Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дегидратационная структуризация биологических жидкостей в норме и при паразитозах

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Дегидратационная структуризация биологических жидкостей в норме и при паразитозах"

На правах рукописи

Мартусевич Андрей Кимович

Дегидратационная структуризация биологических жидкостей в норме и при паразитозах

03.02.11- паразитология 03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

21 НОЯ 2013

Москва-2013

005538762

005538762

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Кировская ГМА Минздрава России

Научные консультанты:

доктор биологических наук, доцент О.Б. Жданова доктор медицинских наук, профессор Н.Ф. Камакин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.И. Бенедиктов доктор биологических наук, профессор A.C. Корягин доктор биологических наук, доцент Т.Н. Сивкова

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Курский государственный университет»

Защита диссертации состоится "11" декабря 2013 г. в И— часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 006.011.01, созданного на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина»

Адрес: 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС

2013 Г.

Ученый секретарь Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, д. б. н., профессор

Бережко Вера Кузьминична

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время показано, что современные постгеномные технологии (метаболомика, геномика, протеомика, метабономика) имеют широкие возможности для определения качественных и количественных изменений метаболических процессов в организме человека и животных (Лохов П.Г, Арчаков А.И., 2008). Концепция индивидуального «метаболического профиля», который мог бы отражать состав биологических жидкостей, была впервые предложена Роджером Вильямсом в конце 40-х годов прошлого века. Однако только технологический прогресс 60-х и 70-х годов прошлого столетия сделал возможным количественное измерение метаболических профилей (Preti G., 2005). Термин «метаболический профиль» был введен в 1971 году Хорнингом после того, как удалось показать, что газовая хромато-масс-спектрометрия может быть использована ' для определения соединений, представленных в моче и тканевых экстрактах человека (Griffiths W.J., Wang, Y., 2009).

Термин «Metabolomics» впервые было опубликован в 1998 г. в книге «Effect of Slow Growth on Metabolism of Escherichia coli, as Revealed by Global Metabolite Pool (metabolom) Analysis». Согласно существующим представлениям, метаболомика - это «систематическое изучение уникальных химических «отпечатков пальцев», специфичных для процессов, протекающих в живых клетках» (Daviss, 2005). Метаболом представляет собой совокупность всех метаболитов, являющихся конечным продуктом обмена веществ в клетке ткани, органе или организме (Jordan K.W. et al., 2009). В то время как данные об экспрессии мРНК генов и данные протеомного анализа не раскрывают полностью того, что может происходить в клетке, метаболические профили могут дать мгновенный «снимок» физиологических процессов в ней (Novotny et al., 2008). Токсические эффекты, генетические и соматические заболевания могут проявляться нарушением синтеза некоторых белков, приводящим к изменению управления биохимическими процессами, что в свою очередь отражается на соотношении концентраций многих эндогенных веществ в потоках биологических жидкостей (Машко C.B. с соавт., 2002). Нарушение динамического равновесия в биологических жидкостях организма, вызванное заболеванием или интоксикацией, изменяет их качественный и/или количественный состав. Для установления факта происходящих изменений необходимо одновременно определить множество метаболитов в широком диапазоне концентраций в плазме крови, моче, желчи и других биосубстратах.

Начиная с 2002 г., активно развивается метабономика — новая технология количественного измерения динамического мультипараметрического метаболического ответа живых систем при патофизиологических или генетических изменениях (Morrow Jr., John К., 2010). Различие между метаболомикой и метабономикой состоит в том, что метаболомика - это изучение метаболизма в клетке и ткани, а метабономика - подход к изучению метаболизма при использовании биологических жидкостей как индикаторов происходящих (патологических) процессов (Nicholson J.K. et al., 1999, 2006).

Основными инструментами новых технологий являются ядерно-магнитный резонанс, масс-спектрометрия, новейшие тандемные инструментальные методы, в то время как спектр экономичных и относительно простых методов метаболомики крайне узок (Meynial-Salles I. et al., 2005). На сегодняшний день метаболомика все ещё остается «новой» областью исследований (Morrow Jr., John К., 2010). Дальнейший прогресс в этой области зависит от многих

факторов, в том числе от развития базы аналитических методов. С учетом подобной ситуации неслучаен интерес к инновационным методам, способным отражать метаболический профиль биожидкостей. К таковым, в частности относятся технологии исследования кристаллогенных свойств биосред.

Длительное время кристаллография оставалась прерогативой технических наук, результатом чего стали современные представления о строении и свойствах кристаллического состояния вещества, а также жидких кристаллах. Из областей, близких к биологии и медицине, кристаллография нашла применение лишь в фармации и судебно-медицинской экспертизе Фармакологами кристаллоскопические методы исследования использовались для анализа структуры синтезируемых лекарственных препаратов (Никольская М. Н. с соавт., 1965). Судебные медики рассматривали кристаллизацию как подход в экспериментальной и практической токсикологии (Белова А. В., 1960).

Непосредственно в медицине кристаллоскопия стала использоваться в течение последних 35 лет. Приставку «био-» к данной дисциплине добавили работы Рапис Е.Г. (1973), которая впервые описала характер кристаллообразования некоторых биосред глаза человека и животных (хрусталик, стекловидное тело и т. д.). Их продолжением стали обширные исследования, выполненные специалистами Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.В. Владимирского, заложившими основу одного из основных направлений кристаллоскопического анализа биосубстратов - тезиграфии (Каликштейн Д. Б. с соавт., 1981, 1990).

Второе направление биокристаллоскопии - ' «классическая» кристаллоскопия, основанное на изучении собственной способности биосубстрата к кристаллогенезу впоследствии получили развитие и усовершенствование благодаря работам Шабалина В.Н. и Шатохиной СН (2001, 2004). Ими аналогично изысканиям Савиной JI.B. (1999) описаны новые маркерные структуры, образуемые биосубстратами при дегидратации в норме и при патологии отдельных органов и систем.

Объект для изучения возможностей методов биокристалломики как метаболомных технологий также выбран неслучайно. Гельминтозы - наиболее распространенные паразитарные заболевания человека и животных, вызываемые различными представителями низших червей - гельминтов (Токмалаев А.К., 2005, 2007). В нашей стране с конца 20-х годов прошлого века велась научно обоснованная борьба с гельминтозами, что привело к значительному снижению заболеваемости у населения (Успенский A.B. с соавт., 2011). Однако в 90-х годах отмечена тенденция к увеличению пораженности гельминтозами, растет число больных токсокарозом, трихинеллезом. Не улучшается эпидемическая обстановка в очагах

распространения биогельминтозов: описторхоза и цестодозов _

дифиллоботриоза, тениидозов, эхинококкозов (Токмалаев А.К., 2005). По официальным данным, заболеваемость гельминтозами в России составляет около 1%, однако, по мнению ведущих специалистов, ежегодно инвазируется не менее 15 млн человек.

Несмотря на значимость разработки противоэпидемических мероприятий и создания новых технологий лечения гельминтозов, актуальность не теряют изыскания в области фундаментальных основ гельминтологии, в частности, связанные с изучением метаболических аспектов взаимодействия в системе «паразит-хозяин» (Бабак О.Я., 2005; Бибик О.И., 2012).

В настоящее время единичными работами зарубежных авторов показано, что присутствие некоторых паразитов (в частности, малярийного плазмодия) существенно изменяет кристаллогенную активность внутриэритроцитарного содержимого и плазмы крови (Hempelmann Е., Egan T.J., 2002; Egan T.J., 2008), причем эти метаболические перестройки имеют не только феноменологическую, но и патофизиологическую значимость, т. к. служат лимитирующей стадией развития паразита (Ridley R.G. et al., 1995" Pandey A V Tekwani B.L., 1996; Sullivan D.J., 2002). Эффективность разработанной кристаллогенез-ингибирующей терапии малярии, подтвержденная ex juvantibus, доказывает принципиальную роль нарушений кристаллостаза в механизме развития данного заболевания (Martins Alho M. et al., 2009). В то же время эти исследования носят отрывочный характер, а диагностическая ценность изучения метаболома биожидкостей по их кристаллогенным свойствам совершенно не изучена. Кроме того, необходимо создание теоретико-экспериментальной базы по влиянию микроорганизмов и гельминтов на процессы кристаллизации и дегидратационной структуризации.

Цель исследования: Комплексно изучить процессы кристаллизации в биосистемах in vitro и in vivo и влияние на них гельминтов.

Задачи работы:

1. Создать новые и оптимизировать имеющиеся методы изучения кристаллогенных и инициирующих свойств биологических субстратов и биосистем. '

2. Изучить особенности микроорганизм- и паразит-ассоциированного кристаллогенеза в различных модельных системах.

3. Количественно описать видовые особенности кристаллогенеза биологических жидкостей организма людей и животных.

4. Уточнить особенности дегидратационной структуризации биологических сред организма животных при экспериментальном и спонтанном гельминтозе.

5. Установить характер сдвигов кристаллостаза биожидкостей человека при тканевых гельминтозах.

6. Раскрыть патогенетическую значимость и механизмы преобразования свободного и инициированного кристаллогенеза биосред при гельминтозах.

7. Оценить диагностические возможности исследования дегидратационной структуризации биосред в ветеринарной и медицинской паразитологии.

8. Исследовать возможности методов биокристалломики в прогнозировании и мониторинге эффективности лечения гельминтозов.

9. Составить рекомендации по использованию биокристалломных технологий в экспериментальной и практической паразитологии.

Научная новизна. На основании опыта изучения собственной и инициированной кристаллизации различного биоматериала была предложена и обоснована новая дисциплина - биокристалломика, - рассматриваемая как синтетическая наука о биогенных кристаллах. Была создана методология данного научного направления, а также систематизирован его методический аппарат. Общим теоретическим базисом для исследования биокристаллизации явилась предложенная холистическая теория биокристалломики.

Создан интегративный алгоритм исследования динамических и статических параметров дегидратации биосред, включающий как модификации ранее разработанных методов, так и новые собственные подходы. На основании

анализа обширного фактического материала была усовершенствована система визуаметрического описания результата свободного и инициированного кристаллообразования биологических субстратов. Предложен комплекс новых методов биокристалломики (спектрометрическое исследование биокристаллов, лазерная флоуметрия фаций, биогравиметрия, протеогравиметрия' биокристаллопровокационные тесты и др.), а также способы учета их результатов.

Применение подобного комплекса методов позволило сформировать представление о кристаллостазе как новом параметре гомеостаза организма человека и животных, и его вариациях при экспериментальных и спонтанных гельминтозах. Впервые приведены количественные сведения о видовых особенностях кристаллогенеза биосубстратов человека и лабораторных животных (крыса, мышь, свинья), на основании чего предложены нормативы тезиокристаллоскопии биоматериала.

На основании теоретического анализа и результатов собственных изысканий обнаружен и обоснован феномен микроорганизм-паразит-ассоциированного кристаллогенеза, выделены и рассмотрены его варианты. Продемонстрированы возможности его моделирования in vitro и изучения в модельных и реальных условиях.

Установлено, что наличие гельминтоза направленно трансформирует кристаллогенные и инициирующие свойства биосубстратов животных и человека, причем особенности формируемых сдвигов зависят от вида и метаболического статуса организма, а также обусловлены характером и интенсивностью инвазии. Показана метаболическая обусловленность изменения картины дегидратационной структуризации при гельминтозах.

Разработаны и запатентованы новые технологии диагностики тканевых гельминтозов, базирующиеся на анализе кристаллогенных свойств биологических субстратов (сыворотка крови, моча, кал). Верифицированы возможности методов биокристалломики как способа оценки эффективности антигельминтного лечения у человека и животных, а также его индивидуализации.

Научно-практическая значимость.

Впервые в экспериментальной и практической паразитологии предложена и обоснована новая диагностическая технология текущей и динамической интегральной оценки состояния организма, основанная на изучении кристаллостаза организма методами биокристалломики.

Биокристалломный мониторинг метаболического статуса организма животных способен явиться информативным подходом при доклинических испытаниях лекарственных препаратов для задач паразитологии. Данный алгоритм может быть использован в целях контроля эффективности различных вариантов лечения гельминтозов.

Фармакобиокристалломный аспект использования данных подходов включает возможность первичного подбора компонентов ведения этих пациентов на основании предварительного биокристаллоскопического исследования состояния больного животного или человека, индивидуализированного выбора конкретного препарата (или эфферентной терапии) и требуемой дозировки из возможного диапазона. Кроме того, значимым представляется предложение по использованию биокристалломного текущего и заключительного (по окончании лечения) мониторинга эффективности проводимого комплексного лечения.

Таким образом, исследование кристаллостаза при паразитозах может оказаться достаточно информативным, простым и быстрым по исполнению диагностическим инструментом на всех этапах диагностического и лечебного процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Кристаллостаз организма (или биосистемы), рассматриваемый в рамках гомеостаза, и его сдвиги в условиях патологии представляется возможным оценить по кристаллогенным и инициирующим свойствам соответствующего биоматериала.

2. Кристаллостаз жидкой биосистемы определяется ее компонентным составом, физико-химическими параметрами, а также присутствующими в ней модуляторами кристаллогенеза, в том числе биологической природы.

3. Метаболическая активность и поверхностные свойства микроорганизмов и гельминтов обеспечивают условия для формирования сдвигов кристаллостаза, изменяя кристаллогенные свойства собственного микро- и макроокружения (феномен микроорганюм-паразит-ассоциированного кристаллогенеза). Это влияние проявляется как на локальном (в модельных системах), так и на организменном (при развитии паразитарной инвазии) уровне.

4. Тканевые гельминтозы (экспериментальные и спонтанные) приводят к существенному нарушению кристаллостаза организма человека и животного, что проявляется в значительном изменении кристаллообразующей и инициаторной активности биологических жидкостей. Сдвиги тезиокристаллоскопических характеристик биосред обусловлены видом гельминтоза и метаболическими особенностями организма-хозяина.

5. Биокристаллоскопические технологии позволяют получить информацию о метаболическом статусе в норме и при гельминтозах, ценную в плане диагностики вида и тяжести инвазии. Методы биокристалломики могут применяться в целях индивидуализации, текущего и заключительного мониторинга эффективности лечения паразитарных заболеваний человека, и животных.

Апробация работы.

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены: на XX Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), на 9-м-14-м Славяно-Балтийских научных форумах «Санкт-Петербург - Гастро» (Санкт-Петербург, 2007-2012), на 65-й юбилейной открытой научно-практ. конф. с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), на Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2007), на II-VII Региональных конф. молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем (Крестовские чтения)» (Иваново, 2007-2012), на 11-ми 12-м Конгрессе с международным участием «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2007, 2008), на V Международной научно-практ. дистанционной конф. «Новые технологии в медицине - 2008» (Москва, 2008), Н-\''1 Междунар. научн. конф. «Системный анализ в медицине» (Благовещенск, 2008-2012), на I Всероссийской конф. «Многомерное моделирование процессов и структур в нанотехнологиях» (Москва, 2008), на 13-й и 14-й Нижегородских сессиях молодых ученых «Разуваевские чтения» (Татинец, 2008, 2009), на VII Международной науч. конф. «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва,

2008), на Международном симпозиуме «Biological motility: achievement and perspectives» (Пущино, 2008), на V, VI VII Междунар. науч. конф. «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины» (Иваново, 2008, 2010, 2012), на First International Congress «Technological and Scientific Advances in Ozone therapy» (Mehico, Mexica, 2008), на I Международной научно-практ. конф. преподавателей, молодых ученых и аспирантов аграрных ВУЗов РФ «Инновационные процессы в АПК» (Москва,

2009), на Международной науч. конф. «Молодежь в науке-2009» (Минск, Беларусь, 2009), на I и II Междунар. конф. «Процессы самоорганизации в высыхающих каплях многокомпонентных жидкостей: эксперименты, теории, приложения» (Астрахань, 2010, 2012), Всеросс. конф. с междунар. участием «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды» (Санкт-Петербург, 2010, 2012), IV и V Всеросс. научно-практ. конф. «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011, 2012), IV Междунар. симп. «Биокосные взаимодействия в природных и антропогенных системах» (Санкт-Петербург, 2011), на Eur. Congr. on Intergrative Medicine (Флоренция, Италия, 2012), II Всеросс. научн. конф. молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), Первая Всеросс. научн. конф. молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, РАМН, 2012), на секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2013).

Актуальность и значимость результатов работы отмечены дипломом Президиума Национальной Академии Наук Республики Беларусь (2009).

В рамках 11-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро - 2009» была проведена тематическая секция «Биокристалломика в гастроэнтерологии и гепатологии».

Реализация результатов исследования

Разработанные биокристалломные технологии используются при проведении научных исследований во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина, Кировской государственной медицинской академии, в НОЦ «Институт молекулярной медицины» Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П. Павлова. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. Павлова И.П.; кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии; нормальной физиологии и патофизиологии Кировской ГМА, курса патофизиологии Вятской ГСХА.

Исследования поддержаны грантом РФФИ №098-04-97077-р_поволжье_а.

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано около 150 научных работ, в том числе 3 монографии и 1 глава в монографии, 3 учебных пособия, 61 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и иностранных журналах, получены 2 патента РФ на изобретения. Также по результатам исследования утверждены 3 технологических регламента по диагностике трихинеллеза, альвеококкоза и консервации биоматериала (2006, 2012, 2013)

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 354 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав с изложением результатов собственных исследований,

обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 701 источник, в том числе 313 - зарубежных авторов.

Изучение акустомеханического импеданса биосред проводилось совместно с сотрудниками лаборатории аутоволновых процессов ИПФ РАН (зав. лаб. -д.ф.-м.н., проф. Яхно В.Г.), исследование кристаллогенных свойств микроорганизмов - совместно с сотрудниками лаборатории консервации крови и тканей Кировского НИИГПК (зав. лаб. - д.м.н. Костяев A.A.), а моделирование гельминтозов - с сотрудниками института медицинской паразитологии и тропической медицины ПМГМУ им. И.М. Сеченова (д.м.н., проф. Коваленко Ф.П.), клинический материал любезно предоставлен к.м.н., доц. Янченко В.А., за что автор выражает им глубокую благодарность.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Общий объем исследований и формирование групп обследуемых. Было сформировано несколько этапов исследования, для каждого сформирована промежуточная цель. Было изучено 4 биосреды организма человека (сыворотка крови, смешанная слюна, моча и гомогенаты слизистой) и 3 биологических субстрата животных (сыворотка крови, моча и желчь).

Таблица 1. Объем и этапы исследования

Объект исследования Объем исследования Цель изучения данной группы Изученные биосреды

I. Эксперименты in vitro

Сыворотка крови человека 15 Исследование модуляции кристаллогенных свойств

Моча здорового человека 35 Исследование модуляции кристаллогенных свойств

Escherichia Coli 90 Изучение кристаллогенных свойств

Staphylococcus aureus 90 Изучение кристаллогенных свойств

Alaria alata, Hymenolepis nana (яйца) 30 Исследование кристаллогенных свойств в индивидуальном виде и с дезинфектантами

Helicobacter pylori 156 Изучение кристаллогенных свойств Гомогенаты слизистой

Pseudomonas aeruginosa 160 Исследование кристаллогенных свойств в индивидуальном виде и с дезинфектантами

II. Исследование кристаллогенных и инициирующих свойств биосред животных

Крысы линии Вистар 30 Изучение кристаллизации биосред в норме сыворотка крови, моча

Мыши линии Блэк 30 Изучение кристаллизации биосред в норме сыворотка крови, моча

Свиньи 36 Изучение кристаллизации биосред в норме сыворотка крови

Нутрии 15 Изучение кристаллизации биосред в норме желчь

Коровы 25 Изучение кристаллизации биосред в норме желчь

Коровы 10 Исследование кристаллостаза при спонтанном фасциолезе желчь

Свиньи 30 Моделирование трихинеллеза сыворотка крови

Мыши 20 Моделирование трихинеллеза моча

Крысы 30 Моделирование трихинеллеза Сыворотка крови

Крысы 20 Моделирование эхинококкоза моча

Мыши 20 Моделирование альвеококкоза Моча

Нутрии 10 Исследование кристаллостаза при спонтанном фасциолезе желчь

III. Изучение кристаллогенных и инициирующих свойств бижидкостей человека

Практически здоровые люди (18-25 лет) 50 Изучение свободного и инициированного кристаллогенеза Слюна, моча, сыворотка крови, кал

Пациенты с альвеококкозом печени 32 Изучение трансформации кристаллостаза биосред при альвеоккозе Слюна, моча

Пациенты с альвеококкозом печени 42 Изучение трансформации кристаллостаза биосред в динамике оперативного лечения Слюна, моча

Всего Изучен материал от 276 животных 5 видов, 174 людей, а также 516 колоний микроорганизмов и яиц паразитов (2598 образцов) |

Биокристалломные методы исследования биосубстратов. Комплекс примененных кристаллоскопических технологий, кроме акустомеханического импеданса, является собственной разработкой и позволяет оценивать динамические и статистические параметры кристаллогенеза биосубстратов.

Пробоподготовка кристаллоскопических и тезиграфических фаций. На предварительно обезжиренное, промытое и просушенное предметное стекло наносят полученные на предыдущем этапе образцы биологического материала в объеме 0,1-0,2 мл. В дальнейшем для получения фации биосубстрата производится дегидратация микропрепарата, которую возможно осуществлять в двух основных вариантах: в естественных условиях без ускорения процесса кристаллообразования (температура 18-20°С, влажность 50-70%) и в потоке теплого воздуха (температура 40-50°С, влажность 20-30%).

Исследование акустомеханического импеданса высыхающих капель. Для регистрации динамических характеристик структуризации высыхающих капель использовали специальный программно-аппаратный комплекс (Институт прикладной физики РАН). Капля исследуемой жидкости при комнатных условиях высыхала на поверхности кварцевого резонатора, совершавшего сдвиговые колебания с постоянной частотой 60 КГц. При этом в

образце возникала сдвиговая волна, чрезвычайно чувствительная к возникновению и росту новой фазы. Регистрируемой величиной являлась комплексная электрическая проводимость резонатора; емкость ненагруженного резонатора компенсировалась мостовой схемой устройства. Регистрируемый сигнал автоматически пересчитывался в единицы акустомеханического импеданса (АМИ), и отражался на дисплее в режиме реального времени. Форма кривой АМИ после автоматической обработки по специальным алгоритмам могла быть представлена в виде точки на плоскости параметров. Этот подход позволял получать численные результаты с данными статистических различий между сравниваемыми жидкостями практически сразу после высыхания капли. Все сравниваемые жидкости тестировали при одинаковых внешних условиях.

Биогравиметрия и протеогравиметрия. Процедура выполнения исследования включает регистрацию продолжительности интервалов времени, в течение которого происходит убывание каждой единицы массы образца, в сочетании со значением учитываемой массы. Учет времени производится вплоть до достижения стабильного веса микропрепарата. Предварительно фиксировали исходное значение показателя, соответствующее нулевому уровню. Данные дальнейшего исследования вместе с начальными сведениями заносят в таблицу. Последними значениями таблицы являются стабильный вес образца и время его достижения. Биогравиметрические исследования производились на весах ВК-300.1 с электронной регистрацией массы. Точность взвешивания составляла 0,001 г., а погрешность измерения - 0,0005 г.

Формула для расчета биогравнметрического коэффициента следующая:

БГК - Таг!?- >

где БГК - биогравиметрический коэффициент, штах - масса анализируемой капли до начала высыхания, Тполн - полное время высыхания образца.

Для протеогравиметрического коэффициента, оцениваемого на основании измерения динамики ширины краевой зоны в процессе высыхания образца, формула принимает следующий вид:

ПГК =

Тпа„ '

где ПГК - протеогравиметрический коэффициент, П>и - ширина краевой зоны капли по окончании высыхания, Тполн - полное время высыхания образца.

Визуальная морфометрия крнсталлоскопических и тезиграфических фаций. Для описания результата собственного и инициированного кристаллообразования биосубстратов применялась новая система критериев, исключающая зависимость оценю! от вида биоматериала и конкретных структур фации. Для кристаллограмм параметры включали:

I. Основные показатели:

1. Индекс структурности (ИС);

2. Кристаллизуемость (Кр);

3. Тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур (ТВ).

II. Дополнительные параметры:

1. Степень деструкции фации (СДФ);

2. Равномерность распределения кристаллических элементов фации (II);

3. Степень выраженности ячеистости фации (С);

4. Выраженность отдельных зон кристаллизации

5. Индекс хаотичности (ИХ);

6. Выраженность краевой белковой зоны (Кз);

7. Рельефность текстуры (Т).

Для исследования тезиграмм использовали:

I. Основные показатели:

1. Основной тезиграфический коэффициент (Q)

2. Коэффициент поясности (Р);

3. Индекс хаотичности (ИХ).

II. Дополнительные параметры:

1. Степень деструкции фации (СДФ);

2. Равномерность распределения кристаллических элементов фации (R);

3. Степень выраженности ячеистости фации (С);

4. Выраженность отдельных зон кристаллизации (Z);

5. Кристалличность (К);

6. Выраженность краевой белковой зоны (Кз);

7. Рельефность текстуры (Т).

Спектрометрия кристаллограмм и тезиграмм. Исследование спектрометрических характеристик фаций выполнялось на стекле на микроспектрофотометре PowerWave XS (США). Результатом анализа являются значения оптической плотности при длинах волн 300-450 нм, причем особое внимание уделялось значениям оптической плотности при 3 длинах волны (300, 350 и 400 нм). Для нивелирования погрешности измерения уровень оптической плотности образца определяли с учетом данных спектрометрии чистого стекла (для кристаллограммы) или фации базисного вещества (для тезиграммы).

Биокристаллопровокация - группа кристаллоскопических методов, связанная с введением в биосубстрат метаболитов для изучения реактивности биосистемы на данное воздействие. В нашем случае метод применялся в отношении введения в сьшоротку крови человека 30; 15; 7,5; 3,75; 1,875 и

0.9375% растворов мочевины.

Статистическая обработка данных. Фактический материал, полученный при проведении исследований у всех изученных группы людей и животных, был обработан методом вариационной статистики (Наследов А. Д., 2004). Вычисляли средние величины (М), их стандартную ошибку (т). Показатели считали достоверными при значениях р<0,05 (по t-критерию Стьюдента и U-критсрию Манна-Уитни). Зависимость между признаками оценивали при помощи коэффициента парной корреляции.

Исследования с участием животных и людей одобрены локальным этическим комитетом КГМА, соответствовали Хельсинской декларации (2000), «Правилам клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Все лица (их законные представители), участвующие в исследовании, давали информированное согласие. Эксперименты с использованием животных проводились с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (№86/609/ЕЕС, Страсбург, 1986).

Расчеты выполняли с помощью программы SPSS 16.0.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Научно-методологические основы биокристалломики как синтетической дисциплины о биогенных кристаллах.

Известно, что многие живые организмы обладают способностью к образованию кристаллических или псевдокристаллических тел внутри себя

и/или во внешней среде. Так, для агентов микромира преобладающим является последний вариант (Minski A. et al., 2001; Мартусевич А.К., Жданова О.Б., 2008), тогда как'у высших организмов превалирует эндолитогенез (Волчецкий АЛ. с соавт., 1999; Савина Л.В., 1999; Рихванов Л.П. с соавт., 2004; Голованова O.A., 2006; Мартусевич А.К., 2008). Кроме того, интерес многих исследователей, прежде всего минерологов, привлекает предполагаемая «промежуточная» роль кристаллов как интермедиатов живой и неживой природы. Этот тезис подтверждают многолетние исследования акад. РАН Н. П. Юшкина, посвященные гипотезе зарождения жизни на первичных органо-минеральных агрегатах (Юшкин Н.П., 2007), а также многочисленные факты генеза живыми существами кристаллов (Герасименко Л.М. с соавт., 1996; Бакулин M.K. с соавт., 2006). В то же время обращает на себя внимание тот факт, что эти сведения крайне разрознены и являются достоянием различных дисциплин, а попытки применения системного подхода к анализу общих закономерностей био-ассоциированного кристаллообразования практически отсутствуют. К предпосылкам обобщения представлений об отдельных аспектах проблемы относятся «теория функциональной морфологии биологических жидкостей», предложенная акад. РАМН. Шабалиным В. Н и проф. Шатохиной С.Н. (2001), а также теория самоорганизации белка «Протос», разрабатываемая на протяжении более 30 лет проф. Рапис Е.Г. (2003). Каждая из вышеперечисленных теорий касается лишь некоторых частных закономерностей формирования биогенных кристаллов. Так, концепция Шабалина В.Н. и Шатохиной С.Н. (2001, 2002), базирующаяся на диагностическом значении отдельных маркерных структур, генерируемых в результате дегидратации биологических сред и, по мнению авторов, являющихся высокоспецифичными индикаторами конкретных патологических состояний, может быть применена исключительно к исследованию собственного кристаллогенеза биосубстрата.

Крайне важным и принципиальным аспектом, упускаемым создателями указанных выше теорий, является «спонтанный» кристаллогенез в реальных условиях (in vivo), наличие которого подтверждено многочисленными наблюдениями, достаточно подробно описанными в литературе различного профиля [физико-химической (Гилинская Л.Г. с соавт., 2003; Рапис Е.Г., 2003), биологической (Волчецкий А.Л. с соавт., 1999; Рихванов Л.П. с соавт., 2004) и медицинской (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001, 2004)].

С учетом того, что рассматриваемые проблемы носят междисциплинарный характер, т. к. одновременно затрагиваются интересы медиков, биологов, химиков, физиков, математиков и др., данное направление должно быть синтетическим. Для обозначения этой интегративной науки нами предлагается термин «биокристалломика», указывающий на непосредственный объект исследования и подчеркивающий биологический уклон дисциплины. С наших позиций, формируемое направление может стать качественно новым этапом развития представлений о биогенных кристаллах, логично продолжающим ранее предложенные теории, трактующие феномен биокристаллизации.

Биокристалломика - наука о структуре, свойствах, механизмах и условиях образования и деградации, а также функциональной значимости био-ассоциированных кристаллических и псевдокристаплическш тел.

Основной целью биокристалломики как новой синтетической науки должна явиться комплексная, многосторонняя расшифровка природы и сущности кристаллизации, связанной с жизнедеятельностью организмов.

Поскольку данная дисциплина носит синтетический характер, весь спектр методических приемов целесообразно разделить на специфические и неспецифические. В настоящее время предложено более 20 различных собственно биокристаллоскопических подходов. По оцениваемым свойствам биокристаллов их можно разделить на три группы.

К первой группе, должны быть причислены способы, базирующиеся на изучении непосредственно кристаллогенных свойств биообъектов (кристаллоскопические методы). Подходы, отнесенные к данной группе, различаются особенностями режима получения биокристаллов (использование закрытой ячейки (Антропова И.П., Габинский Я.Л., 1997), вакуумирование образца (Савина Л.В., 1999), воздействие различных температур, применение широкого диапазона подложек и их модификация покрытиями и др.).

Факторы модуляции кристаллогенеза

- температура;

- влажность;

- потоки воздуха;

- особенности подложки;

- давление

- другие факторы

- микрофлора;

- вещества- - простейшие;

активаторы; - гельминты;

- вещества- - биологически

ингибиторы; активные

- вещества- вещества

модуляторы (качественные - наночастицы с биологическим

сдвиги) действием

Изолированное воздействие — идеальный случай

Смешанные

- кристаллизация в открытой системе in vitro (на стекле или пластике);

- кристаллизация in vivo

i

Реальные условия

Рис. 1. Классификация модуляторов биокристаллогенеза по природе действующего агента

Вторая группа объединяет методы биокристаллоскопического исследования, позволяющие производить анализ инициирующих свойств биосубстратов (тезиграфические методы). Общим принципом, положенным в их основу, является сокристаллизация оцениваемого объекта и модулятора кристаллогенеза (базисного вещества), подбираемого заранее. Нами показано, что в качестве базисного вещества может выступать простой или составной краситель (метод хромокристаллоскопии), который, выполняя функции инициатора кристаллообразования, способен селективно окрашивать компоненты дегидратирующегося биоматериала. В качестве наиболее общего параметра, характеризующего инициирующие свойства биологического

субстрата или организма по отношению ко всей совокупности потенциальных базисных веществ, нами предлагается термин «инициаторный потенциал».

Третья группа включает небольшое количество методов, позволяющих проводить с высыхающей биосистемой манипуляции различной сложности. В основе методов субстратной конгрегации (Коротько Г.Г., 2000) и модельных композитов (Савина JI.B. с соавт., 2003) лежит изолированная кристаллизация отдельных компонентов биосред (белков, липидов, углеводов, неорганических и органических солей) в индивидуальном виде и в различных комбинациях.

Подходы экспериментальной биокристалломики, исходно являясь исключительно исследовательскими, призваны решить одну из наиболее принципиальных задач дисциплины - разработку способов управления биокристаллогенезом. По нашему мнению, подобное моделирование и изучение влияния широкого спектра модуляторов данного процесса позволит сформировать основы направленной качественно-количественной модификации био-ассоциированной кристаллизации (рис. 1).

Общие экспериментально-теоретические сведения и фактологический материал были интегрированы нами в форме холистической теории биокристаллогенеза, включающей три основных положения:

1. Явление био-ассоциированной кристаллизации представляет собой общебиологический феномен и присуще живой материи на всех уровнях ее организации.

2. Форма, состав и функциональное значение формируемых биогенных кристаллов зависят от механических свойств и метаболической активности живых существ и детерминированы выполняемой ими функцией.

3. Биокристаллогенез - сложный каскад физико-химических процессов, регулируемый системой биогенных и ксеногенных модуляторов, что обеспечивает возможность управления им.

В плане практического применения результатов оценки информативности биогенных кристаллов представляется возможным выделить несколько наиболее перспективных направлений биокристалломики:

1. Экспериментальная биокристалломика - область биокристалломики, связанная с расшифровкой механизмов биокристаллогенеза и его моделированием.

2. Кристаллодиагностика - направление, изучающее диагностические перспективы оценки кристаллогенеза биосред человека и животных.

3. Кристаллопатологш - направление, исследующее патологические процессы, протекание которых связано с кристаллообразованием.

4. Кристаллотерапт - раздел биокристалломики, основной целью которого является изучение и применение способов управления биокристаллогенезом в условиях in vitro и in vivo для разработки принципиально новых технологий лечения заболеваний человека и животных, в патогенезе которых существенную роль играет кристаллообразование.

5. Фармако(био)кристалломика - направление биокристалломики, изучающее возможности биокристаллоскопических методов в исследовании фармакодинамики, фармакокинетики, индивидуализированном подборе, а также текущем и заключительном мониторинге эффективности лекарств.

6. Кристаллоиндикацш - направление биокристаломики, изучающее способность биогенных кристаллов выступать в качестве маркеров.

Таким образом, к настоящему времени полностью сформирован фундамент для становления новой синтетической дисциплины - биокристалломики.

2. Молекулярные механизмы структурообразования в высыхающих каплях биологических субстратов. Кристаллопротеом.

На основании данных литературы (Обухова Л.М., 2010) и многолетних собственных изысканий в области экспериментальной биокристаллоскопии нами предполагается, что ведущая роль в формировании фации как информационно насыщенного отпечатка жидкой биологической ткани принадлежит белкам и протеинсодержащим соединениям. При этом, с нашей точки зрения, остальные компоненты биологической среды, придающие последней выраженную гетерогенность, выступают в качестве универсальных или в той или иной степени специфичных модуляторов кристаллообразования.

В модельных экспериментах на белковых и белково-солевых растворах, а также при исследовании локализации протеинового компонента кристаллоскопической картины реальных биосубстратов было показано, что белки играют многогранную роль в генезе кристаллоскопической и тезиграфической фации (Яхно Т.А. с соавт., 2005). В этом плане представляет интерес тот факт, что биосреды с высоким содержанием белка и растворы индивидуальных белков и их смесей образуют аналогичные дегидратационные картины. Конкретизируя тезис о полифункциональности белков как базиса последующего биокристаллогенеза, необходимо подчеркнуть следующее:

1. белки создают ограниченное пространство для формирующейся фации, образуя особый сетчатый «каркас» по свободной, не соприкасающейся с подложкой, поверхности образца и придавая высыхающей капле клиновидную пространственную конфигурацию;

2. белки способны выступать в качестве самостоятельных активных центров кристаллообразования как в индивидуальном виде (монокристаллы), так и в форме соединений, в т. ч. комплексных, с другими компонентами биоматериала (гетерокристаллы). Это свойство протеинов в некоторых случаях может быть диагностически значимым при условии достаточной изученности вопроса о специфических морфотипах отдельных белков.

3. белки могут являться модуляторами кристаллогенеза как протеиновых, так и небелковых элементов биосубстрата. Подобный кооперативный эффект может приводить либо к образованию кристаллов, состоящих исключительно из модулируемого вещества, либо к формированию структур, представляющих собой результат сокристаллизации модулятора и преобразуемого соединения.

Подводя итог данному краткому описанию роли белковых молекул в биокристаллогенезе, можно свидетельствовать об их превалирующем значении в детерминации кристаллоскопической и тезиграфической фации. Немаловажным моментом, дополнительно подчеркивающим принципиальное место протеинового компонента в формировании особенностей процесса и результата кристаллизации биологического субстрата, является тот факт, что присутствие в последнем белковых молекул непосредственно определяет и «маркирует» биогенность анализируемого материала.

Все вышеперечисленное создает существенный базис для нового перспективного направления биологии и биохимии - кристаллопротеомики. С наших позиций, кристаллопротеомика - биологическая дисциплина, интегрирующая методологию и методику протеомики и биокристалломики. Под кристаллопротеомом мы предлагаем понимать кристаллическую структуру всех белков определенного биологического образца и целостного организма.

Рассматривая место и роль кристаллопротеома в процессах жизнедеятельности отдельных клеток (рис. 2), мы предполагаем, что он

выступает в качестве универсального мессенджера, осуществляющего посреднические функции между совокупностью относительно стабильной генетически детерминированной информацией (геномом) и метаболическими реакциями цитозоля и органелл. Кроме того, данный процесс реализации геномной информации не изолирован от влияния многочисленных разнородных факторов, имеющих как эндогенное происхождение (биотических), так и экзогенных (ксенобиотических). Каждый из них способен стать первичным (непосредственно воздействующим на физико-химические свойства белков) или вторичным (опосредованно через промежуточные соединения и/или процессы) модулятором состояния кристаллопротеома.

Рис. 2. Состав и факторы модуляции кристаллопротеома

Особым аспектом проблемы является определение состава кристаллопротеома. В соответствии с нашими представлениями, белки, имея абсолютный размер в диапазоне 0,1-100 А (Ю'"-10'8 м), в определенных условиях приобретают способность к образованию первичных центров будущего биокристаллогенеза - нанокристаллов. Дальнейшая интеграция отдельных нанокристаллов приводит к формированию более крупных элементов - кристалломицелл. Прогрессирование этого процесса способствует объединению указанных частиц в ассоциаты, на следующем этапе формирующие крупные, достигающие в максимальном измерении нескольких миллиметров (например, кристаллы мочевой кислоты в синовиальной жидкости, кристаллы в растительных клетках при холодовом шоке [Трунова Т.И., 2007]) макрокристаллы. Этот каскад может иметь обратимый характер и, по нашему мнению, обладает способностью стабилизироваться на

любой из вышеперечисленных стадий. Более того, мы считаем, что практически в любой момент в составе кристаллопротеома присутствуют все указанные элементы, тогда как принципиальным различием отдельных состояний является лишь их взаимное соотношение. Последний параметр, с наших позиций, и определяет характер и направленность регуляции элементами кристаллопротеома метаболических процессов на различных уровнях организации живой материи (в эволюционном ряду) и отдельных биосистем (молекулярный, клеточный, тканевой, органный, организменный и др.).

Таким образом, кристаллопротеом есть высокодинамичная само- и экзогенно регулируемая биохимическая система, сформированная совокупностью белков и играющая значительную роль в обеспечении и изменении жизнедеятельности организма и его отдельных элементов.

3. Экспериментальная модуляция и исследование возможности управления кристаллообразованием биоматериала в условиях in vitro.

Особый интерес представляет моделирование физиологических и патологических состояний, сопряженных с нарастанием или снижением концентрации в биологической жидкости отдельных метаболитов. Для этой цели удобно использовать субстраты прямой и обратной реакций ферментных комплексов биосубстратов. В связи с этим, было проведено изучение преобразований характера кристаллизации биосреды при введении биохимических «метаболитов-антагонистов».

| 2.5

! "

i о

3.5

| 3.5

К

!05 о

Рис. 3. Трансформация собственного кристаллогенеза мочи при введении метаболитов в нарастающей концентрации (п=30; все значения - в баллах) Примечание: А - добавление лактата натрия; Б - добавление пирувата натрия. ИС - индекс структурности; Кр - кристаллизуемость

В качестве биологической жидкости была использована моча человека. К биосреде добавлялись водные растворы лактата и пирувата натрия. Тестируемые концентрации составляли 40%, 20%, 10%, 5% и 2,5% мг/мл - для лактата натрия, и 200, 100, 50, 25 и 12,5 мг/мл - для пирувата натрия. Это

позволило приблизить моделируемые гиперлактатурию и гиперпируватурию к теоретически возможным для человека в условиях патологии (Меньшиков В.В., 1988; Назаренко Г.И., Кишкун A.A., 2000). Анализ результатов свободного и инициированного кристаллообразования позволил судить о наличии четкой динамики преобразования кристаллогенеза в зависимости от концентрации метаболитов (рис. 3-4). В частности, выявлены существенные изменения кристаллизации систем «моча - лактат натрия» и «моча - пируват натрия». Так, нарастание концентрации пирувата натрия в отсутствие активного кристаллообразователя приводит к деструктуризации и хаотизации картины, о чем свидетельствует динамика индекса структурности (рис. 3).

В то же время при повышении концентрации лактата натрия обнаруживается противоположная тенденция. Кроме того, введение нарастающих количеств пирувата натрия, в соответствии с химическим составом обладающего способностью к полимеризации и, следовательно, гелеобразованию, затрудняет формирование центров кристаллизации. Это находит отражение в изменениях уровня кристаллизуемости. Даже образующиеся кристаллические структуры характеризуются высокой степенью деструкции. Для лактата натрия отмечены неоднозначные тенденции.

При сравнительном анализе всех панелей рисунка 3 было установлено, что дополнение биосистемы, содержащей лактатдегидрогеназу, субстратами ее прямой и обратной реакции в возрастающих концентрациях приводит к

А Б

Рис. 4. Характер инициации мочой кристаллизации 0,9% раствора хлорида натрия при введении метаболитов (п=30; все значения - в баллах) Примечание: А - добавление лактата натрия; Б - добавление пирувата натрия. (2 - основной тезиграфический коэффициентСДФ - степень деструкции фации

При исследовании результата кристаллообразования биосистем, инициированного 10% водным раствором хлорида натрия установлено, что по наиболее значимому количественному показателю тезиграфического теста

(основному тезиграфическому коэффициенту С>) увеличение концентрации лактата натрия приводит к нарастанию инициаторного потенциала по отношению к указанному базисному кристаллообразующему веществу, тогда как пируват натрия снижает инициаторные свойства биосреды пропорционально его содержанию (рис. 4).

Вследствие того, что производимые с модельной биожидкостью преобразования не изменяют белковый состав новообразованной биосистемы, динамика коэффициента поясности (Р) и СДФ не носит закономерного характера. С другой стороны, даже сложная зависимость степени деструкции образца, как и основного тезиграфического коэффициента, от концентраций метаболитов представляется неслучайной, когда анализ производится в сравнительном аспекте. В этом случае, аналогично данным, полученным при собственной кристаллизации биосистем, нарастание содержания субстратов противоположных реакций одного фермента способствует антагонистичным изменениям параметров (рис. 4).

С позиций конечного результата - фации - представляется логичным разделить весь массив факторов относительно физического состояния биосреды на стабилизирующие (способствующие удержанию биосистемы как жидкости) и дестабилизирующие (вызывающие фазовый переход к твердому телу). Основные факторы каждой из вышеперечисленных групп представлены на рисунке 5. В случае преобладания дестабилизирующих факторов при дегидратации наблюдаются кристаллообразование; формирование псевдокристаллов или переход к жидкокристаллическому состоянию. При доминировании стабилизирующих факторов высушивание приводит к полному или частичному торможению кристаллогенеза, реализуемых путем (Яхно Т.А., Яхно В.Г., Санин А.Г. с соавт., 2004) гелеобразования или золеобразования.

Дестабилизирующие (Ьактооы

Повышение осмолярности раствора Увеличение доли минеральных соединений «Экстремальный» температурный режим

Стабилизирующие (Ьактооы

Способность

компонентов к

полимеризации

Точка фазового Нарастание доли органических

перехода соединений

Усиление комплек-

—■---, \ сообразовательной

способности

Температурный

оптимум

Рис. 5. Концепция стабильности биосреды как кристаллогенного раствора

На основании применения подобного экспериментального подхода предлагается концепция стабильности биологической среды как

20

кристаллогенного раствора, базирующаяся на том положении, что любое вводимое в биосистему вещество модулирует результат дегидратации исходного биосубстрата, направляя его либо к сохранению жидкого состояния (фактор стабилизации), либо к кристаллизации (фактор дестабилизации) с учетом условий макро- и микроокружения кристаллогенеза.

Рассматривая биохимические механизмы подобных преобразований, необходимо указать на то, что попадание в биожидкость субстратов содержащихся в ней ферментов, приводя к конформационным изменениям последних, трансформирует и состояние всего кристаллопротеома, что отражается на кристаллогенных и инициаторных свойствах целостной биосистемы. Кроме того, на состояние кристаллопротеома способны оказывать влияние белки-шапероны. Это является дополнительным по отношению к смещению кристаллостаза (по шкале «белки - нанокристаллы -кристалломицеллы - агрегаты кристалломицелл») механизмом изменения характера свободного и инициированного кристаллообразования биоматериала.

4 Экспериментальное исследование реализации микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза

В качестве микроагентов нами были выбраны колонии двух микроорганизмов: бактерии Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Подобный выбор биообъектов неслучаен: Е. coli является типичным представителем аутохтонной микрофлоры организма человека и животных, тогда как St. aureus представляет собой классический патогенный бактериальный агент. В целях уточнения роли концентрации бактерии были использованы единые для обоих микроорганизмов тестовые количества биомикрообъектов: 10 , 108, Ю10, 1012, 1014, 1016, 1018 и Ю20 КОЕ/мл раствора. Подобный дифференцированный подход позволил не только сопоставить микроорганизмы между собой по инициирующей активности, но и установить их пороги инициирующих свойств путем установления минимальной концентрации бактерий, вносящей существенные изменения в характер кристаллообразования базисного вещества. В качестве инициируемого (базисного) вещества применялся 10% раствор хлорида натрия). Это дало возможность количественно оценить «инициаторный потенциал» бактерии, трактуемый нами как ее способность оказывать влияние на картину кристаллизации раствора соли.

Исследование особенностей инициации структуризации раствора хлорида натрия рассматриваемыми бактериями в зависимости от концентрации анализируемой культуры позволило установить, что имеет место динамика нарастания выраженности сдвигов кристаллообразования гипертонического раствора при увеличении содержания модулирующего его микроагента. Важно, что данная тенденция касается обоих микроорганизмов (рис. 6-7). При более подробном изучении распределения тезиграмм по градации возрастающей инициирующей дозы микроагента с учетом всех контролируемых концентраций был обнаружен двухступенчатый характер реагирования хлорида натрия на метаболическую активность микроорганизма. Он включает первоначальное отсутствие значимых вариаций по сравнению с контрольным образцом базисного вещества. При нарастании количества микробных тел для каждого микроорганизма отчетливо регистрируется концентрация, начиная с которой появляется динамика трансформации кристаллогенеза в краевой зоне. Она выражается в формировании островков одиночных кристаллов, окружающих относительно крупные пирамидальные структуры, образованные хлоридом натрия (рис. 7 и 8).

Рис. 6. Кристаллогенез тезиосистем, включающих Escherichia Coli и 10%

7сч

10" KUE/мл 10'" КОЕ/мл Ю"и КОЕ/мл

Рис. 7. Кристаллогенез тезиосистем, включающих Staphylococcus Aureus и 10% раствор хлорида натрия (увел. х7,5) Принципиально подчеркнуть, что концентрация, с которой начинают обнаруживаться подобные изменения, у эшерихии и стафилококка варьирует, причем она значительно меньше у патогенного микроагента. Так, для Е. coli данная пороговая концентрация составляет 10 КОЕ/мл (рис. 6), то относительно St. aureus даже при минимальном (из изученных) количестве бактерий (106 КОЕ/мл) регистрируются значимые преобразования структуропостроеиия краевой зоны (рис. 7).

Рис. 8. Динамика нарастания основного тезиграфического коэффициента (С)) и степени деструкции (СДФ) образцов растворов, содержащих возрастающие концентрации микроорганизмов

Третьим признаком инициации кристаллообразования хлорида натрия бактериями, ассоциированных с количеством микроагентов, является нарастающий неокристаллогенез (отсутствует в контрольном образце) в центральной и промежуточной зонах высушенного препарата. На основании

о -1-

io"6koe юл1о кое ига кое

10*6 кое

ю'юкое

10л20 КОЕ

этого представляется возможным выделить вторую пороговую концентрацию, причем ее значение, как и для первой, видоспецифично (10 КОЕ/мл - для Е. coli и 10 КОЕ/мл - для S. aureus).

В качестве наиболее информативных и несущих максимальный объем биологически значимых сведений параметров рассчитаны основной тезиграфический коэффициент (Q) и степень деструкции фации (СДФ). Первый из показателей позволяет охарактеризовать направленность (по градации «активация - ингибирование») и выраженность «инициаторного потенциала» микроорганизмов. Коэффициент Q является основной количественной мерой последнего. Степень деструкции фации указывает на выраженность разрушения либо дефекты формирования кристаллов и других видимых при оптической микроскопии элементов образца. Обнаружено, что качественные преобразования, связанные с метаболической активностью бактерий, находят полное подтверждение при оценке количественных критериев тезиграфического теста (рис. 8). В частности, монотонное нарастание уровня основного тезиграфического коэффициента является следствием сначала краевого, а затем и тотального (все зоны микропрепарата) неокристаллогенеза, отражающего «инициаторный потенциал» микроорганизма. В то же время увеличение количества кристаллических образований не сопровождается повышением структурированности фации в целом, о чем свидетельствует прогрессивный рост показателя СДФ, визуализирующего качественные преобразования тезиграфической картины (рис. 8). При этом важно отметить, что выбранные микроорганизмы в отношении количественных оценочных критериев существенно различимы. Так, по основному тезиграфическому коэффициенту, а, следовательно, и по инициаторной способности St.aureus достоверно превосходит Е. coli при всех исследованных концентрациях микроагентов (р<0,05), и если вначале «инициаторный потенциал» эшерихии незначителен, то у стафилококков он исходно высок (усиление кристаллообразования хлорида натрия в 3,5 раза). При высоких концентрациях столь четкая дифференциация между бактериями несколько сглаживается за счет выраженного повышения инициаторного потенциала E.coli.

Аналогичные тенденции были обнаружены при оценке «правильности» модулируемого- микроорганизмами кристаллогенеза раствора хлорида натрия (по степени деструкции фации), однако на низких концентрациях бактериальных агентов достоверных различий по рассматриваемому параметру не выявлено (р<0,05). Кроме того, представляется интересным, на наш взгляд, подчеркнуть, что патогенная бактерия (в нашем случае - золотистый стафилококк) на средних и высоких концентрациях обладает достоверно более четким деструктурирующим действием на кристаллизацию растворов хлорида натрия, чем микроорганизм-представитель аутохтонной микрофлоры многих биотопов человека и животных (кишечная палочка). Эти изменения не связаны с нарастанием «инициаторного потенциала» изучаемых агентов микромира, что верифицировано с помощью корреляционного анализа (г=-0,103±0,062), т. к. сопоставимые темпы прироста инициирующей способности бактерий с увеличением их концентрации не подтверждаются превалирующим ростом деструктивности микропрепарата, связанной с повышением количества стафилококка, аналогичной динамикой у эшерихии.

Таким образом, на основании прямых модельных экспериментов с колониями отдельных патогенных и непатогенных микроорганизмов впервые описано новое явление, ранее не выделяемое - микробная инициация

кристаллообразования солей неорганического ряда (феномен микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза [МАК]). Принципиально важен тот факт, что данное явление универсально для агентов микро ммира, однако он носит и специфичные черты, накладываемые видовой принадлежностью микроорганизма и его текущим метаболическим статусом.

Кроме того, на основании собственных результатов, данных отечественной и зарубежной литературы можно заключить, что лимитирующим моментом при реализации МАК является строго определенная функциональная значимость кристаллизации в каждом конкретном случае. С наших позиций, она и выступает в качестве ключевого звена при выборе вида расположения кристаллических структур, связанных с деятельностью микроорганизмов. В настоящее время мы предлагаем выделять следующие основные виды:

1. Экстрацеллюлярный - кристаллизация обнаруживается на определенном расстоянии от микроорганизма. В этом случае феномен кристаллизации связан с метаболической активностью последнего, т. е. с синтезом и экзоцитозом определенных веществ во внешнюю для бактерии, вируса или гриба среду.

2. Примембранный - кристаллизационный процесс происходит в непосредственной связи с мембраной микробной клетки. В данном случае на первый план по отношению к метаболической активности микроорганизма выступают свойства самой бактериальной стенки (этот феномен в большей степени характерен для бактерий и грибов, для вирусов подобная активность к настоящему моменту не установлена). Это центр-инициатор кристаллизации, молекулярным субстратом которого может явиться липополисахарид клеточной стенки, а фактором, модулирующим сродство конкретного микроагента к формированию кристаллов определенного вещества строго детерминированных размеров и конфигурации - различные нелипидные компоненты бактериальной стенки, в частности, присутствующие в ней изобилии рецепторы и ионные каналы, имеющие белковую природу.

3. Интрацеллюлярный - осуществляется путем инициации внутриклеточной кристаллизации микроорганизмом отдельных веществ. Чаще всего микроагент использует данный феномен в целях создания дополнительной защиты некоторых собственных структурных элементов. Примером подобного эффекта могут являться широко обсуждаемые в зарубежной литературе факты протективной кристаллизации белковых молекул (в частности, белка RecA Escherichia Coli) вокруг молекул ДНК.

5. Оценка инициирующих свойств гельминта в условиях in vitro (на примере Alaria alata и Hymenolepis nana)

Следующим этапом работы служило уточнение инициирующих свойств гельминтов. Эти особенности удобно проиллюстрировать на примере яиц гельминтов, помещенных в 0,9% раствор хлорида натрия, выступающий в этом случае и как микроокружение, и как базисное вещество для реализации тезиграфического теста. Кроме того, подобным приемом достигается единообразие в изучении инициирующей активности бактерий и гельминтов.

В качестве биомодели для проведения исследований нами были выбраны яйца относительно слабо изученной трематоды Alaría alata, относящейся к группе паразитарных зоонозов (Масленникова О.В., 2005; Ястреб В.Б., Горохов В.В., Шестаков A.M., 2005), а также достаточно неплохо изученной цестоды Hymenolepis nana, возбудителя соответствующего биогельминтоза человека и грызунов. Гельминтологические вскрытия кишечника плотоядных проводили в 2007-2009 гг. в Кировской области.

Установлено, что яйца гельминтов различных видов обладают характерными особенностями инициаторного потенциала (рис. 9). Так, для тезиграфической фации, сформированной изотоническим раствором хлорида натрия в присутствии яиц алярий свойственна стимуляция кристаллообразования базисного вещества, причем среди кристаллических элементов образца превалируют одиночные структуры с высокой степенью деструкции, покрывающие практически всю текстуру микропрепарата. Следует отметить, что, учитывая наличие кристаллических фигур и в непосредственной близости от яйца Alaria alata (рис. 9А), в случае данного гельминта имеют место одновременно экстрацелллюлярный и перимембранный типы паразит-микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза.

Рис. 9. Характер фации, полученной при дегидратации 0,9% раствора хлорида натрия в присутствии яиц гельминтов

Принципиально иной характер инициации наблюдается при дегидратации того же базисного соединения в присутствии яиц Нутепо1ер!.ч папа (рис. 9Б). Для данного гельминта, в отличие от алярий, свойственно формирование как одиночно-кристаллических элементов, так и дендритных структур, причем в тезиграммах наблюдали отчетливое превалирование последних. Важной, на наш взгляд, особенностью инициаторного процесса является обнаружение в фациях объемных дендритных кристаллов типа «множественная пирамида» в совокупности с мелкими дендритами. Представляет интерес тот факт, что в данном случае не наблюдали формирования кристаллических структур около яиц, что свидетельствует только о наличии экстрацеллюларного типа типы паразит-микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза, косвенно указывая на иной профиль метаболитов рассматриваемого гельминта. Таким образом, видовая принадлежность и особенности метаболизма гельминта обуславливают его инициаторные свойства в отношении базисного вещества.

6. Собственное и инициированное структурообразование биосред здоровых животных

На следующем этапе работы было проведено сопоставление образцов высушенной сыворотки крови человека, крысы, мыши и свиньи, отображенное на рисунке 10. Выявлено, что кристаллоскопическая фация сыворотки крови практически здорового человека образована четко ограниченной текстурой,

Здоровый человек

шрг" . Я-Л

Мышь

Свинья

содержит единичные кристаллические элементы и немногочисленные центростремительные разломы. Микропрепарат биосреды крысы образован минимальным количеством одиночно-кристаллических структур, а также регулярными разломами, распространяющимися на весь диаметр фации, фрагментирующими образец на равные небольшие отдельности. Необходимо подчеркнуть меньшую текстурированность капли сыворотки крови.

Крыса

Рис. 10. Кристаллоскопические фации сыворотки крови человека и некоторых

животных (увел. х56)

Особую картину свободной кристаллизации удалось обнаружить при исследовании образцов сыворотки крови здоровых половозрелых свиней. Так, кристаллоскопическая фация данной биосреды отличается низкой степенью отграниченное™ текстуры от подложки, значительным диаметром краевой зоны, фрагментированной многочисленными разломами. Промежуточная зона в образцах сыворотки крови свиней практически отсутствует. Центральная зона полностью образована монокристаллами, равномерно распределенными по данной части фации. Анализ данных визуаметрии по большинству показателей установил наличие значимых вариаций. В частности, исследование ключевых параметров оценки результата свободного кристаллогенеза биоматериала указало как на более высокую сложность структуропостроения (по индексу структурности - р<0,05), сопровождаемую пониженной плотностью элементов фации (по показателю кристаллизуемости - р<0,05).

Для образцов биосубстрата крыс характерны минимальный уровень деструкции структурных элементов и ячеистости, тогда как в фациях биоматериала мыши обнаруживается достаточно высокий уровень деструкции кристаллов и аморфных тел, сочетающийся со значительной выраженностью ячеистости (табл. 2). Краевая зона исследуемого биосубстрата крыс имеет больший относительный диаметр, чем аналогичная в фациях сыворотки крови мышей (р<0,05). Подобная тенденция выявлена и для равномерности распределения элементов по текстуре образца. В то же время близкие значения найдены по выраженности зон кристаллограммы и четкости текстуры фаций. В целом, визуаметрия кристаллограмм сыворотки крови человека животных позволила верифицировать наличие видовых особенностей кристаллогенных свойств биосубстрата.

Таблица 2. Кристаллоскопический «паттерн» сыворотки крови здоровых __мышей и крыс _

Параметр Крыса Мышь

Индекс структурности 1,15±0,12 0,46±0,11 *

Кристаллизуемость 0,37±0,14 1,20±0,19*

Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел оттеснение налипание

Степень деструкции фации 0,30±0,12 1,74±0,24*

Четкость краевой зоны 2,5б±0,39 1,72±0,25*

Зонализация 1,47±0,16 1,79±0,21

Выраженность ячеистости 1,84±0,15 3,49±0,27*

Равномерность распределения элементов 4,38±0,35 2,18±0,31*

Четкость текстуры 1,67±0,15 1,96±0,11

Примечание: * - уровень статистической значимости различий р<0,05

Следующим компонентом исследования является анализ инициирующей активности биологического субстрата. Морфология вариантов высушенных биосистем «сыворотка крови - 0,9% раствор хлорида натрия» представлена на рисунке 11. Визуальное описание тезиграфических фаций сыворотки крови человека и рассмотренных видов животных позволяет выявить существенные различия в характере инициированной кристаллизации изучаемой биосреды у представителей разных видов. Так, результат инициированного кристаллогенеза исследуемого биосубстрата человека в норме представлен четко сформированной текстурой, достаточно резко контурирующей относительно подложки кристаллизации, выраженной краевой зоной, отграниченной от центральной и содержащей умеренное количество разломов, практически не распространяющихся в последнюю. Центральная зона образована многочисленными дендритными кристаллами, а также значительным количеством разломов, не выходящих за ее пределы.

Тезиграфический микропрепарат сыворотки крови крысы имеет сходный с характерным для биосреды человека общий план строения, однако имеет ряд особенностей. В их числе наличие регулярных дугообразных разломов, распространяющихся в умеренно выраженную промежуточную и центральную зоны, в некоторых случаях - радиальных; отсутствие четкого разграничения зон фации; меньшая степень деструкции элементов высушенного образца. Установлено, что специфичными характеристиками тезиграммы сыворотки крови животных данного вида являются слабая выраженность краевой

белковой и промежуточной зон фации за счет относительного превалирования центральной, представленной как одиночно-кристаллическими (прежде всего, типа «пластинчатый прямоугольник»), так и дендритными (фигуры типа «хвощ», «крест» и др.) структурами, полностью покрывающими поле зрения. Особенностью инициированной кристаллизации сыворотки крови мыши слушп^гтс^гствие во всех зонах образца разломов.

Крыса

Свинья

Рис. 11. Тезиграфические фации сыворотки крови человека и некоторых животных (базисное вещество - 0,9% раствор хлорида натрия; увел. х56)

Таблица 3. Тезиграфический «паггерн» сыворотки крови мыши и крысы в

Параметр Крыса Мышь

Основной тезиграфический коэффициент 1,28±0,14 1,79±0,12*

Коэффициент поясности 2,14±0,18 1,58±0,17*

Кристалличность 1,65±0,17 1,21±0,13*

Четкость краевой зоны 2,79±0,26 1,48±0,15*

Равномерность распределения элементов 3,71±0,28 3,94±0,44

Выраженность ячеистости 3,20±0,34 1,40±0,27*

Четкость текстуры 1,35±0,15 0,87±0,12*

Зонализация 0,54±0,14 0,32±0,19

Степень деструкции фации 0,84±0,10 0,37±0,12*

Сведения, полученные при визуальной оценке тезиграфического теста, верифицированы путем применения собственной системы количественных и полуколичественных критериев (табл. 3). Характеризуя обнаруженные вариации, необходимо подчеркнуть существенно более высокую инициирующую способность изучаемой биосреды мышей по отношению к раствору хлорида натрия по сравнению с таковой у крыс (по значениям основного тезиграфического коэффициента - р<0,05). Данный факт может быть частично объяснен большими абсолютными габаритами кристаллов, формирующих тезиграфическую фацию бисубстрата у крыс, относительно аналогичных для мышей, о чем свидетельствует соотношение уровней кристалличности у представителей исследуемых видов животных ¿><0,05). В реальных образцах эти характеристики находят отражение в том, что у мышей микропрепарат имеет большую плотность за счет одиночных и мелких дендритных структур, а у крыс - меньшую за счет более крупных образований.

В то же время спектр молекулярных масс компонентов биоматериала крыс шире, чем у мышей, на что указывает повышенный уровень коэффициента поясности образца (р<0,05). Данный тезис дополнительно подтверждает вышеуказанные тенденции, т. к. большая гетерогенность компонентов биосубстрата крыс может способствовать оттеснению разнородных кристаллических и псевдокристаллических элементов друг от друга, обеспечивая пространство для формирования крупных дендритных структур! На значимое участие кристаллопротеома в кристаллизации образцов сыворотки крови косвенно указывает больший относительный диаметр краевой белковой зоны микропрепаратов крыс по сравнению с таковыми мышей (р<0,05). Составляющие кристаллопротеома в данном случае могут выступать, с одной стороны, как модуляторы дендритного кристаллогенеза, а, с другой стороны, как его зародышеобразователи. В пользу выдвигаемой концепции можно привести и выраженность ячеистости рассматриваемых образцов. Так, ее достоверно более высокий уровень в тезиграммах сыворотки крови крыс дополнительно верифицирует обнаруженную тенденцию к формированию в динамике высыхания микропрепарата определенных «островков» отдельных типов (потенциально дифференцированных по химическому составу), при окончательной дегидратации трансформирующихся в ячеистость. Подобные особенности инициированного кристаллогенеза сказываются и на четкости текстуры фации, что связано с большим сродством к молекулам воды у более структурированных надмолекулярных элементов кристаллопротеома (нанокристаллы, кристалломицеллы и их агрегаты) по сравнению с низшими, моно- или олигомолекулярными (белки, аминокислоты). Превалирование структур кристаллического и псевдокристаллического строения над аморфными телами, с наших позиций, детерминирует более высокую степень деструкции фации биосубстрата крыс по отношению к таковой для дегидратированных образцов исследуемой биосреды мышей (р<0,05). На основании вышеперечисленного можно предположить, что кристаллопротеом изучаемого биосубстрата крыс в большей степени представлен более структурированными компонентами. Близкий уровень равномерности распределения элементов по текстуре образца (р<0,05) в фациях изучаемого биосубстрата лабораторных животных может быть обусловлен примененным единым базисным веществом, выступающим в качестве основного кристаллообразователя. Данный факт может определять и аналогичную сформированность зон тезиграмм у представителей обоих видов животных.

Рис. 12. Оптическая плотность кристаллоскопических фаций сыворотки крови крыс и мышей в норме (* - уровень статистической значимости межвидовых

различий р<0,05)

Вышеперечисленные исследования базируются на визуальном изучении кристаллоскопических и тезиграфических фаций, всегда содержащем субъективный компонент. Поэтому для верификации видовых особенностей свободного и инициированного кристаллогенза сыворотки крови нами впервые применен биоспекгрометрический анализ микропрепаратов, позволяющий оценивать оптическую плотность образцов высушенных биологических жидкостей. Для унификации проведения данного метода все фации биосубстратов, подвергаемые биоспектрометрии, изучают в едином диапазоне длин волн (300-450 нм) с акцентом на исследование значений оптической плотности биокристаллов в трех опорных точках (300, 350 и 400 нм).

:акрыса. . <амыа1Ь1

Рис. 13. Результат спектрометрии тезиграфических фаций сыворотки крови крыс и мышей в норме (базисное вещество - 0,9% раствор хлорида натрия; * - уровень статистической значимости межвидовых различий р<0,05)

При изучении уровня оптической плотности кристаллограмм сыворотки крови крыс и мышей установлено, что данный показатель статистически

значимо выше у образцов мышей (р<0,05), причем подобная закономерность прослеживается на всех рассмотренных длинах волн (рис. 12). Это обстоятельство, по нашему мнению, объясняется более высокой плотностью кристаллических структур в микропрепаратах биосубстрата мышей, что ранее подчеркивалось при визуаметрическом анализе их кристаллоскопических фаций. Индикатором плотности элементов образца выступает кристаллизуемость как основной показатель ее количественной оценки.

Важно подчеркнуть, что между уровнем оптической плотности микропрепаратов и значениями соответствующих оценочных показателей визуаметрии (индекс структурности, кристаллизуемость, равномерность распределения элементов по текстуре и выраженность ячеистости образца) выявлены статистически значимые положительные корреляционные связи средней и высокой силы (г= +0,618; +0,824; +0,497 и +0,531 соответственно; р<0,05 для всех корреляций).

Данные спектрометрии тезиграфических фаций сыворотки крови крыс и мышей, как и результаты их визуаметрии, свидетельствуют о наличии выраженных видовых различий инициированного кристаллообразования исследуемой биосреды данных лабораторных животных (рис. 13). Так, значимые вариации оцениваемого параметра обнаружены на длинах волн 300 и 350 нм (р<0.05).Проведенный корреляционный анализ относительно количественных морфометрических показателей тезиграфии (основной тезиграфический коэффициент, коэффициент поясности, кристалличность и выраженность ячеистости) позволил выявить наличие статистически значимых положительных корреляционных связей средней и высокой силы (г= +0,804; +0,420; +0,789 и +0,492 соответственно; р<0,05 для всех корреляций). Этот факт дополнительно верифицирует данные визуаметрии кристаллоскопических и тезиграфических фаций, а также косвенно подтверждает предполагаемые особенности кристаллопротеома лабораторных животных изучаемых видов.

8. Кристаллогенные и инициирующие свойства биосубстратов животных при экспериментальных паразитозах

Особенности собственного кристамогенеза мочи мелких грызунов при моделировании гельминтозов

Для проведения исследований использованы мыши массой 45-50 г (при заражении и заборе материала) и крысы массой 75-100 г — при заражении и 100120 г - при наборе биосреды. Мыши были заражены Trichinella spiralis (штамм ВИГИС) и Echinococcus multilocularis (штамм ВИГИС). Забор мочи производился безаппаратным способом. Пробы мочи были взяты у здоровых и зараженных гельминозами животных (трихинеллез, альвеококкоз).

Выполнялось сопоставление кристаллоскопических картин, полученных от здоровых и больных животных (рис. 14-15). Результат высушивания мочи мышей, зараженных Trichineüa spiralis, значительно отличается от фаций, полученных от здоровых животных. В частности, наибольшие вариации зарегистрированы нами при анализе одиночно-кристаллического компонента, в отношении которого наблюдаются как качественные, так и количественные сдвиги. Так, при свободной кристаллизации исследуемого биосубстрата четко выявляются «прямоугольники», отсутствующие в фации здоровых мышей, но обнаруживаемые в единичном количестве у практически здоровых людей.

Количественные различия у животных, имеющих трихинеллез, отмечены по встречаемости кристаллических фигур типа «пирамида». С другой стороны, существенно снижается количество аморфных образований в поле зрения при

сохранении их размера и типа взаимодействий с крупными кристаллами, что, возможно, имеет компенсаторное значение. Дендритная составляющая микропрепарата у зараженных животных, как и у здоровых мышей, слабо выражена, но представлена не линейчатыми образованиями, а пластинчатыми прямоугольниками. Итак, кристаллограмма мочи здоровых мышей существенно отличается от морфологии образцов высушенной биожидкости человека по всем изучаемым параметрам, а присутствие Trichinella spiralis существенно трансформирует результат кристаллогенеза биосреды.

□ ззоромя мш> с Г SF-jai*

1 i ' rt-

сдф

Рис. 14. Дополнительные критерии оценки результата свободного кристаллогенеза у здоровых и больных мышей

□ здоровая крыса

□ крыса с эхинококковом

1-й г-±- -i-

0.2

сдф

Рис. 15. Дополнительные критерии оценки результата свободного кристаллогенеза у здоровых и больных крыс

Нами также была проанализирована кристаллоскопическая картина мочи здоровых и имеющих эхинококкоз крыс. К параметрам, по которым возможна идентификация образца биосреды как микропрепарата мочи, являются преобладание в кристаллической составляющей одиночных прямоугольников, суммарно занимающих до трети площади поля зрения; отсутствие фигур типа «мох», «лук», «комета», характерных для морфологии дегидратированной мочи человека, а также размер аморфных тел. Вышеуказанные критерии должны расцениваться как специфичные относительно фаций мочи крыс. Представляет определенный физиологический и диагностический интерес значительно выраженное повышение «ассортимента» и количества кристаллических и аморфных образований (кристаллизуемости, являющейся основным количественным показателем кристаллогенеза биологической жидкости)

высушенной оцениваемой биожидкости крыс, зараженных альвеококкозом. В образцах мочи больных крыс нами обнаружены все известные на данный момент виды одиночных кристаллов в значительном количестве. Дендритный компонент также включал различные поликристаллические морфотипы, наиболее постоянными из которых являлись линейчатые кристаллы, преимущественно с углом расхождения фрагментов в 180°, пластинчатые прямоугольники и крупные по размеру фигуры типа «хвощ», не встречаемые в фациях мочи практически здоровых людей и крыс. Данные особенности, по нашему мнению, могут быть ассоциированы с присутствием альвеококка в организме животного. Аморфная картина имела лишь количественные отличия в сторону повышения по сравнению аналогичной у здоровыми крысами.

Норма

Трихинеллез

Собственная кристаллизация

Тезиграфия с 0,9% раствором

Кроме использования морфологического подхода к интерпретации кристаллограмм рассматриваемой биосреды, применялась система дополнительных критериев оценки, позволившая уточнить полученные при визуальной морфометрии данные (рис. 14-15). При исследовании рассматриваемых параметров у здоровых и зараженных Trichinella spiralis мышей установлено, что для микропрепаратов высушенной мочи у обеих групп животных характерна низкая и недостоверно различающаяся равномерность распределения структур, что свидетельствует о значительной хаотичности процесса кристаллообразования данной биосреды в норме и при изучаемой патологии. Наиболее существенные по абсолютной величине и достоверные

Рис. 16. Кристаллоскопическая и тезиграфиче

здоровых и зараженных трихинеллезом свиней

различия (р<0,05) обнаружены в отношении выраженности ячеистости картины и степени ее деструкции. Нами было выявлено снижение первого из указанных показателей в 2,35 раза (р<0,05), что косвенно демонстрирует уменьшение количества очагов (участков) стяжения кристаллогидратов и, возможно, изменению концентрации в исходной моче кристаллоскопически невизуализируемых соединений. Однако предположение о трансформациях белкового состава биологической жидкости, формирующееся первично, опровергается отсутствием как в контрольных, так и в опытных образцах краевой зоны (по ее четкости - критерий Кз).

Выявленные в отношении фаций мочи мышей в норме и при патологии тенденции сходно проявляются и при исследовании образцов изучаемой биожидкости крыс, но у них наблюдаются существенные особенности реагирования на присутствие и метаболическую активность гельминта (рис. 15). В частности, к общим чертам относятся достоверное снижение равномерности распределения структурных элементов по текстуре фации у больных крыс по сравнению со здоровыми (р<0,05), сопровождаемое выраженным ростом степени деструкции фации у представителей опытной группы по отношению к контрольной (р<0,05) с практически полного отсутствия данных тенденций до умеренного разрушения элементов картины.

Морфология фаций сыворотки крови свиней при трихинеллезе

В целях составления диагностического алгоритма проведена оценка результатов собственного и инициированного кристаллогенеза сыворотки крови 36 здоровых свиней и 30 свиней, зараженных Trichinella spiralis (штамм ВИГИС, доза возбудителя - 1000). Для этого на 30 день после заражения производили получение биожидкости.

Таблица 4. Диагностический кристаллоскопический «паттерн» сыворотки _крови свиней при трихинеллезе_

Параметр Диагностический диапазон

Индекс структурности 0-0,5

Кристаллизуемость 0-0,5

Тип кристалло-аморфного взаимодействия Налипание

Степень деструкции фации 2-2,5

Равномерность распределения элементов 1,5-2

Выраженность ячеистости 2,5-3

Выраженность зон фации 1-1,5

Четкость краевой зоны 4-4,5

Выраженность текстуры фации 0,5-1

Анализ собственной и инициированной кристаллизации сыворотки крови позволил верифицировать различия кристаллоскопических и тезиграфических образцов у здоровых и зараженных трихинеллезом свиней, а также установить достаточный уровень критериев тезиокристаллоскопии биосреды для достижения чувствительности и специфичности теста более 75%. Полученную совокупность значений и сами образцы сопоставляли с составленными на основании проведенного ранее исследования картинами собственной и инициированной кристаллизации и тезиокристаллоскопическим «(паттерном» (рис. 16; табл. 4-5). При совпадении с «паттерном» не менее 6 значений параметров тезиокристаллоскопии фиксировали наличие трихинеллеза.

Таблица 5. Диагностический тезиграфический «паттерн» сыворотки крови _свинт при трихинеллезе (базисное вещество - 0,9% раствор хлорида натрия)

Параметр

Основной тезиграфический коэффициент Коэффициент поясности

Степень деструкции фации

Кристалличность

Равномерность распределения элементов

Выраженность ячеистости

Выраженность^он фации_

__ _Четк0стъ_краев01^501^1 Выраженность текстуры фацщГ

Диагностический диапазон

0,53 8±0,067

0,41 [±0/152

2,5-3

0-0,5

1,5-2

3-3,5

0,5-1

4-4,5

1-1,5

Кристаплогенез желчи при спонтанном фасциолезе животных Следующий фрагмент работы посвящен исследованию диагностических возможностей изучения свободного и инициированного кристаллогенеза биосубстратов при экспериментальном и спонтанном фасциолезе. Проведенные исследования позволили установить «паттерны» тезиокристаллоскопии желчи животных при фасциолезе.

.......—---------------- -

тг р-

□ Здоровое животное О Фаециолез

ггГН ГТ

□ Здоровое животное О Фаециолез

СДФ

Кр СДФ

А. Образцы желчи нутрий Б. Образцы желчи коров

Рис. 17. Особенности кристаллогенеза желчи нутрий и коров при фасциолезе

Так, на рисунке 17 приведены данные визуальной морфометрии кристаллограмм биосреды нутрии и коровы Установлено, что наличие фасциолеза является фактором, способствующим изменению состава и физико-химических свойств желчи изученных животных, однако у представителей различных видов сдвиги носят разнонаправленный характер. У нутрий паразитоз обуславливает повышение кристаллизуемости биосреды, сопровождаемое нарастанием деструктивных признаков, а также снижением доли нативных протеиновых компонентов в биологической жидкости.

У коров изменения, связанные с заранжением фасциолами, проявляются в форме усиления структуризации биосубстрата с одновременным упрощением образующихся элементов. В то же время у данного вида животных выраженность деструктивных изменений формы кристаллических структур значимо не возрастает. Четкость краевой белковой зоны фации снижается в той

же степени, что и у нутрий, имеющих данный паразитоз. Кроме того, по большинству характеристик обнаруживаются корреляционные связи высокой силы (р<0,05) с показателями оптической плотности этих фаций.

9. Сравнительная биокристалломная характеристика основных биологических субстратов организма здорового человека

Теоретически изучению с использованием биокристаллоскопических методов исследования могут быть подвергнуты любые биологические субстраты, однако наиболее часто в работах медико-биологического профиля в качестве биоматериала для оценки кристаллогенных свойств выступают сыворотка или плазма крови, слюна или моча. Это объясняется не только достаточной простотой их получения, но и тем обстоятельством, что данные биожидкости позволяют интегрально описать метаболический статус организма пациента. Приведенный комплекс жидких биосубстратов составляет основу кристаплодиагностики метаболического статуса и его нарушений у человека.

С этой целью нами проведено исследование характера кристаллизации указанного биоматериала 50 практически здоровых людей (возраст 18-25 лет) в тезиокристаллоскопическом тесте. На основании этого были составлены «паттерны» собственной кристаллизации наиболее часто используемых для биокристалломного анализа биосубстратов (табл. 6).

Рассматриваемые биологические жидкости обладают субстрат-специфичными кристаллогенными свойствами, что находит отражение в статистически значимых различиях значений визуаметрических параметров для фаций сыворотки крови, слюны и мочи. Так, индекс структурности и кристаллизуемость монотонно убывают в ряду «сыворотка крови - слюна -моча», причем по первому показателю эта тенденция выражена более четко, о чем свидетельствуют достоверные различия между всему исследуемыми биосредами (р<0,05). Минимальная кристаллогенная активность мочи прежде всего связана с присутствующими в ней химическими факторами стабилизации ее коллоидного состояния (например, литостатин), практически не обнаруживаемыми в других биосредах. Вариабелен у данных биосубстратов и тип взаимодействия кристаллических и аморфных элементов.

Таблица 6. Кристаллоскопический «паттерн» некоторых биологических _жидкостей практически здоровых людей__

Параметр Сыворотка 1фОВИ Слюна Моча

Индекс структурности 1,67±0,15 1,24±0,14* 0,54±0,20* "

Кристаллизуемость 1,61±0,19 1,44±0,13 0,45±0,17* +

Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел оттеснение налипание оттеснение

Степень деструкции фации 0,64±0,10 0,71 ±0,34 1,36±0,15*"

Четкость паевой зоны 2,26±0,18 1,47±0,25* 0,27±0,17* +

Зонализация 0,31±0,12 1,28±0,29* 0,63±0,21 *

Выраженность ячеистости 4,05±0,52 2,08±0,15* 1,37±0,29*"

Равномерность распределения элементов 3,84±0,36 3,38±0,27 2,31±0,24* +

Четкость текстуры 1,27±0,16 | 0,41±0,32* 0,91±0,38

Примечание: * - достоверность относительно показателя для сыворотки крови р<0,05; + - достоверность относительно показателя для слюны р<0,05

Таблица 7. Тезиграфический «паттерн» некоторых биологических жидкостей _здоровых людей (базисное вещество - 0,9% раствор хлорида натрия)

Параметр Сыворотка крови Слюна Моча

Основной тезиграфический коэффициент 1,80±0,16 2,12±0,23 2,29±0,30*

Коэффициент поясности 1,72±0,15 1,86±0,20 2,09±0,27*

Кристалличность 2,17±0,24 1,95±0,26 1,46±0,18*

Четкость краевой зоны 2,57±0,21 1,55±0,18* 0,34±0,16* "

Равномерность распределения элементов 3,69±0,25 2,50±0,19* 1,23±0,24* +

Выраженность ячеистости 2,18±0,20 1,75±0,16* 0,43±0,24* т

Четкость текстуры 2.31±0,19 0,62±0,30* 1,27±0,19* "

Зонализация 1,25±0,16 1,54±0,21 1,33±0,18

Степень деструкции фации 0,38±0,28 0,78±0,32 0,91±0,23*

Примечание: * - достоверность относительно показателя для сыворотки крови р<0,05; - достоверность относительно показателя для слюны р<0,05

Неодинаковое содержание белковых молекул в изучаемом биоматериале детерминирует выраженные различия уровня параметра «четкость краевой зоны», непосредственно определяющимся долей протеинового компонента биожидкости. В этой связи биосреды с высоким содержанием белков имеют высокие значения показателя, а депротеинизированная в норме моча -практически отсутствующую краевую зону. В отношении дополнительных оценочных критериев кристаллоскопических фаций описываемых биожидкостей (зонализация, выраженность ячеистости, равномерность распределения структур по текстуре образца и четкость формирования последней) нужно также отметить существенные вариации. В целом, морфометрический анализ кристаллограмм указанных биосред позволил дополнительно верифицировать особенности их свободного кристаллогенеза.

Таблица 8. Уровень оптической плотности кристаллоскопических фаций ___биожидкостей организма здорового человека

Длина волны, им Значение оптической плотности, усл. ед. (М±сг1

Сыворотка крови Слюна Моча

300 0,363±0,073 0,595±0.102* 0,415±0,067+

350 0,146±0,025 0,084±0,014* 0,108±0,024

400 0,086±0,021 0,049±0,011 0,040±0,018*

Примечание: * - достоверность относительно значения показателя, характерного для сыворотки крови р<0,05; + - достоверность относительно значения показателя, характерного для слюны р<0,05

В таблице 7 отображены сведения о нормативах инициированного кристаллогенеза данных биосред (при использовании 0,9% раствора хлорида натрия) у практически здоровых людей. Изучение особенностей инициированного кристаллогенеза сыворотки крови, слюны и мочи позволило продемонстрировать различия инициаторного потенциала биосред. Так, максимальным инициирующим эффектом обладают образцы мочи, а наименьшим среди оцениваемых биожидкостей - сыворотка крови, причем

различия между данными биосубстратами по этому параметру достоверны (р<0,05). Аналогичные тенденции зарегистрированы по коэффициенту поясности микропрепаратов, что указывает на наибольший разброс компонентов по молекулярным массам в фациях мочи (р<0,05).

Таблица 9. Уровень оптической плотности тезиграфических фаций _биожидкостей организма здорового человека

Длина волны,нм Значение оптической плотности, усл. ел ГМ+гт)

Сыворотка крови Слюна Моча

300 0,517+0,044 0,381+0,054* 0,276±0,025* +

350 0,198±0,030 0,117+0,012* 0,076+0,014* +

400 0,056±0,022 0,048±0,009 0,034+0,012

Примечание: * - достоверность относительно показателя, характерного для сыворотки крови р<0,05; + - достоверность относительно показателя характерного для слюны р<0,05

Следует отметить, что в норме в фациях исследуемого биоматериала соблюдается баланс «плотность кристаллов / структурированность кристаллов», что подтверждается обратной динамикой основного тезиграфического коэффициента, являющегося основной количественной характеристикой результата инициированного кристаллообразования биосреды, и кристалличности образцов, отражающей сложность построения элементов тезиграммы и являющейся прямым аналогом индекса структурности. Реальность физиологического сопряжения этих свойств биосубстратов верифицирована данными корреляционного анализа (г=-0,73 8+0,114; р<0,05).

Одним из постоянных признаков тезиграфических микропрепаратов биожидкостей организма практически здоровых людей является низкий уровень деструкции структурных элементов. Эта особенность в меньшей степени относится к фациям мочи, что, возможно, связано с их сравнительно малой кристалличностью при выраженном инициаторном потенциале, визуализируемом по значениям основного тезиграфического коэффициента' превышающего в данной биосреде уровень, выявленный для остальных изученных биосубстратов (р<0,05). Для тезиграмм сыворотки крови, мочи и слюны свойственны специфичные значения большинства дополнительных параметров визуаметрии, кроме четкости формирования отдельных зон фации.

0,25 ;---

?1 121 152 гв2

•0,05 - — - - . ______, ......

Рис. 18. Биогравиметрическая кривая дегидратации сыворотки крови человека

38

Верификация различий кристаллогенных свойств исследуемых биосред проводилась спектрометрически (табл. 8-9). Установлено, что оптические характеристики микропрепаратов также существенно варьируют.

В качестве примера применения одного из подходов к исследованию кристаллогенных свойств биосреды приведен результат биогравиметрического теста - способа повременной регистрации убывания массы образца в процессе удаления жидкой части биосреды (рис. 18).

10. Аналнз модуляции кристаллогенных свойств некоторых биологических жидкостей человека и животных при альвеококкозе

Изучено 20 дегидратированных образцов мочи крыс, экспериментально зараженных альвеококками (инфицирующая доза - 1000), 25 здоровых крыс а также слюны и мочи 10 пациентов, страдающих данным заболеванием '

смешанной слюны и мочи при альвеококкозе человека и к-пЧ<-

Параметр Моча Слюна

Крысы Люди Люди

1 1 2 I 2 1 1 2

Одиночные кристаллы

Прямоугольники оо 00 1 3 4 2

Призмы 0 1 0-1 1 2 0

Пирамиды 1 2-3 0 2 1 1

Дендритные структуры

Линеичатые 2 4 0-1 2 1 0

Прямоугольники 3 2 0-1 2 0-1 3

«Мох», «лук» 0 0 2-3 0 2-3 10

«Кресты» 2 0-1 0 0 0-1 2

«Хвощ» 0 1-2 0 0 0 0

Аморфные образования

Размер мелкие мелкие крупные мелкие средние средние

Количество среднее много мало среднее среднее много

Тип взаимодействия оттеснение оттеснение оттеснение оттеснение налипание налипание

Дополнительные критерии

Равномерность плотности 4,1 ±0,5 2,3±0,3* 4,3±0,4 1,5±0,1* 3,8±0,4 2,1±0,2*

Ячеистость 1,3±0,3 2,4±0,3* 1,2±0,3 3,4±0,4* 0,8±0,3 2,6±0,4*

Степень деструкции фации 0,2±0,4 1,7±0,4* 0,4±0,3 2,0±0,2* 0,5±0,3 1,9±0,2*

Выраженность краевой зоны 0,4±0,1 0,3±0,2 0,3±0,4 1,8±0,2* 2,4±0,5 3,7±0,4*

Примечание: 1 - здоровые испытуемые, 2 - больные или зараженные альвеококкозом; «*» - статистическая значимость различий р<0,05

Кристаллоскопический «паттерн» высушенных образцов мочи здоровой крысы оказался достаточно своеобразным, качественно и количественно отличающимся как от морфологии дегидратированной биожидкости человека (табл. 11). Так, при альвеококкозе у человека фациях мочи обнаружено появление фигур типа «пирамида», сопровождающееся исчезновением «октаэдров». В дендритной картине наблюдается тенденция к уменьшению размеров структур, в аморфной - дробление элементов (увеличение количества при меньших габаритах). В образцах слюны пациентов по сравнению с практически здоровыми лицами установлено обеднение одиночно-кристаллического компонента за счет «призм» и «октаэдров», укрупнение дендритов при увеличении доли аморфных образований.

При анализе дополнительных критериев обнаружено снижение равномерности распределения элементов по текстуре фации у больных крыс и людей по сравнению со здоровыми (р<0,05), сопровождаемое выраженным ростом степени деструкции фации (р<0,05), что указывает на хаотизацию фации. В образцах мочи и слюны пациентов наблюдается повышение содержания белковой составляющей (по критерию Кз).

Обнаруженное соотношение коэффициентов и Р указывает на то что трансформация свойств биологических жидкостей, а, следовательно и их инициаторного потенциала, вследствие наличия альвеококкоза демонстрирует сходные тенденции (установленные по параметру 0) при существенно различающемся компонентом составе (косвенно оцениваемом по показателю Р). Данный факт свидетельствует об общности метаболических перестроек происходящих в жидкой ткани организма больных с рассматриваемой патологиеи, несмотря на ее структурную неоднородность. Это подтверждается практически полным соответствием между инициаторным потенциалом смешанной слюны и мочи пациентов в отношении всего ряда базисных веществ (по коэффициенту С}). Коэффициент Р, указывающий на дисперсию молекулярных масс компонентов анализируемого биосубстрата, существенно варьирует по абсолютному большинству кристаллообразователей, что в частности, ассоциировано с дифференцированностью биосред по балансу между органическими и минеральными составляющими. Это предопределило установление контрольного уровня Р, равного 2, при котором имеет место баланс между ними.

А. Практически здоровый человек Б. Пациент с альвеокоюсозом

Рис. 19. Примеры фаций практически здоровых и имеющим альвеоккокоз испытуемых. Увеличение х56

Пример преобразования кристаллоскопической картины слюны пациента с альвеококкозом представлен на рисунке 19.

Результаты исследования позволяют предположить, что присутствие в организме человека и крысы альвеококка способствует формированию специфических изменений свободного и инициированного кристаллогенеза слюны и мочи, а, следовательно, сдвигах физических свойств и химического состава последних. Важно отметить, что рассматриваемые биосреды человека при альвеококкозе обладают вариабельным модулирующим эффектом на изученные базисные вещества, однако наличие данного паразитоза направлено изменяет кристаллогенные свойства слюны и мочи.

11. Анализ кристаллогенных свойств биологических жидкостей пациентов с альвеококкозом в послеоперационном периоде

Изучение особенностей собственной кристаллизации слюны пациентов с

глТГГ В °?ДЛеПН0М ПерИОДе П0СЛе радикальной операции позволило установить (рис. 20), что по основных параметрам, характеризующим сложность структуропостроения и плотность кристаллических элементов (индексу структурности и кристаллизуемое™), уже через 2 недели после выписки из стационара регистрируются значения, минимально отличающиеся от физиологических (р>0,05). В дальнейшем они практически не изменяются выходя на плато. Сохранность дизметаболических изменений состава и свойств слюны верифицирована нами на основании оценки интегрального показателя «правильности» кристаллогенеза - степени деструкции фации высушенной биосреды. Так, оставаясь на достаточно высоком уровне по выписке она существенно снижается в первой точке наблюдения (через 2 недели) но значимо превышает уровень показателя, установленный для практически здоровых людей (р<0,05). Через месяц после выписки рассматриваемый параметр уже не отличался от физиологических значений, а через 3 месяца он продолжал снижаться, оставаясь при этом в диапазоне нормы.

здоровые после через 2 через I через 3 .ноли операции недели месяц меся ш

А. Кристаллограммы слюны Б. Кристаллограммы мочи

Рис. 20. Данные морфометрии кристаллофамм биожидкостей при альвеококкозе в отдаленном послеоперационном периоде

Аналогичная динамика выявлена и для выраженности краевой зоны образца (рис. 20), однако в отношении данного параметра его значение оставалось выше полученного для образцов слюны представителей группы сравнения и через 1 месяц после выписки из стационара. Только через 3 месяца после выписки больных в микропрепаратах слюны происходит нормализация данного показателя. Наиболее стойкие изменения выявлены в отношении степени деструкции фации. Данный показатель демонстрирует четкую тенденцию к снижению, но сохраняется на повышенном уровне относительно контрольных значений даже через 1 месяц после выписки. Его нормализация

происходит только через 3 месяца, когда значение СДФ уже попадает в физиологический диапазон. Следовательно, можно говорить о наличии метаоолическихсдвигов продолжительностью до 3 месяцев с момента выписки

¡О черец Э месяца.

радикальная операции • □ черт 5 месяца ; нерздикальнал операция.

Рис, 21. Динамика кристаллогенных свойств слюны пациентов с

альвеококкозом в зависимости от радикальности оперативного лечения

Также в рамках общей концепции исследования произведена оценка динамики сдвигов кристаллогенных свойств мочи в отдаленном послеоперационном периоде. Обнаружено, что в кристаллограммах данной биологической жидкости выраженность изменений была более существенной чем в слюне. Так, через 2 недели после выписки из стационара полноценная нормализация происходит только в отношении кристаллизуемости - в дальнейшем данный уровень данного параметра выходит на плато ' не отличаясь от физиологического «паттерна» мочи (р>0,05). В первой точке амбулаторного наблюдения также существенно снижаются и другие показатели, однако через 2 недели они продолжают оставаться на уровне превышающем установленный для практически здоровых людей (р<0 05)' Наиоолее быстрыми темпами снижаются выраженность краевой зоны микропрепарата и его индекс структурности, достигающие нормы значений через 1 месяц после выписки пациентов из стационара и продолжающие умеренно падать в последней^ошттной точ^Хчерез 3 месяца).

. О здоровые люди в до операции

О через 3 месяца радикальная

□ через 3 месяца нералнкальная операция

Рис. 22. Результаты спектрометрического исследования фаций слюны пациентов с альвеококкозом в зависимости от радикальности операции

Также нами проведено сопоставление реализации кристаллогенного потенциала слюны через 3 месяца у пациентов с альвеококкозом Г^етом того была ли проведена радикальная операция (рис. 22). В соответствии с данными предыдущего раздела работы, в этот период большинство м0рфомс~ских показателей кристаллоскопической фации слюны нормализуются. ИсГючение составляет только выраженность краевой зоны, где дополнительно ^ физиологическим компонентам могут концентрироваться транспортируемые

3;3ЛМаТ°"СМ1ШарНМЙ барЬСр аНТИТела С « альвеококку. Напротив

выполнение пациенту паллиативного вмешательства, в раннем периоде после

жиТГД" ЧаСТИ™° Н0РМ2ЛИЗУЯ кристалле генную активность ротовой жидкости в дальнейшем нивелируют это позитивное действие на метаболизм

бплТХ ™Т'°ДНТ Шражепис в том> что У Рассматриваемой категории больных через 3 месяца послеоперационного периода значения оценочных показателей кристаллограмм слюны снова патологически трансформируются практически возвращаясь к дооперационному уровню (р>0,05 по сравнению с исходными значениями показателей). Только степень деструкции фации существенно повышаясь, не достигает его (р<0,05). ^ фации,

тя,тЭЛТеНДеНЧИИ отчетливо визуализируются по результатам спектрометрии кристаллограмм слюны пациентов основной группы и группы сравнения (рис 1ак, оптическая плотность кристаллоскопических фаций лиц, перенесших радикальное оперативное вмешательство, через 3 месяца после выписки из стационара не отличается от установленной для практически здоровых людей

™Г Г35° ПМ' При КОТОрОЙ ур0вень этого паРаме^ превышает норму (р<0,05). Напротив, спектроскопический «паттерн» слюны больных с альвеококкозом через 3 месяца после проведения паллиативного лечения полностью повторяет дооперационный уровень.

В целом, характеризуя совокупность метаболических эффектов оказываемых на кристаллостаз организма человека развитием альвеококкоза' можно заключить, что они носят направленный характер и могут быть' полностью обратимыми при проведении радикального лечения При этом реализация феномена паразит-ассоциированной кристаллизации на организменном уровне обеспечила сонаправленную трансформацию кристаллогенных и инициирующих свойств биологических жидкостей организма пациента в присутствии альвеококка, выраженность которой увеличивается при прогрессировании заболевания, завися как от метаболической активности самого гельминта, так и ответной реакции макроорганизма, в том числе иммунного ответа. Таким образом сдвиги кристаллостаза играют значимую роль в патогенезе альвеококкоза и могут быть зафиксированы и оценены с помощью комплекса биокристалломного исследования жидких сред организма, выступая в качестве диагностического критерия, а также показателя эффективности и радикальности оперативного вмешательства и течения раннего и отдаленного послеоперационного периода

Выводы:

1. Показано, что кристаллогенная активность биосреды (кристаллостаз) является параметром ее гомеостаза, отражающим совокупность ее компонентного состава и физико-химических свойств. Установлено, что кристаллогенные и инициирующие свойства биосред организма здоровых людей и животных являются видо- и субстратоспецифичными.

2. Выявлено, что характер дегидратационной структуризации биологической жидкости может быть направленно изменен под действием

физико-химических модуляторов, что продемонстрировано на примере метаболитов (лактата, пирувата и мочевины).

3. Паразиты и микроорганизмы обладают как непосредственным так и опосредованным влиянием на кристаллостаз биологических субстратов rífnA^l1 о микР00Рганизм"паРазит-ассоциированного кристаллогенеза LMIIAKJ). В основе феномена МПАК лежит метаболическая активность простейшего, микроорганизма или паразита, а также их поверхностные свойства. Результат МПАК является совокупностью модулирующего действия метаболитов микроорганизма и организма-хозяина в конкретных условиях (в частности, в биологической жидкости).

4. В модельных условиях яйца гельминтов демонстрируют специфические кристаллогенные свойства, отличающие их от инициаторных свойств микроорганизмов; в отношении паразитов, бактерий и грибов данный эффект является дозозависимым. Установлено, что яйца гельминтов (нематод, трематод и цестод) и колонии бактерий способствуют инициации кристаллогенеза хлорида натрия in vitro. В частности, даже единичные яйца Ascaris suum, Alaria alata и Hymenolepis nana вызывают существенную модификацию кристаллогенеза последнего, а для Escherichia coli и Staphylococcus aureus, взятых в количестве 106-Ю20КОЕ, отмечали нарастание основного тезиграфического коэффициента, кристалличности и степени деструкции фации вплоть до максимальных значений при исследовании Ю20 КОЕ Staphyllococcus aureus.

5. Присутствие гельминта (фасциол, трихинелл, эхинококков альвеоккоков и др.) в организме значимо и видоспецифично трансформирует кристаллогенные и инициирующие свойства биосубстратов организма-хозяина что способно выступать как основа диагностической технологии. В частности' чувствительность и специфичность кристаллодиагностики трихинеллеза свиней превышают 75%.

6. Паразит-ассоциированный кристаллогенез имеет патогенетическое значение, так как может рассматриваться как проявление метаболической адаптации гельминта к условиям макроорганизма, а оценка кристаллогенных свойств биологической жидкости может быть дополнительным эффективным инструментом изучения паразито-хозяинных взаимоотношений.

7. В отношении патогенеза гельминтозов биокристаллоскопические исследования являются эффективным и быстрым методом изучения саногенетических и танатогенетических процессов, позволяя интегрально мониторировать особенности и динамику физико-химического и компонентного состава биологических субстратов животных, и человека, что показано на примере моделирования трихинеллеза у крыс, а также до- и послеоперационного периода у пациентов с альвеококкозом печени.

8. Подтверждено, что исследование кристаллогенных свойств слюны и мочи человека обладает высокими чувствительностью и специфичностью (более 85/о) в диагностике альвеококкоза печени, а также позволяют в послеоперационном периоде оценивать радикальность проведенного вмешательства с точностью 88,1%.

9. Особенности кристаллоскопического анализа биоматериала (быстрота и простота выполнения, экономичность, высокая информативность и точность) позволяют рекомендовать их для более широкого использования в экспериментальной и прикладной паразитологии.

Практические рекомендации:

1. Для изучения кристаллостаза биосистем необходимо использовать биофизические технологии (визуаметрия, спектрометрия, исследование автомеханического импеданса и др.) с оценкой количественных параметров

2. Экспресс-диагностика гельминтозов может быть осуществлена ' с применением методов кристаллоскопического исследования сыворотки крови

ИЛИ МОЧИ животных. vpviivn криви

3. Слюна способна выступать в качестве индикатора состояния организма, в том числе может быть применена для неинвазинвной диагностики альвеококкоза у людей, а также оценки эффективности его лечения

4. Методы биокристалломики могут использоваться в качестве скрининг-теста на тканевые гельминтозы. v

Список основных печатных работ:

Монографии:

1. Воробьев А. В., Мартусевич А. К., Перетяган С. П. Кристаллогенез биологических жидкостей и субстратов в оценке состояния организма. Нижний Новгород: ФГУ «ННИИТО Росмедтехнологий», 2008. - 384 с

2. Мартусевич А. К. Биокристаллизация: гносеология, методология информативность. Киров: Типография Вятской ГСХА, 2008 - 150 с

3. Мартусевич АЖ. Биокристалломика в молекулярной медицине / Под ред.

«Триада>>Ш20ÎT. - П2 с ИзДаТеЛЬСТВ0 СПбГМУ' ТиеР'>: ООО «Издательство

4. Martusevich А. К., Ghdanova О. В., Rasputin P. G., Koshkin А N Disinfectant activity and crystallogenesis features of the new agent takine in consideration its concentration // Advanced disinfectants and safety techniques applied in pathogen treatment. - Kirov: RPCEM RACEM Ltd, 2006. - P. 204-214.

Патенты

1. Мартусевич A.K., Жданова О.Б., Написанова Л.А., Успенский AB »^fi?Д ™Сп°с°б прижизненной диагностики трихинеллеза свиней. Патент РФ №2423700 от 20.10.2010 г. (приоритет от 10.04.2009 г )

2. Воробьев А.В Мартусевич А.К., Погодин И.Е., Перетягин СЛ., Гришина A.A. (Бюлл №20 от 20.07.2011 г.). Патент РФ на изобретение №2424521 Способ ЗоТо 2009™ °Ж0Г0В0Й токсемнн: Зарегистрировано 20.07.2011 г. Приоритет от

Учебные пособия и рекомендации:

1. Мартусевич А. К. Количественная оценка результата свободного и инициированного кристаллогенеза биологических субстратов Учебное пособие. Нижний Новгород: ФГУ «ННИИТО Росмедтехнологий» 2008 - 28 с

2. Мартусевич А. К., Гришина А. А. Биокристалломика: общие представления, методология и методы исследования. Учебное пособие Киров-Типография ВГСХА, 2009. - 26 с. " '

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и в зарубежных журналах-

1. Мартусевич А. К., Жданова О. Б. Информативность исследования кристаллообразования при зоонозах на модели животных // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. - 2006. - №1. - С. 30-38.

2. Мартусевич А. К., Жданова О. Б., Янченко В. А., Камакин Н Ф Информативность изучения дегидратационных свойств биосред при альвеококкозе // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006 - N»9 -С 54

3. Мартусевич А. К., Жданова О. Б., Янченко В. А. Диагностическая роль кристаллогенеза биосубстратов пациентов с альвеококкозом // Анналы хирургической гепатологии. - 2006. - Т.11, №3. - С. 50.

4. Мартусевич А. К, Жданова О. Б.' Янченко В. А. Патогенетическое значение изучения кристаллообразования биологических жидкостей при альвеококкозе // Анналы хирург, гепатологии. - 2006. - Т. 11, №3. - С 50-51

5. Мартусевич А. К. К вопросу об особенностях краевой зоны кристаллоскопической фации биологических жидкостей // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - Т. 15, №3. - С. 112-113

6. Мартусевич А. К., Камакин Н. Ф. Кристаллография биологической жидкости как метод оценки ее физико-химических свойств // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, №3. - С. 358-360

7. Мартусевич А.К., Сафарова Р.И. Информативность исследования кристаллогенеза слюны спортсменов-лыжников в прогнозировании результативности их выступления // Вестник спортивной науки. - 2007. - №4. -

8. Мартусевич А. К., Камакин Н. Ф. Унифицированный алгоритм исследования свободного и инициированного кристаллогенеза биологических жидкостей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №6. - С. 21-24.

9. Мартусевич А. К. Кристаллографический анализ биосубстратов как новый метод клинической протеомики и метаболомики // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №9. - С. 4-5.

Ю.Мартусевич А. К., Жданова О. Б., Янченко В. А. О кристаллоскопической диагностике альвеококкоза // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. -

11.Martusevich А. К., Kamakin N. F. Ciystallography of biological fluid as a method of evaluating its physicochemical characteristics // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2007. - Vol. 143, N 3. - P. 385-388.

12. Мартусевич А. К., Жданова О. Б. Особенности свободного кристаллогенеза мочи здоровых и зараженных гельминтами грызунов // Труды Всероссийского института гельминтологии им. К.И. Скрябина. - 2007. - Т. 45. -С. 153-163.

13.Martusevich А. К., Zimin Yu. V., Bochkareva А. V. Morphology of dried blood serum specimens of viral hepatitis // Journal of Hepatitis Monthly - 2007 -Vol. 7, Iss. 4.-P. 207-210.

14.Martusevich A. K„ Kvitsinskaya N. A., Ghdanova О. B, Peretyagin P V About mdicatoiy role of the biosubstrates crystallogenesis // Eur. J Nat Hist - 2008 -№1.-P. 90-91.

15.Мартусевич А. К., Зимин Ю. В. Экспериментальная кристалломика -моделирование биокристаллогенеза // Вестник новых медицинских технологий -2008.-Т. 15, №1.-С. 14-17.

16.Zimin Yu. V., Bochkareva A. V., Solovyeva A. G., Martusevich А К Dynamics of lactate dehydrogenase catalytic activity // Bull. Int. Sci. Surg Assoc -2008. -Vol. 3, №1,- P. 49-50.

17.Мартусевич А. К. Особенности кристаллогенеза слюны в зависимости от характера питания школьников старших классов // Вопросы детской диетологии. -2008. - Т. 6, №1. - С. 12-15.

18.Киселева Ю. А., Мартусевич А. К., Перетягин П. В. Диагностическая информативность изучения кристаллогенеза биологических субстоатов желудочно-кишечного тракта у животных // Be™ PocÍSoro государственного медицинского университета. -2008 - №2 -С 295°ССИИСКОГО 9. Мартусевич Л К' Математические методы и двоичное' кодирование в экспериментальной и диагностической биокристалломике // Информатика и системы управления. - 2008. - №2. - С. 33-36 J f d™Ka и

20.Мартусевич А. К. Алгоритмизация системного анализа кристаллогенных и инициаторных свойств биологических субстратов орг^иТа человека и животных //Информатика и системы управления. -2008 №2 С 143-145

21.Мартусевич А. К. Биокристалломика как наука ' о спонтанном направленном и управляемом бнокристаллогенезе // Информатика и Системы управления. - 2008. - №2. - С. 145-148. "«^ирматика и системы

22.Мартусевич А. К., Колеватых Е.П., Зимин Ю. В. Кристаллогенез биоспся при^хеликобактериозе // Вестник новых медицинских техноZnT 2008 - Т

23.Мартусевич А. К., Жданова О. Б. Эколого-биологический аспект феномена микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза // Теоретическ^ и прикладная экология. - 2008. - №2. - С 15-22 юрешческая

24. Мартусевич А.К., Абрамова ТВ., Зверева Т.А. Тезиокристалло-скопическая характеристика водянистой влаги при катаркте р^ли^ой

■ степени зрелости // Вестник офтальмологии. - 2008. - Т 124 №6 р 37 40

25.Мартусевич А. К. Кристаллогенез биологических субстратов (сущность диагностаческая5И индикаторная роль) //Технологии живых систем. -2008 - 7.

26.Мартусевич А. К., Зимин Ю. В. Роль физико-химических процессов в %TotTJK^°PU2H.U5 ' ЧеЛ°ВеЮ> " ВеСТШК СШГМА ИМ' И" И" Мечникова.

27.Мартусевич А.К., Воробьев A.B., Камакин Н.Ф., Зимин Ю В Метол хромокристаллоскопи» в свете современной биокристалломики: сущность роль, перспективы // Вестник Нижегородского университета им НИ

Лобачевского.-2009.-№1,-С. 78-83.

28.Мартусевич А. К. Метод биокристаллопровокации в прогнозировании поведения биосистем макро- и микроуровня // Информатика и системы управления.-2009,-№4.-С. 36-38. у ^«ии системы

29.Гришина А. А., Мартусевич А. К. Практические возможности управления кристаллостазом организма (на примере меламин-ассоциированной патологии) и Информатика и системы управления. - 2009. - №4 - С 38-40

30.Мартусевич А. К., Гришина А. А., Камакин'Н. Ф. Модификация кристаллогенных свойств биожидкости субстратами содержащихся в ней ферментов//Информатика и системы управления. - 2009 -№4 - С 84-86

31.Мартусевич А. К., Воробьев А. В., Зимин Ю. В., Камакин Н Ф Визуаметрия и спектрометрия в кристаллосаливадиагностике // Российский стоматологический журнал. - 2009. - №4. - С. 30-32.

32.Мартусевич А.К., Русских А.П., Гришина A.A. Биокристаллодиагносшка уролитиаза у котов // Вестник Российского университета дружбы народов

серия. Агрономия и животноводство.-2009 - №4 -С 64-71

33.Martusevich А.К., Grishina A.A., Bochkareva A.V. CrystaJlodiagnostics of some animals helrmntosis // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine - ">010 -Vol. 3,N3.~P. 176-179. „uiv.

Bnn„i!apiyc™ A.K. Мировой «меламиновый кризис»: уроки, спорные Ж - С 50Р54ШеНИЫС пр0блемы " ВопР°сы детской диетологии. - 20Ш -Т

35. Марту севич А.К., Воробьев A.B., Гришина А.А, Русских АП Физиология и патология кристаллостаза: общая парадигм^ и пемпекгавы тГтуниверситета иГн.И ЛобХ™

•^н1б;МаР"ТуССВИЧ А-К- Процссс структурной самоорганизации биологических жидкостей при дегидратации: системный анализ // Информатика и "истомы управления.-2010.-№2.-С. 31-34. ч-^шм и системы

37.Мартусевич А.К., Гришина A.A. Компьютерная морфометаия в

äs

животных//ВестникРГМУ. -2010 -№2 - С 515-516 человека и

39.Мартусевич А.К., Гришина A.A.,' Камакин НФ Фармакобиокристалломика: современное состояние и перспективы ' // Молекулярная медицина.-2010. - №4 - С 22-25 F

40.Масленникова О.В., Жданова О.Б.,' Мартусевич А.К., Ашихмин СП Клюкина Е.С. Распространение Alaria Alata в Киевской областа и некоторые

i"0:™ ее '«кристаллизации с растворами дезинфектантов // Российский паразитологическии журнал.-2010 -№3 -С 73-76

И А'П" МаР^севич А.К. Инновационные подходы к мониторингу

и управлению патогенным минералообразованием в организме (на модели

6„o1toS¿C"BH4 А'К" Симонова Ж.Г. Кристаллогенные свойства биологическом жидкости при введении химического агента // Современные

технологии в медицине,-2011.-№1,-С 95-98 современные

44.Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г., Камакин Н.Ф. Панкреатические лектины: «Двуликий Янус» поджелудочной железы // Вестникновых

медицинских технологий,-2011.-Т XVIII №1 -С 12 16

45.Ашихмин С П., Жданова О.Б., Масленникова О.В.', Пестрикова О А Мутошвили Л.Р., Мартусевич А.К., Распутин П.Г., Клюкина Е С перспективы' ЕиГ"* /Р'™фаФ"ческих методов ди'агности™ альв"!™ в С 94-99 ™ Российский паразитологический журнал. - 2011 №1. !

46.Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г. Биокристаллоскопические методы в

Оренбургского государственного университета. - 2011. - №4 -С М0-141

48.Мартусевич А.К., Ашихмин С.П., Жданова О.Б. Янченко В А Сравнительный анализ модуляции кристаллогенных свойств HeKOTopbfx

биологических жидкостей человека и животных при альвеококкозе // Здоровье населения и среда обитания. -2011. - № 12 - С 31-33 -здоровье

49.Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г., ТарловскаяЕ.И. Helicobacter nvlori и патология сердечно-сосудистой системы: действительно лГп^Гк Сердцу лежит через желудок? // Российский кардиол. журнал. - 2012. - №3_ С 91-101

50.Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г., Камакин Н.Ф. ' Сомодуляция кристаллогенных свойств слюны и сыворотаи крови у пациентов с язвенной вГГЖоГ— физиологии и патологии "„ 2012

51.Ашихмин С.П., Мартусевич А.К., Жданова О.Б. Азид натрия- некоторые физико-химические свойства и потенциальное место в дезинфектологии // Здоровье населения и среда обитания. - 2012. - №4 - С 43-45

52.Zhdanova О.В Scheshunov I.V., Martusevich А.К., Artese F

- Vol1 1Е№40^ОрЬГЙ19Ш thC h°m0e0pathy "Int J" Hi8h Dilution Res. - 2012.'

Л™*™?™4 AK" Симонова Ж.Г., Иванникова E.B. Изучение Т"И Д/ГИДратШ1ИИ Роверов некоторых лекарственных средств и их комбинации с биологической жидкостью // Вестник СПбГУ - 2012 - Сеп 11 Медицина, Вып. 3. - С. 72-78. ' р'

п„Л4'Мар1уСеВИЧ А'К" Кривоногова П.Л., Ковалева Л.К. Изучение пространственно-временной организации кристаллогенеза биологических

20 "С. Д5Иза™5°4СТИЧеСКИЙ тест " Ве«„ик РУДН. Серия Медиана

55.Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г. Потенциальная патогенетическая роль периодических сдвигов кристаллостаза жидких сред организма // Вестник РУДН. Серия Медицина. - 2012. - №7. - С. 154-155

56.Мартусевич А.К., Жданова О.Б., Написанова Л.А. Биокристалломика в паразитологии: современное состояние, возможности и перспективы // госсийскии паразитологический журнал. —2012. - JV°4 - С 77-88

57.Мартусевич А.К., Ашихмин С.П., Симонова Ж.Г., Жданова ОБ изучение феномена микроорганизм-паразит-ассоциированного кристаллогенеза в модельных условиях // Здоровье населения и среда обитания.

- ¿VIJ. - №1. _ 42-44.

5 8. Мартусевич А.К., Ковалева Л.К., Костяев А.А. Особенности кристаллогенного потенциала крови мышей при экспериментальном л-фолеикозе // Вестник новых медицинских технологий. - 2013. - Т. XX, №1.

59.Мартусевич А.К., Жданова О.Б. Исследование зависимости кристаллогеннои активности биосреды от интенсивности инвазии Trichinella

spiralis//Российский паразитологический журнал.-2013 -№2 -С 78 85

60.Ашихмин СП., Жданова О.Б., Мартусевич А.К., Написанова ЛА клюкина Ь.С. Некоторые кристаллогенные свойства дезинфектантов и перспективы применения кристаллоскопической оценки в дезинфекции и

дезинвазии//Российский паразитологический журнал. - 2013 - №2 - С 102-

110.

61.Мартусевич А.К., Жданова О.Б., Написанова Л.А., Ашихмин СП Применение с1о1-Е1Л8А и биокристаллоскопии для прижизненной диагностики трихинеллеза // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 №2-3 С. 187. *

Статьи в других изданиях:

1. Мартуссвич А. К., Жданова О. Б., Каманин Н. Ф., Янченко В. А. Взаимодействие «Альвеококк - человек»: метаболические аспекты // Вятский медицинский вестник. - 2006. -№2.-С. 50-51.

2. Мартусевич А. К. Идеология изучения метаболической активности микроорганизмов кристаллографическими методами // Естествознание и гуманизм. - 2007. - Т. 4, №2. - С. 144.

3. Мартусевич А. К. Жданова О. Б., Ашихмин С. П. с соавт. К вопросу о паразитарно-микробной кристаллизации // Естествознание и гуманизм. - 2007. - Т. 4, №2. - С. 147.

4. Мартусевич А. К., Колеватых Е. П. К вопросу о микробной инициации кристалогенеза // Вятский медицинский вестник. - 2007. - №2-3. - С. 8-22.

5. Мартусевич А. К. Направленный кристаллогенез как одна из потенциальных перспектив терапии патологии желудочно-кишечного тракта // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2008. - №2-3. - С. М71-М72.

6. Мартусевич А. К., Киселева Ю. А., Жданова О. Б. с соавт. Биокристаллоскопическая диагностика характеристика субстратов при экспериментальном моделировании паразитозов // Нижегородские ведомости медицины. - 2008. - №9. - С. 40-42.

7. Мартусевич А. К., Гришина А. А. Потенциальная роль белков теплового шока в формировании кристаллостаза биосред при термической травме // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2009. - №5. - С. 83.

8. Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г. Исследование некоторых химических модуляторов кристаллогенных свойств биологических жидкостей // Успехи современного естествознания. -2010.-№11.-С. 77-78.

9. Мартусевич А.К., Колеватых Е.П. Кристаллостаз-инициирующие свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2010.-№2-3.-С. М59.

10. Иванникова Е.В., Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г. Биогравиметрия: методология, методика, первые результаты//Клинико-лабораторный консилиум. -2011. -№3.-С. 61-62.

11. Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г. Гипотетическая роль феномена микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза в развитии эмболизации легочной артерии // Врач-Провизор-Пациент. - 2011. - № 1. - С. М7.

12. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф., Симонова Ж.Г. Молекулярные механизмы структурообразования в высыхающих каплях биологических субстратов // Вятский медицинский вестник. - 2011. - №2. - С. 32-38.

13. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф. Новый алгоритм визуаметрического анализа кристаллогенных и инициирующих свойств биологических субстратов // Клинико-лабораторный консилиум. - 2011. - №2. - С. 23-26.

14. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф. Биокристалломика в России: краткий очерк этапов становления // Вятский медицинский вестник. - 2011. - №3-4. - С. 54-60.

15. Мартусевич А.К., Эмануэль В.Л. Биокристалломика: предпосылки, сущность и перспективы // Клинико-лабораторный консилиум. -2011.- №4. - С. 54-60.

Список сокращений

АМИ - акустомеханический импеданс БГК - биогравиметрический коэффициент ИС - индекс структурности Кз - выраженность краевой белковой зоны КОЕ - колониеобразующая единица Кр - кристаллизуемость

МАК - микроорганизм-ассоциированный кристаллогенез

МПАК - микроорганизм-паразит-ассоциированный кристаллогенез

ПГК - протеогравиметрический коэффициент

СДФ - степень деструкции фации

Т - рельефность текстуры

ТИ - тезиграфический индекс

С? - основной тезиграфический коэффициент

Р - коэффициент поясности

И — равномерность распределения кристаллических элементов фации

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Мартусевич, Андрей Кимович, Киров

ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

05201352091

МАРТУСЕВИЧ Андрей Кимович

Дегидратационная структуризация биологических жидкостей в норме и при паразитозах

03.02.11 - Паразитология 03.03.01 - Физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты: доктор биологических наук, доцент О.Б. Жданова, доктор медицинских наук, профессор Н.Ф. Камакин

Киров 2013

Содержание

Стр.

Введение 6

Глава 1. Обзор литературы 19

1.1. Этапы становления диагностической биокристалломики 19

1.2. Анализ предпосылок для изучения феномена микроорганизм- 29 паразит-ассоциированного кристаллогенеза

1.2.1. Фундаментальное обоснование микробной инициации 29 кристаллогенеза

1.2.2. Современное состояние представлений о микробной 36 инициации кристаллообразования

1.3. Современные представления о прижизненной диагностике 51 гельминтозов

Глава 2. Материал и методы исследования 62

2.1. Общая характеристика объектов и методов исследования 62

2.2. Пробоподготовка в биокристалломике 66

2.3. Методы исследования в биокристалломике 69

2.3.1. Измерение акустомеханического импеданса высыхающих 69 капель биосред

2.3.2. Исследование некоторых показателей биофизического 70 профиля дегидратируемого образца

2.3.3. Методы визуальной морфометрии кристаллоскопических и 76 тезиграфических фаций

2.3.4. Спектрометрическое исследование биокристаллов 87

2.3.5. Метод биокристаллопровокации 89

2.4. Методы статистической обработки данных 89 Глава 3. Экспериментально-теоретическое обоснование исследования 91 кристаллостаза в норме и при гельминтозах

3.1. Научно-методологические основы биокристалломики как 91 синтетической дисциплины о биогенных кристаллах

3.2. Молекулярные механизмы структурообразования в 100 высыхающих каплях биологических субстратов

3.3. Экспериментальная модуляция и исследование возможности 113 управления кристаллообразованием биоматериала в условиях in

vitro

3.4. Оценка дозозависимости ответа биологической жидкости на 123 введение химического агента

3.5. Экспериментальное исследование реализации микроорганизм- 128 ассоциированного кристаллогенеза

3.6. Оценка инициирующих свойств гельминта в условиях in vitro 136 (на примере Alaria alata и Hymenolepis nana)

3.7. Изучение роли микроорганизмов в изменении кристаллогенных 142 свойств реальных биологических субстратов in vitro

3.8. Возможности применения феномена микроорганизм- 147 ассоцированного кристаллогенеза для задач кристаллоиндикации

Глава 4. Кристаллизация биологических жидкостей животных в норме 151 и при гельминтозах

4.1. Собственное и инициированное структурообразование биосред 151 половозрелых здоровых животных

4.2. Преобразования кристаллизации биологических жидкостей 167 организма при спонтанном заражении гельминтами

4.2.1. Кристаллогенные свойства сыворотки крови свиней при 167 спонтанном трихинеллезе

4.2.2. Кристаллогенез желчи при спонтанном фасциолезе 173

4.3. Особенности собственного кристаллогенеза мочи мелких 189 грызунов при моделировании гельминтозов

4.4. Изучение зависимости кристаллогенной активности биосреды 202 от интенсивности экспериментальной инвазии (на примере

Trichinella spiralis)

Глава 5. Характеристика кристаллогенных и инициирующих свойств 212 биосубстратов здоровых людей и пациентов с гельминтозами

5.1. Изучение дегидратации кристаллоскопических и 212 тезиграфических образцов биологических субстратов человека

5.1.1. Свободный и инициированный кристаллогенез слюны 212 практически здоровых людей

5.1.2. Сравнительная биокристалломная характеристика 218 основных биологических субстратов организма здорового

человека

5.2. Сравнительный анализ модуляции кристаллогенных свойств 225 некоторых биологических жидкостей человека и животных при альвеококкозе

5.3. Динамика тезиокристаллоскопических показателей биосред при 232 оперативном лечении альвеококкоза печени

5.3.1. Кристаллогенные свойства слюны пациентов с 235 альвеококкозом при проведении оперативного лечения

5.3.2. Собственный и инициированный кристаллогенез мочи 241 пациентов при проведении оперативного лечения альвеококкоза

5.3.3. Анализ кристаллогенных свойств биологических 246 жидкостей пациентов с альвеококкозом в отдаленном послеоперационном периоде

Обсуждение результатов 254

Заключение 277

Выводы 281

Практические рекомендации 283

Список литературы 284

Список сокращений

АМИ - акустомеханический импеданс БГК - биогравиметрический коэффициент ИС - индекс структурности Кз - выраженность краевой белковой зоны КОЕ - колониеобразующая единица Кр - кристаллизуемость

МАК - микроорганизм-ассоциированный кристаллогенез

МПАК - микроорганизм-паразит-ассоциированный кристаллогенез

ПГК - протеогравиметрический коэффициент

СДФ - степень деструкции фации

Т - рельефность текстуры

ТИ - тезиграфический индекс

С) - основной тезиграфический коэффициент

Р - коэффициент поясности

И. - равномерность распределения кристаллических элементов фации

Введение

В настоящее время показано, что современные постгеномные технологии (метаболомика, геномика, протеомика, метабономика) имеют широкие возможности для определения качественных и количественных изменений метаболических процессов в организме человека и животных (Лохов П.Г., Арчаков А.И., 2008). Концепция индивидуального «метаболического профиля», который мог бы отражать состав биологических жидкостей, была впервые предложена Роджером Вильямсом в конце 40-х годов прошлого века. Используя хроматографическую бумагу, он предположил, что характеристические метаболические профили в моче и слюне связаны с развитием шизофрения. Однако только технологический прогресс 60-х и 70-х годов прошлого столетия сделал возможным количественное измерение метаболических профилей (Preti G., 2005). Термин «метаболический профиль» был введен в 1971 году Хорнингом после того, как удалось показать, что газовая хромато-масс-спектрометрия может быть использована для определения соединений, представленных в моче и тканевых экстрактах человека (Griffiths W.J., Wang, Y., 2009).

Термин «Metabolomics» впервые было опубликовано в 1998 г. в книге «Effect of Slow Growth on Metabolism of Escherichia coli, as Revealed by Global Metabolite Pool (metabolom) Analysis». Согласно существующим представлениям, метаболомика - это «систематическое изучение уникальных химических «отпечатков пальцев», специфичных для процессов, протекающих в живых клетках» (Daviss, 2005). Метаболом представляет собой совокупность всех метаболитов, являющихся конечным продуктом обмена веществ в клетке, ткани, органе или организме (Jordan K.W. et al., 2009). В то время как данные об экспрессии мРНК генов и данные протеомного анализа не раскрывают полностью того, что может происходить в клетке, метаболические профили могут дать мгновенный «снимок» физиологических процессов в ней (Novotny et al., 2008). Токсические

эффекты, генетические и соматические заболевания могут проявляться нарушением синтеза некоторых белков, приводящим к изменению управления биохимическими процессами, что в свою очередь отражается на соотношении концентраций многих эндогенных веществ в потоках биологических жидкостей (Машко C.B. с соавт., 2002). Нарушение динамического равновесия в биологических жидкостях организма, вызванное заболеванием или интоксикацией, изменяет их качественный и/или количественный состав. Для установления факта происходящих изменений необходимо одновременно определить множество метаболитов в широком диапазоне концентраций в плазме крови, моче, желчи и других биосубстратах.

Метабол ом представляет собой полный набор метаболитов (промежуточные продукты обмена веществ, гормоны и другие сигнальные молекулы и вторичные метаболиты), которые могут быть найдены как в биологическом образце, так и в единичном организме (Griffin J.L., Vidal-Puig А., 2008). В метаболомике метаболиты обычно определяют как любые молекулы размера не более 1 КДа (Samuelsson L.M., Larsson D.G., 2008). Так же, как транскриптом и протеом, метаболом постоянно меняется. Хотя метаболом может быть определен сравнительно легко, в настоящее время не представляется возможным определение широкого спектра метаболитов с помощью одного аналитического метода. В январе 2007 г. учёные университета Альберта и университета Калгари закончили первую версию метаболома человека. Они каталогизировали около 2500 метаболитов, 1200 лекарств и 3500 компонентов пищи, которые могут быть найдены в человеческом теле (Wishart D.S. et al., 2007). Но даже эта информация, доступная в базе метаболома человека (www.hmdb.ca) и основанная на анализе существующей научной литературы, далека от полноты.

Начиная с 2002 г., активно развивается метабономика — новая технология количественного измерения динамического

мультипараметрического метаболического ответа живых систем при

патофизиологических или генетических изменениях (Morrow Jr., John К., 2010). Различие между метаболомикой и метабономикой состоит в том, что метаболомика - это изучение метаболизма в клетке и ткани, а метабономика - подход к изучению метаболизма при использовании биологических жидкостей как индикаторов происходящих (патологических) процессов (Nicholson J.K. et al., 1999, 2006).

Основными инструментами новых технологий являются ядерно-магнитный резонанс, масс-спектрометрия, новейшие тандемные инструментальные методы, в то время как спектр экономичных и относительно простых методов метаболомики крайне узок (Meynial-Salles Т. et al., 2005). На сегодняшний день метаболомика все ещё остается «новой» областью исследований (Morrow Jr., John К., 2010). Дальнейший прогресс в этой области зависит от многих факторов, в том числе от развития технической базы аналитических методов. С учетом наличия подобной ситуации неслучаен интерес к инновационным методам, которые способны отражать метаболический профиль биологических жидкостей. К таковым, в частности, относятся технологии исследования кристаллогенных свойств биосред.

Первое упоминание о кристаллообразовании в научном источнике относится к 1730 г., когда в своем труде «Оптика» И. Ньютон описал феномен образования регулярных структур из растворов солей. С этого времени кристаллография стала оформляться как техническая дисциплина, имеющая прежде всего минералогическую направленность. В период с XVIII по XIX в. в России и многих других странах стали стремительно развиваться представления о структуре минералов, обнаруживаемых на территории данных государств. Этот начальный этап становления кристаллографии можно охарактеризовать как «минералогический».

Как метод исследования кристаллография проявилась, начиная с работ Т.Е. Ловица (1804, 1805), последователя М.В. Ломоносова, который описал два принципиально новых подхода к анализу растворов, первый из которых -

это микрокристаллические реакции, нашедшие в настоящее время широкое применение в судебной медицине, фармации и иммунологии. Другой способ, названный автором «методом выветренных солей», явился прообразом современной кристаллографии.

Длительное время кристаллографии оставалась прерогативой технических наук, результатом чего стали современные представления о строении и свойствах кристаллического состояния вещества, а также жидких кристаллах. Из областей, близких к биологии и медицине, кристаллография нашла применение лишь в фармации и судебно-медицинской экспертизе. Фармакологами кристаллографические методы исследования использовались для анализа структуры синтезируемых лекарственных препаратов (Никольская М. Н. с соавт., 1965). Судебные медики рассматривали кристаллизацию как подход в экспериментальной и практической токсикологии (Белова А. В., 1960), но в последние годы наличии появляться единичные работы, имеющие медицинскую направленность. Так, Тахер М. Ассад (1995) изучил особенности кристаллогенеза биологических жидкостей при прижизненном повешении.

Непосредственно в медицине кристаллоскопия стала использоваться в течение последних 35 лет. Приставку «био-» к данной дисциплине добавили работы Е.Г. Рапис (1973), которая впервые описала характер кристаллообразования некоторых биосред глаза человека и животных (хрусталик, стекловидное тело и т. д.). Эти исследования открыли новый этап в развитии биокристаллографии - «эмпирический». Его продолжением стали обширные исследования, выполненные специалистами Московского областного научно-исследовательского клинического института (МОНИКИ) им. М.В. Владимирского, заложившими основу одного из основных направлений кристаллоскопического анализа биосубстратов - тезиграфии. Она заключается в оценке результата сокристаллизации изучаемой биосреды и тестового соединения - базисного вещества (Каликштейн Д. Б. с соавт., 1981, 1990). Перу этих авторов принадлежит первое предложение о

применении различных базисных веществ в качестве кристаллообразователей. Несмотря на достаточно широкий спектр заболеваний (хронический гастродуоденит, хронический панкреатит и др.), для которых была составлена тезиграфическая характеристика, данные работы имели существенный недостаток, который связан с применением метода в варианте т. н. «классической» тезиграфии, предусматривающей изучение только вышеуказанного образца-сокристаллизанта. В настоящее время предложены более современные методы тезиграфического анализа.

Другая школа, активно занимающейся изысканиями в области биокристаллографии, сформировалась под руководством Л.В. Савиной. Данная школа идеологически связана с изучением кристаллообразования сыворотки крови в норме и при патологических состояниях. Основным направлением Л.В. Савиной и ее учеников является также поиск кристаллоскопических маркеров, специфичных для того или иного патологического статуса.

Второе направление биокристаллографии - «классическая» кристаллоскопия, основанное на изучении собственной способности биосубстрата к кристаллогенезу, предпосылки которого были первично заложены Е.Г. Рапис, впоследствии получили развитие и усовершенствование благодаря работам В.Н. Шабалина и С.Н. Шатохиной (2001, 2004). Ими аналогично изысканиям Л.В. Савиной описаны новые маркерные структуры, образуемые биосубстратами при дегидратации в норме и при патологии отедльных органов и систем.

Все эти исследования создали почву для перехода биокристаллографии на новый, «современный» этап, который характеризуется активным вовлечением медиков в изучение особенностей кристаллообразования биологических сред при различных заболеваниях.

Объект для изучения возможностей методов биокристалломики как метаболомных технологий также выбран неслучайно. Гельминтозы -наиболее распространенные паразитарные заболевания человека и животных,

вызываемые различными представителями низших червей - гельминтов (Токмалаев А.К., 2005, 2007). В нашей стране с конца 20-х годов прошлого века велась научно обоснованная борьба с гельминтозами, что привело к значительному снижению заболеваемости у населения (Успенский A.B. с соавт., 2011). Однако в 90-х годах отмечена тенденция к увеличению пораженности некоторыми гельминтозами (прежде всего энтеробиозом и аскаридозом), также растет число зарегистрированных больных токсокарозом, трихинеллезом. Не улучшается эпидемическая обстановка в очагах распространения биогельминтозов: описторхоза и цестодозов — дифиллоботриоза, тениидозов, эхинококкозов (Токмалаев А.К., 2005). По официальным данным, заболеваемость гельминтозами в России составляет около 1%, однако, по мнению ведущих специалистов страны, ежегодно инвазируется не менее 15 млн человек.

Несмотря на значимость разработки и усовершенствования противоэпидемических мероприятий и созданию новых технологий лечения гельминтозов, актуальность не теряют изыскания в области фундаментальных основ гельминтологии, в частности, связанные с изучением метаболических аспектов взаимодействия в системе «паразит-хозяин» (Бабак О.Я., 2005; Бибик О.И., 2012).

В настоящее время единичными работами зарубежных авторов показано, что присутствие некоторых паразитов (в частности, малярийного плазмодия) существенно изменяет кристаллогенную активность внутриэритроцитарного содержимого и плазмы крови Hempelmann Е., Egan T.J., 2002; Egan T.J., 2008), причем эти метаболические перестройки имеют не только феноменологическую, но и патофизиологическую значимость, т. к. служат лимитирующей стадией развития паразита (Ridley R.G. et al., 1995; Pandey A.V., Tekwani B.L., 1996; Sullivan D.J., 2002). Эффективность разработанной кристаллогенез-ингибирующей терапии малярии, подтвержденная ех juvantibus, доказывает принципиальную роль нарушений кристаллостаза в механизме развития данного заболевания (Martins Alho M. et al., 2009). В то

же время эти исследования носят отрывочный характер, а диагностическая ценность изучения метаболома биологических жидкостей по их кристаллогенным свойствам совершенно не изучена (Мартусеви�