуации всегда существует зависимость от физиологического состояния конкретной терминальной микроэкологической ниши - биотопа. Использование в производстве пробиотических препаратов лактобактерии, сбрасывающие со своей поверхности ЛСК, позволит с несколько иных позиций подойти к решению проблемы дисбактериоза в терапевтической и гинекологической практике.

Положения., выносимые на защиту.

1. Для лактобактерий характерна вариабельность экспрессии ЛСК на поверхность клетки. Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов существуют, варианты с выраженной экспрессией таких структур и варианты их не экспрессирующие.

2. Культуральная жидкость (КЖ), полученная после выращивания лактобактерий на жидкой питательной среде, представляет собой многокомпонентную систему, включающую биополимеры.

3. Биополимеры ЮК некоторых видов лактобактерий способны оказывать модулирующее действие на адгезию патогенной и условно-патогенной флоры к эпителиоцитам влагалища (ЭВ).

4. КЖ, полученная при культивировании лактобацилл, в определенной степени сбалансирована, поскольку удаление из нее компонента, тормозящего адгезию, усиливает фиксацию тест-культур на клетках-мишенях.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Анохина, Ирина Викторовна

Выводы

1. Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов, существуют варианты с выраженной экспрессией JICK и варианты, их не экспрессирующие. Вариабельность экспрессии ЛСК регистрируется не только среди видов, но и внутри одного и того же производственного штамма лактобактерий.

2. Адгезивная активность лактобактерий к клеткам-мишеням определяется не их видовой, а пггаммовой принадлежностью и является функцией от многих производных.

3. ЮК, полученная при выращивании L.fermentum штамм 90 TS-4 (21), клон 3 на жидкой питательной среде в определенной степени сбалансирована и представляет собой многокомпонентную систему, оказывающую модулирующее действие на адгезию ДПГ к ЭВ только в том случае, когда штамм тест-культуры исходно высокоадгезивный.

4. ЛСК, экспрессируемый некоторыми видами лактобактерий и достаточно легко детектируемый с помощью конА, является адгезином, отличающимся от FimH. Рецепторы к нему часто встречаются на разных эукариотических клетках, в связи с чем клеточные модели можно считать наиболее адекватными при изучении конкурирующего действия лактобактерий с адгезинами патогенных микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анохина, Ирина Викторовна, Москва

1. Анкирская А.С. Бактериальный вагиноз.// Ж. акушерства и гинекологии1995 -6 с.13-16

2. Багирова М.Ш., Коршунова О.В., Кафарская Л.И., Минкина Г.Н.

3. Микрофлоро генитального тракта у больных с попиломавирусной инфекцией.// Ж. Микробиология. 1995 - 3 - с. 113-116

4. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Бондаренко В.М., Лихачева А.Ю.

5. Традиционная классификация и геносистематика бактерий рода Lactobacillus.// Ж.Микробиол.-1995-4-с .19-23

6. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты спробиотической функцией / Журн. микробиологии. 2004. — № 1. - С. 84-92.

7. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбакгериозыкишечника у взрослых / КМК Scientific Press. М. - 2003. - С. 220.

8. Бондаренко В.М., Боев Б.В., Лыкова Е.А., Воробьев А.А. //Рос. журн.гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 1998. - № 1. - С. 66-70.

9. Бондаренко В.М. Характеристика и терапевтический потенциалпробиотиков по данным клинических испытаний. //Журн. Биопрепараты. 2007 - №1 - С.11-15

10. Бондаренко В.М. Классификация бактерий рода Lactobacillus //

11. Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитологов. М., 2002. Т. 1. С. 140.

12. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл. // Автореф.дисс.канд.мед.наук М. -1983 -19с.

13. Воробьев А. А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры:биологические свойства и защитные функции / Журн. микробиологии. -1999—№6. -С.102-105.

14. Володин Н.Н., Ефимов Б.А., Пикина А.П., Коршунова О.В., Смеянов

15. В.В., Коршунов В.М. Микробиологическая диагностика дисбактериозов кишечника (пособие для врачей).- М.- 1997 24с.

16. Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл.// Бюллетень сибирской медицины, 4, 2003

17. Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов. Итоги науки и техники, ВИНИТИ: сер. Микробиология. - М - 1985 -т.16 - 107с.

18. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Грантъ,2002. 296 с.

19. Караев З.О., Величко Е.В., Быков В.Л. // Ж. Микробиол. 1986 - 7 -с.59-61

20. Квасникова Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.-1975

21. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз.//Автореф. дисс.д-ра мед. Наук СПб1995-44с.

22. Кирющенков А. Бактериальный вагиноз и генитальный кандидоз. // Ж. Врач- 1993-11 -с.11-15

23. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э., Тюрин М.Э. Лакгофлора колонизационная резистентность. // Антибиотики 1987 - 3 - с. 173-179

24. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Тоом М.А. О способности лактобацилл микрофлоры человека продуцировать лизоцим. // Ж. Микробиол. 1975- 8- с. 77-81

25. Несвижский Ю.В. Изучение изменчивости кишечного микробиоценозачеловека в норме и патологии.// Вестник Российской АМН. 2003 -№1.-С. 49-5326,Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Б. и др. / Журн. микробиологии. -2003. — № 3. С. 113-119.

26. Роуз Э. Химическая микробиология. -М -1971- с.89-90

27. Соколова К.Я., Соловьева Н.В., Панова Е.В., Федотова М.Н. Новыеподходы к изучению и оценке микробиоценозов влагалища.// Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький -1988 - с.5-10.

28. Тимербаева Р.Х. Профилактика и лечение дисбактериозов лактсодержащими бактерийными препаратами ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа

29. Черкасов С.В., Константинов О.Д. Антилизацимная активность и видоваяхарактеристика микрофлоры репродуктивного тракта женщин во время беременности.//Ж.Микробиология. 1996 -3- с.88-90

30. Под ред. Ф. Герхарда и др. Методы общей бактериологии: перев. с англ. //- М. Мир - 1984 - т.2 - с.469

31. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред Г.Г. Оншценко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. 608 с.

32. Abreu MT, Taylor K.D., Lin Y.C. et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn's disease. Gastroenterology 2002, 123: 679-88

33. Aderem Д Ulevitch RJ Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature. 2000 Aug 17;406(6797):782-7.

34. Archibald A.R., Armstrong J J., Baddiley J., Hay J.B. Teichoic acid and thestructure of bacterial walls.// Nature 1961 - 191 - p. 570-572

35. Baddiley J., Davison A.L. The occurrence and location of teichoic acid in lactobacillus.// J. Gen.Microbiol.-1961 -24-p.295-299

36. Blaut, M., Collins, M. D., Welling, G. W., Dore, J., van Loo, J., and de Vos, W. (2002). Molecular biological methods for studying the gut microbiota: the EU human gut flora project. Br J Nutr 87 Suppl 2, S203-S211.

37. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 1998, 42: 2-7

38. Bengmark S., Gianotti L. Nutritional support to prevent and treat multiple organ failur. World J Surg 1996, 20: 474-81

39. Barrow P.A., Brooker B.E., Fuller R., Newport M.J. The attachment of bacteria to the gastric epithelium of the pig and its importance in the microecology of the intestin. J Appl Bacterid 1980, 48: 147-54

40. Brownlee A., Moss W. The influens diet on lactobacillus in the stomach of therat. //J.Path. Bact. 1961 -82 (2) -p.513-516

41. Barrou P.A., Fuller R.,Newport M.J. Changes in the microflora and physiolgy of the anterior intestinal tract of pigs weaned at 2 days, with special referans to the pathogenessis diarrea.// Infect Immunol. 1997 -18 - p.586-595

42. Brown J.P. Cytochemical Electron Microscopic Localization of Esterase Activity in Lactobacillus casei. // App. Microbiol.- Jun 1970 - p.-1001-1004

43. Berg R.D. Probiotics, prebiotics or "combiotics"? Trends Microbiol 1998, 6:89.92

44. De Simone C. VSL#3 A probiotic preparation investigator brochure. 2001

45. Dembele Т., Obdrzalek., Votava M. Inhibition of bacterial pathogens by lactobacilli. Zentralbl Bacterid 1998, 288: 395-401

46. Dubos R., Schedler R.W., Castello R., Hoet P. Indigenous, normal and autochthonous flora of the gastrointestinal tract. // J. Exp. Med. 1965 - 122 - p.67-76

47. Doring В., Ehrhardt S., Lucke F., Schillinger U. // System. Appl. Microbiol. 1988. V. 11. < l.P. 67—74.

48. Eckmann L., Kagnoff M.F., Fierer J. Intestinal epithelial cells as watchdogs for the natural immune system. Trends Microbiol 1995 3: 118-20

49. Fabia R., Ar Rajab A., Johansson M.L. et al. Impairment of bacterial flora in human ulcerative colitis and experimental colitis in the rat. Digestion 1993, 54: 248-55

50. Faro S. Review of vaginitis. // Inf. Dis. Obstet. Gynecol. 1993 - 1 - p. 153161

51. Fitzsimmons N., Berry D.R. Inhibition of Candida albicans by Lactobacillus asidophilus: evidance for the invovement of peroxidase system. // Microbios. -1994-80 (323) -p.125-133

52. Fuller R., Turvey A. Bacteria associated with the intastinal wall of the fowl (Gallus domesticus). // J.Appl. Bacteriol. 1971 - 34 - p.617

53. Gibbons R.J., Van Hout J. Bacterial adherence in oral microbial ecology.1. Boston-1975-p. 19-44

54. Granato D., Perotti F., . Masserey I. et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii Lai to human enterocyte-like Caco-2 cells. // Appl Environ Microbiol. 1999. V.65. P.1071-1077.

55. Henriksson A., Szewzyk R. Characteristics of the adhesive determinants of Lactbacillus fermentum 104 // App. and Environmental Microbiol. 1991 -p. 499-502

56. Heinemann C., van Hylckama Vlieg J.E., Janssen D.B., Busscher H.J., van der Mei H.C. Reid G. // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 190. P. 177-180.

57. Isolauri E, Majamaa H, Arvola T, Rantala I, Virtanen E, Arvilommi H. Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology. 1993 Dec; 105(6): 1643-50.

58. Ivanova T, Jekova M. Preventive role of lyophilic dairy products bulgaricum and biostim. 1997 Mar 19;114(l-2):93-5.

59. J G Ruseler-van Embden, W R Schouten, and L M van Lieshout. Pouchitis:result of microbial imbalance? Gut 1994 May; 35(5): 658-664.

60. Jiang Q, Akashi S, Miyake K, Petty HR. Lipopolysaccharide induces physicalproximity between CD. 4 and toll-like receptor 4 (TLR4) prior to nuclear translocation of NF-kappa B. J Immunol. 2000 Oct l;165(7):3541-4.

61. Jean-Christophe Bocle. Effets des probiotiques et prebiotiques sur la flore etl'immunite de I'homme adulte. AFSSA.2005. p.128- ISBN 2-11-095439-6

62. Karimi О., Pena A.S. Clinical aspects of probiotics: News on the horizon. Yakult 2003 in press.

63. Kawai Y., Suegora N., Shimohashi H. Colonization of lactic acid bacteria isolatade from rats and humans in the gastrointestinal tract of rats. // J. Microbiol. Immunol. 1982 - 26 (5) -p.363-373

64. Kawai Y., Suegora N. Specific adhesion of lactobacilli to keratinized epitalial cells of the rat stomach in vitro. // Am. J. Clin. Nutr. -1977 Nov. - 30 -p.1777-1780

65. Kato I., Tanaka K., Yokokura T. // J. Immunopharmacol. 1999. V. 21. P. 121131.

66. Kaila M., Isolauri е., Soppi E. Et al. Enhancement of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhea by a human Lactobacillus strain. Pediatr Res 1992, 32:141-4

67. Kruis W, Schutz E, Fric P, Fixa B, Judmaier G, Stolte M. Double-blind comparison of an oral Escherichia coli preparation and mesalazine in maintaining remission of ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 1997 Oct;ll(5):853-8.

68. Knox K.W., Campbell L.K., Evans J.D., Wisken AJ. Identification of thegroup G antigen of Lactobacilli. // J. Gen. Microbiol. 1980 -Jul. - 119(1)-p.203-209

69. Knox K.W., Wicken A J. Serological properties of the wall andnembrane teichoic acid of Lactobacillus helveticus NCIB 8025. // J. Gen.microbiol. -1970 63 - p.237-248

70. Knox K.W., Wicken AJ. // Bacterid. Rev. 1973 - 37 - p.215-257

71. Lancefield R.C. //J.Exp. Med. 1933 - 57 - p.571-595

72. London J. The ecology and taxonomic status of the lactobacilli. // Ann. Rev. Microbiol. 1976 - 30 - p.279-301

73. Lidbeck A., Nord C.E. Lactobacilli and the normal human anaerobic microflora. // Clin. Infect. Dis. 1993 - Jun.- p.l81-187

74. Lepargneur J.P., Rousseau V. Role protecteur de la flore de Doderleln. J Gynecol Obstet Reprod 2002, 31 : 485-494

75. Lee I.A., Bouchard C., Simard R.E., Pichard В., Holley K.A. Effect du pH, de la temperature et de Diverssels sur la croissance de Lactobacillus plantarum sous atmospheres modifiees // Lebensm.-Wirs+Technol. 1986. V.19. < 2. P. 132—137.

76. Mack, D. R., Michail, S., Wei, S., McDougall, L., and Hollingsworth, M. A. (1999). Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Am. J Physiol 276, G941-G950.

77. McFarland L.V. Probiotics and C.difficile diarrhea. Am J Gastroenterol 2000, 95:2128

78. Madsen K.L. The use probiotics in gastrointestinal disease. Can J Gastroenterol 2001, 15: 817-22

79. Malin M, Suomalainen H, Saxelin M, Isolauri E.Promotion of IgA immune response in patients with Crohn's disease by oral bacteriotherapy with Lactobacillus GG. Ann NutrMetabl996;40(3): 137-45.

80. McGeehan G.M., Becherer J.D., Bast R.C. et al. Regulation or tumour necrosis fector-alpha processing by a metalloproteinase inhibitor. Nature 1994, 370: 558-61

81. Nicand E., Cavallo J.D., Crenn Y., Meyran M. Scoring system for Gram stain diagnosis of bacterial vaginosis. // Path.Biol. 1994 - 42(5) - p.539-543

82. Patterson J.A., Burkholder K.M. Application of prebiotics and probiotics in poultry production. Poult Sci 2003, 82: 627-31

83. Perdigon G., Nader de Macias M.E., et al. Prevention of gastrointestinal infection using immunobiological methods with milk fermented with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus. J Dairy Res 1990, 57: 25564

84. Pena A.S. Genetics of inflammatory bowel disease. The candidate gene approach: Susceptiblity disease heterogeneity. DigDis 1998,16: 356-63

85. Rambaud J.C., Bouhnik Y., Marteau P., Pochart P. Manipulation of the human gut microflora. Proc Nutr Soc 1993, 52: 357-66

86. Rani В., Khetarpaul N. Probiotic fermented food mixtures: Possible applications in clinical anti-diarrhoea usage. Nutr Health 1998, 12: 97-105

87. Rojas M., Ascencio F. and Conway L.P. Purification and characterization of a surface protein from Lactobacillus fermentum 104R that binds to porcine small intestinal mucus and gastric mucin. // Appl Environ Microbiol. 2002-V.68 -p.2330-2336

88. Romagnani S., Parronchi P., D'Elios M.M. et al. An update on human Thl and Th2 cells Int Arch Allergy Immunol 1997, 113: 153-6

89. Rogosa M., Sharpe M.E. An approach to the classification of lactobacilli.// J. Appl. Bact. -1959-22-p.329-340

90. Zoetendal, E. G., Akkermans, A. D., and De Vos, W. M. (1998). Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria. Appl Environ Microbiol 64, 3854-3859.

91. Sullivan MGTGOSGCC J.K Probiotic bacteria: Myth or reality? Trends Food Sci Technol 1992, 3: 309-14

92. Sorokulova I.B., Kirik D.L., Pinchuk I.I. Probiotics against Campylobacter pathogens. J Travel Med 1997, 4: 167-70

93. Schiffiin E.J., Brassart D., Servin A.L. et al. Immune modulation of blood leukocytes in humans by lactic acid bacteria: Criteria for strain selection. Am J Clin Nutr 1997, 66:515S-20S

94. Savage D.C., Dubos R., Schaedler R.W. The gastrointestinal epitelium and its autochthonus bacterial flora. // J/ Exp. Med. 1968 - 127 - p.67-76

95. Sonnenborn U., R. Greinwald. Antagonismus von E. coli gegen andere Mikroorganismen.// In Beziehungen zwischen Wirsorganismus und Darmflora, 2nd Ed.1991. Stuttgart -New York.p.55-69

96. Sharpe M.E. //J. Gen. Micribioi. 1955 - 12 - p.107-122

97. Shimohashi H. Antigenic analyses of Lactobacilles fermenti. //Jpn. J. Microbiol. 1975 - Apr. - 19(2) - p. 133-140

98. Stein PE, Leslie AG, Finch JT, Carrell RW. Crystal structure of uncleaved ovalbumin at 1.95 A resolution. J Mol Biol. 1991 Oct 5;221(3):941-59.

99. Tannoc G.W., Archibald R.D. //Canad. J. Microbiol. 1984 - 30 - p.849-853

100. Tannoc G.W., Smith J.M.V. The microflora of the pig stomach and its possible relationship to ulceration of the pars oesophagea. // J. Сотр. Pathol. 1970 - 80 - p.359-367

101. Ulisse S., Gionchetti P., D'Alo S. Et al. Expression of cytokines, inducible nitric oxide synthase, and matrix metalloproteinase in pouchitis: Effects of probiotic treatment. Am J Gastroenterol 2001, 96: 2691-9

102. Vaughan E.E., Mollet В., deVos W.M. // Curr Opin Biotechnol. 1999. V. 10. P. 505-510

103. Vitagliano L, Merlino A, Zagari A, Mazzarella L. Reversible substrate-induced domain motions in ribonuclease A.Proteins. 2002 Jan 1;46(1):97~ 104.

104. West C.A., Warner P.J. Plantacin B. Is bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum NCDO 1193.// FEMS Microbiol. Let. 1988 - 49 - p. 163-165

105. Wilson, К. H., and Blitchington, R. B. (1996). Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis. Appl Environ Microbiol 62, 22732278.

106. Woese, C. R., Kandler, O., and Wheelis, M. L. (1990). Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci USA 87, 4576-4579.

107. Williams RL, Greene SM, McPherson A. The crystal structure of ribonuclease В at 2.5-A resolution. J Biol Chem. 1987 Nov 25;262(33): 16020-31.

108. Williams N.B.// J. Amer. Dent. Ass. 1948 - 37 - p 407

109. Eschenbach D.A., Davick P.R., Klebanoff SJ. et al Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women wiht bacterial vaginosis.// J.Clin.Microbiol. 1989 - Feb. - 27(2) - p.251-256

Информация о работе

Анохина, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы