Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетический анализ движения бактерий при хемотаксисе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетический анализ движения бактерий при хемотаксисе"

• РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСГОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

Р Г и С Л На правах рукописи

,. - ; 1 ; о '->

ЗАВАЛЬСКИЙ Леонид Юлианович

КИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДЫИЕНИЯ БАКТЕРИЙ ПРИ ХЕМОТАКСИСЕ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО - 1993

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии Государственного концерна "БИОПРЕПАРАТ"

Научные руководители: доктор технических наук В.Н.Брезгунов доктор химических наук В.Я.Волков

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук В.В.Смолянинов кандидат физико-математических наук А.Б.Медвинский

Ведущая организация: Институт биозимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится 1993 г. в

часов на заседании специализированного совета Д 200.22.01 Института ¡теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская область, г.Пущино, ИТЭБ РАН

О диссертацией модно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан "23 " _1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета ^ кандидат биологических науя"^ ^

П.А.Нелипович

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Явление хемотаксиса бактерий, то есть направленного движения клеток в ответ на действия химических раздражителей, начиная с опытов Адлера в 1966 году по настоящее время является предметом пристального и всестороннего изучения учеными разных специальностей. В целом система хемотаксиса микроорганизмов интересна уже тем, что является простейшей системой ор-ганизменного реагирования на переменные условия внешней среды, и хотя до сих пор детальные механизмы функционирования этой системы остаются невыясненными, система хемотаксиса бактерий к настоящему времени остается наиболее полной изученной клеточной подсистемой. В связи с этим важным представляется детальный анализ результативной стороны хемотаксиса - собственно движения клеток, как реакции на пространственные и временные изменения внешних условий.

Попытки найти адекватное математическое описание движения бактерий при хемотаксисе предпринимали многие исследователи. При атом все придерживались одного из двух подходов: феноменологического, моделирующего движение популяции бактерий как волновой процесс, либо микроскопического, выявляющего характеристики движения отдельной клетки после воздействия на нее изменяющимися концентрациями хемоэг^ектора. В настоящей работе впервые сделана попытка объединить оба эти подхода в рамках единого кинетического уравнения, связать феноменологию и микродвижение в единое целое.

Цель работы. Состоит во всестороннем исследовании и анализе движения бактерий при хемотаксисе на основе предложенного кинетического подхода.

Научная новизна работа. Предложен совершенно новый метод исследования движения популяций микроорганизмов - кинетический, отличающийся от других существующих тем, что объединяет в себе как микро-, так и макроскопический подход к движению, а потому реша-

ющий одновременно двуединую задачу: как исходя из микропараметров движения одной клетки спрогнозировать движение целой популяции в изменяющихся условиях окружающей среды; как исходя из известного пространственного распределения клеток выявить характеристики отдельно взятой клетки. Детально проанализированы все входящие в кинетическую модель параметры и выявлена их связь"с физиологическими факторами клетки. Впервые объяснен эффект образования и дет. :ения бактериальных полос в средах с переменным химическим составом'и доказано, почему этого нельзя сделать в границах традиционного диффузионного подхода. Подсчитан оптический эффект, связанный с направленным движением клеток цри хемотаксисе. Предложена модель жгутикового мотора и на ее основании подсчитан эффект вязкости среды на движение клеток. Продемонстрирована возможность полного разделения различающихся по хемотакси-ческой активности штаммов, обнаружена корреляция хемотаксиса бактерий с их■энтомопатогенной активностью.

Практическое значение работы. Адекватное описание движения бактерий при хемотаксисе может иметь широкое распространение в разделе экологии микроорганизмов, поскольку оно позволяет предсказывать поведение как одной клетки, так и серии конкурирующих между собой популяций в условиях изменяющейся окружающей среды, а также по внешним признакам распределения клеток в пространстве выявлять физиологические характеристики отдельно взятой клетки. Кроме того, впервые предложен новый способ определения с помощью реакции хемотаксиса присутствия в среде следовых концентраций биологически активных химических веществ. Предложен быстрый количественный- способ определения концентрации антибиотиков с использованием в качестве тест-системы хемотаксиса бактерий. Разработан способ разделения бактерий, различающихся по хемотакси-ческой подвижности. На примере штамма ВТ-НЗ цродемонстрирована

корреляционная связь между хемотаксической подвижностью и энтомо-патогенной активностью клеток.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, получено два авторских свидетельства об изобретении, подготовлена к печати монография. Результаты исследований неоднократно докладывались на Всесоюзных конференциях и совещаниях.

Апробация. Диссертация апробирована на заседании ученого совета ГосНИИ ПМ государственного концерна "БИОПРЕПАРАТ".

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора Литературы, изложения собственных методов исследования хемотаксиса, кинетической модели хемотаксиса бактерий, описания модельных экспериментов, обсуждения, выводов. Диссертация изложена на 85 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и фотографий и 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе I суммируются все накопленные к настоящему времени в литературе сведения о движении как отдельных бактерий, так и популяций, подробно рассматривается механика движения отдельной клетки - с тем чтобы быть положенной в основу развиваемой далее кинетической модели.

В главе 2 предлагаются два метода исследования хемотаксиса. В первом /Рис.1/ Используется фотометрическая кювета, на дно которой при помощи микрошприца или перистальтического насоса наслаивается исследуемая культура клеток, а в раствор добавляется заданной концентрации хемоэффектор. йиа сконструирована специальная установка, включающая лазерный облучатель клеток /гелий-неоновый лазер/ и фотоприемник для регистрации рассеянного излучения под различными углами /Рис.2/. Установка позволяет автоматически отслеживать форму и скорость движения "бактериальных полос"

Рис Л. Миграция "бактериальных полос" различных штаммов

ВТ-НЗ в градиенте растворенного в воде кислорода/фото/.

Рис. 2. Схема установки для регистрации "бактериальных полос".

12 3 1 5 6 7 8 9 10 П 12

расстояние - /мм/

1 2 5 4 5 6

ю 11 У2

расстояние /мм/

Рис.3. Временное распределение концентрации клеток Рэ.аеги^'-пойо. вдоль оптической кюветы в реакции на растворенный в воде молекулярный кислород /Ю~%/ и /-серин/1СГ2М/. Исходная концентрация клеток 6х10^кл/мл. а - исходное распределение клеток; б - через два часа.

в пространственных градиентах химических веществ и регистрировать результаты измерений на самописце /Рис.За,б/. Характер полученных кривых оказался видоспецифичен для разных штаммов, а потом,, методика может применяться для идентификации и контроля за хемотаксисом бактериальных клеток.

Второй способ исследования хемотаксиса базируется на предсказанном теорией изменении светорассеяния ориентирующихся при хемотаксисе клеток /Завальский и др., 1984/. Это экспресс-методика количественного и качественного измерения хемотаксической реакции, она подробно излагается в диссертации.

В главе 3 детально излагается кинетический подход к моделированию хемотаксиса бактерий. В основу модели кладутся результаты опытов Берга и Брауна /Вег^, В го «Г/г , 1972; Вгл^п , Ве/у , 1974/, а также согласующиеся с ними результаты исследований группы Кошланда /^)al^¿(ju^(¡i/ ¿ойе£д} ко$Ь¿аы/, 1975/ по исследованию характеристик движения отдельных бактерий. В однородной среде бактерии двигаются по ровным, почти прямолинейным траекториям в течение относительно продолжительного времени А-- 1сек/ с короткими периодами остановок и "кувырканий" на месте 0.1 сек/. После "кувыркания" направление нового движения квазислучайно. В неоднородной среде соотношение времен "плавания" и "кувыркания" клеток меняется. Основные положения кинетической модели следующие:

1. траектория движения бактерии представляет собой ряд последовательных прямолинейных отрезков в пространственно-временной области ¿У ;

2. все участки ровного плавания бактерий характеризуются постоянной скоростью движения У и направлением движения п ;

3. время изменения направления движения /так называемое "время кувыркания"/ пренебрежимо мало по сравнению со временем

плавания f по прямолинейному участку траектории и полагается равным нулю;

4. частота кувырканий клетки # //= ^ - величина, обратная продолжительности пробега/ задается вероятностью распределения, зависящей- только от направления траектории;

5. функция плотности вероятности для частоты кувырканий представляет собой спадающую экспоненциальную функцию У ;

6. угол между двумя последовательными отрезками с направлениями П и П задается вероятностным законом В(л }Г\) и не зависит от направления, продолжительности и скорости движения клетки

по предыдущей траектории /для бактерий E.col I функцияJZftíJ/f) измерена Бергом и Брауном/;

7. все бактерии в группе считаются идентичными.

Вообще говоря, условие 3 о равенстве времени кувыркания нулю не является обязательным для построения кинетической модели движения популяции, однако существенно упрощает вычисления и не сильно "загрубляет" модель.

Бактериальный хемотаксис определяется по существу условием 4, то есть зависимостью функции от направления движения клетки h . В общем случае функция <5 представима в виде:

. ve) /i/

> vc)

где 7 С - вектор градиента хемоэффектора.

Далее в рассмотрение вводится функция £ , которая является плотностью распределения бактерий по направлениям движения П в окрестности точки 1~ в момент времени ~Ь . Плотность /концентрация/ бактерий ё выражается через функцию усреднением по всем направлениям движения:

áí sí?'*'*)"1*

/2/

. Рассматривая движение группы однородных бактерий в пространстве пренебрегая ростом и гибелью клеток, когда общее число рассматриваемых бактерий остается неизменным, а состав популяции и свойства входящих в нее клеток постоянны, из условия баланса с учетом перечисленных положений модели можно написать интегро-диффёренциальное уравнение кинетического переноса даш функции :

ЩШ +

Я'

Начальные и граничные условия должны быть заданы для конкретной задачи. Уравнение /3/ дополняется уравнением, описывающим диффузию и потребление.субстрата-хемоэффектора:

где 7) - коэффициент диффузии хемоэффектора, К (с) - скорость потребления субстрата бактерями.

Система уравнений /3/ - /4/ в рамках принятой модели полностью описывает движение гомогенной .популяции бактерий в пространственно-неоднородной среде.

Параметры 1Г и 2) зависят от вида бактерий и легко определяются из микроскопических наблюдений.

Для функции используется следующее соотношение:

„ ✓ Г . ¿С 1 /с/

где - частота кувырканий клеток в однородной стационарной среде.

Значения ¿С и Кд могут быть измерены независимым образом в реакции специфического взаимодействия рецепторов Е0 с субстра-том-хемоэффектором /согласно уравнению Михаэлис-Ментен/. Величи-

на Зо - может быть найдена экспериментально путем микроскопических наблюдений за отдельными бактериями и усреднением по ансамблю.

Средний угол и функция распределениямежду двумя последующими направлениями движения и Я также могут быть измерены экспериментально /ВгоиГп,6еп^ , 1974/. функции эти видоспе-цифичны и зависят от вязкости среды.

Таким образом, все входящие в систему уравнений /3/ - /4/ параметры допускают возможность независимых экспериментальных измерений. Поэтому система /3/ - /4/, имеющая общий характер, в принципе применима для решения любых задач движения популяций однородных бактерий при условии, что выполняются требования модели 1-7. Система эта является полной, удовлетворяет условиям Копш и имеет единственное решение.

Рассматривая движение клетки с равномерной скоростью т/ в среде с осевым градиентом концентрации, составляющей с направлением оси угол, косинус которого обозначим черезу^ , для получим:

¿с - 2* + ^¿м

Ы.-Ь - 9х ) > /6/

№ /л/

где определяется из /4/.

Численные оценки экспериментальных данных по миграции бакте-

Об

риальных полос показывают, что величина в этих экспериментах обычно на порядок /в 10 раз/ больше расчитанной по формуле /4/ величины . Пренебрежение временными изменениями концентрации хемоэффектора за время одиночного пробега бактерии означает переход К "пространственной" рецепции от "временной". В диссертации подробно анализируется именно этот случай.

После подстановок всех функций в уравнения /3/ - /4/ и разложения всех функций в ряды по полиномам Лежандра, в главе 3 вы-

водится бесконечномерная система дифференциальных уравнений в частных производных первого порядка:

ъ-ь 3 Эх

2± & Эх. 9 рх. ~...........

где к-й член разложения плотности распределения бактерий £ по направлениям движения^ ; запись £ означает суммирование по индексу к от 0 до Оо ; '

< - Щ^-ЩТ

/7а/

/76/ /7в/ /7г/

где Рй - полиномы Лекандра а? -й степени, Х,у. ^ (Ч?)- модифицированные сферические функции Бесселя первого рода, а функция.

и7* .2L.iT /8/.

I Г^ + с)2 %

В главе 3 подробно исследуется система 7 и при условии-^ = о для всех 2 из нее выводится основное диффузионное приближение:

М /9/

где

*>; - ™

Уравнение /9/ с коэффициентами /9а/ и /96/ получено без ограничений на величины градиентов концентраций, определяемых функцией V . В частности, если рассматривать движение бактерий в малых по величине градиентах, когда Ц, в /9а/ и /96/ можно пренебречь членами разложения высокого порядка малости. Тогда вместо /9/ получим:

Й- £-п

ЗУв £ 3 /ю/

Уравнение /10/ по форме совпадает с известным уравнением Кел-лер-Зигеля /Ке^&у^ , 1971/, однако в /10/ все функциональ-

ные параметры имеют четко определенный физический смысл. Важно отметить, что анализ экспериментальных данных Адлера /ке(Се.г , 1966/ по наблюдению "мигрирующих полос "Ё.соП показывает, что в области нахождения полосы, где величина градиента хемоэффекто-ра максимальна, значение функции

У,

вычисленной по формуле /8/, достигает значений ^ / . Поэтому при вычислении точной формы "полосы бактерий" переход от более общего уравнения /9/ к уравнению /10/ неправомочен.

Предложенная кинетическая модель в принципе позволяет исследовать не только характер движения популяций, но и динамику образования "бактериальных полос", а также более "тонкие" эффекты, связанные с ориентацией клеток при хемотаксисе. Обсуждение этих эффектов приводится в главе 3.

- 12 -

'Б главе 4 получают практическое развитие следующие из кинетической теории методы исследования клеток бактерий. Использование этих методов основано на существовании глубинной, часто еще не исследованной, связи системы хемотаксиса с другими клеточными системами, как жизненно важными, так и вспомогательными: реакция на УФ-облучение, энтомопатогенная активность клеток, используемых в практике защиты растений, температурные и химические воздействия. Во всех перечисленных случаях на специально спланированных модельных экспериментах показано, что систему хемотаксиса бактерий можно использовать в качестве биосенсорной тест-системы для изучения воздействия на клетки разнообразных физико-химических факторов. В частности, разработана и отлажена методика быстрого количественного определения концентрации антибиотиков в среде с использованием хемотаксиса бактерий. На Рис.4 в качестве примера приведены зависимости кривых полосообразова-ния бактерий при хемотаксисе от дозы УФ-облучения клеток.

Рис.4. Относительное содержание бактерий Е col I К-12 в полосе после Уф-облучения популяции 100 Вт кварцевой лампой.

- 13 -

выводы

1. Разработана оригинальная кинетическая модель движения бактерий в средах с неоднородным химическим составом, проведены экспериментальные оценки, показывающие адекватность модели для описания ряда явлений, возникающих при движении популяций в пространственно-неоднородных химических средах и в средах в переменным во времени химическим составом. Получена математическая связь между макропараметрами движения популяции и микропараметрами движения отдельной клетки. Показано, что повсеместно используемая для описания пространственного перемещения клеток при хемотаксисе модель Келлер-Зигеля входит в предлагаемую модель как частный случай и не объясняет многих явлений, следующих из кинетической модели. Найден параметр сингулярности, определяющий границы применимости традиционного диффузионного подхода к описанию перемещения популяций клеток.

2. На основании кинетического подхода предсказан и подсчитан . оптический эффект изменения светорассеяния направленно движущихся при хемотаксисе клеток. Проведены численные расчеты э№ек-та, подтверждаемые экспериментом.

3. Проанализирован эйЛект вяжяния вязкости среди на скорость движения подвижных бактерий в растворе. Предложена модель, объясняющая существование для клеток оптимальных значений вязкости среды, при которых скорость движения клеток достигает наивысших значений.

4. Сконструирована и апробирована лазерная установка для слежения за бактериальными полосами, с ее помощью измерены характеристики движения полос.

5. Обнаружена отрицательная корреляционная зависимость между хемотаксисом клеток ВТ-НЗ и их энтомопатогенной активностью. 5. Разработана методика разделения на колонках различающихся

по хемотаксису бактериальных культур. Доказана практическая осуществимость полного разделения клеток по хемотаксическим цризнакам.

7. Разработан простой метод диагностики окружающей среды, использующий в качестве тест-системы хемотаксическую систему бактерий. С его помощью выявлено действие на клетки таких физико-химических факторов как: воздействие Уф-облучением, температурой, химическими агентами. Метод удобен для использования в качестве экспресс-методики для изучения влияния на клетки внешних воздействий.

8. На основе хемотаксиса разработана тест-система быстрого количественного определения концентрации антибиотиков в среде, а также следовых концентраций ряда химических веществ - отходов промышленного производства - в воде, почве и воздухе.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЫЛЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Брезгунов В.Н., Завальский Л.Ю., Олейников P.P. Динамика пространственного распределения популяций бактерий при хемотаксисе.// Тез.докл.стенд.сообщ. I Всесоюз.биофиз.съезда.-Ы.,1982.-Т.3.-

С.15-16.

2. Завальский Л.Ю., Светогоров Д.Е., Брезгунов В.Н. Изменение оптической плотности суспензии бактерий при хемотаксисе.//ДАН СССР,-1984. -Т. 289. . -С. 488-491.

3. Завальский Л.Ю., Светогоров Д.Е., Брезгунов В.Н. Кинетическое описание движения бактерий при хемотаксисе.//Биофизика.-1985.-Т. 30.-JH.-С. 93-97.

4. Завальский Л.Ю. Влияние вязкости на движение и хемотаксис бактерий .//Биофизика.-1866.-Т.32.-С.83-86

5. Завальский Л.Ю. Основы разделения клеток по физиологическим признакам.//Архив ГосНШ ПМ.-1983.-Раздел отчета по теме ИПМ-2081.-9с.

6. Соломин Н.С., Завальский Л.Ю. Расчет специализированной камеры

для разделения клеток.//Архив ГосНШ Ш.-1984.-Раздел отчета по теме ИШ-2584К.-6С.

7. Завальсккй Л.Ю., Соломин Н.С. Модель движения бактерий в цилиндрической камере с вращением.//Архив ГосНИИ ПМ.-1984.- Раздел отчета по теме Ш.!-1884.-5с.

8. Завалъский Л.Ю. Алгоритмы и набор программ "CHEMOTAXIS" дош анализа двикения и разделения клеток в камере с вращением.//Архив ГосНШ ПМ.-1984.-Приложение к отчету по теме ИПМ-1884.-29С.

8. Завальский Л.Ю. Экспериментальное выявление ориентационных эффектов при хемотаксисе.//Архив ГосНШ ЕМ.-1984.-Приложение к отчету по теме ИПМ-1884.-8с.

10.Завальский Л.Ю. Хемотаксис бактерий рода ?4.aerußinojA и Р4. cepacia./Дрхив ГосНИИ ПМ.-1986.-Раздел отчета по теме ИПМ-0784 /дело 2103/.-Юс.

II.Завальский Л.Ю. Лабораторная методика определения хемотаксиса бактерий рода Р^.аеги^'ис^л И Pj.серас1.'а.//Архив ГосНИИ ПМ.-1986.-1.1 15.60-86.-7с.

12.Завальский Л.Ю. Разделение бактерий по хемотаксическим признакам.//Архив ГосНИИ ПМ.-1986.-Докл.на науч.конф.ВНИИ ПМ.-5с. 13.Завальский Л.Ю. Лабораторная методика быстрого количественного определения хемотаксиса бактерий.//Архив ГосНИИ ПМ.-1986.-М 15. 61-86.-4с.

14.Завальский Л.Ю., Брезгунов В.Н., Попов В.Г. Хемотаксическая система бактерий.//Тез.докл.Всесовз.конф."Электроповерхностные явления и мембранные процессы в биологических системах".-Киев, 1987.-С.5-6.

15.Завальский Л.Ю., Щелокова Е.В., Шевцов В.В. Исследование хемотаксиса у вариантов ВТ-НЗ, различающихся по продуктивности.// Архив ГосНИИ 111,1.-1987.-Раздел отчета по теме ИПМ-2287.-4с. 16.Завальский Л.Ю., Щелокова Е.В., Шевцов В.В. Вирулентность и

хемотаксис штаммов ВТ-НЗ.//Архив ГосНИИ ПМ.-1987.-Раздел отчета по теме ИШ-1587.-4С.

17.3авальский Л.Ю. Лабораторная методика отбора вариантов Вас.

по хемотаксическим признакам.//Архив ГосНИИ ПМ.-1988.-М 15.81-88.-5с.

18.Завальский Л.Ю., Асланян Е.М., Щелокова Е.В. Хемотаксические свойства штаммов Ъга .iituriucjltuwi, различающихся по энтомопато-генной активности.//Тез.докл.Всесоюз.совещ,- Велегеж,1989.-С .1718.

19.3авальский Л.Ю., Пахтуев С.Н. Определение концентрации тило-зина в условиях производства.//ЦЗЛ Бердского хим. завода, лаб. методика и акт испытаний. -1887.-8с.

20.3авальский Л.Ю. Кинетический анализ хемотаксиса бактерий.// Биофизика.-1988.-Т.33.-.№2.-С.328-332.

21.Брезгунов В.Н., Завальский Л.Ю., Лазарев A.B. Хемотаксис бактерий .//Успехи микробиологии.-1989.-Т.23.-С.3-28.

22.Брезгунов В.Н., Завальский Л.Ю. Способ определения таксиса анизотропных микроорганизмов,- A.c. №1155428

23.Завальский Л.Ю. Способ определения концентрации антибиотиков. //A.c. № 1650702.

15.07.93 г. Зак. 5738Р. Тир.100 экз. Уч.-изд.я. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН