Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Колебательные изменения жизнеспособности и анализ механизмов старения популяции Drosophila melanogaster в ряду поколений в норме и после радиационного облучения

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Колебательные изменения жизнеспособности и анализ механизмов старения популяции Drosophila melanogaster в ряду поколений в норме и после радиационного облучения"

m £S3

-'*'- НАУК

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОИ ЙИЗИКИ ИМ. H.K.СЕМЕНОВА

На правах рукописи

Измайлов ДшггэпС Михайлович

КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ К АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ СТАРЕНИЯ популяши drosophila melakogaster В РЯДУ ПОКОЛЕНИИ В КОРМЕ К ПОСЛЕ РАДИАЦИОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертасии на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

- I9S3

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук В.К.Кольтовер

Кандидат биологических наук А.В.Рубенович

Ведущая организация: Кафедра биологическое физики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. Ломоносова

на заседании Специализированного совета Д. 002.26.07 при институте химической физики РАН.

Адрес: I17977, Москва, В-334, ГСП-1, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте химической физики РАК.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

М.А.Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной кэ зажнейших проблем современной биологической физики сложных систем являете?; изучение к моделирование колебательных процессов в живой материи. Основная сумма знаний в этой области была получена в исследованиях на молекулярном (реакция Белоусоза-Хаботинского, автоколебания при гликолизе), структурном (нелинейная динамика мембран), органном (автоволновые процессы в сердечной мысе), организмекном (циркадные ритмы) уровне (Рубин и др., ISS7). Подобные язлекия были подробно изучены з большом цикле работ, выполненных акад. Н.М. Эмануэлем и его сотрудниками в течении более 20 лет (Бурлакоза и др., 1975; Долягин, 1969; Коваленко и др., 1971; Лкпсиц и др., 1971), к были основаны на высказанном Н.М.Эмануэлем положении о перспективности использования представлений и методоз химической кинетики для- изучения закономерностей развития нестационарных биологических процессов. К.М.Эмануэль также указывал на то, что химическая кинетика и методы вычислительной техники позволяют полтчить дополнительные сведения о физико-химичских процессах в сложных биологических системах (Эмануэль, 1965).

Значительно меньше известно что-либо с кинетике интегральных характеристик на уровне экспериментальной группы. Предполагалось, что несогласованные зо времени, разнонаправленные колебания жизнеспособности у отдельных особей должны давать результирупцус постоянной величины при сценке интегральных гпупповых характеристик. Однако, коезенные данные, получаемые из исследований по радиационной биофизике, геронтологии, а также из популяционных экспериментов заставили нас усомниться з универсальности тага:х предположений. Актуальность проблемы заключается, кроме того, з том, что непостоянство во времени величин интегральных признаков в контрольных группах может явиться причиной неверных или неточных оценок при экологическом, демографическом прогнозировании и санитарно-гигиеническом нормировании.

С особой остротой з последние годы встал вопрос о прогнозировании риска от действия радиаци». г.о различным

показателям жизнеспособности. В современно': ргзггппсннсй биофизике проблема отдаленнее - в ряду нескольких поколений -эффектов ионизирующей радиант: является недостаточно изученной. Получение определенных количественных оценок на модельных системах позволит конкретизировать прогнозы риска и искать адекватные пути зашиты от действия радиации. Кроме того, настоящее исследование развивает некоторые подходы к выявление механизмов долговременой биологическое памяти после физического воздействия.

Изучение кинетики сложных биологических систем невозможно без математического моделирования и статистического анализа данных с применением современной вычислительной техники. В работе ¡игроке применялись методы математической статистик!'., теории подобия. Для обработки данных на персональных компьютерах типа Apple и ibm были разработаны оригинальные программы статистического к графического сравнения кривых выживания.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель исследования заключалась в экспериментальном изучении кинетики показателей жизнеспособности D.meianoga=ter В РЯДУ ПОКОЛеЗ^ ПОТОМКОВ интактных и однократно облученных родительских особей по критериям приспособленности на уровне экспериментальной группы (значения средней продолжительности жизни) с одновременным анализом распределен!® по этому признаку (изучение кинетики старения анализом кривых выживания).

Конкретные задачи исследования включал:::

1. Изучить кинетику показателей жизнеспособности продолжительности жизни и плодовитости - в ряду поколений интактных особей, установить колебательный характер кинетики жизне способности.

2. Разработать статистическую, свободную от параметров методику наглядного (графического) и адекватного сравнения распределений по продолжительности жизни (НЕ), значительне различающихся по средним значения!.!. Прове ста математическое моделирование распределения по ПЕ с целью выявления инвариантно! состазляшей колебательных изменений в ряду поколений.

3. Подобрать условия проведения эксперимента (

пострадиационными леиямп, состоять кз потомкоз облученных особей. Выбрать соответствуйте моеносте, дозы к режим радиационного воздействия, схему скрещивания после облучения.

4. Получить количественные опенки кинетики жизнеспособности в пострадиационных поколениях, а также провести сравнительный анализ кинетики старения контрольной н пострадиационной линий.

5. Разработать методические подходы к анализу долговременной биологической памяти после облучения путем подбора схем облучения и последующего скрешэаккя контрольных и экспериментальных линий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА К ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Установлено, что кинетика интегральных показателей жизнеспособности б. шеХапоказгег в ряду поколений контрольной линии имеет отчетливо выраженный нерегулярный характер: зависимость абсолютной величины средней ПХ (СИЕ) и ранней плодовитости от номера генерации имеет ввд апериодических колебаний. Колебательные изменения, оцененные по критерию Крускала-Уоллиса, является высоко достоверными. Доказано, что колебания жизнеспособности имеет неслучайное происхождение к ке могут быть отнесены к артефактам лабораторного культизирозания.

Методами математического моделирования и математической статистики доказана масктабная Iинвариантность распределений по в ряду поколений.

Доказано, что при однократном радиационном воздейстзиг наблюдается изменение ритма колебаний жизнеспособности, характерного для контрольной лнкзз:: равновероятно могут регистрироваться как "стинулгрушие", так и "отрицательные" эффекты Радиационное воздействие в целом "сдвигает", изменяет временную (по поколениям) развертку колебаний ЕЕ.

Долговременная биологическая память о физическом (радиационном) воздействии способна длительно сохраняться в ряду поколений потомков облученных особей. Регднзгзк этой информации сопровождается расслоением экспериментальной группы по исследуемым признакам. Биохимическим субстратом долговременной памяти могут являться генетические структуры.

Обнаруженные колебания кинетики жизнеспособности, а также их отчетливые изменения после однократного радиационного воздействия

должны учитываться пи! вероятностной (стгтксткче ском) прогнозировании отдаленного пострадиационного виска, а также могут быть использозаны при разработке методов противолучевой защиты.

Феномен нестабильности ГЕЕ у в.те1апоеаБгег дает логическое объяснение нестабильности результатов при оценке эффективности геропротектороз (Обухова, Эмануэль, 1984). Результат экспериментального продления жизни будет изменяться в зависимости от колебаний жизнеспособности в контрольной группе. Опенки экспериментального к расчетного предела эффективности геропротекторов совпадают и составляют около 40%.

Экспериментальные факты, полученные в настоящей работе, позволяют предполагать, что нерегулярные изменения ПЖ и плодовитости сами по себе способны вызвать резкие колебания численности мух даже при достаточно стабильном лабораторном культивировании. 3 естественных условиях именно колебания ЖИЗНеСПОСОбНОСТИ МОГУТ бЫТЬ ПРИЧИНОЙ Дрейф« ГеНОВ Пче1, 1987 ) и колебаний численности популяции (Четвериков, 1926). Наличие обнаруженных в нашем исследовании колебаний_ П£ и плодовитости может служить дополнительным (помимо естественного отбора) механизмом изменения генотипкческой структур: популяци.

Полученные данные должны учитываться при прогнозировании отдаленного пострадиационного риска, а также могут быть использованы при разработке методов противолучевой защиты.

ПОЛОЖЕНИЯ, ЗЫКОСКМЬЕ НА ЗАЛЕТУ

1. Кинетика показателей жизнеспособности С. melano6asteг Б ряду поколений контрольной линии носит отчетливо выраженный нерегулярный характер: зависимость абсолютной величины СПЖ к ранней плодовитости от номера генерашш имеет вид апериодических колебаний. С использованием критерия Крускала-Уоллиса доказано, что колебания жизнеспособности имеет неслучайное происхождение и не могут быть отнесены к артефактам лабораторного культивирования. С использованием метода масштабного выравнивания кривых выживания к критерия Колмогороза-Смирноза, установлена масштабная инзарпантность распределений ПЖ в контрольной линии.

2. Масштабная инвариантность распределений ПХ з контрольной

лз'киз* доказывает качественное сходство механизмов стареы:я в "~"* поколений. Значзггельные разлгчия вел:чкн СП£ позволяют сделать вывод о разной скорости старения в поколениях одной и той же лабораторной линии, т.е. о существовании кол!чественных отл:чий з реал:зации программы старения в разных поколениях.

3, После однократного радиационного воздействия у потомства наблюдается изменение ритма колебаний жизнеспособности, характерного для контрольной лннзп:. Радиационное воздействие з целом "сдвигает", изменяет временную (по поколения}.!) оаззеотку колебаний ПЖ; наблюдавшиеся эффекты как "стимуляции", так и угнетения заставляют с большой осторожностью подходить к "однонапразленны}.!" прогнозам пострадиационного риска.

4. На основе анализа масштабного подобия кривых выживания контрольной и пострадиационных линий предложено описание распределение ПЕ с поыошьв модели, содержащей овга параметр.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы и обобщения был: доложены и обсуждены на ГУ Симпозиуме "Цитогенетика старения" (Тбил:си, I9S9), Конференшж Московского Общества Испытателей Г.о:госды (Москва, 1SSS;, I Всесоюзном Радиобиологическом съезде (Москва, I9SS), У1 Всесоюзном совещании по проблемам генетики к биологии дрозофилы (Одесса, 1939j, рабочем совещании по исследованию механизма рзлиационно-индупирозанного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 1950), Всесоюзном ксордз :к г ни они о» совешанш: "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" (Самарканд, 1990), ist international

biophysics congress and biotechnoiogy at GAP (Diyarbakir. Turkey. 1ЭЭ1), The 9th International Congress of Radiation Research

(Toronto, 1991), Всесоюзной конференции "Продолжительность жизни: механизмы, прогнозы, пут:: увел:чения" (Киев, 1991).

СЛИСОК ПУБЛИКАЦИИ по теме диссертации содержит 14 наименований.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора л:тературы, постановки задачи, основных глав "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", вызодов и списка цитзфованной лгтергтуры. Диссертация изложена на "f2S машинописных страницах, содержит 18 тгблщ и 27 рисунков. Библгографический

указатель зключает/3? наименований.

МАТЕРИАЛЫ И КЕТОДЫ

В работе использовали Drosophila melanogaster диких линий Д-32, Berlin, Canton-S, Д-18, Р-86 и мутантной линии white. Для культивирования насекомых контрольной и экспериментальных линий использовали стандартные методики lAshburner, 1989). Во время проведения всех экспериментов мухи находились в термостате при температуре 25°С и относительной влажности 75S.

Культивирование контрольной линии в основном эксперименте (линия Д-32) осуществляли непрерывно и однообразно в течение 45 поколений. Случайным образом выбранных 50-70 пар 5-дневных девственных имаго скрещивали по одной паре в течение суток, к после их удаления следили за развитием очередного поколения. Часть молодых насекомых скрещивали в возрасте 5 дней для получения последующей генерации, другую часть использовали в экспериментах по изучению ПЖ.

Четыре раза совершенно одинаковым способом от контрольной линии были получены экспериментальные лини:, состоявшие из потомков однократно облученных родителей. Для этого 130-180 пар 5-дневных девственных особей 0-го, 13-го, 22-го и 38-го поколений подвергали облучению v-квантами со60 на аппарате ГУТ-Со60-400 в КХ5 РАН, мощность дозы составляла 1,0 Гр/мин. На основании предварительных экспериментов были выбраны дозы для самцов 24,0 Гр, для самок 4,8 Гр. Сразу же после облучения несекоыых скрещивали по одной паре в течение 24 часов. В первом и последующих пострадиационных поколениях все процедуры скрещивания и поддержания экспериментальных линий были аналогичны описанным для контрольной линии .

При проведены: дополнительных экспериментов с несколькими линиями D.melanogaster НасеКОМЫХ ОбЛуЧЗЛИ Б доззх от 2,5 до 4,8 Гр (самки) и от 16,0 до 24,0 Гр (самцы). Эа продолжительностью жизни наблюдали только в первых пострадиационных поколениях. Продолжительность жизни мух контрольной линии изучали в четырех сериях последовательных поколений: с 0-го по 3-е (I серия), с 13-го по 20-е (2 серия), с 23-го по 29-е (3 серия), с 38-го по

45-е (4 серия). Для этого из каждого поколения случайным образом выбирали по 90-150 девственных мух обоего пола, которых рассаживали раздельно по 10 особей в пробирку. Наблюдения за 12 б подопытной линии проводили в первом эксперименте на протяжении трех, а в остальных экспериментах - на протяжении сени последовательных пострадиационных поколений.

Кривые выживания строили в традиционных координатах, а таксе используя "безразмерное время" t*. Величины t* получал! путем нормирующей замены t*=t/s, где s - плошадь под кривой выживания. Нормирование координатных осей позволяет привести располагаемые б НИХ кривые К единому масштабу (Engelkine, 1978).

При выполнении второй г.озторности основного эксперимента осуществили реципрокное скрещивание мух 15-го поколения контрольной лшии и хронологически соответстзушего ему 2-го пострадиационного поколения подопытной лшии. В результате скрешсззния сформировал: две дополнительные леи:: а - гибриды контрольных самок и мужского потомства облученных за дза поколения до этого обоих "прародителей", в - гибриды контрольных самцоз и женского потомства обоих облученных "прародителей". Начиная с третьего пострадиационного поколения проводил: наблюдения за ПТ особей и? л:ний айв.

Для косвенной оценки плодовитости использовал: число куколок в расчете на одну сажу после 24-часозой клади: яиц. Анал:зирозал: плодовитость у приблизительно 60 (интервал от 56 до 70) самок. В качестве опенки плодовитости принимал: среднее число куколок по всем пробиркам для данного варианта скрещгаания.

Облучение особей родительски:-: поколений вызызало сззение численности потомстза в первых пострадиационных поколениях. Для характеристики этого явления использовал: велгчину эмбриональной выживаемости, рассч1:тываемую как отношение среднего числа куколок в подопытной л:нии к среднему числу куколок в контрольной лннзп:. Полученное значение выражал: в процентах.

Математические и графические методы

Использовал: непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова при сравнении кривых выживания в опытных и контрольной лкга: и г-критерий Стькдента для сценки разлгзий по плодовитости. Для

казателъстза достоверности колебаний средней НЕ в контрольной кик использовали непараметрический ранговый критерий ускала-Уоллиса. Величину взаимной зависимости между средней одовитостью и (Ж в контрольной лики:, г также между бриональной выживаемостью к СГШ в первых поколениях сперимектальных линзй оценивали с использованием коэффициента рреляции (Zar, 1984). Для масштабного выразнизаия кривых ЖИВЗНИЯ использовали аппарат теории подобия ÍEngelkine. 1978). тематическое моделирование формы кривых выживания осуществляли использованием теории интегральных уравнений.

Обработку данных осуществлял!: на персональном комьютере Apple е с помощью оригинальной программы. Графический анализ и едставление проводили на компьтере apple lie к ibm рс хт

mstrad 1640) С ПОМОЩЬЮ ПрОГраММ Scientific Plotter К Harvard

aphics. Все кинетические кривые получены с помощью интерполяции огочленаш: третьей степени,

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОБСУЖДЕНИЕ Характеристики жизнеспособности контрольной линии

Кг рис. I к 2 (кривые I) к в табл. I к 2 представлены яамика в ряду поколений средней ПЖ самок й самцоз. Отчетливо хкы значительные к достоверные колебания величин средней ÍIÍ от «оления к поколению у особей обоего пола, выявленные как в «делах каждой сери: опытов, так и при сравнении серий между 'бой (во многих случаях видно, что осибки генеральных средних не •рекрываются при уровне значимости р ^ 0,05). Обнаруженные менения CIE могут быть охарактеризованы как нерегулярные, т.к. :стремальные значения появляются через разное число поколений, •о хорошо согласуется с одновременно полученными данными (ЛЬГОЙСКИХ авторов (Lints et al., 1989). ДОСТЭТОЧНО ВвЛИК

13брос значений С1Ш и между разными сериями: из всех четырех гследняя отличается наиболее высокими величинами СШ.

Для доказательства достоверности и неслучайности изменения СПЖ ■ поколения к поколению в пределах каждой серии использовали ютовый критерий Крускала-Уоллиса, позволяла :£ одновременно (енить разброс средних значений в подгруппах одного поколеия и )зможные разами между всеми поколениями данной позторности . В

качестве элементов выборки брал: средние значения ГЕ, расчптанные для подгрупп из 30-40 особей. Применение критерия позволило получить данные, которые убедительно свидетельствуют о невозможности объединения средних из разных подгрупп в одну совокупность. Следовательно, можно говорить не о случайном характере колебаний П1 , но о некотором закономерном аритмическом процессе изменения жизнеспособности э ряду поколений контрольной линии. Уровень надежности такого утверждения более еысок для самок (вероятность ошибки колеблется в пределах от 0,005 до 0,05), чем для самцов (вероятность ошибки колеблется з пределах от 0,005 до 0,15).

В третьей серии эксперимента, где наблюдалось значительное снижение величин СМ, удалось установить высоко достоверную корреляционную зависимость (к=-оэб...-084, р<о,оз) между СИХ и частотой видимых морфологических уродств в экспериментальной группе данного поколения. Оценку частоты морфсзов производили по стандартным методикам ¡Lunch et al., 1991).

Масштабное подобие распределений по ПЖ

Ка основании анализа характеристик кривых выхизания (t,Q, t9f, t ) мы предположили, что резкие, скачкообразные изменения

шах - г

абсолютных величин средней ПЖ не нарушают общих закономерностей естественного зышгоания экспериментальной гг^тплы. Для доказательства этого проводили сравнение кривых выживания там, где велсчина СПЖ резко изменялась. Например, в третьей сери: опытов СП» уменьшается от 57,67 дней в 23-ем поколении до 22,48 дней в 29-ом поколении у самок (рис. 4). Количественные различия очевидны. Однако, если расположить те же кривые в нсрмнрозанных координатах, это призодит к практически их полному совмещению (рис. 5). Также было проведено аналогичное сравнение кривых выживания самок и самцов 29-ого и 39-ого поколений, наиболее отличающихся по значениям СИЕ. Оказалось, что в нормированных координатах различия между этил: кривые', незначительны. Для сравнения распределений 1Ж, построеных в нормированных координатах использовал; критерий согласия Колмогорова-Смирнова. Различия во всех случаях оказались незначимыми (p¿0,05) Это слухпт дополнительным аргументом в пользу того, что несмотря на

- к- ■

2-3-кратные различия средних знзчеаЛ ГЕ, динамика вымирания в разных поколениях следует единому закон}'. Иными словами, относительная доля особей с определенной Ш во всех случаях приблизительно одинакоза.

Совмеиение кривых выживания в нормированных координатах указывает на масштабную инвариантность (масштабное подобие) распределений ПХ во всех поколениях. Иными словами, в нормированных координатах скорость старения одинакова, что указывает на качественное сходство программы старения в ряду поколений. Однако, значительные, до 2-3-кратных, различия средних величин говорят о том, что количественная или временная реализация такой программы может существенно изменяться от поколенения к поколению.

Возможный вид распределения по продолжительности жизни Совмеиение кривых выживания в нормированных координатах позволяет, кроме того, указать на возможный вид распределения ПХ в контрольной линии. Две различные кривые выживания можно описывать функцией с одним параметром "а": з1(г,а1) и з2и.а2). Тогда плопади под кэизыыи выживания вычисляются:

<Х. (X

5с1 = /31(1.а1)е1г=к1(а1) и бс^/ б2 (1, а2 ) <п = к2 ( а2 ) ,

где к,(а ) и к2(а2) - константы.

Произведя замену переменных в каждом из уравнений: г=г'к1(а1)

соответственно, получил выражения для этих функций в нормированных координатах:

г* (кх ¡а, ) г* ,а1) и б! 1к2 (а« н* . &2 )

Совмещение (тождественное равенство) функций б* и б* возможно лишь при независимости каждой из них от своих параметров а ^. Последнее условие выполняется лишь тогда, когда параметр а^ входит в фуккциию в виде сожителя вида 1/к^а ) при переменной t. Обшее решение данной задачи шлется в виде экспоненциальной функции. Исходя из постановки задачи, удалось показать, что решениеи, имевшим биологический смысл, является функция вида:

5(1,а)=ехр1-гг/а2). Для любых значений параметра а в нормированных координатах

функция выживания Судет иметь вид:

Следовательно вблизи этой теоретически полученной зависимости булут группироваться реальные кривые выживания, построенные в нормированных координатах.

Колебания ранней плодовитости в контрольной линии Ранняя плодовитость, как и СШ, была подвержена значительным и достоверным (по крайней мере, р^0,05 для большинства поколений) колебаниям в ряду поколений (рис. 3). Расчитанный коэффициент корреляции между ранней плодознтостью и С1Ж самок необычайно мал, он составляет всего 0,09 (р ^ 0,01), что свидетельствует об отсутствие линейной связи между этими величинами. Таким образом, оказалось, что две важнейшие характеристики жизнеспособности особей - продолжительность жизни и ранняя плодовитость - имеют каждая свой, не коррелирующий с другим "рисунок" колебаний в ряду поколений.

Характеристики жизнеспособности в ряду пострадиационных поколений Подбор доз радиационного воздействия осуществлялся так, чтой: при скрещивании одного облученного и одного интактного партнера эмбриональная выживаемость в дзух вариантах скрещивания была одинаковой и разной приблизительно 50'. Значительная разница доз облучения самок и самцоз объясняется существенно различающейся радиочузствительностью зрелых сперматозоидов к яйцеклеток

(Бапкагапагауапап, 1974).

На основании предварительных экспериментов и анализа данных литературы (Воробцоза, 1933) были выбраны дозы облучения для самок 4,8 Гр и для самцов 24,0 Гр. В этом случае выживаемость потомства обоих облученных родителей составила в перзой повторности основного эксперимента - 25,0±2,2% (облучали мух 0-го поколения контрольной линии), во второй - 23,5±0,7% (облучали мух 13-го поколения), в третьей - 14,9±0,3% (облучали мух 22-го поколения) и в четвертой - 9,4±0,4% (облучали мух 38-го поколения). Столь значительные различия эмбриональной выживаемости могут отражать, по нашему мнению, различную чувствительность к воздействию у разных поколений, что в целом,

согласуется с представлениями о нестабильности характеристик жизнеспособности, как это удалось показать в случае Ж и ранней плодовитости. В результате воздействия пострадиационные ложи оказались в известном смысле "вырезанными".

На pic. I и 2 (кривые 2) представлена динамика СШ в контрольной и пострадиационных линиях. Отчетливо видно, что результаты каждой из четырех повторностей не повторяют друг друга. В первой серж наблюдали превышение СШ подопытной линии над контрольным уровнем - незначительное для caicos и высоко достоверное (на 15-18%) для самок во всех трех пострадиационных поколениях. Это явление не может быть отнесено к феноменам мутагенной стимуляции, т.к. изменению подвергался интегральный групповой признак в пострадиационных поколениях. Во второй и третьей сериях различия были в пользу контрольной линии лишь в каком-либо одном поколении: во второй серж это было пятое поколение, где наблюдались различия до 39% у самок к до 22% у самцов, 3 третьей серки самки третьего пострадиационного поколения жили в среднем на 11% меньше и самцы первого поколения в среднем на 9% меньше, чем особи контрольной, линии. В четвертой серии СПЗЕ в контрольной линии превышает на 4-16% СПЖ потомков облученных родителей: в 1-ом, 4-ом, 5-ом к 7-ом поколениях у самок и в 1-ом, 2-ом и 4-ом поколениях у самцов. Достоверность различий, там где они были обнаружены, колеблется от 95% до 99,9%.

В дополнительных экспериментах на нескольких линиях

D.melanogaster УДЗЛОСЬ ПОКЗЗаТЬ, ЧТО ЛИНИЯ Д-32 Не ЯЗЛЯеТСЯ

уникальной в отношензж эффектов радиационного последействия всех "направлений" в первых пострадиационных поколениях. Так СП! ПОТОМКОВ ОблучеКНЫХ родителей раДИОреЗИСТеНТНОЙ ЛИНИИ Berlin достоверно превышала контрольный уровень на 14% (рис.6, самцы), для радиочувствительной линии canton-s была на 13,8% ниже контроля (рис.7, самки), а для радиочувствительных линий Д-18 (р:с.8, самки), Р-85 и мутантной линии white достоверных отличий от контроля не выявлено. Таким образом, спектр возможных пострадкционных эффектов отражает обшее свойство облученных экспериментальных групп.

Используя метод корреляционного анализа удалось показать, что эмбриональная выжззаемость в первых пострадиационных поколениях (т.е. величина радиационного "вырезания" подопытной группы) не язляется фактором, определяете направление и величину изменения СШ у потомков облученных особей (коэффициент коррелята: = 0,29).

Кривые 2 на рис. I и 2 показывает, что ПЖ в подопытных линиях также подвержена колебаниям, которые в той или иной степени не совпадает с контрольным!:. Если в первой и третьей серии экспериментов колебания СПХ в контроле и опыте имеет сходные дифференциальные характеристики (симбзтный ход), различаясь по амплитудным значениям, то во второй и особенно четвертой се риз: рисунок колебаний в котрольной и опытной линиях совершенно не похожи ни по дифференциальным, ни по масштабным характеристикам. Сравнение соответствующих величин критериальных статистик и уровней значимости позволяет заключить, что различая в распределениях ПЕ между контрольной и опытной группами у самцоз выражены менее отчетлзо, чем у самок ^табл. I и 2).

Масштабная инвариантность кривых выживания з подопытных линиях

На рис. 9 представлены кривые выживания самок подопытных линий из разных повторностей эксперимента, на рис.10 те же самые кривые выживания построены в нервированных координатах. Для этого сравнения произвольно выбирали по одному пострадиационному поколению и? каждой повторности эксперимента, так чтобы разница между ними по СПЖ была наиболее отчетливой. У самок это вторые поколения в первой (CUS - 51,60 дня) , второй (СЕ! - 43,75 дня и четвертой (С1Ж - 65,39 дней) повторности и седьмое поколение третьей повторности (СПЖ - 23,00 дня). Количественные различия хорошо видны на рис. 9. В нормированных же координатах все кривые практически совмещаются (рис. 10).Попарное сравнение кривых выживания, построенных в нормированных координатах. не выяв::ло значимых различий между зм: (критерий согласия Колмогорова-Смирнова, рЛ),05). Такое совмеиение kpjshz свидетельствует в пользу того, что в подопытных линиях, также как это было показано и для контрольной линии, остается постоянным соотношение между особями с различной ЕЕ. Екыми словами, внутри

- 1-1 -

линий потомков облученных родителей относительное распределение особей по продолжительности жизни не меняется в ряду пострадиационных поколений, сохраняется масштабная инвариантность распределений. Нал1шо ситуация аналогичная той, что была выязлена и для контрольной линии.

Таким образом, анализ динамики С1Ш и кривых выживания в контрольной и подопытных линиях позволяет сделать вывод о том, что сущность однократного радиационного воздействия заключается в истинном изменение ритма колебаний жизнеспособности, характерного для контрольной линии. Различия между контрольной и опытной линией в каждом конкретном поколении не являются отражением каких-либо процессов или эффектов, свойственных именно этому поколению. Радиационное воздействие в целом сдвигает, изменяет временную (по поколениям) развертку колебаний ПЖ. При этом все кривые в подопытной линии сохраняют масштабную инвариантность (масштабное подобие). Лишь один раз было обнаружено отклонение от этого правила.

Характеристики распределения ПЖ в подопытных линиях, полученных в результате реципрокного скрещивания

На рис. II представлена в увеличенном ма&дтабе динамика С1Ш самок в эксперименте с резлрокным скрещиванием .особей 15-го поколензж контрольной лики: и второго пострадиационного поколения подопытной линии. Видно, что динамика ЕЕ в линиях а и б, сформированных в результате реципрокного скрещивания, почт:: полностью совпадает с таковой у потомкоз обоих облученных родителей. Максимальные различия достигаются в пятом пострадиационном поколении. Кривые выжизания 18-го поколения контрольной линии, пятого поколения пострадиационной линии и хронологически соответствующих им поколений лпшй айв представлены на рис. 12. Отчетливо видно, что кривые выживания линий 2, а и в имеют неканоническую двухступенчатую форму: есть два явно выраженных участка плато и два участка массовой табели. Различия между контрольной и подопытной линиями во второй повторности эксперимента не могут быть охарактеризованы как изменение ритма колебаний П1, так как распределение 1Ш в пятом пострадиационном поколении очевидно не может быть приведено к

каноническому в::ду путем каких-либо норыкруюаих преобразований. Явное отсутствг.е масштабной инвариантности для этого распределения указывает на то, что в данном случае мы имеем дело с особой формой радиационного последействия, когда степень повреждающего действия радиации оказалась значительно глубже, чем в остальных псзторностях основного эксперимента.

Очевидно, информация об однократном физическом (радиационном) воздействии в 13-ом поколении сохранялась на протяжении нескольких десятков клеточных циклов линии зародышевых клеток и передавалась в ряду поколений. Реализация этой информации сопровождалась резким расслоением экспериментальной группы по исследуемым признакам. Способ форюгрования гибридной линю: а (скрещивание интактной самки и самца-потомка облученных родителей) позволяет предполагать, что биохимическим субстратом долговременной памяти могут являться генетические структуры, т.к. именно ДНК сперматозо!ц:г самца является практически единственным материальным и информационным связующим звеном между облученными родителями и их потомками из линга; а.

Следовательно, по изученному показателю жизнеспособности - ЕЕ - существуют по крайней мере два возможные пути ответа з ряду поколений на однократное радиационное воздействие: первый -находит отражение в истинном изменени: р:ггма колебаний жизнеспособности и не сопровождается изменением масштабной инвариантности распределен:!: признака, 1: второй - характеризуется резкид изменением Е7.ла распределения и расслоением подопытной группы по данному признаку.

Количественные разлгчия между контрольной и опытной лзжией з каждом конкретном поколении не являются отражением каких-либо процессов ил: эффектов (например, только деструктивных), свойственных именно этому пострадиационному поколению. В отдельных, случайно выбранных поколениях, отличия з средних величинах без детального ана.тиза распрелений признака з опыте и контроле не могут служить основанием для утверждения об отрицательном ил: "стему.тоующем" последействии радиации.

- I о -

выводы

1. Установлено, что кинетика показателей жизнеспособности (продолжительность жизни к ранняя плодовитость) б. те1апоеаг1ег в ряд-/ поколений контрольной линии имеет отчетливо выраженный нерегулярный характер: зависимость средних значений от номера генерации имеет вид апериодических колебаний с различиями экстремальных значений до 2-3-кратных. Колебательные изменения является достоверными, уровень значимости отличий, оцененный по критерию Крускала-Уоллиса, в разных сериях эксперимента находился в пределах р<0,005-0,05 для самок и р<0,005-0,15 для самцов.

2. С использованием метода масштабного выравнивания кривых выживания и критерия Колмогорова-Смзфнова, доказана масштабная инвариантность распределений НЕ в контрольной линии. Это указывает на качественное сходство механизмов старения в ряду поколений. Значительные различия величин СПЕ поззоляют сделать вывод о разной скорости старения в ряду поколений одной и той же лабораторной линии.

3. Ка основе анализа масштабного подобия кривых выживания в контрольных и подопытных линиях и проведенного математического моделирования предложено описание распределение ГШ с помощью модели, содержащей один параметр и имевшей следующий математический вид: зи.а)=ехр(-^/а2). Эта модель позволяет вычленить инвариантную составляющую колебательных изменений ПЕ.

4. После однократного радиационного воздействия у потомства наблюдается изменение ритма, разверти: по поколениям колебаний жизнеспособности, характерных для контрольной лоза:. Количественные различия между контрольной и опытной линией в каждом конкретном поколении не являются отражением каких-л:бо процессов или эффектов (например, только деструктивных), свойственных именно этому пострадиационному поколению. В отдельных, случайно выбранных поколениях, отличия в средних велгчинах без детального анализа распрелений признака в опыте и контроле не могут служить основанием для утверждения об отрицательном или "стимулирупаем" последействии радиации.

5. Установлено, что существуют по крайней мере дза пути реализации радиационного последействия в ряду поколений: первый

птть — изменение ритма ксдебанз2~: жнзиаспссобнссти не сопровождающееся изменением масштабной инвариантности распределений признака, и второй путь, характеризующийся резким изменением вида распределения признака, расслоением подопытной группы по данному признаку. Вероятность последнего пути развития радиационного последействия, по-видимому, не велика, т.к. данное явление было обнаружено лишь в одном из девятнадцати прослеженных пострадиационных поколений во всех сериях эксперимента.

6. Показано, что долговременная биологическая память об однократном физическом (радкационнс>м) воздействии способна существовать на протяжении нескольких десятков клеточных циклов и передаваться в поколениях. Реализация информации о воздействии сопровождается расслоением экспериментальной группы по исследуемым признакам. Биохимическим субстратом долговременной памяти могут являться генетические структуры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО T2MS ДЕСС2РТАШС

1. Измайлов Д.М., Обухоза Л.К., Акифьев А.П. Влияние облучения половых клеток родительского поколения на продолжстельность жизни

3 семи ПССТРаДИЗДИОННЫХ генерациях у Drosophila melanogaster. //

Тезисы докладов 1У Симпозиума "Иктогенетика старения". - Тбилиси, 1989. - С. 19-20.

2. Измайлов Д.М., Потапенко А.К., Акифьев А.П., Обухоза Л.К. Динамика продолжительности жизни з ряду последовательных поколений у "дрозофилы. // В сб. "Механизмы процессов старения". Конференция Московского Общестзг Испытателе'й Природы. - М.: Наука", 1989. - С. 41-44.

3. Измайлов Д.М., Обухова Л.К., Акифьев А.П. Радиационное последействие 3 РЯДУ поколений у Drosophila melanogaster (исследование продолжительности жизни). // Тезисы докладов I Всесоюзного Радиобиологического съезда. - Пущине, 1989. - Т.4. -С. 823-824.

4. Измайлов- Д.М., Обухова Л.К., Акифьев А.П. Динамика продолжительности жизни в ряд:/ поколений у Drosophila melanogaster. // Тезисы докладез У1 Всесоюзного совещания по проблемам генетик:: и биологии дрозофилы. - Одесса, 1989. - С. 40.

5. Измайлов Д.М., Обухова Л.К., Окладнова О.В., Акифьев А.П. Изменение продолжительности ЖИЗНИ Drosophila melanogaster В РЯДУ поколений после однократного воздействия ионизирующей радиацией. // Доклады АН СССР. -'1990. - Т. 3:3, n 3. - С. 415-722'.

6. Измайлов Д.М., Обухова Л.К., Окладнова О.В., Акифьев А.П.

lb

Новый Tin: радиационного последействия: исследование продолжительности* жизни в ряду поколений потомкоз облученных дрозофил // Тртды эгбочего совещания по исследованию механизма радиашюнно-ивдширозанного мутагенеза и репарации ДНК. - Дубна, Î990. - С. 175-187

7. Измайлов Д.М., Обухова Л.К., Акифьев А.П., Окладноза О.В. Нетривиальный радиационный мутагенез в сяду поколений у дрозофилы: периодические изменен1:я жизнеспособности. // Тезисы докладов Всесоюзного коорд:нгцконксго совещания "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенный: факторами". - Москва-Самарканд, 1990. - С. 80-81.

8. Izmaylov D.M., Belayev I.Va.. Okladnova O.V., Obukhova L.K.. Akifyev A.P. Non-rhythmic variations of living organisms viability patterns determine their response to low intensive microwaves and ionizing radiation // Abstracts of the 1st International biophysics congress and biotechnology at GAP. Diyarbakir, Turkey. 1ЭЭ1. - P. 36

9. Izmaylov D.U., Obukhova L.K., Okladnova O.V., Akifyev A.P. Long persistance of the viability alterations after single ionizing radiation treatment // Abstracts of the 1st International biophysics congress and biotechnology at GAP. Diyarbakir, Turkey. 1991. - P. 135.

10. Izmaylov D.U., Obukhova L.K., Okladnova O.V., Akifyev A.P. Long-persistance of the viability alterations after single ionizing radiation treatment // Radiation Research: A Twentieth-Century Perspective (Ed. by J.D.Chapman. W.C.Dewey, G.F.Whithmore). - Abstracts cf the 9th International Congress of Radiation Research. - Academic Press, Inc., 1991. - Vol. 1. - P. 337 .

11. Обухова Л.К., Акифьев А.П., Измайлов Д.М., Окладноза O.S. Неслучайный характер колебаний продолжительности жизни Drosophila

melanogaster В рЯДУ ПОСЛеДОВатеЛЬЕЫХ ПОКОЛеНИЙ И П0СЛ5

однократного облучения // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Продолжительность жизни: механизмы,прогнозы, пути увеличения". -Киев, 1991. - С. 99.

12. Акифьев А.П., Обухова Л.К., Измайлов Д.М. К разгадке тайны старения живого организма // Вестник Российской Академзп: Наук. -

1992. - К 5. - С. 82-92.

13. Izmaylov D.M., Obukhova L.K., Okladnova O.V., Akifyev A.P. Phenomenon of life span instability in Drosophila melanogaster.

I. Nonrandom origin of life span variations in successive generations // Experimental Gerontology. - 1993. - Vol. 28, К 2.

14. Izmaylov D.H. , Obukhova L.K., Okladnova O.V., Akifyev A.P. Phenomenon of life span instability in Drosophila melanogaster.

II. Change in rhythm of natural variations of life span aftei single exposure to y-radiation // Experimental Gerontology.

1993. - Vol. 28, N 2.

_ то _

Таблица I . Средняя продолжительность жизни (СНЕ) и стандартное отклонение (С.О.) санок контрольной линии и самок - потомков обоих облученных родителей. Указаны значения критериальной статистики Колмогорова-Смирнова <tks' и соответствушие уровни достоверности различий (р)

КОНТРОЛЬНАЯ ЛИНИЯ ПОСТРАДИАЦИОННАЯ ЛИНИЯ р

* No СПХ ± С.О. Я No [ СШ ± С.О. т 'KS

0 120 46,74±13,70

I 120 36,96±13,65 I 120 43,87±14,70 1,81 *0,01

2 120 43,43±Г7,06 2 120 51,60±16,93 2,52 ^0,001

3 120 46,71±1б,б7 3 120 53,90±15,18 2,00 Л),005

13 120 49,97±14,06

14 150 49,21±24,21 I 150 49,29±12,64 0,51 Н.Э.

15 150 44,63±14,48 2 150 43,76*12,76 0,78 Н.З.

16 120 42,02±15,23 3 120 40,01±15,32 0,65 н.з.

18 90 56,40±17,17 5 100 40,14±21,66 2,55 Л), 001

20 120 54,72±П,51 7 120 53,25±14,00 0,96 Н.З.

23 120 57,67±I6,2I I НО 57,57±17,62 0,10 в.з.

25 НО 58,22±13,60 3 НО 51,90±12,04 1,56 .¿0,05

27 но 40,22±06,75 5 120 41,03±05,17 0,53 н.з.

29 120 22,48±05.86 7 120 23,00±05,55 0,71 н.з.

38 40 62,40±16,92

39 120 72,34±19,52 I 120 60,87±22,45 2,00 .<0.005

40 90 67,II±I5,25 2 90 65,39±17,73 0,45 н.з.

41 90 66,61±15,36 3 90 б5,1б±14,87 0,67 н.з.

42 90 69,52*12,54 4 90 63,02±15,66 1,41 -Ю.05

43 90 63.19±15.03 5 90 59,86*14,16 2,01

44 90 58,67-18,35 6 90 58,98*15,44 0,52 н.з.

45 90 66,42±14,00 7 90 5б,76±17,03 1,57 ^0,05

- 2С -

Таблица 2 . Средняя продолжительность жизни (С1Ш) и стандартное отклонение (С.О.) саыяоз контрольной линии и самзоз - потомков обоих облученных родителей. Указаны значения критериальной статистики Колмогорова-Смирнова (ткз) и соответствующие уровни достоверности различий (Р)

КОНТРОЛЬНАЯ ЛИНИЯ ПОСТРАДИАЦИОННАЯ ЛИНИЯ ТК5 р

а ко С1Ж ± С.О. £ ко СПХ * С.О.

0 120 50,68*16,69

I 120 43,73*19,44 I 120 47,20*17,44 0,90 н.з.

2 120 50,10±19,25 2 120 51,99*18,92 0,84 н.з.

3 120 49,76*16,51 3 120 49,04*21,46 1,10 н.з.

13 120 45,10*14,24

14 150 48,1СЫЗ,21 I 150 49,21*12,22 0,51 н.з.

15 150 43,42*12,84 2 150 44,96*12,83 0,87 н.з.

16 120 39,73*12,59 3 120 38,20*11,45 0,90 н.з.

18 90 39,76*13,38 5 НО 30,96*12,17 3,16 Л),001

20 120 41,51*15,55 7 120 43,38*15,85 1,09 н.э..

23 120 49.30*14,15 I ПО 45,02*13,18 1,61 .¿0,05

25 НО 46,24*12,11 3 НО 46,52*11,64 0,54 н.з.

27 НО 44,11*13,26 5 120 42,11*13,58 0,53 н.з.

29 120 29,84*10,56 7 120 28,76*10,38 0.84 н.з.

38 40 55,92*15.23

39 120 56,70*14,97 I 120 54,11*14,51 1.36 =0,05

40 90 57,60*13,46 2 90 53,80*16,16 1,42 ¿0,05

41 90 51,84*12,53 3 90 56,49*14,05 1,27 н.з.

42 90 57.44*13,74 4 90 52,72*14,18 1,49 ¿0,05

43 90 55,63*13,88 5 90 50,26*14,55 1,19 Н.З.

44 90 57,82*14,00 6 90 60,44*15,27 1,04 Н.з.

45 90 57,08*14,09 7 90 57,63*16,38 0,67 н.з.

линии (I), потомков сбспг облученных родгте.-еП (2), а такхе особей линий А к В. Указаны значения критериальной статистики Колмсгорова-Сиирноза <тК5) и уровни достоверности различий (Р) при сравнит. с контрольной линией.

Таблица 3.

С А М К И

*покол ЛИНИЯ СПЗ ± С.О. ТК5 р

16 I 120 42,02*15,23

2 120 40,01*15,32 0,65 н.з.

А 120 42,84*13,47 1,09 к.з.

в 120 38,28±17,46 1,55 Л), 05

18 I 90 56,40*17,17

2 100 40,14*21,66 2,55 ^0,001

А 120 39,53*19,41 3,08 •сО.001

В 120 33,19*22,30 3,37 Л), 001

20 т 120 54,72*11,61

2 120 53,25*14,00 0,96 н.з.

А ПО 54,54*11,08 0,76 к.з.

В 119 52,00*13,34 1,42 .¿0,05

Тгбдш ;а 4.

САМЦЫ

ХЛОКОЛ ЛИНИЯ ко СПЕ * С.О. ткз р

16 т 120 39,73*12,59

2 120 38,20*11,45 0,90 н.з.

А 120 39,63*13,32 0,45 к.з.

В 120 42,72*13,63 1,29 н.з.

18 I 90 39,76*13,38

2 НО 30,96*12,17 3,16 Л). 001

А 100 32,64*16,35 1,51 Л) ,05

В 90 33,27*17,63 1.71 Л), 01

20 I 120 41,51*15,55

2 120 43,38*15,85 1,09 н.з.

А 120 44,13*14,54 1,03 н.з.

В 120 42,02*13,94 0,39 н.з.

ТТТТТГ—ТГГГГП-1 I 1 I 1 II I

'12 5 »« « 1 11 23 25 2! 25 К>5 41 <5 <5

(357

НОС? посошке

Рас. I

Рис. 2

I | I-11111).,-1 ■ ] , I I .-гтттггп

12 3 15 Ц <6 « ¿0 25 25 2' 23 Я Я 41 <5

Изменения средней продолжительности кпзкн контрольной (I) и пострадиационной (2) линии в зависимости 6т № поколения. Верх няя горизонтальная шкала-постргдиазионнне, нихняя-контрольные поколения. Рис. I - САМКИ, рис. 2 - САМЦЫ. ■

1 5 1_I_I_I

Рис. 3. Изменение средней плодовитости самок контрольной линии в зависимости от номера поколения.

Рас. 6

с-г^ с:и

1 . 00 -2-

Рис. 7

40 с -у тки

Ъ'

X1

Рис. 8

20 40 ве 80 106

Кривые выживания: I - контроль

2 - потомство первого поколения от обоих облученных родителей Ргс. 6 - самцы линии BerCi.ru Рис. 7 - самки линии Со-гЛоп.- и Рас. 8 - самки лшош Д-18

Кривые выживания самок контрольной линии 23-го (I), 25-го (2), 27-го (3) и 29-го (4) поколений.

Рис. 4._ Традиционные коорданаты Ркс. 5. Нормированные координаты

Кривые выживания самок пострадиационных линий: I - ^ повторности, 2 второй повторно сти, 3 первой и четвертой повторноста.

Рис. 9 - традиционные координаты Рис.10 - нормированные координата

третьей

Рис. II .Рис. 12

Изменение'средней продолжительности жизни самок (рис.11) и кривые выживания в пятом поколении (рис.12) второй довторности эксперимента:.I - контроль, 2 - потомство обоих облученных родителей, А и В - гибридные линии.

лозпксгно г печати 25.02.93. 5оомят 50x90. Тираж 70 экз.