Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Летучие соединения в моче самцов мышей как индикаторы функционального состояния иммунной и репродуктивной систем

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Летучие соединения в моче самцов мышей как индикаторы функционального состояния иммунной и репродуктивной систем"

На правах рукописи

ШНАЙДЕР ЕЛЕНА ПАВЛОВНА

ЛЕТУЧИЕ СОЕДИНЕНИЯ В МОЧЕ САМЦОВ МЫШЕЙ КАК ИНДИКАТОРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ И РЕПРОДУКТИВНОЙ

СИСТЕМ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 ФЕВ 7013

Новосибирск 2013

005049304

Работа выполнена в лаборатории экологической генетики млекопитающих Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мошкин Михаил Павлович Институт цитологии и генетики СО РАН, заведующий отделом генофондов экспериментальных животных

доктор биологических наук Гилинский Михаил Абрамович НИИ «Институт физиологии» СО РАМН, заведующий лабораторией регуляции адаптационных процессов

доктор оиологических наук Солёнов Евгений Иванович Институт цитологии и генетики СО РАН. с.н.с. сектора молекулярной физиологии клетки

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова» Российской академии наук

7)9

20 В г. на утреннем заседании

Защита диссертации состоится «¿¿>> диссертационного совета Д 001.014.01'по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в НИИ «Институт физиологии» СО РАМН в конференц-зале Института по адресу:

630060, г. Новосибирск, ул. Тимакова 4, т. (383)335-98-55, факс (383) 335-97-54, е-таіі: nauka@physiol.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ «Институт физиологии» СО РАМН.

Автореферат разослан «^У» ЯИв/І^Л 20 :

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: В животном мире запах особи имеет очень важное значение. Ему отведена роль индивидуального MapKtpa, по которому мать может разыскать своих детёнышей, самка выбрать подходящего полового партнёра, а самец сообщить о своём территориальном и иерархическом статусе. Кроме того, запах стрессированного или инфицированного животного влияет на поведение других особей (Novotny et al., 1985; Yamazaki et al., 2002; Kavaliers et al., 2005), их иммуно-физиологические функции (Суринов и др., 2005) и даже на хромосомный аппарат реципиента хемосигналов (Даев, Дукельская, 2005). Причем влияние паразитов на запах хозяина в значительной степени определяется активацией иммунной защиты и зависит от функциональной реактивности иммунной системы (Moshkin et al., 2001; Moshkin et al., 2002; Zala et al. 2008).

Всё это каким-то образом зашифровано в молекулах, формирующих индивидуальный запах, и расшифровка этого сигнального кода представляет не только фундаментальный, но и практический интерес, поскольку создает научную основу для развития методов неинвазивной диагностики людей, сельскохозяйственных и диких животных. Кроме того, композиции летучих органических соединений (JIOC) рассматриваются в качестве перспективного средства управления поведением и физиологическим состоянием животных и человека (Rekwot et al., 2001; Tamagawa et al., 2008). Важно подчеркнуть, что у млекопитающих, в отличие от беспозвоночных животных, внутривидовая хемокоммуникация базируется не столько на отдельных химических соединениях - феромонах в классическом смысле (Karlson, Luscher, 1959), сколько на композициях органических молекул — так называемых signature mixture (Wyatt, 2009; Wyatt, 2010). Причем формирование и восприятие этих композиций имеет и врожденную и приобретенную составляющую (Суров и др., 2004). Все это вносит дополнительные трудности в расшифровку запаховых сигналов млекопитающих.

В настоящее время весьма интенсивно ведётся исследование летучих соединений, выделяемых мышами, которые относятся к наиболее распространенным объектам хемокоммуникационных исследований. У мышей наибольший интерес представляют мочевые метки самцов, богатые белками, благодаря которым летучие вещества удерживаются на месте гораздо дольше (Hurst et al., 1998; Arakawa et al., 2008). Кроме мочи и мочевых меток, индивидуальные маркёры могут содержаться в фекалиях, слюне и даже в крови животных (Lee and Ingersoll, 1979; Knapp et al., 2006). Но наиболее изученными являются запаховые компоненты мочи. К настоящему времени получен список основных летучих органических соединений, входящих в её состав и их приблизительные концентрации (Schwende ct al., 1986; Willse et al., 2005; Novotny et al., 2007; Pysanenko et al., 2009). Однако этого знания недостаточно, для того чтобы использовать запахи для неинвазивной диагностики индивидуальных качеств особи и для управления поведением животных. Необходимо понять, какие именно ДОС ответственны за ту или

иную поведенческую реакцию животных, участвующих в восприятии запаха и как меняются сами стимулы при изменении физиологического состояния животного-донора.

В отличие от изучения роли запахов в формировании поведенческих и физиологических реакций, существенно меньше работ посвящено влиянию физиологии и образа жизни особи на её запаховый сигнал. Большей частью они связаны с изучением зависимости JIOC от эндокринной функции гонад (Schwende et al., 1986; Andreolini et al., 1987; Jemiolo et al., 1987; Osada et al., 2008). Установленная Yamazaki et al. (1999) зависимость индивидуального запаха от генов главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex - МНС) стимулировали изучение различий в композиции JIOC в зависимости от МНС генотипа. Однако сопоставление результатов разных авторов показало, что, хотя JIOC и варьируют в соответствии с генотипом донора, характер этих вариаций не совпадает в работах разных авторов (Willse et al., 2005; Novotny et al., 2007; Rock et al., 2007; Kwak et al., 2010). Следует также упомянуть исследования, в которых выделены вещества, ассоциированные с такими физиологическими состояниями как половое созревание и стресс (Schaefer et al., 2010).

Значительная методологическая сложность в расшифровке хемосигналов млекопитающих заключается в стохастическом характере их формирования и восприятия (Wyatt, 2010). Комплексное исследование летучих компонент запаха всегда представляло собой сложную задачу ввиду огромного количества летучих соединений внутри одного образца и большого разнообразия их химических структур, для некоторых из которых необходимо подбирать особые методы и условия анализа. Большой вклад индивидуальных особенностей животного в его химические профили, также существенно усложняет задачу, приводя к необходимости исследования больших выборок образцов (Rochfort, 2005). Это существенно повышает временные и финансовые затраты на исследования. Для оптимизации этой работы нами предложен следующий 3-х ступенчатый алгоритм:

анализ ДОС, содержащихся в образце, на основе высокопроизводительной газовой хроматографии с низкой эффективностью разделения;

- биотестирование, т.е. выявление сигнальных образцов, в данном случае мочевых меток, различающихся по биологическим эффектам;

- идентификация JIOC, выделенных при хроматографии, на основе хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения.

Этот алгоритм был применен для изучения изменений хемосигналов, которые, как было показано ранее (Moshkin et al., 2001; Moshkin et al., 2002), наблюдаются при антигенной стимуляции иммунной системы животных, а также для поиска неинвазивных маркеров, отражающих физиологическое состояние и репродуктивные качества самцов мышей.

Цели работы и задачи исследования. Целью работы являлось изучение летучих компонентов в моче самцов мышей и их взаимозависимостей с

активацией иммунной системы, а также репродуктивными способностями самца.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) На основе высокопроизводительной газовой хроматографии исследовать изменчивость спектра летучих органических соединений в образцах мочи контрольных и иммунизированных самцов.

2) Сопоставить индивидуальные вариации летучих органических соединений с репродуктивной эффективностью самцов.

3) Сопоставить вариации летучих соединений в моче самцов с физиологическими характеристиками их иммунной и репродуктивной системы, а также с их эндокринными параметрами.

4) Провести хромато-масс-спсктрометрическую идентификацию химической структуры некоторых биологически значимых летучих соединений.

Положения, выносимые на защиту:

1) Антигенная стимуляция иммунной системы влияет на обмен веществ, что проявляется в изменении спектра выводимых с мочой летучих соединений.

2) В моче самцов мышей содержатся летучие вещества, отражающие репродуктивные возможности животного.

3) Корреляции между показателями эндокринной функции гонад и компонентами запаха, имеющие место у самцов мышей до активации иммунной защиты, нарушаются при антигенной стимуляции.

Научная новизна: В рамках данного исследования были впервые изучены изменения композиции летучих органических соединений в составе запаховых сигналов самцов мышей при развитии иммунной реакции на введение чужеродного антигена. Установлены достоверные изменения нескольких компонентов запаха при антигенной стимуляции животных. На основе многомерной статистики (метод главных компонент) для всей совокупности химических компонентов показано, что сочетание 2-х компонент позволяет с высокой степенью статистической значимости дифференцировать контрольных и антигенстимулированных особей и особей с высокой или низкой иммунореактивностью. Таким образом, впервые экспериментально обосновано, что композиция летучих соединений, выделяемых с мочой, содержит информацию, достаточную для ольфакторного выбора полового партнера и для диагностики иммунного статуса животного.

В работе была установлена положительная связь между репродуктивным успехом самцов и амплитудой трёх хроматографических пиков, которые были идентифицированы как дигидрофураны (ДГФ), являющиеся производными гептанона — феромона самцов мышей, стимулирующих половое созревание самок. Нашими исследованиями впервые показана прямая корреляция между уровнем ДГФ и репродуктивными потенциями самцов. Кроме того, у контрольных самцов выявлены корреляции между ДГФ и эндокринной функцией гонад. Причем наблюдаемые в контроле взаимозависимости нарушаются при антигенной стимуляции самцов, вплоть до инверсии знака корреляции.

Теоретическая и практическая значимость: Установленные в работе хемокоммуникационные и репродуктивные эффекты антигенной стимуляции вносят вклад в изучение механизмов воспроизводства млекопитающих на фоне таких иммуногенных стимулов, как инфекции и аллергены. Изменения корреляций между хемосигнальными маркерами и морфофизиологическими характеристиками самцов, наблюдаемые при активации защитных механизмо! указывает на то, что паразитарная индукция иммунной системы может нарушать сложившийся в популяции генетически детерминированный подбор брачных партнеров.

Кроме того, мы апробировали разработанный для решения оборонных и геологических задач газовый хроматограф ЭХО-В, который может найти широкое применение в биологических и биомедицинских исследованиях, как портативный и высокопроизводительный инструмент. Наибольший интерес для биологии и медицины представляет обусловленная поликапиллярностыо высокая чувствительность прибора. Полученные на основе ЭХО-В данные о диагностической значимости ДГФ могут найти применение при мониторинге репродуктивных качеств самцов мышей, чье разведение относится к самому динамично развивающемуся направлению животноводства.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном выполнении всех этапов пробоподготовки и хроматографирования мочи, включая отработку метода предварительного концентрирования летучих компонентов мочи, а также подбор оптимальных условий для хроматографического разделения образцов. Автором полностью выполнен статистической анализ первичных материалов, проведена интерпретация результатов, апробация материала и подготовка публикаций.

Апробация работы: Результаты работы были представлены на 2-ух международных конференциях: «International Symposium on Olfaction and Electronic noses» (Брешия, Италия, 2009), «Exhaled Breath Analysis: From Sensors to Devices and Applications» (Барга, Италия, 2010). И на одной российской научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, ИХБФМ СО РАН, 2009).

Материалы диссертации докладывались на межлабораторном семинаре ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2011).

Публикации: По материалам исследования опубликовано 5 работ, в том числе 2 в рецензируемых изданиях.

Структура работы: Диссертация изложена на 107 страницах и состоит из введения, четырёх глав текста, выводов, списка цитированной литературы (147 наименований, в том числе 138 на иностранных языках) и 3-ёх приложений. Текст иллюстрирован 17 таблицами и 17 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена в рамках бюджетной тематики лаборатории, проектов РФФИ и проекта № 94 Программы междисциплинарной интеграции СО РАН. Поскольку диссертационное исследование входило в комплексный проект Лаборатории экологической

гепетики млекопитающих ИЦиГ СО РАН, часть используемых в работе материалов была получена совместно с д.б.н. JI.A. Герлинской, к.б.н. Завьяловым, C.B. Масленниковой и A.C. Доценко. Это относится к оценкам репродуктивных характеристик, эндокринного и иммунного статуса самцов, которые были сопоставлены с количественными характеристиками летучих соединений, выделяемых с мочой.

Исследование выполнено на 43 самцах и 76 самках мышей аутбрсдной линии ICR, в возрасте 2-3 месяца. За две недели до начала эксперимента все самцы были рассажены в клетки но одному, а самок содержали группами по 46 животных. В нулевой день эксперимента самцы были произвольно разделены на контрольную и антиген-стимулированную группы. Контрольным животным (п = 19) была сделана внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора (0.9%) в объёме 100 мкл на мышь. Антиген-симулированные животные (п = 24) получили внутрибрюшинную инъекцию 50 мкг гемоцианина (Sigma), разведённого в 100 мкл физиологического раствора. На третий день эксперимента из группы иммунизированных самцов были изъяты пять животных, после чего они были умерщвлены путём декапитации, и их кровь была собрана для анализа титров иммуноглобулинов (IgG 1 и IgG2a) к гемоцианину. Оставшиеся самцы (по 19 животных в каждой группе) были ссажены с самками для проверки репродуктивных качеств исследуемых самцов. Для этого к каждому из самцов подсадили по 2 половозрелых самки. Самки содержались совместно с самцом до совершения им покрытия, или до 9-го дня эксперимента, если покрытие не было совершено до этого времени. Факт покрытия определяли по наличию у самок вагинальных пробок, осмотр проводился ежедневно через 2-3 часа после наступления светового периода. Покрытых самок отсаживали отдельно в индивидуальные клетки. Через 16 дней после обнаружения вагинальной пробки самкам была проведена краниоцсрвикальная дислокация и вскрытие брюшной полости, для подтверждения факта беременности. Беременность считалась наступившей при обнаружении жёлтых тел (овулировавших яйцеклеток) и имплантированных эмбрионов, число которых было подсчитано. Репродуктивный успех самца был определён по количеству фертильных покрытий, совершённых им за 6 дней совместного содержания с самкой. В последствие все самцы были разделены на три группы: покрывшие обеих самок, покрывшие лишь одну из самок и не покрывшие ни одной самки. Общее число овулировавших яйцеклеток и живых эмбрионов, образовавшихся в результате покрытия у обеих самок, определяли как показатели потенциальной и фактической плодовитости самца, соответственно. В результате потенциальная плодовитость самца варьировала от 0 до 21, а фактическая от 0 до 20.

На девятый день эксперимента все самцы были умерщвлены путём декапитации. При этом были взяты образцы крови для последующего определения титров иммуноглобулинов (IgGl и IgG2a) и концентрации стероидных гормонов с помощью иммуноферментного анализа. Кроме того, у самцов после забоя были измерены весовые характеристики некоторых

внутренних органов, относящихся к половой и иммунной системам (семенники, эпидидимис, семенные пузырьки, препуциальные железы, тимус и селезёнка).

Сбор образцов мочи самцов для проведения хроматорафического анализа, проводился непосредственно перед забоем на 9-ый день эксперимента, а также на 4-е сутки после начала эксперимента (на следующий день после подсадки самок). Сбор мочи производился непосредственно в пробирку Eppendorf объёмом 1.5 мл, при лёгком массаже живота мыши. Все собранные образцы были незамедлительно заморожены при -80°С для последующего анализа.

Хроматографическое исследование летучих соединений, содержащихся в образцах мочи, было проведено с использованием метода headspace анализа, при котором анализируется состав равновесной газовой смеси в объёме над жидкостью. Для проведения анализа 30 мкл свежеразмороженной мышиной мочи помещались в стеклянную хроматографическую пробирку объёмом 7 мл с закручивающейся крышкой с септой из политетрафторэтилена (тефлон)/силикона (Supelco, США). Пробирка с образцом прогревалась на водяной бане при температуре 40°С в течение 15 минут для установления равновесия между газовой и жидкостной фазами, а также для денатурации белков мочи, обладающих свойством связывать летучие соединения. Непосредственно после прогрева мы производили предваряющее хроматографию концентрирование образца на сорбенте Тенакс ТА (Chrompack, Нидерланды). Для этого -были использованы специально разработанные картриджи с 6 мг Тенакса ТА, нанесённого равномерным слоем на тонкую металлическую решётку (ИНГТ СО РАН). При концентрировании, летучие соединения выдувались из пробирки током очищенного воздуха со скоростью 40 мл/мин в течение 2-х минут и адсорбировались на картридже. Заполненный картридж помещали в инжектор хроматографа, где происходила автоматическая термодесорбция образца. Образцы очищенного воздуха использовали в качестве контроля фонового уровня летучих веществ и анализировали через каждые пять проб мочи.

Хроматографический анализ, предпринятый для изучения летучих соединений содержащихся в мышиной моче, был проведён в два этапа. На первом этапе мы проанализировали все собранные образцы мочи на газовом хроматографе ЭХО-B (ИН1Т СО РАН, Новосибирск, Россия, разработчик -Балдин М.Н.), оборудованном короткой поликапиллярной колонкой OV-215 (22см х 0.6мм х 40мкм), обладающей полярными свойствами. Неподвижная фаза полярной колонки OV-215 была представлена смесью трифторпропила и диметилсилоксана. Мы выбрали полярную колонку для проведения основного анализа для лучшего разделения наиболее лёгких летучих компонентов мочи, таких как изопрен, этанол, ацетон. На следующем этапе был проведён дополнительный анализ 8-ми образцов мочи на том же хроматографе, на сей раз оборудованном колонкой SE-30 (22см х 0.6мм х 40мкм) с полидиметилсилоксановой фазой, обладающей неполярными свойствами. Таким образом, 8 образцов мочи были проанализированы на обеих колонках с разной полярностью. Это позволило нам сравнить амплитуды и площади

полученных хроматографических пиков для установления соответствия между временами удержания различных компонентов мочи на разных колонках. Такая процедура была необходима в виду того, что хромато-масс-спекгрометр, который был использован в нашей работе для идентификации химической структуры интересующих нас соединений, работал с неполярной колонкой, идентичной по своим свойствам колонке OV-215. Для выполнения дополнительного анализа мы использовали вторые аликвоты проб мышиной мочи, которые хранились замороженными при -80°С и не размораживались до момента их использования.

Дополнительно были исследованы времена удержания ряда химически чистых веществ на обеих колонках, для последующего использования их в качестве реперных точек. Химические стандарты были приобретены в Acros Organics (Бельгия) и Sigma-Aldrich (США).

Использование хроматографа ЭХО-B, работающего с полнкапиллярными колонками, позволило нам провести быстрые, полуколичественные анализы множества образцов мочи в течение нескольких дней, что было бы невозможно осуществить при иных условиях. Хроматографичсский анализ, независимо от типа колонки, проводился при следующих параметрах работы прибора: температура инжектора: 180°С, температура колонки: 50°С в течение всего измерения, давление в колонке: 11кПа, время анализа: 500 сек. В качестве газа-носителя был использован очищенный воздух с постоянной скоростью протока 20 мл/мин. Для детектирования химических соединений после их разделения на колонке был использован фото-ионизационный детектор. Обработка полученных хроматограмм проводилась с использованием оригинального программного обеспечения «Сорбат» (ИНГТ СО РАН).

Идентификация химической структуры интересующих нас соединений проводилось на хромато-масс-спектрометре «НАВАЛ» (ИНГГ СО РАН, разработчики — Макась А.Л. и Трошков МЛ.) под руководством А.Л. Макася. Для этого нами были исследованы три образца мышиной мочи, собранной в нашем эксперименте. Предварительное концентрирование образцов на Тенакс проводилось в соответствие с аналогичной процедурой, описанной выше. Для хроматографического разделения была использована неполярная колонка НР-5, 15м х 0.32мм покрытая неподвижной фазой толщиной в 1цм (Agilent technologies, США), по своим полярным свойствам аналогичная колонке SE-30. Температура колонки в течение 5 минут поддерживалась на уровне 45°С, затем программно повышалась со скоростью 10°С/мин до 150°С. Температура инжектора составляла 280°С. В качестве газа-носителя был использован поток гелия со скоростью 2 мл/мин. Для работы масс-спектромегра были установлены следующие параметры: частота сканирования - 0.5 сек в диапазоне от m/z 45 до m/z 250; температура ионизатора - 180'С; энергия ионизации - 70 эВ. Для обработки данных использовалось программное обеспечение AMDIS (NIST, США). Идентификация масс спектров производилась с использованием библиотек N1ST/EPA/NIH (версия 2.0.2008) и

литературных данных (Schwende et al., 1986; Novotny et al., 2007, личная переписка).

В нашей работе были использованы методы параметрической и непараметрической статистики, а также статистические подходы для обработки многомерных данных. Непараметрические методы применялись в тех случаях, когда распределение признаков отличалось от нормального (по критерию Колмогорова-Смирнова) или было ранговым. Для сравнения двух групп в работе использовался Т-тест Стьюдента. Для сравнения трёх групп -дисперсионный анализ ANOVA с последующим LSD-сравнением. Поиск корреляций между двумя параметрами осуществлялся с помощью коэффициента корреляции Пирсона, если оба параметра были нормально распределены, и коэффициент корреляции Спирмана, если распределение хотя бы одного из параметров отличалось от нормального, или же параметр был ранговым. К нормально распределённым величинам относились: распределение площадей и амплитуд хроматографических пиков и плодовитость самцов. Репродуктивный успех носил ранговый характер вследствие своего определения. Распределение титров антител, весовых характеристик иммунных и половых органов, а также эндокринных параметров, отличалось от нормального. Многомерная статистика, использованная для дискриминации контрольных и иммунизированных самцов по результатам инструментального анализа запаха мочи, включала в себя метод главных компонент на основе алгоритма NIPALS (Nonlinear Iterative Partial Least Squares).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изменение химических компонентов мочи у самцов мышей при развитии иммунного ответа.

В результате проведения хроматографического анализа 69-ти образцов мочи с использованием полярной колонки О V-215 среди летучих компонентов мочи мышей нами было выделено 20 хроматографических пиков, соответствующих одному или группе химических соединений. При этом пиков, характерных только для контрольных или иммунизированных животных, выделено не было. Однако иммунизация вызвала достоверное изменение содержания двух летучих соединений (Т-тест Стьюдента: t = 3.64; df = 67; р < 0.001 и t = 3.28; df= 67; р = 0.002). На хроматографическом профиле это было выражено в достоверном увеличении амплитуд пиков с временами хроматографического удержания (ВУ) равным 129.1 сек и 441.5 сек. (рис.1).

4 день 9 день 4 день 9 день 4 день 9 день 4 день д Демь

А) контроль иммунизация ^ контроль иммунизация

Рисунок 1. Сравнение амплитуды пиков ВУ 129.1 и ВУ 441.5 в образцах мочи, собранных на 4-ый и 9-ый дни, у контрольных и иммунизированных животных. А) *: р < 0.001 - разница между средними в контроле и опыте (4-й день) Б) * р =0.02 - разница между средними в контроле и опыте (4-й день) ** р =0.02 - разница между средними в контроле и опыте (9-й день)

Сопоставив амплитуды пиков у одного и того же животного при повторных сборах мочи (сравнение образцов, полученных на 4-ый и на 9-ый дни эксперимента), мы выявили у контрольных и иммунизированных самцов несколько пиков, которые сохраняли стабильность в течение эксперимента. Так, у контрольных животных коэффициенты корреляции Пирсона между повторно собранными образцами мочи составляли: г = 0.90, р < 0.001 для пика ВУ 11.7; г = 0.80, я < 0.001 для пика ВУ 29.5; г = 0.86, р < 0.001 для пика ВУ 264.5; г = 0.72, р < 0.001 для пика ВУ 342.1; г = 0.57, р < 0.05 для пика ВУ 441.5. Столь высокие коэффициенты корреляции говорят о том, что в норме эти вещества выделяются организмом животного в строго определённом количестве и их количество является индивидуальной характеристикой самца. В отличие от контрольных животных, у иммунизированных самцов только для одного пика была найдена близкая к статистически значимой корреляция между амплитудами в образцах мочи, взятых на 4-е и 9-е сутки после введения антигена (ВУ 11.7; г = 0.51, р = 0.05). Это указывает на то, что активация иммунной системы значительно влияет на обмен веществ и нарушает устойчивость биохимических процессов, определяющих стабильное выделение с мочой целого ряда метаболитов.

Э<Ьфект...введения гемоцианина на летучие компоненты мочи самцов е высоким и низким титром специфических антител.

Генетически детерминированная способность эффективно бороться с заболеванием является одним из важнейших приспособлений, дающих особи преимущество, необходимое для выживания. Так называемые «хорошие гены» являющиеся целью полового отбора, могут повысить конкурентоспособность их носителя при наличии возможностей для демонстрации даваемого ими преимущества. Поэтому, информирование потенциального полового партнёра об особенностях иммунитета могут значительно повысить шансы самца на успех. Учитывая, что запах лежит в основе внутривидовой коммуникации

грызунов, мы ожидали, что информация об иммунореактивности самцов мышей может быть закодирована в летучих соединениях мочи. Для проверки этой гипотезы мы разделили иммунизированных самцов на 2 группы, взяв за основу интенсивность развития иммунной реакции. Если итоговый титр специфических к гемоцианину антител, измеренный на 9-й день после иммунизации, был меньше медианного значения - самец попадал в группу животных с низким иммунным ответом (НизО), при большем значении - в группу с высоким иммунным ответом (ВысО). Сравнение хроматографических пиков показало, что различия между животными с высоким и низким иммунным ответом наблюдаются по пику ВУ 43.3 (Т-гест Стьюдента: / = 2.18; с1/ = 25; р = 0.04). При этом значения амплитуды этого пика в контрольной группе занимают промежуточное значение (рис. 2). Что обусловлено составом контрольной группы, в которую входят мыши, как с потенциально высокой, так и с низкой иммунореактивностью.

А

3,5

CÜ

3

го

> CD 2.5

ГО

S

а.

1,5

и

Г7, 1

5=

<

0,5

0

Р = 0.04

Р = 0.01

Р= 0.28

ВысО (п = 14) НизО (п = 13) Контроль (п = 35)

Рисунок 2. Различия в амплитуде пика ВУ 43.3 в группе самцов с сильным (ВысО) и слабым (НизО) иммунным ответом, а также у контрольных животных.

Полученные результаты интересно сравнить с данными, полученными в ольфакторном тестировании. Параллельно с хроматографическим исследованием мочи самцов, другая группа исследователей из нашей лаборатории (Завьялов E.J1 и Доценко A.C.) протестировали собранные образцы мочи в обонятельном тесте. Результаты тестирования показали, что самки мышей достоверно отличают иммунизированных самцов от контрольных, что выражается в латентном времени подхода к запаховому образцу. В хроматографическом анализе это различие нашло отражение в амплитудах пиков ВУ 129.1 и ВУ 441.5. Также ольфакторное тестирование показало, что иммунизированные самцы с высоким иммунным ответом на гемоцианин, обладали большей запаховой привлекательностью, как в сравнении с самцами, обладающими слабым ответом, так и по сравнению с

контрольными, не иммунизированными, животными. Похожий результат мы получили при анализе летучих компонентов паровой фазы мочи на газовом хроматографе - самцы с высокой иммунной активностью выделялись как на фоне контрольных самцов, так и самцов с низким иммунным ответом. Таким образом, инструментальный анализ позволяет нам воспроизвести дифференцировку образцов по их запаху, аналогичную полученной при ольфакторном тестировании.

Анализ полученных результатов на основе многомерной статистики.

Использование в обработке методов многомерной статистики позволило нам задействовать в дискриминации запахов полный ансамбль найденных компонентов, что воспроизводит тот подход к обработке информации, который используют сами грызуны при восприятии запаховых стимулов. Оценив вектора изменчивости по всей выборке (метод главных компонент) мы обнаружили, что уже 1-я и 3-я рассчитанные компоненты достоверно делят выборку на две искомые группы (рис. 3). Этот результаты был получен на основании достоверных различий между контрольными и иммунизированными животными при использовании собственных значений рассчитанных для 1-ой и 3-ей компоненты в Т-тесте Стыодента (? = 2.40, с1/=

Рисунок 3. Разделение образцов мочи на контрольную и иммунизированную группы на основе анализа всех найденных летучих компонентов. По оси абсцисс отложена первая компонента, по оси ординат - 3-я компонента (компонентный анализ РСА). Демаркационная линия между областями проведена по принципу максимального разделения контрольных и иммунизированных самцов. Различие между областями: х2 = 15.80, р < 0.00!.

Аналогичным образом мы разделили выборку иммунизированных самцов на 2 группы, различающиеся по силе иммунного ответа. Мы получили

2 взаимоперепендикулярных вектора (7-я и 13-я компоненты), каждый из которых надёжно делил выборку иммунизированных самцов (рис.4). Отличия между группами были оценены с помощью Т-критерия Стьюдента: I = 2.41; с!/ = 30; р = 0.022 для 7-ой компоненты и ? = 2.54; (1/ = 30; р - 0.016 для 13-ой компоненты.

высоким и низким иммунным ответом на основе анализа всех найденных летучих компонентов. По оси абсцисс отложена 7-ая компонента, по оси ординат - !3-ая компонента (компонентный анализ РСА). Демаркационная линия между областями проведена по принципу максимального разделения самцов с низкой и высокой силой иммунного ответа. Различие между областями: х2 = 21.21, р < 0.001.

Полученный результат показывает, что паттерны ЛОС содержат информацию, достаточную для статистически значимой дифференцировки самцов с высоким и низким иммунным ответом. Следует подчеркнуть, что ольфакторные тесты также дискриминируют животных с разным иммунным статусом и разной иммунореактивностью не абсолютно, но с точностью, достаточной для статистической значимости результата.

Взаимосвязи между физиологическими характеристиками и..заііаховьіми компонентами мочи у самцов.

Оценка репродуктивного успеха самцов (см. методы) позволила нам разделить всех животных на 3 группы: покрывшие обеих самок, покрывшие лишь одну самку из 2-х и не покрывшие ни одной самки. Дисперсионный анализ показал, что в группе контрольных самцов число покрытых самок имеет достоверный эффект на амплитуду трёх хроматографических пиков -ВУ 11.7 (¥2М = 6.81, р = 0.003), ВУ 29.5 (¥2М = 5.36, р = 0.009) и ВУ 264.5 (1\34 = 9.24, р = 0.0006). Наибольшие значения амплитуды всех трёх пиков (далее -

;

целевые пики) были отмечены в группе самцов, успешно покрывших обеих самок (рис. 5).

Контрольные ж

ВУ 11,7 р = 0.001 £.« 0.006 I

Контрольные *

ВУ 29,5 р = 0.002

■

К««(ХЖЬНЫе животные

ВУ 264,5

р < 0.001__

р « 0.005

Чіс.то<}»ртильных покрытИІ

^сяо фертильных покрыт ИІ

Ч1с;ю фйртильных покрытий

Рисунок 5. Различия в амплитуде пиков ВУ 11.7, ВУ 29.5 и ВУ 264.5, найденных в моче контрольных самцов мышей с различным числом фертильных покрытий. п(0) = 12с?; п(1) = п(2) = Зс?. Цифрами над линиями показаны значения р, полученные при оценке достоверности межгрупповых различий (ЬвО-тест).

В группе иммунизированных самцов величина лишь одного из целевых пиков - ВУ 264.5 зависела от числа покрытых самок (/<2,29 ~ 4.91, р = 0.01). Результаты дисперсионного анализа для 2-х оставшихся целевых пиков составляли: Р2>29 = 2.46, р = 0.10 для ВУ И .7 и = 0.70, р = 0.51 для ВУ 29.5. Однако тот принцип, что максимальная амплитуда целевых пиков наблюдалась у тех самцов, которые совершили наибольшее число покрытий, а минимальная - у самцов, не совершивших ни одного покрытия, сохранилась (рис. 6).

ВУ 11,7

р = 0.04

р = 0.09

ВУ 29,5

р - 0.76

р ода

ВУ 264,5

р а 0.009 __

рд 0,009,

Ч)спо (£ерт ильных покрытий Имиукмзиров&чннц ^иаогные

Чісгіз фертильных покрытий

ИММЦИИЗИрСвИНпШ

тм

Число фертильных покрытий

Иммумигироэанныь

Рисунок 6. Различия в амплитуде пиков ВУ 29.5, ВУ 11.7 и ВУ 264.5 найденных в моче иммунизированных самцов мышей с различным числом фертильных покрытий. п(0) = 4с?; п(1) = 9с?; п(2) = 4с?. Цифрами над линиями показаны значения р, полученные при оценке достоверности межгрунповых различий (ЬвП-тест).

Кроме того, амплитуда целевых пиков в контроле достоверно коррелировала с массой андроген-зависимых препуциальных желёз, которые

13

рассматривают как основной феромон-продуцирующий орган самцов мышей (Miyake et al., 1994; Caldwell and Lepri, 2002): r = 0.57; p = 0.01, и r = 0.58; p = 0.01, и r = 0.48; p = 0.04 для пиков ВУ 29.5, ВУ 11.7 и ВУ 264.5, соответственно. При иммунизации эта зависимость пропадала (/■ = 0.47; р = 0.06, и г = 0.36; р = 0.15, и г = 0.24; р = 0.34). Амплитуда целевых пиков в контроле также положительно коррелировала с плазменным тестостероном (г = 0.52; р = 0.02, и г = 0.51; р = 0.03, и г = 0.45 р = 0.05). Но после иммунизации эти корреляции меняли знак на отрицательный (г = - 0.48; р = 0.007, и г = -0.51; р = 0.004, и г = - 0.36; р = 0.05).

Идентификация химической структуры целевых пиков, проведённая в нашей работе, показала, что данные вещества относятся к классу циклоенольных эфиров и являются производными дигидрофуранов (ДГФ), а именно 5,5-диметил-2-этил-4,5-дигидрофураном, Е-5,5-диметил-2-этилентетрагидрофураном и г-5,5-диметил-2-этилентетрагидрофураном. Причём данные соединения не входят в состав летучих соединений мочи, а являются продуктами дегидратации б-гидрокси-б-метил-З-гептанона (ГМГ) -мышиного феромона, присутствующего в мышиной моче. Таким образом, содержание ДГФ в хроматографических фракциях мочи отражают содержание в ней ГМГ. Физиологическая роль ГМГ заключается в акселерации полового созревания молодых самок (Novotny et al., 1999 а). Кроме того, данный феромон никак не влияет на запаховую привлекательность особи (Osada et al., 2008), в отличие от ряда других феромонов, нарабатываемых, в основном в препуциальных железах. Сам ГМГ появляется в мочевом пузыре самцов (Novotny et al., 1999 a; Zhang et al., 2007), а также присутствует в моче самок (Andreolini et al., 1987; Jemiolo et al., 1987). Что убедительно доказывает то, что ГМГ не является продуктом секреции препуциальных желёз.

Из наших результатов следует, что, благодаря повышенной экскреции ГМГ, самцы с высоким репродуктивным потенциалом способны обеспечить себя достаточным количеством половозрелых самок постоянно стимулируя созревание молодых особей, появляющихся на их территории. Напротив, самцам с низкой репродуктивной эффективностью не выгодно иметь излишек половозрелых самок на своей территории, так как они не смогут обеспечить отцовство всех их детёнышей, и часть самок будет покрыта пришлыми самцами. Соблюдая баланс между собственными репродуктивными возможностями и числом самок, готовых к спариванию, самец создаёт идеальные условия для размножения и передачи своих генов в следующем поколении.

Заключение.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что контрольные самцы с высокой репродуктивной активностью, обладая высоким уровнем тестостерона, активно нарабатывают запаховые компоненты в андроген-зависимых препуциальных железах, привлекая таким образом молодых самок на свою территорию. Повышенный уровень ГМГ в моче этих самцов,

стимулируя пубертацию молодых самок, позволяет самцам максимально реализовать свой репродуктивный потенциал.

При иммунизации такой характер связей нарушается, поскольку животным приходится затрачивать ресурсы на активацию иммунитета. Нарушается стабильность уровня ГМГ в моче; резко меняется характер связи между уровнем ГМГ в моче и уровнем тестостерона в крови. Физиологический механизм этого процесса пока не ясен, но очевидно, что он вносит существенный вклад в борьбу между хозяином и паразитом/инфекцией. Снижение уровня тестостерона снимает нагрузку с иммунной системы (Grossman, 1985; Folstad, Karter, 1992), повышая сопротивляемость животного заболеваниям. А меньшие затраты на производство феромонов позволяют направить сэкономленные ресурсы на поддержание работы иммунной системы.

ВЫВОДЫ

1. Установленное в работе различие в композиции летучих соединений, выявляемых в моче контрольных и антигенстимулированных самцов, указывает на наличие материальной основы для ольфакторной оценки самками иммунного статуса потенциального брачного партнера.

2. Анализ совокупности хроматографических пиков на основе метода главных компонент показывает, что паттерны летучих соединений в моче антигенстимулированных самцов с высоким и низким титрами специфических антител статистически значимо отличаются друг от друга. Этот факт согласуется с данными о запаховом предпочтение самками самцов с высоким иммунным ответом.

3. На основе высокопроизводительной газовой хроматографии выявлены три летучих компонента мочи мышей, коррелирующих с показателями репродуктивной функции самцов. Индивидуальные различия по этим соединениям хорошо воспроизводятся при повторном измерении. Поэтому данные компоненты мочи могут рассматриваться в качестве фенотипического маркера репродуктивных качеств самцов мышей.

4. Компоненты мочи, коррелирующие с репродуктивным успехом самца, идентифицированы как продукты дегидратации одного из мышиных феромонов — б-гидрокси-6-метил-З-гептанона. Все три вещества относятся к классу циклических виниловых эфиров: 5,5-диметил~2-этил-4,5-дигидрофуран, Е-5,5-диметил-2-этилентетрагидрофуран и Х-5,5-диметил-2-зтилеї ітетрагидрофу раї і.

5. Предложенный нами метод полуколичественного анализа концентрации циклических виниловых эфиров в хроматографических фракциях мочи позволяет использовать газовую хроматографию для неинвазивного фенотипирования репродуктивных качеств самцов мышей.

6. Положительные корреляции между различными характеристиками половой, а также эндокринной систем, и компонентами запаха, имеющие место у контрольных самцов, претерпевают существенные преобразования у иммунизированных особей, что может вносить вклад в феногенетическую изменчивость при размножении на фоне естественной или экспериментальной антигенной стимуляции.

Публикации по теме диссертации:

1. Ludmila Л. Gerlinskaya, Elena P. Shnayder, Anna S. Dotsenko, Svetlana O. Maslennikova, Eugene L. Zavjalov, Mikhail P. Moshkin. Antigen-induced changes in odor attractiveness and reproductive output in male mice. // Brain, Behavior, and Immunity. 2012. 26: 451^158.

2. Куликов В.Ю., Руяткина JI.A., Сорокин М.Ю., Шабанова Е.С., Балдин М.Н., Грузнов В.М., Ефименко А.П., Петровский Д.В., Шнайдер Е.П., Мошкин М.П. Содержание легких углеводородов в выдыхаемом воздухе в зависимости от факторов риска метаболических нарушений // Физиология человека. 2011.3: 70-75.

3. Е. P. Shnayder, М. P. Moshkin, D. V. Petrovskii, A. I. Shevela, А. N. Babko, and V. G. Kulikov. 2009. Detection of Helicobacter pylori infection by examination of human breath odor using electronic nose Bloodhound-214ST. //AIP Conf. Proc. 1137, pp. 523-524.

4. E.P. Shnayder, D.V. Petrovskii, V.M. Gruznov, M.N. Baldin, M.P. Moshkin. 2010. Correlations Between Concentration Of Volatile Organic Compounds In Saliva And Exhaled Air And Their Dependence On Age And Body Mass Index Of Subjects. // Тезисы конференции Exhaled Breath Analysis: From Sensors to Applications.

5. Петровский Д.В., Шнайдер Е.П., Шевела А.И., Бабко А.Н., Куликов В.Г., Мошкин М.П. 2011. Электронный нос как средство неинвазивной диагностики. // Материалы научной конференции Медицинская геномика и протеомика. Тезисы докладов. Новосибирск, стр.145.

Подписано к печати 15.01.2013г. Формат бумаги 60 х90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 1

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10