Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия генов коклюшного токсина BORDETELLA PERTUSSIS в клетках гетерологичных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов коклюшного токсина BORDETELLA PERTUSSIS в клетках гетерологичных микроорганизмов"

2

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени Н.Ф. ГАМАЛЕИ

на правая рукописи

ШУМАКОВ ЮРИЙ ЛЕОНВДОЗИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ КОКЛЮШНОГО ТОКСИНА BORDETELLA PERTUSSIS В КЛЕТКАХ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

(03. 00. 07 - микробиология) (03. 00. 15 - генгтика)

Автореферат дассгртацяи ка соисханиг ученей степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена-в.научно-исследовательском ордена Трудового^г-Красного Знамени Институте эпидемиологии и микробиологе и имени Н.Ф. Гамалеи Российской АМН

Научные руководители - доктор биологический наук,

профессор В.Н. Гершанович „

доктор медицинский наук КА. Лаяаева

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук.

профессор А.А. Прозоров

доктор медицинских наук, профессор В.Г. Лккодед

Ведущее учреждение - Московская Медицинская Академия им. И.М.Сечгнова

Защита диссертации состоится " 1992 г.

в ,урЧ* часов на заседании Специализированного совета К 001. 07. 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в научно-исследовательском Институте эпидемиологии и микробиологии имени И.Ф. Гамалеи Российской АМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ эпидемиологии и микробиологии км. И.Ф. Гамалеи Российской АМН.

Автореферат разослан "/С)" / 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Сояета доктор медицинских наук

Е.И. Коптелова

Актуальность темы. В. pt_.tussis является эт'-члогическим агентом широко спространенного заболевания детей - коклюша. По материалам ВОЗ епздно в мире заболевает коклюшем около 50 млн. детей и, примерно, ин миллион умирает (Бюллютень ВОЗ, 1985).

рпускулярная коклюшная вакцина, используемая з настоящее время для щинации детей, обладает рядом отрицательных свойств, важнейшими га герых являются высока'- реактсгенность к непродолжительность сгвакцинального иммунитета, а также способность защищать в основном заболевания, но не от инф^цир заиия.

Практически во всех странах ведутся исследования по замене пьноклеточной коклюшной вакцины белее совершенным препаратом, падающим высокой защитней активностью и низкой реахгогеикостью. В чеве разработки нового похоления коклюшных вакцин лежит концепция timan, 1979, 1У84) об антитоксической направленности противококлюшного 1муннтета, согласно которой Бедущая роль в патогенеза коклюша отводится слюшному экзотоксину (КТ). Одним из перспективных путей создания втивокохлюшных препартгоч нового поколения является конструирование аммсв-продуцентои КТ B.pcrtussis. Штаммы некоторых

|!зкородстве!1ных микроорганизмов, практически безопасные для ювека, например, B.brondiiseptica, синтезирующий н' ->бходимые этектнвные антигены, можно рассматривать как потенциально вакцинные •аммы. Разработка коклюшной вакцины на основе КТ ограничивается 'дностью его получения в достаточном количестве и использованием srsix методов-очистки из клеток B.pertutsis. Одним из надежных способоз ■струирпЕания штаммез подобного типа, язляется использование генно-женерпых подходов, включающих клонирование сперона КТ и чструирсвание стабильного штаммг продуцента. Важнейшим этапом этих :ледспаний является подбор устойчиво наследуемого плазмидного пехтора, )собного обеспечить высокий уровень продукции КТ, а также выбор крооргашпма-реципиента и спреллг.ение оптимальных условий его :ьти2ирсвания.

Пель и запачи 1'сследозания. Целы® настоящей работы являлось 1струировапие плгзмидной ДНК, несущей опгрсн КТ, и создание здуцента КТ на основе гетеролегачного микроорганизма ; В соответствии с этой целью были поставлены следующие лдачи:

1. Получение банка генов В. pertu^is в клетхах Е. со!i.

2. Клонирование участка хромосомы В. pertussb, несущего полный оперон

3. Конструирование рекомбкнантней плазмяды, содержащей ояерон КТ ; под контролем собственного, так и гетеролегачного промотора, способной хледооатъея в различных микроорганизмах.

4. Подбор микроорганизма - продуцента КТ.

5. Изучения иммунобиологических и физико-химических свойств омбинаитного КТ.

г

Научна!; новизна. В результате изучения клонированной в клетках 1 области хромосомы В.региши, содержащей оперон КТ, покг невшмовцосгь получения полноценного КТ в этих клетках, как контролем собственного промотора,' так и гетерологичного Ьас-промс Е.соЦ.

Пошшо, чти гибрндные белки, синтезируемые в Е.соИ и несущие в с составе ц_лую или модифицированную с помощью делеции Б2 субъели КТ иммукопозитивны, но не обладают протективиой активностью.

Впервые показано, что геномы двух близкородственных в В.рагараЛпсз1з и' В.ЬгспсккерПса несут в своем составе так называс "молчащие" гены КТ в нефункциональном состоянии. Введением генов КТ на плазмиде в клетки штамма В. ЬгопсЫзер^са показано, что данный микроорганизм сохраняет способность поспранслкционному процессингу су&ьедикиц, сборке и транспорту К' внешнюю среду.

Теоретическое значение проведенных исследований заключается в что оно способствует пониманию хромосомной организации функционирования оперона КТ В. г тш^.

Практическую значимость работь; представляет серия рекомбинант плазм ид р1Ш 119, рЯН 121, р1Ш 134, КБРТ I и рОУ 311, несущих в о составе оперон КТ либо его часть , как под контролем собственного, т гетерологичного промоторов. Причем на основе двух последних из указав плазмид сконструированы штаммы - продуценты полноценного КТ.

Впервые сконструированные нами реком'бинантные плазм иды 1^РТ рОУЗИ универсальны и могут быть использованы для подбора продуце КТ среди других групп микроорганизмов. Кроме того плазмида рШ несущая полный оперон КТ может быть использована в каче молекулярного ДНК-зонда при тиагностпке сочетанных инфекций вер: дыхательных путей или инфекций с атипичной и стертой симптоматикой

Апробация работы. Основные положения диссертационной ра( доложена на конференции молодых ученых НИИЭМ им. Н.Ф.- Гам. АМН СССР, 1987; на международно^ симпозиуме Европейс Микробиологического Общества по проблеме В.регШиЬ, г. Берлин, 1988 конференции Всесоюзного Микробиологического Общества по 1 "Бактериальные плазмиды", г.Нальчик, 1990.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 статьи, 2 тез» получены 3 авторских свидетельства на изобретение.

Р| .тура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введении, об литературы, материалов и методов, результатов собственных исследоваш их обсуждения, заключения, выэодоа и списка литературы. Работа юл о» наГ- страницах машинописного текста и лроиллюсг*ироьана ; рисунк и таблицами. Список литературы содержит 172 наименования ( отечилвст.ыл и 155 - «¡¡астра;*..!»•>:}.

Мл ГЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и рлагччяы. В работа использованы штаммы 3.perti:ssis и B.brcnchisfptica из коллекции сспрудкичакздего центра ЕОЗ для :пра20х и научных исследований по коклюшу на баз; КИИЭМ им. ¡.Ф.Ггмалеи АМН СССР .

В качестве плззмкдного вектора для улокнрсйння в клетках E.coli JM 107 1спол1-зовали мультнкопийнуга 1.лазмидпу:о ДНК рЬ'С 19. Для ¡'.лснкроганк.т i клетхая B.bronchijepiica использовали плазмидный вектор широкого круга ;озяев RSF 1319 л бирспликонньы плазмидный вектор pOV3 (3axape;¡xo и оагт., 1989 г.).

Среды. В качестве полноценной среды использовали жидкий или .ropn3csa:!:¡!>¡!Í бульон L.

Для культиг:ирсв-.нил различных видев микроорганизмов рода Bordeteüa хпользезапи кгзеитево-угсльный агар (КУА) с добавлением 20% кропи елозека и полусинтетнчесхую среду тиг:а Cohsn-Wfceelw гтроиззодегга ЩИИЗС упл. Мечникова.

Селехцчга пекомбинактса штампа E.coii JM 107 при клонировании в екторг pUC 19 гтрозодилн к а среде Мах-Конки с 1% лактозой (nifco, США). 1!1тибиоткх!1 з селективные среды дсбазлялн в концентрациях (мхг/мл): мгтицилкк (Ар) 50-50; (Км) - 50; стрелтсц:'.:! (£m) - 100;

ульфаниламид (5п) -25.

Зыделекке плагмисном ДИК, Скрининг бактериальных коломиЗ и ген.чо-!;:;<e¡:epy:ue прэаодилн го методу (Birr.boiro, Do'.y, 1979).

Emeедег;:» гроуоссмнсч ДНК проводили фенольиым методом (Мализт, 571). ■

зглечек^г фрагментов ДНК из агарэзного геля, нкж-тргнеяяцикз, ДНК-ДНК {бридпзгцига, обработку фрагментов лигазей • фага Т4 к щелочной осфотазой, гь;делемие ДНК фага h Е. сой преходила как описано в /котодстзе (Ма!!!!ат::с с соавт., 19S4).

>cuthernJ975)." •

Т^псформ?.цу'о гглазм^г-т-'? gHK в клетки E.ec!i прогоняя по метод;' lañaban, 1983). Криотргксфсрмгцкзз клеток ргцеяиентсз E.bronchiseptica зоведили по методу (Дитятхии и соаз., 1S79).

Получение и истощение знтух^^рот'-е? " КТ прозйдиля хах со fi о з •боте (Salo et а?., 1983). «

Выделение и очистху КТ щ клеток В. рггйжгз проводил я пэ методу ekura ct al., 3934), а очистку белховыл продуктов, синтез которых ¡терминирован рекомбинаитзюй плазмидной ДНК, по Методу (Asktücf et al., >32).

Изучение иммунобиологических сеэйстб препарата;; и токсичность препаратов KT проводились б соответствии с Инструкцией по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактери."; (I9S7 г.) и методическими рекомендациями Лаборатории коклюшек и других бордетеллезов НЛИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР. СНО - тест стакилк б соответствии с работой ( Hewlett st а!., 1986).

Статистическую обработку цифрозого материала проездили с использованием методов вариационной статистики Оишера-Стыодента (Ашмарин к Воробьев, 1962) и Лорда и Урбаха (Урбах, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Клонирование -енов KT В. pertussis в клетках Е. coli .

Первым этапом работы было получение банка генов В. pertussis в клетках E.Ck,.i с последующим их скринингом in situ с помощью ан~ чсыворотки к очищенному KT. При этом i i исходили из данных литературы, свидетельствующих о том, что, по крайней мерс, некоторые белки В. pertussis эхспрессировапись в клетках E.coli (Sliarek et al. , 1984; Семина и соавт.,1983; Розиноз и соавт., 1986). .

Банк генов В. pertussis был получен на основе фагового вектора А 47.1. В качестве донора ДНК был использован штамм В. pertussis 475 фаза I серсьара 1.2.З., характеризующийся высокой продукцией KT и об.' "дающий типичными иммунобиологическими свойствами возбудителя коклюша. Среди проверенных в количестве 8 тыс. рекомбииангных фагов, нам не удались отобрать фаг, несущий гены KT, что могло свидетельствовать об отсутствии экспрессии генов KT В. pertussis • клетках Е. coli.

Используя данные о локализации генов KT на хромосоме В. pertussis (Locht and Keith, 1987), нами был разработан метод клонирования KT оперона м штамма В. pertussis 475. Схема конструирования приведена на рис. 1. Багк генов В. pertussis 475 полученный, на плазмидном векторе pUC 19 проверяли с помощью молекулярного зонда, представляющего собой 15-члеиньш олигонуклеотид, комплементарный последовательности ДНК и кодирующий Зрелую" N-коицевую часть S4 субъединицы KT. В результате был отобран клон, несущий рекомбинантную плазмиду pRH 119 со вставкой ДНК B.perlussis. размером 4,7 т.п.н. и содержащей оперон KT, чю подтверждалось строгим совпадением проверенных 12 сайтов рестрикции с реглрмкциошюн картой, представленной„ другими авторами (Nicosia et al. 1937). Клоны В. coli JM 107 (pRH 119) были проверены на экспрессию генов KT методом иммупоблотткнга in situ с антисы чроткой к KT и J-I2:,' белкомА, оцнако экспрессия гемоз KT отсутствовала.

Хромосомная jlHK e.psrfus$cs k!5

ilEcoRI .

it Элюция ИЗ ГЕЛЯ 4>pfl.r-___] МЕНТОЗДНК ^?г.п.н.

It. ЯН X-ЛИ ГАЗА фй ГА ТА. ,

| ггрдно4хзрмди.и'Я а клетки Е.соа..-Клоны

IОтбор КЛОНОВ С ПДАЗМИйЛМИ, НЕСУ14ИМИ ГЕНЫ КТ, ПУТЕМ. сЛОШБРИйИЗАЦЯИ LH S.W с {Щ-ЗОЯДСМ 2.РЕСГРИки,1!ОННЫЙ ЛНАЛИЗ РЕК0М6И-ПАНТНОЙ ПЛАамиды.

Рис.1. Схема хонструисоззиия рексмбянантной гиа^мэды рРчН 119.

Прямоугольником обозкачс i промотор гена Lac Z; пунктирной стрелкой - направление транскрипции ггиа Lz: 2; сплошной стрелкой - геноз КТ; дзейкей линией - встроенная часть ДНК B.perlussis, нгсуцая оягрон КТ.

1.2. Получение экспрессии ¡-»нта КТ в угет*яг. Б. со!?.

Отсутствие экспрессии мы объясняем несколькими вероятными 1рлчингми:

1. Промотор КТ оперона является слабь:м промотором з системе Е. cc!i Nicosia ct. al., 1PS7).

2. мРНК генов КТ не стабильна в системе Е. со!5.

3. Между Ььс-промотсром плазмидкого векторэ и КТ сперотом наводится [фагмеиг ДНК размером 400 и.п.. хоторый может содержать нгг'ю >егулятор>;у:о область, например, терминатор транскрипции.

Для проверки нашего предположения (пункт 3) и с ц.лыо получения экспрессии Ю* спероиа гены КТ были "приближены" к Ьас-промотору вектора рис 19. Нами были получены различные делеционные варианты исхсд.юй плазмады pI-i.II 119 (рис. 2).

а. н

б. 6.

I.

PRH121

pRH 122 pRH123

pRH\2h

si

-< I-

S2

i-

Z

S'i S5 S5

Рис.2. Схема получения делеционных вариантов плазмидь: рЕК 119. Толстой линией обозначена векторная часть плазмнды рис 19; гонкой линией - клонированный оперок КТ; стрелками - порядок субъединичной конструкции оперона' КТ и направление транскрипции; вертикальной пунктирной линией - сайты рестрикции для каждого дглсцкошшгс варианта плазмиды рГШ 119.

Клоны с полученными плазчидамм проверяли на наличие экспрессии генов КТ в условиях индукцин ШПТ и без него.

Кг риг. 3 представлены данные иммуноблогтинга ¡п 5ки щ которого, видно, что в штаммах с плаэмидами рИК 121, р>1Н 122 и рГШ 123 экспрессия геиоз 1СТ происходила на разном уровне.

А Б & Г (1 t

ф

Лч

О

е

О U

PkcJ. ИммуН00Л01ТИ11Г клонов in situ. Клоны штамма E.coÜ JM 107, содержащие следующие ¡.лалмкя!.:: Л - pUC .9; Б - рйН 119; В - pRH 121; Г • pRH 122; Д - р!Ш 12., Е - pRH 124; Ж - pRH I22K: 3 рКН 134.

Следует отметить, что зкспрессия имела место только в условиях индукции актсзиоги иримотсра ИПТГ. Приближение гсноз KT :< Lac-промотору р;;зод1=.т к зксгрессм:?, по крайней мере, некоторых генов ХТ, однако при мму^г.блоттингг клеточных дезкнтегратоз, содержащих плазмиды pRH 121, RH 122 л pRH 123, .чам ::е удалось получить четких белхозых зси, дэтзетствукзчих зекам-иатиг 'ых субъединиц KT при элехтроферезе з SDS-!ААГ, т.е. зкспресгля renos KT протекает г- клетках H. соН на минимальном резне.

!.3. Увеличение зуспруссни хгоч»пс«!?нт'* з Е. coü генсз KT g. pertussis п

Следующий этап вхличал в себя работы гто увеличению экспрессии KT з псткг.х Е. c.c.'.l. 3t:í исследования были необходимы, т.к. уровень зхслресснн с слециопнь!5 заризктсз плазмид ке позволял исследовать биологическую ктизность рехомбянантных Целковых продуктов.

На основе плазмяды pRH 522, в которой :te совпадали рамки считывания ля ген! L~cZ я дмсталькой частя S1 субьединицм при

за::скр".пции с Lac-промоторз, нами бт!ла сконструирована рехомбинактная лазмкда рЯН 122К. Не соответствие рамох считыззнкя при ■-рансляции ыло устранено путем вставки 4 я.н. з сайте рестрикции Sali (см. рис. 2). ■ммуксблэттикг in sita показал, что :>: г'экспрессии геноз KT з ссстазг гей плгзмиды г:.п;.;, чем s случке pRH 122 . Но, несмотря на использогаяиг даохозффгхтигнепэ метода ечкепел с '.~;;;>:г/:;ь:о кммупссорбента г эзаггктаэ гтриаатымм гнтктгламя х ХТ, кдгнтлфкакреззтэ 5глкс~ыг рздухты не удалссь либо из-за к я небольшого холичестза, либо кз-зэ ;?а еградации з прсцессе очистки препа, 1та.

Для >:зу;£::кя rs-.'-.ziv/.r. делеций на зхспресеаю ка уровне белхсзыя редухтоз я стабильность мРНХ были псстязлеиы слгдугсщ^;. .эксперименты.

терминаторном ходоне S1 субъедииицы KT оперона по сайту Xba I была :едг:!з Eal 31 делгция размером .42 н.п. Размер деления те затрагивает зследсзательязсть, кодирующую "зрелую" -гастъ субъединкцы S2 я ïî ::дер;:у:с часть. В результате этой операции, а также после перевода гнозь шинной плазм иды pRH 134, в штамм Е. coü SC 122 (НцуК "-"), дефектный и кгхоторым прэтеазам, урсге;:ь экспрессам сущестеслио повысился :м.рис.З). Клетки Е. coli, несущиг ялгзмиду pRH 134 синтезировали только ультимеры кепроаессирозанмой' 32 суЕъединнцы, -тс подтггрждалссь ммупсблсттингом -препаратаЕно очищенного белхизого препарата, рахцксяирсванкдго з ПААГ' (см.рис.4), а также анализом кухлестидкой эследэгзтелыюстз з месте введения делегда и es сразнгикгм с пелкой ^клготидной последовательностью KT оперена (Lccnï atid Ktith, 1987).

й-й А й SS- ^э

V? -fi

Рис.4. Иммуноблоттинг белкового препарата, счищенного с помощью иммуносорбента из клеток Е. coli JM 107 (pRH 134) (А) и

натывного KT из B.pertussis (Б).

GS

-Ss -S4

Протективныг' свойства бглкозых продуктов рекок "инанткой плазмид рГШ 134 были проверены в тесте активной защиты про-п кктрацеребр&лыгого заражения мышей и на СНО-клетк; высокочувствительных к цитстоксическому действию КТ. Одн&ко, аитигсл полученные к очищенному р£к„мбинантному белку не обладали згщитис актишоегью, хотя при титровании актнсывороток мышей в ИФА выявлю высоки нтигенкая активность клонированных белков.

II началу проведения настоящих исследований какие-либо даняь литературы о наличии генов КТ о геномах В.рагарегЦ^Б и В. Ьгог.сЫгсрЦ отсутствовали. Коклюшный экзотоксин синтезируется только в клетк. П.рег1и£5>5 фазы I , в то врлмя как у В. р;г1и.од фазы IV , В. рагар5.г:»5мз В.Ьгсг'1н5ериса этот токсин не обнаруживался (Мипог и., 1935). Учитып; достаточно близкое таксономическое положение различных видов Бордетел мы предположили, что геномы В.рагаргПи.^з и В.ЬгслсЫаерпса мог содержать так называемые "молчащие" 1ены КТ.

Для проверки' нашего предположения в качес.ле молекулярного зон; бы 1 не; «тьзована клонирс игая -ирми ранее послсдокагелыюсгь Д1.1 В.регЦ!^ , содержащая "олный оперой КТ.

? 4 5

Т-П.И.

• <® ф 0В — 4,7

j—4,0

о» — 2,36

© ® ® ® -1,46

-<» <ш :—1,27

о» да в» —0,96

Рис.5. Блотгибридгаация хромосомньи ДНК- различных видов рода Bordetella, рестрицкроваиныя по сайтам EcoRI (на фото нечетные) и Pst I (на фото четные).Слеса направо расположены ДНК:1. B.pertussis 475 фаза IV;

2.B.parapertussis 662-2 (изявертант фагом 134);

3.B.bronchisept!ca 214; 4. B.parapertussu 504 и 17903; 5.В.pertussis 475 фаза I.

к видно из результатов, представленых на рис. 5, хромосомные ДНК чных видов Бордетелл, проверенные методом блотгибридизацйи, жат гены KT, причем картина гибридизации практик уси идентична во случаях. Отсутствие общей полосы гибридизации случае ДНК ichiseptica 214, ресгрицировалной по Pst I сайтам, и появление ее j. ве другого фрагмента может объясняться мутацией в этом сайте, цем в дистглыюй области KT оперена. Следует отметить, что с зондом дизовались ресгрикиионные Его RI - фрагменты всея пр9веренных мов.опинакового размера (4,7 тл.н.). Таким образом нами был сделан t о том, что гены KT присутствуют у всех изученных видов Бордетелл и латаются в идентичных регионах хромосомальной ДНК .

род контролем собственного промотора и клетках В. broncbiseptica.

Полученные нами результаты изучения протектикности S2 субъединицы а также данные других авторов (Nicosia et al., 1988) свидетельствуют о том, что протективные эп ~опы (или Эаитсп) KT являются коиформацнонными, т.е. присущими только полноценному нативному токсину. Кроме того присутсть Л лидерных последовательностей во всех пяти субъединицах KT свидетельствуют о секреции субъединиц в периплазму клетки B.pertussis, где происходит сборка тохсина. Основываясь на приведенных данных, а также данных, изложенных в предыдущей главе , логично было предположить сохранение механизмов посгтрансляционного процсссинга субъединиц, сборки токсина и его транспорта во внешнюю среду у В. broncbiseptica и, следовательно, возможность экспрессии KT оперона в составе рекомбинантной плазмиды в клетках этого микроорганизма.

В качестве штамма - реципиента был отобран штамм В. bronchiseptica , характеризующийся фенотипической стабильностью и отсутствием yen .чивости к канамнцину^ Кроме того учитывалась относительная биологическая безопасность для человека к просгота культивирования бронхосептикозного микроба .

Конструирование рехомбинаитнон плазмиды RSIT I проводилось и два этапа. Ка первом этапе был создан рекомбинантный вектор широкого круга хозяев на основе плазмиды RSF 1010 с введением в него генг канамициаусгойчивости . Источником последовательности ДНК размером 4,' T-ti.il., содержащей оперон KT, служила рекОмбинантиая плазмида pRH 119 В результате генно-инженерных манипуляций была получена плазмид; RSl'T I, в составе которой находился фрагмент ДНК В. pertussis размером 4," т.п.н., несущий полный оперон KT и маркер канамицинуотойчивосги Стабильность наследования данной плазмиды в клетках В. bronchiseptic; высокая , т.к. потеря введенного маркера какамицинустойчиБости а следовательно, к самой к.лазмнды. составляла менее 1%. Схем; конструирования рекомбинантной плазмиды RSPT I приведена iia рис. 6 Методом иммуноблоттинга in sita показано наличие экспрессии генов К1 B.pertussis в клетках В. bronchiseptica .Изучение выделенных и очищенных i помощью афинной хроматографии на иммуносорбентах белков, сшпе: которых детерминирован плазмидои RSPT I показало, что в данном случа; происходит синтез полноценного KT, причем рекомбинантный токем транспортируется из клетки в культуральную среду.

IIa сновании полученных нами результатов экспрессии KT в клетках 11 broncbiseptica было изучено распределение рекомбинантного продукта межд микробной клеткой и внешней гредой. Счищенный с помощьи иммуносорбента рекомбинантный продукт из клеток и культурально-

i юлiii-xm

выдоенный из культурглыю.. жг л кости штамма В. bio:ichi¡c¡nicn 8220-1 (RSPT I ) и KT из к нтролмюго штамма B.pertussis Tobama имел'

одинаковым субъсдиничиый состав, а электроферетмческая пслннжш отдельных субъедикнц также была идентичной (см. рпг 7).

ып

йНК Тиб

ВотН!

неа

ЫИ+ВатШ г.Элюция из геай фрагмента йм , нгсуцсго гьг1 пеог, роИКёепоу

"С 3. Т4-лигаза

ПВО

ЕсоЯГ

ЕсЛ1 4

З.Г4-Д1ША

■¡г

Есой!

2.3ЛЮЦИЯ ИЗ ГЕЛП ФРАГМЕНТА Ш НЕСУЩЕГО ГЕНЫ

ЕсоК I

1Ш1

Xх;

псог

Гис/>. Схема конструировани,-! рекомбинантной плазмидм КБГТ I. Тонкой линией обозначена векторная часть плазмид ИЗР 1050 и р!Ш 119; толстой линие*! -клиннрозан-лый опгрон КТ; двойной линией - ген канамсциноезистентносги.

Таким образом нами получена экспрессия коклюшного экзот лссина П.рег!!.«^ в клетках В.ЬгопсЫ^ери'са, при этом имел место транспорт полноразмерного КТ в культуральчуго среду.

А Б

Рис. 7. Электрофорез препаративно очищенного рексмбинантного КТ из клеток И.Ьгопс1пзер11са 8220-17(А). В -ачрегве контроля взят очищеш.^й КТ из клеток В.реПииЬ. (Б).

То*сичн(*.ть рекомбинантного КТ из В. ЬгопсЫьерПса 8220-17 тестировали в опытах на животных (леккоцитезетимулирующая активность (ЛСА) и на чувствительных к КТ летках китайского хомячка (СНО -тест) .

ЛСА для рекомбинантного препарата превышала ЛСА отраелгвого стандартного об, лца (ОСО-3), но Оыла мгчыие чем у КТ из клеток В.регИши ТоЬаша, а тест на СНО-клстках показал высокую токсическую активность рекомбинантного КТ, сравнимую с токсичностью КТ из штамма Врег ши5 ТоЬата.(см.'табл.1).

Таблица!. Токсическая активность препаратов КТ, полученных

из шт:1 ммоа В.рсг1ии!з ТоИдта. В.Ьгог.с1тср1ка 8220 и 8220-17.

Штамм Доза по Количество Индекс Довери- Титр

белку лейкоцитов ЛСА к тельный í

(мкг) (при п=3) ОСО-3 интервал

ТоЬата 25 60 000 7,64+0,02 2,31-3,02 10"*

В.Ь. 8Г1 25 8 000 0,35+0,012 0,22-0,46 10"г

В.Ь.8220-17 25 35 000 1.53+0,08 1,23-1,74 10"8

ОСО-3 22 900 1,00+0,02 0,98-1,02 10"3

Примечание. Данные в таблице представлены как результат 3-х опытов.

Кластер-эффект на СИО-клстках развивался в течении 36-48 час.

Результаты наших опытов свидетельствуют о том, что клетки В ronchiscplica сохраняют механизм процессинга субъединмц KT, его сборки л эанслорта. Причем рекоыбинантный KT, синтезируемый клетками В. roncbiie^iica, имеет Сиолотческую активность и субьединичное строение, эавшшое с KT В. pertussis , по двум тестам, а также по результатам яехтрофореза в SDS-ПААГ и нммуноблоггинга с антителами к KT .pertussis.

.3.2 Экспрессия генов KT В. pertussis р составе рехомбинакт"ой плазмпды оп контролем Lâc-промотора Е coli в клетках В. broncHiseptica. Промотор KT ¡элерона можно отнести к разряду слабых, что подтверждено модельных экспериментах по экспрессии САТ-белка о клетках Е. coli N'cosia et.a!., 1987). Выявленное соотношение Kej.o3fl прямо экстраполировать а микроорганизмы рода Bordetella, поскольку микроорганизмы этого рода ме.ют выраженную позитивную vir-зазиснмую регуляции, экспре' ии KT Weiss, 1986). Сложность и ¡едостаточная изученность регуляторных 1ехапизмов у B.bronchiseplica "е позвол? т пока оптимизировать условии хспрессин генов KT с собственного промотора в клетках B.bronc'-iseptica. (апример, нам не удгвалось синхронизировать культуру по фазовому остоякшо, что приводило к накоплению клеток и авирулентной фазе, не |родуцирующих токсин.

Указанные сложности обусловили необходимость создания эффективной истемы экспрессии КТ,- независящей от механизмов регуляции клетки-|ецепиента; основанной на использовании сильного . гетерологичного ¡ромотора.

Нами была конструирована рекомбннантная плазмида pOV 3R, несущая в воек» составе гены всех пяти субъединиц KT с заменой природной 1ромоторной области tsa промотор гена LacZ Е. coli. В качестве донора еннэ-инженерной Koiicrpyi ции "промотор LacZ - оперон KT" мы н-полмовали полученную ранее плазмиду pRH 121, являющуюся модификацией рекомбкнантнзй плазмпды pRHU9 в результате делеции по айпм рестрикции Крн 1 в проксимальной области сперона KT. При это из ¡езультатоз наших исследований следует, что дачная делеция в 450 ч.п. 'даляег терминатор транскрипции, находящийся между промотором н )бластью структурных генов KT. В качестве сектора была выбрана 1екомб.чнантазя плазмида широкого круга хозяев pOV 13 (Захаренко с соавт., L939), несущая маркер устойчивости к ганаммцину, сульфаниламиду, тетрациклину и стрептомицину. 3 результате генно-инженерных манипуляций была получена рскомбинантнач плазмида pOV 3R, схема {онструировапия которой приводится на рис. В .

Метолом криотрапсформпции плазмида pOV 3R, была передана в клетки 3.bn>nchù?ptica. Штрчи,, обозначен как Б bronc'iii optici 8220-13 (pOV 3R). Kar i в случае сконструированного ранее um мм* B.b'onchist^tica 8220-17 (Р"РТ1), нучены иммунобиологические и '¡""чго-гнмичеекме свойства эскомбиианшого препарата KT. Клон В. brcnct'ivcptica 8220-13 продуциро-гл

рккомбинактный КТ, о чем свидетельствовали результаты иммуноблоггн in situ, пре^-.-тавлениые на рис. 9 . причем хлоны, содержащие плазм! pOV 3R, имели существенно более сильный сигнал, чем клоны содср«аи плазмнду S4SPT 1. Это позволяет сделать вызод, что уровень экспрессии клетках B.bronchisepti'i 8220-13 выше, чем в клетках B.broni;hiscpiica 8220-17.

Pvuïï. EcoRî4

1 PvuH

2.ЭЛКШ ИЗ ГЕЛ5 ФРАГМЕНТА ДНК.Н^СЧЩЕГО ГЕНЫ КТ ПОИ КОНТРОЛЕН Uc-ПРОМОТОРА Е.со 3. Т4-/1ЙГАЗА

PvU.il \ Eco Ri

tcoRI

Рис.8. Схема конструировапп; ¡'скомбинантной плазмвд. pOV 3R. Обозначен .я как in рис. 6.

б

Щ> в

ê г й

Рис.9. Иммуноблоттиш in situ клоноз B.bfonchiseptica 8220-12 (ряд А и Б); B.p.erlussis 475 (ряд ' В); B.bronchiseptica 8220-17 (ряд Г); очищенный КТ из клеток B.periussis (ряд Д).

С целью характеристики распределения рекомбинантных Оелк'ты» родуктда между клеткой и внешней средой рекомбинантный КТ бк.1 сделен и очищен на иммуносорбенте с антителами к К1\ След! г отметить, что лишь незначительная часть рекомбииантпсш 1\Т .¡ходит з культуральную среду, тогда как основная его масса накапливается £угри клеток. Нами достоверно установлен только один случайте* .тпры-ани;* Т в культуральной среде. Электрофоретическнй анализ препар; гоа КТ шосадочной жидкости и клеток В. Ьгопс!шерпса 8220-12 в БОЗ-ПЛДГ .■явил характерное для нати^чого токсина распределение по юс п гол :, [алогичные препарату КТ из клеток В. ЬгопсИнерПса 8220-17 и И.рег;щ.1!5 )1тата. Однако в случае препарата из клеток В.Ьгопс1щерИ'са 822013 н; |)и;.у полосами, соответствующими субъедиж.лам нативного токсина, шсутствуют другие мощные белковые зоны. Проверка методом шуноблоттинга на НЦ-фильтрах подтвердили иммунопозпгш носа характерных белковых зон в "реках с препаратом КТ из В.ЫопсЫ .ерм'са 20-13 (см.рис.Ю). „

А Б В Г

55!=й1*я=э «ТЗКГТЕ»» О-'-.Л.—-*.'«

Рис. 10. Иммупоблотгннг препаратов КТ, выделенных из: А. - клеток В.ЬгопсЫзер'^са 8220-13: Б - клеток В.Ь:опс'1!5ерп'са £220-17; В - культур ал той среди в.Ьгопс1л$ер11'са 8220-17: Г - КТ,очищенный из клетп;: 13 рсг1и5515.

шные результаты могут объясняйся накоплением в клетках бол лого 1честза непроцессированмых субъсдипчц рскомбингнтного КТ и •.■х атов. Поскольку в культуральной сп«? и клерках В. ЬгопсЫя-р'Лсз 8220 ?

присутствует нативный токсин, го .предположительно, имеет ме супер жспр^-сия генов КТ под контр тем Ьас-промотора, однако возмож мастичное нарушение механизмов процессинга и транспорта КТ в клет В.ЬгонсЫзерПса не позволяет всей массе наработанных субьеди! воссоединиться в пс ноценный токсин.

Другим объяснением это! -ч факту может служить то, что наруше; эквнмоляриых соотношений между субъединицами в процессе их спнете свою очередь также могут приводить к нарушению механизма сбс] нативного токсина. Кроме того, мы не исключаем того, что белки больи молекулярной массы могут быть синтезированы как слитые в результ транскрипции част'* оперона КТ с векторного промотора, либо трансляции и субъеднниц в составе единого белка в следствии сунресси стоп-кодон конце гена субъединицы.

Полученные препараты КТ из клеток В. ЬгопсИ^ериса 8220-13 бь проверены на биологическую активность в тесте на СНО клетках. Рсзульта приведенные в таблице 2 и 3 свидетельствуют о том, что рекомбинантн препарат К.Т, выделенный из клеток В.Ьгопс1н5ер1ка 8220-13 при уро продукции, превышающем уровень продукции в клетках В. ЬгопсЫхсрпса 82 17 .1 сравнимым с уровнем продукции а клетках В.рег1!55)5 ТоМата, прояв; токсическую активность на порядох ниже, чем рекомбинантный КГ В.ЬгопсЫьег'са 8220-17.

Таблица 2.0прсделение ¿оличествч КТ с помощью иммуноферментного

анализа на НЦ -фильп

Источник токсина ИФА-Нц (м к г/мл) СНО-тест (биологическая активность) мкг/м/

П.Ы опсМ>ерИ'са 8220-17. 0,93 + 0,07 1,00

В.ЬгопсЫ$ср(1са ¡,-20-13 2,30 + 0,0о 0,20

О.ЬгапсЫ.<;ериса 8220 0,00 0,001

Примечании данные о таблице представлены как результат 3-х опытов.

Значения оптической плотности проводили при 492 нм .

при определении КТ с использованием НЦ-фильтров.

Отчасти это можно объяснить тем, что на единицу массы рекомбинантн продукта в клетках В.ЬгопсЫзер^са 8220-13 приходится большее количес испроцгсснропаиных субъедикиц и агрегатов этих субъедиииц, тохсичес; активность которых ниже, чем у целого КТ. Другим возможным объяснен* полученных результатов могут оыь конформацпонные изменения в струхт рскомбииантного КТ аеизьестмой природы, которые еще предел установить. Рекомбинантный препарат, имеющий близкую к нагивне токсину структуру и низкий уровень токсической активности, мох (■иссматрииагь как желаемый компонент современной бесклеточ; кох.иошной лакни и 1,1.

Таблица 3. Результаты определения биологической активности KT, зкспресслрусыого в сосгаве рекомбинантных плазм ид RSKT I 11 pOV ?.

i.bronchiseptica B.bronchiseniic: B.bronchisentica KT Tiup

220 8220-17 8220-13 (стандарт)

+ -t- -t + + 1С"

+ - + -r + + + + 10*г

- - + + + + + ю-4

- - + + + + + + К'4

+ + 4. + + Ю-5

+ _ + + 10"6

_ _ + + к""

- - - - - - - - ю"3

Примечание. Концентрация ' Г (стандарт) 100мкг/мл. Концетрация белка в осветленных лизатах B.bronchiseptica 8220,8220-17,8220-13 - 4,5 мг/мл.

Полученные результаты показгии, ':то: во-первых, B.bronchiseptica является ерспективным реципиентом для создания продуценте». протектизных нтигенов B.pertussis, основным из которых, по современным представлениям, зляется коклюш/ ш экзотоксин; во-вторых, продукция рекомбннантного KT • клетках B.bronchiseptica может быть повышена при использовании сильных терологичных промоторов для экспрессии структурных генов KT.

ВЫВОДЫ

1. При клонировании генов коклюшного экзотоксина B.pertissis в клетах .coli установлено, что:

- промотор оперона коклюшного токсина не работает в системе Е. cot':

- экспрессия геиоз коклюшного тс сина возможна при замене нативного ромотори на Lac-промотор Е. coli;

- рекембинантиый белок, состоящий из днстальиой части части генэ LacZ - ' S2 субьпдиянцы коклюшного токсина, не обладает протектиьнои

ктивностыо в тесте защиты мышей от интрацеребрального заражения четками B.pertus&i

2. В составе гсномоз близкородственных гидов B.pnrapertussis и .broncliiseptica обнаружены так называемые "молчащие" гены KT, аходящисся з нефункциогальком состоянии.

3. Сконструированы рекомбимантиые плазмиды RoPTI pOV3R,детерминирующие синтез reif i коклюшного токсина B.pertussis клетках В. bronchiseptica под контролем собственного промотора и La промотора li.cuü.

4. Па основе реком^чнаитных пла^мид RSPT I и pOV 3R созданы штамм продуцгчты коклюшного экзотс сила в клетках В. bronchiseptica.

5. Полученные штаммы В. bronchiseptica 8220-17 (RSPT Î) и 8220 ' (pOV3R) продуцируют рекомбипантный коклюшный токсин, неотличающиГк по своим биологичссхим и физихо-хнмичсским свойствам от нативно; токсина В. pertussis. В случае штамма В. bronchiseptica 8220-13 (pOV3R) nf урорче продукции, -^авнимом с уровнем продукции з клетках В. pertusí Tohama, наблюдается снижение токсической активности рехомбинантно: препарата коклюшного токсина.

Смисох работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Клоннрозанис и экспрессия. генов ЛСФ B.perUissis в Е. coli путг приближения гепоз х лактозиому промотору плазмиды pUC 19 (М.Н.Розш:с

A.АЛайн, JC Л.Шумаков и др.), ЖМЭИ, 1988, N ,, с. 86-90.

2. ^.дентификаци« белковых продуктов оперона JICO B.pertuss клоиирогалного в Е. coli (М.Н.Розиное, ЮЛ.Шумакоз, А.АЛайн и д; Ж.^'ол. генетика, михребиол. и вирусол.", 1987, N 12, с. 20-26.

3. Обнаружение последовательностей геноз ЛСФ B.pertussis C.bronclsiseptica с помощью молекулярной гибридизации (М.Н.Рознщ ЮЛ.Шумаков, А.А.Дайн и др.), ЖМЭИ, 1988, N 4.x. 90-93.

4. T.A.Holzmay^r, A.A.D;'in, Yr.L.Shi..nakov, V.N.Gershanovich. Pertussis tea operon exprcssis in E. coli two trancatcd fragments of SI subunit. FEW'S Symposium on B. pertussis, 20 - 22 april, 1988, Berlin, GDR.

5. ЮЛ.Шум^оз, В.М.Госоруи, Е.В.Нечаева и др. Плазмиды, кодируют синтез коклюшного тохеина, в клетках В. bronchiseptica. Характеристика свойства полученных препаратов. В сборнике тезисов Всесоюзна конфер.нции Микробиологического Общества "Бактериальные плазмид: Нальчик, 1990.

6. М.Н..Роэиноз, А.АЛайн, ЮЛ.Шумаков, Т.А.ГольцМаЙ!

B.Н.Гершаноьич, И АЛапаева. Рехсмбинантная плазмидная ДНК рХЕ Ъ кодирующая субьсдиницы ЛСФ В.pertussis: способ ее получения, штамм Е.с К-12 í^Bg 2244 - продуцент субъединчц ЛСФ В. pertussis. Иоложительп решение Гос. Научно-технической экспертизы на авторскую заяв; 30,01.1987г., N 4187255/13.

7. М.ШЧшшпв, А АЛайн, ЮЛ.Шумаков, Т.А.Гольцмайер. ИЛ.Амелш м.П.Гсршг.нович, И.АЛапасг.а. Рекомбинантная плазмидпак ДНК рКЕ 7. кодируют?.!, псе пять субьедипиц ЛСФ В. pertussis: способ et получен!

штамм E.coü К-12 L Bg 2242 - продуцент ЛСФ В. pertussis. Положительно? решение Гос. Научно-технической экспертизы на авторскую заявку. 11.05.87. Л< 4242205/13.

8. ICJL Шумаков, ИЛ. Лапаева, Е.В. Нечаева, Г.И. Каратаев, В.М. Говорун, Л.Н. Снняшина. Рехсмбшшгтная плазмида RSPT I, кодирующая спите i коклюшного токсина и штамм В. bronchiseptica 8220-17 - продуцент биологически ахтивного коклюшного токсина. Положительное рсмение Гсс. Научно-технической экспертизы на авторскую заявку. 27.07.90.

N 4749/13-127735.