Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Контаминация нестерильных растительных лекарственных средств мицелиальными микромицетами

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Контаминация нестерильных растительных лекарственных средств мицелиальными микромицетами"

РГ6 од

\ С) ДПЯкШ'^МИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

На правах рукописи

ЗАКАРЯН АННЕТ АМАЯКОВНА

КОНТАМИНАЦИЯ НЕСТЕРИЛЬНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ МИКРОМИЦЕТАМИ

03.00.05 - Ботаника 03.00.24 - Микология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1992

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной микологии кафедры ботаники Ереванского государственного университета Республики Армения, в лаборатории гигиенических исследований импортируемых пищевых продуктов Института питания АМН СССР

Научный руководитель - член-корреспондент АН РА, доктор

биологических наук, профессор

л.л.осипян

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение - Армянский педагогический институт

в "_" часов на заседании специализированного совета

Д 0C5.05.0I при Институте ботаники АН Армении. Адрес: 375063, Ереван-63, Институт ботаники АН Армении.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

доктор биологических наук, профессор

С.А.СШОНЯН кандидат биологических наук

Н.Ю.ИОАННЕСЯН

им.Х.Абовяна

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность темы. Растительные лекарственные средства • (РЛС), обладая высокой медикаментозной ценностью, все шире используются в арсенале современной медицины. Согласно статистике, на международном фармацевтическом рынке каждый третий препарат имеет растительное происхождение, более того в терапии ряда патологий используются преимущественно растительные препараты (Соколов, 1985; Георгиевский, 1990).

Растительные лекарственные средства, приготовленные из природного сырья и не имеющие фармакопейных требований к стерильности, подвержены заспоренкю сапротрофными микромицетами. Особенности строения мицелиальных грибов, а также их быстрый рост, энергия размножения, неприхотливость, широкий спектр действия мощной ферментативной системы позволяют им быстро адаптироваться к изменяющимся условиям ореды и завоевывать новые, ранее не специфичные для них субстраты.

Присутствие микромицетов-контаминантов в РЛС может не только изменить их физические, химические, органолептические и эстетические свойства, но и понизить терапевтический эффект лекарства. Помимо этого, некоторые из контаминантов могут стать причиной микоинфекции (микозов, аллергозов), иногда с леталь-- ным исходом ( Кш^а et а11980). В отдельных случаях возможно образование токсичных метаболитов - микотоксинов, обладающих выраженной нейро- и нефротоксичностью, мутагенным,тератогенным и канцерогенным действием.'

В свете вышесказанного микологический контроль, а также микотоксикологическая экспертиза лекарственного растительного сырья и готовых препаратов становятся важной функцией в гарантии качества и безопасности лекарств.

Несмотря на свою актуальность, вопросы контаминации микро-мицетами неотерильных лекарственных средств и в настоящее время остаются вне сферы внимания многих специалистов. Грибной контаминации РЛС посвящены единичные сообщения, которые ограничиваются констатацией величин заспоренности и лишь в отдельных случаях указываются некоторые роды и виды микромицетов-контаминантов. В то время как детальному анализу бактериальной биоты, загрязняющей медикаменты, посвящены многочисленные публикации и монографии.

В связи с этим характеристика структуры комплекса микроми-цетов-контаминантов растительного сырья и препаратов, включающая сведения относительно качественного состава микобиоты, количественных соотношений отдельных таксономических групп и конкретных видов грибов' и их встречаемости, представляет научно-практический интерес в области биологического мониторинга медикаментов и охраны внутренней среда человека от попадания чужеродных агентов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является мониторинг загрязнения миделиальными микромицетами лекарственного растительного сырья и нестерильных растительных лекарственных препаратов как отечественного, так и зарубежного производства, поступающих в аптечную сеть Республики Армения.При этом перед нами были поставлены следующие задачи:

- установление степени заспоренности микромицетами исследованных серий лекарственного растительного сырья из групп Нег-Ъа, Folium, Flores, Radix, Species;

- установление уровня контаминированности фармацевтических препаратов, представленных твердыми, мягкими и жидкими лекарственными формами;

- выявление видового состава грибов-контаминантов сырья и готовых препаратов, установление доминирующих видов, плотности и частоты их встречаемости;

- исследование токсигенности наиболее типичных микромицетов-загрязнителей лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Научная новизна исследования. Впервые в странах СНГ начато миколого-ток сикологическое исследование нестерильных РЛС. В диссертации приводятся оригинальные данные по заспоренности, частоте встречаемости и плотности популяции грибов-контаминантов 266 исследованных серий растительного сырья и фармацевтических препаратов. Впервые для проанализированных РЛС составлен систематический список микромицетов-контаминантов, включающий 143 вида и вариаций, для которых исследуемый субстрат является новой, ранее не изученной микологами абиогенной экологической юшей. Таксономический же анализ грибов-контакинантов исследуемых лекарственных форм, проведенный на видовом уровне, не имеет аналогов.

Впервые исследована токсигенность наиболее типичных микро-мицетов-загрязнителей растительного сырья и фитопрепаратов.

Предложена регламентация количественного и качественного состава микобиоты РЛС в соответствии с категорией микробиоло- • гической чистоты.

Экспериментально установлено, что наиболее чувствительной питательной средой, позволяющей выявить широкий спектр грибов-контакинантов лекарственных средств, является модифицированная нами среда OGAM (Guarro et al., 1978).

Практическая значимость. Результаты исследований по контаминации микромицетами лекарственных средств растительного происхождения могут быть использованы в качестве дополнения к статье Госфармакопеи'СССР (XI изд.) "Испытание на микробиологическую чистоту", а также для обоснования мероприятий, направленных на повышение качества и безопасности лекарств, что важно в здравоохранительном и экономическом аспектах.

Информационный листок с краткой аннотацией работы направлен в Минздрав Республики Армения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Оценка степени заспоренности шцелиальными микромицетами исследованного лекарственного растительного сырья и фармацевтических препаратов.

2. Анализ таксономических структур микобиоты растительных лекарственных средств.

3. Микотоксикологическая экспертиза грибов-контаминантов лекарственного сырья и фитопрепаратов.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации докладывались на заседаниях кафедры ботаники и Ученом совете биологического факультета Е1У (1986, 1987), на научной конференции профессорско-преподавательского состава Е1У (1989), на Всесоюзном съезде ботаников (Алма-Ата, 1988), а также представлены в материалах X конгресса европейских микологов ( Tallin, 1989). .

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и приложения, в котором приводится конспект микромицетов-контаминантов РЛС. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирова-

на 18 таблицами и 24 рисунками. Список литературы включает 301 наименование работ, из них 231 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В главе, состоящей из 5 разделов, систематизированы и обобщены данные зарубежной литературы по микробиологической контаминации нестерильных лекарственных средств. Представлен анализ сведений о распространении мицелиалышх микромицетов на лекарственном растительном сырье, вспомогательных веществах и фармацевтических препаратах. Обсуждается медицинский аспект грибной контаминации лекарственных препаратов, а такке вопросы деконтаминации растительных лекарственных средств.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа проводилась в лаборатории экспериментальной микологии кафедры ботаники ЕГУ с 1986 г.

Объектами исследований являлись нестерильные РЛС (растительное сырье и препараты), получаемые аптечной сетью Республики Армения. Растительное сырье поступало из предприятий по переработке лекарственного сырья - Еитошрский и Красногорский з-ды, Швенченская ф-ка, фирма "Herbapol" (Польша) и др. Исследовались лекарственные препараты, изготовляемые химико-фармацевтическими предприятиями Минмедпрома и Минмедбиопрома -СССР (Ашхабадский, Горьковский, Львовский, Казанский, Таллинский, Ташкентский, Тбилисский, Томский и др. химфармзаводы). Анализировались также препараты, импортируемые из-за рубежа (Индия, Румыния, Югославия, Польша).

Микологическому анализу были подвергнуты 23 вида растительного лекарственного сырья (приведенного в стандартное состояние), относящегося к группам НегЬа (трава), Folium (лист), Flores (цветок), Radix (корень), Species (сбор), а также фармацевтические препараты 31 наименования, представленные твердыми - Tabulettae (таблетки), Drage (драже), Granulae (гранулы), Brikettae (брикеты); мягкими - Unguentum (мази), Oleum (масла), Capsulae molles (мягкие капсулы); жидкими - • Succus (соки), Sirupus (сиропы), Ei-tractuni (экстракты), Tinctura (тинктуры) лекарственными формами.

Выделение микромицетов-контаминантов РЛС осуществляли методом десятикратных серийных разведений и методом мембранной фильтрации (К>, 1920; FIP*, 1975; • Lutomski, Kedzia, 1980; PRO-pharmacopea, 1983) с применением универсальных - Чапек-агар, сусло-агар (Литвинов, 1969; Пидошшчко, 1953) и специальных питательных сред - Сабуро, Тиогликолевой (ГФ, 1990; FIP, 1975), а также модифицированной нами среды OGAM (Guarro et al., 1978).

Для характеристики структуры комплекса микромицетов-конта-минантов использовали показатель частоты встречаемости и плотности популяции (Мирчинк, 1976; Билай, 1989; Matsushima et al., 1958; El-Kady, 1982). Заспоренность мшфомицеташ оценивали по нормативам, предложенным FIP (1975), К" (1990), согласно которым в I г/мл нестерильных лекарственных средств допускается наличие не более 10 КОЕ грибов.

Микроскопирование проводили общепринятыми методами, а также согласно описанному (Goncalves, Pavia, 1985).

Идентификация аксенических культур шкромицетов осуществлялась по известным в микологии руководствам-. Систематика высших таксонов приводилась по Ainsworth et Bisbys (1983), в пределах отдельных групп по работам разных авторов.

Биоиндикация токсигенных метаболитов грибов, полученных согласно Reddy et al. (1971), Нага et al. (Ï974), Donald et al. (1981), проводилась на следующих тест-организмах: Bacillus stearothermophilus - экспресс-метод J«Guarro et al. (1980); на наушшусах Artemia salina методом J.Harwing, P.Scott (1971) в модификации G.Suarez et al. (1981); на куриных эмбрионах (Лозбин, 1978; Jarvis et al., 1982); на белых мышах (Курасова и др., 1971).

Химический анализ грибных экстрактов на микотоксины (анатоксин Bj.Bg.CpCg, охратоксин, зеараленон, патулин) проведен методом ТСХ-флуориметрии (Методические рекомендации, 1982, 1984, 1986).

За ценные консультации при выполнении данной работы выражай искреннюю благодарность проф.Дж. Г.Абрамян.

у

M - Государственная фармакопея

FIP - International Furmaceutical Federation

ГЛАВА 3. КОНТАШИИРОВАННОСТЪ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ШКРОМИЦЕГАШ

Доброкачественность лекарственного растительного сырья является гарантом чистоты конечного препарата. По данным большинства специалистов не менее 50$ готовых лекарственных форм содержат микроорганизмы, привнесенные в препарат из сырья. В связи с этим возникла необходимость введения микробиологического контроля и установления критериев, ограничивающих присутствие микроорганизмов в лекарственном сырье (ï/alhauber, 1977).

В главе приводятся результаты микологического анализа 23 наименований отечественного'и импортируемого растительного лекарственного сырья.

3.1. Количественная оценка заспотзенности. Из 118 проанализированных серий растительного сырья 12% конташнированы в пределах I02fI04, в том числе 31% показали I02fI03 и 41% -I03fI04, а в 15% серий выявлена высокая загрязненность микро-мицетами, превышающая I04fI0^ КОЕ/г. Только 13% исследованных серий удовлетворяли микробиологическим нормам fip, по которым допускается присутствие I02 КОЕ грибов.

Высокая степень заспоренности микроскопическими грибами, в несколько раз превышающая норму, отмечена в образцах Herba Hyperici, Folium Urticae, Folium Senixae, Folium Menthae, Flores Tiliae, Flores Sambuci, а также во всех сериях растительного сырья ИЗ групп Hadix И Species.

Микологический анализ показал, что хотя в каждой группе имелись растения как с высокими, так и с низкими степенями загрязнения, в целом группы Herba, Folium и Flores менее контаминированы ыикромицеташ, чем группа Radix (рис.1). Так, если 14% Herba, 20% Folium и 27% Flores имели заспоренность в пределах нормы (Ют-Ю2), то в группе Radix ни одна из проанализированных серий не удовлетворяла предъявляемым критериям. Более того, 71% исследованных серий этой группы имели заспоренность, превышающую I03 КОЕ/г. Большая загрязненность группы Radix объясняется непосредственным контактом с почвой, средой, богато населенной микроорганизмами и, в частности,ри-зосферными грибами. Высокая контаминированность микромицетами

Herb а

Folium

Flores

Radix

Species

Рис. 1. Количественная оценка заспоренности микрошщетами—контаминантами по группам лекарственного сырья (%)

отмечена также в группе Species, где 24% исследованных образцов по степени заспоренности превышали 1С4 КОЕ/г. Загрязненность этой группы, представляющей собой композицию-из нескольких лекарственных растений, является до некоторой степени следствием суммирования заспоренности исходных ингредиентов сбора.

Во всех исследованных сериях лекарственного сырья наблюдается большая вариабельность заспоренности от 10 до I06 пропа-гул в I г. Наибольший разброс величин контаминированности выявлен у Herba Uillefolii, Folium Menthaе, Folium Salviae,Flores Chamomillae, Kadix Glycyrrhizae, Species carminativae.

Следует отметить, что наименьшая заспоренность выявлена в тех сериях лекарственного растительного сырья ( НегЪа leonuri, Herba Gnaphalii, Folium Farfarae, Flores Calendulae, Flores Chamomillae и др.), которые выпускались в форме брикетов и гранул. Возможно, технологический процесс приготовления этих лекарственных форм способствует уменьшению степени заспоренности сырья диаспорами грибов, в связи с чем считаем, что брикетированное и гранулированное сырье представляет собой не только удобную для потребителя дозированную форму лекарственного сырья, но и с микробиологической точки зрения более чистую.

3.2. Таксономический состав грибов и их встречаемость по группам растительного сырья. На формирование комплекса микро-мицетов-контаминантов лекарственного растительного сырья существенное влияение оказывают экологические факторы, среди которых важнейшие - тип почвы, ее физико-химические и агрохимические свойства, метеорологические условия - температура воздуха и почвы, количество осадков в течение вегетационного периода и т.д. Немалую роль играют условия сбора и сушки сырья. Нельзя не учитывать также технологическую цепь производства и переработки растительного сырья, которая в той или иной мере коррегирует количественный и качественный состав микобиоты. В результате проведенного микологического анализа лекарственного сырья выделено в аксенические культуры и идентифицировано 112 видов микромицетов-контаминантов, относящихся к 23 родам, 6 семействам, 4 порядкам, объединенным в два класса: Zygomycetes - 12 И Hyphomycetes - ICO ВИДОВ (табл.1). Приведенные данные свидетельствуют о широком распространении

Таблица I

Таксономический состав микромицетов-контаминантов растительного лекарственного сырья и фармацевтических препаратов

Класс Порядок

Семейство

Род

Количество изолированных видов

сырье препараты

Zygo- Mucorales

myce-

tes

PIее- Eurotiales

tomyce-

tes

Pyreno-Sphaeria-myce- les tes

Hypho- Agonomyce-myce- tales tes

Hyphomyce-tales

Mucoraceae Absidia

Circinella Mucor Khizopus Mortierella- Mortierella Tricßocomata- Byssochlamys Monascaceae Monascus Chaetomiaceae Ascotricha Chaetomium Agonomycetaceae Rhizoctonia Sclerotium

Moniliaceae

Dematiaceae

Tubercula-riales

Tubercularia-ceae

2 I 7 I I

I

1

2 21

Acremonium Aspergillus Cephalosporium I Paecilomyces 2 Penlcillium Sporotrichum Trichoderma Trichothecium Verticillium Alternaria Arthrinium Cladosporium Catenularia Humicola Scopulariopsis Stemphylium Torula -

Ulocladium J

Fusarium 5

44 2 2

1

2 2

2 4 2

1

2 I I I I I 3 I I

19

I 34

I I I 4 I I 3

Итого:

112

83

- 10 -

в сырье представителей несовершенных грибов из 18 родов. Семейство Moniliaceae представлено 9 родами и 77 видами, Dema-tiaceae - 6 родами И 16 видами, Tuberculariaceae - 5 И Ago-nomycetaceae - 2 видами. Наибольшим видовым разнообразием отличаются представители семейства светлоокрашенных гифомице-тов, включающее такие крупные роды как Penicillium - 44 и Aspergillus - 21 вид. Значительно меньшим числом видов, однако с достаточной частотой встречаемости на различном сырье характеризуется семейство меланинсодержащих микромицетов,включающее ВИДЫ родов Cladosporium, Alternaria, Stemphylium, Sco-pulariopsis, Humicola, Ulocladium. Немногочисленным видовым составом характеризуется семейство Tuberculariaceae, включающее один род 'Fusarium, и семейство Agonomycetacеае, представленное родами Rhizoctonia И Sclerotium.

Широко распространены в растительном сырье представители класса зигомицетов, включающего семейство Mucoraceae - II

ВИДОВ И Uortierellaceae с ВИДОМ M.polycephala.

Анализ таксономического состава микромицетов доминирующих родов показал, что среди представителей рода Penicillium (44 вида) преобладали грибы из секции ¿symmetrica (рис.2). Высокий процент ИЗОЛЯТОВ Asymmetrica-Fasciculata ОТМечеН ВО Всех группах лекарственного сырья и достигает максимума в группе Folium, составляя 47$. Следующей по представленности является подсекция Asymmetrica-Velutina, составляющая ОТ 6% В группе Radix до 28% у Flores. Для остальных пенициллий с асимметричным конидиальным аппаратом - Asymmetrica-Divarica-ta, Asymmetrica-Lanata и Asymmetrica-Funiculosa процент встречаемости был невысоким. Сравнительно реже обнаруживались пенициллин из секций Biverticillata-Symmetrica И Monoverti-cillata.

Наибольшей частотой встречаемости отличались виды p.cycio-

pium, P.puberulum, P.expansum, P.chrysogenum, P.granulatum, P.crustosum, изолированные ИЗ Herba - Н^perici, Millefolii, Leonuri, Gnaphalii; Folium - Urticae, Sennae, Salviae, Farfa-rae; Flores - Calendulae, Ghamomillae, Sambucij Radix - Tara-xaci, Glycyrrhizaej Species - amarue, laxantes, sedativae, r.tomachicao.

Ишроко распространены в лекарственном растительном сырье

Рис. 2. Процентное распределение видов рода Pénicillium по секциям:

a—Monoverticillata, б—Asymmetrica—Fasciculata, в—Asymmetrica—Lanata, г-Asymmetrica- Divaricata, д-Asymmetrica-Funiculosa, e— Asymmetrica—Velutina, ж—Biverticillata—Symmetrica

- 12 -

гифомицеты из рода Aspergillus, представленного 21 видом. Доминирующее и субдоыиниругощее положение занимают A.fiavus, A.niger, A.fumigatus, A.clavatus, встречающиеся ПОЧТИ во всех проанализированных сериях растительного сырья. Примечательно, что некоторые аспергиллы в культуре образуют сумчатую стадию. Телеоморфы отнесены к роду Eurotium - A.chevalieri, A.amstelodami, А.repens, А.ruber, изолированных ИЗ Herba Leonuri, Folium Farfarae, Radix Valerianae И Species amarae.

В растительном сырье довольно обильно представлены микрош-цеты из семейства Mucoraceae. Анализ видового состава показал, ЧТО Mucor corticola, M.racemosus, 11 .hiemalis, M.mucedo И Rhizopus stolonifer являются ПОСТОЯННЫМИ компонента!;® мико-биоты всех исследованных групп сырья, с наибольшим преобладанием в группе Radix.

Микромицеты-контаминанты из родов Cladosporium, Alternaria, Trichoderma, Fusarium на растительном сырье распространены довольно широко. По частоте встречаемости (42-60Я они относятся к числу субдоминантов. Чаще других изолируются диаспоры видов T-viride, A.alternata, C.herbarum, C.gossypicola, G.brevi-oompactum, а также F.solani, которые в отдельных сериях сырья Herba Millefolii, Flores Sambuci, Folium Menthae выступают в качестве основных контамннактов.

Несколько реже выделяются гифомицеты-загрязнители из рода Scopulariopsis - S.brevicaulis, S.brevicaulis var.glabra И var.alba, выделяемые преимущественно из растительного сырья группы Folium.

Изредка в лекарственном сырье обнаруживались мицелиальные грибы ИЗ родов Stemphylium, Verticillium, Ulocladium, представленные в основном видами V.lateritium, S.botryosum, реже V.lateritium var.beticola, S.macrosporoideum, U.consor-tiale.

йце реже встречались виды из родов Cephalosporium, Tri-chothecium, Sporotrichum, Paecilomyces, Acremonium, Humicola, Rhizoctonia и Sclerotium. Они спорадически выделялись из растительного сырья группы Species, а также Flores Tiliae, Folium Farfarae и Radix Glycyrrhizae.

Таким образом, микобиота лекарственного растительного сырья представлена довольно разнообразным видовым составом гри-

- 13 -

бов-контаминантов. Наибольшую загрязненность микромицетами показало сырье из групп Radix и Species, причем в последнем микобиота отличалась большим разнообразием и обилием видов. Заспоренность, не превышающая микробиологические нормы, а также малочисленный видовой состав грибов-загрязнителей выявлен в растительном сырье, содержащем в своем составе вещества с фунгистатическим действием.

ГЛАВА 4. КОНТАШНИРОЗАННОСТЪ НЕСТЕРИЛЬНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДОШМЩЕГАШ

4.1. Количественная опенка заспоренности. Приведены результаты микологической экспертизы 31 наименования отечественных и импортируемых растительных препаратов, представленных твердыми, мягкими и жидкими лекарственными формами.

Количественная оценка заспоренности микромицетами 148 серий фармацевтических препаратов выявила отсутствие жизнеспособных пропагул грибов в 38% исследованных образцов. Заспоренность 16$ находилась в пределах IflO, 24$ - IOflO2, 14% -I02fI03 и 8$ - свыше Ю3 КОЕ г/мл. Таким образом, микробиологическая чистота, соответствующая требованиям PIP и ГО, подтвердилась для 78% проанализированных серий, а 22% не соответствовали стандартам, предъявляемым к этой груше медицинских препаратов.

Среди исследованных твердых лекарственных форм (таблетки, драже, гранулы, брикеты) в микробиологическом аспекте наиболее загрязненными оказались таблетированные препараты, 48% которых имели заспоренность в несколько раз превышающую предельно допустимую норму. Наивысшая степень контаминированно-сти микромицетами отмечена у Liv-52 - 3,5x10® и Extraetum Sennae - 2,4хЮ2 КОЕ/г. Несколько меньшая заспоренность,однако выходящая за пределы предъявляемых требований, выявлена у Cafiolum, Fiaminum, Aiiocholum, Besalolum. Отсутствие жизнеспособных пропагул грибов откечено только в таблетках Vi-cal inum.

Из исследованных мягких лекарственных форм (мази,' масла, мягкие капсулы) 69$ удовлетворяли требованиям FIP и ГО. Высокую микробиологическую чистоту показали вое проанализированные серии капсул OlimetiJium и Oleum Ricini in capsulis,

а также Oleum Caryophyllae и Oleum Rosae. Низкая степень за-споренности обнаружена у мази Phytolysinum, а из масел - Oleum Camphoratum. Из мягких лекарственных форм чрезвычайно высокая степень загрязнения пропагулами микромицетов (3,1хЮ3 КОЕ/мл), намного превышающая допустимую норму, отмечена толь- .. КО у Oleum Hyppopheae (БИЙСКИЙ 3-д).

¡•.'экологическая экспертиза жидких лекарственных форм выявила высокую микробиологическую чистоту проанализированных серий препаратов Chlorophylliptum, Befur.ginum, Uaraslavin, Suc-cus Kalanchoes и Romasulanum, что, на наш взгляд, объясняется технологией приготовления этой лекарственной формы и 'входящими в их состав консервантами, обладающими выраженным фунги-бтатическим действием по отношению к грибным садротрофам. Отсутствие жизнеспособных диаспор микромицетов отмечено также во всех проанализированных сериях настоек: Tinctura - Conval-lariae, Calendulae, Henthae, /alerianae, Capsici, Leonuri.

Испытание на микробиологическую чистоту лечебных сиропов не выявило' грибов-контаминантов в исследованных образцах si-rupus Rosae и Sirupus Aloes. Только в препарате Cholosa-sum обнаружено незначительное число пропагул A.giaucus G., известного своей осмофильностьга.

Во .всех исследованных сериях лекарственных препаратов наблюдались колебания заспоренности. Наибольшие у Liv-52 -I,3xI02f3,5xI03 И Oleum Hyppopheae - 8,5xI02f3,IxI03 КОЕг/мл; наименьшие У Phytolysinum - 0,5x10- ~ 1x10 И Oleum Ricini -1,0x10*5,4x10 КОЕ г/мл.

Микробиологические нормы PIP и превышали 40$ исследованных серий Flaminum, 60$ Besalclum и все проанализированные серии Liv-52, Extractum Sennae и Cafiolum. Заспоренность, превышающая регламентируемую величину, отмечена также в 43$ драже Allocholum и 67$ Oleum Hyppopheae.

Таким образом, количественная оценка контаминярованности микромицетами нестерильных растительных препаратов показала, что из 31 проанализированного нами лекарства в 7 (22$) выявлена заспоренность, в несколько раз превышающая микробиологические нормы и BÍ, причем твердые лекарственные формы и, в частности, таблетированные являются наиболее загрязненной грибами группой препаратов, по сравнению с другими формами.

- 15 -

4.3. Таксономический состав контаминантов. Микологический анализ лекарственных препаратов выявил 83 вида мицелиальных микромицетов, относящихся к 22 родам, 8 семействам, 5 порядкам, объединенным в 4 класса. Изолированные виды и разновидности распределяются по классам следующим образом: Zygomyce-tes - 5, Plectomycetes - 2, Pyrenomycetes - 4 И Hyphomyce-tes - 72 (табл.1). Во всех исследованных сериях лекарственных препаратов широко распространены светлоокрашенные гифюмицеты из семейства Moniiiaceae, представленного 56 видами и включающего роды Pénicillium (34) и Aspergillus (19 видов). Ме-ланинсодержащие сапротрофы из семейства Dematiaceae представлены 7 родами и 14 видами.

Значительно меньшим числом видов характеризуется порядок Mucoraies, включающий семейство Mucoraceae, представленное 4 видами, и семейство Mortierellaceae с ОДНИМ ВИДОМ M.poly-cephala•

В числе грибов—контаминантов лекарственных препаратов довольно редкой и своеобразной по своему таксономическому составу группой (ранее не отмечаемой авторами) являются сумчатые грибы, представленные класс ai,га Plectomycetes и Pyrenomycetes, 3 семействами - Monascaceae, Trichocomataceae, Chaeto-miaceae.

Проанализированный материал показал, что роды Aspergillus и Pénicillium являются наиболее агрессивными агентами контаминации лекарственных препаратов и по частоте встречаемости занимают доминирующее положение, причем род пенипиллий, отличаясь большим разнообразием видов, составляет 43$ от общего количества выявленных грибов. Анализ гифомицетов доминирующего рода Pénicillium на видовом уровне свидетельствует, что наибольшей частотой встречаемости отличались пенициллин из секции Asymmetrica, что, вероятно, связано с их высокой антагонистической активностью, коррелирующей со сложно устроенным конидиальным аппаратом (Беккер, Максимова, 1958), обеспечивающим высокую конкурентоспособность и широкое распространение на различных субстратах, а в конкретном случае на лекарственных препаратах. Самый высокий процент (32) составляли представители подсекции Asymmetrica-Fasciculata, изолированные из таблетированных препаратов Flaminum, Tabulettae contra

tussim, Extractua. Sennae, Besalclum, Liv-52; ИЗ гранулированного препарата Extractum Helichrysis, a также из мягких лекарственных форм Oleum camphoratum, Oleum Ricini, Oleum Hyp-popheae. Следующей по представленности видов является секция Biverticillata-Symmetrica, составляющая 20$ от общего числа изолятов Pénicillium. Процент встречаемости остальных пени-циллий с асимметричным конидиальным аппаратом - Asymmetrica-ûivaricata, *.s,>mmetrica-\felutina И Asymmetrica-Lanata был сравнительно невелик (рис.3).

Следует отметить, что род Pénicillium по обилию и разнообразию видов хотя и превосходит остальных микромицетов-контами-нантов, однако абсолютного доминирования отдельных видов во всех исследованных сериях лекарств не наблюдалось. По частоте встречаемости к категории субдоминантов отнесен p.cyciopium. Высокая плотность популяции указанного вида t53-81$), по сравнению с другими, выявлена в сериях следующих препаратов: са-fiolum, Flaminum, Tabulettae contra tussim, Extractum Helichrysis .

Широко распространены в лекарственных препаратах представители аспергиллов, которые по численности видов (19) уступают лишь роду Pénicillium, однако превосходят его по частоте встречаемости пропагул. Во многих сериях твердых препаратов у аспергиллов наряду с конидиальной стадией наблюдается и сумчатая. Телеоморфы относятся к родам Eurotium с конидиальной стадией - A.repens, A.echinulatus, A.ruber, A.amstelodami, A.tonophilus, A.chevalieri; Neosartorya - A.fischeri; Chaeto-sartorya - A.ornatus. Перечисленные виды с большой частотой встречаемости обнаруживаются во всех сериях Senade, Senade-xinum и Liv-52. Обнаружение в твердых лекарственных формах наряду с анаморфой и сумчатой стадии (часто только сумчатой) с образованием обильных клейстотециев при отсутствии других грибов-контаминантов связывается с ксерофильностью многих видов Eurotium, обладающих способностью преодолевать большую водоудерживающую силу субстрата (препарата) и выживать при низких значениях неблагоприятных для развития других грибов ( Aureli et al., 1985).

Результаты микологических анализов растительных препаратов показали, что частота встречаемости представителей аспергил-

- Г7 -

Лекарственные препараты

эис.З. Процентное распределение видов рода Pénicillium по секциям ■:

a- MonovertlcHJato, б- Asymmetrlca- Fasclculata, в- Asymmetrlca- Dîvarlcata, г- Asymmetrlca- Lanata, д- Asymmetrlca- Velutina, е- Blvertlclllata- Symmetrica

лов весьма различна. К доминирующим видам относятся A. f lav us и A.niger, встречающиеся во всех проанализированных сериях таблеток, драже, брикетов, гранул, мазей и масел, за исключением Sxtracturn Helichrysis. К субдоминантам ОТНОСИТСЯ A.cla-vatus, выделенный из различных серий Cafiolum, piantaglu-cidum, Extracturn Sennae, Liv-52, Tabulettae stomachicae И Oleum camphoratum. Виды A.fumigatus, A-candidus, A.ustus, A.terreus, A.tamarii, A.wentii, A.parasiticus, A.ochraceus, изолированные как с твердых, так и с мягких лекарственных форм, по час'тоте встречаемости отнесены к категории редких и единичных видов.

Достаточно широко представлены в растительных препаратах роды Cladosporium и Scopulariopsis из семейства Dematiaceae. Чаще других изолируются ВИДЫ c.herbarum и C.brevicompactum, а также S.brevicaulis. Наибольшая плотность популяции (6472%) вышеперечисленных микромицетов отмечена в отдельных сериях Tabule ttae stomachicae И Oleum Ricini. Из остальных Г/.ела-нинсодержащих гифомицетов на растительных лекарствах изредка Обнаруживались Alternaria alternate, Arthrinium phaeospermum, Humicola grisea, Catonularia sp. Виды рода Torula - T.herba-

rum, T.lucifuga и Torula sp. являются специфичными контами-нантами драже Aiiocholum, с плотностью популяции 80-85$.

Изредка выявлялись монили&чьные ми1фомицеты из родов choderma, /erticillium И Paecilomyces, Представленные единичными видами.

Довольно часто контаминантами лекарственных препаратов являются представители семейства Agonomycetaceae. ВИДЫ Rhizoctonia soiani и Sclerotium rolfsii с одинаковой частотой обнаружены как В твердых (Senade, Besalolum, Tabulettae stoma-chicae, Tabulettae contra tussim, Aiiocholum, Flaminum ),так И В МЯГКИХ (Phytolysinum, Oleum Ricini, Oleum Hyppopheae ) лекарственных формах.

Среда микромицетов-контаминантов растительных лекарственных препаратов немногочисленны сумчатые грибы из родов Мо-nascus, Byssochlamys, Chaetomium, Ascotricha. Последний изолирован только из Liv-52 и представлен видом А.chartarum (идентифицирован по /«Arx, 1970). Роды Monascus И Byssochlamys также представлены по одному виду - м.ruber и B.ni-vea» изолированы из Senadexinum, Plantaglucidum, Oleum Hyppopheae, Extractum Helichrysis. Вилн рода Chaetomium - C.glo-bosum, c.thermophile, Chaetomium sp.довольно часто обнаруживались В Cafiolum, Extractum Sennae И Liv-52. С наибольшей частотой встречаемости аскомицеты, известные своей термофиль-ностью, обнаруживались на твердых лекарственных формах и в особенности на гранулированных препаратах. Технология изготовления последних, предусматривающая сушку и грануляцию при температуре 40-45°С, по всей видимости, не только не оказывает ингибирующего воздействия на пропагулы термофильных грибов, но и до некоторой степени стимулирует их прорастание.

Таким образом, результаты проведенного анализа видового состава грибов-контаминантов еще раз свидетельствуют о том, что, являясь полифагами с широким ареалом распространения и высокой адаптивной способностью, микромицеты могут выживать в разных экстремальных условиях. К последним с полным основанием можно отнести лекарственные препараты, в которых грибы, претерпевая многочисленные этапы производственного процесса, включающего механическое, химическое и термическое воздействие, тем не менее сохраняют жизнеспособность.

4.3, Мпкобиота галеновых лекарственных препаратов. Лекарственные растения являются основным сырьем для получения галеновых лекарственных форм - инфузий (настоев) и декоктов (отваров).

Микологический анализ декоктов выявил их высокую микробиологическую чистоту. Результаты же анализа инфузий показали, что нормируемый режим термической обработки не исключает сохранения жизнеспособности диаспор грибов-контаминантов. Мико-биота настоев представлена облигатными - Humicola grisea, и факультативными термофилaim -A.fumigatus, A.candidus, а также проявившими термотолерантность мезофилами - A.niger, A.fla-vus, p.expansum, p.chrysogenum, Peniciiiium sp. Указанные виды мицелиальных грибов выделены из следующих настоев: Нег-ba Hyperici, Herba Millefolii, Folium Salviae, Folium Ыеп-thae, Flores Sambuci, Plores Chamomillae, Radix Tormentillae И Species laxantes.

Установлено, что заспоренность микромицетами приготовленных настоев уменьшалась на 2-3 порядка по сравнению с исходным растительным сырьем и полностью соответствовала микробиологическим требованиям pip и ГО, предъявляемым к этой группе лечебных препаратов.

ГЛАВА 5. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА ШКРОШЦЕТОВ-КОНТА-МИНАНТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Биологическими методами на токсигенность исследовано 164 штамма грибов-контаминантов лекарственного растительного сырья и фармацевтических препаратов. Испытанные изоляты относятся к 32 видам из 6 родов класса несовершенных грибов. Выраженную токсичность проявили 56 (34$)-тестируемых штаммов (табл.2). Проанализированные микромицеты являются наиболее характерными представителями микобиоты исследованных растительных лекарственных средств.

Состав изолятов, проявивших токсичность, представлен . гифоми-цетами. из родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria. Наибольшее число токсичных изолятов зарегистрировано у A.flavus, A.niger, A.fumigatus, P.expansum, P.granulatum,

Лекарственные средства

Количество испытанных

видов

штаммов

Растительное сырье Лекарственные препараты Итого :

29 14

105 59 164

31 39 34

выделенных из НегЪа Hyperici, Herba tlillefolii, Flores Chamo-millae, Radix Valerianae, Extractum Sennae, ¿enadexinum, Flaminum и в особенности из Liv-52, 42$ тестируемых штаммов которого оказались средне- и высокотоксичными.

Хроматографический анализ на обнаружение афлатоксина, зеа-раленона, охратоксина и патулина в экстрактах 14 штаммов не выявил искомых микотоксинов. Однако эти данные мы склонны считать предварительными, непозволяшими дать окончательное заключение и не служащими основанием для отрицания наличия микотоксинов в лекарственных средствах. Эти вопросы должны стать предметом специального исследования.

1. В лекарственном растительном сырье выявлено 112 видов микромицетов-контаминантов, относящихся к 23 родам, 6 семействам, 4 порядкам и объединенным в 2 класса. Изолированные виды и вариации распределяются по классам следующим образом: Zygomycetes - 12 (11$), Hyphomycetes - Ю0 (89$). Наибольшим видовым разнообразием отличаются семейства Moniliaceae -77(69$) и Dematiaceae - 16(14$) видов. Немногочисленным видовым составом представлены семейства Mucoraceae - II, Tu-berculariaceae - 5, Agonomycetaceae - 2, Mortierellaceae -

I ВИД.

2. Выявлена высокая степень контагшшрованности мицелиаль-ными грибами 87$ проанализированных серий лекарственного растительного сырья и только 13$ исследованных образцов удовлетворяли микробиологическим нормам FIP.

ВЫВОДЫ

- 21 -

3. Сравнительная оценка заспоренности по группам лекарственного сырья показала, что растения из групп Herba, Folium и Flores менее загрязнены микромицетами, чем Radix и Species .

4. Микологический анализ гранулированного и брикетированного растительного сырья показал, что это не только удобная для потребителя дозированная форма лекарственного сырья, но и наименее загрязненная пропагулами микроскопических грибов.

5. Микологической экспертизой 31 наименования нестерильных растительных препаратов (148 серий) выделено в аксенические культуры и идентифицировано 83 вида мицелиальных микромицетов-контаминантов, относящихся к 22 родам, 8 семействам, 5 порядкам, объединенным в четыре класса: Zygomycetes - 5(6$),piec-tomycetes - 2(2%), Pyrenomycetes - 4(5$) И Hyphomycetes -72(87$) видов. Из класса несовершенных грибов наибольшим видовым разнообразием отличается семейство Moniiiaceae, представленное 5 родами и 56(67$) видами. Меланинсодеряащие сапро-трофы из семейства Dematiaceae представлены 7 родами и 14 (17$) видами. Значительно меньшим числом видов характеризуется семейство Mucoraceae - 4 И liortierellaceae - I ВИД. В числе грибов-контаминантов фармацевтических препаратов впервые отмечается наличие довольно редкой для лекарственных средств и своеобразной по своему таксономическому составу группы сумчатых грибов, представленных семействами Monasca-ceae, Chaetomiaceae, Trichocomataceae.

5. Таксономический анализ 266 исследованных серий растительных ЛС показал, ЧТО роды Aspergillus (27) И Penicillium (55 видов) являются наиболее агрессивными агентами контаминации и по частоте встречаемости и видовому разнообразию занимают доминирующее положение. Четкой закономерности в распределении этих родов и их приуроченности к определенному лекарственному средству не выявлено. Наибольшей частотой встречаемости видов отличались пенициллин из секции Asymmetrica-Fasciculata. в растительных лекарственных средствах и в особенности в твердых лекарственных формах у аспергиллов наряду с конидиальной стадией наблюдается и сумчатая. Телеоморфы относятся К родам Eurotium, Neosartorya и Chaetosartorya.

В растительном сырье и фитопрепаратах по частоте встречав-

МОСТИ доминирующими видами ЯВЛЯЮТСЯ Л.Пауиз И А.Шеег, встречающиеся почти во всех проанализированных сериях лекарственных средств. К субдоминантам отнесены виды А.сХауа-Ьиз, A.fumigatus, Р.сус1ор1шп, Р.сгиз-ЬоЕиш, Р.риЬеги1ит.

6. Количественная оценка заспоренности лекарственных препаратов ыикромицетами показала, что микробиологическая чистота, удовлетворяющая требованиям Р1Р и РЗ, подтвердилась для 78$ исследованных серий, а 22$ не соответствовали стандартам, предъявляемым к этой группе медицинских препаратов. Во всех исследованных образцах фитопрепаратов наблюдалась флуктуация заспоренности. Наибольшие колебания величин контаминкрованно-сти отмечены в мягких лекарственных формах.

7. Установлено, что твердые лекарственные формы являются наиболее контаминированной группой препаратов, по сравнению с мягкими и жидкими формами лекарств. Среди исследованных твердых лекарственных форм в микробиологическом аспекте наиболее ин-фищрованными оказались таблетировадные препараты, 48$ проанализированных серий которых имели заспоренность, в несколько раз превышающую регламентируемую величину.

Из исследованных мягких лекарственных форм (мази, масла, мягкие капсулы) 31$ не удовлетворяли микробиологическим нормам ир и га.

Высокой микробиологической чистотой обладали все проанализированные серии жидких препаратов (тинктуры, соки, сиропы).

8. Микологический анализ галеновых лекарственных препаратов выявил микробиологическую чистоту отваров, заспоренность же настоев находилась в пределах нормы, регламентируемой для этой группы лекарств.

9. При идентификации микромицетов-контаминантов лекарственных препаратов были замечены небольшие отклонения морфо-культуральных признаков: изменения в размерах колоний и пигментации реверзума, образование у колоний узкой спороносной зоны и широкого аспорогенного края, формирование обильных и крупных склероциев, образование хламидоспор, предшествующих формированию типичных органов размножения. Отмечены также незначительные отклонения в размерах конидиалыюго аппарата и тенденция к шероховатости конидиеносцев и конидий.

10. Биологическими методами на токсигенность исследовано

164 штамма грибов-контаминант.ов нестерильных ЛС, относящихся к 32 видам из 6 родов класса несовершенных грибов. Выраженную токсичность проявили 56(34/1!) тестируемых штаммов. Наибольшее число токсичных изолятов зарегистрировано у A.flavus, A.fumigatus, A.niger, P.expansum, P.granulatum.

II. Приведенные данные свидетельствуют о возможности побочного действия на организм человека лекарственных препаратов, инфицированных токсигенными микромицетами, и диктуют необходимость ужесточения предельно допустимых нормативов по грибной контаминации нестерильных лекарств как в отношении количественного, так и качественного состава микобиоты.

Микробиологические нормы на фармацевтические средства должны регламентировать количество микроскопических грибов-конта-минантов: для нестерильных препаратов П категории не более 10, Ш не более 50 КОЕг/мл, а для растительного лекарственного сырья не более I02 КОЕ/г. Считать недопустимым присутствие таких потенциальных грибных патогенов как A.flavus, A.fumigatus, A.parasiticus, P.expansum, которые могут стать причиной серьезных микозов и микотоксикозов.

Вышеизложенное особенно необходимо в настоящее время, в момент становления новых государственных институций, упорядочения законодательства и предстоящих реформ, направленных на унификацию национальной службы мониторинга качества импортируемых и экспортируемых лекарственных средств.

прдасшшя ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. На основании результатов исследования составлена схема миколого-токсикологической экспертизы нестерильных растительных лекарственных средств.

2. Предложен комплекс превентивных и корректировочных мер, гарантирующих микробиологическую доброкачественность растительного сырья.

3. Составлен проект микологических требований, предъявляемых к лекарственному растительному сырью.

4. Предложена регламентация количественного и качественного состава мицелиальных микромицетов-контаг.синантов нестерильных лекарственных средств, в соответствии с категорией микробиологической чистоты (дополнение к рекомендациям pip, 1975).

5. Составлен информационный листок "Микологический контроль нестерильных растительных лекарственных средств" для внедрения в практику контрольно-аналитической лаборатории производственного объединения "Армбиофармация".

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Грибы почв облепиховых насаждений и их общность с контами-наторами плодов.- Мат.УП Закавк.конф.по спор.раст.- Ереван, 1986, с.74-75 (в соавт.с Л.Л.Осипян).

2. О контаминации микрошцетами нестерильных растительных лекарственных средств.- Биол.ж.Армении.- 1989, т.42, И 5,

с.483-485 (в соавт.с Л.Л.Осипян).

3. К микофлоре нестерильных растительных лекарственных средств.- Биол.ж.Армении.- 1989, т.42, tè II, с.1042-1045 (в соавт.с Л.Л.Осипян).

4. Estimation of contamination of herbal medical preparations by micromycetes.- Tenth Congress of European mycologists, Tallin, august 1989, p.89 (в соавт.с Л.Л.Осипян).

5. К вопросу жизнеспособности сапротрофных минромицетов в процессе приготовления галеновых лекарственных препаратов.-Конф. "Антропогенная экология 1,шкромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды".- Тез., Киев, 16-20 апреля 1990, с.95-96 (в соавт.с Л.Л.Осипян).

6. Токсикологическая экспертиза микромицетов-контамияантов растительных лекарственных препаратов.- Наука и производство, Ереван, 1993, № 2 (в соавт.с Л.Л.Осипян; \на арм.яз.).