Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кристаллогенные свойства сыворотки крови как интегральный показатель адаптационных возможностей организма

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Кристаллогенные свойства сыворотки крови как интегральный показатель адаптационных возможностей организма"

На правах рукописи

Ковалева Лида Константиновна

Кристаллогенные свойства сыворотки крови как интегральный показатель адаптационных возможностей организма

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 АВГ 2014

Нижний Новгород - 2014

005551554

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава России.

кандидат медицинских наук Мартусевич Андрей Кимович

Дерюгина Анна Вячеславовна

доктор биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» Министерства образования и науки Российской Федерации, доцент кафедры физиологии и биохимии человека и животных.

Панфилов Алексей Борисович доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Вятская государственная

сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, зав. каф. диагностики, терапии, морфологии и фармакологии.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Нижний Новгород.

Защита состоится 30 сентября 2014 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.047.01 при ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации по адресу: 603107, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 97.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Автореферат размещен на сайте ВАК Минобразования и науки РФ http:// vak2.ed.gov. ru. и на сайте Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии wvvw.nnsaa.ru.

Автореферат разослан 25 июля 2014 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета

Q/t/erg&CfS

Иващенко М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Кровь представляет собой одну из важнейших систем жизнеобеспечения организма, обладающую рядом особенностей. Высокая митотическая активность гемопоэтической ткани обусловливает ее повышенную чувствительность к действию повреждающих факторов, а генетическая детерминированность размножения, дифференцировки, структуры и обмена веществ кровяных клеток создают предпосылки как для геномных нарушений, так и для изменений генетической регуляции (Быков В.Л., 2003).

Являясь связующим звеном в механизмах нейроиммуноэндокринной регуляции, система крови обладает высокодифференцированными функциями, которые четко распределены между ее различными элементами (Козлов В.А., 2001; Полунин И.Н., Наумова Л.И., Сердюков В.Г., 2007, 2010). Поэтому кровь - не просто саморегенерирующаяся структура, а сложный комплекс компонентов, включающихся в общую систему. При этом она работает на основе саморегуляции, индуцируемой конечным результатом деятельности морфофункциональной системы (Роуз М.Дж., Берлинер Н„ 2001; Павлова М.М., 2007; Дерюгина A.B., 2012).

Несколько десятилетий назад была впервые изучена способность сыворотки крови к формированию определенной картины при дегидратации на стекле (Савина Л.В. с соавт., 1987; Каликштейн Д.Б. с соавт., 1990), что положило начало масштабным исследованиям в данной области биомедицины. Этими работами подтверждено, что исследование кристаллогенной активности сыворотки крови, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения ее научно-практической значимости (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001; Орлов Б.Н. с соавт., 2002; Пахмутов И.А. с соавт., 2004, 2005) и потенциальной диагностической ценности (Потехина Ю.П., 2004; Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2004; Обухова Л.М., 2010; Яхно Т.А., 2011). В то же время единичны исследования по изучению границ физиологической вариабельности кристаллизации жидких биологических сред (Денисов А.Б., 2007; Мартусевич А.К., КамакинН.Ф., 2007; Воробьев A.B., Мартусевич А.К., Перетягин С.П., 2008). Недостаточно полно изучено возможное влияние функционального состояния организма на результат кристаллизации рассматриваемой биологической жидкости (Мартусевич А.К., Сафарова Р.И, 2007; Мартусевич А.К., 2008). Несмотря на это, ранее высказывались предположения о потенциальной способности кристаллизации биологических жидкостей выступать в качестве индикатора адаптации организма, тем не менее данная методология была реализована только в отношении некоторых жидких

биосред человека (Волчецкий А.Л., 1999).

Следует отметить, что абсолютное большинство публикаций в рассматриваемой области касаются изучения характера дегидратационной структуризации биологических субстратов организма человека, тогда как биосредам животных уделяется существенно меньше внимания (Громова И.П.. 2005; Стекольников A.A. с соавт., 2009). Кроме того, единичны сообщения о видовых особенностях их кристаллизации (Мартусевич А.К., Жданова О.Б.,

2006; Обухова Л.М., 2010). С другой стороны, даже имеющиеся работы позволяют ' подтвердить диагностическое значение исследования кристаллогенных свойств биологических жидкостей, прежде всего — сыворотки крови, в ветеринарной и экспериментальной медицине (Пахмутов И.А. с соавт., 2004, 2005; Мартусевич А.К. с соавт., 2009; Анашкина А.А., 2012). В связи с этим, целесообразно проведение анализа кристаллогенной активности сыворотки крови животных и человека в аспектах видовой специфичности и адаптации к различным стрессирующим воздействиям. Данная работа является попыткой решения этих проблем.

Цель исследования: изучить кристаллогенные свойства сыворотки крови животных и человека в сравнительном аспекте и оценить адаптивность их ответа на некоторые стрессирующие воздействия.

Задачи работы:

1.Сформировать и апробировать комплекс методов исследования собственной и инициированной кристаллизации образцов сыворотки крови некоторых видов животных.

2.Провести сравнительное изучение собственной и инициированной кристаллизации сыворотки крови животных и человека.

3. Сопоставить изменения кристаллогенных свойств сыворотки крови животного и человека на физическую нагрузку и острый травматический стресс (термическую травму).

Научная новизна. Впервые с помощью визуаметрии, биогравиметрии и спектрометрии получены сравнительные данные о кристаллогенной активности сыворотки крови у животных различных видов и человека. Установлены диапазоны их физиологической вариации. Представлены сведения о характере реакции крови человека и животного на физиологический стрессор (физическая нагрузка) по ее способности к собственной и инициированной кристаллообразователем структуризации. На основании этого расширены представления о видовых особенностях адаптации млекопитающих к стрессирующим воздействиям. Продемонстрированы сдвиги физико-химических характеристик сыворотки крови при травматическом стрессе у животных и человека.

Научно-практическая значимость.

Результаты работы позволяют получить объективные данные о видовых особенностях кристаллогенных свойств сыворотки крови человека и некоторых видов животных, что может служить базисом для разноплановых экспериментальных и клинических исследований, а также разработки новых диагностических технологий, основанных на анализе кристаллогенных свойств рассматриваемого биологического субстрата.

Полученные данные позволяют уточнить значимость оценки характера дегидратационной структуризации образцов сыворотки крови как одного из индикаторов адаптации к стрессорам различного происхождения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Кристаллогенные свойства сыворотки крови являются видо- и субстрат-специфичной характеристикой данной биологической жидкости, косвенно

отражающей функциональное состояние и адаптационные возможности организма животных и человека при воздействии стресс-факторов.

2. Действие физиологических стрессоров приводит к значимому, дифференцированному, но кратковременному (адаптивному) изменению показателей собственной и инициированной кристаллизации сыворотки крови.

3. По сравнению с физиологическими воздействиями травматический стресс сопровождается более существенными и продолжительными (дизадаптивными) сдвигами ее кристаллогенной активности.

Апробация работы.

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на VI Междунар. научн. конф. «Системный анализ в медицине» (Благовещенск, 2012), II Междунар. конф. «Процессы самоорганизации в высыхающих каплях многокомпонентных жидкостей: эксперименты, теории, приложения» (Астрахань, 2012), Первой Всеросс. научн. конф. молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), Междунар. конф. молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика-13» (Пущино, 2013), XV научно-практ. конф. с междунар. участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2014), VIII Междунар. научн. конф. «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация как форма самоорганизации вещества» (Иваново, 2014).

Реализация результатов исследования

Разработанные технологии используются при проведении научных исследований в Кировской государственной медицинской академии, Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии. Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс профильных кафедр Кировской государственной медицинской академии, Вятской государственной сельскохозяйственной академии и Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии.

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 161 странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Список литературы включает 222 источника, в том числе 117 - отечественных и 105 - зарубежных авторов. Диссертация содержит 12 таблиц и 33 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Работа выполнена на базе ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Общий объем исследований и формирование групп обследуемых. В соответствии с целью и задачами исследования было произведено изучение кристаллизации сыворотки крови животных (крыс, мышей, кроликов, собак,

свиней и коров) и человека. Для этого запланированы и выполнены следующие этапы работы:

A. Изучение видовых особенностей дегидратационной структуризации сыворотки крови животных и человека.

Данный фрагмент работы включал изучение собственной и инициированной кристаллизации сыворотки крови крыс линии Вистар (п=30), мышей линии Блэк (п=30), свиней (п=25), кроликов (п=20), собак (п=20) и коров (п=20). Результаты исследования были сопоставлены с кристаллограммами и тезиграммами биожидкости здорового человека (п=50). Анализ проводили, используя как морфологические и визуаметрические подходы, так и спектрометрию фаций. Всего на данном этапе выполнено 170 исследований.

Б. Моделирование стресса на животных.

Данный раздел работы был выполнен на нелинейных белых крысах-самцах (п=30), разделенных на 3 равные по численности группы, первая из которых была контрольной, у животных второй моделировали физическую нагрузку плаванием, а крысам третьей группы вводили адреналин (0,1 мл/кг). У животных основных групп получали образцы крови (до начала эксперимента, через 15, 30, 60, 120 мин и через 24 часа после воздействия), у интактных крыс - однократно. Осуществляли визуаметрический анализ результатов кристаллоскопии и тезиграфии. На данном этапе проведено 130 исследований.

Термическую травму моделировали на 30 крысах линии Вистар по собственной методике (патент РФ №2408081 от 27.12.2010 г.), нанося комбинированный ожог нагретым телом на площади 20% поверхности тела (экспозиция - 4-5 е.). Изучали кристаллогенные и инициирующие свойства сыворотки крови животных через 1 час, 1, 3 и 7 дней после нанесения травмы с помощью технологий визуаметрии и спектрометрии кристаллоскопических и тезиграфических фаций указанных биологических жидкостей. Всего на данном этапе было проведено 240 исследований.

B. Оценка кристаллостаза сыворотки крови практически здоровых людей в состоянии покоя и в условиях эу- и дистресса.

Для осуществления данного этапа у 50 добровольцев получали образцы крови (с дальнейшим отделением сыворотки), кристаллоскопические и тезиграфические фации которых исследовали с помощью морфологических, визуаметрических, спектроскопических методов, а также акусто-механического импеданса, биогравиметрии и протеогравиметрии. На данном этапе проведено 150 исследований. Физиологический стрессор (физическую нагрузку) моделировали у 35 добровольцев, у которых двухкратно получали кровь (в спокойном состоянии и после нагрузки - суммарно 210 исследований). В качестве модели использовали тест Р\УС 170.

На последнем этапе нами выполнено исследование характера собственной и инициированной кристаллизации пострадавших с ожогами И-Ша степени (п=32) на площади более 10% поверхности тела на 7-10 сутки с момента получения травмы. Всего проведено 160 исследований.

Таким образом, в основу проведенного исследования легли результаты изучения образцов сыворотки крови, полученных от 215 животных (90 крыс, 30

мышей, 25 свиней, 20 кроликов, 20 собак и 20 коров) и 127 людей, в том числе 32 пациентов с ожогами. В целом, выполнено 960 исследований.

Биокристалломные методы исследования сыворотки крови.

Пробоподготовка кристаллоскопических и тезиграфических фации. На предварительно обезжиренное, промытое и просушенное предметное стекло наносят полученные на предыдущем этапе образцы биологического материала в объеме 0 1-0 2 мл. В дальнейшем для получения фации биосубстрата производится дегидратация микропрепарата в естественных условиях без ускорения процесса кристаллообразования (температура 18-20 С, влажность 5070%).

Исследование акустомеханического нмпеданса высыхающих капель

(Яхно ТА с соавт., 2009). Для регистрации динамических характеристик структуризации высыхающих капель использовали специальный программно-аппаратный комплекс (Институт прикладной физики РАН). Капля исследуемои жидкости высыхала на поверхности кварцевого резонатора, совершавшего сдвиговые колебания с постоянной частотой 60 КГц. Регистрируемым сигнал автоматически пересчитывался в единицы акустомеханического импеданса (АМН) и отражался на дисплее в режиме реального времени. Все сравниваемые жидкости тестировали при одинаковых внешних условиях.

Биогравиметрия и протеогравиметрия (Мартусевич А.К. с соавт., 2010). Процедура выполнения исследования включает регистрацию продолжительности интервалов времени, в течение которого происходит убывание каждой единицы массы образца (до достижения стабильного веса). Предварительно фиксировали исходное значение показателя. Биогравиметрические исследования производились на весах ВК-ЗШ.1. Точность взвешивания составляла 0,001 г., а погрешность измерения - 0,0005 г.

Биогравиметрический коэффициент рассчитывали по формуле:

БГК=^-

™тах '

где БГК - биогравиметрический коэффициент, ттах - масса анализируемой капли до начала высыхания, Тполн - полное время высыхания образца.

Для протеогравиметрического коэффициента, оцениваемого на основании измерения динамики ширины краевой зоны в процессе высыхания образца, формула принимает следующий вид:

D

ПГК =

Т

ПОЛИ

где ПГК - протеогравиметрический коэффициент, D„ - ширина краевой зоны капли по окончании высыхания, Тпол„ - полное время высыхания образца.

Визуальная морфометрня кристаллоскопических и тезиграфических фаций (Мартусевич А.К., Гришина A.A., 2009). Для описания Результата собственного и инициированного кристаллообразования биосубстратов применялась новая система критериев, исключающая зависимость оценки от IZ биоматериала и конкретных структур фации. Для кристаллограмм параметры включали основные показатели [индекс структурности (ИС),

кристаллизуемость (Кр); степень деструкции фации (СДФ); выраженность краевой белковой зоны (Кз)] и дополнительные параметры [тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур (ТВ); равномерность распределения кристаллических элементов фации (R); степень выраженности ячеистости фации (С); выраженность отдельных зон кристаллизации (Z); индекс хаотичности (ИХ); рельефность текстуры (Т)].

Для исследования тезиграмм использовали основной тезиграфический коэффициент (Q) или тезиграфический индекс (ТИ); коэффициент поясности (Р); кристалличность (К), степень деструкции фации (СДФ); выраженность краевой белковой зоны (Кз), индекс хаотичности (ИХ); равномерность распределения кристаллических элементов фации (R); степень выраженности ячеистости фации (С); выраженность отдельных зон кристаллизации (Z); рельефность текстуры (Т)]

Спектрометрия кристаллограмм и тезиграмм (Мартусевич А.К. с соавт., 2009). Исследование спектрометрических характеристик фаций выполнялось на спектрофотометре PowerWave XS (США). Результатом анализа являются значения оптической плотности при длине волны 300, 350 и 400 нм. Для нивелирования погрешности измерения уровень оптической плотности образца определяли с учетом данных спектрометрии чистого стекла (для кристаллограммы) или фации базисного вещества (для тезиграммы).

Исследования с участием животных и людей одобрены локальным этическим комитетом КГМА, соответствовали Хельсинской декларации (2000), «Правилам клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Все лица (их законные представители), участвующие в исследовании, давали информированное согласие. Эксперименты с использованием животных проводились с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (№86/609/ЕЕС, Страсбург, 1986). Все животные проходили карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение не менее 14 суток. Содержание животных и экспериментальные вмешательства осуществляли согласно приказу Минздрава СССР №775 от 12.08.1977 г. Животных кормили натуральными кормами в соответствии с утвержденными нормами.

Расчеты выполняли с помощью лицензионной программы SPSS 16.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Е-критерий Стьюдента и Н-критерий Краскала-Уоллеса.

Результаты собственных исследований и их обсуждение 1. Изучение кристаллогенных свойств сыворотки крови животных.

Проведено сопоставление образцов сыворотки крови крыс, мышей, кроликов, свиней и коров. Микропрепарат биосреды крысы образован минимальным количеством одиночно-кристаллических структур, а также регулярными разломами, распространяющимися на весь диаметр фации, фрагментирующими образец на равные небольшие отдельности. Необходимо

подчеркнуть слабую текстурированность капли сыворотки крови. Кроме того, для кристаллограмм сыворотки крови крыс характерны минимальный уровень деструкции структурных элементов и ячеистости, тогда как в фациях биоматериала мыши обнаруживается достаточно высокий уровень деструкции кристаллов и аморфных тел, сочетающийся со значительной выраженностью ячеистости (табл. 1). Краевая зона исследуемого биосубстрата крыс имеет больший диаметр, чем аналогичная в фациях сыворотки крови мышей (р<0,05).

Таблица 1

Кристаллоскопический «паттерн» сыворотки крови мышей, крыс и кроликов-

' Вид животных___

Параметр

Индекс структурности

Кристаллизуемость Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел

Степень деструкции фации

Четкость краевой зоны

Крыса (п=30)

1,15*0,12 0,37±0,14

Оттеснение

0,30*0,12

2,56*0,39

Мышь (п=30)

0,46*0,11*

1,20*0,19*

Налипание

1,74*0,24*

1,72*0,25*

Кролик (п=20)

0,64*0,10*

1,68*0,19*

Налипание

1,14*0,18*

1,56*0,20*

Примечание: * - уровень статистической значимости различий р<0,05

В фациях сыворотки крови кроликов обнаруживается значительное количество мелких одиночных кристаллов, краевая зона достаточно широка, но умеренно отграничена от центральной.

Особую картину свободной кристаллизации удалось обнаружить при исследовании образцов сыворотки крови здоровых половозрелых свиней. Так, кристаллоскопическая фация данной биосреды отличается низкои степенью отграниченности текстуры от подложки, значительным диаметром краевой зоны, фрагментированной многочисленными разломами. Центральная зона полностью образована монокристаллами, равномерно распределенными по данной части фации. Анализ данных визуаметрии по большинству показателей установил наличие значимых вариаций (табл. 2).

Таблица 2

Кристаллоскопический «паттерн» сыворотки крови собак, коров и свиней—_

Параметр

Индекс структурности Кристаллизуемость

Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел

Степень деструкции фации

Четкость краевой зоны

Вид животных

Собака(п=20)

1,24*0,14

2,10*0,12

оттеснение

0,74*0,15

1,78*0,14

Корова(п=20)

0,66*0,11*

2,67*0,24*

Налипание

0,57*0,16

2,31*0,16*

Свинья (п=25) 1,03*0,11*

2,34*0,21

Налипание

1,18*0,14*

2,11*0,15

Примечание: * - уровень статистической значимости различий р<0,05

Высушенные образцы сыворотки крови свиней и коров отличает высокий уровень кристаллизуемости (табл. 2), причем сложность структуропостроения выше у коров, в кристаллограммах которых многочисленны дендриты. Также для животных обоих видов характерна широкая краевая зона.

В целом, визуаметрия кристаллограмм сыворотки крови животных продемонстировала видовые особенности кристаллизации биосубстрата.

Следующим компонентом исследования является анализ инициирующей активности биологического субстрата. Визуальное описание тезиграфических фаций сыворотки крови человека и рассмотренных видов животных позволяет выявить существенные различия в характере инициированной кристаллизации изучаемой биосреды у представителей разных видов. Тезиграфический микропрепарат сыворотки крови крысы имеет сходный с характерным для биосреды человека общий план строения, однако имеет ряд особенностей. В их числе наличие регулярных дугообразных разломов, распространяющихся в умеренно выраженную промежуточную и центральную зоны, в некоторых. случаях - радиальных; отсутствие четкого разграничения зон фации; меньшая степень деструкции элементов. Установлено, что специфичными характеристиками тезиграммы сыворотки крови животных данного вида являются слабая выраженность краевой и промежуточной зон фации за счет относительного превалирования центральной, представленной как одиночно-кристаллическими, так и дендритными структурами, покрывающими все поле зрения. Особенностью инициированной кристаллизации сыворотки крови мыши служит отсутствие разломов во всех зонах образца.

Таблица 3

Тезиграфический «паттерн» сыворотки крови мыши и крысы в норме (базисное _вещество - 0,9% раствор хлорида натрия)_

Параметр Вид животных

Крыса (п=30) Мышь (п=30) Кролик (п=20)

Основной тезиграфический коэффициент 1,28±0,14 1,79±0,12* 1,86±0,20*

Кристалличность 1,65±0,17 1,21±0,13* 0,87±0,14*

Четкость краевой зоны 2,79±0,26 1,48±0,15* 2,71±0,21

Степень деструкции фации 0,84±0,10 0,37±0,12* 1,28±0,13*

Примечание: * - уровень статистической значимости различий р<0,05

Сведения, полученные при визуальной оценке тезиграфического теста, верифицированы путем применения системы полуколичественных критериев (табл. 3 и 4). Так, необходимо подчеркнуть существенно более высокую инициирующую способность изучаемой биосреды коров и свиней по отношению к раствору хлорида натрия по сравнению с таковой у других видов животных (по значениям основного тезиграфического коэффициента — р<0,05).

Таблица 4

Тезиграфический «паттерн» сыворотки крови мыши и крысы в норме (базисное _вещество - 0,9% раствор хлорида натрия)

Параметр

Основной тезиграфический коэффициент

Кристалличность

Четкость краевой зоны

Степень деструкции фации

Вид животных

Собака (п=20)

2,07±0,21

1,54±0,13

2,04±0,12

0,76±0,14

Корова(п=20)

2,74±0,21*

1,6б±0Д5

1,67±0,18*

1,51±0,14*

Свинья (п-25)

2,26±0,16*

1,17*0,14*

2,59±0,17*

0,83±0,12*

Примечание: * - уровень статистической значимости различий р<0,05

Данный факт может быть частично объяснен большими габаритами кристаллов, формирующих тезипэафическую фацию бисубстрата у последних, относительно аналогичных у мышей, о чем свидетельствует соотношение уровня кристалличности у исследуемых животных (р<0,05). На значимое участие кристаллопротеома в кристаллизации образцов сыворотки крови косвенно указывает больший относительный диаметр краевой белковой зоны микропрепаратов крыс по сравнению с таковыми мышей (р<0,05). Так, ее достоверно более высокий уровень в тезиграммах сыворотки крови крыс дополнительно верифицирует обнаруженную тенденцию к формированию в динамике высыхания микропрепарата определенных «островков» отдельных типов при окончательной дегидратации трансформирующихся в ячеистость. Превалирование структур кристаллического и псевдокристаллического строения над аморфными телами, с наших позиций, детерминирует более высокую степень деструкции фации биосубстрата мышей по отношению к таковой для образцов исследуемой биосреды других видов животных (р<0,05).

*

-ь --1

* —I—

¡и— — ¡'¿.¿Г. *

-

6350

Рис. 1. Оптическая плотность кристаллограмм сыворотки крови крыс и мышей в норме (* - уровень статистической значимости различий р<0,05)

Вышеперечисленные исследования базируются на визуальном изучении кристаллоскопических и тезиграфических фаций. Поэтому для верификации

видовых особенностей кристаллогенеза сыворотки крови нами впервые применен биоспектрометрический анализ микропрепаратов, позволяющий оценивать оптическую плотность образцов высушенных биожидкостей.

При изучении уровня оптической плотности кристаллограмм сыворотки крови крыс и мышей установлено, что данный показатель статистически значимо выше у образцов мышей (р<0,05), причем подобная закономерность прослеживается на всех рассмотренных длинах волн (рис. 1). Это обстоятельство, по нашему мнению, объясняется более высокой плотностью кристаллических структур в микропрепаратах биосубстрата мышей, что ранее подчеркивалось при визуаметрии их кристаллоскопических фаций.

н-

Рис. 2. Результат спектрометрии тезиграфических фаций сыворотки крови крыс и мышей в норме (базисное вещество - 0,9% раствор хлорида натрия; * - уровень статистической значимости межвидовых различий р<0,05)

Между уровнем оптической плотности микропрепаратов и значениями соответствующих оценочных показателей визуаметрии (индекс структурности, кристаллизуемость, равномерность распределения элементов по текстуре и выраженность ячеистости образца) выявлены статистически значимые положительные корреляционные связи средней и высокой силы (г= +0,618; +0,824; +0,497 и +0,531 соответственно; р<0,05 для всех корреляций).

Данные спектрометрии тезиграфических фаций сыворотки крови крыс и мышей, как и результаты их визуаметрии, свидетельствуют о наличии выраженных видовых различий инициированного кристаллообразования исследуемой биосреды данных лабораторных животных (рис. 2). Так, значимые вариации оцениваемого параметра обнаружены на длинах волн 300 и 350 нм (р<0,05). Их корреляция с морфометрическими показателями тезиграфии (основной тезиграфический коэффициент, коэффициент поясности, кристалличность и выраженность ячеистости) позволила выявить наличие статистически значимых положительных корреляционных связей средней и высокой силы (г= +0,804; +0,420; +0,789 и +0,492 соответственно; р<0,05)

2. Биокристаллоскопическая оценка динамики кристаллизации сыворотки крови крыс при моделировании физиологического стресса

(плавание с утяжелением).

Известно, что в условиях чрезвычайной ситуации единои реакцией на раздражитель' является общий адаптационный синдром, направленный на мобилизацию резервных возможностей и перестройку гомеостатических механизмов (Селье Г., 1979). Даже в рамках универсальной адаптационной реакции воздействие конкретных агентов несет в себе черты специфичности, что детерминирует соответствующие особенности ответа организма, в той или иной степени трансформирующие проявления адаптационного синдрома. В связи с этим, целью данного фрагмента работы служило изучение влияния физической нагрузки и введения адреналина на состояние системы крови крыс.

Интегральным показателем, характеризующим физико-химические свойства жидких сред организма, в том числе сыворотки крови, является их кристаллогенная стабильность (Мартусевич А.К., Гришина A.A., 2009; Мартусевич А.К., 2012). Наиболее четкая визуализация сдвигов кристаллогенного потенциала биожидкости возможна при использовании количественных параметров описания ее собствтногокристаллогенеза,----

% 150 -|

« 100 -о

» 50 -

О

* о

□ шшзние Мадреналин

15 мин 30 мин 60 мин 120 мин 1 сутки оремя после ооздейсгоия

1-й

бОмим 120МИМ Uvi"

А Кристаллизуемость образцов Б. Степень деструкции фации

Рис 3 Уровень кристашгазуемости и степени деструкции фации сыворотки крови крыс в постстрессовом периоде (в % от уровня интактных животных)

Кристаллизуемость, являясь основным количественным маркером способности биологического субстрата к формированию кристаллов, отражает активность процесса кристаллогенеза (рис. ЗА). Воздействие стрессирующих факторов на организм животного приводит к повышению уровня данного параметра в выполненном эксперименте относительно интактных крыс, причем менее значимое усиление кристаллогенеза наблюдается при введении адреналина (0,1 мкг/кг). Способствуя развитию типичной адаптационной реакции системы крови на стрессирующее воздействие, он вызывает умеренное повышение уровня кристаллизуемости рассматриваемой биосистемы по сравнению с аналогичным у интактных животных. Плавание в холодной воде привело к выраженному усилению кристаллизации, что может быть вызвано комплексом факторов, в числе которых общий адаптационный синдром; каскад

реакций, ассоциированных с низкотемпературным стрессом (Мартусевич А.К., Гришина А.А., 2009), а также повышением двигательной активности крыс с нарастанием лактацидемии. Последнее обусловлено тем обстоятельством, что молочная кислота и лактат натрия оказывают стимулирующее действие на кристаллогенез биожидкостей (Мартусевич А.К., Зимин Ю.В., 2011).

Правильность протекания процессов кристаллизации изучали с помощью оценки степени деструкции фации (рис. ЗБ). Данный параметр оставался выше показателя интактных животных на протяжении всего эксперимента. В группе, животные которой подверглись физической нагрузке, максимальная деструкция образца регистрировалась на 30-60-й минутах эксперимента с последующим снижением уровня параметра к суткам с момента начала эксперимента. Введение адреналина вызывало резкое усиление процессов деструкции уже через 15 минут после воздействия с дальнейшей редукцией к окончанию суток с момента наблюдения, однако изучаемый показатель оставался в рассматриваемой группе самым высоким на протяжении всего эксперимента.

В целом, динамика кристаллогенеза сыворотки крови визуализирует типичность ответа организма крысы на стрессирующие воздействия. В то же время введение адреналина и плавание сохраняют черты специфичности.

3. Изучение кристаллогенных и инициирующих свойств сыворотки крови крыс при моделировании травматического стресса.

В качестве модели дистресса, значимого для организма животного, был использован травматический стресс в форме контактного термического ожога.

В соответствии с данными рисунков 4 и 5, картины кристаллизации сыворотки крови здоровых животных и крыс с модельной термической травмой принципиально различны, что полностью подтверждают результаты визуаметрического анализа кристаллограмм и тезиграмм (рис. 6). Так, установлено, что контактный ожог способствует выраженному ингибированию собственного кристаллообразования биосреды, что проявляется достоверным снижением индекса структурности и нарастанием фрагментированности образующихся кристаллических элементов (р<0,05), визуализированной по уровню кристаллизуемое™ и степени деструкции образца.

Здоровое животное Модель термической травмы

Рис. 4. Кристаллограммы сыворотки крови крыс (увел. х56)

I

* Г*1

ш Щ

* ■ь — (& ЙЙ

- -Е-

Г*Г

а р ь 01*

Кристаллоскопия Тезиграфия

Рис. 6. Собственный и инициированный кристаллогенез сыворотки крови крыс в норме и при травматическом стрессе (1-е сутки наблюдения; * - уровень статистической значимости различий р<0,05; КТО - термический ожог)

В целом, на основании визуальной и морфометрической оценки кристаллогенных и инициирующих свойств сыворотки крови показано, при моделировании ожога они претерпевают существенные преобразования, причем частичное восстановление происходит лишь на 7-10 сутки после травмы. Это указывает на дизадаптивный характер данных сдвигов кристаллостаза биологической жидкости.

4. Биокристалломная характеристика сыворотки крови и других биологических жидкостей организма человека

Принципиальным является составление количественных «паттернов» свободного и инициированного кристаллообразования сыворотки крови здоровых взрослых людей. С этой целью нами проведено исследование

Эти данные согласуются с результатами тезиграфии, проведенной в осмотически и рН-нейтральной среде. О снижении инициаторного потенциала биожидкости свидетельствует уменьшение значений основного тезиграфического коэффициента О и коэффициента поясности Р, сопровождаемые резким повышением степени деструкции фации (р<0,05).

Здоровое животное Модель термической травмы

Рис. 5. Тезиграфические фации сыворотки крови крыс (базисное вещество ■ 0,9% раствор хлорида натрия; увел. х56)

характера кристаллизации указанного биоматериала 50 практически здоровых людей по отношению к других жидким биосредам (табл. 5).

Таблица 5

ТГрш^яштоскопический «паттерн» сыворотки --—^ — Сыворотка крови Слюна

Параметр

Индекс структурности Кристаллизуемость

Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел

Степень деструкции фации

Четкость краевой зоны

1,67±0,15

1,61+0,19

оттеснение

0,64+0,10

2,26+0Д8_

1,24+0,14*

1,44+0,13

налипание

0,71+0,34

1,47+0,25*

значения показателя,

Примечание: * - достоверность относительно характерного для сыворотки крови р<0,05

В соответствии с данными рисунков 4 и 5, картины кристаллизации сыворотки крови здоровых животных и крыс с модельной термической травмой принципиально различны, что полностью подтверждают результаты визуаметрического анализа кристаллограмм и тезиграмм (рис 6). 1ак, установлено что контактный ожог способствует выраженному ингибированию собственного кристаллообразования биосреды, что проявляется достоверным снижением индекса структурности и нарастанием фрагментированности образующихся кристаллических элементов (р<0,05), визуализированной по уровню кристаллизуемое™ и степени деструкции образца. Таблица 6

Тезиграфический «паттерн» некоторых биологических жидкостей здоровых людей (базисное веществ^О^раствор хлоридалитош^-^

Параметр

Основной тезиграфический коэффициент

Коэффициент поясности_ Кристалличность

Четкость краевой зоны

Сыворотка крови

1,80+0,16

1,72+0,15

2,17+0,24

2,57+0,21

0,38+0,28

Слюна

2,12+0,23

1,86+0,20

1,95+0,26

1,55+0,18*

0,78+0,32

Моча

2,29+0,30*

2,09+0,27"

1,46+0,18*

0,34+0,16*

0,91+0,23"

Степень деструкции фации___

Примечание: * - достоверность относительно значения показателя,

характерного для сыворотки крови р<0,05

Максимальным инициирующим эффектом обладают образцы мочи, а наименьшим среди оцениваемых биожидкостей - сыворотка крови (табл. 6), причем различия между данными биосубстратами по этому параметру достоверны (р<0,05). Аналогичные тенденции зарегистрированы по коэффициенту поясности микропрепаратов, что указывает на наибольший разброс компонентов по молекулярным массам в фациях мочи (р<0,05).

Важно подчеркнуть, что одним из наиболее постоянных признаков тезиграмм сыворотки крови человека является низкий уровень деструкции.

Таким образом, инициирующий потенциал, как и кристаллогенная активность, является субстрат-специфичной характеристикой сыворотки крови.

Таблица 7

Уровень оптической плотности кристаллоскопических фаций биожидкостей _ организма здорового человека (п=50)_

Длина волны, нм Значение оптической плотности, усл. ед.

Сыворотка крови Слюна Моча

300 0,363±0,073 0,595±0,102* 0,415±0,067

350 0,146±0,025 0,084±0,014* 0,108±0,024

400 0,086±0,021 0,049±0,011 0,040±0,018*

Примечание: * - достоверность относительно значения показателя, характерного для сыворотки крови р<0,05

Верификация обнаруженных количественных различий свободного и инициированного кристаллообразования исследуемых биосред проводилась спектрометрически. В результате этого получены спектрометрические «паттерны» кристаллограмм и тезиграмм изучаемых биообразцов, которые также могут быть использованы в качестве нормативов для различных задач диагностической биокристалломики (табл. 7 и 8). Установлено, что оптические характеристики микропрепаратов также существенно варьируют.

Таблица 8

Уровень оптической плотности тезиграфических фаций биожидкостей организма здорового человека (базисное вещество — 0,9% раствор хлорида __натрия; п=50) __

Длина волны, нм Значение оптической плотности, усл. ед. (М±ст)

Сыворотка крови Слюна Моча

300 0,517±0,044 0,381±0,054* 0,276±0,025*

350 0,198±0,030 0,117±0,012* 0,076±0,014*

400 0,056±0,022 0,048±0,009 0,034±0,012

Примечание: * - достоверность относительно значения показателя, характерного для сыворотки крови р<0,05

В целом, нами сформированы «паттерны» динамических и статических параметров собственного и инициированного базисными веществами кристаллообразования сыворотки крови, наиболее значимых для диагностики.

5. Особенности дегидратационной структуризации сыворотки крови человека при некоторых физиологических стрессирующих состояниях.

Нами проведена оценка кристаллогенной и инициирующей активности сыворотки крови 35 практически здоровых студентов-добровольцев (возраст 18-20 лет). У всех испытуемых получали кровь в спокойном состоянии, после

выполнения теста PWC 170 (Епифанов В.А., 2007) и через 2 часа после нее. Установлено что указанный физиологический стрессор способствует существенному преобразованию собственного кристаллообразования рассматриваемой биожидкости (рис. 7).

Рис 7 Результаты визуаметрии кристаллограмм сыворотки крови здоровых людей при физической нагрузке (здесь и на рис. 9-11: ФН-физическая нагрузка; «*» -р<0,05 по отношению к состоянию покоя)

При выполнении физической нагрузки изменения кристаллоскогшческой картины сыворотки крови были более отчетливыми и включали усложнение структурной организации кристаллических элементов (за счет преобладания дендритных кристаллических образований с минимальным количеством одиночных структур), увеличение их плотности в фации в сочетании с нарастанием степени их деструкции. Это проявилось в статистически значимом приросте уровня индекса структурности, кристаллизуемости и параметра СДФ соответственно (р<0,05). Кроме того, после осуществления велоэргометрической пробы наблюдали существенное расширение краевой зоны микропрепарата, приводящее к увеличению показателя выраженности последней (Кз), причем в этом случае указанная зона фации была шире не только по сравнению с фациями сыворотки крови, полученными в состоянии покоя но и в условиях экзаменационного стресса (р<0,05).

Следует отметить, что через 2 часа после физической нагрузки происходит практически полная нормализация кристаллогенной активности сыворотки крови, что позволяет охарактеризовать ответную реакцию данного параметра биологической жидкости на рассматриваемый стрессор как адаптивную.

Зафиксированные методом визуаметрического анализа

кристаллоскопических фаций сдвиги были верифицированы последующим их спектрометрическим исследованием при длинах волны 300, 350 и 400 нм. (рис 8) Установлено, что при физиологическом стрессе оптическая плотность кристаллограмм возрастает, причем в случае выполнения нагрузочного теста РШС 170 данная тенденция более отчетлива при всех использованных длинах волны статистически значимо отличаясь от уровня показателя,

зарегистрированного в состоянии покоя (р<0,05). Таким образом, спектрометрические данные позволяют подтвердить результаты визуаметрии кристаллоскопических фаций в состоянии покоя и в условиях стресс-реакции.

i

□ состояние покоя

С с(Шу после ФИ

■ через 120 мим после ФН

А 400

Рис. 8. Спектрометрические показатели кристаллоскопических фаций сыворотки крови здоровых людей при физической нагрузке

О состояние покоя

И сразу после ФН

■ через 120 мин после ФН

Рис. 9. Результаты визуаметрии тезиграмм сыворотки крови здоровых людей

при физической нагрузке

Также была проведена комплексная оценка инициирующих свойств сыворотки крови практически здоровых людей при реализации метаболического ответа на физическое напряжение (рис. 9 и 10). Выявлено, что, как и в отношении кристаллогенной активности биологического субстрата, в тезиграфическом тесте в условиях стресс-реакции наблюдали нарастание значений большинства визуаметрических параметров (рис. 9). В частности, по уровню основного тезиграфического коэффициента непосредственно после физической нагрузки регистрировали нарастание инициаторного потенциала биосреды, о чем свидетельствовало значимое увеличение данного параметра (р<0,05). ' Стрессирующий фактор также способствовал усложению формируемых кристаллических элементов в высушенных образцах биологической жидкости, на что указывало умеренное нарастание уровня

кристалличности (р<0,05 для обоих случаев). Аналогичная динамика имела место в отношении степени деструкции фации - маркера «правильности» кристаллогенеза. По нашему мнению, характер изменения этих параметров отражает общий компонент метаболического стресс-ответа.

Особенности краевой зоны микропрепарата дегидратированной сыворотки крови при воздействии изучаемого стрессирующего фактора в целом аналогичны обнаруженным для основного тезиграфического коэффициента, данный параметр статистически значимо возрастает после физическом нагрузки, снижаясь через 2 часа после нее (р<0,05).

Рис. 10. Результаты спектрометрического анализа тезиграфических фаций сыворотки крови здоровых людей при физической нагрузке

Приведенные сдвиги инициированного кристаллообразования сыворотки крови, как в случае кристаллоскопических фаций биологической жидкости, полностью подтверждаются результатами спектрометрического исследования (рис. 10). Так, при всех использованных длинах волны тезиграммы сыворотки крови демонстрируют более высокий уровень оптической плотности по сравнению с высушенными образцами биосреды, полученными от этих же

людей в спокойном состоянии (р<0,05).

Таким образом, тезиокристаллоскопическая картина сыворотки крови является чутким индикатором различных физиологических состояний, в том числе физической нагрузки, что находит отражение в морфологии высушенных микропрепаратов биожидкости.

6. Свободное и инициированное кристаллообразование сыворотки крови человека при травматическом стрессе.

Преобразования, аналогичные обнаруженным в отношении кристаллостаза животных при травматическом стрессе, выявлены и в отношении образцов биожидкостей человека при ожоговой болезни - результате термической травмы. Так, для дегидрации сыворотки крови пациентов с ожогами характерно ингибирование кристаллообразования, верифицированное путем применения комплекса методов биокристалломики. Анализ динамики формирования фаций позволил установить более позднее начало кристаллизации образцов при

травматическом стрессе и более медленные темпы ее протекания по сравнению с уровнем, характерным для здоровых людей (рис. 11).

кр

-иориа

--ожоговая болезнь

Рис. 11. Динамика показателей визуаметрии при кристаллизации сыворотки крови здоровых людей и пациентов с ожогом (Кр - кристаллизуемость, Кз -выраженность краевой зоны)

Сходные сведения получены при использовании двух тестов оценки динамики кристаллообразования сыворотки крови - биогравиметрии и протеогравиметрии, основанных на изучении массы образца и ширины краевой зоны в процессе высушивания микропрепарата соответственно (рис. 12).

БГК ПГК

Рис. 12. Биогравиметрический (БГК) и протеогравиметричский (ПГК) коэффициенты сыворотки крови практически здоровых людей и пациентов с ожогами (* - значимость различий р<0,05)

Рис. 13. Уровень акустомеханического импеданса собственной кристаллизации сыворотки крови здоровых (1) и обожженных (2) людей Аппаратная регистрация параметров кристаллогенеза, производимая на основании учета уровня акустомеханического импеданса (АМИ) высыхающих капель также позволила верифицировать ингибирование кристаллизации сыворотки крови пациентов при контактном ожоге, о чем свидетельствует

более позднее начало нарастание АМН и меньшая его амплитуда по отношению к кривой, полученной при анализе биосреды человека (рис. 13).

7. Анализ характера преобразования кристаллостаза сыворотки крови при различных стрессирующих воздействиях.

В целях обобщения результатов проведенных исследований был выполнен сравнительный анализ изменения кристаллогенных свойств сыворотки крови при действии стрессирующих факторов, носящий физиологический характер (физическая нагрузка) и приводящих к развитию патологии - ожоговой болезни (дизадаптивных). Кроме того, выделяли специфический и неспецифический компоненты трансформации кристаллостаза биосреды.

Таблица 9

Трансформация кристаллогенных свойств сыворотки крови при действии __стрессирующих факторов___

Стрессор Неспецифический компонент Специфический компонент

Животное (крыса) Человек

Физическая нагрузка Активация кристаллогенеза (увеличение Кр, ИС), умеренное нарастание СДФ, расширение краевой зоны Выраженная стимуляция кристаллизации биосреды со значительным расширением краевой зоны Умеренная активация кристаллогенной активности практически без изменения краевой зоны

Травматический стресс Выраженное нарастание СДФ, ингибирование кристаллогенных свойств, сужение краевой зоны фации, хаотизация разломов Умеренное ингибирование структуризации, сужение краевой зоны фации Крайне выраженное ингибирование кристаллогенеза (вплоть до тотального)с минимизацией краевой зоны

Установлено, что эу- и дистресс вызывают различные по интенсивности и направленности сдвиги изучаемых параметров гомеостаза биологической жидкости, причем у крыс и человека данные тенденции едины (табл. 9). Следует отметить, что как в отношении физической нагрузки, так и травматического стресса изменения включали неспецифические (в рамках общего адаптационного синдрома) и специфические черты.

В целом, можно заключить, что динамика кристаллогенных свойств сыворотки крови способна отображать адаптивность ответа организма на стрессирующие воздействия.

Выводы:

1. Применение комплекса биофизических методов исследования (визуаметрия и спектрометрия фаций, био- и протеогравиметрия, изучение

акустомеханического импеданса) позволяют полноценно описать особенности кристаллизации образцов сыворотки крови животных и человека.

2. Кристаллогенные и инициирующие свойства сыворотки крови животных (крыс, мышей, собак, кроликов, коров, свиней) и человека являются видоспецифичной характеристикой данной биологической жидкости. Максимальной кристаллогенной активностью обладает сыворотка крови свиней и коров (уровень кристаллизуемости - 2,34±0,21 балла и 2,67±0,24 балла соответственно), минимальной - мышей (1,12±0,19 балла), тогда как у человека данный параметр находится на промежуточном уровне (1,61±0,19 балла).

3. В условиях воспроизведения физиологического стрессирующего воздействия (физической нагрузки) кристаллогенная активность сыворотки крови существенно возрастает, о чем свидетельствует увеличение кристаллизуемости фаций более чем в 2,5 раза у крыс и в 1,4 раза - у людей. Обратимость этих изменений указывает на их адаптивный характер.

4. Введение адреналина вызывает нарастание кристаллизуемости образцов сыворотки крови, менее выраженное по сравнению с физической нагрузкой (не более чем в 1,5 раза относительно интактных животных), на фоне более значимого увеличения степегги деструкции фации.

5. При этом сдвиги собственггой и инициированной кристаллизации сыворотки крови крыс, индуцированные физической нагрузкой и введением адреналина, быстро и полноценно устраняются (в течение 2 часов после воздействия), что свидетельствует об адаптивности ответа рассматриваемого параметра биожидкости с учетом специфики стрессора.

6. Травматический стресс обуславливает более существенные по сравнению с физической нагрузкой нарушения кристаллогенных свойств сыворотки крови (многократное ингибирование свободного и инициированного кристаллогенеза с субтотальной деструкцией образующихся кристаллических структур) с последующей их частичной нормализацией (у животных - к 7-м суткам после травмы). Это указывает на дизадаптивный характер изменений кристаллизации биологической жидкости при действии данного стрессора.

Практические рекомендации:

1. Исследование кристаллогенных свойств сыворотки крови может использоваться в качестве индикатора адаптации организма животных и человека к различным стрессирующим воздействиям.

2. Данные о видовых особенностях собственной и инициированной кристаллизации сыворотки крови и их сдвигах при физиологических и патологических состояниях могут быть включены в учебные курсы физиологии, биофизики, биохимии и патофизиологии для студентов биологического, медицинского и ветеринарного профиля.

Список основных публикаций по теме диссертации:

(«*» - публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ)

1. Ковалева Л.К., Зиновьев Ю.В., Рябов Н.В., Козлов С.А., Федоровская Н.С. Гематологическая характеристика инбредной линии мышей AKR/J // Мат. междун. мед. конгресса «Санкт-Петербургские чтения». - 2007. - С. 31.

2. * Федоровская Н.С., Ковалева JI.K., Поздеев Н.М., Дьяконов Д.А., Федоровский A.M. Сравнительная оценка морфометрических показателей функциональных зон селезенки нелинейных лабораторных мышей и мышей линии AKR/JY // Морфология. - 2010. - Т. 137. - С. 201.

3. Мартусевич А.К., Кривоногова Е.В., Жукова Н.Э., Камакина И.Н., Ковалева JI.K. Биокристалломика жидких сред организма как платформа для инновационных диагностических и лечебных технологий // Мат. Первой Всеросс. научн. конф. молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - Москва, РАМН. - 2012. - С. 303-304.

4. * Мартусевич А.К., Кривоногова П.Л., Ковалева JI.K. Изучение пространственно-временной организации кристаллогенеза биологических жидкостей как диагностический тест // Вестник РУДН. Серия Медицина. -2012.-№7.-С. 153-154.

5. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф., Жданова О.Б., Симонова Ж.Г., Ковалева JI.K., Шубина О.И., Кривоногова П.Л. Эволюция представлений о кристаллогенных свойствах биологических жидкостей и методологии их изучения // Вятский медицинский вестник. - 2013. - №3. - С. 30-35.

6. * Мартусевич А.К., Ковалева Л.К. Особенности дегидратационной структуризации сыворотки крови человека при некоторых физиологических состояниях // Врач-аспирант. - 2013. - №6. - С. 104-109.

7. Мартусевич А.К., Ковалева Л.К., Симонова Ж.Г., Перетягин С.П., Шубина О.И. Адаптологические аспекты биокристалломики // Тез. докл. VIII Межд. научн. конф. «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация как форма самоорганизации вещества». - Иваново. - 2014. - С. 76.

8. Шубина О.И., Ковалева Л.К., Олашина Ю.В. Кристаллогенные свойства сыворотки крови при введении в нее криопротектора // Сб. тр. XV научно-практ. конф. с междунар. участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке». - Киров. -2014. - С. 520-521.

Список сокращений

АМИ - акустомеханический импеданс БГК - биогравиметрический коэффициент ИС - индекс структурности Кз - выраженность краевой белковой зоны Кр - кристаллизуемость

ПГК - протеогравиметрический коэффициент СДФ - степень деструкции фации Q - основной тезиграфический коэффициент Р - коэффициент поясности