Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование тканей и индукция морфогенезаin vitro у эспарцета (Onobrychis sp.)"

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование тканей и индукция морфогенезаin vitro у эспарцета (Onobrychis sp.)""

P, n

~ - г* \ 1 £ 1 п О v

Нащональна Акадеюя наук Украши 1нститут KJiiTHHHoi бйшогп та генно1 шженерц

На правах рукопису УДК 543.545:577.152.193: 633.361:576.536

Задерей Натал1я Сергивна

Культивування тканин i шдукщя морфогенезу in vitro у еспарцету (Onobrychis 8р.)

03.00.25 - клиинна бюлог!я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацп на здобуття наукового ступени кандидата бшлогччних наук

Кшв 1997

Роботу виконано в лабораторП бютехнологи вд.дд1лу генетики Одеського селекцШно-генетичного шституту УААН та на кафедр1 генетики I молекулярной бюлоги Одеського державного ушверситету иа. 1.1. Мечншова

Науков1 кер1вники - доктор бюлоичних наук, професор

B.М. Тоцький,

кандидат бюлог1чних наук

C.О. 1гнатова

Офщшш опоненти - доктор б1олог1чних наук, професор

В.А. Кунах,

кандидат б1олопчних наук М.В. Кучук

Проввдна оргаы1защя - 1нститут агроекологй' i бютехнологи

УААН

Захист вадбудеться " 30 " 1997 р. о Jty год.

на засадант спещал1зовано1 вчено'1 "ради Д.01.19.01 при 1нститут1 клггинно! бюлогп та генетично! шженери HAH Украши за адре-сою: 252143, Ки!в, вул. Заболотного, 148.

3 дисертащею можна ознайомитись в б1блютещ 1нституту клггинно! бюлогп та генетично! шженерп HAH Украши

Автореферат роз1сланий

.¡ц " G2/UUtä 1997 р.

Вчений секретар спещал1зовано! ради, кандидат бюлог1чних наук

JI.B. Тарасенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОВОТИ

Актуальшсть проблеми. Забезпечити тваринництво кормами в засушливих умовах твдня Ураши можна шляхом створен-ня засухостшких сортов кормових рослин. Перспективною кормовою культурою для твдпя Украши е еспарцет. Незважаючи на жорстк1сть корм1в, харчова цшшсть еспарцету досить велика. BiH засухо- i морозостшкий; менше тддаеться ураженню Bipyc-ними шфекщями, hkî широко розповсюджет в цьому perioni, запоб!гае розвитку TiMnaHiï у тварин (Оруджаев А.К., Мамедов A.I., 1966; Ганшбал О.В., 1983; Балаболш М.А., 1984). Селекщя еспарцету штенсивно ведеться у в1дд1л1 селекцп i насшництва Одеського селекцшно-генетичного шституту. Шдвищити ефек-тивтсть селекцп можна шляхом створення вихщного селекщй-ного матер1алу з заданими властивостями за допомогою культу-ри in vitro. В Укранп досладження щодо розробки технологи культивування еспарцету in vitro не проводились. Поодинош публшацп, HKi е в заруб1жнш Л1тератур1 (Ahuja P.S. et al., 1983; Zhuping G.U., 1987; Jia Jing-fen, 1989; Tie-gang et al., 1990) св1дчать про вщсутшсть оптимальних технологш отримання ре-генерант1в при культивуванш тканин, клгтип i протопластав еспарцету. Зовс1м не дослвджеш особливоста диференщаци кльтин та морфогенезу за культивування калусних культур еспарцету, не з'ясоваш шляхи оптагомзацп цих процеив, а, отже, способи спрямованого стимулювання регенерацп рослин. До того ж слщ зазначити, що icnyi04i поодинок1 досладження по культивуван-ню тканин та клйин еспарцету in vitro проведен! на сортах лише одного виду рослини - Е. Звичайного.

Саме тому перед лаборатор1ею бютехнологп Одеського се-лекщйно-генетичного 1нституту поставлено завдання розробити ефективну технологш культивування еспарцету in vitro з метою отримання вихщного селекщйного матер1алу. Все вищезазначе-не i обумовило мету дисертацшно! роботи.

Мета та завдання досладжень. Гол овна мета дослщжень поля-гала в розробщ технологи культивування тканин i клггин еспарце-ту i вивченш юптинного диференщювання i морфогенезу in vitro. До конкретних завдань роботи входило:

1. OnTHMieyBaTH умови отримання калусних культур i шдукцп регенерацшних процес1в у перспективних з точки зору подальше! селекцшно! роботи форм еспарцету.

2. Розробити методику вщцлення житездатних протопласпв еспарцету;

3. Вивчити залежшсть диференщювання i морфогенезу в куль-Typi тканин i кл1тин еспарцету в1д сшввцщошення фмогор-мон1в в поживних середовищах;

4. Дослвдити експресившсть ген-ензимно! системи пероксидази (вивчити актившсть i множинт молекулярш форми (ММФ) ферменту) в процеы де- i диференщацп кл1тин еспарцету in vitro з метою маркування окремих еташв цих процеЫ.в, роз-робки cnoco6iB i'x прогнозу, а також критерпв ефективност1 ix регулювання шляхом модифшацп xiMi4Horo складу поживних середовищ.

Наукова новизна результаив дослщжень. Запропонована високоефективна технолог!я культивування тканин i кл1тин та регенераци рослин для ряду вид1в роду Onobrychis, р1зних за своЗСм морфогенетичним потенщалом. Отримана за щею техно-лог1ею культура запропонована за модель для вивчення про-цес1в диференщювання i морфогенезу у еспарцету. За допомо-гою ще! модел1 отримаш HOBi дат щодо можливост1 корекци диференщювання i морфогенезу гормонами i шшими компонентами середовища.

Вперше вивчеш видов1 особливоста експресц ген-ензимно! системи пероксидази у еспарцету. Встановлено, що окреш молекулярш форми цього ферменту е специф1чними для певних стадш диференщювання клшш i морфогенезу, а тому можуть використовуватись як критерш р1вня диференщювання (пероксидазний тест).

Практична цшшсть роботи. Розроблена нами система реге-нераци рослин з листових, им'ядольних, гшокотилевих i коре-невих експлант1в для сорт1в еспарцету, отриманих у вщдШ се-лекцп i насшництва бобових культур Одеського селекщйно-ге-нетичного 1нституту дае можлив!сть отримати вихщний матерь ал для селекци i скоротити строки селекцшного процесу. Запро-понована технолопя культивування i регенераци щлих рослин може бути використана для клонування цшних генотитв, отри-мання сомаклональних вар1анив i мутантних форм, а також до-рощування габридних зародк1в.

Положения, що виносяться на захист.

1. Запроноваш умови культивування тканин in vitro дають мож-лив1сть з високою частотою регенерувати рослини з листових, ым'ядольних, гшокотилевих експлштв еспарцету.

2. Пстолог1чний i цитологачний анатз отриманих калусних культур дозволяе виявити залежтсть типу морфогенезу у еспарцету в1д сшввадношення гормоноактивцих речовин в поживно-му середовипц.

3. Морфогенетичний потенщал тканин еспарцету в культур! in vitro визначаеться ix видовою i сортовою належшстю.

4. Активн1сть i пол1морф1зм пероксидази можна використову-вати як маркер окремих етатв морфогенезу в культур! in vitro еспарцету.

5. Розроблена методика видшення протопластав з мезоф!лу листа еспарцету дае можливкть з високою ефектившстю отриму-вати життeздaтнi 1зольоваш кл1тини.

Апробащя роботи. Основш положения та результати ди-сертацп представлялись на науково- практичнш конференцп молодих вчених i спещал1ст1в (Чабани, 1991), на Всесоюзнш конференцп "Досягнення бютехнологп агропромисловому комплексу" (Чершвщ, 1991), на VI Украшському з'1зд1 генетик!в i селекщонер1в (Полтава, 1992), на м1жнародному симпозиум! по

генетичнш жженерп 1 бютехнологп рослин (Кшв, 1994), на на-уковш конференцп Одеського державного ушверситету (Одеса, 1996), на науковому сем1нар1 ваддолу цитоф1з1ологп 1 кл1тинно1 шженери 1нституту клггинно! б1ологи 1 генетично! шженери (Кшв, 1997).

Об'ем 1 структура роботи. Дисертащя викладена на 156 сто-ршках машинописного тексту, складаеться 1з вступу, огляду лгге-ратури, матер1ал1в 1 методов, результапв досладжень та IX обгово-рення, заключения, висновюв та списку використано1 л1терату-ри. Робота вм1щуе 33 таблищ 1 49 малюншв. Б1бл1ограф1чний список включае 217 лггературних джерел, 1з них 95 на шозем-них мовах.

MaTepiaJiH i методика досладжень

В poöoTi використаш сорти трьох вид1в еспарцету i один м1жвидовий пбрид:

- Е. звичайний (О. viciifolia Scop.) - сорти Мустанг i Агат;

- Е. шсчаний (О. arenaria D.C.) - сорт Альта1р i генотип ЗОЮ,

- Е. неозброений (О. inornis Stev.) - генотип В-5 3070,

- м1жвидовий тбрид [Шсчаний 1251хЗакавказький 9696] - сорт Швденноукрашський.

Прол1феративну актившсть експланив i регенерацшну здатшсть тканин еспарцету вивчали в культур! in vitro. Експ-лантами були ппокотил^ KopeHi, листки i с1м'ядол1 6-10-денних i 28-30-денних проростк1в еспарцету. Для шдукцП калусогенезу i наступного субкультивування калуив використовували сере-довища ШХ (Schenk, Hildebrandt, 1972), MC (Murashige, Skoog, 1962), JIC (Ljnsmeyer, Skoog, 1965). Середовища доповнювали гормонами (2,4 -Д, IMK, БАЛ, тригонелш) в р1зних концентращях i ствввдно-шеннях. Для шдукцп регенеращг використовували середовища з зеатин-рибозидом та 24зопентиламшопурином (2Ш). Ризоге-нез стимулювали ждодьл-З-оцтовою (ЮК) та 1-нафплоцтовою (НОК) кислотами, ... . . „

Морфологаю калусних тканин вивчали за допомогою комп'-ютеризовано! системи обробки оптичного зображення MOPVIDEOPLAN ф1рми "Opton" (ФРН). Цитолопчний анал13 ка-лус1в здшснювали в приготовлених суспенз1ях i на постшних препаратах.

Пероксидазну актившсть в калусних тканинах визначали спектрофотометрично (Бояркш А.Н., 1951). ММФ пероксидази визначали за допомогою електрофорезу в пол1акрЬтм1дному гел1 в anapari для вертикального електрофорезу LKP 2001 Vertical Elektrophoresis (Davis, 1964). Пстох1м1чну щентифшащю перок-сидаз на електрофореграмах здшснювали за методом Liu (1973).

Амшокислотний склад калусно! маси, тканин та насшня ес-пардету визначали на амшокислотному анализатор! (Stein, Moore, 1961).

Результата дослщжень та i'x обговоренпя

1. Оптим1защя умов вндшення протопласт1в з мезофЫу листа еспарцету

Розроблена технолопя отримання протопласпв листа еспарцету. Найбшьш придатними для видолення протопласта вияви-лись молода рослини в вщ1 20-30 дтв, лиcтoвi пластинки яких повинш бути не старцц6-8 дшв Максимальний вихад протопластов отримано в результат! шкубацп листов еспарцету 3i знятим етдерм1сом в ферментному розчиш, що м1стив 27x105 М целю-лази i ЗхЮ"5 М пектинази, а також осмопротектори - 0,5 М машт, 0,27 М хлориетий кальщй, 0,1 М глщин. Оптимальними умова-ми були температура шкубацп 25 °С та утримання рослин в темном перед видаленням протопласт1в.

Виявлено сортов! вщмшностс виходу протопластов (табл. 1). Так, з мезоф1лу листа рослин сорту Мустанг вдаеться отримати в два рази бшыпе протопласпв, шж з мезоф1лу листа генотипу В-5 3070.

Таблиця 1. Вихад протопласт!в з мезоф!лу листа еспарцету в залежносп ввд генотипу рослини

Показники сорт Мустанг генотип В-5 3070

Число протопластав в 1 мл суспензи хЮ5 13,93±3,48 6,48±1,41 р<0,001

Вих1д в % 100 46,5

Прим1тка: вш рослини - 20-23 дш, другий лист - у впц 6-9 дшв; концентращя фермент1в: целюлаза - 27х105 М, пектиназа - ЗхЮ"6 М; концентращя машту - 0,5 М; листки без ешдертсу.

Слад в1дм1тити, що запропонована нами технолопя дозволяе досягти значно большого виходу протопласт1в з мезоф1лу листа еспарцету (14,6x10е протошшхтв в розрахунку на один грам тканинй), nopiBHHHO з даними англшських вчених (Ahuja et al., 1983), у яких вихщ протопластав теля понереднього плазмол1зу тканин складав 8,5x10е.

2. Визначення оптимального сольового, вггамшного i гормонального складу поживних середовищ, необхщних для прол1фераци клиин еспарцету in vitro

3 метою оптим1зацц умов культивування in vitro тканин, клггин i протонласт1в еспарцету збалансовано сшвввдношення сольових, в1там1нних i гормональних компонентав поживних середовищ для р1зних об'ектав культивування (листя, с!м'ядол1, rino-котил1, кореш, зрШ 1зольован1 зародки). Запропоноваш заруб1ж-ними авторами середовища св1дчать про ввдсутшсть едино! думки вщносно умов шдуцп калусоутворення у еспарцету. Зокрема L. Heszky (1975), S. Arcioni i D. Mariotti (1982), F. Puppili та in.

(1989) вважають достатшм використання 2,4-Д для шдукцп

калусогенезу у еспарцету. В той же час G. Zhuping (1987) ствер-

джуе, що ауксини непотр1бт для культивування тканин еспар-

цету. Для шдукци калусогенезу i наступно!' регенерадц через соматичний ембрюздогенез вш вважае за необхздне вшшристал-ня цитокшшу БА. В1дсугн1сть' в зазначених роботах цнтологгч-ного контролю за процесами морфогенезу in vitro не дае можли-BOCTi з'ясувати особливос-п впдиву кожно! з вшсористагшх ф1зхо-лопчно активних речовин.

Все це спонукало нас до комплексиих морфолопчних, цито-лопчних i генетико-бюхЬичних дошпджепъ з метою вивчсшгя морфогенетичних процейв в тканинах i клтшах еспарцету, якд культивували на середовищах з pisniiM сольовим, гормонаяьним та в1тамшним складом. З'ясувалось, що середовище Гомборга Ва не придатке для культивування еспарцету. На серед о пицц Ng зародки еспарцету розвиваються бъчьш активно, однак недороз-винення листових пластинок св!дчить про недостатпе жнвлення рослип. Середовища ШХ i МС забезпечують необхЛдпий баланс сольовнх та в1тамшних компонентов i стимулюють розвиток нормальних рослин, в зв'язку з чим вони були запропоиоваш для культивування тканин i юитин еспарцету. . , Нами вивчено вплив таких ф1зюлог1чно активних речовин, як 2,4-Д, IMK, БАЛ i тригонелш на прол1ферапдю юитин еспарцету. Ефектившсть гормонального складу середовища визнача-ли за швидгастю шдукци калусогенезу, числом експлант!в, що утворюють калус, масою калусу. Встаяовлено, що р!зн1 гормоно-активш речовини неоднаково впливають на хдд морфогенезу в культур! еспарцету in vitro. Так, 2,4-Д приекорюе дедиференц1а-цш клггин еспарцету, що супроводжуеться значяим набуханиям тканин i неоргашзованнм ростом клтш, ят виявляготься вже на третш день культивування експланйв на поживному се-редовипц. БАП також етимулюе неоргашзоваций picT тканин, але швидклсть цього процесу значно нижча, н1ж за наявност1 2,4-Д. На середовинц без гормошв, а також за окремих добавок триго-нелшу i IMK калус практично не утворюеться, за винятком невеликих островадв, виникнення яких може бути обумовлене травматичною шдукщсго шд час дзоляци сксдланту. На середовищ!

з 2,4-Д в1дбуваеться не т1льки б!лып швидка шдукщя калусоут-ворення, але 1 значно больший вихщ калусу в першому пасажь Маса калусу, отриманого на середовипц з 2,4-Д, в два рази пере-вищуе масу калусу на середовипц з БАП (табл. 2).

Таблиця 2. Вплив ф1з1олопчно активних речовин на р1ст калусу сорту Мустанг

Маса Маса калусу, сформованого на р1зних середовищах, мг

експланту, мг Без гормошв 1МК, 1 мг/л БАП, 1 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л Тригонелш 5 мг/л

25,6±4,6 86,1±18,9 122,4±38,2 242,5+82,6 462,3±22,5 74,0+17,3

Таким чином, швидшсть 1 частота утворення калусу, а також прир1ст його маси на середовипц з 2,4-Д б!льш значш, шж в присутност1 шших гормоноактивних речовин.

Нами виявлено значш вщмшност1 в морфологи тканин, що зросли на поживних середовищах з р1зними гормоноактивними сполуками. Саме це, а також та обставина, що значне наростання калусно! маси в присутноста 2,4-Д не завжди корелюе з и здат-шстю до регенерацп, спонукали нас до цитолог1чного дослщжен-ня первинного калусу. За допомогою системи МОР-УШЕОРЬАК встановлено, що кл!тини еспарцету на середовищах з ауксинами набували веретенопод1бно! або округло-овально! форми. На середовипц з БАП утворювалися калусш шптини двох тишв. Юити-ни одного типу мал и довгу, веретеноподгбну форму 1 нагад ували юптини, що появляються на середовипц з ауксинами. Клтши другого типу мали значно менпи розм1ри, округлу форму 1 часто групувались у мжрокалуси.

Виявлено, що штенсивне нарощування маси калусу в при-сутност1 2,4-Д е не результатом збшыпення числа кл1тин, обу-мовленого !х под1лом, а наслщком зб1льшення !х об'ему шляхом розтягування. В присутноси БАП в середовипц клггини еспарцету збер1гають свою спещ&тзацио. Довп. веретенопод1бш клггини можуть представляти собою паренх1мш кл1тини, що роз-

рослися в o6'eMi в умовах культури in vitro, а мшрокалуси утво-рилися в результат клонування меристемних кл1тин. Вщсутшсть в калусн, утвореному в присутносп ауксишв, мшроколонш, а та-кож однорвдшсть отримано! клггинно! культури дозволяе вва-жати, що ауксини сприяють дедиференщацй' клггин еспарцету. Тому для ефективно! де- i диференщацп клп-ин еспарцету in vitro необхщно пдабрати neBHi стввщношення ауксин1в i цито-шшшв. Так, внесения в поживш середовища, що м1стять IMK, нав!ть незначно! к1лькост1 ВАЛ забезпечуе б1льш ефективний подш клггин. Шдвищення концентрацп БАП у вказанш cyMiuii гормон1в сприяе не т!льки зб1льшенню калусно! маси, але й штен-сифшуе процеси диференщацп клп"ин. Ефективне калусо-утворення i закладку органогенних структур в калусах еспарцету забезпечуе середовище, яке мктить 0,4 мг/л БАП, 2 мг/л IMK i 5 мг/л тригонелшу.

Вщомо, що процеси калусоутворення залежать вад генотипу рослин. Однак для еспарцету особливостч морфогенетичного по-тенщалу р1зних його copTiB не з'ясовань Отримаш нами дат про м1жсортов1 особливосп калусогенезу у еспарцету наведено на мал. 1, 2, 3. Дослщжуват сорти еспарцету значно вадр1зня-ються здатшстю до калусоутворення i морфогенетичними характеристиками. Так, на четвертий день культивування на середо-випц, що метить БАП, IMK i тригонелш у листових експланпв доогпджуваних сорпв вадбуваеться шдукщя калусоутворення з досить високою частотою у сорту Мустанг (Е. звичайний) - 80 %, у сорту Агат (Е. звичайний) - 60 % i у генотипу В-5 3070 (Е. неозброений) - 55 %. В протилежшсть цьому у copTiB АльтаХр (Е. тсчаний) i Швденноукрашський (пбрид ШсчанийхЗакав-казький) на четвертий день культивування листових експланпв калусоутворення не спостер1гаеться. У цих сорт1в процеси шдукцц калусогенезу вщбуваються значно повыьшше i тiльки на 20-й день шльтсть листових експланив, що утворюють ка-лус, досягае 67 % у Альта!ру i 50 % у Швденноукрашського.

! го

а

0

ы

а

1

« 40

¡2 о

Ь£

Щ га

4 день

20 день

ДН

■ ШвджкоукраТиський еВ - 5 3070 0 Агат В Мустанг О Аяьтар

Мал. 1 МЪксортов! особливосп штенсивност1 калусоутворен-ня у експлагтв з коренхв еспарцету

ГБядыпюукраяюький

ВБ-,5 3070 РАгат

В Мус та ш" □ АльтаТр

4 день

20 день

ДИ1

Мал. 2. М1жсорт6в1 особливосп 1нтенсивност1 калусоутво-рення у експлан'пв з гшокотшпв еспарцету

4 день

20 день

ИГШдешгоукрагшьккй ав-5 3070

□ Лгат

И Мустанг

□ Л.га,та1р

дш

Мал. 3. М1жсортов1 особливоси штенсивност1 калусоутво-рення у експлантав з листшв еспарцету

Ефектившсть калусоутворення 1 наступнсн регенеращ! рос-лин залежить не ильки в1д генотипу рослин, але й ввд конкретного органу рослини. Нами встановлена низька калусоутворю-вальна здатшсть кореневих експлантсв вих п'яти дослвджува-них сорив еспарцету. У сортав Агат, В-5 3070 1 Швдениоукра!-нський максимальною калусоутворювальною здаттстю вадзна-чаються експланти гшокоташв, а у сорту Мустанг - експланти лиспов.

3. Розробка технологи культивувания ткапин 1 клтш еспарцету, отримання рослин регенерапив

Уже в перпиному калус1 еспарцету спостер1гаються структура! вщмшносп м1ж калусними тканинами в залежноста в1д напрямку IX регенерацл по типу органогенезу чи соматичного ембрющогенезу. , . , .

Якщо на поживному середовшщ без 2,4-Д клшши еспарцету не втрачають повтстю свое! функционально! спещал1зацп, що приводить до 1х клонування 1 подалыпого розвитку шляхом органогенезу, то при поеднанш. БАП з 2,4-Д в концентрациях 1 мг/л 1 0,001 мг/л вадповадно, стимулюеться соматичний ембрющогенез. В цьому випадку д1я ауксину 2,4-Д як сильного дедиференщато-ра доповнюеться д1ею цитокшшу, який спрямовуе морфогенез на шлях соматичного ембрппдогенезу. Наступш пасаж1 тканин лише сприяють подалыпому розвитков1 шитин в цьому напрямку за умови оптимального сшвв!дношення концентрацш ауксйтв 1 цитокипшв в поживному середовшщ.

Стимулювати шдуковаш в першому пасаж1 органогенш про-цеси вдавалося шляхом шдвищення в поживному середовшщ концентраци цитокшш1в вздносно ауксйтв при загальному зни-женн1 р1вня гормошв в 10 раз!в. Калус, що субкультивувався на поживному середовшщ МС, яке м1стило 0,2 мг/л 1МК, 0,05 мг/ л БАП, 0,5 мг/л зеатин-рибозиду 1 200 мг/л пептон-гщрол1за-ту, вже на третш-п'ятий день культивування на св1тл1 утворю-вав шдльт глобулярш структури зеленого кольору.

3 метою прискорення морфогенетичних процеыв калусну тканину в третьему пасаж1 помицали в рщке середовище МС ¿з зменшеним наполовину вм1стом солей 1 в1там1шв, але з попе-редшм вм1стом гормошв. Уже на шостий день культивування калусу в редкому середовшщ при обертант на круговш гойдалщ з1 швидкктю 60 об/хв утворювалися нцльш глобулярш структури та ембрюзди довжиною в1д 3 до 7 мм. Мшроскошчний анал1з поздовжнього зр1зу ембршдав свщчить про наявшсть точок росту пагона 1 кореня, тобто про бшоляртсть структури.

Для стимулящ! регенерацп пагон1в часто використовуеть-ся цитовдшн 2Ш (ЬеЬтшёег М.В., ^коЬвеп Н.1., 1989; Р. РирПИ et а1., 1989). В результат! пересадки отриманих нами калус1в на середовище з 2Ш в1дбувався розвиток пагошв-регенеранив з утворених в калуснш культур! адвентивних бруньок (табл.3).

Таблиця 3. Динамша утворення регенераш1в з калусно?

тканин еспарцету в четвертому пасаж1

Дш культивування 3 13 33 43

Шльшсть регенеруючих калуав, % 11 50 61 72

Одтею !з складних проблем регенеращ! рослин еспарцету являеться отримання з регенерант1в повнощнних рослин з розвинутою кореневою системою, здатною витримувати пересадку з поживного середовища в грунт. Процент регене-ранив з утвореними коренями, як правило, незначний, а в утворених коренях в1дбуваеться вторинне калусоутворення (Агсшт Б., МапоШ Б., 1982; РирПИ Р., 1989). Шд1бравши оптимальт умови живлення, осв1тлення 1 температури, ми пропонуемо ефективну систему ризогенезу у регенерант1в еспарцету. Для стимуляцп коренеутворення необхщно куль-тивувати пагони в середовипц ШХ, яке метить половинну в1д норми шлыисть солей 1 вггамш1в при повнШ в1дсутност1 чи мш1мальнш к1лькост1 в ньому сахарози 1 за наявност1, залежно в1д сорту, р1зних концентрацш ЮК (в межах 0,021,0 мг/л). Кр1м цього, першорядне значения для коренеутворення еспарцету мають штенсивтсть освгглення 1 температура. Так, в кл1матичнш камер1 з освгглешстю 25-30 тис. лк. 1 при температур! 20-25 °С регенеранти гинули на про-тяз1 тижня. Регенеранти, яш утримувалися в культуральлш шмнат1 з освгглетстю 2-3 тис. лк., мали вггрифишване лис-тя, утворювали поодинок1 кореш, як1 формували вторинний калус. Пагони-регенеранти, утримуват в розс1яному св1тл1 при температур! 18-20 °С, формували корень

<■':'■ , ... - ■ ■ , 4. Геи-еизимна система пероксидази i морфогенез

в культур! тканин pi3iuix генотишв еспарцету

Своечасну направлену регуляцио морфогенетичних процес1в в культур! in vitro шляхом корекдп xÍMÍ4Horo складу пожив-них середовищ можна здшснювати за умови наявносп чутливол тестово! системи, яка б дозволяла адентифжувати навггь He3Ha4Hi 3míhh морфогенезу ще до того, як вони проявляються в1зуально. Осшльки утворення калусу, чи закладка органогенних структур в калусц обумовлеш змшами ecnpecil окремих гешв геному, то маркерами цих процеив можуть бути ген-ензимш системи (Ко-нарев В.Г., 1985а, 19856). Багато автор1в пропонують використо-вувати ген-ензимну систему пероксидази як тест для контролю за морфогенезом у рослин (Андреева В.А., 1988; Rao K.V. et al., 1990; Забродина М.В. i íh., 1996). На жаль, число досладжених в цьому вщношевш Видав невелике, а тому залишаеться неясним, насшльки ушверсальною е ген-ензимна система пероксидази в рол1 KpnTepiio piBHH диференщацп клтш i морфогенезу.

Ми вивчали актившсть i множинт молекулярш форми пероксидази одночасно з цитолопчним анал1зом структури куль-тивованих in vitro тканин з метою з'ясувашш можливосп вико-ристання пероксидазного тесту для маркування окремих стадш калусоутворення i морфогенезу за культивування експланмв еспарцету, а Ьа!яе:'1. шдукщя калусоутворення; 2. стад1я сфор-мованого калусу; 3. шдукщя диференщацП в загальнш Maci не-диференщйованйх юптин; 4. стад in старшня калусу.

Виявлено, що ген-ензимна система пероксидази характеризуемся певними особливостями експреси в pisHi строки культивування тканин еспарцету in vitro, причому щ особливосп в значнш Mipi вйзначаються органною i-видовою належшстю експланту.

Встановлено значне шдвищення пероксидазно! активное^ в експлантах bcíx дослзджуваних генотишв еспарцету на протяз1 перших п'яти д1б ix культивування (мал. 4, 5, 6) в dopíbhhhhí з вихщними рослинами. Шдвищення пероксидазно! активное™ в

експлантах в перни дт 1х культивування сшвпадае з появою на електрофореграмах ново! середньорухомо! форми пероксидази з выносною електрофоретичною рухливктю (ВЕР)=0,50, не характерно! для донорних рослин.

25 т -•❖--Пшденноукрашський

20

ей К Ч

Б 15

' и 'х

§ Ю

■О <

5 О

0 5 10 15 20 25 30 дш

Мал. 4 М1жсортов1 особливост пероксидазно! активност1 в листовому калум еспарцету

У б1льшост! генотитв еспарцету пероксидазна актившеть продовжуе зростати до десято! доби культивування, що корелюе 1з строками утворення первинного калусу. Цитолопчт досл1д-ження показали, що в цей час розпочинаеться штенсивний под1л клггин. Вш супроводжуеться збшыпенням загально! к1лькост1 ММФ пероксидази до семи, в той час як в рант строки культивування виявляеться одна-три форми. Форма ферменту з ВЕР=0,43 може бути показником штенсивного под1лу клггин, осюльки вона присутня в калусних тканинах з 5 по 15-й день культивування, тобто в перюд найвищо! мистично! активность

Мал. 5 MijKcopTOBi особливосп пероксидазшн активноста в ко-реневому Kanyci еспардету

—О - - Пшдешюукрашсышй —D—Агат

Мал. 6 Шжсортов1 особливост1 пероксидазно'г активноста в ка-лус1 з гшокотилю еспардету

В наступш, б1лып тэт строки культивування у бшьшоста ге-нотитв еспарцету за IX утримання без пересадки на шип поживш середовища спостер1гаеться зниження пероксидазно1 активносп. Щ 61ох1м1чш змши сшвпадають з поступовим потемншням 1 ста-ршням калусних тканин. Однак, кр1м зазначено! тенденцп до загального зниження прол1феративно1 активности клтга калусу, в окремих культурах вщбуваеться закладка органогенних структур, що супроводжуеться новим шдвигценням пероксидазног активность Останне спостер1галось в калусах, отриманих з гапокоти-ля та кореня сорту Мустанг, а також гшокотиля генотипу В-5 3070 на тридцятий день IX культивування. Саме щ калуси в1др1зня-ються високим регенерацшним потенщалом.

Встановлено, що спрямовашсть морфогенезу в калусних тканинах певним чином корелюе з р1внем пероксидазно! активность Так, б1лын висока актившсть пероксидази виявлена в калусах, отриманих на середовипц ШХ з 1 мг/л БАП та 0,001 мг/ л 2,4-Д. Цитологачний анал1з калумв, отриманих на цьому сере-довипц виявив закладку в них проембр1ональних структур. Знач-но нижчу пероксидазну актившсть мають та калуси, в загальнш мас1 яких розпочинаеться пагоневий органогенез. Ця зако-ном1ршсть дае змогу запропонувати використання показника пероксидазно! активност! для ощнки морфогенетичного потенц-1алу калусних тканин, як1 передбачаеться використовувати для вщцлення протопластав. Виходячи з отриманих результатов, мож-на припустити, що використання листових пластинок рослин еспарцету для отримання протопластав не дозволить отримати юцтини, здатщ до подолу, утворення мжроколонш 1 регенерантав. Саме на це вказуе низька актившсть пероксидази в листках до-норних рослин еспарцету. В той же час первиний калус в1др1зняеться високою пероксидазною актившстю, що може св1дчити про прискорення певних метаболиних процетв в його юптинах, зв'язане з утратою шптшшо1 спещашзацп. Використання таких клхтин для отримання протопластав еспарцету може сприяти бЬльш високш життездатностх останшх. . л

Слщ пщкреслити, що тканини, яю. культивуються на пожив-ному середовшщ з 2,4-Д, мають значно вищу пероксидазну ак-тивтсть, шж на середовищах з шшими ф1з1олопчно активними речовинами, але повздстю втрачають свою спещал1защю. Тривала шкубащя тканин еспарцету на поживному середовшщ з 2,4-Д стимулюе розтягування клтш, теля чого вони втрачають здатшеть до регенераци. Тому найбьпып перспективним шдходом в робоп з протопластами еспарцету е видшення 1х з первинного калусу, утвореного за наявнект 2,4-Д, з наступним 1х культивуванням на поживних середовищах, що мктять цитокшши БАП i зеатин-рибозид, яш стимулюють органогенн1 процеси.

висновки

1. Розроблено технолопю культивування тканин та шптин еспарцету i вивчено особливост1 морфогенезу i регенераци рос-лин in vitro у pi3HHx форм еспарцету в1тчизняно1 селекци.

2. Процеси калусоутворення, морфогенезу i регенераци у дослщ-жуваних рослин визначаються видовою i сортовою належнштю.

3. Актившсть i спектри множинних молекулярних форм перок-сидази являються показниками ступеню диференцшованост1 кл1тин в культур!, спрямованоси морфогенезу i морфогене-тичного потенщалу окремих copTiB еспарцету.

4. Розроблено умови ефективного вид^лення протопласпв з ме-зоф1лу листов еспарцету. Показано м1жсортов1 особливост1 юльккжого виходу протопласт1в.

5. Запропонована технолопя регенераци рослин еспарцету може ви-користовуватись для клонування цшних генотишв щех культури.

Список роб1т, опублшованих по тем1 дисертаци

1. Игнатова С.А., Задерей Н.С. Условия выделения протопластов из мезофилла листа эспарцета // Научно-технический бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института. - 1990. - № 1(75).- С.52-55.

2. Задерей Н.С. Формирование каллуса и регенерация растений эспарцета // Научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов. Чабаны. - 1991.- С.91.

3. Игнатова С.А., Задерей Н.С., Александрова Л.Г. Оптимизация условий регенерации растений эспарцета // Всесоюзная конференция " Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу". Черновцы. - 1991. - С.45.

4. Игнатова С.А., Задерей Н.С. Изучение условий выделения протопластов из мезофилла листа эспарцета // Материалы VI съезда УоГиС. Полтава. - 1992. - С.117-118.

5. Задерей Н.С., Игнатова С.А. Особенности пролиферации и регенерации тканей эспарцета// Методы биотехнологии в селекции сельскохозяйственных растений / Под ред. C.B. Бирюкова. - Одесса: СГИ. - 1992. - С.49-58.

6. Zaderej N.S. Morphogenetic processes in the tissue culture of sainfoin // International Symposium "Plant Biotechnology and Genetic Engineering". Kiev, the Ukraine.- 1994. - P.120.

7. Задерей H.С., Игнатова С.А., Тоцкий В.H. Множественные молекулярные формы пероксидазы и морфогенетические процессы у эспарцета при культивировании эксплантов // Цитология и генетика. - 1996, - т.75, № 2. - С.46-52.

Задерей Н.С. "Культивирование тканей и индукция морфогенеза in vitro у эспарцета (Onobrychis sp.)".

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25-клеточная биология. Селекционно-генетический институт УААН, Одесса, 1997.

Защищается 7 научных работ по теме диссертации.

Представляется к защите диссертация, которая содержит разработанную технологию культивирования тканей и клеток некоторых видов рода Onobrychis sp. Предложена методика выделения жизнеспособных протопластов эспарцета. Оптимизированы условия получения каллусных культур и индукции реге-нерационных процессов у ряда перспективных, с точки зрения дальнейшей селекционной работы, сортов эспарцета. Использование полученной in vitro культуры эспарцета в качестве моде-

ли для изучения механизмов клеточной дифференцировки и морфогенеза у эспарцета позволило получить новые данные о возможности коррекции этих процессов гормонами и другими компонентами питательной среды. Изучены видовые особенности экспрессии ген-энзимной системы пероксидазы в культуре эспарцета in vitro. Установлено, что отдельные, молекулярные формы этого фермента специфичны для определенных стадий дифференцировки клеток и морфогенеза, поэтому могут использоваться в качестве критериев уровня дифференцировки (пе-роксидазный тест).

Ключевые слова: эспарцет, протопласты, каллусные ткани, растения-регенеранты, маркеры морфогенеза, ген-энзимная система пероксидазы.

Zaderey N.S. "Cultivating tissues and the induction oi morphogenesis in vitro of the sainfoin (Onobrychis sp.)".

Dissertation for the academic degree of candidate of biological sciences, speciality 03.00.25-cell biology. Selection-genetics institute of UAAS, Odessa, 1977.

7 scientific works on the dissertation theme are defended.

There is submitted to the defending a dissertation containing the technology of cultivating tissues and cells of some species oí the genus Onobrychis sp. There have been proposed methods oJ selection of viable sainfoin protoplasts. The conditions of generating callus cultures and induction of regenerating processes in som< perspective from the viewpoint of further selecting sainfoin species have been optimized. Using obtained in vitro sainfoin culture as £ model for investigation of cell differentiation mechanisms anc morphogenesis of the sainfoin enabled to obtain new data on th< possibility of correcting these processes by hormones and othe] components of the nourishing medium. The genus peculiarities o: the gen-ensime system expression of the peroxidaze in the culture ii vitro of the saifoin have been investigated. It is found that somi molecular forms of this ferment are specific for definite stages o: cell differentiation and morphogenesis, so they can be used as thi criteria of the differentiation level (the peroxidaze test).

Key words: sainfoin, protoplasts, callus tissues, plants regenerante, morfogénesis markers, gen-ensime system of peroxidase