Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследованиях

Еропкин, Михаил Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследованиях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследованиях"

На правах рукописи

ЕРОПКИН Михаил Юрьевич

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК КАК МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА В БИОХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

. диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении НИИ гриппа РАМН

Научный консультант: доктор биологических наук член-корреспондент РАМН профессор Киселев Олег Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Комов Вадим Петрович

доктор медицинских наук профессор Долго-Сабуров Валерий Борисович

доктор биологических наук Янковский Олег Юлианович

Ведущая организация: центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт Мин. здравоохранения и соц. расшитая РФ

заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 при Государственном Учреждении научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: Каменноостровский пр. д. 69/71 (конференц-зал НИИЭМ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ по адресу: 1973 76, С.Петербург, ул. акад. Павлова д. 12

Автореферат разослан «_»_2004 года.

Защита состоится »

часов на

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Л.В.Пучкова

2005-4 12291

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение биологической активности веществ, независимо от последующей цели их использования, как правило, на первом этапе предполагает оценку их токсичности. Методы оценки токсичности, альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных, а именно, модели с использованием культур клеток находят все более широкое применение в биохимико-токсикологических исследованиях. [Maier, 1988; Митрохин и др., 1991; Balls, Fentem, 1992; Лукьянов и др., 1996; Clemcdson et a!., 19%, 1998]. Такие методы позволяют помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых химических препаратов прежде всего на стадии их доклинических испытаний.. Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные спнсргнчсские и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений [Митрохин и др., 1991].

Несмотря на широкое развитие и признание альтернативных методов в мире [Всрезовская, Митрохин, 1990; Walum, Ekwall, 1996, 2000; Clemedson ct al., 1996, 1998. 2000], у нас в стране они пока не получили должного распространения. Так, при анализе материалов I съезда токсикологов России (1998) можно обнаружить, что из около 300 представленных сообщений только 35 так или иначе связаны с моделями in vitro, из которых на культурах клеток человека выполнено лишь 6 работ. Отдельные методы экспресс-тестирования in vitro, которые к настоящему времени утверждены Минздравом, Госкомсаиэпиднадзором и Госстандартом Российской Федерации [ ред. Подунова и др., 1999], являются недостаточно точными и специфичными и одновременно трудоемкими. Отсюда видно, насколько велика потребность в развитии подобных методов для отечественной науки и практики.

Широкое внедрение биохимико-токсикологического тестирования in vitro требует адаптации к условиям клеточных культур биохимических методов, первоначально разработанных для исследования биологических жидкостей, гомогенатов тканей и других объектов на макроуровне [Donato et al.. 1998; Garcia-Alfonso ct ah, 1998], что явилось важной самостоятельной задачей нашей работы.

Модуляция биологической активности ряда препаратов внутренней

prxvinit ímraiiimn I Mininn r>1 ni ЮКО- Мпгояп Pt я1 1Q8R- Нпч 1QRQ- Г1рпТ1ПН-

всего сыворотки крови и отдельных сывороточных белков на специфическую, например, антимикробную активность, и на токсичность препаратов. В связи с этим большой интерес представляют исследования на одной и той же модели in vitro цитотоксичности препарата, а также его антимикробного действия, включая биоцидный и антиадгезивный эффекты.

В настоящее время широко признается, что в основе комплекса ответных реакций клеток, имеющих защитный характер и обеспечивающих адаптацию к меняющимся условиям в ответ на воздействие различных неблагоприятных факторов, в том числе и токсических агентов, лежат единые фундаментальные механизмы, приводящие к сходным изменениям на морфологическом и молекулярном уровнях [Александров, 1985; Котелевцев и др, 1986; Herbennan et al., 1986; Браун, Моженок, 1987; Барабой и др., 1992J. Такой универсальный характер стрессовых реакций на клеточном уровне в ответ на разнообразные внешние воздействия делает перспективным применение моделей in vitro и стандартных биохимических критериев оценки жизнеспособности и метаболических изменений клеток не только при действии химических препаратов, но и физических (электромагнитных полей различной частоты и интенсивности) и биологических факторов (вирусов, тканевых жидкостей от больных с различными типами патологии).

Цель исследования. Основная цель настоящей работы состояла в разработке модели тестирования токсичности на культурах клеток с помощью комплекса биохимических методов оценки на клеточном уровне состсяния мембран, устойчивости клеток к окислительному стрессу, их систем детоксикации и общей интенсивности метаболизма. Предполагалось показать, что даннач модель может быть использована для решения самых разнообразных задач в области токсикологии и клеточной биологии, а именно, для изучения ряда представляющих практический интерес потенциальных или уже использующихся в практике фармакологических препаратов, физических и биологических воздействий на клеточные культуры.

Задачи исследования.

1. Адаптировать к условиям культур клеток ряд биохимических методов с целью использования полученных с их помощью показателей в качестве критериев жизнеспособности и метаболизма клеток in vitro .

2. Использовать разработанную модель для анализа закономерностей цитотоксичности ряда мономерных и полимерных антисептиков, используемого в хирургии костного цемента, некоторых противовирусных препаратов и цитопатогенного действия вирусов, растительных экстрактов, биологических жидкостей, полученных от больных с различными формами патологии.

3. Провести сравнительное изучение антимикробной активности и токсичности модельных антисептиков, в отношении клеток в культуре.

4. Исследовать на культурах клеток механизм антиадгезивной активности модельных антисептиков и отдельных сывороточных белков.

5. Исследовать пролиферативный и метаболический ответ клеток в культуре на воздействие электромагнитных полей различной частоты и интенсивности.

6. Оценить в условиях острой токсичности in vitro и in vivo защитный эффект ряда антигипоксических и антиоксидантных препаратов и их комбинаций.

Научное значение и новизна работы.

В ходе исследования установлен однотипный харгктер метаболического ответа клеток в культуре на различные повреждающие воздействия - токсические химические агенты, физические факторы, биологические жидкости от больных с разными формами патологии и экспериментальных животных, вирусы, выражающийся в повреждении клеточных мембран, усилении процессов перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ), подавлении активности ряда клеточных дегидрогеназ и ферментов обмена глутатиона. Показано, что универсальность этой реакции проявляется вне зависимости от химической структуры токсического вещества, метода оценки цитотоксичности и очень слабо зависит от тканевого и видового происхождения культивируемых клеток.

- Детально исследован эффект метаболической активации клеток в культуре при воздействии минимальных эффективных концентраций изученных веществ. Подтвержден универсальный характер фазы активации. В связи с этим расширены и детализированы представления о механизмах стресса на клеточном уровне.

- Уточнен и детализирован токсический эффект in vitro и in vivo костного цемента, используемого в операциях эндопротезирования, за который ответствен несвязавшийся мономер метилметакрилата (ММА). Показано, что существенным моментом неблагоприятного действия ММА на клетки является развитие окислительного стресса и клеточной гипоксии.

- Изучено действие в условиях острой токсичности in vitro ряда антигипоксических и антиоксидантных препаратов и их комбинаций. Впервые показано, что комбинированное применение антигипоксанта мафусола и антиоксидантов а-токоферола, СОД, унитиола, глутатиона вызывает повышение защитного эффекта препаратов.

Выявлен защитный эффект сыворотки крови и ее отдельных белков на цитотоксичность in vitro модельных антисептиков (катамина АВ, катапола и полисепта).

- Впервые продемонстрирован разнонаправленный характер влияния сыворотки крови на антимикробную активность, включая биоцидный и антиадгезивный эффекты, полимерных катионных антисептиков различной химической структуры: снижение эффективности катапола и повышениг - у полисепта.

- Показано, что антиадгезивная активность иммуноглобулинов в отношении S aureus, препятствующая фиксации патогена на клетках-мишенях и колонизации тканей хозяина, не зависит от их антигенной специфичности..

- Впервые исследован пролиферативный ответ и устойчивость к индуцированному перекисному окислению липидов фибробластов человека в культуре под действием электромагнитных полей геомагнитного уровня различной частоты и конфигурации, а также видимого света различных частотных диапазонов.

Научно-методическое и практическое значение работы.

Ряд биохимических методов: оценка индуцированного перекисного окисления липидов, активностей лактатдегидрогеназы, ДТ-диафоразы, глутатион^-трансферазы, глутатионредуктазы, общего содержания клеточных белков, связывания клетками ионов Са2+ - был адаптирован к условиям культур клеток.

Предложен способ комплексной оценки острой токсичности in vitro, состоящий в последовательном изучении среды инкубации клеток, мембранных дегидрогеназ и лишь на заключительном этапе внутриклеточных ферментов. Это позволяет определять на одном образце клеточной культуры до 4-х биохимических показателей с сохранением жизнеспособности монослоя, что существенно сокращает количество используемого клеточного материала и длительность тестирования токсичности препаратов, а также позволяет повысить точность и эффективность определения порогов токсических концентраций веществ. Разработанная модель обладает более высокой чувствительностью, чем традиционные морфологические методы исследования и может быть рекомендована для широкого 'применения в предварительной фазе тестирования на токсичность, а также в скрининге цитопротекторньгх препаратов [Патент РФ № 2079130 от 10.05.1997].

Обнаружение наиболее значительного защитного эффекта в условиях острой токсичности in vitro при комбинации антигипоксических (фумарат) и антиоксидантных (СОД, тиоловые соединения, а-токоферол) препаратов позволяет рекомендовать данный комбинированный подход для поддерживающей терапии в тех случаях, когда применение токсичных препаратов неизбежно. Указанное сочетание препаратов нашло применение в клинике при операциях эндопротезирования крупных суставов с использованием костного цемента [Патент РФ № 2159089 от 20/11/2000].

Выявленный благоприятный пролиферативный и метаболический ответ клеток человека в культуре на действие циклотронного электромагнитного поля геомагнитного уровня позволяет рекомендовать его для клинических испытаний с целью ускорения заживления ран и переломов.

Модификация сывороткой крови бактериостатического и антиадгезивного эффекта, а также цитотоксичности исследованных

антисептиков показывает необходимость проведения исследований на культурах клеток в условиях, как можно более полно имитирующих внутреннюю среду организма.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенная модель тестирования токсичности in vitro с помощью комплекса биохимических методов оценки на клеточном уровне состояния мембран, устойчивости клеток к окислительному стрессу, их систем детоксикации и общей интенсивности метаболизма демонстрирует высокую эффективность при решении самых разнообразных задач в области клеточной токсикологии.

2. Вне зависимости от конкретной химической структуры соединений, а также метода оценки цитотоксичности, все исследованные ксенобиотики вызывают качественно сходный острый токсический отвег клеток в культуре, существенной чертой которого является фаза активации метаболических процессов минимальными эффективными концентрациями веществ.

3. Ряд препаратов с антигипоксическими и антиоксидантными свойствами при их использовании в концентрациях, адекватных применяемым в клинике, защищают клетки в культуре от токсического действия исследованных практически значимых ксенобиотиков, причем максимальный цитопротекторный эффект наблюдается при комбинации антигипоксанта мафусола (фумарат Na) с одним из антиоксидантов (а-токоферол, СОД, тиоловые препараты).

4. Сыворотка крови и отдельные сывороточные белки снижают токсичность ' in vitro исследованных антисептиков и оказывают разнонаправленное действие на антимикробный эффект препаратов различной структуры.

5. Антиадгезивная активность иммуноглобулинов в отношении патогенных микроорганизмов не зависит от их антигенной специфичности.

6. Циклотронное и постоянное электромагнитные ноля геомагнитного уровня оказывают значимое влияние на процесс пролиферации клеток в культуре и вызывают характерный фазный ответ их устойчивости к индуцированному ПОЛ. Световое излучение различных частоныых диапазонов также приводит к разнонаправленным сдвигам метаболизма и скорости пролиферации клеток в культуре.

7. Инкубация культур клеток с лаважной жидкостью, полученной от экспериментальных животных на блеомициновой модели фиброза легких, вызывает типичную токсическую реакцию, сопровождающуюся окислительным стрессом и повреждением клеточных мембран.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на 12 конференциях и конгрессах, в том числе на 7-ми международных: на Всероссийских научных конференциях «Биология клетки в культуре», С.Петербург в 1995 и 1998 г.; 1-ом международном конгрессе по биологической медицине, Израиль, 1994 г.; II междунар. научн.-практ. конф. « Биологич. активны; вещества и новые

продукты в косметологии», Москва, 1997; VI Всеросс. съезде анестезиологов и реаниматологов, Москва, 1998; международной коференции «Механизмы цитотоксичности in \itro», Рим, Италия, 1999; 7-ом конгрессе французского общества клеточной фармако-токсикологии, Нанси, Франция, 1999; 37-ом и 38-ом европейских токсикологических конгрессах «Евротокс'99», Осло, Норвегия, 1999 и «Евротокс'2000», Лондон, Великобритания; III и IV всемирных конгрессах по альтернативам использованию лабораторных животных в медико-биологич. экспериментах, Болонья, Италия, 1999 и Новый Орлеан, США, 2002; меж.нар. конференции «Свободнорадикальные процессы: экологич., фармакол. и клинич. аспекты», С.Петербург, 1999; Всеросс. конф. «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиол., диагностики гриппа и др. вирусных инфекций», С.Петербург, 2001; 2-ом съезде токсикологов России, Москва, 2003.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 34 печатные работы и два патента на изобретение.

Структура диссертации. Работа изложена на 356 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 10-ти глав (каждая из которых содержит литературную предпосылку, специфические методы, результаты исследования и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 673 наименования, в том числе 209 на русском языке и 464 на иностранных. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 55 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры. Основная часть работы выполнена на культурах диплоидных клеток эмбриона человека (ДКЭЧ) — легочных и кожно-мышечных фибробластах, полученных по методу Freshney [1987]. На различных этапах работы использовали также следующие перевиваемые клеточные линии человека: mHeLa - клетки, производные эпителиоидной карциномы шейки матки, Mg-63 - клетки остеосаркомы, А-549 - клетки эпителиоидной карциномы легкого, Нер-2 — клетки карциномы гортани, U-937 - моноцитарные клетки человека лейкемического происхождения (суспензионная культура), иммортализованные астроциты, а также перевиваемые клеточные линии животных - иммортализованные астроциты крысы и MDCK - клетки эпителия почки собаки. Все клеточные культуры, кроме астроцитов, полученных в институте экспериментальной медицины РАМН, С.Петербург, являются линиями, депонированными в коллекции клеточных культур института гриппа РАМН, С.Петербург, и охарактеризованы в соответствии с требованиями, предъявляемыми к паспортизации депонированных культур [Соминина и др., 1975].

Основные аналитические методы, использованные в работе, представлены в табл 1.

Таблица 1. Аналитические методы, использованные в работе.

Биохимические методы_

Определение конечных продуктов Ре2*-индуцированного ПОЛ по реакции с тиобарбитуровой кислотой [Стальная, Гаришвили, 1977, с модификациями! • Определение общей антиокислительной активности в тест-системе из

желточных липопротеинов [Клебанов и др., 1988, с модификациями]._

Определение общей концентрации клеточного белка по Лоури [Lowry et al.,

1951]._

Определение активностей ферментов:

- ЛДГ (КФ 1.1.1.27) [Bergmeyer, 1970; Ещенко, 1982],

- ДТ-диафораза (КАВ(Р)Н-хиноноксидоредуктаза, КФ 1.6.99.2) [Malviya et al., 1986],

- глутатион-Б-трансфераза (КФ 2.5.1.18) [Habig et al., 1974],

- глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) [Bergmeyer, 1970; Путилина, 1982],

- общая АТФ-азная активность (КФ 3.6.1...) [Толстухина, 1982]_

Определение интегральной активности митохондриальных дегидрогеназ в

нитротетразолиевом тесте (НТТ) [Mosmann, 1983]_

Исследование связывания Са2+ клетками в культуре с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклина [Virmani et al., 1985, с

модификациями]_

Анализ газового и электролитного состава крови подопытных животных на анализаторе ABL-505 (Radiometer, Дания)_

Микробиологические методы_

Исследование антимикробной активности препаратов в тест-системе in vitro с помощью микробиологического анализатора Avantage (Abbott Lab., США) Оценка бактериальной адгезии на клеточных культурах с окраской по Граму

(Грабовская, Тотолян, 1977]_

Гистологические методы_

Приготовление гистологических препаратов с окраской по Романоскому_

Окраска витальным красителем трипановым синим и подсчет числа

жизнеспособных клеток [Соминина и др., 1975]_

Статистические методы в составе компьютерных программ Statistical Graphics System [Manugistics, 1992]; Statistica for Windows [Statsoft, 1993]; Excel [Microsoft, 2000]:

- элементарная статистика

- оценка различий средних в непарном t-тесте Стьюдента и непараметрическим методом Вилкоксона-Манна-Уитни

- одно- и многофакторный дисперсионный анализ

- регрессионный анализ_

Табл.2 содержит перечень препаратов, токсичность которых исследовалась в тесг-системе на клеточных культурах.

Таблица 2. Список препаратов, исследованных на токсичность в тест-системе in vitro.

Название препарата Химическая структура или состав

Катамин АВ (роккал, цетилпиридиний) Алкил (С8-С18диметилбензиламмония хлорид

Катапол Полимерный комплекс катамина с сополимером ^винилпирролидона и кротоновой кислоты

Полисепт Полигексаметиленгу анилин

Протамин сульфат Сильноосновный низкомолекулярный белок с высоким содержанием аргинина

ддс Додецилсульфат (лаурилсульфат) №

Ацемин №-соль Е-аминокапроновой кислоты

Полимерное производное ацемина Полимерное производное ацемина с сополимером ^винилпирролидона и кротоновой кислоты

Комбинированное полимерное производное ацемина и катамина Комплексное производное катамина и ацемина на полимерной матрице из N винилпирролидона и кротоновой кислоты

Костный цемент «Полакрис» Цемент на основе полиметилметакрилата

Метилметакрилат, мономер Жидкий компонент для приготовления костного цемента

Аналоги рибовирина 1,2,4-триазол-З-карбоксамид и морфолиновое производное 1,2,4-триазола

Хвойно-хлорофилл о -каротиновая паста Препарат из хвои пихты, содержащий каротиноиды, вит.Е и другие биологически активные вещества

Экстракт коры березы Препарат, содержащий тритерпеноиды и другие биологически активные вещества

Вигопан Экстракт культуры тканей жень-шеня с витаминными добавками

В табл.3 представлены препараты, исследованные в качестве защитных веществ при токсическом воздействии на клетки в культуре ряда ксенобиотиков.

Таблица 3. Список препаратов, исследованных в качестве цитопротекторов в условиях острой токсичности in vitro.

Название препарата Химическая структура или состав

Мафусол 0,1 М фумарат Na; 0,1 М NaCl; 4 mM KC1 и l,3mMMgC2

Эрисод Супероксиддисмутаза из эритроцитов человека

Витамин Е а-токоферол

Тиоктацид Т а-липоат

Унитиол 2,3-димеркаптопропансульфонат Na

Глутатион 7-глутамил-цистеинил-глицин

Димексид Диметилсульфоксид

Милдронат 3-(2,2,2-триметилгидразиний)-пропионат

Цитохром С —

Нормальный иммуноглобулин человека

Бычий сывороточный альбумин —

Цельная сыворотка крови здоровых доноров

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧНОСТИ IN VITRO.

Идея предложенного нами подхода к оценке острой токсичности in vitro заключается в последовательном определении нескольких биохимических показателей токсичности в среде инкубации клеток с сохранением жизнеспособности клеточного монослоя и лишь затем в клетках интактного монослоя или в их гомогенате, полученном после снятия монослоя с субстрата. Это позволило нам определять на одном и том же клеточном материале до 4-х показателей токсичности и, следовательно, более точно оценивать степень повреждающего воздействия исследуемых токсических веществ, в том числе выявлять минимальные токсические дозы (МТД) in vitro. Подобный подход к исследованию токсичности на клеточном уровне использован впервые. Кроме того, разработанная модель позволила оценить степень обратимости/необратимости токсического эффекта ряда

исследованных препаратов. Для этого после экспозиции с ксенобиотиком и его отмывки культуры клеток помещали в свежую порцию ростовой среды на 24 ч, после чего определяли какие-либо из показателей токсичности.

Активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран в настоящее время рассматривается многими авторами как одно из важнейших проявлений стресса на клеточном уровне, но все еще достаточно редко используется применительно к культурам клеток [Murrell et al, 1990; Morliere et al., 1991]. В ходе предварительных опытов нами было установлено, что содержание ТБК-положительных продуктов ПОЛ в среде инкубации клеток всегда коррелирует с их содержанием в кислотном экстракте гомогената, полученного из клеточного монослоя, поэтому в дальнейшем данный показатель мы исследовали только в культуральной среде клеток. Вторым показателем, определяемым непосредственно в среде инкубации, была активность цитозольного фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Выход ЛДГ в среду инкубации клеток является широко признанным маркером нарушения целостности плазматической мембраны при неблагоприятных внешних воздействиях [Morgan et al., 1989; Clemedson et al., 1996]. Третьим показателем, определяемым с сохранением жизнеспособности клеток в культуре, может служить мембраносвязанная форма ДТ-диафоразы — NAD(P)H: хинон оксидоредуктазы - одного из ферментов антиоксидантной системы клетки, участвующего в опосредовании ответов на токсические воздействия [Malviya et al., 1986; Ross et al., 1993]. Тот факт, что плазматическая мембрана практически непроницаема для искусственного акцептора электронов этого фермента 2,6-дихлорфенолиндофенола, позволяет утверждать, что при добавлении последнего в культуральную среду измеряется активность почти исключительно формы энзима, локализованной в плазматической мембране. Остальные биохимические показатели, перечисленные в табл.1, исследовались либо непосредственно в клеточном монослое (например, НТТ), либо в гомогенате клеток, приготовленном на, 0,5 %-ном тритоне X-100, полученном в результате снятия монослоя с субстрата.

2. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ И РЯДА ДРУГИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ

Для биохимико-токсикологического анализа in vitro нами был выбран ряд препаратов, либо уже применяющихся на практике, либо проходящих испытания на разных стадиях. В то же время, токсичность этих препаратов ранее исследовалась почти исключительно традиционными методами с использованием лабораторных животных и таких интегральных показателей как LD50, что не позволяет выявить тонкие механизмы действия препаратов

Таблица 4. Показатели цитотоксичссксно эффекта различных коицешраций иолисента (молшексаметилещуанидина) на фибробласлы легкою эмбриона человека (ДКЭЧ) в культуре

Покаиюли конц. \ полисепта,\ мкг/мл ЛДГ клеточного юмогена- та, нмоль ЫАОН/ мин»106 клеток ЛДГ в среде инкубации, нмоль ЫАШ/мин • 106 клеток Глутатион-трансфе-раза, пмоль д.н.б./мин» 106 клеток дт- диафораза клеточной мембраны, % от контроля Восстановление ниг-росинего тетразолия, %от контроля I- 1-е инд>ци-рованное перекнсное окисление в среде инкубации, нмоль МДА/ мл Связывание Са2+, огн.ед. флуоресценции/ мг клеточно! о белка

контроль 12,6+1,98 0,00±0,00 99,6±5,0 100±7,1 10011,3 0,01210,004 100112,2

0,5 — 1,22±0,63 105,7±8,6 — 96,4±9,7 0,023±0,008 —

1,0 13,910,70 2,32±0,91 63,6±8,2 + — 111,215,2 0,06410,006* 78119,2

5,0 — 4,05±1,28 + 56,1±2,2 * 93,5±1,6 49,2±7,2 * 0,08410,006* —

10,0 11,411,30 17,8211,67* 50,1 ±5,8 * 118,7110,2* 41,3±1,1 * 0,12810,013* 278125,2*

50,0 5,1611,08* 29,8512,49* 41,5±3,1 * 63,2±3,5 * — 0,18210,011* —

100,0 3,90+0,10* — ... 41,711,0* 13,7±1,2 * 0,26510,032* —

Примечание:+ - отличие от контроля достоверно, р< 0,05; * - то же, р < 0,01; жирным шрифтом выделены значения, превышающие соответствующие контроли (фаза метаболической активации); прочерк означает отсутствие данных при соответствующей концентрации. Клетки инкубировали с препаратом в среде Хэнкса в течение 2 час и после тщательной отмывки определяли исследуемые показатели, п>4. - данные по связыванию Са2+ получены на суспензионной культуре и-937.

на клеточном уровне. Для понимания таких механизмов представляются необходимыми исследования с использованием культур клеток.

Основное внимание было уделено изучению ряда препаратов с антисептической активностью. Список всех исследованных нами препаратов приводится в табл.2. В качестве примера токсического эффекта исследованных препаратов представлены данные по действию на фибробласты легкого эмбриона человека в культуре катионного антисептика полисепта (табл.4) (данные по связыванию клетками Са2+ получены на суспензионной кульгуре U-937).

При анализе полученных данных можно отметить, что исследованный антисептик вызывал в культурах клеток следующие дозозависимые эффекты: 1) всплеск Ре2+-индуцированного ПОЛ; 2) выход в среду инкубации цитоюльной ЛДГ; 3) подавление активности ряда дегидрогеназ и ферментов обмена глутатиона.

В то же время, минимальные эффективные концентрации токсического препарата вызывали повышение активности ряда цитозольных (ЛДГ, ГР, глутатион-8-трансфераза), митохондриальных (выявляемых в тесте восстановления нитросинего тетразолия) и мембранных (ДТ-диафораза) ферментов. Аналогичные данные получены практически по всем исследованным препаратам. Так, катамин АВ в диапазоне концентраций 0,550 мкг/мл вызывал резкий подъем ПОЛ, угнетение активностей АТФаз, ЛДГ клеточного гомогената, ДТ-диафоразы плазматической мембраны. Токсическое действие катапола было аналогичным, но МТД (5 мкг/мл) была существенно выше по сравнению с мономерным катамином АВ (0,5 мкг/мл) даже с учетом меньшего содержания активной структуры в полимерном комплексе, что впервые подтверждает на клеточном уровне общую закономерность снижения токсичности полимерных препаратов по сравнению с мономерными, отмеченную ранее in vivo [Афиногенов, Панарин, 1993]. Цитотоксическим действием обладали все исследованные препараты независимо от их структуры, кроме Вигопана, который оказался нетоксичным в широком диапазоне исследованных концентраций.

Особый практический интерес представляло исследование костного цемента (КЦ) на основе полиметилметакрилата, используемого в хирургии и вызывающего в некоторых случаях осложнения токсического характера. КЦ в клинически адекватных концентрациях обладал выраженным токсическим действием на фибробласты человека в культуре, зависимым от концентрации КЦ и времени экспозиции с ним клеток. Токсический эффект КЦ выражается в развитии окислительного стресса и клеточной гипоксии (увеличение ПОЛ примерно вдвое, падение на треть общей антиоксидантной активности и активности дыхательных ферментов), повреждении клеточных мембран и снижении пролиферативной активности клеток. Наиболее ответственным за развитие возникших повреждений оказался временной интервал в 1 ч после внесения свежеприготовленного КЦ в среду инкубации. Замена питательной

среды и, таким образом, удаление растворимых токсичных продуктов в этот период существенно снижает деструктивные процессы. Показано, что за токсический эффект КЦ ответствен мономерный метилметакрилат (ММА), который в концентрациях, сопоставимых с попадающими в кровяное русло при хирургических операциях, вызывает те же нарушения метаболизма клеток, что и сам КЦ.

Для установления зависимости характера токсического эффекта от тканевого происхождения использованной клеточной линии было проведено специальное исследование цитотоксического ответа трех клеточных линий -ДКЭЧ, Mg-63 и шИеЬа на введение возрастающих концентраций ДЦС (показатели токсического действия - активность ЛДГ в среде инкубации клеток и в клеточном гомогенате после отмывки препарата и последующего культивирования клеток 1 сут). Многофакторный дисперсионный анализ показал очень незначительный вклад в вариабельность данных тканевого происхождения клеточной линии, который не превышает 2,5 % от уровня варьирования данных. Аналогичные результаты получены и для клеток различных видов млекопитающих (крыса, собака, человек).

Следует также отметить, что выявленный нами эффект «метаболической активации» минимальными эффективными концентрациями ксенобиотиков наблюдался практически для всех исследованных препаратов и при использовании различных показателей метаболического состояния клеток.

Таким образом, развитие токсического ответа на введение возрастающих- концентраций ксенобиотиков различной химической природы носит однотипный характер вне зависимости от: 1) структуры препарата; 2) использованного показателя токсичности; 3) тканевого и видового (в пределах класса млекопитающих) происхождения клеток.

Объяснением такому сходству может служить гипотеза общей или базовой токсичности, согласно которой большая часть соединений, вне зависимости от их химической природы, повреждает одни и те же жизненно важные («базовые») функции, общие для всех клеток независимо от их специализации. Повреждение одного метаболического пути или одной субклеточной структуры неизбежно постепенно распространяется и на другие функции/структуры, поэтому использование различных биохимических показателей токсичности обычно приводит к сходным результатам. Обнаруженный при этом парадоксальный метаболический ответ - активация минимальными токсическими концентрациями исследуемых соединений ряда клеточных ферментов, как связанных с жизненно важными функциями клеток (ЛДГ), так и непосредственнс участвующих в детоксикации и антиоксидантной защите (глутатион-Б-трансфераза, ГР, ДТ-диафораза) может быть интерпретирован как мобилизационная стадия стресса на клеточном уровне. Увеличение активности ферментов, связанных с обменом глутатиона, активности ДТ-диафоразы, АОА, по-видимому, отражает активацию систем детоксикации клеток и защиты против

1(1

окислительного стресса, что неизоежно приводит к оошеи активации метаболизма, в частности, интенсивности гликолиза (ЛДГ) и митохондриальных дегидрогеназ (НТТ).

Полученные данные показали, что разработанная модель является наиболее адекватной в оценке острой токсичности in vitro для широкого спектра препаратов, установлении МТД и степени обратимости/необратимости токсических эффектов по сравнению с применявшимися ранее.

3. ВЫЯВЛЕНИЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ

Почти все тестированные нами препараты проявляли выраженное токсическое действие in vitro, при этом часто в диапазоне концентраций близком или перекрывающимся с их фармакологическими дозами. Проблема снижения токсичности веществ без уменьшения их специфической фармакологической эффективности явилась предпосылкой этой части нашей работы, посвященной скринингу питопротекторных препаратов на клеточной модели острой токсичности in vitro. Цитотоксический ответ клеток в культуре моделировался введением в среду инкубации полисепта, катапола или ДДС - ксенобиотиков, токсическое действие которых было изучено нами в разработанной тест-системе наиболее всесторонне. Учитывая показанный выше однотипный характер цитотоксического действия. соединений разнообразной химической структуры, полученные данные могут носить достаточно универсальный характер. Это подтвердилось при дальнейшем исследовании цитопротекторного действия выбранных препаратов на модели острой токсичности, вызванной костным цементом на основе ММА

Поскольку первым защитным барьером при .попадании в организм ксенобиотиков является внутренняя среда организма, в частности, сыворотка крови, исследовали защитный эффект цельной сыворотки крови в различных концентрациях и отдельных сывороточных белков - нормального иммуноглобулина и альбумина. Неспецифическая защитная функция в организме сывороточных белков широко обсуждается [Morgan et al., 1988; Миллер, 1993; Пентюк, 1995]. Целый ряд белков, в частности, сывороточный альбумин, обладают неспецифическим антиоксидантным действием [Baturay, Roque, 1991; Волчегорский и др., 1997].

Одним из наиболее важных механизмов цитотоксичности считается окислительный стресс, в процессе которого генерируются активные формы кислорода, развивается перенапряжение антиоксидантных систем клетки, подавляется дыхательная функция митохондрий [Brogaard, 1997; Garcia-Alfonso et al., 1998]. Одним из последствий окислительного стресса становится развитие тканевой гипоксии [Лукьянова, 1989, 1997; Ляпков,

Ткачу к, 1995] Это предопределило выбор препаратов с антитипоксическим и/или антиоксидаитным действием в качестве возможных цитопротекторов. При этом мы отдавали предпочтение соединениям, уже разрешенным для клинического применения, а также их всевозможным комбинациям (табл. 3), причем препараты использовали в клинически адекватных концентрациях, исходя из расчетной концентрации в крови при максимальных суточных дозах согласно инструкции к применению.

Введение в инкубационную среду сывороточных белков приближало ее по составу к внутренней среде организма и имело четко выраженное защитное действие (рис. 1).

Рис 1 Защитное действие нормального иммуноглобулина и сывороточного альбумина в отношении токсического эффекта полисепта, выраженного в усилении индуцированного ПОЛ в культурах ДКЭЧ.

1 - контроть, 2 - иммуноглобулин, 20 мг мч, 3 - альбумин, 20 мг/мл, 4 - полисепт, 1 мг/мл (п1), 5 - п1 + иммуноглобулин, 6 - полисепт, 50 мкг/мл (п2), 7 - п2 + иммуноглобулин, 8 - п2 + альбумин * - статистически достоверное отличие от контроля (р<0,01), # -статистически достоверное отличие от п2 (р<0 01) п>4

Как нормальный иммуноглобулин, так и сывороточный альбумин полностью предотвращали токсический эффект полисепта, начиная с его концентрации 50 мкг/мл, не только возвращая к норме реакции ПОЛ, но и понижая уровень ТБК-реактивных продуктов ниже соответствующих контролен. Аналогичные данные получены с катаполом, а также с катамином и протамином. В целом протективное действие сывороточных белков выражалось в сдвиге повреждающих фибробласты концентраций использованных препаратов в сторону их увеличения примерно на порядок.

МТД изученных препаратов оказались при этом не токсичными, а исследованные показатели не отличались от контрольных. Это делает возможным увеличение концентрации антисептиков в среде инкубации без неблагоприятного влияния на клетки: МТД катапола в присутствии сыворотки увеличивалась с 5 до 10 мкг/мл; для полисепта аналогичные цифры составили 1 и 50 мкг/мл.

Защитное действие ряда препаратов с антигипоксической/ антноксидантной активностью в отношении токсического эффекта ММА представлено в табл. 5.

Наиболее выраженным цитопротекторным эффектом,

препятствовавшим развитию свободнорадикального ПОЛ и предохранявшим мнтохондриальные ферменты от инактивации, обладали эрисод, глутатион и унитиол.

Таблица 5. Сравнительная характеристика цитопротекторного действия антигипоксантов V антиоксидантов на ПОЛ и общую активность дыхательных ферментов в присутствии ММА

Состав среды ПОЛ (нмоль МДА/ мл) Общая активность

дыхательных ферментов

(восстанов. нитросинего

тетразолия, % от контр.)

Ростовая среда 0,09 ±0,01 99,2 ± 1,71

(контроль)

[ММА 1,17 ±0,12* 70,7 ± 3.22 *

ММА. мафусол 0,57 ± 0.08 * # 86,2 ±2,11 *#

ММА, эрисод 0,37 ± 0,04 * # 89,2 ± 3,74 * #

ММА, витамин Е 0,24 ± 0,03 * # 75,2 ± 5,0 *

ММА, глутатион 0,28 ± 0,01 * # 91,3 ± 3,80 #

ММА, унутиол 0,29 ± 0,03 * # 87,4 ± 2,31 *#

ММА, мафусол, эрисод 0,30 ± 0,03 * # 86,1 ± 2, 30 * #

ММА, мафусол, 0,22 ± 0,09 # 80,6 ±1,0*

витамин Е

ММА, мафусол, 0,26 ± 0,05 * # 94,9 ± 3,95 #

глутатион

ММА, мафусол, 0,27 ±0.01 * # 95,8 ± 1,30 #

унитнол

* Отличия в пробах достоверны от контроля при р< 0 02

# Отличия в пробах достоверны от образца с ММА при р< 0.02

Конечная концентрация препаратов: ММА 0,36 мг/ мл; мафусола 8 мМ. эрисода 0,3 мкМ, витамина Е 25 мкМ; гл>татиона 0.3 мМ; унитиола 0,5 мМ Время инкубации с препаратами - 18ч

Мафусол практически полностью предотвращал снижение общей активности дыхательных ферментов и в меньшей степени ингибировал ПОЛ. Витамин Е. наоборот, проявлял более выраженное антноксидантное действие по сравнению с антигипоксическим. В комбинации мафусола с витамином Е протективный эффект определялся, видимо, преимущественно витамином Е, поскольку по антигнпоксической активности смесь препаратов уступала действию одного мафусола. Наиболее эффективными по обоим критериям оказались комбинации мафусола с эрисодом, глутатионом или унитиолом.

Учитывая важность надежного доказательства благоприятного эффекта мафусола, эрисод и их комбинации, которую мы планировали исследовать в дальнейшем in vivo, опыты по влиянию данных препаратов на токсичность, вызванную различными концентрациями ММА, были продолжены. На рис.2 представлены обобщенные данные, где оптическая плотность в НТТ в присутствии ММА была принята за 100 %.

Рис. 2. Обобщенные данные по цитопротекторному действию мафусола (2), эрисод (3) и их комбинации (4) в условиях острой токсичности на культурах ДКЭЧ, вызванной ММА (1).

* - достоверное отличие от проб с ММА (р<0.001). # - достоверное отличие от 3 (эрисод)

Результаты многофакторного дисперсионного анализа, степень влияния на исследуемый показатель мафусола и эрисод высокодостоверна, степень влияния взаимодействия мафусола и эрисод при совместном введении значима: Г=5,067 (пограничное значение = 1.89). р=0, 0269

Отличие действия комбинации мафусола и эрисод но сравнению с изолированным введением препаратов оказалось значимым по результатам дисперсионного анализа. Кроме того, эффект совместного введения двух препаратов отличается от эффекта эрисод также по 1-критерию.

Целесообразность комбинированной внутривенной инфузии мафусола и внутримышечной инъекции эрисод в условиях токсичности, вызванной ММА, была подтверждена в опытах на кроликах и в клинических испытаниях, проведенных в РНИИ травматологии и ортопедии им.Р Р.Вредена [Мамаева и др., 2000].

4. ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ: ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ II МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ОТВЕТ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ

В ходе предпринятых нами исследований был обнаружен ряд общих закономерностей и выявлены некоторые детали механизма ответа клеток в культуре на повреждающие внешние воздействия. Это позволило интерпретировать зозникающие в ответ на токсическое воздействие изменения метаболизма и жизнеспособности клеток как проявление фазных реакций стресса на клеточном уровне, что дало возможность использовать разработанную модель не только для оценки токсичности в узком смысле этого термина, но и для изучения разнообразных внешних воздействий химической, физической и биологической природы на клетки в культуре.

По данным литературы [Ясногородский, 1987] под влиянием электромагнитных полей вблизи полупроницаемых мембран происходит повышение концентрации одноименно заряженных ионов, которые способны изменять функциональное состояние клеток. При этом возрастает их чувствительность к действию свободнорадикальных реакций ПОЛ и скорость переноса электронов в системе цитохромов. Стимулирующее действие электромагнитных полей опосредовано в значительной степени их влиянием на клеточную мембрану [8ака1 й а1., 1991]. Показано также значимое воздейтвие на клетки в культуре светового воздействия различных частей спектра видимого диапазона, в частности низкоинтенсивного лазерного излучения [Зырянова и др., 1994].

Для воздействия на культуры ДКЭЧ применяли постоянное, переменное и циклотронное электромагнитные поля с одинаковой напряженностью 80 мкТл. Время воздействия составляло от 1 до 6 ч. Применялся излучатель магнитного поля оригинальной конструкции с встроенным магнитометром [Соколов, 1991]. В трех сериях опытов исследовано воздействие полей на величину прироста клеточной массы и соотношение живых и мертвых клеток в культуре.

В опытах с циклотронным полем продемонстрировано достоверное повыление числа живых клеток по отношению к контролю после облучения в течение 1 ч (153 %, р<0,001), 2 ч (202 %, р<0,001), 4 ч (167 %, р<0,001) и 6 ч

(140 V р<0,001) и сокращение числа мертвых клеток после облучения в течение 1 ч (67 %, р<0,05) и 4 ч (29 %, р<0,001) В результате применения постоянного и переменного электромагнитных полей бьпо установлено, что изменения в культурах обусловлены не приростом клеточной массы, а снижением или увеличением числа мертвых клеток Воздействие, основанное на эффекте циклотронного магнитного резонанса, приводило к наиболее выраженным сдвигам в процессе пролиферации фибробластов. во всех опытах наблюдался достоверный прирост живых клеток на фоне снижения числа мертвых Выявлено, что пиковым значением для стимуляции к неточной пролиферации является двухчасовое воздействие любым из названных видов электромагнитных полей.

Содержание ТБК-положительных продуктов в среде инкубации клеток при Ре" /аскорбат-индуцированном ПОЛ изучали или непосредственно после электромагнитного облучения, или спустя 1 сутки Обнаружено повышение уровня прод\ктов ПОЛ после воздействия циклотронным и постоянным полями в течение 1-2 ч с последующим уменьшением ниже контрольных значений при более длительных сроках воздействия Для более полного выявления отмеченных тенденций был использован регрессионный анализ Наиболее достоверно с помощью линейной модели регрессии описывается временная тенденция воздействия циклотронным полем (рис 3)

Рис 3 Воздействие циклотронного электромагнитного поля на интенсивность инд)цированного ПОЛ в культурах фибробластов Определение продуктов ПОЛ через 1 сут после воздействия

Линейная модель регрессии Ось абсцисс - время облучения культур, ч, ось ординат - концентрация МДА в % от контроля

Дисперсионный анализ линейной модели показал, что ее информационная способность высока ^=99,98% Модель значима F=607,87, p=0,026 Временная тенденция воздействия постоянным полем описывается

мультипликативной моделью регрессии (Я2=99,99%; Р=15960,02; р=6*10-5). Что касается переменного электромагнитного поля, его влияние выражено слабо и, не носит четкой временной зависимости. Возможно, что наблюдаемое повышение содержания продуктов ПОЛ в среде инкубации клеток при облучении циклотронным и постоянным электромагнитными полями в течение 1-2 ч отражает общую стимуляцию клеточного метаболизма, а его снижение при более длительной экспозиции следует рассматривать как некоторую оптимизацию, стабилизацию компенсаторных процессов, позволяющих клетке успешнее противостоять индуцированному перекисному окислению мембранных липидов. При этом незначительная активация ПОЛ в начальный период воздействия электромагнитных полей может трактоваться как благоприятный адаптивный процесс, универсальная реакция организма на внешние воздействия.

При исследовании светового воздействия культуры клеток облучали в течение 3 мин с помощью светодиодного излучателя «Спектр» светом следующих длин волн: красный - 0,62-0,76 мкм, зеленый - 0,510-0,575 мкм, синий - 0,45-0,48 мкм. и инкубировали в ростовой среде при 37° С 20 ч, после чего определяли общую концентрацию белка в гомогенате клеточного монослоя в 1 %-ном водном растворе тритона Х-100, а также активность ЛДГ в среде инкубации клеток и способность клеточного монослоя к восстановлению нитросинего тетразолия (табл. 6).-Облучение фибробластов красным и в еще большей степени зеленым светом вызывало значимое повышение общей концентрации белка в культуре, что свидетельствует об усилении клеточной пролиферации, в то время как облучение синим светом имело следствием тенденцию к ингибированию скорости размножения, которая, впрочем, не была статистически достоверной.

Таблица б. Сравнительное действие красного, синего и зеленого света на ДКЭЧ в культуре.

Световое Общая НТТ, % от НТТ(ср.опт.пл* Активность

воздействие концентрация контроля 103)/ср..сод. ЛДГ в среде

белка белка(мкг/мл) инкубации,

клеточного нмоль

монослоя, МЛБЫ/мл*ми

мкг/мл - н

Контроль 452,5+18,0 100,0+3,7 2,77 7,72+0,29

Красный свет 552,5+6,5 + 107,5+2,2 2,43 9,84+0,69+

Синий свет 400,0+18,5 100,3+2,3 3,17 7,28+0,37

Зеленый свет 582,5+29,0+ 121,6+3,9* 3,05 7,33+0,29

Отличия от контроля достоверны при:+ - р<0,05; * - р<0,01; п>5.

Общая активность митохондриальных дыхательных ферментов (НТТ) была достоверно повышена только после воздействия зеленым светом. В то

же время, воздействие красным светом приводило к достоверной лабилизации клеточной мембраны, регистрируемой по утечке клеточной ЛДГ, в то время как синий и зеленый свет вызывали небольшое снижение выхода клеточной ЛДГ (табл 6) Полученные данные позволяют констатировать наименее благоприятный эффект на клетки в культуре светового излучения красного диапазона, которое можно характеризовать как «раздражающее»: усиление пролиферации с одновременной дестабилизацией клеточных мембран, в то время как излучение синей части спектра было, напротив, «стабилизирующим» - снижение скорости пролиферации без снижения метаболической активности и небольшая стабилизация плазматической мембраны клеток. Зеленый свет вызывал как усиление пролиферации, так и метаболической активности клеток (НТТ) без дестабилизации мембранных структур (выхода ЛДГ)

5. ОЦЕНКА IN VITRO ТОКСИЧНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ

Возможные токсические свойства биологических жидкостей (сыворотки крови, жидкости из пузырей от ожогов и обморожений, бронхо-альвеолярной лаважной жидкости) испытаны на культурах клеток ДКЭЧ и А-549. Было исследовано действие биологических жидкостей от 25 больных со следующими формами патологии: острый панкреатит, саркоидоз легких, ожоговые поражения и обморожения II-III степени, острое нарушение мозгового кровообращения, крупномасштабные хирургические вмешательства с различным течением послеоперационного периода (клинические образцы получены в РНИИ ТО им. Вредена, Военно-медицинской Академии и Ин-те пульмонологии МЗ РФ). Кроме того, использована экспериментальная модель фиброза легких у крыс после внутритрахеального введения блеомицина с забором лаважной жидкости через 1-30 сут после введения (в опытах использовано 47 животных).

Результаты показали, что лишь при тяжелых осложнениях (например, септический эндотоксикоз) сыворотка больных вызывает резкое угнетение жизнеспособности клеточного монослоя. В большинстве остальных случаев наблюдается стимуляция таких показателей как восстановление нитросинего тетразолия, ПОЛ, активность внутриклеточной ЛДГ, ДТ-диафоразы плазматической мембраны, что, вероятно, отражает активационную стадию стресса на клеточном уровне. В отдельных случаях (ожоговая болезнь) прослежен фазный ответ: переход от угнетения клеточного метаболизма на ранних стадиях (1-3 сут) к стимуляции - на стадии реконвалесценции

Исследование действия на клетки в культуре бронхо-альвеолярной лаважной жидкости на блеомициновой модели фиброза легких у крыс позволило подробнее исследовать динамику процесса, выявить корреляцию между содержанием продуктов распада тканей в лаваже и реакцией на него

клеток в культуре (табл. 7). Инкубация клеток с лаважной жидкостью приводила к повышению ПОЛ на всех сроках исследования (1-30 сут после введения блеомицина), повышению активности ЛДГ гомогената клеток (3-14 сут), фазному ответу ДТ-диафоразы (снижению активности на 1 сут, повышению к 3 сут и затем снижейию к 14 сут).

Таблица 7. Действие бронхо-альвеолярной лаважной жидкости крыс на культуры ДКЭЧ в разные сроки после однократного внутритрахеального введения блеомицина.

Сроки после Показатели

введения Индуцирован- Активность Активность Активность

блеомицина, ное ПОЛ, ДТ- ДЦГ в среде ЛДГ в

суток нмоль диафоразы инкубации, гомогенате

МДА/мл плазматич. нмоль клеток, нмоль

мембраны, NADH/мл« NADH/мл'мин

% от мин

контроля

Контроль 0,066:1:0,011 100,0±14,2 4,32±1,23 16,85±0,14

1 0,116:b0,006 * 82,0±29,0 6,29±0,46 * —

3 0,126:1:0,007 * 246,0±8,3 * б,85±0,47 * 20,84±0,77 *

14 0,155:Ь0,014 * 185,0±22,5 * 14,34±0,93 * 24,41±3,84

20 0,090±0,010 91,8±6,3 11,97±1,29 * 15,73±1,14

- отличие от контроля достоверно, р<0,05; * - то же, р<0,01

Данные, полученные на модели экспериментального фиброза легких, в целом, подтвердили результаты исследований клинических образцов биологических жидкостей. Они позволяют констатировать, что клеточная модель in vitro может с успехом применяться для выявления эндотоксичности биологических жидкостей.

6. ВОЗМОЖНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ IN VITRO ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИТОПАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ И ЭФФЕКТА АНТИВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

Известно, что острая вирусная инфекция связана с модификацией активности целого ряда важнейших внутриклеточных ферментов [Голубев, 1979; Pasternak, 1990]. Изменения молекулярной конфигурации мембран в результате внедрения и репродукции вирусов неизбежно должны сказываться на их проницаемости для таких маркеров целостности плазматической мембраны как ЛДГ,

В опытах использованы две клеточные линии, чувствительные к вирусам гриппа - MDCK и U-937. Культуры заражали вирусом гриппа А H3N2 по стандартной методике и инкубировали 2 суток, после чего отбирали аликвоты среды инкубации для определения активности ЛДГ, а клеточный монослой или отмытую клеточную суспензию использовали в тесте восстановления клетками нитросинего тетразолия (НТТ).

Одновременно с указанными тестами наличие вируса в среде инкубации клеток контролировали по реакции гемагглютинации. В среду инкубации части образцов вводили одновременно с вирусом хвэйно-хлорофилло-каротиновую пасту (экстракт из хвои пихты, полученный лиофилизацией 10 %-ной суспензии препарата), противовирусная активность которой была установлена ранее [Литвинова и др., 1998; Юхнова и др., 1998].

Результаты работы продемонстрировали, что сам противовирусный препарат обладал цитотоксическим действием в том же диапазоне концентраций, которые проявляли противовирусный эффект, по крайней мере в культуре U-937. Вирусы гриппа также вызывали дозозависимую цитопатическую реакцию, проявлявшуюся в утечке из цитоплазмы фермента ЛДГ й угнетении активности дыхательных ферментов. Следует отметить, что наименьшие эффективные концентрации как вирусов, так и использованного препарата, вызывали небольшую, но достоверную активацию в тесте НТТ, что является, с нашей точки зрения, отражением общности механизмов стресса на клеточном уровне и было неоднократно продемонстрировано нами при действии на клетки в культуре разнообразных химических агентов. В то же время, препарат в концентрации 100 мкг/мл, еще не токсичной на культуре MDCK, снижал цитопатическую реакцию клеток на действие 2-х испытанных титров вируса (достоверное уменьшение повреждения плазматических мембран, тестированное по активности ЛДГ и улучшение дыхательного метаболизма в тесте НТТ).

Следует отметить, что ранее препарат из хвои пихты в концентрациях 50-200 мкг/мл оценивался по морфологическим критериям как нетоксичный [Литвинова и др., 1998; Юхнова и др., 1998]. Отсюда можно сделать вывод, что модель ферментативного тестирования токсичности in vitro оказалась более чувствительной, чем морфологическаие методы, и может быть использована в оценке степени цитопатогенного действия вирусов и эффекта противовирусных препаратов.

7. ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОГО И АНТИАДГЕЗИВНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ В СРАВНЕНИИ С ИХ ТОКСИЧНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В

КУЛЬТУРЕ. РОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ОТДЕЛЬНЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ.

Определение антимикробной активности антисептиков катапола и полисепта в отношении тест-культур S.aureus, E.coli, P,aeruginosa, а также смешанной культуры, состоящей из S.aureus и P.aeruginosa, продемонстрировало сходный бактериостатический эффект обоих антисептиков в бессывороточной среде. Однако добавление 50 % сыворотки крови выявило принципиальное отличие в антимикробном действии исследуемых препаратов. Бактериостатическая активность катапола значительно снизилась и минимальная, подавляющая рост микроорганизмов концентрация (МПК) возросла с 5 мкг/мл до 160 мкг/мл. Аналогичная тенденция антимикробного действия в присутствии сыворотки была характерна также для ДЦС и катамина АВ. В противоположность этим препаратам антимикробная активность полисепта в присутствии сыворотки крови не только не ослабевала, но даже незначительно усиливалась и МПК в отношении S.aureus уменьшалась с 2,5 до 1,25-0,63 мкг/мл. Принимая во внимание влияние сыворотки на токсические параметры in vitro двух исследованных антисептиков, представляется интересным сравнить их антимикробные и токсикологические показатели в присутствии сыворотки крови. Так, для катапола МПК (160 мкг/мл) в несколько раз превышает МТД (10 мкг/мл), в то время как соотношение показателей полисепта более благоприятное: МПК - 0,63-1,25 мкг/мл, а МТД - 50 мкг/мл.

С целью дальнейшего изучения механизмов антимикробного действия исследуемых препаратов была предпринята оценка их антиадгезивной активности, препятствующей прикреплению патогенных микроорганизмов и колонизации им тканей хозяина. Полисепт достоверно снижал в наших исследованиях показатели колонизации S.aureus и P.aeruginosa в культурах ДКЭЧ в суббактериостатических концентрациях (ингибирование адгезии S.aureus до 55,5 % от контроля в 4-ом двукратном разведении МПК). В среде, содержащей 50 % сыворотку крови, антиадгезивная активность полисепта достоверно усиливалась, как и его бактериостатическое действие: ингибирование адгезии при этом достигало 83 % для S.aureus и 73 % для P.aeruginosa. Эффективное антиадгезивное действие полисепта, по-видимому, можно объяснить присутствием в его структуре полярных групп, способных модифицировать лиганды клеточной стенки бактерий и его полимерным характером. Известно, что степень полимерности препарата непосредственно влияет на процесс адгезии, обеспечивая конкурентное связывание лигандов патогена и тем самым препятствуя их кооперативному взаимодействию с рецепторами клетки хозяина [Matrosovich, 1989].

С целью уточнения роли сыворотки крови и отдельных сывороточных белков в механизмах бактериальной адгезии к клеткам-мишеням было исследовано влияние нативной сыворотки крови, сывороточного альбумина, нормального и антистафилококкового иммуноглобулинов, нормального комплемента, белка А стафилококков, а также их различных сочетаний, на адгезию клинического штамма S.aureus к культурам клеток Нер-2 и иммортализованных астроцитов. В результате показано, что наибольшей

активностью, ингибирующей процесс бактериальной адгезии, обладают нормальный и антистафилококковый иммуноглобулины в бессывороточной среде. Отсутствие разницы в действии нормального и антистафилококкового иммуноглобулинов, а также полное подавление их антиадгезивной активности " белком А, указывает на неиммунный (сорбционный) тип взаимодействия лигандов бактерий с иммуноглобулинами, которое осуществляется по константному Fc-фрагменту последних. Уровень антиадгезивной активности нативной сыворотки был значительно ниже и составил 4 % от уровня активности нормального иммуноглобулина и 85 % от уровня альбумина. Несмотря на выраженное ингибирующее действие иммуноглобулина и альбумина, растворение их в сыворотке не увеличивало антиадгезивную активность последней.

Полученные результаты иллюстрируют перспективность комплексного подхода к изучению антимикробного действия препаратов in vitro, которое следует сочетать с исследованием токсичности на культурах клеток, причем в условиях, наиболее полно имитирующих внутреннюю среду организма.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ оценки токсичности in vitro, состоящий в последовательном тестировании на каждом образце клеточной культуры до 4-х биохимических показателей токсического действия с сохранением жизнеспособности клеточного монослоя. Это позволяет существенно сократить затраты используемого клеточного материала и времени и одновременно повысить точность количественной токсикологической оценки препаратов in vitro.

2. Исследованные антисептики и ряд других фармакологических препаратов разного химического строения оказывают однотипное токсическое воздействие на клетки в культуре независимо от их тканевого и видового происхождения, выражающееся в резком усилении процессов перекисного окисления липидов, нарушении целостности клеточной мембраны, увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция, подавлении активности ряда мембран освязанных и цитозольных дегидрогеназ и ферментов обмена глутатиона, что свидетельствует об универсальности механизмов токсичности на клеточном уровне.

3. Минимальная эффективная концентрация большинства исследованных препаратов вызывает достоверное повышение активности изученных ферментов, что, по-видимому, отражает мобилизацию защитных механизмов на ранних стадиях токсического ответа, приводящую к общей интенсификации клеточного метаболизма.

4. Детально исследовано влияние на метаболизм фибробластов человека в культуре препарата костного цемента (КЦ), способного вызывать интраоперационные осложнения токсического характера. Под действием концентраций КЦ, адекватным применяющимся в клинике, в клетках

дозоздвисимо развивается окислительный стресс и гипоксия, а также снижается их способность к размножению.

5. Тестирование цитопротекторных препаратов в условиях острой токсичности in vitro, вызванной антисептиками и компонентом костного цемента, содержащим мономерный метилметакрилат, выявило наиболее значительный защитчый эффект антигипоксанта мафусола и антиоксидантов эрисод, глутатиона, унитиола, а-токоферола, а также сочетанного введения мафусола и эрисод.

6. Эффективность комбинированного применения мафусола и эрисод в качестве защиты от токсического действия КЦ подтверждена исследованием на экспериментальных животных и клиническими испытаниями.

7. Низкоинтенсиеные циклотронное и постоянное электромагнитные поля оказывают значимое влияние на процесс пролиферации фибробластов в культуре, а также вызывают фазный ответ устойчивости клеток к индуцированному ПОЛ с повышением его интенсивности при кратковременном облучении и последующим снижением до уровня ниже показателей контрольных клеток при увеличении длительности воздействия.

8. Световое излучение синей, зеленой и красной частей спектра вызывает в культурах клеток разнонаправленные сдвиги исследованных показателей метаболизма и пролиферации. По сумме показателей действие синего света можно оценить как стабилизирующее, зеленого - как стимулирующее и красного - как раздражающее.

9. Исследование влияния тканевых жидкостей (сыворотки крови, жидкости из пузырей от ожогов и обморожений, бронхолегочного лаважа), полученных от больных с различными формами патологии, выявило в культурах клеток фазный ответ изученных показателей токсичности в зависимости от тяжести и сроков заболевания. Инкубация клеток с лаважной жидкостью, полученной от экспериментальных животных на блеомициновой модели фиброза легких, вызывает типичную, зависимую от тяжести процесса токсическую реакцию, сопровождающуюся окислительным стрессом и повреждением клеточных мембран.

10. Исследование цитопатогенного действия in vitro вирусов гриппа и эффекта противовирусного препарата из хвои пихты выявило высокую чувствительность ферментативных тестов (выход ЛДГ, общая активность митохондриальных дегидрогеназ) для оценки цитопатической реакции, что делает предложенную модель применимой для тестирования противовирусных препаратов.

11. Сыворотка крови и отдельные сывороточные белки, снижая токсичность всех исследованных антисептиков примерно на порядок, оказывают разнонаправленное влияние на антимикробную активность катапола и полисепта: биоцидный и антиадгезивный эффекты катапола существенно снижаются, в то время как для полисепта эти показатели повышаются.

12. Сыворотка крови и отдельные сывороточные белки проявляют выраженную антиадгезивную активность в отношении клинических штгммов Staphylococcus aureus. Наибольшей активностью обладают препараты нормального и антистафилококкового иммуноглобулинов. Отсутствие разницы в их эффекте, а также блокирование антиадгезивной активности белком А клеточной стенки стафилококка, свидетельствуют о неиммунном механизме их действия. Список публикаций по теме диссертации

1. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Интенсивность перекисного окисления липидов в культуре фибробластов человека как возмо кный индикатор острой цитотоксичности in vitro. // Вестн. С.-Петербург. Ун-та, 1994, Сер. 3, вып. 1 , (№ 3). С. 50-58.

2. Еропкин М.Ю., Афиногенов Г.Е., Еропкина Е.М. Некоторые биохимические показатели цитотоксического ответа фибробластов человека в культуре под действием природных и синтетических поликатионов. // Вопр. мед. химии, 1995, Т. 41, № 2. С. 36-40.

3. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю. Влияние отдельных сывороточных белков и нативной сыворотки крови на адгезию Staphylococcus aureus к клеткам in vitro. // Ж. Микробгол., эпидемиол., иммунобиол., 1995, № 5. С. 19-23.

4. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю., Литвинчук Л.Ф., Смирнова Т.Д. Совершенствование тестов для определения цитотоксичности лекарственных препаратов in vitro. // Цитология, 1996, Т. 38, №2. С. 199-200.

5. Eropkina E., Aflnogenov G., Eropkin M. Human cell cultures as a prospective model for the assessment of antimicrobial activity and toxicity of newly designed drugs. // Hygiene + Medizin, 1996, Vol. 21, No 3. P. 162-171.

6. Афиногенов Г.Е., Еропкина Е.М., Бондаренко В.М., Еропкин М.Ю. Исследование противомикробной активности и цитотоксичности антиинфекционных препаратов на модели культуры киеток человека. // Ж. микробиол., эпидемиол., иммунобиол., 1996, № 5. С. 3-7.

7. Афиногенов Г.Е., Анисимов А.И., Еропкин М.Ю., Ерспкина Е.М., Калинин А.В., Соколов Г.В. Облучение электромагни гными полями и процессы индуцированного перекисного окисления липидов в культурах фибробластов. // Травматология и ортопедия России, 996, № 4. С. 30-34.

8. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю. Сравнительное исследование антимикробного и цитотоксического действия антисептиков in vitro с применением модели культуры эмбриональных фибробластов человека. // Токсикол. вестник, 1997, № 2. С. 12-17.

9. Afinigenov G., Eropkina E., Eropkin M. Evaluation of the antiadhesive activity ofbiologically active substances in the cell culture model. // Hygiene + Medizin, 1997, Vol. 22, No 4. P. 185-192.

Ю.Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Ферментативные методы оценки цитотоксичности на модели клеток человека в культуре: динамика лактатдегидрогеназы и глутатионредуктазы под действием различных концентраций ДДС-Na. // Токсикол. вестник, 1997, № 5. С. 26-31.

П.Афиногенов Г.Е., Еропкина Е.М., Еропкин М.Ю., Афиногенова А.Г. Новый способ выявления токсичности парфюмерно-косметических средств на культурах фибробластов кожи и легкого эмбриона человека. // Тезисы докл. II Междунар. научн.-практ. конф. « Биологич. активные вещества и новые продукты в косметологии» М., 1997. С. 68.

12.Eropkin M., Eropkina Е., Smirnova T. Enzymatische Endpunkte der Zytotoxizitat: LDH und Glutathionreduktase in menschlichen Zellinien bei akut zytotoxischer Reaktion aufNatriumdodecylsulfat. // Hygiene + Medizin, 1998, Vol. 23, No 6. S. 212-217.

13.Войтович А.В., Еропкина Е.М., Мамаева Е.Г., Еропкин М.Ю., Семиголовский Н.Ю., Афиногенов Г.Е. Оценка влияния костного цемента и антигипоксантов мафусола и милдроната на клетки человека в культуре. // Тез. Докл. VI Всеросс. Съезда анестезиол. и реаниматол., М., 1998. С. 154.

И.Афиногенов Г.Е., Калинин А.В., Анисимов А.И., Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М., Соколов Г.В. Цитобиохимический ответ культуры фибробластов на воздействие электромагнитными полями геомагнитного уровня. // Травматология и ортопедия России, 1998, № 3. С. 47-50.

15.Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Еропкина Е.М. Метаболическая активация минимальными токсическими дозами ксенобиотиков как общая закономерность острого цитотоксического ответа фибробластов человека в культуре. //Токсикол. вестник, 1999, № 1. С. 16-21.

16.Eropkm М., Smirnova Т., Eropkina E. Metabolic activation by the lowest effective doses of xenobiotics as a basic feature of the acute cytotoxic response ofthe different cell lines in culture. // Intern. Conf. on IN VITRO Cytotoxicity Mechanisms. Rome, Jan. 1999. P. 18.

17.Eropkina E., Mamaeva E., Voytovich A., Eropkin M. Cytotoxic action of polymethylmethacrylate (polyMMA) bone cement in the cell cultures ofhuman foetal fibroblasts and the possible modes of its protection. // Intern. Conf. on IN VITRO Cytotoxicity Mechanisms. Rome, Jan. 1999. P. 110.

18.Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Еропкина Е.М. Исследование закономерностей реакции культивируемых клеток на действие различных ксенобиотиков с помощью простых биохимических методов. // Цитология, 1999,Т.41,№ 3\4. С. 271-272.

19.Eropkine M. Participation du calcium a la reponse cytotoxique des cellules humaines en culture. // 7 erne Congres de la Societe de Pharmaco-Toxicol. Cellulaire. Nancy, France, 1999. P.38.

20.Eropkin M.Y., Smirnova T.D., Eropkina E.M., Mamaeva E.G. Cytoprotective action of antihypoxic and antioxidant preparations in human cultured cells under conditions of induced cytotoxic response. // Abstr. of the 37 Europ.

Congr. ofToxicology EUROTOX'99, Oslo. Toxicol. Letters, 1999, Vol. 109, Suppl. l.P. 43.

21 .Eropkina E., Mamaeva E., Eropkin M., Mashkov V. Biocompatibility problems "(T.eth> Imethacrylate bone cement and hypochlorite application and possible modes of their prevention. // Abstr. of the III World Congr. on Alternatives and Animal Use in the Life Sci., Bologna, Italy. ATLA(Alternatives to Laboratory Animals), 1999, Vol. 27, Special Issue. P. 314.

22.Eropkin M., Eropkina E., Smiraova T. Testing of acute toxicity and cytoprotective preparations in human cultured cells. // Ab.str. of the III World Congr. on Alternatives and Animal Use in the Life Sci., Bologna, Italy. ATLA, 1999, Vol. 27, Special Issue. P.411.

23.Ма!иаева Е.Г., Еропкина Е.М., Еропкин М.Ю., Нетылько Г.И., Варфоломеев А.П. Цитопротекторные препараты при цементном эндопротезировании. // Тез. докл. меж.нар. конф. «Свободнорадикальные процессы: экологии., фармакол. и клинич. аспекты. Цитология, 1999, Т. 41, №9. С. 822.

24.Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Еропкина Е.М., Мамаева Е.Г. Цитопротекторное действие антигипоксических и антиоксидантных препаратов на клетки человека в культуре при моделировании токсического ответа. // Вопросы мед. химии, 1999, Т. 45, № 5. С. 384-388.

25.Еропкин М.Ю. Модели, альтернативные использованию лабораторных животных в токсикологии. Достижения и проблемы. // Токсикол. вестник, 1999, №5. С. 7-13.

26.Еропкин М.Ю. Использование клеточных культур в качестве модельных систем в токсикологии. // Информац. бюллетень «Клеточные культуры». СПб, Ин-т цитологии РАН. 1999, вып 14. С. 16-22.

27.Корнилов Н.В., Еропкина Е.М., Еропкин М.Ю., Мамагва Е.Г., Войтович А.В., Машков В.М., Афиногенов Г.Е. Влияние костного цемента на метаболизм фибробластов человека в культуре. // Травматология и ортопедия России, 2000, № 2-3. С. 25-29.

28.Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Еропкина Е.М., Мамаева Е.Г. Исследование участия ионов кальция в токсическом действии ксенобиотиков на клетки человека в культуре. // Цитология, 2000, Т. 42, № 2. С. 154-159.

29.Eropkin M.Yu., Eropkina E.M., Mamaeva E.G., Paramonov B.A. In vitro cytotoxicity of biological fluids in different forms of clinical and experimental pathology. //Abstr of the 38 Europ. Congr. of Toxicolog> EUROTOX'2000, London. Toxicol. Letters, 2000, Vol. 116, Suppl. 1. P. 15.

30.Еропкин М.Ю., Литвинова О.М., Юхнова Л.Г., Смирнова Т.Д. Результаты использования ферментативных маркеров для оценки противовирусного действия хлорофилло-каротиновой пасты. // Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций. Материалы Всеросс. конф. 16-.i8 апр.2001, С.Петербург, 2001. С. 73-74.

31 .Корнилов Н В., Еропкина Е.М., Еропкин М.Ю., Мамаева Е.Г. и др.

Возможные пути коррекции токсического действия акрилового костного цемента с помощью цитопротекторных препаратов. // Травматология и ортопедия России, 2002, № 1. С. 50-55.

32. Еропкина Е.М., Мамаева Е.Г., Еропкин М.Ю. Особенности действия костного цемента на фибробласты человека в культуре и возможные пути его коррекции с помощью цитопротекторных препаратов. // Эксп. клинич. фармакол., 2003, № 5. С. 48-52.

33. Еропкин М.Ю., Киселев О.И., Еропкина Е.М., Смирнова Т.Д., Литвинова О.М. Возможности культур клеток и биохимических критериев в оценке токсичности противовирусных препаратов. // Тезисы докл. 2-го съезда токсикологов России. Москва, 2003. С.458-459.

34.Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов (монография). - СПб.: Морсар АВ. - 2003. - 239 С.

Патенты

35.Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю. Способ выявления токсичности химических агентов на культурах фибробластов кожи и легких эмбриона человека. // Патент РФ № 2079130 от 10.05.1997.

Зб'.Мамаева Е.Г., Машков В.М., Еропкина Е.М., Еропкин М.Ю., Нетылько Г.М., Анисимова Л.О., Стеблева Т.Ф. Способ профилактики и лечения общего токсического влияния мономера метилметакрилата при эндопротезировании крупных суставов с применением костного цемента. // Патент РФ № 2159089 от 20/11/2000.

Подписано в печать 04 06 04. Формат 60x84 1/16

Бумага офсетная Печать офсетная. ^

Усл. псч л. 1.86 Тираж 100 эк! Заказ №

ЦОП типографии Издательства СПбГУ 199061. С-Пстерб\рг. Средний пр . 41.

11172 19

РНБ Русский фонд

2005-4 12291

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Еропкин, Михаил Юрьевич

Список сокращений.

Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие механизмы токсичности на клеточном уровне

1.1.1. Механизмы токсичности, опосредованные взаимодействием с рецепторами.

1.1.2. Повреждение клеточной мембраны.

1.1.3. Изменение энергетического метаболизма клетки.

1.1.4. Роль ионов кальция в механизмах токсичности.

1.1.5. Связывание ксенобиотиков с жизненно важными биомолекулами.

1.2. Биотрансформация ксенобиотиков.

1.2.1. Фаза I биотрансформации.

1.2.2. Фаза II биотрансформации.

1.3. Окислительный стресс.

1.3.1. Источники АФК в организме

1.3.2. Клеточные мишени действия АФК.

1.3.3. Антиокислительные защитные системы.

1.4. Универсальность механизмов стресса на клеточном уровне и адаптивных ответов клеток.

1.5. Некроз и апоптоз в ответе клеток на токсические воздействия.

1.6. Общая и избирательная цитотоксичность. Гипотеза фундаментальной или базовой ("basal") токсичности.

1.7. Альтернативные модели в токсикологии.

1.7.1. Программа межлабораторной взаимной проверки и оценки практической применимости (валидации) методов тестирования токсичности in vitro (MEIC).

1.7.2. Пример успешного использования альтернативных методов в токсикологии - замена теста Драйза.

1.7.3. Основные тенденции развития альтернативных методов в токсикологии.

2. РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧНОСТИ IN VITRO.

2.1. Культуры клеток, использованные в работе.

2.2. Биохимические методы.

3. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ И РЯДА ДРУГИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

3.1. Исследованные препараты.

3.2. Результаты исследований и их обсуждение.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ КСЕНОБИОТИКОВ IN VITRO.

4.1. Материалы и методы исследования.

4.2. Результаты исследований и их обсуждение.

5.ВЫЯВЛЕНИЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ

5.1. Методология экспериментов и использованные препараты.

5.2. Результаты исследований и их обсуждение.

6. ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ КОСТНОГО ЦЕМЕНТА НА ОСНОВЕ МЕТИЛМЕТАКРИЛАТА И СПОСОБЫ ЕГО ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ.

6.1. Цитотоксическое действие костного цемента на фибробласты человека в культуре.

6.1.1. Методология экспериментов и исследованные препараты.

6.1.2. Результаты исследований и их обсуждение.

6.2. Возможные пути коррекции токсичности костного цемента: исследования in vitro.

6.3. Опыты на лабораторных животных.

6.4. Клинические исследования.

7. ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ: ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ОТВЕТ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ.

7.1. Методы исследования.

7.2. Результаты исследований и их обсуждение.

8. ОЦЕНКА IN VITRO ТОКСИЧНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ.

8.1. Результаты исследований и их обсуждение.

9. ВОЗМОЖНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ IN VITRO ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИТОПАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ И ЭФФЕКТА АНТИВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

10. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ В СРАВНЕНИИ С ИХ ТОКСИЧНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ.

11. ОЦЕНКА АНТИАДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИСЕПТИКОВ, СЫВОРОТКИ КРОВИ И ОТДЕЛЬНЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЖОВ НА

КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследованиях"

Изучение биологической активности веществ, независимо от последующей цели их использования, как правило, на первом этапе предполагает оценку их токсичности. Методы оценки токсичности, альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных, а именно, модели с использованием культур клеток находят все более широкое применение в биохимико-токсикологических исследованиях. [Maier, 1988; Митрохин и др., 1991; Balls, Fentem, 1992; Лукьянов и др., 1996; Clemedson et al., 1996, 1998]. Такие методы позволяют помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых химических препаратов прежде всего на стадии их доклинических испытаний. Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные синергические и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений [Митрохин и др., 1991].

Несмотря на широкое развитие и признание альтернативных методов в мире [Березовская, Митрохин, 1990; Walum, Ekwall, 1996, 2000; Clemedson et al., 1996, 1998, 2000], у нас в стране они пока не получили должного распространения. Так, при анализе материалов I съезда токсикологов России (1998) можно обнаружить, что из более чем 300 представленных сообщений только 35 так или иначе связаны с моделями in vitro, из которых на культурах клеток человека выполнено лишь 6 работ. Отдельные методы экспресс-тестирования in vitro, которые к настоящему времени утверждены

Минздравом, Госкомсанэпиднадзором и Госстандартом Российской Федерации [ ред. Подунова и др., 1999], являются недостаточно точными и специфичными и одновременно трудоемкими. Отсюда видно, насколько велика потребность в развитии подобных методов для отечественной науки и практики.

Широкое внедрение биохимико-токсикологического тестирования in vitro требует адаптации к условиям клеточных культур биохимических методов, первоначально разработанных для исследования биологических жидкостей, гомогенатов тканей и других объектов на макроуровне [Donato et al., 1998; Garcia-Alfonso et al., 1998], что явилось важной самостоятельной задачей нашей работы.

Модуляция биологической активности ряда препаратов внутренней средой организма [Minton et al., 1982; Morgan et al., 1988; Bos, 1989; Пентюк, 1995] делает актуальными исследования влияния ее составляющих, прежде всего сыворотки крови и отдельных сывороточных белков на специфическую, например, антимикробную активность, и на токсичность препаратов. В связи с этим большой интерес представляют исследования на одной и той же модели in vitro цитотоксичности препарата, а также его антимикробного действия, включая биоцидный и антиадгезивный эффекты.

В настоящее время широко признается, что в основе комплекса ответных реакций клеток, имеющих защитный характер и обеспечивающих адаптацию к меняющимся условиям в ответ на воздействие различных неблагоприятных факторов, в том числе и токсических агентов, лежат единые фундаментальные механизмы, приводящие к сходным изменениям на морфологическом и молекулярном уровнях [Александров, 1985; Котелевцев и др., 1986; Herberman et al., 1986; Браун, Моженок, 1987; Барабой и др., 1992]. Такой универсальный характер стрессовых реакций на клеточном уровне в ответ на разнообразные внешние воздействия делает перспективным применение моделей in vitro и стандартных биохимических критериев оценки жизнеспособности и метаболических изменений клеток не только при действии химических препаратов, но и физических (электромагнитных полей различной частоты и интенсивности) и биологических факторов (вирусов, тканевых жидкостей от больных с различными типами патологии).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель настоящей работы состояла в разработке модели тестирования токсичности на культурах клеток с помощью комплекса биохимических методов оценки на клеточном уровне состояния мембран, устойчивости клеток к окислительному стрессу, их систем детоксикации и общей интенсивности метаболизма.

Предполагалось показать, что данная модель может быть использована для решения самых разнообразных задач в области токсикологии и клеточной биологии, а именно, для изучения ряда представляющих практический интерес потенциальных или уже использующихся в практике фармакологических препаратов, физических и биологических воздействий на клеточные культуры.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. Провести сравнительное изучение антимикробной активности и токсичности модельных антисептиков в отношении клеток в культуре.

НАУЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ И НОВИЗНА РАБОТЫ.

- В ходе исследования установлен однотипный характер метаболического ответа клеток в культуре на различные повреждающие воздействия — токсические химические агенты, физические факторы, биологические жидкости от больных и экспериментальных животных с разными формами патологии, вирусы, выражающийся в повреждении клеточных мембран, усилении процессов перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ), подавлении активности ряда клеточных дегидрогеназ и ферментов обмена глутатиона. Показано, что универсальность этой реакции проявляется вне зависимости от химической структуры токсического вещества, метода оценки цитотоксичности и очень слабо зависит от тканевого и видового происхождения культивируемых клеток.

- Изучено действие в условиях острой токсичности in vitro ряда антигипоксических и антиоксидантных препаратов и их комбинаций. Впервые показано на клеточном уровне, что комбинированное применение антигипоксанта мафусола и антиоксидантов а-токоферола, СОД, унитиола, глутатиона вызывает повышение защитного эффекта препаратов.

Впервые продемонстрирован разнонаправленный характер влияния сыворотки крови на антимикробную активность, включая биоцидный и антиадгезивный эффекты, полимерных катионных антисептиков различной химической структуры: снижение эффективности катапола и повышение - у полисепта.

Показано, что антиадгезивная активность иммуноглобулинов в отношении S. aureus, препятствующая фиксации патогена на клетках-мишенях и колонизации тканей хозяина, не зависит от их антигенной специфичности.

Впервые исследован пролиферативный ответ и устойчивость к индуцированному перекисному окислению липидов фибробластов человека в культуре под действием электромагнитных полей геомагнитного уровня различной частоты и конфигурации, а также видимого света различных частотных диапазонов. НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Ряд биохимических методов: оценка индуцированного перекисного окисления липидов, активностей лактатдегидрогеназы, ДТ-диафоразы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы, общего содержания клеточных белков, связывания клетками ионов Са - был адаптирован к условиям культур клеток.

Предложен способ комплексной оценки острой токсичности in vitro, состоящий в последовательном изучении среды инкубации клеток, мембранных дегидрогеназ и лишь на заключительном этапе внутриклеточных ферментов. Это позволяет определять на одном образце клеточной культуры до 4-х биохимических показателей с сохранением жизнеспособности монослоя, что существенно сокращает количество используемого клеточного материала и длительность тестирования токсичности препаратов, а также позволяет повысить точность и эффективность определения порогов токсических концентраций веществ. Разработанная модель обладает более высокой чувствительностью, чем традиционные морфологические методы исследования и может быть рекомендована для широкого применения в предварительной фазе тестирования на токсичность, а также в скрининге цитопротекторных препаратов [Патент РФ № 2079130 от 10.05.1997].

Модификация сывороткой крови бактериостатического и антиадгезивного эффекта, а также цитотоксичности исследованных антисептиков показывает необходимость проведения исследований на культурах клеток в условиях, как можно более полно имитирующих внутреннюю среду организма.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Предложенная модель тестирования токсичности in vitro с помощью комплекса биохимических методов оценки на клеточном уровне состояния мембран, устойчивости клеток к окислительному стрессу, их систем детоксикации и общей интенсивности метаболизма показала высокую эффективность при решении самых разнообразных задач в области клеточной токсикологии.

2. Вне зависимости от конкретной химической структуры соединений, а также метода оценки цитотоксичности, все исследованные ксенобиотики вызывают качественно сходный острый токсический ответ клеток в культуре, существенной чертой которого является фаза активации метаболических процессов минимальными эффективными концентрациями веществ.

4. Сыворотка крови и отдельные сывороточные белки снижают токсичность in vitro исследованных антисептиков и оказывают разнонаправленное действие на антимикробный эффект препаратов различной структуры.

6. Циклотронное и постоянное электромагнитные поля геомагнитного уровня оказывают значимое влияние на процесс пролиферации клеток в культуре и вызывают характерный фазный ответ их устойчивости к индуцированному ПОЛ. Световое излучение различных частотных диапазонов также приводит к разнонаправленным сдвигам метаболизма и скорости пролиферации клеток в культуре.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы были представлены на 14 конференциях и конгрессах, в том числе на 8-ми международных: на Всероссийских научных конференциях «Биология клетки в культуре», С.Петербург в 1995 и 1998 г.; 1-ом международном конгрессе по биологической медицине, Израиль, 1994 г.; II междунар. научн.-практ. конф. « Биологич. активные вещества и новые продукты в косметологии», Москва, 1997; VI Всеросс. съезде анестезиологов и реаниматологов, Москва, 1998; международной коференции «Механизмы цитотоксичности in vitro», Рим, Италия, 1999; 7-ом конгрессе французского общества клеточной фармако-токсикологии, Нанси, Франция, 1999; 37-ом европейском токсикологическом конгрессе «Евротокс'99», Осло, Норвегия, 1999; III всемирном конгрессе по альтернативам использованию лабораторных животных в медико-биологич. экспериментах, Болонья, Италия, 1999; меж.нар. конференции «Свободнорадикальные процессы: экологич., фармакол. и клинич. аспекты», С.Петербург, 1999; 38-ом европейском токсикологическом конгрессе «Евротокс'2000», Лондон, Великобритания, 2000; Всеросс. конф. «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиол., диагностики гриппа и др. вирусных инфекций», С.Петербург, 2001; IV всемирном конгрессе по альтернативам использованию лабораторных животных в медико-биологич. экспериментах, Новый Орлеан, США, 2002; II съезде токсикологов России, Москва, 2003.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 34 печатных работы и два патента на изобретение.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 354 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 10-ти глав (каждая из которых содержит литературную предпосылку, специфические методы, результаты исследования и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 673 наименования, в том числе 209 на русском языке и 464 на иностранных. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 55 рисунками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время в мире зарегистрировано более 7 миллионов химических соединений. Их число возрастает примерно на 10 % в год и около 15 % из числа вновь синтезированных веществ находят то или иное применение в различных областях человеческой деятельности. Например, в США до недавнего времени в промышленность ежегодно внедрялось более 3 тысяч новых соединений, не считая лекарств и пестицидов [Ротенберг, 1986; Рожнов и др., 1995].

Согласно существующему во всем мире положению, каждое из внедряемых химических соединений должно пройти токсикологические испытания. Полученная информация дает представление о величине среднесмертельной дозы (LD50) и степени токсичности вещества, характере вызываемой им интоксикации, уровне максимально переносимой дозы, предположение о его способности аккумулироваться в организме, оказывать избирательное действие, позволяет выявить видовую, половую, возрастную чувствительность и определить ориентировочный уровень доз для последующих углубленных исследований [Сидоров, Халепо, 1970; Chan et al., 1982; Красовский и др., 1986; Miiller, 1992].

Уже сама постановка такой задачи определяет необходимость оптимизации соответствующих методических подходов, так как классические методы токсикологических испытаний на млекопитающих являются трудоемкими, длительными и дорогостоящими. Кроме того, современные этические представления и нормы резко ограничивают область применения высших животных в токсикологических исследованиях. По данным Zutphen и Balls [1996] ежегодно для научных исследований, тестирования и в образовательных целях во всем мире используется более 100 миллионов позвоночных животных. Общество в целом и, в особенности, научное сообщество несут моральную ответственность перед животными, пожертвованными во имя научного прогресса. Таким образом, с практической и этической точек зрения одной из актуальных проблем токсикологии является поиск и «валидация» (т.е. межлабораторная взаимная проверка и последующее признание организациями, регламентирующими токсикологические испытания) адекватных тест-систем, сопоставимых по основным токсикологическим характеристикам с млекопитающими, для последующего использования таких тест-моделей вместо высших животных. Для успешной разработки и адекватного применения таких модельных систем необходимо детально представлять общие механизмы токсического действия на клеточном уровне. Кроме этого, многочисленные факты свидетельствуют в пользу того, что токсическое действие можно в определенной степени считать частным проявлением общих механизмов стресса на клеточном уровне [Александров, 1975, 1985; Herberman et al., 1985; Браун, Моженок, 1987; Барабой и др., 1992], в связи с чем нам представлялось целесообразным рассмотреть эти механизмы в последующих разделах обзора литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Еропкин, Михаил Юрьевич

ВЫВОДЫ

2. Исследованные антисептики и ряд других фармакологических препаратов разного химического строения оказывают однотипное токсическое воздействие на клетки в культуре независимо от их тканевого и видового происхождения, выражающееся в резком усилении процессов перекисного окисления липидов, нарушении целостности клеточной мембраны, увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция, подавлении активности ряда мембраносвязанных и цитозольных дегидрогеназ и ферментов обмена глутатиона, что свидетельствует об универсальности механизмов токсичности на клеточном уровне.

5. Тестирование цитопротекторных препаратов в условиях острой токсичности in vitro, вызванной антисептиками и компонентом костного цемента, содержащим мономерный метилметакрилат (ММА), выявило наиболее значительный защитный эффект антигипоксанта мафусола и антиоксидантов эрисод, глутатиона, унитиола, а-токоферола, а также сочетанного введения мафусола и эрисод.

7. Низкоинтенсивные циклотронное и постоянное электромагнитные поля оказывают значимое влияние на процесс пролиферации фибробластов в культуре, а также вызывают фазный ответ устойчивости клеток к индуцированному ПОЛ с повышением его интенсивности при кратковременном облучении и последующим снижением до уровня ниже показателей контрольных клеток при увеличении длительности воздействия.

12. Сыворотка крови и отдельные сывороточные белки проявляют выраженную антиадгезивную активность в отношении клинических штаммов Staphylococcus aureus. Наибольшей активностью обладают препараты нормального и антистафилококкового иммуноглобулинов. Отсутствие разницы в их эффекте, а также блокирование антиадгезивной активности белком А клеточной стенки стафилококка, свидетельствуют о неиммунном механизме их действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение нам представляется целесообразным еще раз остановиться на основных положениях, развиваемых в настоящей работе, с некоторыми обобщающими комментариями.

Основная цель данной работы состояла в разработке модели тестирования токсичности in vitro с использованием комплекса биохимических методов, адаптированных нами к условиям клеточных культур. В ходе предпринятых исследований был обнаружен ряд общих закономерностей и выявлены некоторые детали механизма ответа клеток в культуре на повреждающие внешние воздействия. Это позволило интерпретировать возникающие в ответ на токсическое воздействие изменения метаболизма и жизнеспособности клеток как проявление фазных реакций стресса на клеточном уровне, что дало нам возможность использовать разработанную модель не только для оценки токсичности в узком смысле этого термина, но и для изучения разнообразных внешних воздействий химической, физической и биологической природы на клетки в культуре.

Идея предложенного нами подхода к оценке острой токсичности in vitro заключается в последовательном определении нескольких биохимических показателей в среде инкубации клеток с сохранением жизнеспособности клеточного монослоя и лишь затем в гомогенате клеток, полученном после снятия монослоя с субстрата. Это позволило нам впервые последовательно определять на одном и том же клеточном материале до 4-х биохимических показателей для выявления токсического эффекта и, следовательно, более полно и количественно оценивать степень повреждающего воздействия исследуемых токсических веществ, а также полнее выявлять механизмы токсического эффекта на клеточном уровне.

Широко признается, что одними из важнейших мишеней токсического воздействия на клеточном уровне являются клеточные мембраны, соотношение про- и антиоксидантных компонентов клетки, система энергетического метаболизма, гомеостаз ионов Са (главы 1.1.2 — 1.1.4 и 1.3). Выбор нами биохимических показателей для оценки токсичности базировался на этих представлениях.

Активация ПОЛ в результате окислительного стресса (дисбаланса про-/антиоксидантных систем) рассматривается в настоящее время многими авторами как одно из важных проявлений стресса на клеточном уровне, но все еще достаточно редко используется для оценки острой токсичности in vitro [Murrell et al., 1990; Morliere et al., 1991]. В ходе предварительных опытов нами было установлено, что содержание ТБК-положительных продуктов ПОЛ в среде инкубации клеток всегда коррелирует с их содержанием в кислотном экстракте гомогената, полученного из клеточного монослоя, что позволило определять этот важный показатель в среде инкубации клеток с сохранением интактного монослоя.

Вторым показателем, измеряемым непосредственно в среде инкубации, была активность цитозольного фермента ЛДГ. Выход ЛДГ в среду инкубации клеток является широко признанным маркером нарушения целостности цитолеммы при различных неблагоприятных воздействиях [Morgan et al., 1989; Clemedson et al., 1996].

Третьим показателем, определяемым с сохранением жизнеспособности клеточного монослоя, может служить активность связанной с плазматической мембраной ДТ-диафоразы (NAD(P)H — хиноноксидоредуктазы) - фермента, участвующего в опосредовании токсических ответов и одного из элементов АО защиты клетки [Malviya et al., 1986; Ross et al., 1993]. Это определение основано на том, что искусственный субстрат этого фермента — 2,6-дихлорфенолиндофенол не проникает внутрь клетки и, будучи добавленным в среду инкубации, восстанавливается мембраносвязанной формой ДТ-диафоразы.

Остальные биохимические показатели: определение активности ферментов обмена глутатиона (глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы), общей активности митохондриальных дегидрогеназ в нитротетразолиевом тесте, активности внутриклеточной ЛДГ, общего содержания белка, общей антиоксидантной активности - определялись в гомогенате клеточного монослоя, полученного гомогенизацией последнего с 0,5 % неионным детергентом тритоном Х-100.

Следует подчеркнуть, что распространенная в литературе (глава 1.7.1.) оценка острой токсичности in vitro лишь по одному из указанных выше показателей является, с нашей точки зрения, недостаточно полной и надежной и только предложенный нами комплексный подход позволил всесторонне оценить токсичность in vitro исследованных препаратов.

Для биохимико-токсикологического анализа in vitro с использованием разработанной нами модели был отобран ряд препаратов, либо уже применяющихся на практике, либо проходящих испытания на разных стадиях. В то же время, токсичность этих препаратов ранее исследовалась только традиционными методами с использованием лабораторных животных и таких интегральных показателей как LD50, что не позволяет выявить механизмы действия препаратов и их эффекты на клеточном уровне. Для понимания последних представляются необходимыми исследования на моделях клеток в культуре.

В качестве препаратов для тестирования были выбраны вещества различной химической структуры: катионные антисептики, относящиеся к четвертичным аминам (катамин АВ, катапол) или к гуанидиновым основаниям (полисепт), в том числе полимерной структуры (катапол, полисепт), анионные соединения ДДС, ацемин и высокомолекулярные производные последнего, противовирусные препараты на основе триазола, растительные препараты различного назначения (экстракты коры березы, хвои пихты, культур клеток жень-шеня), костный цемент на основе метилметакрилата, использующийся в хирургии и способный вызывать осложнения токсического характера.

При анализе полученных данных отмечено, что практически все тестированные соединения в характерном для каждого из них диапазоне концентраций вызывали в культурах клеток следующие дозозависимые эффекты: 1) всплеск Fe -индуцированного ПОЛ; 2) выход в среду инкубации цитозольной ЛДГ; 3) подавление активности внутриклеточных и связанных с плазматической мембраной дегидрогеназ, а также ферментов обмена глутатиона; 4) повышение внутриклеточной концентрации Са2+. В то же время, минимальные токсические концентрации исследованных препаратов вызывали повышение активности ряда цитозольных (ЛДГ, ГР, глутатион-S-трансфераза), мембранных (ДТ-диафораза) ферментов, а также общей активности митохондриальных дегидрогеназ. Следует отметить, что выявленный нами эффект «метаболической активации» минимальными эффективными концентрациями наблюдался не только для всех исследованных химических препаратов, но и растительных экстрактов сложного состава, тканевых жидкостей, полученных от больных или экспериментальных животных с различными формами патологии, при цитопатической реакции на минимальные эффективные концентрации вирусов, при воздействии электромагнитных полей. Объяснением этому, по-видимому, служит формирование и развитие защитных реакций неспецифического адаптационного синдрома клеток в ответ на внешние неблагоприятные воздействия, а обнаруженный парадоксальный метаболический ответ - активация минимальными эффективными дозами повреждающего фактора, может быть интерпретирован как мобилизационная стадия стресса на клеточном уровне. Такие показатели как активность ферментов обмена глутатиона, ДТ-диафоразы, АОА отражают активацию систем детоксикации клеток и защиты против окислительного стресса, что неизбежно приводит к общей активации метаболизма, в частности, гликолиза (ЛДГ) и митохондриальных дегидрогеназ, общая активность которых определялась в нитротетразолиевом тесте. Наши результаты согласуются с многочисленными данными по «раздражающему» действию пороговых доз повреждающих клетку агентов [Александров, 1975, 1985; Браун, Моженок, 1987; Shibata et al., 1997; Slamon, Pentreath, 1998; Calabrese, Baldwin, 1998]. Более того, ряд авторов, обсуждая свои данные, никак не отмечают такой эффект метаболической активации малыми дозами токсических веществ, хотя соответствующие пики присутствуют на представленных графиках [Roguet et al., 1992; Shibata et al., 1997].

Использование нами для тестирования in vitro различных клеточных линий с последующим многофакторным дисперсионным анализом показало очень слабый вклад в вариабельность данных тканевого и видового происхождения выбранной клеточной линии.

Таким образом, полученные нами данные позволяют констатировать, что развитие токсического ответа клеток в культуре на введение возрастающих концентраций ксенобиотиков различной химической природы носит однотипный характер вне зависимости от: 1) структуры препарата; 2) использованного показателя токсичности на клеточном уровне; 3) тканевого и видового (в пределах класса млекопитающих) происхождения клеток. В то же время отдельные составляющие компоненты такого стереотипного ответа, безусловно, могут иметь разное количественное проявление. Объяснением наблюдаемому сходству токсических ответов на клеточном уровне может служить гипотеза «фундаментальной» или «базовой» токсичности (глава 1.6), согласно которой большая часть соединений, вне зависимости от их химической природы, повреждает одни и те же жизненно важные («базовые») функции, общие для всех типов клеток независимо от их специализации [Clemedson et al., 1996, 1998].

Исследования токсического эффекта ксенобиотиков на разработанной модели позволили выявить и ряд других интересных закономерностей. Так, нами впервые было показано снижение токсичности антисептиков in vitro при повышении степени их полимерности - закономерность, установленная ранее in vivo [Афиногенов, Панарин, 1993]. При этом антимикробное действие высокомолекулярных комплексов антисептиков, в частности, их антиадгезивный эффект, напротив, усиливается. Это усиление антимикробной активности, вероятно, объясняется: 1) кооперативным механизмом взаимодействия заряженных групп высокомолекулярных ПАВ с лигандами клеточной стенки бактериальной клетки; 2) созданием более высоких локальных концентраций ПАВ, связанных с полимером, по сравнению со свободным антисептиком. В этом случае может происходить образование «полимерных слоев» ПАВ вокруг бактериальной клетки [Афиногенов, Панарин, 1993]. Уменьшение токсичности полимерных антисептиков по сравнению с мономерными в отношении эукариотических клеток, с нашей точки зрения, может быть связано с: 1) уменьшением возможности проникновения высокомолекуляного препарата в клетки; 2) возможными «детоксицирующими» свойствами полимера-носителя. В качестве основного полимерного компонента в изученных нами препаратах используется поливинилпирролидон, биосовместимость и благоприятный эффект которого при интоксикации широко обсуждаются [Парамонов, 1997].

Большой интерес представляло изучение на культурах клеток механизма токсического действия полиметилметакрилатного костного цемента, широко применяющегося в клинике при операциях эндопротезирования и нередко вызывающего местные и генерализованные интраоперационные осложнения токсического характера. Нами показано на культурах фибробластов эмбрионов человека, что токсическое действие цемента определяется остаточным (несвязавшимся при полимеризации) мономерным метилметакрилатом, установлены in vitro опасные разовые дозы цемента, а также выявлен временной интервал приблизительно в один час, следующий непосредственно за процессом полимеризации и приводящий к наиболее выраженным нарушениям в состоянии клеток. Показано, что замена питательной среды и тем самым удаление растворимых токсичных продуктов существенно снижает деструктивные процессы в фибробластах. Полученные на клеточных культурах данные подтверждены исследованиями на экспериментальных животных [Мамаева и др., 2000].

Дополнительная информация о действии токсикантов была получена в опытах по оценке обратимости/необратимости токсических эффектов. Для этого после экспозиции с препаратом (полисепт, ММА) и его тщательной отмывки культуры клеток помещали в свежую порцию ростовой среды на 24 ч, после чего измеряли один из показателей токсичности. При этом было установлено, что, например, для полисепта порог обратимости по выходу в среду инкубации ЛДГ составляет приблизительно 40 % от максимально возможной в данных условиях потери фермента.

Мы отдаем себе отчет, что для полной токсикологической характеристики препарата необходимо изучение его возможной биотрансформации в организме, взаимодействия с генетическим аппаратом клетки (генотоксичности). Следует подчеркнуть, что мы не ставили перед собой задачи исчерпывающей характеристики отдельных препаратов, которые использовались в наших исследованиях как модельные для характеристики самой тест-системы. Как неоднократно подчеркивалось, мы изучали, в основном, острую цитотоксичность, когда возможные эффекты на генном уровне просто не успевают развернуться. В то же время информационная ценность такой тест-системы достаточно высока в силу стереотипного характера воздействия соединений на клетки в культуре (гипотеза «базовой» токсичности).

В нашей работе по биохимико-токсикологическому анализу in vitro систематически использовались культуры диплоидных кожно-мышечных и легочных фибробластов эмбриона человека (ДКЭЧ), на которых получена основная часть результатов. Эти клетки, практически не использующиеся в зарубежных программах оценки токсичности in vitro, например, таких как MEIC [Clemedson et al., 1996, 1998], имеют, с нашей точки зрения, ряд преимуществ перед перевиваемыми клеточными линиями: подобно последним они являются стандартизованными по морфологии, поддерживаются достаточно длительное время в культуре (20-40 пассажей) и одновременно лишены главного недостатка постоянных линий - их трансформированное™, что приводит к разной степени злокачественности и дедифференцировки. ДКЭЧ сохраняют на протяжении всего срока культивирования постоянный диплоидный набор хромосом и характерную морфологию. Кроме того, исследование фибробластов как элементов соединительной ткани представляет особый интерес в свете данных о повышенной чувствительности соединительных тканей к окислительному стрессу, невысокого уровня активности в них ферментов антиокислительной защиты, интенсивной деградации под действием АФК таких специфических для них соединений как коллаген и гиалуроновая кислота [Герасимов, Фурцева, 1986]. Все это позволяет считать ДКЭЧ одной из наиболее перспективных моделей для биохимико-токсикологических исследований in vitro.

Изучение практически всех тестированных нами препаратов выявило их выраженное токсическое действие in vitro. В то же время в числе препаратов, обладающих токсическим действием на организм, могут оказаться соединения, перспективные для практического применения, когда ценность специфического фармакологического эффекта препарата «перевешивает» опасность развития токсических осложнений. В некоторых случаях по жизненно важным показаниям применение токсичных препаратов неизбежно (например, эндопротезирование с применением костного цемента). Поэтому задачей следующего этапа нашей работы был скрининг цитопротекторных средств, способных снизить токсическое действие препаратов без снижения их специфической активности.

Выявление общих молекулярных механизмов, лежащих в основе патологических изменений клеток и тканей при токсическом воздействии, определило новые подходы к патогенетической терапии, основными принципами которой должны стать прежде всего защита клеточных мембран и коррекция энергетического состояния клеток. В этой связи целесообразно использовать цитопротекторные препараты с антиоксидантными и антигипоксическими свойствами.

Нами было установлено, что введение в среду инкубации клеток препаратов с антигипоксическими и антиоксидантными свойствами в клинически адекватных концентрациях способно существенно уменьшить токсическое воздействие ряда антисептиков (катамин АВ, катапол, полисепт, ДДС) и мономера ММА (фактор хирургической агрессии при цементном эндопротезировании). Наиболее выраженный защитный эффект оказывали антигипоксант мафусол и антиоксиданты эрисод, унитиол и глутатион. В то же время такой классический антиоксидант прямого действия как а-токоферол, полностью блокируя индуцированное ПОЛ в культурах клеток даже при самых высоких концентрациях токсикантов, был эффективен по другим показателям токсичности только в пределах слаботоксичных доз препаратов. Исследование различных комбинаций цитопротекторных препаратов показало, что сочетанное введение мафусола с перечисленными антиоксидантными препаратами обладало более выраженным протективным действием. Полученные нами in vitro данные послужили отправной точкой для исследования сочетанного введения мафусола и эрисод экспериментальным животным в условиях токсичности, вызванной ММА, и последующих клинических испытаний указанной комбинации препаратов при операциях цементного эндопротезирования. На основании положительных результатов исследований получен патент РФ на изобретение [Патент РФ № 2159089 от 20/11/2000].

Поскольку первым защитным барьером при попадании в организм ксенобиотиков является сыворотка крови, мы исследовали in vitro защитный эффект в условиях острой токсичности цельной сыворотки крови и отдельных сывороточных белков - нормального иммуноглобулина и альбумина. Как цельная сыворотка, так и иммуноглобулин и, в меньшей степени, альбумин, оказывали выраженное защитное действие на клетки в условиях острой токсичности. Это делает возможным увеличение концентрации антисептиков в среде инкубации в присутствии сыворотки примерно на порядок без неблагоприятного воздействия на клетки в культуре. Кроме того, защитный эффект сыворотки показывает, что исследования токсичности in vitro должны проводиться в условиях, как можно более полно имитирующих внутреннюю среду организма.

В дополнение к исследованиям взаимодействия клеток в культуре с химическими агентами нам представлялось целесообразным исследовать воздействие in vitro физических полей. По данным литературы, под влиянием электромагнитных полей происходит повышение концентрации одноименно заряженных ионов вблизи клеточных мембран, которые способны изменять функциональное состояние клеток, в частности, увеличивается их чувствительность к ПОЛ [Ясногородский, 1987; Sakai et al., 1991].

Нами изучено действие на ДКЭЧ в культуре циклотронного, переменного и постоянного электромагнитных полей геомагнитного уровня, а также светового излучения в красном, зеленом и синем диапазонах спектра. Наблюдения показали, что как циклотронное, так и в меньшей степени постоянное электромагнитные поля вызывают повышение пролиферативного потенциала клеток в культуре и градуальное снижение чувствительности к индуцированному ПОЛ при росте длительности облучения от 1-2 до 4-6 ч. Исследования показали, что стимулирующий эффект циклотронного электромагнитного резонанса на пролиферацию и жизнеспособность клеток в культуре может быть опосредован через мембранозависимые механизмы, включая ПОЛ. При этом незначительная активация ПОЛ в начальный период воздействия низкоинтенсивными электромагнитными полями может трактоваться как благоприятный адаптивный ответ, универсальная реакция клеток на внешние воздействия. Это предположение подтверждается полученными позднее результатами работ других авторов [Зырянова, 1994; Katsir, Parola, 1998]. Данные по влиянию на клетки в культуре видимого света различных диапазонов спектра позволили констатировать как наименее благоприятный эффект светового излучения красного диапазона, которое можно охарактеризовать как «раздражающее»: усиление пролиферации с одновременной дестабилизацией клеточных мембран. В то же время излучение синей части спектра было, напротив, «стабилизирующим», поскольку вызывало снижение скорости пролиферации без снижения метаболической активности и стабилизацию клеточных мембран. Зеленый свет вызывал как усиление пролиферации, так и окислительного метаболизма клеток в культуре без дестабилизации мембранных структур.

Полученные результаты показали, что разработанная нами модель проявляет высокую чувствительность при воздействии не только химических, но и физических факторов и может быть использована для оценки их эффектов и механизма действия на клеточном уровне.

Культуры клеток были использованы нами также для оценки возможных токсических свойств тканевых жидкостей (бронхо-альвеолярного лаважа, сыворотки крови, жидкости из пузырей от ожогов и обморожений) при различных формах клинической и экспериментальной патологии. Прежде всего, исследована экспериментальная модель фиброза легких у крыс при внутритрахеальном введении антибиотика блеомицина с последующим забором в разные сроки бронхо-альвеолярной лаважной жидкости. Показано, что в самой лаважной жидкости существенно повышено общее содержание белка и активность ЛДГ во все сроки исследования, что свидетельствует о развитии выраженных деструктивных процессов. Инкубация клеток в культуре с лаважной жидкостью от экспериментальных животных приводила к повышению уровня ПОЛ на всех сроках исследования (1-30 сут после введения блеомицина), повышению внутриклеточной активности ЛДГ и фазному ответу активности ДТ-диафоразы плазматической мембраны. Можно предположить, что лаважная жидкость содержит одновременно как токсические компоненты (АФК, продукты перекисной модификации биомолекул, «среднемолекулярные пептиды»), так и различные цитокины, в результате чего в ответ на ее введение наблюдается токсический ответ клеток в культуре с одновременной стимуляцией их общей метаболической активности и пролиферации.

В результате предварительного исследования действия на клетки в культуре тканевых жидкостей от больных с острым панкреатитом, саркоидозом легких, ожоговыми поражениями и обморожениями, хирургических больных после крупномасштабных операций с различным течением послеоперационного периода показано, что лишь в отдельных случаях тяжелых осложнений сыворотка больных вызывает резкое угнетение жизнеспособности клеточного монослоя. В большинстве остальных случаев наблюдалась стимуляция таких показателей как общая активность митохондриальных дегидрогеназ, ПОЛ, активность внутриклеточной ЛДГ, ДТ-диафоразы плазматической мембраны, что, вероятно, отражает стадию стресса, сопровождающуюся мобилизацией функций на клеточном уровне. В отдельных случаях (ожоговая болезнь) прослежен фазный ответ: переход от угнетения клеточного метаболизма на ранних стадиях (1-3 сут после поражения) к стимуляции на стадии реконвалесценции. Это дает основание предполагать, что непосредственно после термического поражения жидкость из ожоговых пузырей содержит токсические продукты деструкции тканей, вызывающие угнетение клеточного метаболизма и жизнеспособности, что находит подтверждение в литературе [Туликова, 1989; Thomson et al., 1990]. В более поздние сроки на первый план выступает эффект цитокинов и факторов роста, интенсивно синтезирующихся в зоне поражения, которые вызывают стимуляцию клеточного метаболизма и пролиферации.

Полученные данные в части испытания клинических образцов тканевых жидкостей от больных носят предварительный характер, но, тем не менее, позволяют констатировать применимость клеточной модели in vitro для выявления токсического действия тканевых жидкостей, что может иметь определенное прогностическое значение.

Еще одной областью применения разработанной нами модели оценки токсичности in vitro биохимическими методами стало исследование цитопатогенного действия вирусов гриппа и эффекта растительного противовирусного препарата — экстракта хвои пихты. Вирусы гриппа вызывали дозозависимую цитопатическую реакцию чувствительных к ним культур клеток (U-937 и MDCK): повреждение мембран (выход ЛДГ) и угнетение клеточного дыхания (последний показатель оценивался в НТТ). При этом сам испытанный противовирусный препарат обладал цитотоксическим эффектом в диапазоне концентраций, частично перекрывающимся с его противовирусными дозами. В то же время препарат в концентрации 100 мкг/мл, еще не токсичной на культуре MDCK, снижал цитопатическую реакцию клеток на действие испытанных титров вируса гриппа. Цитопатогенное действие вирусов на культуры клеток и эффект противовирусных препаратов, как правило, оценивают по морфологическим критериям и наличию продукции вирусных частиц. В частности, хвойно-хлорофилло-каротиновый препарат в концентрациях 50-200 мкг/мл ранее оценивался по морфологическим критериям как нетоксичный. Отсюда можно сделать заключение о большей чувствительности ферментативных тестов на культурах клеток в исследовании цитопатогенного действия вирусов, которые могут быть рекомендованы для оценки противовирусных препаратов.

Исследование антимикробного действия антисептиков в бессывороточной среде и в присутствии 50 % сыворотки крови и сопоставление их эффективных концентраций с дозами, токсичными в отношении культур клеток человека в аналогичных условиях, выявили разнонаправленные эффекты сыворотки крови на антимикробную активность препаратов различной химической структуры: бактериостатическая активность катапола, катамина АВ и ДДС в присутствии сыворотки существенно снижалась, а полисепта - незначительно увеличивалась. Сравнение антимикробных и токсикологических показателей двух препаратов выявило, что для катапола минимальная подавляющая рост бактериальных тест-культур концентрация (МПК) - 160 мкг/мл в несколько раз превышает минимальную токсическую дозу (МТД) в отношении фибробластов человека в культуре - 10 мкг/мл, в то время как для полисепта соотношение аналогичных показателей оказалось значительно более благоприятным: МПК 0,63-1,25 мкг/мл; МТД - 50 мкг/мл. Полученные данные иллюстрируют перспективность предложенного нами комплексного подхода к изучению антимикробного действия in vitro, которое следует сочетать с исследованием токсичности препаратов на клеточных культурах в аналогичных условиях, принимая во внимание возможность разнонаправленного эффекта внутренней среды организма на антимикробную активность.

С целью продолжения и углубления исследования различных аспектов антимикробного действия антисептиков в сравнении с их токсичностью in vitro, а также механизмов взаимодействия препаратов с внутренней средой организма, была предпринята работа по оценке антиадгезивной активности препаратов, препятствующей прикреплению патогенных микроорганизмов к клеткам-мишеням и колонизации ими тканей хозяина. Катионный полимерный антисептик полисепт снижал в наших исследованиях показатели колонизации Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в культурах ДКЭЧ в суббактериостатических концентрациях. В среде, содержащей сыворотку крови, антиадгезивная активность этого препарата существенно усиливалась, как и его бактериостатическое действие.

Изучение влияния на адгезию нативной сыворотки крови, а также отдельных сывороточных белков продемонстрировало, что наибольшей активностью, ингибирующей процесс прикрепления S. aureus к клеткам в культуре, обладают нормальный и антистафилококковый иммуноглобулины. Отсутствие разницы в действии этих двух препаратов, а также полное подавление антиадгезивной активности иммуноглобулинов белком А стафилококков свидетельствуют о неиммунном (сорбционном) характере взаимодействия лигандов бактерий с иммуноглобулинами, которое не зависит от их антигенной специфичности и, вероятно, осуществляется по константному Fc-фрагменту последних, что находится в соответствии с данными литературы [Овод, Вершигора, 1982; Wideback, 1987]. Таким образом, подтверждено имеющееся в литературе представление, что компоненты тканевых жидкостей, в частности, сыворотки крови, вовлекаются в сложный процесс взаимодействия патогена с хозяином, принимая участие в ранних этапах этих отношений. В целом эти исследования продемонстрировали еще одну область применимости альтернативных моделей in vitro с использованием культур клеток. * *

В заключение нам хотелось бы отметить несколько практических следствий, вытекающих из проделанной работы, и рекомендаций, которые, по нашему мнению, могут быть предложены на основе полученных результатов.

Впервые разработанный нами способ оценки острой токсичности in vitro, состоящий в последовательном тестировании на одном образце клеточной культуры до 4-х биохимических показателей для выявления токсического действия, позволяет существенно сократить количество используемого клеточного материала, время, необходимое для токсикологической оценки препаратов, и одновременно с этим повысить точность определения характера токсичности, выявляемой по нескольким параметрам одновременно. Приоритет указанного способа подтвержден патентом РФ на изобретение [Патент РФ № 2079130 от 10.05.1997].

Предложенный в результате наших исследований способ предупреждения интраоперационных осложнений при эндопротезировании крупных суставов с использованием костного цемента на основе метилметакрилата, состоящий в сочетанном внутримышечном введении эрисод и внутривенной инфузии мафусола, также явился основанием для получения патента РФ и нашел применение в клинике [Патент РФ № 2159089 от 20/11/2000].

Выявленный благоприятный пролиферативный и метаболический ответ фибробластов человека в культуре на действие циклотронного электромагнитного поля геомагнитного уровня позволяет рекомендовать его для клинических испытаний с целью ускорения заживления ран и переломов.

Многократно продемонстрированная нами однотипность цитотоксического ответа клеток в культуре вне зависимости от используемого показателя токсичности, а также очень слабая вариабельность в зависимости от тканевого и видового происхождения клеточной культуры позволяют рекомендовать для серийного тестирования токсичности in vitro: 1) использовать ограниченный набор перевиваемых клеточных линий человека или диплоидные эмбриональные фибробласты человека; 2) использовать немногие простые в исполнении и хорошо поддающиеся масштабированию и стандартизации биохимические показатели для выявления токсического воздействия, например, оценку выхода в среду

• инкубации ЛДГ, определение в среде инкубации клеток продуктов индуцированного ПОЛ и нитротетразолиевый тест.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Еропкин, Михаил Юрьевич, Санкт-Петербург

1. Агаджаков М.И., Симонян М.А., Казарян Ш.А. Влияние препарата супероксиддисмутазы на содержание эндогенной супероксиддисмутазы и перекисное окисление липидов при термических ожогах // Вопр.мед.химии. 1989. - Т.35, № 4.- С.28-30.

2. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975.-329 с.

3. Александров В.Я. Реактивность клетки и белки. Л.: Наука, 1985. - 317 с.

4. Алешкин В.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г., Алешкина Т.Н. Белки острой фазы и их клиническое значение // Клинич.мед. 1988. - Т.66, № 8. - С.39-48.

5. Амвросьев А.П., Верещако Г.Г., Банецкая Н.В. Динамика гистохимической активности окислительно-восстановительных ферментов в миокарде зрелых и старых крыс при общем у-облучении в дозе 1 Гр // Радиобиология. 1989. - Т.29, № 4. - С.469-472.

6. Андреев А.И. Снижение эффективности повреждающего действия ультрафиолетового излучения на перитонеальные нейтрофилы мышей при действии красного света // Горизонты физико-химической биологии. -Пущино, 2000. Т. 1. - С.19.

7. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб.дело. 1988. - № 11.-С.41-43.

8. Андреева Л.И., Иванова Л.И., Титова М.В. и др. Биохимические механизмы апоптоза // Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С.Новикова. С.Пб.: Наука, 1996. - С.51-71.

9. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. - 327 С.

10. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран. М.: Наука, 1983. -54 С.

11. Афанасьев Ю.И., Борохинина Т.В. Витамин Е: значение и роль в организме // Успехи совр.биол. 1987. - Т. 104, № 3. - С.400-411.

12. Афиногенов Г.Е., Анисимов А.И., Еропкин М.Ю. и др. Облучение электромагнитными полями и процессы индуцированного перекисного окисления липидов в культурах фибробластов // Травматол. и ортопедия России. 1996. - № 4. - С.30-34.

13. Афиногенов Т.Е., Еропкина Е.М. Бактериальная адгезия и способы ее предотвращения // Диагностика, профилактика и лечение раневых инфекций в травматологии и ортопедии. С.Пб., 1994. - С.8-14.

14. Афиногенов Т.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. С.Пб.: Гиппократ, 1993. - 263 с.

15. Балабанов Ю.В., Савинсон Б., Трахт И. Получение иммортализованных астроцитов из спинного мозга человека // Докл. АН СССР. 1990. - Т.315. -С.1238-1241.

16. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи совр.биол. 1991. - Т. 111. № 6. - С.923-931.

17. Барабой В.А., Брехман И.И., Глотин В.Г.и др. Перекисное окисление и стресс. С.Пб.: Наука, 1992. 160 с.

18. Бауманис Е.А., Бирска И.А., Закенфельд Г.К. и др. Цитологические и иммунологические аспекты противоопухолевого действия полигексаметиленгуанидина у мышей линии BALB/c // Экспер.онкология. -1989. Т.11, № 3. - С.66-69.

19. Бекманн Р., Флое JL, Вильсманн К. 10 лет опыта терапевтического применения супероксиддисмутазы // Медицина: компакт-информация для

20. Вашей практики. Приложение 1. Аахен: Фирма Грюненталь, 1987. - С.1-30.

21. Бекярова Г.И., Маркова М.П., Каган Б.Г. Защита альфа-токоферолом эритроцитов от гемолиза, индуцированного термической травмой // Бюлл.экспер.биол.мед. 1989. - № 4. - С.413-415.

22. Березин И.В., Можаев В.В. Взаимосвязь структуры и стабильности протеинов // Успехи совр.биол. 1985. - Т.26. - С. 108-12.4.

23. Березовская И.Б., Митрохин Н.М. Экспресс-методы определения острой токсичности // Бюлл. Всес.научного центра по безопасности биологически активных веществ. М., 1990. - С.45-67.

24. Богдан А.С. Альтернативные методы токсикологических исследований с использованием в качестве тест-объекта Tetrahymena pyriformis И Тезисы докл. 1 Съезда токсикологов России. — М., 1998. С.270.

25. Болдырев А.А., Булыгина Е.Р. Является ли Ыа+,К+-АТФаза мишенью окислительного стресса? // Бюлл.экспер.биол.мед. 1996. - № 3. - С.275-278.

26. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. JL: Наука, 1987. - 231 с.

27. Бурова JI.A., Риц М. Иммуноглобулиновая Fc-рецепция стрептококков и связь ее с вирулентностью микробов // Вестник АМН СССР. 1986. - № 7. -С.57-63.

28. Вальдман Б.М., Волчегорский И.А., Пужевский А.С. и др. Среднемолекулярные пептиды крови как эндогенные регуляторы перекисного окисления липидов в норме и при термических ожогах // Вопр.мед.химии. 1991.-Т.37, № 1.-С.23-26.

29. Василенко Ю.К. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы // Эксперим.клинич.фармакол. 1993. - Т.56, № 4. - С.53-55.

30. Веселовский В.П., Богоявленский И.Ф., Сергеев В.П. Применение димексида в медицине. JL: Лен.гос.ин-т усоверш. врачей им.Кирова, 1988. -54 с.

31. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Патол.физиол.эксперим.терапия. — 1989. № 4. - С.7-18.

32. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.Н. и др. Свободные радикалы в живых системах // Биофизика. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, 1991. - Т.29. - С. 1-252.

33. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 259 с.

34. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. - С.182-193.

35. Волчегорский И.А., Львовская Е.И., Глузмин М.И. и др. Изменения антиокислительной активности сыворотки крови при воспалительной патологии // Вопр.мед.химии. 1997. - Т.43, № 4. - С.233-238.

36. Воскресенский О.Н. Перекиси липидов в живом организме // Вопр.мед.химии. 1970. - Т. 16, № 6. - С.563-583.

37. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты — облигатные факторы питания // Вопр.мед.химии. 1992. - Т.38, № 4. - С.21-26.

38. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопр.мед.химии. 1987. - № 1. -С.118-122.

39. Галустян Г.Э., Михайлов И.Б. Влияние строфантина и дигоксина на активность сукцинат-, лактатдегидрогеназ и мембранной Ыа+,К+-АТФазы в сердце крыс с экспериментальным миокардитом // Бюлл.экспер.биол.мед. -1989. Т. 107, № 4. - С.442-444.

40. Гапотченко П.А., Лейбензон А.С. Об опыте применения тканевых культур для токсикологической оценки текстильных материалов // Гигиена и санитария. 1979. - № 6. - С.75-77.

41. Гембицкий П.А., Бокша Л.Ф., Болденков Г.Ф. и др. Синтез метацида // Химич.промышл. 1984. - № 2. - С.82-83.

42. Герасимов A.M., Фурцева Л.Н. Биохимическая диагностика в травматологии и ортопедии. М.: Медицина, 1986. - 234 с.

43. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Окислительное повреждение эритроцитов миелопероксидазой. Защитное действие сывороточных белков // Бюлл.экспер.биол.и мед. 1989. - № 4. - С.428-430.

44. Голиков С.Н., Саноцкий И.В. Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. Л.: Медицина, 1986. - 280 с.

45. Голубев Д.Б. Ферментативные сдвиги при вирусной репродукции. Л.: Медицина, 1968. - 206 с.

46. Голубев Д.Б. Ферменты в системах инфицированных вирусами клеток. — Л.: Наука, 1979.- 194 с.

47. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.И. Руководство к применению клеточных культур в вирусологии. -Л., 1976. 223 с.

48. Гонский Я.И., Корда М.М., Клищ И.Н. и др. Коррекция диметилсульфоксидом и а-токоферолом нарушений окислительных процессов при остром и хроническом поражении печени // Вопр.мед.химии. 1996. Т.42, № 1. - С.30-33.

49. Гончаренко Е.Н., Деев Л.И., Ахалая М.Я. и др. Исследование влияния карнозина и мидийного гидролизата на некоторые изменения обмена липидов и аминов у крыс, подвергнутых кратковременному переохлаждению // Вестник МГУ. 1995. - Сер.16, № 2. - С.37-41.

50. Горошинская И.А., Могильницкая М.В., Ненашкалова Л.А. Состояние мембранных ферментов клетки при гипоксии и защитный эффект пиразидола // Биохимия. 1993. - Т.58, № 1. - С.62-69.

51. Грабовская К.Б., Тотолян А.А. Взаимодействие стрептококков группы А с культурой клеток Нер-2 // Ж.микроб.эпидем.иммунобиол. 1977. - № 2. -С.32-36.

52. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. JL: Медицина, 1973. -141 с.

53. Гуляев А.Е., Кивман Т.Я. Клеточная фармакокинетика: состояние, перспективы, прикладное значение // Лекарственные средства. Экономика, технология и перспективы получения. М., 1990. - Вып. 6. - 37 с.

54. Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины бактерий // Итоги науки и техн. Сер. Микробиология. 1985. - Т. 16. - 110 с.

55. Давыдкин И.Л., Селезнев Е.И. Влияние унитиола на реологические свойства и антиоксидантные системы эритроцитов у больных, перенесших инфаркт миокарда // Тез.докл. Научно-практ.конф. памяти проф. С.В.Шестакова. Самара, 1994. - С.29-32.

56. Данилов Л.Н., Лебедева Е.С., Маховенко Л.В. и др. Патогенетические особенности формирования экспериментального фиброза легких // Актуальные проблемы пульмонологии. Л., 1991. -С.141-143.

57. Дремина Е.С., Шаров B.C., Владимиров Ю.А. Определение антиоксидантной активности биологических и лекарственных препаратов: методологические аспекты // Пульмонология. 1995. - № 1. С.73-75.

58. Дроговоз С.М. Супероксиддисмутаза перспективный гепатопротектор // Экспер. и клин.фармакол. - 1993. Т.56, № 4. - С.51-52.

59. Дупин A.M. Мышечные дипептиды природные ингибиторы перекисного окисления липидов // Биохимия. - 1987. - Т.52, № 5. - С.782-787.

60. Дупин A.M., Клюшник Т.П., Даниловская Е.В. и др. Ингибирование перекисного окисления липидов синаптосом мозга крыс пептидной и белковой фракцией, изолированной из фетального мозга человека // Бюлл.экспер.биол. и мед. 1996. - № 8. - С.233-235.

61. Ельский В.Н., Бородин А.Д. Нейрогуморальные механизмы формирования тканевой гипоксии и их коррекция мафусолом и гипербарическим кислородом // Бюлл.гипербарич.биол. и мед. 1993. - № 14. - С.14-18.

62. Еропкин М.Ю. Модели, альтернативные использованию лабораторных животных в токсикологии. Достижения и проблемы // Токсикол.вестник. -1999.-№5.-С.7-13.

63. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Интенсивность перекисного окисления липидов в культуре фибробластов человека как возможный индикатор острой цитотоксичности in vitro II Вестник СПбГУ. 1994. - Сер. 3, вып. 1. -С.50-58.

64. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Ферментативные методы оценки цитотоксичности на модели клеток человека в культуре: динамика лактатдегидрогеназы и глутатионредуктазы под действием различных концентраций ДДС-Na //Токсикол. вестник. 1997. - № 5. - С.26-31.

65. Еропкин М.Ю., Афиногенов Т.Е., Еропкина Е.М. Некоторые биохимические показатели цитотоксического ответа фибробластов человека в культуре под действием природных и синтетических поликатионов // Вопр.мед.химии. 1995. - Т. 41, № 2. - С.36-40.

66. Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Еропкина Е.М. Метаболическая активация минимальными токсическими дозами ксенобиотиков как общаязакономерность острого цитотоксического ответа фибробластов человека в культуре // Токсикол. вестник. 1999. - № 1. - С. 16-21.

67. Еропкин М.Ю., Смирнова Т.Д., Еропкина Е.М. и др. Исследование участия ионов кальция в токсическом действии ксенобиотиков на клетки человека в культуре // Цитология. 2000. - Т.42, № 2. - С. 154-159.

68. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е. Антиадгезивная активность белковых комплексов биологических жидкостей и секретов // Ж.микр.эпидем.иммунобиол. 1994. - № 2. - С.110-114.

69. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю. Влияние отдельных сывороточных белков и нативной сыворотки крови на адгезию Staphylococcus aureus к клеткам in vitro II Ж.микр.эпидем.иммунобиол. -1995. № 5. - С.19-23.

70. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю. Сравнительное исследование антимикробного и цитотоксического действия антисептиков in vitro с применением модели культуры эмбриональных фибробластов человека // Токсикол. вестник. 1997а. - № 2. - С. 12-17.

71. Еропкина Е.М., Афиногенов Г.Е., Еропкин М.Ю. Способ выявления токсичности химических агентов на культурах фибробластов кожи и легких эмбриона человека // Патент РФ № 2079130 от 10.05.1997.

72. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., Слонская Т.К. Количественная оценка биологической активности токсичных агентов (одноклеточные модели) // Бюлл.экспер.биол. и мед. 1997. - Т. 123, № 5. - С.594.

73. Ефимов К.М., Гембицкий П.А., Снежко А.Г. Полигуанидины класс малотоксичных дезсредств пролонгированного действия // Дезинфекц. дело - 2000. - № 4.

74. Ещенко Н.Д. Определение содержания молочной кислоты и активности лактатдегидрогеназы в тканях // Методы биохимических исследований / под ред. М.И.Прохоровой. Л.: изд-во ЛГУ, 1982. - С.222-226.

75. Завьялов Н.В., Червонская Г.П., Панкратова Г.П. и др. Ускоренное изучение цитотоксического действия в экспресс-тестах in vitro II Тезисы докл. 1 съезда токсикологов России. М., 1998.-С.279.

76. Загородний Н.В. Эндопротезирование тазобедренного сустава у ревматологических больных // Актуальные вопросы травматологии, ортопедии и медицины катастроф. Материалы конф. Волгоград, 1994. -С.7-11.

77. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи совр.биологии. 1993. -Т.113, № 3. - С.286-296.

78. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б., Шегин С.М. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика. Новосибирск, 1993. - 181 с.

79. Зырянова Т.Н., Лаврова В.М., Канапацкая А.Т. и др. Влияние низкоэнергетического лазерного излучения на интенсивность перекисного окисления липидов // Вопр.мед.химии. 1994. - Т.40, № 2. - С.31-32.

80. Игнатова Г.Л., Волчегорский И.А., Волкова Э.Г. и др. Интенсивность перекисного окисления липидов как показатель выраженности воспалительного процесса при обострении хронического бронхита // Бюлл.экспер.биол. и мед. 1997. - Т. 124, № 8. - С.202-203.

81. Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном воздействии (справочник). М.: Медицина, 1977.-С.196.

82. Исакова Е.Ф., Филенко О.Ф., Юклеевских М.Ю. Изменение резистентности ракообразных Daphnia magna при длительном воздействии потенциально токсичных веществ // Тезисы докл. 1 съезда токсикологов России. М., 1998. - С.284.

83. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов // Итоги науки и техники. Серия Биофизика. М., 1986.-Т.18. 136 с.

84. Карпищенко А.И. (ред.). Лабораторная диагностика эндогенной интоксикации // Медицинские лабораторные технологии. С.Пб.: Интермедика. - 1999. - Т.2. - С.618-648.

85. Карпов Р.С., Кошельская О.А. Милдронат средство коррекции нарушений кислородного баланса при стенокардии напряжения // Клинич. фармакол. и терапия. - 1994. - № 3. - С.42.

86. Кару Т.И. Фотобиология низкоинтенсивной лазерной терапии // Итоги науки и техники. Физические основы лазерных и пучковых технологий. -1989. Т.4. - С.44-84.

87. Квитко О.В., Перепецкая Г.А. Исследование влияния магнитного поля на митотический индекс и частоту аберраций хромосом в культивируемых клетках методом «шести классов» // Цитология. 1991. — Т.ЗЗ, № 6. — С.104-108.

88. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи совр.биол. 1993. -Т.113, № 4. - С.456-470.

89. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.А. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб.дело. 1988. - № 5. - С.59-62.

90. Кобяков В.А. Цитохромы семейства Р-450 и их роль в активации проканцерогенов // Итоги науки и техники. Серия Биол.химия. М., 1990. -Т.35.- 190 с.

91. Коваленко Е.А., Мордвин С.В. Влияние магнитного поля на регенерацию костной ткани в эксперименте // Бюлл. СО АМН СССР. 1987. - № 2. - С.65-66.

92. Кокряков В.Н. Биохимические основы антимикробной активности нейтрофильных гранулоцитов / Под ред. В.Е.Пигаревского. JL: ИЭМ, 1988. -С.12-51.

93. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. -СПб.: Наука, 1999.- 162 С.

94. Комов В.П., Фирсова Б.И. Фармацевтическая биохимия. СПб.: Хим.-фарм. ин-т, 1992. - 76 с.

95. Кондратов С.А. Гигиеническая оценка нового полимерного флоккулянта полигексаметиленгуанидина // Гигиена и санитария. 1992. - № 3. - С.11-13.

96. Корнилов Н.В., Войтович А.В., Машков В.М., и др. Хирургическое лечение дегенеративно-дистрофических поражений тазобедренного сустава. СПб.: ЛИТО Синтез, 1997. - 292 с.

97. Корнилов Н.В., Еропкина Е.М., Еропкин М.Ю. и др. Влияние костного цемента на метаболизм фибробластов человека в культуре // Травматол. и ортопедия России. 1999. - № 1. - С.29-36.

98. Кошельская О.А., Дудко В.А., Кузьменко Д.И. и др. Влияние милдроната на физическую работоспособность и обмен липидов у больных ишемической болезнью сердца // Кровообращение. 1990. - № 4. - С.43-44.

99. Котелевцев С.В., Стволинский С.Л., Бейм A.M. Эколого-токсикологический анализ на основе биологических мембран. М.: Изд-во МГУ, 1986.- 104 с.л I

100. Котеров А.Н. Ингибирование металлотионеином Fe -индуцированного перекисного окисления липидов в липопротеинах яичного желтка // Биохимия. 1997. - Т.62, № 2. - С. 164-166.

101. Красовский Г.Н. Установление смертельных эффектов токсических веществ при разных путях поступления // Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду. М.: Центр меж.-нар.проектов ГКНТ, 1986. - С.65-103.

102. Кривцова Е.И., Павлова Н.Т., Пономаренко Ю.Р. и др. К механизму действия милдроната на плоды кролика, развивающиеся в условиях плацентарной недостаточности // Бюлл.экспер.биол.мед. 1998. - Т. 126, № 8.-С.182-185.

103. Кудрин А.В., Жаворонков А.А. Роль микроэлементов и кальция в регуляции апоптоза // Успехи совр.биол. 1998. - Т. 118. - № 5. - С.623-629.

104. Лакин К.М. Биотрансформация веществ. М., 1981. - 342 С.

105. Лебедева Е.С., Данилов Л.Н., Еропкина Е.М. и др. Состояние антимикробной защиты легких у крыс с токсическим легочным фиброзом // Пульмонология. 1994. - № 2. - С.21-26.

106. Литвинова О.М., Фураева В.А., Юхнова Л.Г. и др. Оценка противовирусной активности некоторых лекарственных растений на модели

107. РНК и ДНК-содержащих вирусов // Тезисы 2 юбилейной меж.-нар.конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». СПб., 1998. - С.105.

108. Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. Биохимические анализы в клинике (справочник). М., 1998. - 302 с.

109. Лукьянов А.С., Лукьянова Л.Л., Чернавская Н.М. и др. Биоэтика. Альтернативы экспериментам на животных. М.: Изд-во МГУ, 1996. - 253 с.

110. Лукьянов А.С., Семина Т.К., Королев A.M. Конформационные перестройки в белковых системах как показатель токсичности химических соединений // Тезисы докл. 1 съезда токсикологов России. М., 1998. - С. 293.

111. Лукьянова Л. Д. Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. -М., 1989.-С. 11-15.

112. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции // Бюлл. экспер.биол.мед. 1997. - Т. 124, № 9. - С.244-254.

113. Лукьянчук В.Д., Савченкова Л.В. Антигипоксанты: состояние и перспективы // Экспер.клинич.фармакол. 1998. - Т.61, № 4. - С.72-79.

114. Лунец Е.Ф., Кучуро С.В., Костюк В.А. Влияние перекисного окисления липидов на активность Mg -АТФазы мозга и печени // Вопр.мед.химии. -1986. № 4. - С.32-35.

115. Лызлова С.Н. Лизосомальные белки нейтрофилов факторы антимикробной защиты клеток // Вопр.мед.химии. - 1987. - Т.ЗЗ, № 5. — С.43-48.

116. Львова С.П., Горбунова Т.Ф., Абаева Е.М. Влияние гипотермии и даларгина на перекисное окисление липидов в тканях крыс // Вопр.мед.химии. 1993. - Т.39, № 3. - С.21-24.

117. Львовская Е.И., Гаврилюк Т.А., Мохова С.В. Влияние in vitro препарата БИТО, церулоплазмина, трансферрина, эссенциале на интенсивность процессов липидной пероксидации при термической травме // Вопр.мед.химии. 1996. - Т.42, № 2. - С. 125-126.

118. Любимов Ю.А., Саватеев А.В., Комяк К.Н. Автоматизированный цитотоксический тест для изучения материалов медицинского назначения // Тезисы докл. 1 съезда токсикологов России. М., 1998. - С.294.

119. Ляпков Б.Г., Ткачук Е.Н. Тканевая гипоксия: клинико-биохимические аспекты // Вопр.мед.химии. 1995. - Т.41, № 2. - С.2-8.

120. Магура И. С., Рожманова О.М. Окислительный стресс и нейродегенеративные заболевания // Биополимеры и клетка. 1997. - Т. 13, № 6. - С.513-515.

121. Максименко А.В. Модифицированные препараты супероксиддисмутазы и каталазы для защиты сердечно-сосудистой системы и легких // Успехи совр.биол. 1993. - Т. 113, № 3. - С.351-364.

122. Максименко А.В., Тищенко Е.Г., Голубых В.Л. Антитромботическое действие производных каталазы и хондроитинсульфата при артериальном поражении у крыс // Вопр.мед.химии. 1998. - Т.44, № 4. - С.362-365.

123. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации // Эфферентная терапия. 1995. - Т. 1, № 2. - С.61-64.

124. Мамаева Е.Г., Машков В.М., Еропкина Е.М. и др. Способ предупреждения интраоперационных осложнений при эндопротезировании крупных суставов с использованием костного цемента на основе метилметакрилата // Патент РФ на изобретение № 2159089 от 20.11.2000.

125. Матвеев С.Б., Марченко В.В., Голиков П.П. Влияние а-токоферола на перекисное окисление липидов в печени при острой кровопотере // Вопр.мед.химии. 1992. - Т.38, № 3. - С. 18-20.

126. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Издание XIII Харьков: Торсинг, 1997.-Т.1.-543 е.; Т.2.-590 с.

127. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи совр.биол. 1993. - Т.113, № 4. - С.442-455.

128. Миллер Ю.И. Связывание ксенобиотиков альбумином сыворотки крови // Клинич.лаб.диагностика. 1993. № 1. - С.34-40.

129. Мирзоян С. А., Мкртчян С. Л., Манукян А. А. Церебральные вазоконстрикторные эффекты малонового диальдегида // Экспер.клинич.фармакол. 1993. - Т.56, № 4. - С.18-19.

130. Митрохин Н.М., Жигачева И.В., Чаморовская Л.Т. Активация перекисного окисления липидов в митохондриях печени и острая токсичность химических соединений // Гигиена и санитария. 1991. - № 1. -С.49-51.

131. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков // Соросовский Образоват. Ж. — 1996. -№ 7. С.10-18.

132. Нейфах А.А., Александрова А.Ю. Пониженное накопление флуоресцентных красителей в клетках, обладающих множественной лекарственной устойчивостью // Докл. АН СССР. 1986. - Т.291, № 4. -С.989-991.

133. Новиков B.C. (Ред.) Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука, 1996.-276 с.

134. Новиков B.C., Булавин Д.В., Цыган В.Н. Молекулярные механизмы инициации клеточной гибели // Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С.Новикова. СПб.: Наука, 1996. - С.30-50.

135. Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков B.C. Механизмы клеточной смерти: проблемы и перспективы // Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С.Новикова. СПб.: Наука, 1996. - С.9-29.

136. Ноздрачев А.Д., Янцев А.В. Автономная передача. СПб.: изд-во СПбГУ, 1995. - С.123-135.

137. Овод В.В., Вершигора А.Е. Адгезивность бактерий // Успехи совр. биол. 1982. - Т.94, № 2. - С.213-224.

138. Оковитый С.В., Смирнов А.В. Антигипоксанты // Экспер. клинич. фармакол. 2001. - Т.64, № 3. - С.76-80.

139. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и их роль в организме // Успехи биол. химии. 1990. - Т.31. — С.180-199.

140. Панарин Е.Ф., Афиногенов Г.Е. Полимерные производные поверхностно-активных веществ, их биологические и лечебные свойства // Полимеры медицинского назначения. М., 1988. - С.35-65.

141. Панасюк Е.Н., Бабич В.И., Лыч О.С. и др. Действие ослабленного магнитного поля Земли на систему свертывания крови // Косм.биол. и авиакосм.мед. 1991. - Т.25, № 3. - С.59-60.

142. Панченко Л.Ф., Герасимов A.M., Антоненков В.Д. Роль пероксисом в патологии клетки. М.: Медицина, 1981. - 207 с.

143. Парамонов Б.А. Современные возможности и перспективы развития методов восстановления кожного покрова у тяжелообожженных // Автореферат докт.дисс. СПб., 1997. - 37 с.

144. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. - 527 с.

145. Пентюк А.А. Изучение новых функциональных свойств альбумина // Вопр.мед.химии. 1995. - Т.41, № з. - С.11-13.

146. Пескин А.В. Роль кислородных радикалов, образующихся при функционировании мембранных редокс-цепей, в повреждении ядерной ДНК // Биохимия. 1996. - Т.61, № 1. - С.65-72.

147. Пигаревский В.Е. О секреторной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов // Арх. патол. 1982. - № 5. - С.74-80.

148. Плетнев С.Д. Лазеры в клинической медицине. М.: Медицина. - 1996. - 432 с.

149. Подунова Л.Г. (Ред.) Альтернативные методы исследования (экспресс-методы) для токсикологической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. Методическое пособие. М., 1999. - 108 с.

150. Потников В.А., Волков А.В., Добровольская Н.В. Полимеры медицинского назначения. М., 1988. - С.23-34.

151. Прайор У. (Ред.) Свободные радикалы в биологии. М.: Мир, 1979. -318 с.

152. Путилина Ф.Е. Определение активности глутатионредуктазы // Методы биохимических исследований / Под ред. М.И.Прохоровой. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. - С.181-183.

153. Раевский К.С. Возбуждающие аминокислоты, патология ЦНС и пути ее фармакологической коррекции // Итоги науки и техники. Серия Физиология чел. и жив. 1989. - Т.36. - С.148-176.

154. Ранчалис В.П., Бальчюнене Л.С. «Парадоксальное» действие тиоловых соединений // Вестник РАМН. 1995. - № 1. - С.44-49.

155. Рожнов Г.И., Пройнова В.А., Лиманцева А.В и др. Разработка альтернативных методов оценки токсичности химических веществ на основе биотестирования // Токсикол. вестник. 1995. - № 6. - С.27-29.

156. Романчук Л.А., Фактор Э.А., Журавков В.И. Определение биохимических показателей перекисного окисления и состояния антиоксидантной системы в организме спортсмена. СПб.: Гос.Акад.физич.культуры им.Лесгафта, 1997. - 31 с.

157. Ротенберг Ю.С. Прогнозирование безвредных уровней и содержания химических веществ в воздухе рабочей зоны. М., 1986. - С.44-62.

158. Руденко М.И., Андрюшкин В.Н., Артемов В.Г. Использование мафусола при острой кровопотере // Военно-мед.журн. 1994. - № 10. - С.33-34.

159. Сазыкин Ю.О. Антибиотики как ингибиторы биохимических процессов. -М: Наука, 1968.-425 с.

160. Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения. М.: Минздрав СССР, 1987. - 97 с.

161. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. - 121 с.

162. Селиванов Е.А. Инфузионный раствор антигипоксического действия мафусол // 1-ый Российский нац. Конгресс «Человек и лекарство». Тез.докл. -М., 1992.-С.418.

163. Семиголовский Н.Ю. Применение антигипоксантов в остром периоде инфаркта миокарда // Анестезиол. и реаниматол. 1998. - № 2. - С.56-59.

164. Сидоров К.К., Халепо А.И. Определение смертельных доз и концентраций при различных путях поступления ядов // Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970. - С.97-101.

165. Скворцова Е.К., Нехорошева А.Г., Гембицкий П.А. Бактерицидные свойства производных гуанидина // Проблемы дезинфекции и стерилизации. М., 1975. - вып. 24. - С.58-62.

166. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский образоват. ж. 1996. - № 3. - С.4-16.

167. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Соросовский образоват. ж. 2001. - № 6. - С.4-10.

168. Смирнов А.В., Криворучко Б.Н. Антигипоксанты в неотложной медицине // Анестезиол. и реаниматол. 1998. - № 2. - С.50-55.

169. Соловский М.В., Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. и др. Полимерные комплексы анионных поверхностно-активных веществ // Хим.фарм. ж. -1980. -№ 11.- С.51-56.

170. Соловский М.В., Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. и др. Полимерные комплексы антисептика катамина АВ и их биологическая активность // Хим.фарм. ж. 1991. - № 4. - С.40-43.

171. Соловьева Г.Р. Магнитотерапевтическая аппаратура. М.: Медицина, 1991.- 176 с.

172. Соловьян В.Т. Приспособление клеток к неблагоприятным факторам. Характеристика адаптивных ответов (Обзор). // Биополимеры и клетка. -1990. Т.6, № 4. - С.32-42.

173. Соминина А.А. (Ред.) Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами. Л.: Всес.НИИ гриппа МЗ СССР, 1975. -43 с.

174. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н., Иваницкий Ю.Ю. и др. Возможные пути влияния химических агентов и ионизирующих излучений на процессы апоптоза // Программированная клеточная гибель /Под ред. В.С.Новикова. -СПб.: Наука, 1996. С.209-216.

175. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н.Ореховича. М.: Медицина, 1977. - С.66-68.

176. Степанова Н.Ю., Петров A.M., Шагидуллин А.Г. и др. Разработка комплексного подхода для оценки воздействия выпусков сточных вод на окружающую среду // Тезисы докл. 1 съезда токсикологов России. М., 1998.-С.319.

177. Сторожок Н.М., Друлле А.Я., Логин Я.Я. и др. Антиоксидантная активность природных и синтетических хинонов // Вопр.мед.химии. — 1995. -Т.41,№ 1. С.16-21.

178. Тезисы докл. 1-го Съезда токсикологов России / Под ред.Б.А.Курляндского. М., 17-20 ноябр.1998. - 339 с.

179. Титов В.Н., Амелюшикина В. А., Коткина Т.И. и др. Лактатдегидрогеназа в диагностике инфаркта миокарда: диагностические и методические аспекты // Лаб.дело. 1988. - № 11. — С.31-40.

180. Тиунов Л.А. Биохимические механизмы адаптации и компенсации нарушенных функций при действии на организм химических веществ // Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций / Под ред. Д.С.Саркисова. М., 1987. - С.366-380.

181. Тиунов Л.А. Некоторые вопросы молекулярной токсикологии // Вестник АМН СССР. 1991. - № 1. - С.8-12.

182. Толстухина Т.И. Определение Ма,К-активируемой, Mg-зависимой АТФ-азной активности в субклеточных фракциях // Методы биохимич. исследований / Под ред. М.И.Прохоровой. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. - С.258-260.

183. Троценко В.В., Тощев В.Д., Кашко А.К., Алтухов В.К. Применение костного цемента при эндопротезировании тазобедренного сустава по К.М.Сивашу // Ортопед.травматол. 1980. - № 1. - С.14-17.

184. Туманов А.А., Баринова О.В., Крестьянинов П.А. Микроорганизмы, простейшие, гидробионты как тест-объекты при альтернативном методе оценки токсического воздействия загрязняющих веществ // Тезисы докл. 1 Съезда токсикологов России. М., 1998. - С.323.

185. Туликова З.С. Антиоксидантные и токсические свойства средних молекул при ожоговой болезни // Автореф.дисс.канд.биол.наук. Д., 1989. -18 с.

186. Филенко О.Ф., Дмитриева А.Г., Артюхова В.И. и др. Количественная взаимосвязь биологических параметров водорослей при токсическом воздействии // Тезисы докл. 1 Съезда токсикологов России. М., 1998. -С.325.

187. Франклин Т., Сноу Дж. Биохимия антимикробного действия. М.: Мир, 1984.-238 с.

188. Хансон К.П. Программированная клеточная гибель (апоптоз): молекулярные механизмы и роль в биологии и медицине // Вопр.мед.химии. 1997. - Т.43. - С.402.

189. Холмогоров В.Е. Действие оптического излучения на кровь. Фотомодификация свойств крови // Тез. докл. 2 Съезда биофизиков России. — М., 1999. Т.2. - С.730.

190. Холодов Ю.А., Шишло М.А. Электромагнитные поля в нейрофизиологии. М.: Наука, 1979. 168 с.

191. Хрипач Л.В., Ревазова Ю.А., Ходжаян А.Б. Люминесцентный бактериальный тест (ЛБТ) как экспресс-метод определения токсичности // Тезисы докл. 1 Съезда токсикологов России. М., 1998. С.326.

192. Червонская Г.П. Культура клеток альтернативная биологическая модель в токсикологических исследованиях // Тезисы докл. 1 Съезда токсикологов России. - М., 1998. - С.328.

193. Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И. Спектральный люминесцентный анализ в медицине. Минск: Наука и техника, 1988. - 234 с.

194. Шапошников Ю.Г. О некоторых проблемах эндопротезирования // Эндопротезирование в травматологии и ортопедии. М., 1993. - С.3-11.

195. Шпирт М.Б. Количественная токсикологическая оценка ядов в культуре клеток человека // Гигиена и санитария. -1977.-№4.-С.5 0-53.

196. Юхнова Л.Г., Литвинова О.М., Фураева В.А. и др. Оценка противовирусной активности некоторых препаратов на основе лекарственных растений // Тезисы докл. II Всеросс. научной конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс». Саратов., 19-21 мая 1998.

197. Янковский О.Ю. Механизмы защиты от токсического действия кислорода и способы использования реактивных форм кислорода в живых системах // Ж.общей биол. 1983. - Т.44, № 1. - С.62-70.

198. Янковский О.Ю. Перспективы создания пролонгированных форм супероксиддисмутазы, ориентированных на очаг воспаления // Биотехнология. 1996. - № 5. - С.748-751.

199. Янковский О.Ю. Кооперативные взаимодействия миелопероксидазы лейкоцитов и опсонинов плазмы крови в системах антимикробной и антиоксидантной защиты // Дисс.докт.биол.наук. СПб., 1997. - 265 с.

200. Янковский О.Ю., Слепенков С.В. Редокс-факторы как модуляторы клеточных функций // Вестник СПбГУ. 1995. - Сер.З, № 3. - С.78-84.

201. Ясногородский В.Г. Электротерапия. М.: Медицина, 1987. - 239 с.

202. Adamson G.M., Hartman A.M. Oxidative stress in cultured hepatocytes exposed to acetaminophen // Biochem.Pharmacol. 1993. - V.45, No.ll. -P.2289-2294.

203. Anders M.W. S-conjugate-dependent toxicity; alternatives to animal studies // Altern.Animal Testing & Experiment. (AATEX). 2000. - V.7, No.l. - P.30-36.

204. Andersen K.-J., Christensen E.I., Vik H. Three-dimensional growth of renal epithelial cells in vitro: A tool in toxicity testing // Altern.to Lab.Animals (ATLA). 1993. - V.21, No.2. - P.191-195.

205. Andersson M., Forsby A., Lewan L. Determination of ATP leakage from cultured cells in toxicity testing: a two-step bioluminescent assay // ATLA. -1990. V. 17. - P. 188-190.

206. Andreoli Т., Dal Degan В., de Angelis I. Evaluation of metabolic endpoints of acute toxicity in V79 fibroblasts // Toxicol. In Vitro. 1991. - V.5, No.5-6. -P.549-553.

207. Andres M.I., Repetto G., Sanz P. Et al. Determination of phosphofructokinase and enolase activities in cultured mouse neuroblastoma cells: application to the in vitro detection of neurotoxic effects // ATLA. 1995. - V.23, No.l. - P.63-71.

208. Annett B. The fund for the replacement of animals in medical experiments (FRAME): the first 25 years // ATLA. 1995. - V.23, No.l. - P.19-32.

209. Annunziato L., Taglialatela M., Di Renzo G.et al. Relationship between free radical production and К and Ca ion homeostasis in neurodegeneration // Int.Conf. on In vitro cytotoxicity mechanisms. Rome, 1998. - P.35.

210. Anuszewska E.L., Kozirowska J.H. Protective role of reactive oxygen species scavengers against toxicity of 3-chloropyridine and 2-chloropyridine N-oxide // Toxicol. In Vitro. 1996.- V.10,No.4. P.503-506.

211. Arbuthnott J.P., Smyth C.J. Bacterial adhesion in host/pathogen interactions in animals // Adhesion of Microorganisms to Surface / Ed. by D.Ellwood. Lond.: Acad.Press, 1979.-P. 165-198.

212. Armstrong R.N. Glutathione S-transferases: structure and mechanism of an archetypical detoxication enzyme (Review) // Adv. Enzymol. Relat.Areas Mol. Biol.-1994.-V.69. P. 1-44.

213. Ashikaga Т., Motoyama A., Ishikawa H. et al. Low molecular peptide model of protein denaturation by UVA irradiation and the effect of antioxidants // Altern. Animal Testing & Experiment. 2000. - V.7,No. 1. - P.30-36.

214. Avrova N.F., Shestak K.I., Zakharova I.O. et al. Free radicals in the mechanism of glutamate neurotoxicity // Цитология. 1999. - T.41, № 9.-C.791-792.

215. Balls M. Validation of alternative tests in the European Union // Curr.Probl.Dermatol. 1995. - V.23. - P.265-274.

216. Balls M., Clothier R.H. Comments on the scientific validation and regulatory acceptance of in vitro toxicity tests // Toxicol. In Vitro. 1991. V.5, No.5-6. -P.535-538.

217. Balls M., Corcelle G. Statement on the scientific validity of the rat skin transcutaneous electrical resistance (TER) test // ATLA. 1998a. - V.26, No.3. -P.275-277.

218. Balls M., Corcelle G. Statement on the scientific validity of the ERISKIN™ test // ATLA. 1998b. - V.26, No.3. - P.278-280.

219. Balls M., Fentem J.H. The use of basal cytotoxicity and target organ toxicity tests in hazard identification and risk assessment // ATLA. 1992. V.20. - P.368-389.

220. Balls M., Reader S., Atkinson K. et al. Non-animal toxicity tests for detergents: genuine replacements or mere prescreens // J. Chem. Biotechnol. -1991. V.50. -P.423-433.

221. Ban Yoshiki, Nakatsuka Т., Matsumoto H. Effects of calcium channel blockers on cultured rat embryos // J.Appl.Toxicol. 1996. - V.16. - P. 147-151.

222. Barratt M.D. The role of structure-activity relationships and expert systems in alternative strategies for the determination of skin sensitization, skin corrosivity and eye irritation // ATLA. 1995. - V.23. - P. 111-122.

223. Barroso-Dobz J., Fernandez-Puntero В., Iglesias A., et al. Influence of flaxetin on the lifespan and longevity facing induced stress // Phytotherapy Res. -1998.-V.12, Suppl.l. S107-S110.

224. Barile F.A., Arjun S., Hopkinson D. In vitro cytotoxicity testing: biological and statistical significance // Toxicol. In Vitro. 1993. - V.7. - P. 111-116.

225. Basset C.A.L., Chokani H.R., Hernandez E. et al. The effect of pulsing electromagnetic field on cellular calcium and calcification of non-unions // Elecrical Properties of Bone and Cartilage. N.Y., 1979. - P.427-441.

226. Bassi A.M., Bosco O., Brenci S. et al. Evaluation of the cytotoxicity of the first 20 MEIC chemicals in two hepatoma cell lines with different xenobiotic metabolism capacities // ATLA. 1993. - V.21, No.l. - P.65-72.

227. Baturay N.Z., Roque H. In vitro reduction of peroxidation in UVC-irradiated cell cultures by concurrent exposure with Bowman-Birk protease inhibitor // Teratogen.Cancerogen.Matagen. 1991. - V.l 1, No.4. - P. 195-202.

228. Beck W.T., Cirtain M.C., Look A.T. et al. Reversal of vinca alkloids resistance but not multiple drug resistance in human leucemic cells by verapamil // Cancer Res. 1986. - V.46, No.2. - P.770-785.

229. Behl C. Vitamin E and other antioxidants in neuroprotection // Int.J.Vitamin Nutrit.Res. 1999. - V.69, No.3. - P.213-219.

230. Behl C., Skutella Т., Lezoualch F. et al. Neuroprotection against oxidative stress by estrogens: structure-activity relationship // Molec.Pharmacol. 1997. -V.51. - P.535-541.

231. Ben-Dov N., Shefer G., Irinitchev A. et al. Low-energy laser irradiation affects satellite cell proliferation and differentiation in vitro II Biochim. Biophys. Acta. Molec. Cell. Res. 1999. -V. 1448, No.3. -P.372-380.

232. Bereznowski Z. In vivo assessment of methyl methacrylate metabolism and toxicity // Int.J.Biochem.Cell.Biol. 1995. - V.27, No.12. - P.1311-1316.

233. Berger N.A. Poly (ADP-ribose) in the cellular response to DNA damage // Radiat.Res. 1985. - V. 101, No. 1. - P.4-15.

234. Berger M.M. Role antioxydant des micronutiments: pertinence en epidemiologic et en reanimation I I Nutrition clinique et metabolisme. 1997. V.l 1, No.2. - P.125-132.

235. Bergmeyer H.U., Bernt E. Lactat-Dehydrogenase. UV-Test mit Pyruvat und NADH // Methoden der enzymatischen Analyse / Herausgegeben von H.U.Bergmeyer. Berlin:Academie-Verlag, 2 Auflage, 1970a. - Bd.I - S.533-538.

236. Bergmeyer H.U., Gawehn K., Grassl M. Glutathion-reductase // Methoden der enzymatischen Analyse / Herausgegeben von H.U.Bergmeyer. -Berlin:Academie-Verlag, 2 Auflage, 1970b. Bd.I. - S.424-425.

237. Biel S., Wilhelm K.P., Siegers C.-P. Evaluation of phototoxicity using an in vitro human keratinocyte (HaCaT)-neutral red assay // Allergologie. 1993. V.l6, No.4. - P. 169.

238. Blaauboer В .J., Barratt M.D., Houston J.B. The integrated use of alternative methods in toxicological risk evaluation // ATLA. 1999. - V.27, No.2. - P.229-237.

239. Blakeman D.P., Ryan T.P., Jolly R.A. et al. Protein oxidation: examination of potential lipid-independent mechanisms for protein carbomyl formation // J.Biochem.Molec.Toxicol. 1998. - V.12, No.3. - P. 185-190.

240. Blumberg J.B., Halpner A.D. Antioxidant status and function: relationships to aging and exercise // Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health / Ed. by A.M.Papas. London: CRC Press, 1999. - P.249-275.

241. Bolann B.J., Ulvic R.J. Decay of superoxide catalyzed by ferritin // FEBS Lett. 1993. - V.318, No.2. - P.149-152.

242. Bolender R.P. Stereology applied to structure-function relationships in pharmacology // Fed. Proc. 1974. - V.33, No. 10. - P.2187-2194.

243. Boue-Grabot M., Halaviat В., Pinon J.F. Cytotoxicity of non-hydrosoluble substances towards human skin fibroblasts cultured on microporous membrane: a model for the study of ocular irritancy potential // ATLA. 1992. - V.20. - P.445-450.

244. Borenfreund E., Puerner J.A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption // Toxicol.Lett. 1985. - V.24. - P. 119-124.

245. Borenfreund E., Babich H., Martin-Alguacil N. Comparison of two in vitro cytotoxicity assays the neutral red (NR) and tetrazolium (MTT) tests // Toxicol. In Vitro. - 1988.-V.2, No.l. - P. 1-6.

246. Borst P. DNA amplification and multidrug resistance // Nature. 1984. -V.309, No.5969.-P.580.

247. Bos O.J.M. Albumin the "Jack-of-all-trades" in the protein world // Prarm.Weekbl.Sci. 1989. - V.l 1, No.6. - P.242-243.

248. Boveris A., Oshino N., Chance B. The cellular production of hydrogen peroxide // Biochem.J. 1972. - V.128. - P.617-630.

249. Boveris A., Cadenas E., Stoppani A.O. Role of ubiquinone in the mitochondrial generation of hydrogen peroxide // Biochem.J. 1976. - V.l56, No.2. - P.435-444.

250. Brigham K.L., Meyrick В., Berry L.C. et al. Antioxidants protect cultured bovine lung endothelial cells from injury by endotoxin // J. Appl. Physiol. 1987. - V.63, No.2. - P.840-850.

251. Brodie B.B., Reid W.D., Cho A.K., et al. Possible mechanism of liver necrosis caused by aromatic compounds // Proc.Nat.Acad.Sci. USA. 1971. -V.68, No.l. -P.160-164.

252. Brogaard В., Clausen J. An in vitro system for evaluation of oxidative stress and the effects of antioxidants // ATLA. 1997. - V.25, No.3. - P.279-287.

253. Brunton V.G., Grant M.H., Wallace H.M. The role of amine oxidases in polyamine-induced toxicity in a fibroblast cell line // Human Toxicol. 1990. -V.9, No.5. -P.347.

254. Burdon R.H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation // Free Radical.Biol.Med. 1995. - V.l8. - P.775-794.

255. Burleson F.G., Limardi L.C., Sikorski E. et al. Cytokine mRNA expression in an in vitro human skin model Skin2™ // Toxicol. In Vitro. 1996. - V.10. -P.513-521.

256. Bursch W., Oberhammer F., Schulte-Hermann R. Cell death by apoptosis and its protective role against disease // Trends Pharmacol. Sci. 1992. - V.13. -P.245-251.

257. Burton V., Mitchell H.K., Young P. et al. Heat shock protection against cold stress of Drosophila melanogaster // Molec.Cell.Biol. 1988. - V.8, No.8. -P.3550-3552.

258. Buttke T.M., Sandstrom P.A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis // Immunology Today. 1994. - V. 15, No.l. -P.7-10.

259. Byrick R.J. Cement implantation syndrome: a time limited embolic phenomenon // Can.J.Anaesth. 1997. - V.44, No.2. - P. 107-111.

260. Cadenas E. Antioxidant and prooxidant functions of DT-diaphorase in quinone metabolism // Biochem.Pharmacol. 1995. - V.49, No.2. - P.127-140.

261. Calabrese E.J., Baldwin L.A. Can the concept of hormesis be generalized to carcinogenesis? // Regul.Toxicol.Pharmacol. 1998. - V.28, No.3. - P.230-241.

262. Calleja M.C., Persoone G., Geladi P. The predictive potential of a battery of ecotoxicological tests for human acute toxicity as evaluated with the first 50 MEIC chemicals // ATLA. 1993. - V.21. - P.330-349.

263. Camins A., Diez-Fernandez C., Prieto P. Cell-surface expression of heat shock proteins in dog neutrophils after oxidative stress // Toxicol. In Vitro. -1999. V.13, No.3. - P.437-443.

264. Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F. et al. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing // Cancer Res. 1987. - V.47. - P.936-942.

265. Carson J.J., Prato F.S., Drost D.J. et al. Time-varying magnetic fieldsл iincrease cytosolic free Ca in HL-60 cells // Amer. J. Physiol. 1990. - V.259, No.4, Pt.l. -P.C687-C692.

266. Celis J.E., Kruhoffer M., Gromova I. et al. Gene expression in profiling: monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics // FEBS Lett. 2000. - V.480. - P. 2-16.

267. Cenni E., Granchi D., Pizzoferrato A. Platelet activation after in vitro contact with seven acrylic bone cements // J. Biomater. Sci. Polymer Edition. 2002. -V.13. -No.l. -P.17-25.

268. Cerutti P.A., Trump B.F. Inflammation and oxidative stress in carcinogenesis // Cancer Cells. 1991. - V.3, No.l. - P. 1-7.

269. Cervinka M., Puza V. Apoptosis and necrosis: dynamics of structural changes in cells cultivated in vitro after treatment with xenobiotics // Toxicol. In Vitro. -1995. V.9. - P.387-396.

270. Chatterjee P.K., Cuzzocrea S., Thiemermann C. Inhibitors of poly (ADP-ribose) synthetase protect rat proximal tubular cells against oxidant stress // Kidney Int. 1999. - V.56, No. 3. - P. 973-984.

271. Clemedson C., McFarlane-Abdulla E., Andersson M. et al. MEIC evaluation of acute systemic toxicity. Parts I and II. // ATLA. 1996. V.24, Suppl.l. - P.251-311.

272. Clemedson C., Ekwall B. Overview of the final MEIC results: I. The in vitro-in vitro evaluation // Toxicol. In Vitro. 1999. - V.13, No.4-5. - P.657-663.

273. Chatham W.W., Blackburn W.D., Heck L.W. Additive enhancement of neutrophil collagenase activity by HOC1 and cathepsin G // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1992.- V. 184, No.2. -P.560-567.

274. Chen M.S., Wu J.N., Yang S.N. et al. Free radicals are involved in methylmethacrylate-induced neurotoxicity in human primary neocortical cell cultures // Clin.J.Physiol. 1998. - V.41, No.4. - P.203-209.

275. Cheng J.T., Yang C.F., Jou T.C. Inhibitory effect of L-ascorbic acid on the growth of astrocytes in cell culture // Neuropharmacology. 1988. - V.27, No.l 1.1. P.l 179-1182.

276. Chiba K., Makino J., Ohuchi J. et al. Interlaboratory validation of the in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients. (9). Evaluation of cytotoxicity test on HeLa cells // Toxicol. In Vitro. 1999. - V. 13, No.l. - P. 189-198.

277. Chow C.K. Vitamin E and oxidative stress // Free Radical. Biol.Med. 1991.- V.ll,No.2. -P.215-232.

278. Christman M.F., Morgan R.W., Jacobson F.S. et al. Positive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some heat-shock proteins in Salmonella typhimurium II Cell. 1985. V.41. - P.753-762.

279. Ciapetti G., Stea S., Granchi D. et al. The effects of orthopaedic cements on osteoblastic cells cultured in vitro II Chir.Organ.Mov. 1995. - V.80, No.4. -P.409-415.

280. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell life // EMBO J. 1998. - V.17, No.24. - P.7151-7160.

281. Cinelli S., Falezza A., Meli C. et al. Alternative methods in toxicology tests: in vitro toxicity//Cytotechnology. 1991. - V.5, No.l. - P.51-54.

282. Ciombor D., Aaron R.K. Synergistic effects of growth factors and pulsed fields on proteoglycan synthesis in articular cartilage // J.Cell.Biol. 1991. — V.l 15,No.3, Pt.2. - P.448.

283. Cochrane C.G., Schraufstatter I.U., Hyslop P. et al. Cellular and biochemical events in oxidant injury // Oxygen Radicals and Tissue Injury / Ed. by B.Halliwell.- bond.: Upjohn, 1988. P.49-56.

284. Comforti M. Biology of disease lipid peroxidation and cellular damage in toxic injury // Lab.Invest. - 1985. - V.53. - P.599.

285. Coney A.H. Induction of microsomal enzymes by foreign chemicals and carcinogenesis by polycyclic aromatic hydrocarbons // Cancer Res. 1982. -V.42. - P.4875-4917.

286. Corsini E., Limorili E., Marinovich M. et al. Selective induction of interleukin-12 in reconstructed human epidermis by chemical allergens // ATLA. -1999.-V.27.-P.261-269.

287. Coulomb В., Lebreton C., Mathieu N. et al. UVA-induced oxidative damage in fibroblasts cultured in a 3-dimentional collagen matrix // Experiment.Dermatol.- 1996. V.5. -P.161-167.

288. Counor J., Sawezuk J.S., Benson M.C. et al. Calcium channel antagonists delay regression of androgen-dependent tissues and supress gene activity associated with cell death // Prostate. 1988. - V.13. - P.l 19-128.

289. Courtellement P., Herbert P., Redziniak G. Evaluation of EYTEX™ system as a screening method for ocular tolerance: application to raw materials and finished products // ATLA. 1992. - V.20. - P.466-470.

290. Cross A.R. Inhibitors of the leukocyte superoxide generating oxidase: mechanisms of action and methods for their evaluation // Free Radical. Biol. Med.- 1990. -V.8, No.l. P.71-93.

291. Crawford D., Zbinden J., Amstad P. et al. Oxidant stress induces the proto-oncogens c-fos and c-myc in mouse epidermal cells // ONCOGENE. 1988. -V.3, No.l. -P.27.

292. Dahl O.E. Cardiorespiratory and vascular disfunction related to major reconstructive orthopedic surgery // Acta Orthoped. Scand. 1997. - V.68, No.6. -P.607-614.

293. Da Lozzo E.J., Oliveira M.B.M., Carnieri G.S. Citrinin-induced mitochondrial permeability transition // J.Biochem.Molec.Toxicol. 1998. - V.12, No.5. -P.291-297.

294. Daniel J.C. Effects of chlorhexidine on human fibroblasts in vitro И J. Rehabil.Res. and Dev. 1989. - V.26, Suppl. - P.295.

295. David J.C., Grognet J.F. Les proteines de stress // INRA Productions animates. 2001. - V.l4. - P.29-40.

296. Davies К J. A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects // J.Biol.Chem. 1987. - V.262, No.20. - P.9895-9901.

297. Davies K.J.A., Delsignore M.E., Lin S.W. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of aminoacids // J.Biol.Chem. 1987a. -V.262, No.20. - P.9902-9907.

298. Davies K.J.A., Lin S.W., Pacifi R.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein // J.Biol.Chem. 1987b. -V.262, No.20. - P.9914-9920.

299. De Martino G.N., Slaughter C.A. The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms // J.Biol.Chem. 1999. V.274, No.32. P.22123-22126.

300. Dice J.F. Molecular determinants of protein half-lives in eucaryotic cells // FASEB J. 1987. - V. 1. - P.349-357.

301. Dickson F.M., Lawrence J.N., Benford D.J. Surfactant-induced cytotoxicity in cultures of human keratinocytes and a commercially available cell line // Toxicol. In Vitro. 1993. - V.7, No.4. -P.381-384.

302. Diener В., Traiser M., Arand M. Xenobiotic metabolizing enzyme activities in isolated and cryopreserved human liver parenchymal cells // Toxicol. In Vitro. -1994. V.8, No.6. - P.l 161-1166.

303. Dierickx P.J., Ekwall B. Long-term cytotoxicity testing of the MEIC chemicals 21-50 by the determination of the protein content in human embryonic lung cells // Altern.Animal Testing and Experiment.- 1993. V.2, No.l. - P.33-36.

304. Donato Т., Gomez-Lechon J., Castell J.V. A microassay for measuring cytochrome P450IA1 and P450IIB1 activities in intact human and rat hepatocytes cultured in 96-well plates // Analyt.Biochem. 1993. - V.213, No.l. - P.29-33.

305. Donato M.T., Castell J.V., Gomez-Lechon J. The coumarin 7-hydroxilation microassay in living hepatic cells in culture // ATLA. 1998. - V.26, No.2. -P.213-223.

306. Dowd D., MacDonald P., Komm B. et al. Stable expression of the calbindin-D 28k complementary DNA interferes with the apoptotic pathway in lymphocytes // Molec.Endocrinol. 1992. - V.6. -P.1843-1848.

307. Dragunow M., Beilharz E., Sirimanne E. et al. Immediate-early gene protein expression in neurons undergoing delayed death, but not necrosis following hypoxic-ischemic injury to the young rat brain // Molec.Brain Res. 1994. - V.25, No.1-2. - P.19-33.

308. Drozdz R., Naskalski J.W., Szuajd J. Oxidation of amino acids and peptidesof reaction with MPO, chloride and hydrogen peroxide // Biochim.Biophys.Acta. 1988.- V.957.-P.47-52.

309. Durnam D.M., Hoffman J.S., Qnaife C.J. et al. Induction of mouse metallothionein-1 mRNA by bacterial endotoxin is independent of metal and glucocorticoid hormones // Proc.Nat.Acad.Sci. USA. 1984. - V.81, No.4. -P.1053-1056.

310. Dypbukt J.M. et al. Different prooxidant levels stimulate growth, trigger apoptosis or produce necrosis in insulin-secreting RINm5F cells. The role of intracellular polyamins // J.Biol.Chem. 1994. - V.269, No.48. - P.30553-30560.

311. Ekwall В. Toxicity to HeLa cells of 205 drugs as determined by the metabolic inhibition test supplemented by microscopy // Toxicology. 1980. -V.17. - P.273-295.

312. Ekwall B. Screening of toxic compounds in mammalian cell cultures // Annals N.Y.Acad.Sci. 1983. - V.407. "Cellular Systems for Toxicity Testing" / Ed. By G.M.Williams et al. - N.Y., 1983. - P.64-77.

313. Ekwall B. The basal cytotoxicity concept // Alternative Methods in Toxicology. V.ll. / Ed. By A.M.Goldberg, F.M. van Zutphen. N.Y.: Mary Ann Liebert, 1995.-P.721-725.

314. Ekwall В., Clemedson C., Ekwall C. et al. EDIT: a new international multicentre programme to develop and evaluate batteries of in vitro tests for acute and chronic systemic toxicity // ATLA. 1999. - V.ll. - P.339-349.

315. Ellis R.E., Yuan J., Horvitz H.R. Mechanism and functions of cell death // Ann.Rev.Cell.Biol. 1991. - V.7. -P.663-698.

316. Elmaraghy A.W., Humeniuk В., Anderson G.I. et al. The role of methylmethacrylate monomer in the formation and haemodynamic outcome of pulmonary fat emboli // J. Bone Joint Surgery Br. 1998. - V.80, No.l. - P. 156161.

317. Eropkina E., Afinogenov G., Eropkin M. Human cell cultures as a prospective model for the assessment of antimicrobial activity and toxicity of newly designed drugs // Hygiene + Medizin. 1996. - V.21, No.3. - P. 162-171.

318. Esterbauer H., Wag G., Puhl H. Lipid peroxidation and its role in atherogenesis // Brit.Med.Bull. 1993. - V.49. - P.566-576.

319. Faberguette A., Zhi Hua S., Lasne F. et al. Evaluation de la cytotoxicite des antiseptiques utilises en pratique courante sur des cultures de fibroblastes et de k&atinocytes // Pathol.Biol. 1994. - V.42, No.9. - P.888-892.

320. Fahey R.C., Sundquist A.R. Evolution of glutathione metabolism // Advances in Enzymology / Ed. by A.Meister.-N.Y.: Wiley & Sons, 1991. V.64. - P. 1-55.

321. Fentem J.H., Briggs D., Chesne C. et al. A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation: results and evaluation of the management team // Toxicol. In Vitro. -2001. V.15, No.l. -P.57-93.

322. Fernandez-Salguero P., Hoffman S.M.G., Cholerton S. et al. A genetic polymorphism in coumarin 7-hydroxylation: sequence of the human CYP2A genes and identification of variant CYP2A alleles // Am. J. Human Genetics. -1995. V.57. -P.651-660.

323. Ferraris M., Marafante E., Dosanjh M. In vitro studies on the metabolism and toxicity of aflatoxin Bi in primary cultures of black catfish (Ictalurus melas) hepatocytes // ATLA. 1998. - V.26, No.2. - P.225-239.

324. Ferro M., Bassi A.M., Ledda S. et al. A mild oxidative stress modulates the expression of aldehyde metabolizing enzymes in liver and skin derived cell lines // Int.Conf. on In vitro cytotoxicity mechanisms. Rome, 1998. - P.32.

325. Fesus L. Biochemical events in naturally occuring forms of cell death // FEBS Lett. 1993. - V.328, No.1-2. - P.l-5.

326. Finiels F. Induction of neuronal apoptosis by excitotoxins associated with long-lasting increase of 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate responsive element binding activity // J. Neurochem. 1995. - V.65, No.3. - P. 1027-1034.

327. Fitzsimmons R.J., Strong D.D., Mohan S. et al. Low-amplitude, low-frequency electric field-stimulated bone cell proliferation may in part be mediated by increased IGF-II release // J.Cell.Physiol. 1992. - V.150, No.l. - P.84-89.

328. Flint O.P. In vitro toxicity testing: purpose, validation and strategy // ATLA.- 1990. V.18. -P.l 1-18.

329. Flint O.P. Toxicity at the cellular level // ATLA. 1996. - V.24, Special issue. - P. 103.

330. Floh L. Superoxide dismutase for therapeutic use: clinical experience, dead ends and hopes//Molec.Cell.Biochem. 1988. - V.84. - P. 123-131.

331. Forsmark P., Aberg F., Norling B. et al. Inhibition of lipid peroxidation by ubiquinol in submitochondrial particles in the absence of vitamin E // FEBS Lett.- 1991. V.285,No.l. -P.39-43.

332. Frederiksen C.M., Clausen J. The effects of oxidative stress in in vitro cultured astroglial cells // ATLA. 1999. - V.27. - P.351-357.

333. Freshney R.I. Culture of animal cells. A manual of basic technique. 2nd ed. -N.Y.: Alan Liss Inc., 1987. 397 p.

334. Frey A.H. Electromagnetic field interactions with biological systems // FASEB J. 1993.-V.7,No.2.-P.272-281.

335. Fridovich I. Superoxide radical: an endogenous toxicant // Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1983. - V.23. - P.239-257.

336. Garcia-Alfonso C., Sanz P., Repetto G. et al. Direct determination of glutathione reductase in cells cultured in microtitre plates as a biomarker for oxidative stress // ATLA. 1995. - V.23, No.4. - P.531-538.

337. Garle M.J., Fentem J.H., Fry J.R. In vitro cytotoxicity tests for the prediction of acute toxicity in vivo II Toxicol. In Vitro. 1994. - V.8, No.6. - P. 1303-1312.

338. Garza-Ocanas L., Torres-Alanis O., Pineyro-Lopez A. Evaluation of the cytotoxicity of 18 compounds in six rat cell lines // ATLA. 1990. - V.17. -P.246-249.

339. Genno M., Yamamoto R., Kojima H. et al. Evaluation of a new alternative to primary Draize skin irritation testing using the EPIDERM™ skin model // Altern. Animal Testing & Experiment. 1998. - V.5, No.4. - P. 195-200.

340. Gibbons R.J. Bacterial adherence to mucosal surfaces and its inhibition by secretory antibodies // Adv.Exp.Med.Biol. 1974. - V.45. - P.315-325.

341. Gilman A.G., Rail T.W., Nies A.F. et al. (ed.) The pharmacological basis of therapeutics. 8th edition. -N.Y.: Pergamon Press, 1991. P.345-382.

342. Gniadecki R., Hansen M., Wulf H.C. Two pathways for induction of apoptosis by ultraviolet radiation in cultured human keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 1997. - V.l09. - P. 163-169.

343. Goering P.L., Thomas D., Rojko J.L. et al. Mercuric chloride-induced apoptosis is dependent on protein synthesis // Toxicol.Lett. 1999. - V.l05, No.3. - P.183-195.

344. Goldberg A.L., Goff S.A. The selective degradation of abnormal proteins in bacteria // Maximizing Gene Expression / Ed. by W.Reznikoff, L.Gold. -Stoneham, MA.: Butterworth, 1986. P.287-314.

345. Gonzalez F.J. Human cytochromes P450: problems and prospects // Trends Pharmacol. Sci. 1992. - V.l3. - P.346-352.

346. Gough J.E., Downes S. Osteoblast cell death on methacrylate polymers involves apoptosis // J. Biomed. Mater. Res. 2001. - V.57. -No.4. - P.497-505.

347. Grant M.H., Granger N., MacDonald C. Comparative menadion toxicity in primary cultures and SV-40 immortalised rat hepatocytes // Brit. J. Clin. Pharmacol. 1994. - V.38, No.2. P.12-15.

348. Grant R.L., Acosta D. Prolonged adverse effects of benzalkonium chloride and sodium dodecyl sulfate in a primary culture system of rabbit corneal epithelial cells // Fundam.Appl.Toxicol. 1996. - V.33. - P.71-82.

349. Grant R.L., Acosta Jr.D., Smith M.A. Experimental models and general mechanisms of toxicity // Comprehensive Toxicology on CD-ROM. Elsevier Sci., 1997.-V.l.

350. Green D.R., Scott D.W. Activation-induced apoptosis in lymphocytes // Curr.Opin.Immunol. 1994. - V.6, No.3. - P.476-487.

351. Greenberg J.T., Monach P., Chou J.H. et al. Positive control of a global antioxidant defense regulon activated by superoxide-generating agents in Escherichia coli II Proc.Nat.Acad.Sci. USA. 1990. - V.87. - P.6181-6185.

352. Grilli M., Pizzi M., Spano P. Neuroprotection by aspirin and sodium salicylate through blocade of NF-кВ activation // Science. 1996. - V.274. -P.1383-1385.

353. Guengerich F.P. Reactions and significance of cytochrome P-450 enzymes. Minireview//J.Biol.Chem. 1991. - V.266, No. 16. - P. 10019-10022.

354. Ф 378. Guengerich F.P., Shimada Т. Oxidation of toxic and carcinogenic chemicalsby human cytochrome P450 enzymes // Chem.Res. in Toxicol. 1991. - V.4. -P.391-407.

355. Guguen-Guillouzo C., Guillouzo A. Methods for preparation of adult and fetal hepatocytes // Isolated and Cultured Hepatocytes / Ed. by A. Guillouzo, C. Guguen-Guillouzo. Paris: Editions INSERM, 1986. - P. 1-12.

356. Guguen-Guillouzo C., Gripon P., Van Denberghe Y. et al. Hepatotoxicity and molecular aspects of hepatocyte function in primary culture // Xenobiotica. -1988. V.18, No.6. - P.773-783.

357. Gulden M. In vitro toxicity screening using cultured rat skeletal muscle cells. I. Surfactants and mitochondrial poisons // Toxicol. In Vitro. 1993. - V.7, No.l. -P.25-34.

358. Gulden M., Finger J. Effects of the first twenty MEIC reference chemicals on viability, glucose consumption and spontaneous contractility of primary cultured rat skeletal muscle cells. ATLA. - V.20, No.2. - P.222-225.

359. Habig W.H., Pabst H.J., Jakoby W.B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J.Biol.Chem. 1974. - V.249, No.22. - P.7130-7139.

360. Hagino S., Kinoshita S., Tani N. et al. Interlaboratory validation of in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients. (2). Chorioallantoic membrane (CAM) test // Toxicol. In Vitro. 1999. - V. 13,No.l. - P.99-113.

361. Hall E.D., Braughler J.M. The role of oxygen radical-induced lipid peroxidation in acute central nervous system trauma // Oxygen Radicals and Tissue Injury / Ed. by B.Halliwell.- Michigan, USA.: Upjohn, 1988. P.92-98.

362. Halliwell B. A radical approach to human disease // Oxygen Radicals and Tissue Injury / Ed. by B.Halliwell. Michigan, USA.: Upjohn, 1988. - P.139-143.

363. Halliwell B. Superoxide, iron, vascular endothelium and reperfusion injury // Free Rad. Res. Commun. 1989. - V.5, No.6. - P.315-318.

364. Halliwell В., Aruoma O.I. DNA damage by oxygen-derived species: its mechanism and measurement in mammalian systems // FEBS Lett. 1991. -V.281, No.l. -P.9-19.

365. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. (ed.). Free radicals in biology and medicine. N.Y.: Oxford University Press, 1987. - 346 p.

366. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals and toxicology // Free Radicals in Biology and Medicine, 2nd ed. Oxford: Clarendon Press, 1989. - P.299-357.

367. Halliwell В., Gutteridge J.M.C., Cross C.E. Free radicals, antioxidants and human disease: where are we now? // J.Lab.Clin.Med. 1992. - V.119, No.6. -P.598-620.

368. Hammond A.H., Fry J.R. Effects of culture duration, cytochrome P-450 inhibition and glutathione depletion on toxicity of diverse xenobiotics // Toxicol. In Vitro. 1996. V.10, No.3. - P.315-321.

369. Harman D.A. A hypothesis on the pathogenesis of Alzheimer disease // Ann.N.Y.Acad.Sci. 1996. - V.786. -P.152-168.

370. Hata Y., Kawate Т., Hiraishi H. et al. Hydrogen peroxide-mediated cytotoxicity to cultured colonic epithelial cells // Life Sci. 1997. - V.60. -P.2221-2230.

371. Hawton K., Ware C., Mistiy H. et al. Why patients choose paracetamol for self-poisoning and their knowledge of its danger // Brit.Med.J. 1995. - V.310. -P.164.

372. Hayashi Т., Itagaki H., Fukuda T. et al. Quantitative structure-activity relationship of surfactants on eye irritation predicted by hemoglobin denaturation // Altern.Animal Testing & Experiment. 1993. - V.2, No.2. - P.49-55.

373. Heikkila J.J., Papp J.E.T., Schultz G.A. et al. Induction of heat shock protein messenger RNA in maize mesocotyls by water stress, abscisic acid and wounding // Plant Physiol. 1984. - V.76, No.l. - P.270-274.

374. Hennekens C.H. Antioxidant vitamins and cardiovascular disease // Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health / Ed. by A.M.Papas. Lond.: CRC Press, 1999. - P.463-477.

375. Herberman R.B., Reynolds C.W., Ortaldo J. Mechanisms of cytotoxicity of natural killers (NK) cells // Ann.Rev.Immunol. 1986. - V.4. - P.651-680.

376. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin pathway for the degradation of intracellular proteins // Progress Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1986. - V.33, No.l.-P. 19-56.

377. Hines R.N., Cashman J.R., Philpot R.M. et al. The mammalian flavin-containing monooxygenases: molecular characterization and regulation of expression // Toxicol.Appl.Pharmacol. 1994. - V.125, No.l. - P. 1-6.

378. Hinson J. A. The role of metabolic activation in drug toxicity // Drug Metab. Rev. 1994. - V.26, No. 1-2. - P.395-412.

379. Holland C.J., Kim K.C., Melik M.I. Histological and hemodynamic studies of the toxic effects of monomeric methylmethacrylate // Clin. Orthoped. Relat.Res. -1973. No.90. - P.262-270.

380. Honda S., Matsuo M. Protective effect of glutathione against oxygen-induced growth inhibition of human diploid fibroblasts // Biochem. Int. 1989. - V.18, No.2. - P.439-446.

381. Hoopen H.J.G., Nobel P.J., Shaap A. et al. Effects of temperature on cadmium toxicity to the green alga Scenedesmus acutus. Development of cadmium tolerance in batch cultures. Antoine van Leewenhuck J. Microbiol. -1985. V.51, No.3. - P.344-346.

382. Horton J.W., White J., Baxter C.R. The role of oxygen derived free radicals in burn-induced contractile depression // J. Burn Care Rehabil. 1988. - V.9, No.6. - P.589-598.

383. Huang H., Huang C.F., Wu D.R. et al. Glutathione as a cellular defence against arsenite toxicity in cultured Chinese hamster ovary cells // Toxicology. -1993. V.79, No.3. - P.195-204.

384. Hugo W.B. Mode of action of non-antibiotic antimicrobial agents // Pharmaceutical Microbiology / Ed. by W.B.Hugo, J.B.Russel. Blackwell, 1977. - P.202.

385. Husay Т., Syversen Т., Jenssen J. Comparisons of four in vitro cytotoxicity tests: the MTT assay, NR assay, uridine incorporation and protein measurements // Toxicol. In Vitro. 1993. -V.7, No.2. - P.149-154.

386. Huveneers-Oorsprong M.B., Hoogenboom L.A., Kuiper H.A. The use of MTT test for determining the cytotoxicity of veterinary drugs in pig hepatocytes // Toxicol. In Vitro. 1997. - V.l 1, No.4. - P.385-394.

387. Hye Gwang Jeong. Inhibition of cytochrome P450 2E1 expression by oleanoic acid: hepatoprotective effects against carbon tetrachloride-induced hepatic injury // Toxicol.Lett. 1999. - V.l05, No.3. - P.215-222.

388. Ikarashi Y., Tsuchiya Т., Nakamura A. Comparison of three in vitro assays to determine the ocular toxicity of detergent, oil and organic solvents // J.Toxicol. Cutaneous and Ocular Toxicol. 1993. - V.l2, No.l. - P. 15-24.

389. Ishiyama M., Tominaga H., Shiga M. et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicity with a highly water-soluble tetrazolium salt, neutral red and crystal violet // Biol, and Pharmacol.Bull. 1996. - V.19. - P.1518-1520.

390. Jacob S.W., Bishel M., Herschler R.J. Dimethyl sulfoxid (DMSO): a new concept in pharmacology // Curr.Ther.Clin.Exp. 1964. - V.6, No.l. - P.134-135.

391. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical.Biol.Med. 1990. - V.9. - P.515-540.

392. Janero D.R., Burghardt B. Cardiac membrane vitamin E and malondialdehyde levels in heart muscle of normotensive and spontaneously hypertensive rats // Lipids. 1989. - V.24, No.l. -P.33-38.

393. Jarkelid L., Kjellstrand P., Martinson E. et al. Toxicity of 20 chemicals from the MEIC programme determined by growth inhibition of L-929 fibroblast-like cells // ATLA. 1997. - V.25, No. 1. - P.55-59.1. Л I

394. Jiang Т., Acosta D.,Jr. Mitochondrial Ca overload in primary cultures of rat renal cortical epithelial cells by cytotoxic concentrations of cyclosporin: a digitized fluorescence imaging study // Toxicology. 1995. - V.95. - P.155-166.

395. Jones O.T.G., Jones S.A., Hancock J.T et al. Composition and organization of the NADPH-oxidase of phagocytes and other cells // Biochem. Soc. Transact. -1993. V.21. -P.343-346.

396. Jurima-Romet M., Huang H.S., Paul CJ. et al. Enalapril cytotoxicity in primary cultures of rat hepatocytes. I. Effects of cytochrome P-450 inducers and inhibitors // Toxicol.Lett. 1991a. - V.58, No.3. - P.256-267.

397. Jurima-Romet M., Huang H.S., Paul С J. et al. Enalapril cytotoxicity in primary cultures of rat hepatocytes. II. Role of glutathione // Toxicol.Lett. -1991b. V.58, No.3. - P.269-277.

398. Kahru A. Toxicity of the first ten MEIC chemicals using marine luminescent bacteria {Photobacterium phosphoreum): the Biotox™ test // ATLA. 1993. -V.21. -P.210-215.

399. Karin M. Metallothioneins: protein in search for function // Cell. 1985. -V.41, No.l. -P.9-10.

400. Katsir G., Parola A.H. Enhanced proliferation caused by a low frequency weak magnetic field in chick embryo fibroblasts is suppressed by radical scavengers // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1998. - V.252, No.3. - P.753-756.

401. Kautman RJ. The cellular response to stress in the endoplasmic reticulum // Symp. on Mechanisms of Toxicity, Baltimore. -Sept.8-10, 1997.

402. Kedderis G.L. Toxicokinetics: biotransformation of toxicants // Comprehensive Toxicology on CD-ROM. Elsevier, 1997. - V.l.

403. Kehrer J.P. Free radicals and reactive oxygene species // Comprehensive Toxicology on CD-ROM. Elsevier, 1997. - V. 1.

404. Kehrer J.P., Lund L.G. Cellular reducing equivalents and oxidative stress // Free Radical.Biol.Med. 1994. - V.l7, No. 1. - P.65-75.

405. Kemp R.B., Meredith R.W.J., Gamble S. et al. Toxicity of detergent-based commercial products on cells of a mouse line in suspension culture as a possible screen for the Draize rabbit eye irritation test // ATLA. 1983. - V.ll, No.l. -P.15-21.

406. Kerszman G. Toxicity of the first ten MEIC chemicals to bacteria // ATLA. — 1993. V.21. - P. 151-155.

407. Kikugawa K., Kojima Т., Yamaki S. et al. Interpretation of the thiobarbituric acid reactivity of rat liver and brain homogenates in the presence of ferric ion and ethylendiamine tetracetic acid // Analyt.Biochem. 1992. - V.202. - P.249-255.

408. Kirkland J.B. Lipid peroxidation, protein thiol oxidation and DNA damage in hydrogen peroxide-induced injury to endothelial cells: role of activation of poly(ADP-ribose)polymerase // Biochim.Biophys.Acta. 1991. - V.1092, No.3. -P.319-325.

409. Klopman G., Ptchelintsev M., Pennici S. et al. Multiple computer automated structure evaluation methodology as an alternative to in vivo eye irritation testing // ATLA. 1993. - V.21, No.1. - P. 14-27.

410. Knight C.R., Rees R.C., Griffin M. Apoptosis: a potential role for cytosolic transglutaminase and its importance in tumor progression // Biochem.Biophys.Acta. 1991. - V.1096, No.2. -P.312-318.

411. Koepke M., Glander H.-J., Ziegler V. Erfassung irritativer von Chemikalien in einem Sperma-modell // Allergologie. 1992. - V.15, No.9. - S.320.

412. Kojima H., Katada Т., Konishi H. Which cytotoxicity tests are useful for prediction of skin irritation by surfactants? // Alten.Animal Testing & Experiment. 2000. - V.6, No.2/3. - P.79-88.

413. Komatsuda A., Wakui H., Oyama Y. et al. Overexpression of the human 72 kDa heat shock protein in renal tubular cells confers resistance against oxidative injury and cisplatin toxicity // Nephrol. Dial. Transplant. 1999. - V.14. - No. 6. -P.1385-1390.

414. Koop D.R. Oxidative and reductive metabolism by cytochrome P450 2E1 // FASEB J. 1992. - V.6. - P.724-730.

415. Kosugi H., Kikugawa K. Potential thiobarbituric acid-reactive substances in peroxidized lipids // Free Radical.Biol.Med. 1989. V.7. - P.205-207.

416. Kramer A., Groschel D., Heeg P. Klinische Antiseptik. Berlin: Springer, 1993.-417 S.

417. Kristen U., Hoppe U., Pape W. The pollen tube growth test: a new alternative to the Draize eye irritation assay // J. of the Soc. of Cosmetic Chemists. 1993. -V.44. - P.153-162.

418. Krueger J.H., Walker G.C. GroEL and dnaK gene of Escherichia coli are induced by UV irradiation and nalidixic acid in an htpR+-dependent fashion // Proc.Nat.Acad.Aci. USA. 1984. - V.81, No.5. -P.1499-1503.

419. Kruidering M., Water van, В., Heer de, E. et al. The use of porcine proximal tubular cells for studying nephrotoxicity in vitro: the role of oxidative stress in cisplatin-induced cell death // ATLA. 1996. - V.24, No.2. - P.161-172.

420. Kunimoto M., Aoki Y., Shibata K. et al. Differential cytotoxic effects of methylmercury and organotin compounds on mature and immature neuronal cells and non-neuronal cells in vitro II Toxicol. In Vitro. 1992. - V.6. - P.349-355.

421. Landvik S.V., Packer L. Alpha-lipoic acid in health and disease // Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health / Ed.by A.M.Papas. Lond.: CPC Press, 1999.-P.591.

422. Langley G. Biopharmaceuticals from animals or plants? // ATLA. - 1998. -V.26, No.5. - P.569-570.

423. Lau S.S., Monks T.J., Greene M.E.I, et al. The role of ortho-bromophenol in the nephrotoxicity of bromobenzene in rats // Toxicol.Appl.Pharmacol. 1984. -V.72. - P.539-549.

424. Lemare F., Demignot S., Adolphe M. Chondrocytes redifferentiated byculture in alginate beads: a suitable cellular model for studying cytokine effects on chondrocyte metabolism? // ATLA. 1996. - V.24, Special Issue. - P.221.

425. Leuschner J., Rimpler M. Evaluierung des prognostischen Wertes von Zellkulturen fur die Erfassung des Stoffwechselmusters von Chemikalien // GIT. -1993. V.37, No.2. - S.132-133.

426. Lezoualch F., Behl C. Transcription factor NF-кВ: friend or foe of neurons // Molec.Psychiatry. 1998. - V.3, No.l. - P. 15-20.

427. Li G.C. Heat shock proteins: role in thermotolerance, drug resistance and relationship to DNA topoisomerases // Nat.Cancer Inst.Monogr. 1987. - No.4. -P.99-103.

428. Li Y., Chopp M., Jiang N. et al. In situ detection of DNA fragmentation after focal cerebral ischemia in mice // Mol.Brain Res. 1995. - V.28, No.l. - P.164-168.

429. Li G.C., Laszlo A. Thermotolerance in mammalian cells: a possible role for heat shock proteins // Changes in Eucaryotic Gene Expression in Response to Environmental Stress / Ed. by B.G.Atkinson, D.B.Walden. Orlando: Acad.Press. - 1985. - P.227-252.

430. Liboff A.R. Geomagnetic cyclotron resonance in living cells // J.Biol.Physics. 1985. - V. 13,No.4. - P.99-102.

431. Liboff A.R., Smith S.D., Mcleod B.R. 45Ca2+ cyclotron resonance in human lymphocytes // J.Biotechnology. 1987b. - No.8. - P.12-22.

432. Lilius H., Isomaa В., Holmstrom T. A comparison of the toxicity of 50 reference chemicals to freshly isolated rainbow trout hepatocytes and Daphnia magna И Aquatic Toxicol. 1994. - V.30, No.l. - P.47-50.

433. Lind C., Hochstein P., Ernster L. DT-diaphorase as a quinone reductase: a cellular control device against semiquinone and superoxide radical formation // Arch.Biochem.Biophys. 1982. - V.216, No.l. - P. 178-185.

434. Lindahl G., Kronvall G. Nonimmune binding of immunoglobulins to Clostridium perfringens. Preferential binding of IgM and aggregated IgG // Immunol. 1988. - V.140, No.4. P.1223-1227.

435. Linsemon D.A., Raczniau T.J., Bacon J.A. et al. In vitro mechanistic toxicology evaluation of the antibiotic, paldimycin sodium, in Chang liver cells // ATLA. 1992. - V.20, No.4. - P.519-528.

436. Little C., O'Braien P.J. The effectiveness of lipid peroxide in oxidizing protein and non-protein thiols // Biochem.J. 1968. - V.106, No.2. - P.415-423.

437. Lockshin R.A., Zakeri Z. Programmed cell death and apoptosis // Apoptosis: the Molecular Basis of Cell Death. Curr.Commun. in Cell.Molec.Biol. / Ed.by L.D.Tomei, F.O.Cope. -N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., 1991. P.47.

438. Longnecker M.P. Intake of foods and supplements rich in p-carotene and vitamin A in relation to risk of breast cancer // Am. J.Epidemiol. 1997. - V.l 1. -S28.

439. Looise B.A.S., Holwerda D.A., Foekema E.M. Induction of glutathione S-transferase in the freshwater bivalve Sphaerium corneum as a biomarker for short-term toxicity tests // Compar.Biochem.Physiol. 1996. - V.l 13. - P.103-107.

440. Loschen G., Floh L., Chance B. Respiratory chain linked H202 production in pigeon heart mitochondria // FEBS Lett. 1971. - V. 18. - P.261-264.

441. Lovstad K.A. Iron ion induced haemolysis: effect of ceruloplasmin, albumin and ascorbat (vitamin C) // Int.J.Biochem. 1988. - V.8. - P. 1067-11071.

442. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J.Biol.Chem. 1951. - V.193, No.2. - P.265-275.

443. Luepke N.P. Hen's egg chorioiallantoic membrane test for irritation potential // Food and Chemical Toxicol. 1985. - V.23. - P.287-291.

444. Maier P. Development of in vitro toxicity tests with cultures of freshly isolated rat hepatocytes // Experientia. 1988. - V.44, No.10. - P.807-817.

445. Maier K.L., Mateikova E., Hinze H. et al. Different selectivities of oxidants during oxidation of methionine residues in the a-1-proteinase inhibitor // FEBS Lett. 1989. - V.250, No.3. - P.221-226.

446. Maiorino M. Prooxidant role of vitamin E in copper induced lipid peroxidation // FEBS Lett. 1993. - V.330,No.2. - P.174-177.

447. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of cell death // Amer.J.Pathol. 1995. - V.146, No.l. - P.3-15.

448. Makinde V., Wali F.A. Toxicity of atracurium measured by lactate dehydrogenase assay in rat isolated hepatocytes // Biochem.Soc.Trans. 1988. -V.16,No.4. — P.614.

449. Malich G., Markovic В., Winder C. The sensitivity and specificity of the MTS tetrazolium assay for detecting the in vitro cytotoxicity of 20 chemicals using human cell lines // Toxicology. 1997. - V.l24. - P. 179-192.

450. Malviya A.N., Mandel P., Mersel M. The nature of DT-diaphorase activity in plasma membrane of astrocytes in primary cultures // Biochim.Biophys.Acta. -1986. V.849, No.2. - P.288-292.

451. Ф 480. Maniatis Т., Goodbourn S., Fischer J.A. Regulation of inducible and tissuespecific gene expression // Science. 1987. - V.236, No.4806. - P. 1237-1245.

452. Marx U., Embleton J., Fischer R. et al. Monoclonal antibody production. The report and recommendations of ECVAM Workshop 23 // ATLA. 1997. - V.25, No.2. - P.121-137.

453. Mascellino M.T., Catania S. Erythromycin, miocanamycin and clindomycin towards adhesivity and phagocytosis of Gram-positive bacteria // Microbiologica. 1988. - V.l 1.-P.231-241.

454. Matrosovich M.N. Towards the development of antimicrobial drugs acting by inhibition of pathogen attachment to host cells: a need for polyvalency // FEBS1.tt. 1989. - V.252, No. 1-2. - P. 1-4.

455. Matsumura F. Toxicology of insecticides. 2nd ed. / Ed.by F.Matsumura. -N.Y.: Plenum Press, 1985. P. 121-138.

456. McConkey D.J., Orrenius S. Cellular signaling in thymocyte apoptosis // Apoptosis. The Molecular Basis of Cell Death / Ed.by L.D.Tomei, F.O.Cope. -N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., 1991. P.227-262.

457. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) // J.Biol.Chem. 1969. - V.244. - P.6049-6055.

458. McDonnell G., Russell A.D. Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance // Clinical Microbiol. Rev. 1999. - V. 12. - No. 1. - P. 147-179.

459. McLeod B.R., Smith S.D., Cooksey K.E. et al. Ion cyclotron resonance frequencies enhance Ca mobility in diatoms // J.Bioelectricity. 1987. - No. 6. -P.1-12.

460. McKenzie R.C., Sauder D.N. The role of keratinocyte cytokines in inflammation and immunity // J.Investigative Dermatol. 1990. - V.95. - SI 05-S107.

461. Mertens K., Rogiers V., Vercruysse A. Measurement of malondialdehyde in cultures of adult rat hepatocytes // Toxicol. In Vitro. 1993. - V.7, No.4. - P.439-441.

462. Mertz P.M., Patt J.M., Marcin J J. et al. Model for studying bacterial adherence to skin wounds // J.Clin.Microb. 1987. - V.l5, No.9. - P. 1601-1604.

463. Miglietta A., Gadoni E., Bocca C. et al. Prooxidant agents induce modifications in the cytoskeletal organization of fibroblasts ATLA. - 1996. -V.24, No.4. - P.557-565.

464. Miller E.C., Miller J.A. Some historical perspectives on the metabolism of xenobiotic chemicals to reactive elecrtophiles // Bioactivation of Foreign Compounds. -N.Y.: Acad.Press, 1985. P.3-28.

465. Minton K.W., Karmin R., Hahn G.M. et al. Nonspecific stabilization of stress-susceptible proteins by stress-resistant proteins: a model for the biological role of heat shock proteins // Proc.Nat.Acad.Sci. USA. 1982. - V.79. - P.7107-7111.

466. Mitchell J.R., Jollow D.L., Potter W.Z. et al. Acetaminophen induced hepatic necrosis. IV. Protective role of glutathione // J.Pharmacol.Exp.Ther. 1973. -V.187. -P.211-217.

467. Moller G. (ed.) Molecular mechanisms of T-cell mediated lysis // Immunol.Rev. 1988. - V. 103.

468. Moreau M.F., Chappard D., Lesourd M. et al. Free radicals and side products released during methylmethacrylate polymerization are cytotoxic for osteoblastic cells // J.Biomed.Materials Res. 1998. - V.40, No.l. - P. 124-131.

469. Monks T.J., Anders M.W., Dekant W. et al. Glutathione conjugate mediated toxicities // Toxicol.Appl.Pharmacol. 1990. - V. 106, No. 1. - P. 1 -19.

470. Monks T.J., Hanzlik R.P., Cohen G.M. et al. Quinone chemistry and toxicity // Toxicol.Appl.Pharmacol. 1992. - V.l 12, No.l. - P.2-16.

471. Monks Т.J., Lau S.S. Glutathione conjugate-mediated toxicities // Hanbook of Experimental Pharmacology. V.l 12. Conjugation-Deconjugation Reactions in Drug Metabolism and Toxicity /Ed.by F.C.Kauffman. Berlin: Springer Verlag, 1994. -P.459-508.

472. Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Man. Geneva: WHO. - 1993. - V.57. - P.312.

473. Morgan D.M.L., Clover J., Pearson J.D. Effects of synthetic polycations on leucine incorporation, lactate dehydrogenase release and morphology of human umbilical vein endothelial cells // J.Cell.Sci. 1988. - V.91, No.2. - P.231-238.

474. Morgan D.M., Larvin V.L., Pearson J.D. Biochemical characterization of polycation-induced cytotoxicity to human vascular endothelial cells // J.Cell.Sci. -1989. V.94, No.3. - P.553-559.

475. Morliere P., Moysan A., Santus R. et al. UVA-induced lipid peroxidation in cultured human fibroblasts // Biochim.Biophys.Acta. 1991. - V.l084, No.3. -P.261-268.

476. Moroson H. Polycation-treated tumor cells in vivo and in vitro II Cancer Res. 1971. - V.31, No.3. - P.373-380.

477. Morota K., Morikawa N., Morita S.-I. et al. Alternatives to primary Draize skin irritation test using cultured human skin model: comparison of six endpoints // Altern.Animal Testing & Experiment. 1999. - V.6, No.l. - P.41-51.

478. Moslen M.T., Balakumaran A. Cytolethality: necrosis versus apoptosis // Comprehensive Toxicology on CD-ROM. Elsevier, 1997. V.l

479. Mossmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. -1983.-V.65.-P.55-63.

480. Muller R.K. Toxicological analysis. Berlin: Ullstein Mosby, 1992. - 846 p.

481. Murrell G.A.C., Francis M.J.O., Bromley L. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals // Biochem.J. 1990. - V.265, No.3. -P.659-665.

482. Nabholz M., MacDonald H.R. Cytolytic T-lymphocytes // Ann.Rev.Immunol. 1983. - V.l. - P.273-306.

483. Nagamune H., Maeda Т., Okhura K. et al. Evaluation of the cytotoxic effects of bis-quaternary ammonium antimicrobial reagents on human cells // Toxicol. In Vitro. 2000. - V.14, No.2. - P. 139-147.

484. Nakajima M., Yamamoto Т., Nunoya K. et al. Role of human cytochrome P450 2A6 in C-oxidation of nicotine // Drug Metabolism and Disposition. 1996.- V.24. P. 1212-1217.

485. Nebert D.W., Nelson D.R. P450 gene nomenclature based on evolution // Methods in Enzymol. 1991. - V.206. - P.3-11.

486. Neeser J.R., Chambaz A., Del Vedovo S. Specific and nonspecific inhibition of adhesion of oral actinomyces and streptococci to erythrocytes and polystyrene by caseinoglycopeptide derivatives // Infection & Immun. 1988. - V.56, No.12.- P.3201-3208.

487. Neuhnejad M.P., Amini S. The correlation between drugs LC50 in brine shrimp, their oral ED50 in rats and their lethal concentration in man // Abstr. V Intern.Congr. of Toxicol. Brighton, 1989. - P.l 17.

488. Nguyen Т., Pickett C.B. Regulation of rat glutathione-S-transferase Ya subunit gene expression. DNA-protein interaction at the antioxidant responsive element // J.Biol.Chem. 1992. - V.267. - P. 13535-13539.

489. Nishino Т. The conversion of xantine dehydrogenase to xantine oxidase andthe role of the enzyme in reperfusion injury // J. Biochem. 1994. - V.l 16. - P. 16.

490. Nicotera P., Zhivotovsky В., Orrenius S. Nuclear calcium transport and the role of calcium in apoptosis // Cell.Calcium. 1994. - V.l 6, No.4. - P.279-288.

491. Noguchi N., Niki E. Chemistry of active oxygen species and antioxidants // Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health / Ed.by A.M.Papas. Lond., 1999.- P.3-20.

492. Novillo A., Ekwall В., Castano A. Protein precipitation in vitro as a mesure of chemical-induced cytotoxicity: an EDIT sub-programme // ATLA. 2001. -V.29,No.3.-P. 309-324.

493. Obatomi D.K., Brant S., Anthonypillai V. et al. Optimizing preincubation conditions for precision-cut rat kidney and liver tissue slices: effect of culture media and antioxidants //Toxicol. In Vitro. 1998. - V.12, No.6. - P.725-737.

494. Orrenius S., McConkey D.J., Bellomo G. et al. Role of Ca2+ in toxic cell killing // Trends Pharmacol.Sci. 1989. - V.10, No.7. - P.281-285.I

495. Orrenius S., McCabe M.S., Nicotera P. Ca -dependent mechanisms of cytotoxicity and programmed cell death // Toxicol.Lett. 1992. - V.64. - P.357-364.

496. Ota K., Hammock B.D. Cytosolic and microsomal epoxide hydrolases:differential properties in mammalian liver // Science. 1980. - V.207. - P. 14791481.

497. Owen A.D., Schapira A.H., Jenner P. et al. Oxidative stress and Parkinson's disease. // Ann. N.Y.Acad.Sci. 1996. - V.786. - P.217-223.

498. Ozer N.K., Azzi A. Beyond antioxidant function: other biochemical effects of antioxidants // Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health / Ed.by A.M.Papas.- Lond.: CRC Press. 1999. - P.448.

499. Pacifi R.E. Protein degradation as an index of oxidative stress // Methods in Enzymology. 1990. - V.l86. - P.485-502.

500. Papas A.M. (ed.) Antioxidant status, diet, nutrition and health. Lond.: CRC Press. - 1999.-650 p.

501. Pasternak C.A. Transmembrane communication and disease // Indian J. Вiochem.Biophys. 1990. - V.27, No.6. - P.363-364.

502. Pearce R., Greenway D., Parkinson A. Species differences and inter-individual variation in liver microsomal cytochrome P450 2A enzymes: effects on coumarin, dicoumarol and testosterone oxidation // Arch.Biochem.Biophys. -1992.- V.298.-P.211-225.

503. Pechan P.M. Heat shock proteins and cell proliferation // FEBS Lett. 1991. - V.280, No.l - P. 1-4.

504. Peloux A.F., Federici C., Bichet N. et al. Hepatocytes in primary culture: an alternative to LD50 testing? Validation of a predictive model by multivariate analysis // ATLA. 1992. - V.20, No.l - P.8-26.

505. Pereira C.M.F., Oliveira C.R. Glutamate toxicity on PC 12 cell line involves glutathione (GSH) depletion and oxidative stress // Free Radical. Biol. Med. -1997.-V.23.-P.637-647.

506. Pfaller W., Balls M., Clothier R. et al. Novel advanced in vitro methods for long-term toxicity testing // ATLA. 2001. - V.29, No. 4. - P.393-426.

507. Pietrobou D., Di Virgilio F., Pozzan T. Structural and functional aspects of calcium homeostasis in eukaryotic cells // Eur.J.Biochem. 1990. - V.193. -P.599-622.

508. Pinto R., Bartley W. The effect of age and sex on glutathione reductase and glutathione peroxidase activities and on aerobic glutathione oxidation in rat liver homogenates // Biochem.J. 1969. - V.l 12, No.l. - P. 109-115.

509. Piper P.W. How cells respond and adapt to heat stress through alterations in gene expression// Sci.Progr. 1987. - V.71, No.284, Pt.4. - P.531-543.

510. Pirovano R., Zanielli P., Nobel J. et al. A European interlaboratory evaluation of an in vitro ocular irritation model (Skin2™ Model Zkl 100) using 15 chemicals and 3 shampoos//ATLA. 1993.-V.21, No.l.-P.81-88.

511. Podkolsin A.A., Stepanova N.V. Magnetic field in the treatment of bone fractures, an experimental study // J.Bioelect. 1990. — V.9, No.l. — P.l 10.

512. Ponsoda X., Jover R., Castell J.V. et al. In vitro toxicity to two cellular systems of the first ten chemicals on the MEIC list // ATLA. 1990. - V. 17. -P.218-223.

513. Ponsoda X., Gomez-Lechon M.J., Castell J.V. Toxicity and cell density monitoring in monolayer and three-dimensional cultures with the XTT assay // ATLA. 1998. - V.26, No.3. - P.331-342.

514. Porter N.A., Caldwell S.E., Mills K.A. Mechanisms of free radical oxidation of unsaturated lipids // Lipids. 1995. - V.30. - P.277.

515. Poumlern-Ares M.I., Ares M.P.S., Orrenius S. Calcium signalling and the regulation of apoptosis // Toxicol. In Vitro. 1998. - V.12, No.5. - P.539-543.

516. Prensch P.C., Siegel D., Gibson N.W. et al. A note on the inhibition of DT-diaphorase by dicoumarol // Free Radical.Biol.Med. 1991. - V.l 1, No.l. - P.77-80.

517. Prohaska J.R. The glutathione peroxidase activity of glutathione S-transferases // Biochim.Biophys.Acta. 1980. - V.611, No.l. - P.87-98.

518. Pucher J.J., Daniel J.C. The effects of chlorhexidine digluconate on human fibroblasts in vitro И J.Periodontal. 1992. - V.63, No.6. - P.526-532.

519. Pugh C.R., Fearnside D. The development of a toxicity test using the luciferase system // J.Bioluminescence. Chemiluminescence. 1994. - V.9, No.5. -P.342.

520. Rabl H., Khoschsourur G., Colombo T. et al. A multivitamin infusion prevents lipid peroxidation and improves transplantation performance // Kidney Internat. 1993. - V.43, No.4. - P.912-917.

521. Rasmussen H. The calcium messenger system // New Engl.J.Med. 1986. -V.314, No.18. -P.1164-1170.

522. Rasmussen E., Strube M. In vitro methods for safety assessment of cosmetics // Soborg Inst, of Toxicol., Natl. Food Agency of Denmark. 1994.

523. Rat P., Osseni R., Cotovio J. et al. New specific glutathione assays using microplate cytometry with monochlorobimane in living cells // ATLA. 1996. -V.24, Special Issue. - P.278.

524. Rechsteiner M. Ubiquitin mediated pathways for intracellular proteolysis // Ann.Rev.Cell.Biol. 1987. - V.3. - P. 1-30.

525. Reddy V.Y., Pizzo S.V., Weiss S.J. Functional inactivation and structural disruption of human а-2-macroglobulin by neutrophils and eosinophils // J.Biol.Chem. 1989. - V.261, No.23. - P.13801-13809.

526. Reed D.J. Glutathione: toxicological implications // Ann.Rev.Pharmacol. & Toxicol. 1990. - V.30. - P.603-631.

527. Regnier J.F., Imbert C. Contributions of physicochemical properties to the evaluation of ocular irritation // ATLA. 1992. - V.20. - P.457-465.

528. Regnier J.F., Imbert C., Boutonnet J.-C. Evaluation of the EYTEX® system as a screening method for the ocular irritancy of chemical products // ATLA. -1994. V.22, No. 1. P.32-51.

529. Renzi D., Valtolina M., Forster R. The evaluation of a multi endpoint cytotoxicity assay system // ATLA. 1993. - V.21, No.l. - P.89-96.

530. Reynolds H.Y. Bronchoalveolar lavage // Am.Rev.Respir.Dis. 1987. -V.135, No.2. - P.250-263.

531. Rice-Evans C.A., Burdon R.H. (ed.) Free radical damage and its control. // New Comprehensive Biochemistry. Amsterdam: Elsevier, 1994. - V.28. - 408 P

532. Richard M.-J. Micronutriments et radicaux libres // Alcoologie. 1996. -V.18, No.2. -P.137-143.

533. Riddel R.J., Panacer D.S., Wilde S.M. et al. The importance of exposure period and cell type in in vitro cytotoxicity tests // ATLA. 1986. - V.14. - P.86-92.

534. Ritchie J.M. Tetrodotoxin and saxitoxin and the sodium channels of excitable tissues // Trends in Pharmacol.Sci. 1980. - V.l - P.275-279.

535. Roberts P.B. Growth in cadmium-containing medium induced resistance to heat in E.colill Int.J.Radiat.Biol. 1984.- V.45, No.l. -P.27-31.

536. Roguet R., Dassau R.G., Rougier A. Prediction of eye irritation potential of surfactants using the SIRC-NRU cytotoxicity test // ATLA. 1992. - V.20, No.3. -P.451-456.

537. Roguet R., Cotovio J., Leclaire J. Reconstructed skin for in vitro cutaneous pharmacotoxicology: example of metabolic studies // Toxicol. In Vitro. 1997. -V.10, No.l. - P.3-9.

538. Rosenfield W., Evans H., Conception L. et al. Prevention of bronchopulmonary displasia by administration of bovine superoxide dismutase in preterm infants with respiratory distress syndrome // J.Pediat. 1984. - V.l05. -P.781-785.

539. Ross D., Slegel D., Beall H. et al. DT-diaphorase in activation and detoxification of quinons. Bioreductive activation of mitomycin С // Cancer Metastasis Rev. 1993. - V.l2, No.2. - P.83-101.

540. Rossini P., Turchi G. DT-diaphorase affects the mutagenic activity of pyrene 1,6-quinone in Chinese hamster epithelial liver (CHEL) cells // ATLA. 1996. -V.24, No.4. - P.567-571.

541. Rudulier D.L., Stom A.R., Dendokar A.H. et al. Molecular biology of osmoregulation // Science. 1984. - V.224, No.4653. -P.1061-1068.

542. RuppovaK., SlamenovaD., Wsolova L. et al. Cytotoxic effects of paracetamol in vitro: the effects of an S9 fraction // ATLA. 1996. - V.24. -P.715-725.

543. Ruppova К., Urbancikova M., Wsolova L. et al. Apoptosis versus cytotoxicity in HeLa cells exposed to paracetamol // ATLA. — 1999. V.27. -P.403-412.

544. Rush G.F., Ponsler G.D. Cephaloridine-induced biochemical changes and cytotoxicity in suspensions of rabbit isolated proximal tubules //

545. Toxicol.Appl.Pharmacol. 1991. - V.109. - P.314-326.

546. Rushmore Т.Н., Morton M.R., Pickett C.B. The antioxidant responsive element. Activation by oxidative stress and identification of the DNA consensus sequence required for functional activity // J.Biol.Chem. 1991. - V.266.1. P.l 1632-11639.

547. Russell W.M.S., Birch R.L. The principles of humane experimental technique. Lond.: Methuen., 1959. - 238 p.

548. Sakai A., Suzuki Т., Nakamura T. et al. Effects of pulsing electromagnetic fields on cultured cartilage cells //Internat. Ortopaedics (SICOT). 1991. - V.15, No.4. -P.341-346.

549. Salovsky P., Shopova V., Dancheva V. et al. Bronchoalveolar lavage fluid in rats treated intratracheally with lead acetate // Bull.Environ.Contam. and Toxicol. 1994. - V.52, No.6. - P.912-918.

550. Sandbacka M., Christianson I., Isomaa B. The acute toxicity of surfactants on fish cells, Daphnia magna and fish a comparative study // Toxicol. In Vitro. -2000. - V.14, No.l. - P.61-68.

551. Sander D.N., Pastore S. Cytokines in contact dermatitis // Am. J. Contact Dermatitis. 1993. - V.4. - P.215-224.

552. Sasaki К., Tanaka N., Watanabe M. Comparison of cytotoxic effects of chemicals in four different cell types // Toxicol. In Vitro. 1991. - V.5, No.5-6. -P.403-406.

553. Sato C., Muriel P., Reyes J.L. Pancreatic lipid peroxidation in alloxan-induced diabetes mellitus // Archives of Med. Res. (Mexico). 1994. - V.25, No.3. - P.377-380.

554. Sawyer D.T. The chemistry and activation of dioxygen species (Ог, O2- and HOOH) in biology // Oxygen Complexes and Oxygen Activation by Transition Metals / Ed.by A.E.Martell, D.T.Sawyer. N.Y.-Lond.: Plenum Press, 1988. -P.131-147.

555. Schade R., Staak C., Hendriksen C. et al. The production of avian (egg yolk) antibodies : IgY. The report and recommendations of ECVAM Workshop 21 // ATLA. 1996. - V.24, N0.6. - P.925-934.

556. Schade R., Hlinak A., Marburger A. et al. Advantages of using egg yolk antibodies in the life sciences: the results of five studies // ATLA. 1997. - V.25, No.5. - P.555-586.

557. Scharff O., Foder D. Regulation of cytosolic calcium in blood cells // Physiol.Rev. 1993. - V.73, No.3. - P.547-582.

558. Scheers E.M., Ekwall В., Dierickx P.J. Long-term in vitro toxicity of 27 MEIC chemicals on Hep G2 cells // ATLA. 2001. - V.29, No. 3. - P.297-299.

559. Schnellmann R.G. Mechanisms of t-butyl hydroperoxide-induced toxicity to rabbit renal proximal tubules // Am.J.Physiol. 1988. - V.255. - C28-C33.

560. Schoenberg M.H., Birk D., Beger H.G. Oxidative stress in acute and chronic pancreatitis // Am.J.Clin.Nutr. 1995. - V.62. - P.1306S-1314S.

561. Schoolnik G.K., Lark D.L., O'Hanley P.D. Molecular approaches for the study of uropathogenesis // Bacteria Host Cell Interaction. - N.Y.: Alan R. Liss, 1987. - P.201-211.

562. Schuppe-Koistinen I. Molecular profiling and prediction of toxicity // ATLA. 2001. - V.29, No. 3. - P. 287-289.

563. Sciandra J.J., Subjeck J.R., Hughes C.S. Induction of glucose-regulated proteins during anaerobic exposure and of heat-shock proteins after reoxygenation // Proc.Nat.Acad.Sci. USA. 1984. - V.81, No. 15. - P.4843-4847.

564. Seibert H., Kolossa M., Wassermann O. Bovine spermatozoa as an in vitro model for studies on the cytotoxicity of chemicals: effects of chlorophenols 11 Cell Biol.and Toxicol. 1989. -V.5. - P.315-330.

565. Seibert H., Gulden M., Voss J.U. Comparative toxicology: the basis for in vitro toxicity testing // ATLA. 1994. - V.22, No.3. - P. 168-174.

566. Seibert H., Balls M., Fentem J.H. et al. Acute toxicity testing in vitro and the classification and labeling of chemicals. The report and recommendations of ECVAM Workshop 16 // ATLA. 1996. - V.24, No.4. - P.499-510.

567. Shan Xiaogin, Aw Так Yee, Jones D. Glutathione-dependent protection against oxidative injury // Pharmacol, and Ther. 1990. - V.47, No.l. - P.61-71.

568. Shechter E. Biochimie et biophysique des membranes. 2ёте edition. Paris: Masson, 1997.-466 p.

569. Shibata M., Tsuda Т., Itagaki H. et al. Interleukin-1 a and interleukin-8 release by human keratinocyte cell culture treated with surfactants // ATLA. -1997.-V.25, No.2.-P.161-171.

570. Shivji G.M., Segal L., McKenzie R.C. et al. Cutaneous toxicity of surfactants in normal human keratinocytes assessed by cytotoxicity, arachidonic acid release and regulation of interleukin-la mRNA // Toxicol.Methods. 1994. - V.4. -P.193-203.

571. Shrivastava R., Delomenie C., Chevalier A. et al. Comparison of in vivo acute lethal potency and in vitro cytotoxicity of 48 chemicals I I Cell Biol. And Toxicol. 1992.- V.8.- P. 157-170.

572. Sies H. (ed.) Glutathione conjugation: mechanisms and significance. Lond.: Acad.Press, 1988.-480 p.

573. Silverman L.M., Legrys V.A. The acute phase response and clinical significant proteins // J.Med.Technol. 1987. - V.4, No.l. - P.154-157.

574. Simpson J.A., Narita S., Gieseg S. et al. Long-lived reactive species on free-radical damaged proteins // Biochem.J. 1992. - V.282. - P.621-624.

575. Singh G., Duivenvoorden W.C.M. Mitochondria as a critical target for toxicity // Symp. on Mechanisms of Toxicity. J.Hopkins Center for Altern. to Animal Testing, Baltimore, Sept.8-10, 1997.

576. Slamon N.D., Pentreath V.W. A comparison of the acute and chronic effects of antidepressants in cultured C6 and 1321N1 cells. ATLA. - 1998. - V.26, No.3. - P.303-319.

577. Slater T.F. Free-radical mechanisms in tissue injury // Biochem.J. 1984. -V.222, No.l. - P.l-15.

578. Smith M.W., Ambudkar I.S., Phelps P.C.et al. HgCl2-induced changes ina.cytosolic Ca of cultured rabbit renal tubular cells // Biochim.Biophys.Acta. -1987. V.931. -P.130-142.

579. Smith M.W., Phelps P.C., Trump B.F. Cytosolic Ca deregulation and blebbing after HgCl2 injury to cultured rabbit proximal tubule cells as determined by digital imaging microscopy // Proc.Nat.Acad.Sci. USA. 1991. - V.88. -P.4926-4930.

580. Smith M.W., Phelps P.C., Trump B.F. Injury-induced changes in cytosolic Ca2+ individual rabbit proximal tubule cells // Am.J.Physiol. 1992a. - V.262. -F647-F655.

581. Smith C., Halliwell В., Aruoma O.I. Protection by albumin against the pro-oxidant actions of phenolic dietary components // Food Chem.Toxicol. 1992b. -V.30, No.6. - P.483-489.

582. Snider G.L. Interstitial pulmonary fibrosis // Chest. 1986. - V.89, No.3, Suppl. - P.l 15S-121S.

583. Sohal R.S., Weindruch R. Oxidative stress, caloric restriction and aging // Science. 1996. - V.273, No.5271. - P.59-63.

584. Soltoff S.P. ATP and the regulation of renal cell function // Ann.Rev.Physiol. 1986.-V.48.-P.9-31.

585. Spear N., Aust S.D. The effects of different buffers on the oxidation of DNA by thiols and ferric ion // J.Biochem.Molec.Toxicol. 1998. — V.12, No.2.1. P.125-132.

586. Stammati A., Zampaglioni F., Zanetti C. The neutral red uptake assay: comments on the results of the Instituto Superiore di Sanita in the EC/Ho validation study // ATLA. 1998. - V.26, No.l - P.61-68.

587. Steinberg D., Parthasarathy S., Garew T.et al. Beyond cholesterol. Modification of low density lipoprotein that increase its atherogenicity // New Engl.J.Med. 1989. - V.320. -P.915.

588. Stephens N.G., Parsons A., Schofield P.M. et al. Randomized controlled trial of vitamin E in patients with coronary disease Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS) // Lancet. - 1996. - V.347. - P.781-786.

589. Stirpe F., Delia Corte E. The regulation of rat liver xantine oxidase. Conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O) // J. Biol. Chem. 1969. - V.244. - P. 3855-3863.

590. Sumathi R., Jayanthi S., Kalpanadevi V. Effect of DL-a-lipoic acid on tissue lipid peroxidation and antioxidant systems in normal and glycollate treated rats // Pharm.Res. 1993. - V.27, No.4. - P.309-318.

591. Suzuki Т., Nezu K., Sasaki H. et al. Cytotoxicity of chlorinated hydrocarbons and lipid peroxidation in isolated rat hepatocytes // Biol.Pharmacol.Bull. 1994. -V.l7, No.l. - P.82-86.

592. Swicord M., Ning J., Czerska E. Promotion and distribution of normal and transformed cells by exposure to ELF magnetic fields // J.Bioelectricity. 1990. -V.9, No.l. -P.98-99.

593. Tamura H., Kitta K., Shibamoto T. Formation of reactive aldehydes from fatty acids in Fe /Н2О2 oxidation system // J.Agric.Food Chem. 1991. - V.39, No.3.-P.439-442.

594. Tani N., Kinoshita S., Okamoto Y. et al. Interlaboratory validation of the in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients. (8). Evaluation of cytotoxicity tests on SIRC cells // Toxicol. In Vitro. 1999. - V.13, No.l. - P. 175-187.

595. Thomson P.D., Till G.O., Woolliscroft J.O. Superoxide dismutase prevents lipid peroxidation in burned patients // Burns. 1990. - V.16, No.6. - P.406-408.

596. Thornalley P.J., Vasak M. Possible role for metallothionein in protection against radiation-induced oxidative stress, kinetics and mechanism of its reaction with superoxide and hydroxyl radicals // Biochim. Biophys. Acta. 1985. -V.827, No.l. -P.36-45.

597. Till G., Guilds L., Mahrougi M. et al. Role of xantine oxidase in thermal injury of skin // Am. J.Pathol. 1989. - V. 135, No.l. - P. 195-200.

598. Tipnis U.R., He G.-Y. Mechanism of polyamine toxicity in cultured cardiac myocytes // Toxicol. In Vitro. 1998. - V.12, No.3. - P.233-240.

599. Toimela T.A., Tahti H. Effects of mercuric chloride exposure on the glutamate uptake by cultured retinal pigment epithelial cells // Toxicol. In Vitro. -2001.-V. 15, No. l.-P. 7-12.

600. Trump B.F., Berezesky I.K. The role of sodium and calcium regulation in toxic cell injury // Drug Metabolism and Drug Toxicity / Ed.by J.R.Mitchell,

601. M.G.Horning. -N.Y.: Raven Press, 1984. P.261-300. i

602. Trump B.F., Berezesky I.K. The role of cytosolic Ca in cell injury, necrosisand apoptosis // Current Opinion.Cell.Biol. 1992. - V.4, No.2. - P.227-232.

603. Trump B.F., Berezesky J.K, Calcium-mediated cell injury and cell death // FASEB J. 1995. - V.9. - P.219-228.

604. Turrens J.F., Alexandre A., Lehninger A.L. Ubisemiquinone is the electron donor for superoxide formation by complex III of heart mitochondria // Arch.Biochem.Biophys. 1985. - V.237. - P.408-414.

605. Ursini F., Maiani G., Polito A. et al. TBA reactive material in human plasma and its relation to nutritional parameters // Nutrition Rep. Internat. 1989. - V.39, No.6. - P.1263-1274.

606. Viollon-Abadie С., Bigot-Lasserie D., Nicod L. et al. Effects of model inducers on thyroxine UDP-glucuronosyl-transferase activity in vitro in rat and mouse hepatocyte cultures // Toxicol. In Vitro. 2000. - V.14, No.6. - P.505-512.

607. Virmani M., Majchrowicz E., Swenberg C.E. et al. Alterations in calcium-binding activity in synaptosomal membranes from rat brains in association with physical dependence upon ethanol // Brain Res. — 1985. V.359. - P.371-374.

608. Wadstrom T. Molecular aspects on pathogenesis of wound and foreign body infections due to staphylococci // Zbl.Bacteriol.Mikrobiol.Hyg. 1987. - Bd.266 (Ser.A), H.1-2.-S.191-211.

609. Wakuri S., Izumi J., Sasaki K. et al. Cytotoxicity study of 32 MEIC chemicals by colony formation and ATP assays // Toxicol. In Vitro. 1993. - V.7, No.4.-P.517-521.

610. Waldeck A.R., Stocker R. Radical-initiated lipid peroxidation in low density lipoproteins: insights obtained from kinetic modeling // Chemical Res.Toxicol. -1996.- V.8.-P.954.

611. Walum E., Stenberg K., Jenssen D. Understanding cell toxicology: principles and practice. N.Y.: Ellis Howard, 1990. - 206 p.

612. Walum E., Ekwall B. Final MEIC results within reach // ATLA. 1996. -V.24, Suppl.l. - P.249.

613. Walum E., Ekwall B. Cell toxicology a new paradigm // ATLA. - 2000. -V.28, Suppl.l.-P. 159.

614. Wang X., Sasaki Т., Matsudo T. et al. Correlation of in vitro toxicities of MEIC chemicals determined by lactate dehydrogenase release assay with in vivo toxicities to animal and human // Altern.Animal Testng & Experiment. 1994. -V.2. -P.115-126.

615. Ward J.A. Should antioxidant vitamins be routinely recommended for older people? // Drugs & Aging. 1998. - V.l2, No.3. - P. 169-175.

616. Watanabe H., Kabayashi A., Yamamoto T. Alteration of human erythrocyte membrane fluidity by oxygen-derived free radicals and calcium // Free Radical.Biol.Med. 1990. - V.8, No.5. - P.507-514.

617. Waterman M.R., Johnson E.F. (eds.) Cytochrome P450. // Methods in Enzymol. 1991. - V.206. - 716 P.

618. Webb C., Dyson M., Lewis W.H.P. Stimulatory effect of 660 nm low level laser energy on hypertrophic scar-derived fibroblasts: possible mechanisms for increase in cell counts // Laser Surg, and Med. 1998. - V.22, No. 5. - P.294-301.

619. Weiss M.T., Sawyer T.W. Cytotoxicity of the MEIC test chemicals in primary neuron cultures // Toxicol. In Vitro. 1993. - V.7. - P.653-667.

620. Welch W.J. The mammalian stress response: cell physiology and biochemistry of stress proteins // Stress Proteins Biol, and Med. Cold Spring Harbor (N.Y.), 1990. - P.223-278.

621. White R.E. The involvement of free radicals in the mechanisms of monooxygenases // Pharmacol. Therap. 1991. - V.49. - P. 21-42.

622. Wideback K. Binding of albumin fragments to surface receptor in А, С and G streptococci // Acta Pathol.Microbiol.Scand., sect.B. 1987. - V.95, No.5. -P.303-307.

623. Wiebel F.J., Andersson T.B., Casciano D.A. et al. Genetically engineered cell lines: characterization and applications in toxicity testing // ATLA. 1997. -V.25, No.6. - P.625-639.

624. Willis E.D. Evaluation of lipid peroxidation in lipids and biological membranes // Biochemical Toxicology / Ed.by K.Snell, B.Mullock. Oxford: IRL Press, 1987. -P.127-152.

625. World Health Org. Intern. Programme on Chemical Safety. Concise Intern. Chem. Ass. Geneva, 1998. - Doc. No.4: Methylmethacrylate. - P.4.

626. Wu D., Meydani S.N. Antioxidants and immune function // Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health / Ed.by A.M.Papas. Lond.: CRC Press, 1999.- P.370-400.

627. Wu B.J., Hurst H.C., Nicholas G.C. et al. The EIA 13S product of adenovirus 5 activates transcription of the cellular human HSP 70 gene // Molec.Cell.Biol. -1986. V.6, No.8. - P.2994-2999.

628. Xia Z., DePierre J.W., Nedssberger L. Modulation of apoptosis induced by tricyclic antidepressants in human peripheral lymphocytes // J.Biochem.Molec.Toxicol. 1998. - V.12, No.2. - P. 115-123.

629. Yagi K. A simple fluorimetric assay for lipoperoxide in blood plasma // Biochem.Med. 1976. - V. 15, No.2. - P.212-216.

630. Yagi K. Assay for serum lipid peroxide level and its clinical significance // Lipid Peroxides in Biology and Medicine / Ed.by K.Yagi. N.Y.: Acad. Press, 1982. -P.223-242.

631. Yamamoto S. Mammalian lipoxygenases: molecular structures and functions // Biochim.Biophys.Acta. 1992. - V.l 128. - P.l 17.

632. Yankovsky O.Yu. Methionine (Met) Met-sulfoxide - Met-O-peptide reductase redox cycle as a possible catalytic mechanism of antioxidant system // 3rd Intern. Conf. "AIDS, Cancer and Related Problems". - St.Petersburg, 1995. -P.81.

633. Yeo H.C., Helbock H.J., Chyu D.W. et al. Assay of malondialdehyde in biological fluids by gas chromatography mass spectrometry // Analyt. Biochem.- 1994. V.220. - P.391-396.

634. Young J.D.-E., Liu C.-C. Multiple mechanisms of lymphocyte-mediated killing // Immunol.Today. 1988. - V.9. - P. 140-145.

635. Zalups R.K., Knutson K.L., Schnellmann R.G. In vitro analysis of the accumulation and toxicity of inorganic mercury in segments of the proximal tubule isolated from the rabbit kidney // Toxicol.Appl.Pharmacol. 1993. — V.l 19. - P.221-227.

636. Zanetti С., De Angelis I., Stammati A.L. et al. Evaluation of toxicity testing of 20 MEIC chemicals on Hep-2 cells using two viability endpoints // ATLA. -1992.- V.20.-P.120-125.

637. Zhivotovsky В., Cedervall В., Jiang S. et al. Involvement of Ca2+ in the formation of high molecular weight DNA fragments in thymocyte apoptosis // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1994. - V.202, No. 1. - P. 120-127.

638. Zucco F. Cell death and in vitro acute toxicity testing // ATLA. 1996. -V.24, Special Issue. - P.90.

639. Zutphen B. van, Balls M. Chairmen's welcome to the second World Congress on alternatives and animal use in the life sciences // ATLA. 1996. -V.24, Special Issue. - P. 1.

Информация о работе

Еропкин, Михаил Юрьевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследованиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно