Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексная оценка качества кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза липидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Комплексная оценка качества кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза липидов"

На правах рукописи

Васильев Александр Владимирович

Комплексная оценка качества кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза липидов

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2007

003160897

Работа выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Россельхознадзора (ФГУ «ВГНКИ»)

Научный руководитель доктор биологических наук

( Комаров Александр Анатольевич

! _

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Бузлама Виталий Соломонович

! кандидат биологических наук, доцент

; Мистюкова Ольга Николаевна

£

Ведущая организация ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и ' технологический институт птицеводства РАСХН

Защита состоится " 2 " ноября 2007 г в 1300 час на заседании диссертационного совета Д' 006 004 01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г Воронеж, ул Ломоносова 114-6)

I

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН.

Автореферат разослан )ЦР " 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совету кандидат внелогических наук

ТИ Ермакова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Существенное влияние на физиологическое состояние и продуктивность сельскохозяйственной (с -х ) птицы в условиях промышленного птицеводства оказывает качество кормов и кормовых добавок (Ларичева Е А, 1983) Качество кормов в значительной мере зависит от входящих в их состав липидов, которые легко подвергаются гидролитическому расщеплению и окислению (Бузлама В С ,1997, 2004, Журавлев А И 1960, 2007) Это может приводить к возникновению различных заболеваний с -х птицы и снижению ее продуктивности

Продукты окисления и гидролиза липидов отрицательно влияют на сохранность таких важных компонентов кормов, как витамины, жирные кислоты, белки, аминокислоты (Бузлама В С ,1997, Ильина Н А , 2004) Особое значение эта проблема приобрела в последние годы ввиду широкого использования белково-витаминно-минеральных концентратов (БВМК) для производства комбикормов Из-за высокого содержания липидов и катализаторов процессов окисления липидов - ионов металлов переменной валентности в их составе, действие антиокси-дантов недостаточно эффективно

До настоящего времени в Российской Федерации действовали официальные нормативы оценки качества липидов в составе кормов и кормовых добавок только по величине перекисных и кислотных чисел, без учета вторичных продуктов окисления липидов (оксикислот, альдегидов и др), что не позволяло объективно оценивать качество этих продуктов

Таким образом, актуальность данной работы, связанной с необходимостью комплексного подхода к оценке качества кормов по содержанию в них первичных (гидроперекисей и пероксидов), вторичных (альдегидов и оксикислот) продуктов окисления и гидролиза (жирные кислоты) липидов с использованием простых, -легко воспроизводимых в ветеринарных лабораториях методик, очевидна ^

Целью данной работы явилось разработка методик и нормативов комплекс- \ ) ной оценки качества кормов для с -х птицы по уровню содержания первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

модифицировать существующие методы определения продуктов окисления и гидролиза липидов применительно к изучаемым объектам,

отработать оптимальные условия экстракции, для обеспечения максимального извлечения первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов из БВМК и комбикормов в экстракт,

определить влияние первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов БВМК на сельскохозяйственную птицу для установления их максимально допустимых уровней (МДУ),

исследовать динамику образования продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК при хранении,

на основании МДУ продуктов окисления и гидролиза липидов для с -х птиц, а также динамики образования данных продуктов в БВМК, определить максимальные сроки хранения данной продукции,

разработать и метрологически аттестовать методики комплексной оценки качества липидов в составе комбикормов и БВМК для сельскохозяйственной птицы по уровню содержания первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза

Научная новизна. Впервые изучена динамика накопления первичных (гидроперекисей и пероксидов), вторичных (оксикислот и альдегидов) продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для с -х птицы Показано влияние комбикормов с различной степенью окисления и гидролиза липидов на продуктивность, физиологическое состояние и биохимические показатели цыплят-бройлеров и кур-несушек

Практическая значимость работы. Усовершенствованы и метрологически аттестованы «РОСТЕСТ-Москва» методики определения перекисного (гидроперекисей и пероксидов) кислотного, альдегидного чисел и оксикислот, позволяющие проводить комплексную оценку качества БВМК и комбикормов для с -х птицы по уровню содержания в них не только первичных, но и вторичных про-

дуктов окисления и гидролиза липидов Установлены максимально допустимые уровни их содержания в БВМК и комбикормах, а также определены максимальные сроки хранения БВМК для цыплят-бройлеров и кур-несушек Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии 27 января 2003г (№13-5-02/0657) «Методические указания по определению качества липидов кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза», включающие в себя методики количественного определения кислотного, перекисного и альдегидного чисел, а также содержание оксикислот, предназначенные для контроля качества БВМК и комбикормов в условиях научно-производственных лабораторий сельхозпредприятий и региональных лабораторий Россельхознадзора

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на третьей международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 6-8 сентября 2000 г), 1Х-ом Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2001 г), Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г), ГУ-ой региональной конференции «Золотое кольцо России» (Владимир, 2001 г), Х-ом Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2002 г), Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2003 г), Конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» Москве, 2001 г, 2006 и 2007 гг

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 Разработать и аттестовать методики определения продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для с -х птицы

2 Изучить влияние продуктов окисления и гидролиза липидов БВМК и комбикормов на с -х птицу, с целью установления их максимально допустимых уровней

3 Научно обосновать максимальные сроки хранения БВМК и комбикормов для с -х птицы на основании изучения динамики накопления в них первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения Работа иллюстрирована 29 рисунками и 15 таблицами Список литературы содержит 187 источников, в том числе 78 иностранных

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методики

Животные Куры-несушки кросса «Радонеж», цыплята-бройлеры кросса «Смена 2» и «Конкурент»

Корма БВМК различных фирм - производителей с разной нормой ввода Методики Экспериментальная часть работы выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов ФГУ «ВГНКИ», а также на базе ОПХ Манихи-но, ГУ СП Загорское ЭПХ ВНИТИП, ГУП ППЗ Смена (г Сергиев Посад)

Исследования проводились по заданию 10 06 «Разработать нормативы комплексной оценки качества липидов кормов по степени их окисления и гидролиза» Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ в 1998 -2003 г

Методики определение продуктов окисления и гидролиза липидов БВМК и комбикормов Для определения кислотного числа за основу была использована методика по ГОСТ 13496 18, а для определения содержания перекисей - «Методика количественного определения перекисного числа», утвержденная Главвету-пром СССР 4 мая 1987г Для определения альдегидного числа использовали методику из «Временной инструкции по определению степени окисления липидов в кормах и оценке влияния качества кормов на рыб», утвержденной Промрыбводом в 1987г Оксикислоты определяли гравиметрическим методом (Особенности кормления норок в приморском крае, Исаева Т И , Беловодский В Л, 1974г)

Экстракцию липидов для определения кислотного, перекисного и альдегидного чисел проводили в делительной воронке путем пропускания через навеску образца БВМК или комбикорма экстрагента (хлороформа, петролейного и диэти-

лового эфиров) в выпарительную чашку, с последующим выпариванием экстра-гента и высушиванием липидов до постоянной массы

Экстракцию липидов для определения оксикислот проводили хлороформом или диэтиловым эфиром в течение 4-х часов, после чего экстракт фильтровали через бумажный фильтр, с последующим выпариванием экстрагента и высушиванием липидов до постоянной массы

Определение кислотного числа Метод основан на нейтрализации свободных жирных кислот 0,1н раствором щелочи при титровании Кислотным числом считали количество миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1г исследуемых липидов

Определение перекисного числа (гидроперекисей и пероксидов) Метод основан на окислении йодистого калия перекисными соединениями, содержащимися в липидах, в присутствии уксусной кислоты и титровании, выделившегося йода раствором тиосульфата натрия

Определение альдегидного числа Метод основан на взаимодействии карбонильных соединений с бензидином Альдегидное число определяли по изменению оптической плотности при X = 360 нм раствора липидов в смеси хлороформ этанол (1 1), обработанного бензидином

Гравиметрический метод определение содержания оксикислот Метод основан на нерастворимости оксикислот в петролейном эфире Оксикислоты определяли путем взвешивания на аналитических весах после их очистки от гидролизо-ваных липидов петролейным эфиром и высушивания в сушильном шкафу до постоянной массы

В крови цыплят-бройлеров определяли следующие показатели гемоглобин, холестерин, малоновый диальдегид, общие липиды активность пероксидазы, ка-талазы, супероксиддисмутазы витамины А, Е и С, в печени - витамины А, Е и С

В крови кур-несушек - гемоглобин, холестерин, малоновый диальдегид, в печени - витамины А, Е Желток яйца исследовался на содержание витаминов А и Е, кислотное число

Определение концентрации гемоглобина в крови проводили гемоглобин-цианидным методом (Кушаковский МС 1974), малонового диальдегида - спек-трофотометрическим методом в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Двинская Л М и др , 1980), общих липидов - в реакции с фосфованилиновым реактивом (Комаров Ф И и др ,1976), общий холестерол - по Ильку (1972), витаминов А и Е в печени и желтке яйца - спектрофотометрическим методом (Войтов Л И и др , 1989), в сыворотке крови - по Биери в модификации А А Анисовой (Антонов Б И и др , 1991), витамина С в плазме крови (Петрова А Т и др , 1979), а в печени - в реакции с а,а-дипиридилом (Антонов Б И и др , 1991)

Активность каталазы в крови цыплят определяли спектрофотометрическим методом по способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм (Балахнов-ский С Д , 1956), пероксидазы - по скорости реакции окисления бензидина перекисью водорода с образованием окрашенного продукта, имеющего максимум поглощения при 520 нм (Плешков Б П , 1976), супероксиддисмутазы - по торможению восстановления нитросинего тетразолия в присутствии НАД Н и феназинме-тасульфата (Дубинина ЕЕ и др , 1983)

Кислотное число желтка определяли по «Методике определения кислотного числа желтка» согласно МУ «Диагностика токсической дистрофии сельскохозяйственных птиц», утвержденной Главветупром МСХ СССР 15 08 84г

Представленные данные статистически обрабатывали методами вариационной статистики (Жаков М С , 1986)

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1 Модификация методов оценки качества БВМК и комбикормов

Для объективной оценки качества БВМК и комбикормов по степени окисления и гидролиза липидов необходимо было оптимизировать методики определения кислотного, перекисного и альдегидного чисел, а также содержания окси-кислот, приведенные в п 2 1

Как показали проведенные эксперименты, результаты по всем вышеперечисленным показателям варьировали в зависимости от использованного экстра-гента и методов экстракции Таким образом, первым этапом процесса модификации этих методов явилось оптимизация условий экстракции первичных и вторичных продуктов окисления липидов, позволяющих максимально выделять эти соединения из исследуемых объектов, что в значительной степени зависит от выбора экстрагентов

Сравнительная оценка эффективности различных экстрагентов проводилась по степени извлечения продуктов окисления и гидролиза липидов на 10 образцах БВМК и 5 образцах комбикормов В качестве экстрагентов использовали хлороформ, диэтиловый и петролейный эфиры (п 2 1 )

В таблице 1 представлены данные по экстракции продуктов окисления и гидролиза липидов из БВМК и комбикормов разными растворителями

Из данных таблицы 1 следует, что лучшим экстрагентом для перекисных соединений (гидроперекисей и пероксидов) является диэтиловый эфир, для альдегидов - петролейный эфир, для оксикислот - хлороформ или диэтиловый эфир, для продуктов гидролиза (свободные жирные кислоты) - хлороформ

Определение содержания перекисных соединений в липидном остатке после экстракции проводилось в зависимости от их реакционной способности как быстрореагируемых (гидроперекисей), так и труднореагируемых (пероксидов) путем двойной экспозиции в уксуснохлороформенном растворе 20-ти минутной для гидроперекисей, двухчасовой - для пероксидов

Выделение продуктов окисления и гидролиза липидов различными экстрагентами

Наименование продукта Гидроперекиси, 1/20 ммоль/кг Пероксиды, 720 ммоль/кг Кислотное число, Mir КОН/г Альдегидное число, мг КА/кг Оксикислоты, %

X ДЭ ПЭ X -да , ПЭ X >' ДЭ ПЭ X ДЭ ПЭ ДЭ ПЭ

25% БВМК «Стартер» 31,0+2, 67 33,3 ±2, 21' 6,7±0 ,42 7,2+0 ,65 8,2+0,7 ' 5 - 3,1±0 ,29 9,6+0 ,71 6,4+0 ,53 5,2±0,4 6 32,7±2, 90 55,6+4,6 0 73,4+S,i о"- 5,3±0,4' 5 , 5,2i0^7 —

20% БВМК «Гроуэр» 38,3+3, 21 40,9±3, 74 10,0± 0,67 8,8±0 ,72 9,6+0,"7 '6 ,; 4,1±0 ,28 8,7±0 ,69 1 7,0+0 ,65 6,5±0,5 2 40,6+3, 50 44,8±4,2 0 62,9+5,1 0 4,5:0,3 ' г " 4,5±0,35 —

15% БВМК «Финишер» 34,7+2, 68 38,2+3, ,$6 8,2±0 ,72 8,2±0 ,69 9,0±0,7 3 3,3±0 ,22 1,6,7±0 ,58 5,9+0 ,47 5,9±0,5 1 45,1±4, 0 60,2+5,3 0 <93,6+8,4 0 . 6,5+0,5 *"6,5±0,51 —

10% БВМК «Вакон» 28,8+2, 41 32,2+2, 92 7,9+0 ,67 5,4+0 ,39 6,4±0,5 ' 8 3,0±0 ,21 3,5+0 Д5 3,0±0, 18 2,3±0,1 6 40,8±3, 60 59,6±5,4 0 90,2+7,9 " Ь' 'ü,0±0,4 8 6,0±0,55 —

15% БВМК КВС 15 18,3+1, 63 26,1+2, 08 5,2+0 ,47 4,3±0 ,31 5,6±0,4 6 2,0±0 ,12 6,6±0 ,54 6,1 ±0 ,52 5,4±0,4 5 48,2±4, 10 62,4+5,7 0 95,4+8,2 1 0 Sj4±Q,4 3* 5,4±0,43 —

15% БВМК «Биосинтезе» Литва 14,3+1, 22 19,5+1, 62 4,8±0 ,36 3,3±0 ,27 4,0+0,3 4 — 6,5±0 ,57 5,6±0 ,46 5,7+0,4 8 36,5±2, 70 49,1±3,0 8 89,7±8,1 , 0' 7,2±0,6 " 5, - '7,2+0,59 —

10% БВМК ИАБ бройле-премикс (код A4) 16,2+1, 36 22,2±1, 74 6,1+0 ,52 5,0±0 ,32 5,9±0,4 6 2,4+0 ,16 3,7+0-',31 3,2±0 ,22 2,6±0,1 7 44,8+3, 90 61,1+5,4 0 94,1+8,7 , 0 8,4+0,6 ' ,7 8,4+0,66 , —

5% БВМК KLPC 5 19,8+1, 64 23,1+1, 97 7,1±0 ,62 9,0±0 ,67 9,8±0,7 8 4,4±0 ,37 3,1+0 ,23 2,1 ±0 ,14 1,9±0,1 1 35,2+2, 50 56,1±5,1 0 78,4±6,3 0 ; 5,0+0,3 2 4,9+032 —

10% БВМК Райсио поул-три 10 16,0+1, 32 21Д+2, 01 5,0±0 ,39 5,0+0 ,45 5,6±0,3 5 2,5±0 ,14 3,2±0 ;27, 2,0+0 ,12 1,5+0,1 3 41,5±3, 70 43,4+3,4 0 63,9+5,2 0 5,2+0,4 3 5,2+0,41 —

10% БВМК ИАБ премикс (код В4) 21,3+1, 91 25,1±2, 14 7,0±0 ,52 9,9+0 ,76 10,7+1, 01 5,0±0 ,37 3,3+0 ;28 2,4+0 ,18 2,0±0,1 8 30,9+2, 30 56,1±4,2 0 70,6+6,5 0 -5,1+0,4 5, 5,1 ±0,42 —

Комбикорм на основе 15% БВМК КВС 15 24,1±2, 08 27,4±2, 34 8,0±0 ,71 4,9±0 ,39 5,3±0,4 5 1,7+0 ,09 7,1+0 6,1 ±0 ,54 6,2±0,5 4 59,8±4, 80 72,3±6,3 0 100,2±9, 03 4,9±0,3 8 5,0±0,35 —

Комбикорм на основе 20% БВМК «Гроуэр» 36,2±3, 12 39,9±3, 71 9,4±0 ,78 8,4±0 ,64 9,4±0,8 3 4,2+0 ,27 9,61:0 ,78 9,2+0 ,81 8,8±0,7 2 20,7±1, 30 38,2+2,9 0 60,'8±5,2 9 ' 4?1±0,3 2 4,1 ±0,28 —

Комбикорм на основе 10% БВМК «Вакон» 32,0+3, 06 36,5±3, 49 8,8±0 ,75 7,4±0 ,51 8,4+0,7 7 3,8±0 ,29 .4,6+0 " ,,34, 3,9±0 ,25 3,5+0,2 7 33,5+2, 20 50,6±4,5 0 85,3±7,2 0 ,5,3±0,'4 9 5,2+0,37 —

Комбикорм на основе 10% БВМК Райсио поултри 10 21,1+1, 83 24,3±2, 19 - 7,5±0 ,68 9,7±0 ,79 10,4±0, 98 4,5±0 ,37 -4,0+0 ■ ,24- 2,8+0 ,17 1,8+0,1 4 27,5+1, 90 47,8±3,7 0 71,4±6,3 0 59,0+0, ,43 5,0±0,46 —

Комбикорм ПК-5 17,3+1, 38 20,9+1, 87 6,1±0 ,54 5,2±0 ,43 6,3+0;« Ъ 2,3±0 ,19 19,р±,+ 1,55 16,2+ 1,23 15,9±0, В 15,6+1, 30 22,7±1,8 0 47,3+3,4 Ö '3;0+~0,2 4 2,8±0,28 —

X - хлороформ, ДЭ - диэтиловый эфир, ПЭ - петролейный эфир, штрих - оптимальный экстрагент

2.2.2. Исследование влияния продуктов окисления и гидролиза липидов кормов на цыплят-бройлеров и кур-несушек

Действие продуктов окисления и гидролиза липидов кормов на цыплят-бройлеров

Анализ зоотехнических данных показал, что продукты окисления липидов БВМК оказывают существенное влияние на живую массу цыплят-бройлеров Показано, что при уровне гидроперекисей - 23,6 '/20 ммоль/кг, пероксидов - 8,7 720 ммоль/кг, альдегидов - 45,0 мг КА/кг и оксикислот - 3,5% наблюдается существенное снижение живой массы цыплят (на 100 г) по сравнению с контролем Более высокие уровни вторичных продуктов окисления приводят к еще большей потере продуктивности, нарушению отложения подкожного жира и гемолизу эритроцитов (табл 2) Из данных опыта видно, что снижение живой массы цыплят -бройлеров и гемолиз эритроцитов обусловлено, в большей степени, высоким уровнем альдегидов и оксикислот и, в меньшей степени, зависит от содержания гидроперекисей и пероксидов в комбикормах

Установлено, что скармливание кормов с содержанием 23,6 '/20 ммоль/кг гидроперекисей и 8,7 '/2О ммоль/кг пероксидов вызывало резкое (в 1,5 раза) увеличение концентрации холестерина в крови цыплят-бройлеров и существенное снижение уровня витаминов Е и С в крови и печени (в 2 - 4 раза) по сравнению с контролем

Наиболее заметное изменение активности пероксидазы и каталазы происходило в группах цыплят - бройлеров, получавших БВМК с максимальным содержанием перекисных соединений Максимальная активность ферментов наблюдалась на 20-е сутки исследования (пероксидазы - в 3 - 5 раз выше, каталазы в 2 раза выше, чем в контроле), после чего происходило снижение их активности В группах цыплят, получавших корма с максимальным содержанием альдегидов и оксикислот, происходило снижение активности пероксидазы и каталазы (табл 3)

Активность супероксиддисмутазы была максимальной на 20 сутки исследования в группе цыплят, получавших корма с максимальным содержанием перекисных соединений Однако изменение активности супероксиддисмутазы по

сравнению с каталазой и пероксидазой было менее выраженным (табл 3) К концу опыта наиболее существенное (в 1,5 - 2 раза) снижение активности супероксид-дисмутазы наблюдали у цыплят, получавших в составе кормов БВМК с высоким уровнем альдегидов и оксикислот

Супероксиддисмутаза, пероксидаза и каталаза с альдегидами и оксикисло-тами непосредственно не взаимодействуют, однако наибольшее снижение активности ферментов отмечено в группах цыплят, получавших БВМК с максимальным содержанием альдегидов и оксикислот Это, по видимому, связано с гемолизом эритроцитов Поскольку ферменты антиоксидантной защиты локализуются в эритроцитах и других клетках крови, то их разрушение приводит к инактивации ферментов

При содержании в кормах 45,0 мг КА/кг альдегидов и 3,5% оксикислот наблюдали существенное (в 3 раза по сравнению с контролем) увеличение концентрации малонового диальдегида, в 2 раза снижение концентрации гемоглобина и общих липидов в крови, а также на 10% витамина А в крови и печени цыплят-бройлеров (табл 2)

Более высокие концентрации гидроперекисей, пероксидов, альдегидов и оксикислот приводили к более выраженному изменению биохимических и зоотехнических показателей у цыплят-бройлеров

Действие продуктов окисления и гидролиза липидов кормов на кур-несушек Значительное снижение яйценоскости и средней массы яйца (на 4,5% и 2 % - соответственно) отмечали в группе кур-несушек, которым скармливали корма с содержанием гидроперекисей - 23,6 1/2Оммоль/кг, пероксидов - 8,7 72Оммоль/кг, альдегидов - 7,0 мгКА/ЮОг и оксикислот - 5,0 % В этой же группе наблюдали незначительную выбраковку птицы Более высокие концентрации альдегидов и оксикислот липидов в БВМК приводили к более существенному снижению продуктивности, значительной (8%) выбраковке и падежу кур-несушек

Влияние продуктов окисления липидов корма на основе 10% БВМК с различным сроком хранения на биохимиче-_ ские показатели крови и печени цыплят бройлеров__

Показатели Срок хранения БВМК Норма

1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца 5 месяцев

Концентрация продуктов окисления липидов в корме

Гидроперекиси, '/20 ммоль/кг 1,50 + 0,09 8,58 ±0,14 14,01+0,18 25,11 ± 0,23 9,76 ±0,12

Пероксиды, '/гО ммоль/кг не обн 2,91 ±0,08 3,23 ±0,12 9,21 ±0,11 13,14 ± 0,13

Кислоты, мгКОН 1,41 +0,05 2,05 ±0,04 2,26 ± 0,02 2,78 ± 0,03 3,03 ± 0,06

Альдегиды, мгКА/кг не обн 20,3 ± 1,20 44,6 ±2,10 70,3 ± 1,10 98,4 + 3,10

Оксикислоты, % 2,77 + 0,12 3,04 ±0,14 3,45 ±0,17 3,78 ±0,13 4,03 + 0,15

Биохимические показатели в крови, печени и живая масса цыплят бройлеров на 30-й день опыта

Гемоглобин, г/л 160,9 ±5,22 153,2 ±9,01 141,2 ± 2,15** 95,1 ±2,48*** 87,6 ±3,75*** 89,0- 129,0'

Общие липиды, г/л 20,88 + 0,81 20,12 ± 1,02 17,58 ±0,71* 14,46 ± 0,62** 8,99 ±0,61*** 3,6-21,0'

МДА, мкМ/л 2,4 ± 0,05 6,6 ± 0,88« 8,0 + 0,09*** 8,14 ±0,16*** 9,67 ± 0,37*** 1,5-2,5'

Холестерин, мкМ/л 4,51 +0,16 4,93 ± 0,06 6,85 ±0,17*** 7,54 ±0,19*** 5,62 + 0,21* 2,8-5,2'

Вит А в крови, мкМ/л 2,55 + 0,47 2,58 ±0,38 2,37 ± 0,47* 1,87 ±0,52** 1,54 + 0,72** 2,5-3,5'

Вит А в печени, мкг/кг 151,31±1,15 149,29+2,01 128,42±],89*** 99,31+1,68 *** 27,18+1,27*** 120,0-130,0'

Вит Е в крови, мкМ/л 25,32±0,98 25,08±1,18 17,65±1,24** 9,86+1,27 *** 23,56+1,22* 10,0-25,0^

Вит Е в печени, мг/кг 28,3+2,6 28,1±2,8 16,1±1,6** 10,8±1,8*** 27,6±2,9 25,0-60,0'

Вит С в крови, мкМ/л 33,08±3,92 31,09+3,08 16,32±3,01** 7,98±2,43*** 26,47±2,99* 10,5-35"

Вит С в печени, мг/кг 287,4+16,3 284,5±12,3 141,2±20,1** 128,7±10,1 *** 243,7±12,3* 150,0-300,0'

Живая масса, г 1596+141,3 1545+137,4 1496±135,6* 1385±142,2** 1274±136,7** 1500-1600

* - различия достоверны с Р < 0,05, ** - различия достоверны с Р < 0,01, ***- различия достоверны с Р < 0,001, Норма - нормальные показатели по литературным данным

Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии, 1985

2 Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных, 1997

3 Уровень перекисного окисления липидов и некоторых антиоксидантов у цыплят бройлеров в возрастном аспекте 1993

Влияние продуктов окисления липидов корма на основе 10% БВМК с различным сроком хранения на активность _ферментов антиоксидантной защиты в крови цыплят - бройлеров__

Показатели Срок хранения БВМК Норма

1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца 5 месяцев

Концентрация продуктов окисления и гидролиза липидов в корме

Гидроперекиси, '/гО ммоль/кг 1,50±0,09 8,58±0,14 14,01+0,18 25,11±0,23 9,76±0,12

Пероксиды, '/20 ммоль/кг не обн 2,91±0,08 3,23±0,12 9,21+0,11 13,14+0,13

Кислоты, мгКОН 1,41 ±0,05 2,05±0,04 2,26±0,02 2,78±0,03 3,03±0,06

Альдегиды, мгКА/кг не обн 20,3 ± 1,20 44,6 ±2,10 70,3 ±1,10 98,4 ±3,10

Оксикислоты, % 2,77 + 0,12 3,04 ±0,14 3,45 ±0,17 3,78 ±0,13 4,03 ±0,15

Активность ферментов в начале исследования

Активность пероксидазы, ед опт пл /л сек 35,2 ± 3,26 35,7 + 3,59 35,8 ± 3,49 35,8 ±2,92 35,6±3,14 30-40'

Активность каталазы, мкМ 49,3 ±0,58 49,2 ± 0,61 49,4 ± 0,67 49,5 ± 0,59 49,3±0,62 40 - 602

НгОгхМУ/лхсек

Активность СОД, уел ед /мл 73,39±2,56 73,91 ±3,32 74,23±2,09 74,08±2,01 74,03+1,99 36-1 Об2

Активность ферментов через 10 суток

Активность пероксидазы, ед опт пл /л сек 37,2 ± 1,94 48,1 ± 1,9* 98,5 ±2,95*** 140,7 ± 1,61*** 102,3±2,78*** 30-402

Активность каталазы, мкМ 49,8 ±0,31 50,3 ± 0,46 55,8 ±0,62*** 84,2 ±3,18*** 65,3+1,07*** 40-602

Н202хЮ3/лхсек

Активность СОД, уел ед /мл 82,31±2,08 82,52+1,93* 83,22±3,37* 85,18+2,57* 72,95+3,01 ** 36-1 Об2

Активность ферментов через 20 суток

Активность пероксидазы, ед опт пл /л сек 38,8 ±1,31 54,5 ± 0,71*** 118,6 ±3,43*+* 176,4 ±4,75*** 88,5+2,98*** 30-402

Активность каталазы, мкМ 50,1 ±0,22 50,5 ± 0,45 57,9 ± 0,55*** 96,8 ± 3,31*** 58,3±0,32*** 40 - 602

Н202х103/лхсек

Активность СОД, уел ед /мл 90,54+1,81 91,42±4,16* 92,57±2,41* 92,62+2,21** 64,51±2,86*** 36-1Об2

Активность ферментов через 30 суток

Активность пероксидазы, ед опт пл /л сек 45,0 ±2,15 63,2 + 0,69** 105,1 ± 1,76*** 105,5 ± 3,34*** 47,6±2,21 30-402

Активность каталазы, мкМ 50,5 ±0,46 51,4 ±0,86 60,0 ±0,13 *** 44,0 ±2,14* 42,3+1,93* 40-602

Н202хЮ3/лхсек

Активность СОД, уел ед /мл 81,42±3,99 83,93±1,95* 85,05+1,81** 66,28±2,61*** 57,31+2,47*** 36-1062

Примечания см табл 21 Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных, 1997

При вскрытии павшей птицы наблюдали гидроперикардит, воспаление слизистых оболочек кишечника, перерождение печени, что говорит о токсическом действии продуктов окисления липидов, особенно альдегидов и оксикислот, при длительном скармливании птице кормов с высоким их содержанием Таким образом, на снижение продуктивности и патологию кур-несушек наибольшее влияние оказывали альдегиды и оксикислоты, и в меньшей степени - гидроперекиси и пе-роксиды (табл 5)

Отмечено существенное снижение концентрации гемоглобина в крови (в 1,3 раза по сравнению с контролем) витамина А в желтке яйца, крови и печени (в 1,5, 1,3 и 1,2 раза, соответственно и увеличение малонового диальдегида в крови (в 3,3 раза) у кур-несушек получавших БВМК с содержанием 7,0 мгКА/ЮОг альдегидов и 5% оксикислот Однако, изменение концентрации данных показателей в крови кур-несушек, вызванное высокими концентрациями продуктов окисления липидов кормов, было менее выраженное, чем в крови цыплят-бройлеров

Скармливание кормов, с содержанием выше 23,6 '/2Оммоль/кг гидроперекисей и 8,7 '/2Оммоль/кг пероксидов вызывало снижение концентрации витамина Е в крови (в 2,7 раза), печени (в 2,2 раза) и желтке яиц (в 2 раза) и увеличение концентрации холестерина в крови кур-несушек (в 1,4 раза) по сравнению с контролем

Отмечено превышение нормы по кислотному числу в группах кур-несушек, получавших корма с максимальным содержанием альдегидов, оксикислот и продуктов гидролиза (табл 4)

При скармливании цыплятам-бройлерам и курам-несушкам комбикормов с кислотным число более 20 мгКОН/кг, наблюдали снижение его потребления (на 10 - 20%) У многих из них (около 30%) наблюдалась диарея Таким образом кислотное число жира не должно превышать 20 мгКОН/кг поскольку дальнейшее скармливание приводило к снижению продуктивности с -х птицы

На основании полученных данных были определены максимально допустимые уровни (МДУ) содержания продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для цыплят-бройлеров и кур-несушек (табл 4)

Таблица 4

МДУ содержания продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комби_кормах для цыплят-бройлеров и кур-несушек _

Цыплята-бройлеры Куры-несушки

Кислотное число, мгКОН/г 20,0 20,0

Перекисное число*, ммоль/кг У20 32,3 32,3

Альдегидное число, мгКА/кг 45,0 70,0

Оксикислоты, % 3,5 5,0

* - включая гидроперекиси -23,6 ммоль/кг '/20 и пероксиды - 8,7 ммоль/кг У20

Влияние продуктов окисления липидов корма на основе БВМК с различным сроком хранения на зоотехнические и биохимические __показатели кур-несушек__

Показатели Срок хранения БВМК Норма

1 месяц | 2 месяца | 3 месяца | 4 месяца | 5 месяцев | 6 месяцев

Концентрация продуктов окисления и гидролиза липидов в корме

Гидроперекиси, 'АО ммоль/кг 2,36+0,01 9,32±0,02 14,1610,03 25,97±0,04 14,16+0,02 13,38±0,02

Пероксиды, 'АО ммоль/кг -- 3,14±0,02 3,94±0,02 1 ] ,83+0,02 8,71±0,03 6,02±0,02

Кислоты, мгКОН 1,99+0,12 3,28+0,11 3,65+0,11 4,11±0,14 4,27±0,11 4,38+0,05

Альдегиды, мгКА/ЮОг -- 20,5±1,20 44,9+0,21 60,1+1,40 69,4±1,60 72,5±1,80

Оксикислоты, % 2,75+0,09 3,02±0,08 3,41±0,11 3,82+0,10 4,97±0,19 5,15±0,12

Зоотехнические показатели кур-несушек к концу опыта

Потребл корма (г/гол) 122,3±22,1 119,6+14,2 119,1+19,1 122,4+115,8 119,3+10,4 118,7+14,3

Падеж (%) не набл не набл не набл не набл не набл 2

Выбраковка (%) 6 6 7 8 9 9

Сохранность (%) 94 94 93 92 91* 89*

Средняя, живая масса в конце опыта (г) 1687,9±141,6 1683,2+142,1 1674,3+123,9 1682,1+135,6 1672,6±141,2 1658,5+128,3 1500-1600

Яйценоскость (%) 82,9 82,5 79,2 78,5* 77,0** 75,2** 80,5

Средняя масса яйца (г) 66,19+11,72 65,67±12,44 65,01 ±9,61 64,93±10,09 64,70+13,01 63,71+11,07 55-65

Биохимические показатели в крови, печени и желтка яиц кур-несушек к концу опыта

Гемоглобин, г/л 125,7 ±5,64 125,3 ±3,99 124,7 ±5,18 123,2 ±6,02 107,6 + 5,31* 98,6±4,12** 89,0-129,0'

МДА, мкМ/л 1,92 + 0,35 2,07 ± 0,44 2,31 ±0,32 3,02 + 0, 23* 6,41 ± 0,33^4= 6,92±0,29** 1,5-2,52

Холестерин, мкМ/л 3,77 ± 0,27 3,81 ±0,44 3,84 ±0,38 5,31 ±0,28* 5,18 + 0,39* 5,08±0,21* 2,8-5,2'

Вит А в крови, мкМ/л 3,27+0,36 3,02±0,41 2,97±0,42* 2,87±0,34 и 2,54±0,52** 1,85±0,28-<-* 2,5-3,5"

Вит А в печени, мкг/кг 138,2 ±2,9 133,3 ±3,1 127,1 ±4,2 122,4 ±3,2* 119,2 ±2,4** 105,3+1,9** 120-130''

Вит Е в крови, мкМ/л 25,32±0,98 25,08±1,18 17,65+1,24*»- 8,86+1,27** > 22,56+1,22* 23,64+1,18* 10,0-25,02

Вит Е в печени, мг/кг 66,2 + 10,8 62,4 ±9,8 60,8 ±10,2 30,2 ± 8,9*** 39,8 ±9,2** 48,4 ± 11,1* 25,0-60,0'

Вит А в желтке, мкг/г 7,8 ± 1,24 7,6+1,17 7,6 ± 1,09 6,4 ± 1,06 5,2 ± 0,99* 4,9±0,97** 6,0-8,0'

Вит Е в желтке, мг/г 1,14 + 0,17 1,12 ±0,09 1,11 ±0,14 0,54±0,09*** 0,62 ± 0,19"* 0,83 ±0,18* 0,8-1,0

Кислотное число желтка, мгКОН/г 5,1+1,02 5,4±1,03 5,6±1,02 5,8±0,94* 6,1+1,04- 6,8±0,96» * 5,0-6,0"

• - различия достоверны с Р < 0,05, ** - различия достоверны с Р < 0,01, ***- различия достоверны с Р < 0,001, ' - Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии, 1985, 2- Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных, 1997, 3 - Уровень перекисного окисления липидов и некоторых антиоксидантов у цыплят бройлеров в возрастном аспекте 1993,4 - МУ «Диагностика токсической дистрофии сельскохозяйственных птиц», утвержденной Главветупром МСХ СССР 15 08 84г

2.2.3. Исследование качества БВМК и комбикормов

После установления МДУ содержания продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для цыплят-бройлеров и кур-несушек, были проведены исследования, по изучению качества концентратов для с -х, птицы, с целью установления научно - обоснованных сроков хранения

Для этого из образцов БВМК, оставленных на хранение при комнатной температуре на 6 - 9 месяцев проводили отбор проб, в которых ежемесячно определяли перекисное, кислотное, альдегидное числа и оксикислоты методами, описанными в 2 2 1 , после предварительной экстракции анализируемых соединений Экстракцию проводили по п 2 2 1, с учетом избирательности экстрагента по отношению к каждому виду продукта окисления и гидролиза липидов Были получены следующие результаты

В результате проведенных исследований установлено (рис 1 и 2), что максимум накопления гидроперекисей приходится на 4 месяц, а пероксидов на 5 - 6 месяцы хранения БВМК и комбикормов Причем до 2 - 3-х месяцев хранения БВМК и комбикормов мы наблюдали медленное увеличение концентрации гидроперекисей и пероксидов, после чего происходило резкое увеличение их содержания (в 2 - 4 раза) к 4 - 5-ти месяцам Далее начинался их распад, который продолжался до конца исследований (6-9 мес) Из рис 1 и 2 следует, что гидроперекиси достигают МДУ (23,6 ммоль/кг 'АО) на 3 - 4 мес хранения БВМД, а пе-роксиды (8,7 ммоль/кг 1/20) на 4 - 5 мес хранения, причем после 5-6 мес хранения их концентрация снижается ниже МДУ

Начиная с 4-5-го месяцев, наблюдалось существенное (в 1,5-2 раза) увеличение содержания альдегидов и оксикислот по сравнению с предыдущим месяцем (рис 3 и 4), так как при распаде гидроперекисей и пероксидов равновесие смещается к образованию вторичных продуктов окисления Именно в этот период наблюдалось снижение концентраций гидроперекисей и пероксидов в кормах (рис 1 и 2) При анализе рис 3 и 4 видно, что концентрация альдегидов и оксикислот в БВМК для цыплят-бройлеров достигала МДУ (45,0 мгКА/кг и 3,5% - соответст-

венно) на 4 мес хранения, а для кур-несушек (70,0 мгКА/кг и 5,0% - соответственно) на 5 мес хранения

Рис 1 Динамика изменения содержания гидроперекисей в БВМК и комбикормах 23,6 - МДУ гидроперекисей в БВМК для цыплят-бройлеров и кур- несушек

1мес 2 мес Змее 4 мес 5 мес 6 мес 7 мес 8 мес 9 мес

-10% БВМК «Вакон»

- 5% БВМК КЬРС 5

-20% БВМК «Гроуэр»

-15% БВМК КВС 15

-10% БВМК Райсио поултри 10

-25% БВМК «Стартер»

Рис 2 Динамика изменения содержания пероксидов в БВМК и комбикормах 8,7 - МДУ пероксидов в БВМК для цыплят-бройлеров и кур- несушек

1мес 2 мес 3 мес 4 мес 5 мес б мес 7 мес 8 мес 9 мес

-10% БВМК «Вакон»

- 5% БВМК КЬРС 5

- 20% БВМК «Гроуэр»

-15% БВМК КВС 15

-10% БВМК Райсио поултри 10

-25% БВМК «Стартер»

Рис 3 Динамика изменения содержания альдегидов в БВМК и комбикормах 45,0 - МДУ альдегидов в БВМК для цыплят-бройлеров, 70,0 - -//- кур-несушек

Рис 4 Динамика изменения содержания оксикислот в БВМК и комбикормах 3,5 - МДУ оксикислот в БВМК для цыплят-бройлеров, 5,0 - -//- кур-несушек

Таким образом, исходя из полученных МДУ для цыплят-бройлеров и кур-несушек и данных по динамики образования продуктов окисления установлено, что срок хранения БВМК и комбикормов для цыплят-бройлеров не должен превышать 4 месяцев, для кур-несушек - 5 месяцев Полученные данные позволили

ограничить срок хранения поступающих БВМК по импорту при государственной регистрации этой продукции в РФ

Выводы

1 Разработаны условия экстракции первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов из БВМК и комбикормов Наиболее полное извлечение гидроперекисей и пероксидов достигается диэтиловым эфиром, альдегидов - петролейным эфиром, оксикислот - хлороформом и диэтиловым эфиром, жирных кислот - хлороформом

2 Установлено, что максимальное накопление гидроперекисей в БВМК происходит через 3,5 - 4 месяцев хранения, пероксидов - через 5,5 - 6 месяцев Более длительное хранение приводит к распаду перекисных соединений с образованием альдегидов и оксикислот, уровень которых постоянно повышается

3 Использование комбикормов со сроком хранения 4 мес , содержанием альдегидов 45,0 мг КА/кг и оксикислот 3,5% вызывало снижение живой массы цыплят-бройлеров на 10%, со сроком хранения 5 мес, содержанием альдегидов 70,0 мг КА/кг и оксикислот 5,0% - к снижению яйценоскости кур-несушек на 10% Более длительное хранение с более высоким содержанием вторичных продуктов окисления приводило к еще большей потери продуктивности

4 Показано, что высокий уровень продуктов окисления и гидролиза липидов в комбикормах для сельскохозяйственной птицы приводит к существенному изменению биохимических показателей крови и печени цыплят-бройлеров и кур-несушек, снижению концентрации гемоглобина, общих липидов в крови, витаминов А, Е, С в крови, печени и желтке яиц, выраженному изменению активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы), увеличению концентрации холестерина и малонового диальдегида в крови и кислотного числа в желтке яиц

5 Установлено, что продукты окисления липидов первичные (гидроперекиси и пероксиды) и вторичные (альдегиды и оксикислоты) оказывают влияние на качество БВМК и комбикормов, что в свою очередь влияет на продуктивность и физиологическое состояние сельскохозяйственной птицы

6 На основании полученных данных предложены максимально допустимые уровни (МДУ) содержания продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для цыплят-бройлеров и кур-несушек

> для цыплят-бройлеров кислотное число - 20мг КОН/г, перекисное число - 32,3 ммоль/кг '/2О (включает гидроперекиси 23,6 ммоль/кг '/20 и пероксиды 8,7 ммоль/кг У20), альдегидное число - 45,0мг/кг, оксикислоты - 3,5%,

> для кур-несушек кислотное число - 20мг КОН/г, перекисное число -32,3 ммоль/кг '/20 (гидроперекиси 23,6 ммоль/кг '/20 и пероксиды 8,7 ммоль/кг У20), альдегидное число - 70,0мг/кг, оксикислоты - 5,0%

7 Исходя из полученных данных по МДУ первичных и вторичных продуктов окисления липидов и динамики их накопления в БВМК, сроки хранения данной продукции для цыплят-бройлеров не должны превышать 4-х месяцев, для кур-несушек - 5-ти месяцев

Практические предложения

1 Разработаны «Методические указания по определению качества липидов кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза», включающие в себя методики количественного определения кислотного, пере-кисного (гидроперекисей и пероксидов), альдегидного чисел и оксикислот, аттестованные «РОСТЕСТ-Москва» (свидетельство об аттестации МВИ №156-2002 от 14 июня 2002г), утвержденные Департаментом ветеринарии 27 января 2003г (№13-5-02/0657), которые предназначены для оперативного контроля за качеством комбикормов в условиях производственных лабораторий птицефабрик и комбикормовых заводов и контроля качества этой продукции в условиях региональных лабораторий Россельхознадзора

2 Методика определения альдегидного числа включена в проект ГОСТ Р «Комбикорма Методика определения альдегидов»

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Комаров А А Влияние продуктов окисления и гидролиза липидов корма на физиологические и биохимические показатели сельскохозяйственной птицы / Комаров А А , Васильев А В // Тезисы докладов 3 международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» - Боровск , 2000 -С 125-125

2 Комаров А А Влияние продуктов окисления и гидролиза липидов корма на уровень витаминов А, Е, С в крови и печени цыплят-бройлеров / Комаров А А , Васильев А В // Материалы 9 моек междун ветеринар конгресса М , 2001 -С 76-77

3 Кармолиев Р X Состояние антиоксидантных систем защиты организма цыплят при токсической дистрофии / Кармолиев Р X , Васильев А В // Ветеринария-2001 -№11 -С 42-45

4 Комаров А А Влияние продуктов окисления и гидролиза липидов корма на уровень гемоглобина, активность пероксидазы и каталазы крови цыплят-бройлеров / Комаров А А, Васильев А В // Сборник статей Всерос научн конф Соверш мет контр, стандарт и сетиф вет препаратов -М, 2001 -С 238243

5 Комаров А А Изучение динамики окисления и гидролиза липидов БВМК / Комаров А А , Васильев А В // Тез докл Всерос научн конф Соверш мет контр , стандарт и сетиф вет препаратов -М , 2001 -С 208-210

6 Комаров А А Окисление и гидролиз липидов в составе БВМК и комбикормов для кур-несушек / Комаров А А , Васильев А В // Материалы IV per конференции «Золотое кольцо России» - Владимир, 2001 -С 68-69

7 Комаров А А Влияние продуктов окисления и гидролиза липидов корма на цыплят-бройлеров / Комаров А А , Васильев А В // 10 Московский международный ветеринарный конгресс Тезисы докладов - 2002 -С 280-282

8 Комаров А А Определение некоторых витаминов и продуктов окисления липидов в биологических объектах / Комаров А А , Васильев А В // Меж-

дународный Форум «Аналитика и Аналитики» Каталог рефератов и статей - Воронеж.- 2003 - Том.2 -С.411

9 Комаров А А Влияние продуктов окисления липидов кормов на биохимические показатели у цыплят / Комаров А А , Васильев А В // Ветеринария -2004 -№1 -С 56-59

10 Комаров А А Окисление и гидролиз липидов / Комаров А А, Васильев А В , Титова Е Г // Птицеводство - 2007 - №7 - С 36-36

Заказ № 266/09/07 Подписано в печать 19 09 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495)797-75-76,(495)778-22-20 V \v\vw с/г т, е-тай т/о@с/г т

V V ' /У

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Александр Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Окисление и гидролиз липидов

2.2. Механизм окисления липидов

2.3. Факторы, влияющие на стабильность липидов 16 2.3.1. Действие антиоксидантов

2.4. Влияние продуктов окисления и гидролиза липидов кормов на организм сельскохозяйственной птицы

2.5. Система антиоксидантной защиты птиц

2.5.1. Ферментативная антиоксидантная система

2.5.2. Неферментативная антиоксидантная система

2.6. Методы определения продуктов окисления и гидролиза в БВМК и кормах

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Используемые реактивы и материалы

3.2. Методы исследований

3.2.1. Экстракция липидов для определения кислотного, перекисного и альдегидного чисел

3.2.2. Экстракция липидов для определения оксикислот

3.2.3. Методы определения продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах

3.2.3.1. Определение кислотного числа

3.2.3.2. Определение перекисного числа

3.2.3.3. Определение альдегидного числа

3.2.3.4. Гравиметрический метод определения оксикислот

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48 4.1. Модификация методов оценки качества БВМК и комбикормов

4.2. Исследование влияния продуктов окисления и гидролиза липидов

БВМК и комбикормов на цыплят-бройлеров и кур-несушек

4.2.1. Действие продуктов окисления и гидролиза липидов кормов на цыплят - бройлеров 50 4.2.1.1. Влияние продуктов окисления липидов кормов на ферменты антиоксидантной защиты цыплят-бройлеров

4.2.2. Действие продуктов окисления и гидролиза липидов кормов на кур-несушек

4.3. Исследование качества БВМК и комбикормов

5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексная оценка качества кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза липидов"

Существенное влияние на физиологическое состояние и продуктивность с.-х. птицы в условиях промышленного птицеводства оказывает качество кормов и кормовых добавок [78]. Качество кормов в значительной мере зависит от входящих в их состав липидов, которые легко подвергаются гидролитическому расщеплению и окислению. Это может приводить к возникновению различных заболеваний сельскохозяйственной (с.-х.) птицы и снижению ее продуктивности [33,47, 54, 68, 100, 118, 119, 156, 173, 176, 178].

Природные липиды разного состава и строения характеризуются различной устойчивостью в процессе переработки и хранения кормов. На скорость окисления и гидролиза липидов влияют различные факторы. Гидролизу способствуют: высокая влажность, тепло, липолитические ферменты сырья и микроорганизмов. На окисление липидов действует солнечный свет, температура, наличие активаторов (ионы металлов) и ингибиторов (антиоксидан-ты) окисления, доступ кислорода и жирнокислотный состав липидов [3-8, 10, 17-24, 26, 27, 36-38, 47, 55, 56, 69, 73, 79, 82, 90-95, 101, 103, 105-110, 113, 114, 128, 129, 133, 134, 136-138, 142,143, 146, 153, 155, 157, 158, 161,175].

Продукты окисления и гидролиза липидов отрицательно влияют на сохранность таких важных составляющих кормов, как витамины, жирные кислоты, белки, аминокислоты. Особое значение эта проблема приобрела в последние годы ввиду широкого использования белково-витаминно-миперальных концентратов (БВМК) для производства комбикормов. Из-за высокого содержания липидов и катализаторов процессов окисления - ионов металлов переменной валентности в их составе, действие антиоксидаитов недостаточно эффективно.

Использование кормов с высоким содержанием продуктов окисления липидов, особенно альдегидов и оксикислот, приводит к существенному снижению продуктивности сельскохозяйственной (с.-х.) птицы, измеиению биохимических показателей крови и печени и вызывает ряд патологических состояний: токсическую дистрофию печени, гемолиз эритроцитов, гидроперикардит и др. [33, 54, 68, 95, 98, 100, 115, 118, 119, 156, 173, 176, 178]. Высокий уровень продуктов окисления и гидролиза липидов кормов приводит к существенному изменению биохимических показателей крови и печени цыплят-бройлеров, кур-несушек, вызывая достоверное снижение концентрации гемоглобина, общих липидов в крови, витаминов А, Е, С в крови, печени и желтке яиц, значительное изменение активностей ферментов антиоксидант-ной защиты (супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы), а также существенное увеличение концентрации холестерина и малонового диальдегида в крови и кислотного числа в желтке яиц.

Таким образом, актуальность данной работы, связанной с необходимостью комплексного подхода к оценке качества кормов по степени гидролиза и окисления липидов с использованием простых, легко воспроизводимых в ветеринарных лабораториях методик, очевидна.

Цель исследования

Разработать методики и нормативы комплексной оценки качества кормов для с.-х. птицы по уровню содержания первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов.

Задачи исследования

1. Модифицировать существующие методы определения продуктов окисления и гидролиза липидов применительно к изучаемым объектам;

2. Отработать оптимальные условия экстракции, для обеспечения максимального извлечения первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов из БВМК и комбикормов в экстракт;

3. Определить влияние первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов БВМК на сельскохозяйственную птицу для установления их максимально допустимых уровней (МДУ);

4. Исследовать динамику образования продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК при хранении;

5. На основании МДУ продуктов окисления и гидролиза липидов для с.-х. птиц, а также динамики образования данных продуктов в БВМК, определить максимальные сроки хранения данной продукции;

6. Разработать и метрологически аттестовать методики комплексной оценки качества липидов в составе комбикормов и БВМК для сельскохозяйственной птицы по уровню содержания первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза.

Научная новизна работы

Впервые изучена динамика накопления первичных (гидроперекисей и пероксидов), вторичных (оксикислот и альдегидов) продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для с.-х. птицы. Показано влияние комбикормов с различной степенью окисления и гидролиза липидов на продуктивность, физиологическое состояние и биохимические показатели цыплят-бройлеров и кур-несушек.

Практическая значимость работы

Усовершенствованы и метрологически аттестованы «РОСТЕСТ-Москва» методики определения перекисного (гидроперекисей и пероксидов) кислотного, альдегидного чисел и оксикислот, позволяющие проводить комплексную оценку качества БВМК и комбикормов для с.-х. птицы по уровню содержания в них не только первичных, по и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов. Установлены максимально допустимые уровни их содержания в БВМК и комбикормах, а также определены максимальные сроки хранения БВМК для цыплят-бройлеров и кур-несушек. Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии 27 января 2003г (№13-5-02/0657) «Методические указания по определению качества липидов кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза», включающие в себя методики количественного определения кислотного, перекисного и альдегидного чисел, а также содержание оксикислот, предназначенные для контроля качества БВМК и комбикормов в условиях научно-производственных лабораторий сельхозпредприятий и региональных лабораторий Россельхоз-надзора.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на: третьей международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 6-8 сентября 2000 г

- девятом Московском международном ветеринарном конгрессе. Москва, 2001 г.

- всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», Москва, 2001 г.

- четвертой региональной конференции «Золотое кольцо России», Владимир, 2001 г.

- десятом Московском международном ветеринарном конгрессе. Мрсква, 2002 г.

- международном форуме «Аналитика и Аналитики», Воронеж, 2003 г.

- конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» Москве, 2001 г, 2006 и 2007 гг.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Разработать и аттестовать методики определения продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для с.-х. птицы

2. Изучить влияние продуктов окисления и гидролиза липидов БВМК и комбикормов на с.-х. птицу, с целью установления их максимально допустимых уровней.

3. Научно обосновать максимальные сроки хранения БВМК и комбикормов для с.-х. птицы на основании изучения динамики накопления в них первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в различных из-даииях с изложением основных положений и выводов диссертационной работы, в том числе в ведущих научных журналах и изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 15 таблицами. Список литературы содержит 187 источников, в том числе 78 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Васильев, Александр Владимирович

6. Выводы

1. Разработаны условия экстракции первичных и вторичных продуктов окисления и гидролиза липидов из БВМК и комбикормов. Наиболее полное извлечение гидроперекисей и пероксидов достигается диэтиловым эфиром; альдегидов - петролейным эфиром; оксикислот - хлороформом и диэтиловым эфиром; жирных кислот - хлороформом.

2. Установлено, что максимальное накопление гидроперекисей в БВМК происходит через 3,5 - 4 месяцев хранения, пероксидов - через 5,5 - 6 месяцев. Более длительное хранение приводит к распаду перекисных соединений с образованием альдегидов и оксикислот, уровень которых постоянно повышается.

3. Использование комбикормов со сроком хранения 4 мес., содержанием альдегидов 45,0 мг КА/кг и оксикислот 3,5% вызывало снижение живой массы цыплят-бройлеров на 10%; со сроком хранения 5 мес., содержанием альдегидов 70,0 мг КА/кг и оксикислот 5,0% - к снижению яйценоскости кур-несушек на 10% . Более длительное хранение с более высоким содержанием вторичных продуктов окисления приводило к еще большей потери продуктивности.

4. Показано, что высокий уровень продуктов окисления и гидролиза липидов в комбикормах для сельскохозяйственной птицы приводит к существенному изменению биохимических показателей крови и печени цыплят-бройлеров и кур-несушек, снижению концентрации гемоглобина, общих липидов в крови, витаминов А, Е, С в крови, печени и желтке яиц, выраженному изменению активности ферментов аитиоксидаптиой защиты (супероксид-дисмутазы, пероксидазы и каталазы), увеличению концентрации холестерина и малонового диальдегида в крови и кислотного числа в желтке яиц.

5. Установлено, что продукты окисления липидов: первичные (гидроперекиси и пероксиды) и вторичные (альдегиды и оксикислоты) оказывают влияние на качество БВМК и комбикормов, что в свою очередь влияет на продуктивность и физиологическое состояние сельскохозяйственной птицы.

6. На основании полученных данных предложены максимально допустимые уровни (МДУ) содержания продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для цыплят-бройлеров и кур-несушек: для цыплят-бройлеров: кислотное число - 20мг КОН/г; перекис-ное число - 32,3 ммоль/кг У20 (включает гидроперекиси 23,6 ммоль/кг V2O и пероксиды 8,7 ммоль/кг V2O); альдегидное число - 45,0мг/кг; оксикислоты - 3,5%; для кур-несушек: кислотное число - 20мг КОН/г; перекисное число -32,3 ммоль/кг V2O (гидроперекиси 23,6 ммоль/кг У20 и пероксиды 8,7 ммоль/кг У2О); альдегидное число - 70,0мг/кг; оксикислоты- 5,0%.

7. Исходя из полученных данных по МДУ первичных и вторичных продуктов окисления липидов и динамики их накопления в БВМК, сроки хранения данной продукции для цыплят-бройлеров не должны превышать 4-х месяцев, для кур-несушек - 5-ти месяцев.

7. Практические предложения

1. Разработаны «Методические указания по определению качества липидов кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза», включающие в себя методики количественного определения кислотного, перекисного (гидроперекисей и пероксидов), альдегидного чисел и оксикислот, аттестованные «РОСТЕСТ-Москва» (свидетельство об аттестации МВИ №156-2002 от 14 июня 2002г), утвержденные Департаментом ветеринарии 27 января 2003г (№13-5-02/0657), которые предназначены для оперативного контроля за качеством комбикормов в условиях производственных лабораторий птицефабрик и комбикормовых заводов и контроля качества этой продукции в условиях региональных лабораторий Россельхознадзора.

2. Методика определения альдегидного числа включена в проект ГОСТ Р «Комбикорма, Методика определения альдегидов».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Александр Владимирович, Москва

1. Абрамова Ж.И. Человек и антиокислительные вещества. / Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Л.: Наука, 1985.- с. 230.

2. Балахновский С.Д. Методы химического анализа крови. / Балахнов-ский С.Д., Балахновский И.С. М.: Медгиз., 1953. - 746с.

3. Бах А.Н. Методы биохимических исследований. / Бах А.Н., Зубкова С.З. М.: Медгиз, 1956. - С. 392 - 393.

4. Бузлама B.C. Активные формы кислорода, антиоксиданты, адапто-гены. / Бузлама B.C. // Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С. 183-186.

5. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных. / Бузлама B.C., Рецкий М.И., Мещеряков Н.П., Рогачева Т.Е; Под ред. Бузлама

6. B.C. -Воронеж, 1997.- С. 27-29.

7. Бурлакова Е.Б. Биоаитиоксиданты и синтетические ингибиторы радикальных процессов: Успехи химии. / Бурлакова Е.Б. 1975. - Т. 14, №10.1. C. 1871-1886.

8. Бучаренко А.Л. Стабильные радикалы. / Бучареико А.Л., Вассерман A.M. М.: Химия, 1973. - С. 408.

9. Вальдман А.Р. Биологическая роль антиоксидантов. / Вальдман А.Р. Известия АН Латвийской ССР. - 1973. - №5. - С. 13-24.

10. Взаимодействие лекарственных препаратов с гидроперекисями и стабильность лекарственных форм / Тенцова А.И., Гольденберг В.И., Пилько Е.К., Пудель М.Е.; Под ред. А.И. Тенцова Хим. - фарм. ж. - 1978. - №1. - С. 128-132.

11. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление в биологических мембранах. / Владимиров Ю.А., Агарков А.И. М.: Наука, 1972. - 252 с.

12. Воскресенский О.Н. Фармакологические основы применения анти-оксидантов в животноводстве и ветеринарии. / Воскресенский О.Н. // Всесо-юзн. конф.Биоантиоксиданты. Тез. докл.-Черноголовка, 1986.- С. 132-169.

13. Глебов Р.И. Идентификация жиров животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Автореф. дис. канд. вет. наук: 03.00.04 / Р.И. Глебов; М., 1999. - 24с.

14. Глебов Р.И. Исследование состава молекулярных форм триацилг-лицеридов животных жиров. / Глебов Р.И., Родин В.И., Эллер К.И. // Мясная индустрия, 1998. - №7. - С.ЗЗ - 36

15. Гольденберг В.И. Способ стабилизации жиров и масел против окисления / Гольденберг В.И., Шмулович В.Г., Шапиро А.Б. // А.С. //691484 (СССР), 1979.

16. Гольденберг В.И. Антиоксиданты для кормовых продуктов. / Гольденберг В.И., Макарова О. Н. // Комбикорма. 2002. - №8. - С. 63 - 64.

17. Двинская JI.M. Биологическое действие и эффективность использования а-токоферола и синтетических антиоксидантов в кормлении кур: Дис. докт. биол. наук: 03.00.04 / JI.M. Двинская; ВНИФиБ с.-х. животных: Боровск, 1976.-49с.

18. Двинская JI.M. Биологическая эффективность стабилизированной травяной муки. / Двинская JI.M. // Птицеводство. 1973. - №11. - С. 13-14.

19. Двинская JI.M. Влияние стабилизированной травяной муки и добавки этоксиквина на продуктивность и А витаминную обеспеченность кур-несушек. / Двинская JI.M. // Научные труды ВНИФиБ с.-х. жив. - Боровск, 1969. - Т.6. - С. 362-367.

20. Двинская JI.M. Использование антиоксидантов в животноводстве. / Двинская JI.M., Шубин А.А. JI.: Агропромиздат, 1986. - 160с.

21. Двинская JI.M. Стабилизация каротина в травяной муке и ее влияние на витаминную обеспеченность сельскохозяйственной птицы. / Двинская JI.M. // Витаминное питание с.-х. жив. М.: Колос, 1973. - С. 299-305.

22. Двинская JI.M. Стабилизация каротина в травяной муке и повышение А витаминной обеспеченности птиц. / Двинская JI.M. // Научные труды ВНИИФиБ с.-х. жив. - Боровск, 1965.-Т.2.-С. 156-164.

23. Двинская JI.M. Определение переокисления липидов ткани с помощью теста 2-тиобарбитуровой кислотой: Изучение липидного обмена у сельскохозяйственных животных (Методические указания). / Двинская JI.M., Никифорова Л.И. Боровск, 1980. - С. 37 - 40.

24. Дегтярев И.А. Ионол: распределение в организме, метаболизм и биологическое действие. 1. Распределение в организме и метаболизм / Дегтярев И.А., Заиков Г.Е. // Хим. фарм. журнал. 1985. - Т.19, №8. - С.910-919.

25. Дегтярев И.А. Ионол: распределение в организме, метаболизм и биологическое действие. 2. Биологическое действие ионола / Дегтярев И.А., Заиков Г.Е. // Хим. фарм. журнал. 1985. - №10. - С. 1160-1168.

26. Дмитровский А.А. Экспериментальная витаминология. / Дмитровский А.А. Минск: Наука и техника, 1979.- С. 131-172.

27. Дрошев А.Е. Изучение липоперекисного окисления и антиоксидантиой защиты организма карпа при стрессе. / Дрошев А.Е., Борисова М.Н. // Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.28-31.

28. Дубинина Е.Е. Активность и изоферментный спектр супуроксид-дисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека / Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А. // Лаб. дело. 1983. - №10. - С. 30-32.

29. Дьякова С.П. Взаимосвязь перекисного окисления липидов с некоторыми гематологическими и биохимическими показателями крови ярок разных пород. / Дьякова С.П. // Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.31-35.

30. Жаркой Б.Л. Взаимосвязь интенсивности процессов свободноради-кального окисления и показателей иммунного статуса у телят. / Жаркой Б.Л. // Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.36-39.

31. Жаркой Б.Л. Влияние активных форм кислорода на функциональную активность компонентов иммунной системы. / Жаркой Б.Л., Рецкий М.И. // Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.40-44.

32. Журавлев А.И. Биоантиокислители в животном организме. / Журавлев А.И. Биоантиокислители. - 1975. - Т.52. С. 15-29.

33. Журавлев А.И. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. / Журавлев А.И. М.: Наука, 1982.- С. 3-36.

34. Журавлев А.И. Роль перекисей и кислорода в начальных стадиях радиобиологического эффекта. / Журавлев А.И. М.: Издательство АН СССР, 1960.-155с.

35. Журавлев А.И. Свободнорадикальная биология. / Журавлев А.И., Пантюшенко В.Т. М., 1989. - 59с.

36. Захарова Н.А. Антиокислительные свойства синтетических и природных стабилизаторов: Автореф. дис. канд. хим. наук: 03.00.04 / Н.А. Захарова; МГУ им. М.В. Ломоносова М., 1972. - 21с.

37. Иванов И.И. Хемилюминисценция в реакциях перекисного окисления липидов. / Иванов И.И., Галкина С.И., Мерзляк М.Н., Кауров Ю.Н. // Биоантиокислители. / Труды МОИП. 1975. - Т. 52. - С. 241-246.

38. Ильина Н.А. Естественный ингибирующий фактор и его связь с иммунологической резистентностью, процессами ПОЛ и АОЗ. / Ильина Н.А., Масьянов Ю.Н., Пасько Н.В. // Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.52-55.

39. Исаева Т.И. Особенности кормления норок в приморском крае / Исаева Т.И., Беловодский В.Л. Владивосток, 1974. - 42 с.

40. Калитка В.В. Антиоксидапти в пшвл! птищ. Метод, рекомендацп. / Калитка В.В., Адршчук П.Е. Льв1в, 1993. - 37с.

41. Калитка В.В. Влияние комплекса ионола и диметилсульфоксида на витаминную обеспеченность и продуктивность цыплят-бройлеров. / Калитка В.В., Лысенко В.И. // Тез. Всесоюзн. конф. Боровск, 1991.

42. Калитка В.В. Способ кормления цыплят-бройлеров. / Калитка В.В., Лысенко В.И., Шкопинский Е.А. // А.С. //1722391. Бюл. №12.

43. Калмыкова В.И. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. / Калмыкова В.И. М.: Наука, 1982.- С.181-194.

44. Кисилевич Р.Ш. Об определении витамина Е в крови. / Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И. // Лаб. дело. 1972. - №8. - С. 473 - 475.

45. Кнорре Д.Г. Кинетика окисления жиров. / Кнорре Д.Г., Лясковская Ю.Н., Эмануэль Н.М. Изв. АН СССР, сер. хим. - 1967 - № 12. - С. 120-123.

46. Кондрахин И.П. Клиническая и лабораторная диагностика в ветеринарии. / Кондрахин И.П, Курилов Н.В, Малахов А.Г. М: Агропромиздат, 1985.- С. 65.

47. Коробейникова Э.Н. Модификация определения перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. / Коробейникова Э.Н.- Лаб. дело. 1989.- № 7. - С. 8-10.

48. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Лаб. дело.- 1988.- №1.- С. 16-19.

49. Кругликов Г.О. Глутатионпероксидазная и глутатионредуктазпая активность печени крыс после введения селенита натрия. / Кругликов Г.О., Штутман И.М. Укр. биохим. журнал. - 1976. - №2. - С. 223 - 227.

50. Антонов Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии / Под ред. Антонов Б.И. М.: Агропромиздат, 1991.-287 с.

51. Лазаревский А.А. Технологический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. / Лазаревский А.А. М.: Пищевая промышленность. 1967.-С. 95 -99.

52. Ларичева Е.А. Кинетика окислительных реакций и состава липидов тканей кур разного возраста как критерий подбора антиоксидантов для профилактики синдрома «жирная печень» Ларичева Е.А. / Дисс. канд. биол. наук. Боровск, 1983. - 21с.

53. Левин П.И. Механизм действия антиоксидантов и синергизм их композиций. / Левин П.И., Михайлов В.В. Усп. химии. - 1966. - Т.39. - №9. -С. 1687-1706.

54. Левитан А.И Остроумова И.Н., Шабалина А.А. Временная инструкция по определению степени окисления липидов в кормах и оценке влияния качества кормов на рыб / Левитан А.И., Картавцева Н.Е., Абрамова Ж.И. -Л.: Промрыбвод, 1987.

55. Липецкая И.Л. Возрастная динамика некоторых показателей пере-кисного окисления липидов и антиоксидантов у цыплят. / И.Л.Линецкая -Депонирование в ВИНИТИ 21.01.92. №206 - В92. - 7с.

56. Липецкая И.Л. Некоторые показатели перекисного окисления липидов в крови цыплят в возрастном аспекте / И.Л.Линецкая XI Всесоюзная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов: Тезисы докладов. - Оренбург, 1992.- С. 67.

57. Линецкая И.Л. Сравнительный анализ активности супероксиддис-мутазы и каталазы крови цыплят в возрастном аспекте. / И.Л.Линецкая Депонирование в ВИНИТИ 21.01.92. - №205 - В92. - 6с.

58. Линецкая И.Л. Уровень перекисного окисления липидов и некоторых антиоксидантов у цыплят бройлеров в возрастном аспекте / И.Л.Линецкая - Дисс. канд. биол. наук - С. - Петербург, 1993. - 15с.

59. Любавииа Л.А. Объективный метод определения степени окисления жира соленой сельди // Рыбное хозяйство. 1964. - №5. - С. 20 - 21.

60. Мальдзин А.Р. Динамика свободнорадикалыюго окисления липидов в крови стельных коров / Мальдзин А.Р. Дисс. канд. биол. наук. - М., 1990.

61. Мартынова А.В. Влияние голодания на пероксидное окисление липидов и систему антиоксидантной защиты. / Мартынова А.В., Павлова Е.А., Ермакова Т.И. Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.99-102.

62. Мерков А.И. Санитарная статистика. / Мерков А.И., Поляков JI.E-Л., 1974.

63. Мещеряков Н.П. Ферменты антиоксидантной защиты свиней при стрессе и его регуляции адаптогенами. / Мещеряков Н.П. Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С. 102-106.

64. Окисление высоконенасыщенных жиров в присутствии ингибиторов. Известия ВУЗов, Пищевая технология, 1974, №3, с 45 50.

65. Определение гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом: Инструкция главного управления Министерства здравоохранения СССР. -М.: Минздрав СССР, 1980. 4с.

66. Орлов Л.В. К методике определения общих липидов в сыворотке крови и тканях животных. / Орлов Л.В. Изучение липидного обмена у сельскохозяйственных животных (Методические указания). - Боровск, 1980. - С. 34-36.

67. Петрухин И.В. Корма и кормовые добавки. / Петрухин И.В. М.: Росагропромиздат, 1989.-526с.

68. Пилько Е.К. Стабилизация лекарственных форм на жировых основах / Пилько Е.К. Дисс. канд. фарм. наук. - М., 1978. - 134с.

69. Плешков Б.П. Определение активности пероксидазы. / Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - М, 1976.-С. 213-215.

70. Влияние витамина Е на некоторые продуктивные и репродуктивные показатели кур. / Ралчева С., Средкова В., Александров А., и др. Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.130-134.

71. Родин В.И. Изучение жирно-кислотного состава жировых пищевых продуктов. / Родин В.И., Глебов Р.И. Тез. докл. Актуальные проблемы вет. сан. контроля сельскохозяйственной продукции. 2-я международная науч. практ. конф. М.: МГУПБ, 1997. - С.36.

72. Родин В.И. Некоторые вопросы безопасности мясных и молочных продуктов. / Родин В.И., Глебов Р.И., Торская М.С. Тез. докл. Теор. и практ. основы расчета термической обработки пищевых продуктов. М.: МГУПБ, 1997.-С. 184.

73. Рождественский К.В. Кормление сельскохозяйственных птиц. / Рождественский К.В., Шафров В.М. М.: Колос, 1980. - 303с.

74. Сандалова J1.K. Исследование стабильности липофильных мазевых основ / Сандалова J1.K. Дисс. канд. фарм. наук. - М., 1978. - 150с.

75. Сахаева Е.А. Пути повышения качества рыбной продукции / Сахае-ва Е.А., Судоина Н.М. М.: ГУНИМТЭИРХ, 1983. - Вып.З. - С.ЗО.

76. Семенов B.JL Метод определения антиокислителыюй активности материала. / Семенов В.Л., Ярош A.M. Укр. биохим. журнал. - 1985. - Т.57, №3.-С 50-52.

77. Семенов Н.Н. Цепные реакции. / Семенов В.Л. Л.: Госхимтехиз-дат, 1934.-555с.

78. Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности в промышленном птицеводстве / Метод, указ. 1989.- С.63-64.

79. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии. / Под ред. В.Н Ореховича. М., 1977. - С. 63 - 64.

80. Спиричев В.Б., Газдаров А.К. Биоантиокислители и регуляция окислительных процессов в клетке / Спиричев В.Б., Газдаров А.К. М., 1972. -С.132-169.

81. Способ стабилизации жиров и масел против окисления / Шмулович В.Г., Дмитричук Н.А., Гольденберг В.И., и др. А.С. //606879 (СССР), 1978.

82. Сравнительное изучение кинетики окисления липидов и моделирующих их эфиров высших ненасыщенных кислот. // Тез. докл. III Всесоюзной конференции по жидкофазному окислению органических соединений. -Минск, 1975.-С. 70-71.

83. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот. / Стальная И.Д. Современные методы в биохимии. - М., 1977. - С. 63 - 64.

84. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малоиового ди-альдегида с помощью 2-тиобарбитуровой кислоты. / Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Современные методы в биохимии. - М., 1977. - С. 66 - 68.

85. Эммануэль Н.М. Успехи химии перекисных соединений и ауто-окислений под редакцией Эмануэля Н.М. М., 1969.

86. Хамидуллин Т.Н. Эффективность использования антиоксидантов в кормлении кур-несушек. / Хамидуллин Т.Н., Ахметзанова Ф.М., Мучина P.P. Сб. науч. тр. Татарской НИИСХ. - 1987. - Вып. 15. - С. 92-95.

87. Хомутов В.И. Хранение пищевых продуктов / Хомутов В.И., Лова-чевЛ.М. М.: Экономика, 1972.

88. Храпова Н.Г. Хемилюминесцентное исследование природных антиоксидантов липидов и синтетических ингибиторов / Храпова Н.Г. Дисс. канд. хим. наук. - М., 1971. - 121 с.

89. Царенко Т.П. Повышение качества продукции птицеводства. Питание и инкубационные яйца / Царенко Т.П. Л.: Агропромиздат, 1988. - 240с.

90. Чумаков В.Н. Количественный метод определения активности цинк, медьсодержащей супероксиддисмутазы в биологическом материале. / Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф. Вопр. мед. химии. - 1977. - №5. - С. 712 -716.

91. Чумаков В.Н. Активность цинк, медьсодержащей супероксиддисмутазы в тканях крыс в норме и при гипоксии. / Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф.- Вопр. мед. химии. 1979. - №3. - С. 261 - 266.

92. Шакирова Г.И. Влияние травяной муки, стабилизированной различными антиоксидантами, на продуктивность кур-несушек. / Шакирова Г.И.- Кормление и разведение с.-х. жив. 1985. - С. 132-134.

93. Шапиро Д.К. Практикум по биохимии / Шапиро Д.К. М.: Высшая школа, 1967. -236с.

94. Шахов А.Г. Роль процессов свободнорадикального окисления в парогенезе инфекционных заболеваний. / Шахов А.Г. Материалы междун. научно-практической конференции. Воронеж., 2004.-С.З-9.

95. Шевченко А.И. Влияние антиоксидантов на сохранение, использование питательных веществ корма и продуктивные качества яичных кур / Шевченко А.И. Дисс. канд. сельхоз. наук - Загорск, 1976. - 23с.

96. Шилина Н.К. Количественное определения продуктов перекисного окисления липидов сыворотки крови практически здоровых лиц методом УФ- спектроскопии / Шилина Н.К., Чернавина Г.В., Маслова Л.А. Лаб. дело. - 1978. - №3. - С. 140 - 142.

97. Экспериментальная витаминология. // Справочное руководство. -Минск, 1979.

98. Эмануэль Н.М. Критические явления в цепных вырожденно -разветвленных реакциях. / Эмануэль Н.М., Гагарина А.Б. Усп. химии. -1970. - Т.39, №9. - С. 1687-1706.

99. Эмануэль Н.М. Современные представления о механизме действия ингибиторов окисления, / Эмануэль Н.М., Денисов Е.Т. Нефтехимия. -1976.-Т.16,№3.-С. 366-383.

100. Эмануэль Н.М. Торможение процессов окисления жиров / Эмануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. М.: Пищепромтздат, 1961.- 359 с.

101. Яничек Г. Окислительные изменения в пищевых продуктах при их хранении и переработке (Обзор) / Яничек Г. Покорны Я. Кондратенко С.С. М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1976. - 56с.

102. Ясюнас В. Влияние некоторых антиоксидантов в комбикормах на рост и жизнеспособность мясных цыплят./ Ясюнас В. Сб. науч. тр. Прибалт, зон. опытной станции по птицеводству. - 1987. - №11. С. 58-64.

103. Allen R.G., Venkatraj V.S. Oxidants and antioxidants in development and differentiation. / Allen R.G., Venkatraj V.S. J. Nutrition. - 1992. - 122. P. 631-635.

104. Azzi A. Stocker A. Vitamin E: Non-antioxidant roles. Progress in Natural Antioxidants in Avian Nutrition and Reproduction. / Azzi A. Stocker A. Vitamin E Lipid Research. - 2000. - 39. - P. 231 -255.

105. Bains J.S. Neurodegenerative disorders in human: the role of glutathione in oxidative stress-mediated neuronal death. / Bains J.S., Shaw C.A. -Brain Research Reviews. 1997. - 25. - P. 335-358.

106. Bohm R. Carotenoids enhance vitamin E antioxidant efficiency. / Bohm R, Edge R, Land E.J. J. Chem. Soc. - 1997. - 119. - P. 621- 622.

107. Boland J.L. The inhibitory effect of hydroguinon on the thermal oxidation of ethyl linoleate. / Boland J.L., Have P. Trans. Faraday Soc. - 1947. -Vol. 43.-P. 201-210.

108. Bowie A. Oxidative stress and nuclear factor-kappaB activation: a reassessment of the evidence in the light of recent discoveries. / Bowie A. O'Neill L.A. Biochemical Pharmacology. - 2000. - 59. - P. 13-23.

109. Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. / Brigelius-Flohe R. Free Radical Biol. Med. - 1999. -27. -P. 951965.

110. Cardozo-Pelaez F. DNA damage, repair, and antioxidant systems in brain regions: a correlative study. / Cardozo-Pelaez F., Brooks P.J., Stedeford T. -Free Radical Biol. Med. 2000. - 28. - P. 779-785.

111. Carr A. Does vitamin С act as a pro-oxidant under physiological conditions? / Carr A., Frei B. FASEB J. - 1999. - 13. - P. 1007-1024.

112. Cereser C. Thiram-induced cytotoxicity is accompanied by a rapid and drastic oxidation of reduced glutathione with consecutive lipid peroxidation and cell death. / Cereser C., Boget S., Parvaz P. Toxicology. - 2001. 163. - P. 153-162.

113. Chan A.C. Partners in defence, vitamin E and vitamin C. Canadian J. Physiol. Pharmacol. / Chan A.C. 1993/ - 71. - P. 725-731.

114. Chan A.C Regeneration of vitamin E in human platelets. J. Biological Chem. /Chan A.C., Tran K., Raynor T. 1991.-266.-P. 17290-17295.

115. Chow C.K. Vitamin E regulates mitochondrial hydrogen peroxide generation. / Chow C.K., Ibrahim W., Wei Z. Free Radical Biol, and Med. -1999.-27.-P. 580-587.

116. Cort W.M. Antioxidant activity of tocopherols, ascorbyl palmitate and ascorbic acid and their mode of action. / Cort W.M. J. Am. Oil Chem. Soc. -1974.-51(7).-P. 321 -325.

117. Croteau D.L. Repair of oxidative damage to nuclear and mitochondrial DNA in mammalian cells. / Croteau D.L., Bohr V.A. J. Biol. Chem. -1997.-272. -P 25409-25412.

118. Dean R.T. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. / Dean R.T., Fu, S., Stacker, R. Biochemical J. - 324. - P. 1-18.

119. Decuypere E. The day-old chick: a crucial hinge between breeders and broilers. / Decuypere E., Топа K., Bruggeman V. World's Poultry Sci. J. -2001.-57.- 127-138.

120. Diplock A.T. Antioxidants and disease prevention / Diplock A.T. In: Molecular Aspects of Medicine. - V. 15, Edited by Baum, H. Pergamon Press, Oxford and New York. - P. 295-376.

121. Dougherty M.E. Tocopherols as food antioxidants. / Dougherty M.E. -Cereal Foods World. 1988. - 33(2). - P. 222 - 223.

122. Dzanis D.A. Safety of etoxyquin in dog foods. / Dzanis D.A. J. Nutr. -1991.-121.-P. 163- 164.

123. Elliott S.J. Redox control of ion channel activity in vascular endothelial cells by glutathione. / Elliott S.J., Koliwad S.K. Microcirculation. - 1997.-4. -P. 341-437.

124. Engberg R.M. Inclusion of oxidized vegetable oil in broiler diets. Its influence on nutrient balance and on the antioxidative status of broilers. / Engberg R.M., Lauridsen C., Jensen, S.K. Poultry Science. - 1996. - 75. - P. 1003-1011.

125. Fernie K.J. Evidence of oxidative stress in American kestrels exposed to electromagnetic fields. / Fernie K.J., Bird, D.M. Environmental Research. -2001.-86.-P. 198-207.

126. Frei B. Molecular and biological mechanisms of antioxidant action. / Frei B. FASEB J. - 1999. - 13. - P. 963-964.

127. Freisleben H.J. Free radical scavenging activities, interactions and recycling of antioxidants. / Freisleben H.J. Packer, L. Biochemical Soc. Transactions. - 1993.-21.-P. 325-330.

128. Friguet B. Protein degradation by the proteasome and its implications in aging. / Friguet В., Bulteau A.L., Chondrogianni N. Ann. of the N.Y. Acad. Sci.-2000.-908.-P. 143-154.

129. Furst P. The role of antioxidants in nutritional support. / Furst P. -Proceed. Nutr. Soc. 1997. - 55.-P. 945-961.

130. Galey J-B. Potential use of iron chelators against oxidative damage / Galey J-B. In: Antioxidants in Disease Mechanisms and Therapy. - San Diego: Academic Press. - 1997. - P. 167-203.

131. Gross K.L. Effect of Three Different Preservative Systems on the Stability of Extruded Dog Food Subjected to Ambient and High Temperature Storage. / Gross K.L., Bollinger R., Thawnghmung P. Am. Inst. Nutr. - 1994. - P. 2638 -2642.

132. Grune T. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. / Grune Т., Reinheckel Т., Davies, K.J. FASEB J. - 1997. - 11. - P. 526-534.

133. Gutteridge J.M. The measurement and metabolism of lipid peroxidation in biological systems / Gutteridge J.M., Halliwell, B. Trends in Biochem. Sci. - 1990. - P. 129-135.

134. Halliwell B. Oxidants and human disease: some new concepts. / Halliwell B. FASEB J. - 1987. - 1. - P. 358-364.

135. Halliwell B. Free radicals and antioxidants: A personal view. / Halliwell B. Nutr. Rev. - 1994. - 52. - 253-265.

136. Halliwell B. Vitamin C: antioxidant or pro-oxidant in vivo? / Halliwell B. Free Radical Res. - 1996. - 25. - P. 439-454.

137. Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). / Halliwell B. Free Radical Res. - 1999. - 31. - P. 261-272.

138. Halliwell B. Vitamin C: poison, prophylactic or panacea? / Halliwell B. Trends in Biochem. Sci. - 1999. - 24. - P. 255-259.

139. Halliwell B. Free Radicals in Biology and Medicine / Halliwell В., Gutteridge J.M. Oxford: Third Edition. Oxford University Press. - 1999. - P. 57 -61

140. Hilton J.W. Antioxidants: function, types and necessity of inclusion in pet foods. / Hilton J.W. Can. Vet. J. - 1989. - 30. - P. 682 - 684.

141. Hogg, N. Free radicals in disease. / Hogg, N. Seminars in Reproductive Endocrinology. - 1998. - 16. - P. 241-248.

142. Holovska K. Antioxidant and detoxifying enzymes in the liver and kidney of pheasants after intoxication by herbicides MCPA and ANITEN I. / Holovska K., Lenartova V., Rosival I. et al. J. Biochem. Mol. Toxicol. - 1998. -12.-P. 235-244.

143. Jaeschke H. Mechanisms of oxidant stress-induced acute tissue injury. / Jaeschke H. Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. - 1995. - 209. - P. 104-111.

144. Kappus H. Lipid peroxidation: mechanism and biological relevance / Kappus H. In: Free Radicals and Food Additives (Aruoma O.I. & Halliwell B. eds.), 1991, P. 59-75.

145. Kettle A.J. Myeloperoxidase: a key regulator of neutrophil oxidant production. / Kettle A.J., Winterbourn, C.C. Redox Report. - 1997. - 3. - P. 315.

146. Khattad A.N. Stability of peroxidised oils and fat to high temperature heating. / Khattad A.N., El Tinay A.H., Khalifa H.A. J. Sei. Food and Agr. -1974.-V. 25, №6.-P. 405-412.

147. Klandorf H. Accelerated tissue aging and increased oxidative stress in broiler chickens fed allopurinol. / Klandorf H., Rathore D.S., Iqbal M. Сотр. Biochem. and Phys. C. Toxicol, and Pharmacol. -2001. - 129. - P. 93-104.

148. Loliger J. The use of antioxidants in foods. / Loliger J. In: Free Radicals and Food Additives (Aruoma O.I. & Halliwell B. eds.), 1991. - P. 121 -150.

149. Mays F.R. The Oxidation of Unsaturated Compounds. IX. The Effects of Structure on the Rates and Products of Oxidation of Unsaturated Compounds. / Mays F.R., Muller A.A., Russel G.A. J. Amer. Chem. Soc. - 1958. - Vol. 80. - P. 2500-2507.

150. Meister A. On the antioxidant effects of ascorbic acid and glutathione. / Meister A. Biochem. Pharmacol. - 1992. - 44. - P. 1905-1915.

151. Meister A., Anderson M.E. Glutathione. / Meister A., Anderson M.E. Ann. Rev. Biochem. - 1983. - 52. - P. 711-760.

152. Motoyama T. Synergistic inhibition of oxidation in dispersed phosphatidylcholine liposomes by a combination of vitamin E and cysteine. / Motoyama Т., Miki M., Mino M. Arch. Biochem. and Bioph. - 1989. - 270. - P. 655661.

153. Niki E. a -Tocopherol, In: Handbook of antioxidants, edited by Cade-nas E. and Packer L, Marcel Dekker, New York- London. 1996. - P. 3-25.

154. Niki E. Regeneration of vitamin E from alpha-chromanoxyl radical by glutathione and vitamin C. / Niki E., Tsuchya J., Tanimura R. et al. Chemistry Letters.- 1982.-P. 789-792.

155. Official Methods and Recommended of the American Oil Chemists Society. Champaighn, 92, 1980.

156. Official Methods and Recommended of the American Oil Chemists Society, 5th Ed., Champaighn, IL 1992.

157. Packer L. Nutrition and biochemistry of the lipophilic antioxidants vitamin E and carotenoids. / Packer L. In: Nutrition, Lipids, Health, and Disease. Edited by Ong, A.S.H., Niki, E. and Packer, L., AOCS Press, Illinois. - 1995. - P. 8-35.

158. Palamanda J.R. Involvement of vitamin E and protein thiols in the inhibition of microsomal lipid peroxidation by glutathione. / Palamanda J.R., Kehrer J.P. Lipids. - 1993. - 278. - P. 427-431.

159. Palozza P. p-Carotene and a-tocopherol are synergistic antioxidants. / Palozza P., Krinsky N.I. Arch. Biochem. and Bioph. - 1992. - 297. - 184-187.

160. Pappas A.M. Antioxidants Which ones are best for your petfood products? / Pappas A.M. - Petfood Industry. - 1991. - 33(3). - P. 6 - 16.

161. Pearson D. The Chemical analysis of Food., Chemical Publishing, New York, 1971.

162. Rice-Evans C.A. Why do we expect carotenoids to be antioxidants in vivo? / Rice-Evans C.A., Samson J., Bramley P.M. et al. Free Radical Research. -1997.-26.-P. 381-398.

163. Russel G.A. Nature of the Polar Effect in Reactions of Atoms end Radicals. II Reactions of Chlorine Atoms and Peroxy Radicals. / Russel G.A., Williamson R.C. J. Amer. Chem. Soc. - 1964. - Vol. 86. - P. 2357 - 2367.

164. Salyi G. Changes in the lipid peroxide status of broiler chickens in acute monensin poisoning. / Salyi G., Mezas M., Babhidi, G. Acta Veterinaria Hungarica. - 1990. - 38. - P. 263-270.

165. Setser C.S. Sensory evaluation. In: Advances in Baking Technology (Kamel B.S. & Stauffer C.E. eds), VCH Publishers, New York, 1992. P 254 -291.

166. Scott G. Atmospheric oxidation and antioxidants / Scott G. Amsterdam - London - New-York: Elswier Publ., Co, 1965. - 528p.

167. Singal P.K. The role of oxidative stress in the genesis of heart disease. / Singal P.K., Khaper N., Palace, V. Cardiovascular Research. - 1998. - 40. - P. 426-432.

168. Surai P.P. Vitamin E in avian reproduction. / Surai P.P. Poultry and Avian Biol. Rev. - 1999. - 10. - P. 1-60.

169. Surai PF. Tissue-specific differences in antioxidant distribution and susceptibility to lipid peroxidation during development of the chick embryo. / Surai PF., Noble R.C., Speake, B.K. Biochim. Bioph. Acta. - 1996. - 1304. - P. 1-10.

170. Surai P.F. Effect of vitamin A on antioxidant system of the chick during early postnatal development. / Surai P.F., Kuklenko Т., Lonov I. British Poultry Sci. -2000. -41. - P. 454-458.

171. Surai P.F. Carotenoids in avian nutrition and embryonic development. 2. Antioxidant properties and discrimination in embryonic tissues. / Surai P.F., Speake, B.K., Sparks, N.H. J. Poultry Sci. -2001. - 38. - 117-145.

172. Tirosh O. Chemical bases and biological relevance of protein oxidation / Tirosh O., Reznick A.Z. In: Handbook of Oxidants and Antioxidants in Exercise, edited by Sen, C.K, Packer,L. and Hanninen,O.O.P., Elsevier, Amsterdam, 2000. - P. 89-114.

173. Vassilev R.F. On the Mechanism of Chemiluminescence in Oxidation of Organic Substances and Polymers. / Vassilev R.F. Makromol. Chem. - 1969. -V. 126.-P. 231 -238.

174. Wallace S.S. Oxidative damage to DNA and its repair / Wallace S.S. -In: Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defences, Edited by Scandalios, J.D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Harbor, New York, 1997. P. 49-89.

175. Warner K. Methods to Assess Quality and Stability of Oils and Fat-Containing Foods / Warner K., Eskin N.A.M. Editjrs. - 1994.

176. Winkler B.S. The redox couple between glutathione and ascorbic acid: a chemical and physiological perspective. / Winkler B.S., Orselli S.M., Rex T.S. Free Radical Biol, and Med. - 1994. - 17. - P. 333-349.

177. Yu B.P. Cellular defences against damage from reactive oxygen species. / Yu B.P. Physiol. Rev. - 1994. - 74. - P. 139-162.