Кинетические закономерности и механизм регуляции активности фибринолитической системы различными эффекторами

Гулин, Дмитрий Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кинетические закономерности и механизм регуляции активности фибринолитической системы различными эффекторами
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетические закономерности и механизм регуляции активности фибринолитической системы различными эффекторами"

На правах рукописи

ГУЛИН ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФИБРЩОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ РАЗЛИЧНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2009

003481835

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН и на кафедре химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН, Варфоломеев Сергей Дмитриевич

кандидат химических наук Айсина Роза Бакировна

доктор химических наук, профессор, Чухрай Елена Семеновна

доктор биологических наук, профессор Максименко Александр Васильевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Защита состоится «25» ноября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан «¿ßi октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

М.А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Основной физиологической функцией фибринолитической системы (FS) является ограничение тромбообразования и обеспечение внутрнсосудистого кровотока. Ключевым ферментом FS является плазмин, который непосредственно растворяет фибрин тромба. Плазмин образуется из неактивного предшественника плазминогена под действием тканевого активатора плазминогена (t-PA), двухцепочечной урскиназы (и-РА) и одноцепочечной про-урокиназы (scu-PA). В регулировании активности FS участвуют также ингибиторы плазмина и активаторов плазминогена. Недостаточная активность FS может стать причиной тромбозов и тромбоэмболических заболеваний таких, как инфаркт миокарда, инсульт, ишемия и др. В качестве тромболитических агентов используются как физиологические активаторы плазминогена, так и бактериальный белок стрептокиназа (SK). В последние годы за рубежом проводятся клинические испытания тромболитического агента нового поколения - рекомбинантной стафилокиназы (STA), биохимические свойства которой полностью не изучены.

Скорость образования плазмина зависит как от механизма действия активаторов, так и от конформации плазминогена. В плазме крови циркулирует, в основном, нативный GIu-плазминоген (93 kDa), который под действием образующегося при его активации плазмина превращается в легче активируемый Lys-плазминоген (85 kDa). Оба плазминогена существуют в виде двух гликоформ, которые отличаются числом и локализацией карбогвдратных цепей. Показано значительное различие кинетических параметров активации двух гликоформ Glu-плазминогена фибринспецифичным t-PA, в то время как кинетические параметры активации двух гликоформ Glu- и Lys-плазминогенов урокиназой и стафилокиназой не определены.

Благодаря особенностям строения каждого из компонентов FS, их взаимодействия между собой и с клеточными рецепторами, модулированию этих взаимодействий разными факторами осуществляется сложное ее функционирование в различных состояниях организма. Активация или ингибирование активности FS могут быть индуцированы как теми и иными заболеваниями, так и введением в организм лекарственных и др. средств. Актуальной задачей является изучение in vitro влияния эффекторов, присутствующих или образующихся в организме, а также вводимых в организм как лекарственные средства, на кинетику активации плазминогена его активаторами.

К настоящему времени накопились данные, что FS, помимо тромболизиса, участвует во многих физиологических и патологических процессах таких, как ремоделировшше тканей, воспаление и заживление ран, ангиогенез, рост и метастазирование опухолей. Опухолевые клетки высвобождают активаторы плазминогена и их рецепторы, стимулируя тем самым активацию плазминогена в межклеточном матриксе. Образующийся плазмин вместе с активированными им металлопротеиназами вызывает деградацию белков в межклеточном матриксе, создавая условия дам миграции эндотелиальных клеток, участвующих в

формирования новых сосудов, которые необходимы для роста опухоли. Кроме того, плазмин, стимулируя разрушение основания мембраны, создает условия для миграции и инвазии опухолевых клеток в дрзтие ткани и органы. В 1994 году было обнаружено ингибирование ангиогенеза и роста опухоли продуктом деградации плазмина -ангиостатином, представляющим фрагмент первых четырех кринглов его тяжелой цепи. Получение новых данных о сложном механизме антиангиогенного действия крингл-фрагментов плазмин(оген)а является актуальной задачей работы.

: Известно, что основной функцией ренин-ангиотензиновой системы (RAS) является регуляция сосудистого тонуса Тот факт, чгго стимулирование RAS увеличивает, а его ингибирование уменьшает риск сердечно-сосудистых заболеваний, указывает на взаимосвязь циркуляторных FS и RAS, механизм которой до конца не известен. К настоящему времени отмечены некоторые функциональные связи циркуляторных FS и RAS человека. Ключевые компоненты FS и RAS могут влиять на активность и/или высвобождение друг друга, за счет чего достигается сложная и многоступенчатая регуляция таких процессов, как образование и лизис тромбов, спазм и расширение сосудов, синтез и расщепление коллагена и адгезивных белков. Помимо кровотока компоненты этих систем могут присутствовать локально во многих тканях и органах, Например, в глазу широко представлены компоненты FS и RAS. Они играют важную роль в патогенезе таких заболеваний, как диабетическая ретинопатия, глаукома, воспалительные процессы и др. Выявление взаимосвязей FS и RAS при развитии воспаления и заживлении травмы глаза после ожога роговицы и эффектов ингибиторов двух систем на эти процессы имеет большое фундаментальное и практическое значение.

Эксперименты in vivo и оценка клинической картины ожоговой болезни глаза кроликов проводились в ФГУ Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий (в лаборатории Биохимии, возглавляемой проф. Чесноковой Н.Б.). Анализ активности АСЕ в различных средах глаза проводился на кафедре химической энзимологии химического факультета МГУ (в группе, возглавляемой в.н.с., к.х.н. Кост О.А.). Эта часть исследований была выполнена нами в рамках совместного проекта РФФИ (грант № 06-04-49712). Остальные результаты, включенные в работу, бьши получены частично в рамках проекта НТП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» (Договора с ФГУП «ГНЦ <(НИОПИК» № 34/07- и 34/08-Ген-М).

Цель работы: Целью работы является анализ влияния различных эффекторов на кинетические закономерности и механизм регуляции активности FS.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

— исследовать ш vitro влияние отдельных эффекторов и их комбинаций на кинетику активации Glu- и Lys-плазминогенов его активаторами;

— определить кинетические параметры активации гликоформ 1 и 2 Glu- и Lys-плазминогенов STA и выяснить роль фибрина и типа гликозилирования зимогена в механизме ее действия;

— изучить влияние ангиостагшнов на кинетику активации шшминогена in vitro и неоангиогенез in vivo;

— исследовать in vitro перекрестное влияние ингибиторов FS и RAS на активность ключевых ферментов этих систем;

— исследовать in vivo изменение уровней ключевых компонентов FS и RAS в жидких средах и тканях глаз кроликов после ожога роговицы и влияние ингибиторов двух систем на клиническую картину ожоговой болезни.

Научная новизна работы:

1. Получены новые данные о механизме стимулирования или ингибирования различными эффекторами кинетики активации разных форм шшминогена его активаторами.

2. Впервые установлено, что фибрин является мощным стимулятором плазминоген-активаторной активности STA и предложен механизм, объясняющий фибрин-селективность ее действия.

3. Обнаружено перекрестное подавление in vitro активности ключевых ферментов FS и RAS специфичными ингибиторами этих систем.

4. Впервые выявлена взаимосвязь локальных RAS и FS, функционирующих в жидких средах и в тканях глаз кроликов в ходе воспалительного процесса Показано, что ингибиторы этих систем улучшают процесс репарации ожоговой болезни.

5. Впервые показано, что ингибирование ангиостатинами генерации плазмина из шшминогена под действием активаторов вовлекается в сложный механизм их антиангиогеиного действия.

Практическая значимость: Обнаруженное мощное стимулирование фибрином активаторной активности STA, имеет не только научную, но и практическую значимость для улучшения режима терапии этим перспективным тромболитическим агентом.

Выявленные изменения уровней ключевых ферментов FS и RAS в жидких средах и тканях глаз кроликов в ходе развития и репарации воспалительного процесса имеют важное практическое значение для диагностических целей.

Обнаруженное улучшение процесса репарации ожоговой болезни глаз кроликов при обработке ингибиторами FS и RAS, используемыми в медицине как антифибринолитические или гипотензивные агенты, имеют практическую значимость для терапевтических целей.

Найденное улучшение процесса заживления ожоговой болезни глаз кроликов при введении ангиостатина, имеет практическое значение для терапии.

Апробация работы н публикации. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях: XLVIII Научной Конференции Московского физико-технического института (Москва, 2005): V, VI, VII и VIII Ежегодных международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); Moscow International Conference "Biotechnology and Medicine" (Moscow, 2006); IV Московском Международном конгрессе «Биотехнология -

состояние и перспективы развития», (Москва, 2007); XXI and XXII Congresses of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Geneva, Switzerland, 2007 and Boston, USA, 2009); VI Симпозиуме «Химия протеолигических ферментов» (Москва, 2007); XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); XIX Congress of the International Society for Fibrinolysis and Proteolysis (Vienna, Austria, 2008); IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии (Москва 2009); XXII International Conference "Bíocatalysis-2009: fundamentals & applications"(ArkhangeIsk, 2009).

Публикации. Материалы диссертациоииой работы отражены в 26 публикациях, из них: 4 статьи (в том числе 3 работы по списку журналов ВАК) и 22 тезиса докладов на международных и российских конференциях.

Вклад автора состоит в планировании и проведении экспериментов, обработке их результатов и творческом участии в интерпретации, обсуждении и оформлении полученных дашых на всех этапах исследования.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит го введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и списка литературы, изложена на 153 страницах машинописного текста и включает 49 рисунков, 20 таблиц и список цитируемой литературы из 265 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературных данных о структуре и свойствах основных компонентов FS крови человека Собраны и обобщены кинетические параметры активации Glu- и Lys-форм плазминогена его физиологическими активаторами (t-PA, u-PA и scu-PA) и константы ингибирования плазмина и активаторов плазминогена их специфическими ингибиторами. В главе 2 рассмотрены механизмы активации плазминогена активаторами бактериального происхождения (SK и STA), которые используются в современной терапии тромбозов. В главе 3 собраны литературные данные о влиянии эффекторов на активацию Glu- и Lys-форм плазминогена под действием u-PA и t-PA. В главе 4 представлены накопившиеся к настоящему времени литературные данные об участии FS в различных физиологических и патологических процессах таких, как тромболизис, ремоделирование тканей, воспаление и заживление ран, ангиогенез, рост и метастазирование опухолей. Обобщены сведения о возможных механизмах образования in vivo крингл-фрагме1ггов тяжелой цепи плазмин(оген)а (ангиостатинов), обладающих антиангиогенной и противоопухолевой активностью. Описаны компоненты FS, найденные в жидких средах и в отдельных тканях глаза в норме и при патологии. В конце главы приведены обнаруженные к настоящему времени некоторые функциональные связи циркуляторных FS и RAS человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исходные вещества. А) Основные белковые препараты. В работе использованы: стандартные u-PA и t-PA (NIBSC, Великобритания); стрептокиназа ("Reyon Phamiaceutical Co. Ltd.", Корея); рекомбинаптная STA, любезно предоставленная Dr. Lijnen H.R. (Center for Molecular and Vascular Biology, University of Leuven, Бельгия); эластаза из свиной панкреазы ("ICN Biomedicals, Inc", Германия); тромбин человека ("Sigma" (США); анцистрон из яда змеи Agkistrodon halys и фибриноген человека (ООО "Технология-Стандарт", Россия); апротинии "Гордокс" ("Гедеон Рихтер", Венгрия); замороженная цитратная плазма крови человека (Гематологический научный центр МЗ России, Москва). Б) Субстраты. Для определения активностей ферментов использовали: п-нитроанилид HCO-Ala-Phe-Lys (AFK-pNA, ООО "Технология-Стандарт", Россия); п-нитрофениловый эфир М-а-карбобензокси-L-Lys, гидрохлорид (Z-Lys-pNP, синтезированный на кафедре); п-лмтроаиилид H-D-Val-Leu-Lys, дигидрохлорид (S-2251), п-нитроанилид Glp-GIy-Arg, дигидрохлорид (S-2444), п-нитроанилид H,D-Ile-Pro-Arg, дигидрохлорид (S-2288) и Ыа-3-(2-фурил)акрилоил-Ь-фенилаланил-глицил-глицин (FA-Phe-Gly-Gly) ("Sigma", США). В) Ингибиторы: 6-Аминогексаповая кислота (б-АНА) ("Merck", Германия); транс-(4-аминометил)циклогексан-карбоновая кислота (t-AMCHA) ("Acros Organics", США); L-лизин, гидрохлорид, фснилмстансульфонилфторид (PMSF), (25)-1-(3-Меркапто-2-метилпропионил)-Ь-прол1ш (каптоприл) и (5)-№-(1-карбокси-3-фенилпропил)-Ь-;шзил-Ь-пролин (лизииоприл) ("Sigma", США); (5)-1-[Ы-(1-карбоксн-3-фенилпропил)-Ь-аланил]-Ь-пролин (эналаприлат) ("KRKA", Словения). П Антикоагулянты: гепарин ("Sigma", США) и фраксипарин ("Sanofi", Франция). Д) Носители: Lys-сефароза 4В, сефадексы G-25 и G-75 ("GE Healthcare", Швеция).

Методы исследования. Glu-плазминоген (Glu-Pg) выделяли из плазмы человека аффшшой хроматографией на Lys-сефарозе 4В в присутствии апротинина, используя в качестве элюента 0,2 М б-АНА (Castellino & Powell, 1981). Lvs-плазминоген (Lys-Pg) выделяли аналогично, но в отсутствие апротинина. Гликоформы Glu-Pg или Lvs-Pg типа 1 и 2 разделяли на Lys-сефарозе 4В, используя линейный градиент 0 - 0,012 М б-АНА. Полученные образцы Glu-Pg, Lys-Pg и их гликоформ после очистки лиофшшзовали. Растворимый Фибрин (дез-АА-фибрин) получали обработкой фибриногена аннистроном. Ангиостатин К1-3 получали деградацией Glu-Pg эластазой. Ангиостзтин К 1-4.5 получали активацией Glu-Pg урокиназой и автолизом полученного плазмина при щелочных значениях pH. Образцы ангиосгатинов после очистки лиофилизовали. Активности ферментов определяли по скоростям гидролиза их специфических субстратов: AFK-pNA или S-2251 (плазмина и комплекса гогазмин-STA), S-2444 (u-PA), S-2288 (t-PA) и FA-Phe-Gly-Gly (ACE).

Кинетику активации разных форм плазминогена (Pg) под действием его активаторов (РА) изучали в присутствии субстрата (S) плазмина (Рт):

Kpg kpg PA + Pg < " PAPg - * PA + Pm ^

Km ktai

Pm + S * PmS -Pm + p-NA (2)

Образование я-нитроанилина (рЫА) в ходе сопряженной реакции (когда [8] >>КГО, ^]>Крё, [РА]«[Рё]) описывается уравнением:

Д _ ^Мчоз -саг—rgt. •««■ OJ -Z

KP8+[Pg] ■ (3)

405

Зависимости A405 от t2 при [PA] = const и переменной [Pg] дают серию прямых, из наклонов которых (В) определяли начальные скорости активации Pg (v0):

В kPg[PA][Pg] (4)

EM«Aat Kpe+[Pg]

Кинетические параметры активации Pg в отсутствие и присутствии эффекторов определяли из зависимостей l/v0 от l/[Pg],

При постоянной [Pg] скорость его активации описывается уравнением:

Vam = AWt2 = 0,5 х е„ 405 х ко« х kpg х [PA] (5)

За кинетикой активации Pg следили с помощью планшетного фотометра Anthos 2020 (Австрия), соединенного с компьютером и установленного для измерения А405-

В качестве объекта для исследования взаимосвязи FS и RAS in vivo был выбран глаз кролика, так как он удобен для неинвазивной прижизненной оценки клинических и биохимических характеристик воспалительного процесса на различных его стадиях в связи с прозрачностью сред и восполнимостью слезной жидкости. Воспалительный процесс в глазах кроликов вызывали дозированным щелочным ожогом роговицы. За изменением уровней компонентов FS и RAS после ожога роговицы следили в слезной жидкости в динамике (28 суток), а в водянистой влаге и гомогенатах тканей глаза - в острый период (3 сутки). На 7,14, 21 и 28 сутки после ожога оценивали выраженность признаков воспаления, длину и густоту новообразованных сосудов, площадь и глубину изъязвления роговицы в условных баллах. Аналогичное исследование было проведено при инсталляции t-AMCHA и каптоприла (ингибиторов FS и RAS, соответственно).

Статистическую обработку проводили с помощью программы Sigma Plot 7.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика препаратов плазминогена и его крингл-фрагмеигов

Из донорской плазмы крови человека были получены различные формы плазминогена: Glu-Pg, Lys-Pg, Glu-Pgl, GIu-Pg2, Lys-Pgl и Lys-Pg2. Электрофорез очищенных препаратов Glu-Pg и Lys-Pg представлен на рис.1 Д. Lys-форма зимогена лишена N-терминального пептида (~ 8 kDa) Glu-формы. Гликоформы 1 и 2 имеют те же молекулярные массы, что и исходные зимогены. Гликоформа 1 плазминогена содержит О-связанную (между кринглами

3 и 4) и N-связанную (на крингле 3) карбогидратные цепи, в то время как гликоформа 2 -только О-связанную карбогидратную цепь.

Ша

Ша 93-»

Рис. 1. SDS-PAA электрофорез в 12 %-ном геле в не восстанавливающих условиях: (А) Glu-плазминоген (1) и Lys-плазминоген (2); (Б) Glu-плазминоген (1), ангиостатин К1-4,5 (2) и ангиостатин К1-3 (3).

В работе были получены ангиостатины KI-3 и К1-4,5, представляющие первые 3 или 4,5

крингла плазминогена, соответственно (рис. 2). Сравнительный электрофорез Glu-Pg и

полученных из него ангиостатинов К1-3 и К1-4,5 представлен на рис. 1,Б. Наличие двойных

электрофоретических полос очищенных ангиостатинов Kl-3 (Mr ~ 35 и 39 kDa) и Kl-4,5 (М,

~ 50 и 55 kDa), вероятно, связано с незначительными различиями в подверженности двух

гликоформ исходного Glu-Pg эластолизу и плазмина автолизу. Отсутствие амидазной

активности плазмина в препаратах ангиостатинов К1-3 и К1-4,5, указывало на полное

удаление легкой цепи плазмина при их очистке. Тяжелая иеш,

Glu-плазмнноген

Легкий цепь

Рис. 2. Схематическое представление структуры Glu-плазминогена и крингл-фрагментов К1-3 и К1-4,5 его тяжелой цепи.

К1 3

К1-4,5

2. Влияние эффекторов на кинетику активации различных форм плазминогена под действием его активаторов ш vitro

В качестве эффекторов использовали ЫаС1 и фибрин, присутствующий или образующийся в организме, соответственно, а также гепарины, ангиостатины и ингибиторы АСЕ, которые могут вводиться в организм как лекарственные средства.

Влияние фибрина, хлорид-ионов и гепаринов

На рис. 3 представлено влияние концентрации растворимого фибрииа на скорость активации Glu-Pg под действием t-PA, u-PA и STA. Из рисунка следует, что фибрин является мощным стимулятором плазминоген-активаторной активности не только t-PA, обладающего сродством к фибрину, но и STA, хотя STA, как и u-PA, прямо не связывается с фибрином.

Рис. 3. Зависимость скорости активации 1 цМ Glu-Pg, индуцированной 0,25 Ш/ ml t-PA (1), 0,13 пМ стафилокиназой (2) и 0,25 IU/ml u-PA (3), от концентрации растворимого фибрина (37°, pH 7,4). р<0,01.

Сравнительное изучение влияния фибрина на кинетические параметры активации 01и^-1, С1и^-2, Ьуз-Р2"1 и комплексом плазмин(Рш)-5ТА показало (табл. 1), что он

значительно потенцирует активацию всех четырех зимогенов, вызывая повышение каталитической эффективности реакции (кр^р^ в 13-40 раз только за счет снижения Крв.

Таблица 1. Кинетические параметры активации гликоформ Glu- и Lys-плазминогенов комплексом Pm-STA в отсутствие и присутствии 60 пМ растворимого фибрина

Форма плазминогена Kpg, цМ kpg, s'1 kpg/Kpg, pM"1 s"1 Эффект Fm*

В отсутствие фибрина:

Glu-Pg 1 17,1 ±0,2 0,082 ±0,001 4,78'10"3

GIu-Pg2 14,9 ±0,1 0,094 ±0,002 6,30 10-3

Lys-Pgl 11,2 ±0,1 0,089 ±0,003 7,92 10"3

Lys-Pg2 5,3 ±0,1 0,098 ± 0,002 18,2510"3

В присутствии фибрина:

Glu-Pgl ■ 1,30 ±0,01 0,081 ± 0,001 62,4010"3 13,05

Glu-Pg2 0,36 ±0,02 0,096 ±0,002 261.58T0"3 41,5

Lys-Pgl 0,44 ±0,02 0,078 ±0,001 177,68T0"3 22,4

Lys-Pg2 0,20 ±0,01 0,096 ±0,003 497,41'10"3 27,2

'Отношение значений kPs/KPg в присутствии и в отсутствие фибрина.

Растворимый фибрин, пМ

Этот эффект можно объяснить следующим образом. Как только каталитическая концентрация комплекса Pm-STA инициирует актвацию плазминогена в плазмин, начинается деградация фибрина с экспонированием его С-терминалышх лизинов - новых центров для связывания плазминогена. STA значительно сильнее связывается с Lys-Pg и Glu-Pg, сорбированным на частично деградированном фибрине, чем с зимогенами в растворе. В результате аккумулирования плазминогенов на поверхности частично деградированного фибрина и разворачивания их молекул, повышающего доступность STA-связывающих участков зимогенов, эффективность фермент-субсгратного комплекса и скорость активации увеличиваются. На основании анализа кинетических параметров активации двух гликоформ плазминогенов сделан вывод о том, что N-гликозилирование крингла 3 гликоформы 1 плазминогенов создает сгеричесше затруднения для образования фермент-субстратного комплекса Pm STAPg в растворе и на поверхности фибрина.

В работе изучено влияние нефракционированного гепарина (Mr ~ 15 kDa) и фракционированного гепарина (фраксипарина, М, ~ 4-6,5 kDa), которые используются в терапии как антикоагулянты, на активацию Glu-Pgl и Lys-Pgl под действием комплекса PmSTA и u-РА Было обнаружено, что скорость активации плазминогенов повышается с

Таблица 2. Влияние отдельных эффекторов и их комбинаций на кинетические параметры активации и комплексом Рш-5ТА (рН 8,3; 37°С).

Препарат Эффектор* kps, s'1 KpJKh, ((iMs)"1

Glu-Pgl - 3,6 ±0,2 0,090 ±0,001 0,025

NaCl 20,8 ±0,2 0,082 ±0,002 0,00393

Fx 3,6 ±0,1 0,27 ±0,01 0,075

Fx + NaCl 20,8 ±0,2 0,082 ± 0,003 0,00393

Hp + NaCl 20,8 ± 0,2 0,082 ±0,002 0,00393

Fm + NaCI 1,6 ±0,1 0,067 ±0,004 0,0435

Fm + Fx + NaCl 0,53 ± 0,01 0,060 ±0,002 0,113

Fm + Hp + NaCl 0,83 ± 0,01 0,063 ± 0,003 0,076

Lys-Pgl - 0,66 ±0,01 0,196 ±0,002 0,298

NaCl 9,2 ±0,1 0,069 ±0,003 0,0073

Fx 0,73 ± 0,02 0,26 ±0,01 0,358

Hp 0,64 ±0,03 0,165 ±0,004 0,260

Fx + NaCl 9,2 ±0,1 0,069 ±0,002 0,0073

Hp + NaCl 9,2 ±0,1 0,069 ±0,003 0,0073

Fm + NaCl 0,38 ±0,02 0,071 ±0,002 0,1913

Fm + Fx + NaCl 0,47 ±0,01 0,074 ±0,004 0,1578

Fm + Hp + NaCl 0,83 ±0,01 0,077 ± 0,004 0,0930

[Fx] = 0,4 IU/ml; [Нр] = 4 IU/ml; [Fm] = 0,02 mg protcin/ml; [NaCl] = 0,11 M.

ростом концентрации фраксинарина до 0,4 Ш/т1 (затем уменьшается) и падает с ростом концентрации гепарина Хлорид ионы в концентрации, близкой к физиологической, полностью подавляли стимулирующий эффект фраксипарина. В табл. 2 приведены найденные значения кинетических параметров активации 01и^1 и под действием

комплекса Рш-БТА в отсутствие и в присутствии отдельных эффекторов и их комбинаций. Как видно, фраксипарин (0,4 Ш/ш1) повышает скорость активации обоих зимогенов за счет увеличения крЁ, что указывает на повышение доступности активационной связи обоих зимогенов для активатора при их связывании с фраксипарином. Известно, что имеет

"закрытую" информацию в присутствии хлорид-ионов, "полуоткрытую" и "открытую" конформацию при сорбции на интактном и частично деградированном фибрине, соответственно. Из данных табл. 2 видно, хлорид-ионы подавляют слабый стимулирующий эффект фраксипарина за счет увеличения Кр& стабилизируя как "закрытую" конформацию С1и^1, так и "полуоткрытую" конформацию Ьуз-Р§1. Отрицательный эффект хлорид-ионов элиминируется при добавлении фибрина, который стабилизирует более открытую конформацию обоих плазминогенов за счет резкого снижение КрЕ.

Отрицательный эффект хлорид-ионов (снижение (кр/Кр6) наблюдался и для активации этих плазминогенов урокиназой (табл. 3).

Таблица 3. Влияние гепарина и фраксипарина на кинетические параметры активации Glu-Pgl и Lys-Pgl урокиназой (рН 8,3,37°С).

Препарат Эффектор* кРе,мм kpE, s1 кРй/ (nMs)"1

Glu-Pgl - 0,20 ±0,01 0,15 ±0,01 0,765

NaCI 1,06 ±0,03 0,15 ±0,02 0,145

Фраксипарин 0,33 ± 0,01 0,31 ±0,02 0,924

Гепарин 0,33 ±0,02 0,31 ±0,03 0,924

Lys-Pgl - 0,10 ±0,01 0,17 ±0,02 1,627

NaCl 0,73 ± 0,02 0,28 ±0,01 0,383

Фраксипарин 0,10 ±0,02 0,26 ±0,01 2,6

Гепарин 0,10 ±0,01 035 ±0,02 3,4

[Fx] = 0,4 IU/ml; [Hp] = 4 IU/ml; [NaCl] = 0,11 M.

Влияние ангиостатинов

Было изучено влияние двух ангиостатинов на активацию Glu-Pg под действием его физиологических активаторов in vitro. Обнаружено, что ангиосташны К1-3 и К1-4,5 доза-зависимым образом ингибируют реакцию превращения Glu-Pg в плазмин, индуцированную u-РА в растворе (рис. 4, А). В связи с тем, что t-PA является эффективным активатором плазминогена только в присутствии фибрина, было изучено влияние ангиостатинов на фибрин-сгимулированную активацию Glu-Pg под действием t-PA. Обнаружено, что К1-4,5

Ангиостатин, цМ Ангиостатин, цМ

Рис. 4. Доза-зависимое влияние ангиосгатинов К1-3 (1) и К1-4,5 (2) на активацию С1и-Р$ под действием и-РА в отсутствие фибрина (А) и 1-РА в присутствии фибрина (Б). р<0,01.

сильно тормозит скорость активации под действием 1-РА, в то время как К1-3,

практически не влияет на эту реакцию (рис. 4, Б). Последнее можно объяснить тем, что ангиостатин К1-3 лишен крингла 5, обладающего наибольшим сродством к фибрину.

Причиной эффектов ангиосгатинов на скорость активации плазминогена, измеренной сопряженным методом (уравнения (1) и (2)), могло быть их влияние на собственные активности активатора плазминогена или плазмина. Отдельно проведенный эксперимент по гидролизу плазмином, и-РА и 1-РА их специфических субстратов в присутствии высоких концентраций ангиосгатинов К1-3 и К1-4.5 показал, что они не влияют на амидазные активности плазмина, и-РА и 1-РА. Следовательно, ангиосгатины ингибируют генерацию плазмина из плазминогена под действием его активаторов. Для выяснения механизма ингибирования было изучено влияние ангиостатина К1-4,5 на кинетические параметры активации й1и-Р§ двумя активаторами. Из данных табл. 4 видно, что при повышении концентрации ангиостатина крв не изменяется, а КрЕ активации плазминогена урокиназой

Таблица 4. Влияние ангиостатина К1-4,5 на кинетические параметры активации Ии-Рё под действием 0,25 Ш/ш1 и-РА в отсутствие или 1-РА в присутствии фибрина (60 пМ) (р <0,01)

[К1-4.5], ИМ Кр*,цМ крц/Крг, в"' цМ'1

и-РА

0 0,020 0,52 0,039

0,3 0,018 0,79 0,023

1,2 0,020 1,81 0,011

ЬРА + фибрин

0 0,086 0,023 3,74

0,3 0,06 0,048 1,25

1,2 0,04 0,071 0,56

увеличивается, что указывает на конкурентный тип ингибирования ангиостатином активаторной активности u-РА. В случае t-PA, увеличение концентрации К1-4,5 приводит к уменьшению кр6 и увеличению KPg активации. Следовательно, ангиостатин К 1-4,5 иктибирует фибрии-стимулированную активацию Glu-Pg под действием t-PA по смешанному типу. В работе предложен механизм ингибирования двух реакций. Константы ингибирования (K¡) ангиостатином К1-4,5 активации Glu-Pg были найдены равными 0,59 цМ (в случае u-РА) и 0,12 рМ (в случае t-PA).

Влияние ингибиторов RAS

В работе гаучено влияние трех различных по химической структуре ингибиторов АСЕ:

на амидазные активности плазмина. t-PA и u-РА in vitro и обнаружено, что лизиноприл и эналаприлат не влияют, а каптоприл значительно ингибирует амидазные активности плазмина (рис. 5,А) и u-РА (рис. 5,Б). Влияние каптоприла на активность t-PA была аналогичной. Механизм ингибирования, возможно, связан с восстановлением SH-группой каптоприла дисульфидных связей ферментов, которое вызывает обратимое нарушение интактносги их активных центров.

. Каптоприл, шМ Каптопоил. тМ

Рис. 5. Дозо-зависимые эффекты каптоприла на амидазные активности: (А) плазмина ([Рш], пМ: 1 (/), 5 (2), 10 (3)) и (Б) урокиназы ([и-РА], пМ: 18,75 (/), 37,5 (2), 75 (3)). (р < 0,01).

Изучение влияния ингибиторов АСЕ на кинетику активации 01и-Ре показало (рис. б), что эналаприлат не влияет, а каптоприл ингибирует активаторные активности и-РА и ЬРА с

близкими значениями PC]jo. Лизиноприл стимулирует активаторную активность u-РЛ и интибирует активаторную активность t-PA. Возможно, стимулирование лизиноприлом активации Glu-Pg под действием u-РА обусловлено тем, что связывание лизиноприла через положительно заряженный боковой остаток лизина с LBS Glu-Pg разрушает лизин-зависимые взаимодействия в молекуле зимогена, что приводит к изменению его закрытой конформации в более открытую и, соответственно к росту скорости его активации.

Рис. 6. Влияние концентраций эналаприлата (1), лизиноприла (2) и каптоприла (3) на скорость активации 0,3 цМ Glu-Pg под действием 0,75 IU/ml u-PA (А) и 2 IU/ml t-PA + растворимый фибрин (Б), (р < 0,01).

Ингибирукмцее действие лизиноприла на фибрин-стимулированную активацию Glu-Pg под действием t-PA может быть связано с тем, что положительно заряженный боковой остаток лизииа молекулы ингибитора конкурирует с фибрином за связывание плазминогена и, возможно, t-PA. Вытеснение последних с поверхности фибрина лизиноприлом приводит к снижению скорости активации.

Полученные результаты демонстрируют, что ингибиторы АСЕ (каптоприл и лизиноприл) влияют на активность ключевых ферментов FS in vitro.

3. Влияние эффекторов FS на активность АСЕ in vitro

В качестве эффекторов FS были использованы: плазмин, гепарин и растворимый фибрин, а также ингибиторы фибринолиза - б-АНА и t-AMCHA. Обнаружено, что плазмин и гепарин во всем изученном диапазоне их концентраций не влияют, фибрин слабо ингибирует, а ингибиторы FS - 6-АНА и t-AMCHA - значительно подавляют активность АСЕ in vitro (рис.

0,0

--,-,-,-, о,о 40 5 10 15 20 25 О

Ингибитор, тМ

5 10 15 20

Ингибитор, шМ

Я 40

к <

Рис. 7. Зависимость активности АСЕ (0,2 нМ) от концентрации 6-АНА (1) и t-AMCHA (2). (р < 0,01).

Ингибитор, шМ

100

Таким образом, впервые обнаружено перекрестное влияние терапевтических концентраций ингибиторов FS и RAS, применяемых в медицине как антифибринолитические или гипотензивные агенты, соответственно, на активности ключевых ферментов этих систем in vitro.

4. Взаимосвязь FS и RAS в воспалительном процессе глаз кроликов

Уровни компонентов FS и АСЕ в водянистой влаге и гомогенатах тканей глаза в норме и после ожога роговицы

Поскольку водянистую влагу, находящуюся в передней камере глаза, и различные ткани глаза можно отобрать только один раз (до и после энуклеации глаза, соответственно) измерения уровней компонентов FS и АСЕ в этих средах глаза проводили только в норме и в острый период (на 3-й сутки) после ожога роговицы. Результаты исследования представлены на рис. 8. Как видно, в тканях глаза кроликов, как в сосудистых, так и в бессосудистых, и во влаге передней камеры в норме и после ожога обнаруживаются компоненты RAS и FS. В острый период воспаления, вызванного ожогом, их активность существенно изменяется. При этом повышается активность плазмина во всех тканях, плазминогена - значительно в цилиарном теле и роговице, активаторов плазминогена - многократно в конъюнктиве и значительно в сетчатке и хориоидее, АСЕ - во всех тканях, кроме сетчатки и хориоидеи. В водянистой влаге значительно возрастает активность плазмина, плазминогена и АСЕ. Из результатов следует, что после травмы роговицы происходит активация FS и RAS не только в области повреждения и в прилежащих тканях, но и во внутренних структурах глаза Эти изменения в связи с важной ролью изучаемых систем в гемоциркуляции и воспалении могут явиться причиной развития осложнений во внутренних структурах глаза, возникающих после ожога роговицы.

Рис. 8. Уровни компонентов FS и RAS в гомогенатах различных тканей глаза кроликов и во влаге передней камеры (на вставках) (■- здоровые животные, О - 3-й сутки после ожога роговицы), р < 0.05.

(А) Удельная активность плазмина в гомогенатах тканей глаза кроликов в fiM/minxmg. На вставке активность плазмина в водянистой влаге в ((.iM/min*m])x 105.

(Б) Удельная потенциальная активность плазминогена в гомогенатах тканей глаза кроликов в цМЛтпх пщ. На вставке активность плазминогена в водянистой влаге в цМУттхт!.

12 8 4

(В) Суммарная удельная активность активаторов плазминогена в гомогенатах тканей глаза кроликов в пМ/ттхпщ. На вставке активность активаторов

плазминогена в водянистой влаге в (рМ/ттхт!) * Ю4.

—

(Г) Удельная активность АСЕ в гомогенатах тканей глаза кроликов в (цМ/ттхт§)х104. На вставке активность АСЕ в водянистой влаге в (цМЛтпхт1)х104.

Уровни компонентов К5 в слезной жидкости в норме и после ожога роговицы глаза

Известно, что состав слезной жидкости отражает метаболический статус как внешних, так и внутренних структур глаза, поэтому определение содержания компоне1ггов РБ и ЯЛБ в слезной жидкости может иметь диагностическое и прогностическое значение. В связи с тем, что восполняемую слезную жидкость можно отбирать многократно, в работе впервые была изучена динамика изменения уровней компонентов РБ в слезной жидкости в ходе всего процесса воспаления и заживления роговицы, которая была сопоставлена с результатами изменения активности АСЕ в слезе, полученными ранее.

В норме в слезе были обнаружены измеримые, но не высокие уровни 1-РА, и-РА, Pg и плазмина (Рт), что, вероятно, достаточно для поддержания проходимости слезного протока и прозрачности слезы, благодаря предотвращению образования фибринового сгустка. Воспалительный процесс, вызванный ожогом, начинался с разрушения верхнего слоя эпителия и помутнения роговицы, что сопровождалось высвобождением в слезу компонентов КБ и АСЕ. Через 3 дня после ожога дефект эпителия закрывался, а отек и проницаемость сосудов увеличились. В последующие дни вновь обнажалась сгрома роговицы, в которой начинался процесс изъязвления, который достигал максимума на 14-21 сутки. Через 28 дней. воспалительный процесс затухал и на месте ожога формировалась рубцовая ткань. Нами было обнаружено два пика подъема уровней Р§ и 1-РА на 3 и 21 сутки, а Рт и и-РА на 7 и 21 сутки в слезе после травмы (рис. 9).

Сутки Сутки

Рис. 9. Динамика изменения уровней компонентов РЯ в слезной жидкости после ожога роговицы глаза в сравнении с их контрольными уровнями: (А) ЬРА (1) и и-РА (2); (Б) Pg (1) и Рт (2). р < 0,05.

Два пика роста активности АСЕ на 3 и 21 сутки было также обнаружено ранее Кост О.А. с соавторами. Таким образом, повышение уровней Pg, t-PA и АСЕ на 3 сутки и активности Рт и u-PA на 7-ой день является показателем интенсификации воспаления. Повторный скачок уровней u-PA, t-PA, Pg, Pm и АСЕ между 14-21 днями указывает на их важную роль в изъязвлении, а измеримые остаточные уровни u-PA и Рт на 28 день - на их участие в процессе репарации роговицы.

Поскольку ожог роговицы вызывает повышение активности ключевых ферментов FS и RAS не только в тканевых структурах и водянистой влаге, но и в слезной жидкости нами было решено исследовать взаимное влияние инсталляций ингибиторов двух систем на уровни их компонентов в слезе. Было впервые проведено исследование влияния ежедневных инсталляций 1%-ного каптоприпа или 2% t-AMCHA на активность компонентов FS и АСЕ на разных стадиях воспалительного ожогового процесса (рисунки не приведены) и на клинические проявления болезни.

Клинические проявления ожоговой болезни глаз

Лечение t-AMCHA. По интенсивности неоваскуляризащш роговицы - прорастанию сосудов из лимбалыюй области к центру роговицы, опытная группа, получавшая лечение t-АМСНА превосходила контрольную (рис. 10, А). Достоверные клинические различия от

С 0,5

2,5

0,0

14 21

Сутки

Рис. 10. Влияние ежедневных инсталляций 2% ЬАМСНА в течение 14 дней на клиническую картину при ожоге роговицы:

0,0

о - t-AMCHA; • - фосфатный буфер. (р< 0,01).

7 14 21

Сутки

нелеченых животных отмечены на 21 сутки (р<0,05) при ежедневном введении ингибитора. Последующее запустевание новообразованных сосудов у леченых животных также происходило быстрее. При оценке развития и заживления язвы роговицы выявлено, что в группе, получавшей 1-АМСНА, наблюдались значительно меньшая площадь и глубина дефекта и более быстрое его заживление, при этом достоверные отличия от контрольной группы по площади дефекта отмечены на 21 сутки (р<0,05), по глубине - на 28 сутки (р<0,02) (рис. 10, Б и В).

Применение ингибитора плазмина - (-АМСНА значительно улучшило течение репаративных процессов после ожога: снизились глубина и площадь изъязвления роговицы. Сосуды прорастали в роговицу более интенсивно, но в то же время происходило их более раннее запустевание, что способствовало образованию более нежной рубцовой ткани. Клинические проявления послеожогового процесса коррелировали с интенсивностью изменения активности АСЕ в слезной жидкости. Однако мы не обнаружили такой жесткой корреляции с активностью компонентов Р5 в слезной жидкости. Вероятно, это связано с влиянием большого числа факторов на наблюдаемую секрецию каждого белка сложной многокомпонентной ИЗ.

Лечение каптоприлом. В опытной группе животных, которым после ожога ежедневно вводили каптоприл, по сравнению с контрольной группой также наблюдалось более интенсивное прорастание сосудов из лимбальной области к центру роговицы и после 14 суток запустевание новообразованных сосудов. Инсталляции каптоприла существенно снижали частоту развития глубоких язв роговицы (данные не приведены). Таким образом, обнаружен положительный эффект введения как ингибитора плазмина, так и ингибитора АСЕ в глаза кроликов на течение клинической ожоговой болезни.

Влияние ангиостатина на неоваскуляризацию роговицы глаза, вызванную ожогом.

Неоваскуляризация роговицы на ранних сроках имеет положительное значение, т.к. обеспечивает поступление необходимых метаболитов для репарации бессосудистой в норме роговицы, а на поздних сроках имеет отрицательное значение, так как задержка запустевания сосудов приводит к формированию грубого васкуляризированного бельма. Выше было показано, что инсталляции каптоприла и -АМСНА усиливают васкуляризацию на ранних сроках после ожога роговицы и вызывают более раннее запустевание сосудов, что благоприятно для образования более прозрачной рубцовой ткани.

БЗ играет важную роль в регуляции неоваскуляризации роговицы. Предполагается, что в запуске этого процесса ключевую роль играет активация плазминогена под действием и-РА, содержащейся в строме периферической части роговицы. Поэтому нами было изучено

влияние ангиостатина К 1-4,5 на нсоваскуляризацию роговицы глаз у кроликов после ожога. Ангиостатин вводили ежедневно в виде субкопъюнкшвальных инъекций в течение 3 недель, начиная со дня нанесения ожога роговицы. Результаты исследования эффекта ангиостатина in vivo представлены на рис. 11. Как видно, у животных, получавших ангиостатин, длина (Б)

Рис. 11. Влияние ангиостатина К1-4,5 на нсоваскуляризацию роговицы глаз у кроликов, вызванную ожогом: о - К1-4,5; • - контроль.

и густота сосудов (В), а также интенсивность неоваскуляризации (А) были заметно ниже, чем у контрольных животных. В опытной группе запустевание новообразованных происходило также быстрее, чем в контрольной группе.

Таким образом, полученные в данной работе in vivo результаты подтверждают предположение, сделанное нами на основании in vitro результатов, что одним из механизмов сложного антиангиогенного действия ангиостатинов является ингибирование генерации плазмина из плазминогена под действием физиологических активаторов плазминогена.

выводы

1. Изучено влияние фибрина, хлорид-ионов, гепарина, фраксипарина и их комбинаций на кинетику активации различных форм плазминогена его активаторами и получены новые данные о механизме их стимулирующего или ингибирующего действия.

2. Впервые определены кинетические параметры активации гликоформ 1 и 2 Glu- и Lys-плазмииогенов стафилокиназой и обнаружено, что фибрии значительно стимулирует активацию гликоформы 2 и в меньшей степени гликоформы 1 плазминогенов.

3. Впервые показано, что ангиостатины - крингл-фрагменты К1-3 и К1-4,5 плазминогена -ингибируют in vitro генерацию плазмина из плазминогена под действием его физиологических активаторов и предложен механизм ингибирования.

4. Обнаружено перекрестное ингибирование in vitro активности ключевых ферментов фибринолитической (FS) и ренин-ангиотензиновой систем (RAS) ингибиторами этих систем.

5. Впервые проведено сравнительное изучение изменений уровней компонентов FS и RAS в воспалительном процессе, вызванном ожогом роговицы глаз кроликов и обнаружено:

а) Увеличение уровня ключевых ферментов двух систем в водянистой влаге передней камеры и в тканях глаза (хрусталике, стекловидном теле, радужке, цилиарном теле, сетчатке, хориоидее, роговице и конъюнктиве) в острый период ожоговой болезни;

б) Повышение активности ключевых ферментов RAS и FS в слезной жидкости, в острый

период и в период максимального изъязвления роговицы;

в) Улучшение клинической картины ожоговой болезни глаз кроликов (снижение площади

и глубины дефекта и более быстрое заживление язвы роговицы) при инсталляции как ингибитора RAS, гак и ингибитора FS. Таким образом, обнаружена взаимосвязь локальных RAS и FS, функционирующих в жидких средах и в тканях (сосудистых и бессосудисггых) глаз кроликов. Обе системы участвуют в развитии воспалительного процесса, а их ингибиторы улучшают процесс заживления язвы роговицы, вызванной ожогом.

6. Показано, что ангиостатины ингибируют неоваскуляризацию, индуцированную ожогом роговицы глаз кроликов in vivo и основным фактором роста в подкожных имплантатах мышей ex vivo. Из in vitro a in vivo результатов следует, что ингибирование ангиостапшами генерации плазмина из плазминогена является одним из механизмов их сложного антиангиогенного действия.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих публикациях:

1. Gulin D.A.. Mukhametova L.I., Aisina R.B., Varfolomeyev S.D. Correlation between Glu-plasminogen conformation and kinetic parametres of its activation by staphylokinase // Progress in Chemical and Biochemical Physics, Kinetics and Thermodynamics, 2008, Nova Science Publishers, N.-Y. Editors: G.E. Zaikov, P. 91-102.

2. Мухаметова JI.И. Гулин Д.А.. Биневский П.В., Айсина Р.Б., Кост О.А., Никольская И.И.

Перекрестное влияние ингибиторов ренин-ангиотензиновой и фибринолитической систем на их ключевые ферменты in vitro // Биоорганическая химия, 2008, Т. 34, № 4, С. 471-478.

3. Чеснокова Н.Б., Никольская И.И., Мухаметова Л.И., Кост О.А., Айсина Р.Б., Безнос О.В.,

Столярова Е.П., Гулин ДА.. Биневский П.В. Компоненты фибринолитической и ренин-ангиотензиновой систем в тканевых структурах и жидких средах глаза кроликов в норме и после ожога роговицы // Российский офтальмологический журнал, 2008, Т. 1, № 2, С. 4650.

4. Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Гулин Д.А.. Левашов М.Ю., Присяжная Н.В., Гершкович

К.Б., Варфоломеев С.Д. Ингибирующие эффекты ангиостатика на активность системы плазминоген/активаторы плазминогена // Биохимия, 2009, Т. 74, С. 1356 -1367.

5. Moukhametova L.I., Aisina R.B., Gershkovich К.В., Gulin D A., Varfolomeyev S.D. Influence

of fibrin-monomer on activation of Glu- and Lys-forms of plasminogen by staphylokinase // Intern. Congress on Thrombosis, Hacmostasis and Vascular Pathology, 14й Meeting of the Danubian League against Thrombosis and Haemorragic disorders, Symposium of the All-Russian Association on Thrombosis, Haemostasis and Vascular Pathology, St. Peterburg, Russia, 2004, P. 36.

6. Гулин ДА., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Гершкович К.Б., Варфоломеев С.Д. Активация

Glu- и Lys-форм плазминогена рекомбинантной стафилокиназой в присутствии фибрин-мономера // XLVIII Научная Конференция Московского физико-технического института, Москва, 2005, С. 43.

7. Гулин Д.А.. Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Гершкович К.Б. Активация Glul- и Lysl-форм

плазминогена рекомбинантной стафилокиназой в присутствии фраксипарина // V Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика", Москва, 2005, С. 52.

8. Gulin D.A., Mukhametova L.I., Gershkovich К.В., Aisina R.B., Varfolomeyev S.D. Effect of

heparins on the activation kinetics of Glu-plasminogen and Lys-plasminogen by staphylokinase // Moscow International Conference "Biotechnology and Medicine", Moscow, 2006, P. 212.

9. Гулин Д А., Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Варфоломеев С.Д. Взаимосвязь конформации

Глу-плазминогена и кинетическими параметрами его активации стафилокиназой // VI

Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика", Москва, 2006, С. 43.

10. Гулин ДА.. Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Присяжная Н.В., Варфоломеев С.Д., Чеснокова Н.Б. Влияние ингибиторов ренин-ангиотензиновой системы на активацию плазминогена in vitro // VII Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика", Москва, 2007, С. 47.

11. Gulin D.A.. Mukhametova L.l. Role of components of local fibrinolytic system of rabbit eye in inflammation and healing of cornea // IV Московский Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2007, С. 280.

12. Айсина Р.Б., Мухаметова ЛИ., Гулин Д А.. Ларин С.С., Князев АИ., Гершкович К.Б., Левашов М.Ю., Варфоломеев С.Д. Тест-систсма для оценки антиангиогенной активности ангиостапш-подобных фрагментов плазминогена in vitro // XIV Российский Национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2007, С. 604.

13. Мухаметова Л.И., Гулин Д.А.. Присяжная Н.В., Айсина Р.Б., Никольская Н.И., Кост О.А., Чеснокова Н.Б. Влияние ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента на компоненты фибринолитической системы in vitro И XIV Российский Национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2007, С. 160-161.

14. Мухаметова Л.И., Гулин Д.А.. Присяжная Н.В., Крамор Р.В., Айсина Р.Б. Влияние гипотензивных препаратов на прогеолитическую активность плазмина и активаторов плазминогена in vitro II VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007,С. 160. ,

15. Aisina R.B., Mukhametova L.I., Gulin D A.. Larin S.S., Gershkovich K.B., Levashov M.Y., Varfolomeyev S.D. Inhibition of plasminogen/plasminogen activator system by angiostatin-Iike plasminogen fragments is involved in mechanism of antiangiogenesis // J. Thromb. Haemost, 2007, V. 5, Suppl. 2, P. 383.

16. Mukhametova L.I., Aisina R.B., Gulin D.A.. Beznos O.V., Stoljarova E.P., Chesnokova N.B. Fibrinolytic system components in rabbit tears after chemical bum of cornea // J. Thromb. Haemost., 2007, V. 5, Suppl. 2, P. 407.

17. Чеснокова Н.Б., Никольская И.И., Мухаметова Л.И., Кост О.А., Айсина Р.Б., Безнос О.В., Столярова Е.П., Гулин Д.А.. Биневский П.В. Взаимосвязь фибринолитической и реиин-ангиотензиновой систем глаза в норме и после ожога роговицы // VIII Ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика", Москва, 2008, С. 73,

18. Aisina R., Gulin Р.. Levashov М., Mukhametova L., Gershkovich К. and Varfolomeyev S. Test-systems for estimating the biological activities of angiostatin-like plasminogen fragments in vitro II J. Thromb. Haemost., 2008, V. 6, Suppl. 1, Wl-01.

19. Mukharaetova L., Gulin P.. Aisina R., Kost O., Nikolskaya I., Bcznos O. and Chesnokova N. Activity of fibrinolytic system (FS) components and angiotensin converting enzyme (ACE) in various tissues of rabbit eyes before and after cornea burn // J. Thromb. HaemosL, 2008, V. 6, Suppl. 1, P5-0I.

20. Gulin P.. Mukhametova L., Aisina R., Binevski P., Kost 0.: Nikolskaya I., Gershkovich K, and Varfolomeyev S. interference of the inhibitors of renin-angiotensin system (RAS) and fibrinolytic system (FS) on their key enzymes in vitro // J. Thromb. HaemosL, 2008, V. 6, Suppl. l,P5-02.

21. Безнос O.B., Никольская И.И., Чеснокова Н.Б., Столярова Е.П., Мухаметова Л.И., Биневский П.В., Гулин ДА. Влияние ожоговой травмы роговицы на активность компонентов локальных ренин-ангиотензиновой и фибринолитической систем в слезе и водянистой влаге у кроликов // Труды научно-практической конференции с международным участием «Российский общенациональный офтальмологический форум», Москва, 2008, С. 133-136.

22. Гулин Д.А.. Мухаметова Л.И., Айсина Р.Б., Гершкович К.Б. Кинетика активации плазминогена рекомбинантной стафилокиназой (SakSTAR) в присутствии фраксипарина // IV Всероссийская конференция по клинической гемосгазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, Москва, 2009, С. 133.

23. Присяжная Н.В., Мухаметова Л.И., Гулин Д.А.. Гершкович К.Б., Айсина Р.Б. Ингибирующие эффекты ангиостатинов на активацию плазминогена под действием эндогенных активаторов плазминогена. // IV Всероссийская конференция по клинической гемосгазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, Москва, 2009, С. 412413.

24. Gulin Р.А.. Mukhametova L.I., Beznos O.V., Prisyazhnaya N.V., Aisina R.B., Chesnokova N.B., Varfolomeyev S.V. Activity of fibrinolytic system and inhibition of neovascularization by angiostatin in rabbit eye inflammation model // International Conference "Biocatalysis-2009: fundamentals & applications", Arkhangelsk, 2009, P. 125-126.

25. Aisina R., Mukhametova L., Prisyazhnaya N., Gulin P., Gershkovich K., Varfolomeyev S. Mechanism of inhibitory action of angiostatin on plasminogen (Pg) activation by tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase (uPA) // J. Thromb. HaemosL, 2009. V. 7, Suppl. 2, PP-TH-227,P. 1010.

26. Mukhametova L., Gulin P.. Aisina R., Beznos O., Chesnokova N., Nikolskaya N., Binevski P., Kost O. The effect of tranexamic acid and captopril on inflammatory process // J. Thromb. HaemosL, 2009,7, Suppl. 2, PC-005, P. 1172.

Подписано в печать:

19.10.2009

Заказ № 2758 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гулин, Дмитрий Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.б

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. Фибринолитическая система крови человека.

1.1. Основные компоненты фибринолигической системы.

1.2. Структура молекулы плазминогена и специфичность плазмина.

1.3. Физиологические активаторы плазминогена.

1.3.h Тканевый активатор плазминогена.

1.3.2.Урокиназа и про-урокиназа.

1.4. Ингибиторы фибринолитической системы.

1.4.1 Ингибиторы плазмина.

1.4.2. Ингибиторы активаторов плазминогена.

Глава 2. Активаторы плазминогена бактериального происхождения.

Глава 3. Влияние различных эффекторов на активацию плазминогена в плазмин.

3.1. Влияние фибрина.

3.2. Влияние хлорид ионов.

3.3. Влияние гепарина.

Глава 4. Роль фибринолитической системы (FS) в физиологических и патологических процессах.

4.1. Фибринолитическая система и тромболизис.

4.2. Фибринолитическая система и воспалительные процессы.

4.3. Фибринолитическая система и онкологические заболевания.

4.4. Фибринолитическая система и ангиогенез.

4.3.1. Про- и антиангиогенные активности фибринолитической системы.

4.3.2. Превращение плазмин(оген)а в ангиостатины in vivo и in vitro.

4.5. Фибринолитическая система и заболевания глаза.

4.6. Фибринолитическая система (FS) и ренин-ангиотепзиновая система (RAS) в гемососудистой регуляции.

4.6.1. Основные компоненты ренин-ангиотензиновой системы (RAS).

4.6.2. Взаимосвязь фибринолитической (FS) и реннн-ангиотензиповой систем (RAS) в гемососудистой регуляции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 5. Исходные вещества.

Глава 6. Методики эксперимента.

6.1. Выделение, очистка и характеристика белковых препаратов.

6.2. Определение активностей ферментов по скоростям гидролиза их специфических субстратов.

6.3. Изучение влияния различных эффекторов на скорость активации плазминогена его активаторами.

6.4. Изучение влияния различных эффекторов па кинетические параметры активации плазминогена под действием его активаторов.

6.5. Изучение перекрестного влияния ингибиторов FS и RAS на активности ключевых ферментов систем in vitro.

6.6. Воспаление глаза кролика, индуцированное ожогом роговицы.

6.7. Влияние ожога роговицы и инсталляции t-AMCHA и каптоприла на уровни компонентов FS и RAS в слезной жидкости и клиническую картину воспалительного процесса глаза кролика.

6.8. Изучение влияния ангиостатина К 1-4,5 на неоангиогенез в экспериментах in vivo.

6.9. Изучение влияния ангиостатинов К1-3 и К1-4,5 на неоангиогенез в экспериментах ex vivo.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетические закономерности и механизм регуляции активности фибринолитической системы различными эффекторами"

Основной физиологической функцией фибринолитической системы (FS) является ограничение тромбообразования и обеспечение внутрисосудистого кровотока. FS включает несколько основных групп компонентов: I) протеолитический фермент плазмин и его неактивный предшественник плазминоген, 2) активаторы плазминогена тканевого (t-PA) и урокиназного типа (u-РА и его одноцепочечный предшественник scu-PA) и 3) ингибиторы плазмина и активаторов плазминогена. В современной терапии тромбозов и тромбоэмболических заболеваний (инфаркта миокарда, инсульта и др.) используются физиологические активаторы плазминогена (t-PA, scu-PA и u-PA) и белок бактериального происхождения стрептокиназа (SK), которые превращают эндогенный плазминоген в плазмин, который растворяет фибрин тромба.

В последние годы за рубежом проводятся клинические испытания нового тромболитического агента - рекомбинантной стафилокиназы (STA), биохимические свойства которой еще не конца изучены. В связи с этим изучение кинетики активации различных форм плазминогена человека под действием STA и выяснение фибринспецифичносги реакции были одной из целей данной диссертационной работы.

Благодаря особенностям строения каждого из компонентов FS, их взаимодействия между собой и с клеточными и тканевыми рецепторами, модулированию этих взаимодействий разными факторами осуществляется сложное функционирование в различных состояниях организма. Активация или ингибирование активности FS могут быть индуцированы как внутренними факторами, вызванными теми или иными заболеваниями, так и внешними факторами, связанными с введением лекарственных средств. Поэтому другой целью данной работы было исследование in vitro влияния на кинетику активации плазминогена эффекторов, присутствующих (NaCl) или образующихся в организме (фибрин), а также эффекторов, которые могут быть введены в кровоток как лекарственные средства (гепарины и гипотензивные агенты).

К настоящему времени установлено, что FS принимает участие во многих физиологических и патологических процессах. FS играет важную роль в патологии опухолей. Она вовлекается в развитие ангиогенеза - образования в органе или ткани новых кровеносных сосудов, необходимых для роста опухоли. Опухолевые клетки высвобождают активаторы плазминогена и их рецепторы, стимулируя тем самым активацию плазминогена в межклеточном матриксе. Образующийся плазмин вместе с активированными им MMPs вызывает деградацию белков в межклеточном матриксе, создавая условия для миграции эндотелиальных клеток, необходимых для формирования сосудов. Кроме юго, плазмин, стимулируя разрушение основания мембраны и межклеточного матрикса, создает условия для миграции и инвазии опухолевых клеток в другие ткани и органы (метастазы). Удивительным было открытие ингибирования ангиогеиеза продуктами деградации плазмин(оген)а -ангиостатинами, представляющими крингл-фрагменты его тяжелой цепи. Механизм антиангиогенпого и противоопухолевого действия ангиостатинов сложен и до конца не выяснен. Поэтому частью данной работы было изучение влияние ангиостатинов на кинетику активации плазминогена его активаторами in vitro и на неоваскуляризацию в условиях in vivo и ex vivo с целью получения новых данных о механизме их действия.

Известно, что основной функцией FS является растворение фибриновых сгустков, а ренип-ангиогензиновой (RAS) - регуляция сосудистого тонуса. Тог факт, что стимулирование RAS увеличивает, а его ингибирование уменьшает риск сердечнососудистых заболеваний, указывает на взаимосвязь циркуляторных FS и RAS, механизм которой до конца не известен. К настоящему времени отмечены некоторые функциональные связи циркуляторных FS и RAS человека.

Показано, что обе системы участвуют в воспалительных процессах. Ключевые ферменты RAS (ангиотензин-превращающий фермент, АСЕ) и FS (плазмин и активаторы плазминогена) могут влиять на активность и/или высвобождение друг друга, за счет чего достигается сложная и многоступенчатая регуляция таких процессов, как образование и лизис тромбов, спазм и расширение сосудов, синтез и расщепление коллагена и адгезивных белков. Все эти реакции являются необходимыми компонентами воспалительного и репаративного процессов.

Помимо кровотока компоненты FS и RAS могут присутствовать локально во многих тканях и органах. Например, в глазу широко представлены компоненты локальных RAS и FS. Они выполняют самые разнообразные функции и играют важную роль в патогенезе таких заболеваний, как диабетическая ретинопатия, глаукома, воспалительные процессы и др. Эти системы модулируют проницаемость сосудов, стимулируют миграцию и адгезию клеток, инициируют синтез провоспалительных веществ, активно участвуют в неоваскуляризации тканей. К настоящему времени взаимосвязь локальных FS и RAS глаза не исследована.

Поэтому еще одной целью данной работы являлось исследование in vivo взаимосвязи FS и RAS в ходе воспалительного процесса. С этой целью в качестве объекта исследования выбрана модель ожога роговицы глаз кроликов, так как прозрачность срсд глаза позволяет наблюдать и полуколичественно оценить развитие воспалительного процесса. Кроме того, слезная жидкость, омывающая роговицу, постоянно восполняется и может отбираться прижизненно неипвазивным методом, а характер изменения метаболических процессов в слезной жидкости коррелирует е клиническими проявлениями многих заболеваний глаз.

В литературе имеются разрозненные и порою противоречивые данные об уровнях компонентов FS в слезной жидкости после ожога роговицы глаза кролика. Ограниченное число работ посвящено изучению влияния ожога роговицы на уровни активаторов плазминогена в тканевых структурах глаза. В жидких средах и тканевых структурах глаза обнаружены и многие компоненты RAS. обнаружено, что после ожога наблюдается два пика повышения активности АСЕ: в острый период и в период наибольшего изъязвления роговицы.

Для выяснения взаимозависимого функционирования FS и RAS глаза в данной диссертации акцент был сделан на сравнительное исследование: уровней компонентов FS и АСЕ в жидких средах и тканях глаза в норме; изменения их уровней в водянистой влаге и тканях глаза в острый период воспалительного процесса, вызванного ожогом роговицы; динамики изменения функциональных уровней компонентов FS и АСЕ в слезной жидкости при развитии ожогового процесса и при инсталляции различных эффекторов с одновременной оценкой клинической картины развития воспаления и заживления травмы.

Следует подчеркнуть, что эксперименты in vivo , включающие ожог роговицы глаз кроликов, инсталляции различных эффекторов, отбор и подготовку проб для анализа и оценку клинической картины ожоговой болезни глаза, были проведены сотрудниками лаборатории Биохимии, возглавляемой проф. Чесноковой Н.Б., в ФГУ Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий. Эксперименты, связанные с получением АСЕ и анализом его активности в различных средах глаза были выполнены сотрудниками научной группы кафедры химической энзимологии Химфака МГУ, возглавляемой в.н.с., к.х.н. Кост О.А. Эти совместные исследования были проведены в рамках проекта № 06-04-49712 РФФИ.

Остальные исследования, результаты которых представлены в данной диссертации, были поддержаны НТП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг., раздел 5 (Договор с ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» № 34/07-Ген-М и 34/08-Ген-М) и проектами «Высшая школа-2007 и 2008» РФФИ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава 1. Фибринолитическая система крови человека

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гулин, Дмитрий Андреевич

выводы

1. Получены гликоформы 1 и 2 Glu- и Lys-плазминогенов человека. Изучено влияние фибрина, хлорид-ионов, гепарина, фраксипарина и их комбинаций на кинетику активации различных форм плазминогена его активаторами и получены новые данные о механизме их стимулирующего или ингибирующего действия.

2. Впервые определены кинетические параметры активации гликоформ 1 и 2 Glu- и Lys-плазминогеиов стафилокиназой и обнаружено сильное стимулирование фибрином (в 13-40 раз) активации всех зимогенов, однако N-гликозилирование крингла 3 снижает сродство гликоформы 1 Glu- и Lys-плазмипогенов к фибрину.

3. Получены две формы ангиостатина, представляющие крингл-фрагменты К1-3 и К1-4,5 тяжелой цепи плазминогена человека. Впервые показано, что ангиостатины ингибируют in vitro генерацию плазмина из плазминогена под действием физиологических активаторов и предложен механизм ингибирования.

4. Обнаружено перекрестное ингибирование in vitro ингибиторами фибринолитической (FS) и ренин-ангиотензиновой систем (RAS) активности ключевых ферментов двух систем.

5. Впервые проведено сравнительное изучение изменений уровней компонентов FS и RAS в воспалительном процессе, вызванном ожогом роговицы глаз кроликов и обнаружено: а) Увеличение уровня ключевых ферментов двух систем в водянистой влаге передней камеры и в тканях глаза (хрусталике, стекловидном теле, радужке, цилиарном теле, сетчатке, хориоидее, роговице и конъюнктиве) в острый период ожоговой болезни; б) Повышение активности ключевых ферментов RAS и FS в слезной жидкости, в острый период и в период максимального изъязвления роговицы; в) Улучшение клинической картины ожоговой болезни глаз кроликов (снижение площади и глубины дефекта и более быстрое заживление язвы роговицы) при инстилляции как ингибитора RAS, так и ингибитора FS.

Таким образом, обнаружена взаимосвязь локальных RAS и FS, функционирующих в жидких средах и в тканях (сосудистых и бессосудистых) глаз кроликов. Обе системы участвуют в развитии воспалительного процесса, а их ингибиторы положительно влияют на процесс заживления язвы роговицы, вызванной ожогом.

6. Показано, что ангиостатины ингибируют неоваскуляризацню, вызванную как ожогом роговицы глаз кроликов in vivo, так и индуцированную основным фактором роста в подкожных имплантатах мышей ex vivo.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гулин, Дмитрий Андреевич, Москва

1. Saksela О. and Rifkin D.B. Cell-associated plasminogen activation: regulation and physiological functions. // Annu. Rev. Cell Biol. 1988. V. 4. P. 93-126.

2. Robbins K.C. The human plasma fibrinolytic system: regulation and control. // Mol. Cell. Biochem. 1978. V. 20. P. 149-57.

3. Vassalli J.D. The urokinase receptor. // Fibrinolysis. 1994. V. 8. P. 172-181.

4. Lesuk A., Terminiello L. and Traver J.PI. Crystalline human urokinase: some properties. // Science. 1965. V. 147. P.880-2.

5. Duffy M.G. Urokinase-type plasminogen activator and malignancy. // Fibrinolysis. 1993. V. 7. P. 295-302.

6. Binder B.R. Physiology and pathophysiology of the fibrinolytic system // Fibrinolysis. 1995. V. 9. Suppl. 1. P. 3-8.

7. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. М.:«Спорт и культура», 1999. 464 с.

8. MacDonald N.J., Murad А.С., Fogler W.E., Lu Y. and Sim B.K.L. The tumor-suppressing activity of angiostatin protein resides within kringles 1 to 3. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 264. P. 469-477.

9. Stack M.S., Gately S., Bafetti L.M., Enghild J.J., and Soff G.A. Angiostatin inhibits endothelial and melanoma cellular invasion by blocking matrix enhanced plasminogen activation. // Biochem. J. 1999. V. 340. V. 77 - 84.

10. Ploug M. Structure-function relationships in the interaction between the urokinase-type plasminogen activator and its receptor. // Curr. Pharmaceut. Design. 2003. V. 9. P. 14991528.

11. Bachmann F. Fibrinolysis. In: Verstraete M., Vermylen J., Lijnen R., Arnout J. (eds): Thrombosis and Haemostasis. Leuven University Press. 1987. P. 227-265.

12. Booth N. А. // Fibrinol. Proteol. 2000. V. 14. P. 206-213

13. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. М.:«Спорт и культура», 1999. 464 с.

14. Castellino F.J. Plasminogen activators. // Bioscience. 1983. V. 33. P. 647-650.

15. Ponting, C.P., Marshall, J.M. and Cederholm-Williams, S.A. Plasminogen: a structural review. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1992. V. 3. P. 605-614.

16. Markus G. Conformational changes in plasminogen, their effect on activation, and the agents that modulate activation rates a review. // Fibrinolysis 1996. V. 10, P. 75-85

17. Wahl M.L., Kenan D.J., Gonzalez-Gronow M. and Pizzo S.V. Angiostatin's Molecular Mechanism: Aspects of Specificity and Regulation Elucidated. Journal of Cellular. // Biochemistry. 2005. V. 96. P. 242-261.

18. Lerch P.G., Rickli E.E., Lergier W. and Gillessen D. Localization of individual lysine-binding regions in human plasminogen and investigations on their complex-forming properties. // Eur. J. Biochem. 1980. V. 107. P. 7-13.

19. Matsuka Iu.V, NovokhatniT V.V. and Kudinov S.A. Two classes oflysine-binding sites of plasminogen molecule. // Ukr. Biokhim. Zh. 1990 V. 62. P. 83-6.

20. Wiman В., Lijnen II.R. and Collen D. On the specific interaction between the lysine-binding sites in plasmin and complementary sites in alpha2-antiplasmin and in fibrinogen. // Biochim. Biophys Acta. 1979. V. 579. P. 142-54.

21. Petros AM, Ramesh V, Llinas M. 1H NMR studies of aliphatic ligand binding to human plasminogen kringle 4. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 1368-76.

22. Rejante M.R., Byeon I.J. and Llinas M. Ligand specificity of human plasminogen kringle 4. // Biochemistry. 1991. V. 30 P. 11081 -92,

23. Mulichak A.M., Tulinsky A. and Ravichandran K.G. Crystal and molecular structure of human plasminogen kringle 4 refined at 1.9-A resolution. // Biochemistry. 1991. V. 30(43). P. 10576-88.

24. Clemmensen I., Petersen L.C. and Klufit C. Purification and characterization of a novel, oligomeric, plasminogen kringle 4 binding protein from human plasma: tetranectin. // Eur. J. Biochem. 1986. V. 156. P. 327-33.

25. Novokhatny V.V., Matsuka Yu.V. and Kudinov S.A. Analysis of ligand binding to kringles 4 and 5 fragments from human plasminogen. // Thromb Res. 1989. V. 53. P. 24352

26. Thewes Т., Constantine K., Byeon I.J. and Llinas M . Ligand interactions with the kringle 5 domain of plasminogen. A study by 1H NMR spectroscopy. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 3906-15.

27. Varadi & Patthy, Kringle 5 of human plasminogen carries a benzamidine-binding site. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V. 103. P. 97-102

28. Miles L.A., Dahlberg C.M., Plescia J., Felez J., Kato K. and Plow L.F. Role of cell-surface lysines in plasminogen binding to cells: identification of alpha-enolase as a candidate plasminogen receptor. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 1682-91.

29. Gonzalez-Gronow M., Edelberg J.M. and Pizzo S.V. Further characterization of the cellular plasminogen binding site: evidence that plasminogen 2 and lipoprotein a compete for the same site. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 2374-7.

30. Wu H.L., Wu I.S., Fang R.Y., Hau J.S., Wu D.H., Chang B.I., Lin T.M. and Shi G.Y. The binding of plasminogen fragments to culturcd human umbilical vein endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 188. P. 703-11

31. Burge S.M., Marshall J.M., Cederholm-Williams S.A. Plasminogen binding sites in normal human skin. // Br. J. Dermatol. 1992. V. 126. P. 35-41.

32. Suenson E. and Thorsen S. Secondary-site binding of Glu-plasmin, Lys-plasmin and miniplasmin to fibrin. // Biochem J. 1981. V. 197. P. 619-28.

33. Lukas M.A., Fretto L.J. and McKee P.A. The binding of human plasminogen to fibrin and fibrinogen. Hi. Biol. Chem. 1983. V.258. P. 4249-4256

34. Thorsen S., Clemmensen I., Sottrup-Jensen L. and Magnusson S. Adsorption to fibrin of native fragments of known primary structure from human plasminogen. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 668. P. 377-87.

35. Ponting, C.P., Marshall, J.M., and Cederholm-Williams, S.A. Plasminogen: a structural review. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1992. V. 3. P. 605-614.

36. Marshall, J.M., Brown, A.J., and Pointing, C.P. Conformational studies of human plasminogen and plasminogen fragments: evidence for a novel third conformation of plasminogen. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 3599-3606.

37. Rijken D.C. and Sakharov D.V. Basic principles in thrombolysis: regulatory role of plasminogen. //Thromb. Res. 2001. V. 103. S41-9.

38. CasteIIino F.J. and Ploplis V.A. Structure and function of the plasminogen/plasmin system. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 647-54.

39. Boxrud P.D. and Bock P.E. Streptokinase binds preferentially to the extended conformation of plasminogen through lysine binding site and catalytic domain interactions. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 13974-13981.

40. Walther P.J., Hill R.L. and McKee P.A. The importance of the preactivation peptide in the two-stage mechanism of human plasminogen activation. // J. Biol Chem. 1975. V. 250. P. 5926-33.

41. Mangel W.F., Lin B. and Ramakrishnan V. Characterization of an extremely large, ligand-induced conformational change in plasminogen. // Science 1990. V. 248. P. 69-73.

42. Holleman W.H., Andres W.W. and Weiss L.J. The relationship between the lysine and the p-aminobenzamidine binding sites on human plasminogen. // Thromb. Res. 1.975. V. 7. P.683-93.

43. Markus G., DePasquale J.L. and Wissler F.C. Quantitative determination of the binding of epsilon-aminocaproic acid to native plasminogen. // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. P.727-32.

44. Markus G., Priore R.L., Wissler F.C. The binding of tranexamic acid to native (Glu) and modified (Lys) human plasminogen and its effect on conformation. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1211-1216.

45. Rickli & OtavSKy, A new method of isolation and some properties of the heavy chain of human plasmin. // Eur J Biochem. 1975. V. 59. P. 441-7.

46. Urano Т., de Serrano V.S., Chibber B.A.K., Castellino F.J. The control of the urokinase-catalysed activtion of human glutamic acid 1-plasminogen by positive and negative effectors. //J. Biol. Chem. 1987, V. 262. P. 15959-15964.

47. Urano Т., de Sarrano V.S., Gaffney P.J., and Castellino, F.J. (1988) Biochemistry, 34, 9581-9586.

48. Thorsen, S., and Mullertz, S. ate of activation and electrophoretic mobility of unmodified and partially degraded plasminogen. Effects of 6-aminohexanoic acid and related compounds. // Scand. J. Lab. Invest. 1974. V. 34. P. 167-176.

49. Takada, A., Makino, Y., and Takada, Y. Effects of tranexamic acid on fibrinolysis, fibrinogenolysis and amidolysis. // Thromb. Res. 1986. V. 42. P. 39-47.

50. Hoylaerts M., Lijnen H.R. and Collen D. Studies on the mechanism of the antifibrinolytic action of tranexamic acid. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 673. P. 75-85.

51. Sottrup-Jensen et al., 1978;

52. Castellino, F.J., and Powell, J.R. Human plasminogen. // Methods Enzymol. 1981. V. 80. P. 365-378.

53. Miles L.A., Levin E.G., Plescia J., Collen D. and Plow E.F. Plasminogen receptors, urokinase receptors, and their modulation on human endothelial cells. // Blood. 1988. V. 72. P. 628-35.

54. Wiman B. and Wallen P. The specific interaction between plasminogen and fibrin. A physiological role of the lysine binding site in plasminogen. // Thromb. Res. 1977. V. 10 P. 213-222.

55. Wiman В., Collen D. On the kinetics of the reaction between human antiplasmin and plasmin. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 84. P.573-8.

56. Violand B.N., Byrne R., Castellino F.J. The effect of alpha-, omcga-amino acids on human plasminogen structure and activation. // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. P. 5395-401.

57. Urano T, Chibber B.A.K. and Castellino F.J. The reciprocal effects of e-aminohexanoic acid and chloride ion on the activation of human Glul plasminogen by human urokinase. // Biochemistry 1987. V. 84. P. 4031-4034.

58. Edelberg J.M. and Pizzo S.V. Kinetic analysis of the effects of heparin and lipoproteins on tissue plasminogen activator mediated plasminogen activation. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 5906-11.

59. Loscalo J. Structural and kinetic comparison of recombinant human single- and two-chain tissue plasminogen activator. // J. Clin. Invest. 1992. V. 82. P. 1391-1397.

60. Aisina R., L. Moukhamelova R., Gershkovich K., Varfolomeyev S. The role of carbohydrate side chains of plasminogen in its activation by staphylokinase. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1725. P. 370-376.

61. Dobrovolsky A.B. and Titaeva E.V. The Fibrinolysis System: Regulation of Activity and Physiologic Functions of Its Main Components. // Biochemistry (Moscow). 2002. Vol. 67. P. 99-108.

62. Groskopf W.R., Summaria L., Robbins K.C. Studies on the active center of human plasmin. Partial amino acid sequence of a peptide containing the active center serine residue. // J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 3590-7.

63. Фибринолиз: Современные фундаментальные h клинические концепции. Пер. с англ. // Под ред. П. Дж. Гаффни., С. Балкув-Улютина. М.: Медицина. 1982. 240 с.

64. Tanizava К., Kasaba Y., Kanaoka Y. "Inverse substrates" for trypsin. Efficient enzymatic hydrolysis of certain esters with a cationic center in the leaving group 1. // J. Amer. Chem. Soc. 1977. V. 99. P. 4485-4488

65. Kiss I., Aurell L., Pozsgay M., Elodi P. Investigation on the substrate specificity of human plasmin using tripeptidyl-p-nitroanilide substrates. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1985. V. 131. P. 928-934

66. Bachmann F. The enigma PAI-2. Gene expression, evolutionary and functional aspects. // Thromb. Flaemost. 1995. V. 74. P. 172-9.

67. Stepanova V.V. and Tkachuk V.A. Urokinase as a Multidomain Protein and Poly functional Cell Regulator. // Biochemistry (Moscow). 2002. V. 67. P. 109-118.

68. Higgins D.L. and Vehar G.A. Interaction of one-chain and two-chain tissue plasminogen activator with intact and plasmin-degraded fibrin. // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 778691.

69. Collen D and Lijnen H.R. Tissue-type plasminogen activator: a historical perspective and personal account. // J. Thromb. Haemost. 2004. V. 2. P. 541-6.

70. Collen D. The plasminogen (fibrinolytic) system. // Thromb. Haemost. 1999. V. 82. P. 259-270.

71. Lijnen H.R. Elements of the Fibrinolytic System. // Annals of thr NewYork Academy of science. 2001. V. 936. P. 226-236.

72. Hoylaerts M., Rijken D.C., Lijnen H.R. and Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator. Role of fibrin.// J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 2912-9.

73. Jeremiah, J., Schrier, J. A., Rao, J. R. & Amphlett, G. W. // Thromb. Hemostasis 1985. V.54. abstr. 252.

74. Fears R., Hibbs M.J. and Smith R.A. Kinetic studies on the interaction of streptokinase and other plasminogen activators with plasminogen and fibrin. // Biochem. J. 1985. V. 229. P. 555-8.

75. Rijken D.C., Hoylaerts M. and Collen D. Fibrinolytic properties of one-chain and two-chain human extrinsic (tissue-type) plasminogen activator. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 2920-2925.

76. Redlitz A. and Plow E.F. Receptors for plasminogen and t-PA: an update. // Bailliere's clinical haematology. 1995. V. 8. P. 313-27.

77. Hajjar K.A., Nachman R.L. Endothelial cell-mediated conversion of Glu-plasminogen to Lys-plasminogen. Further evidence for assembly of the fibrinolytic system on the endothelial cell surface. // J. Clin. Invest. 1988. V. 82. P. 1769-78.

78. Zhang L., Gong Y., Grella D.K., Castellino F.J. and Miles L.A. Endogenous plasmin converts Glu-plasminogen to Lys-plasminogen on the monocytoid cell surface. // J. Thromb. Haemost. 2003.V. 1. P. 1264-70.

79. Cesarman-Maus G. and Hajjar K.A. Molecular mechanisms of fibrinolysis. // Br. J. Haematol. 2005. V. 129. P. 307-21.

80. Otter M.? Kuiper J., van Berkel T.J. and Rijken D.C. Mechanisms of tissue-type plasminogen activator (t-PA) clearance by the liver. // Ann. N Y Acad. Sci. 1992. V. 667. P. 431-42

81. Duffy M.G. Urokinase-type plasminogen activator and malignancy. // Fibrinolysis. 1993. V. 7. P. 295-302.

82. Flansen A.P., Petros A.M., Meadows R.P. et al. Solution structure of the amino-terminal fragment of urokinase-type plasminogen activator. // Biochem. 1994. V. 33. P. 4847-4864

83. Stephens R.W., Bokman A.M., Myohanen H.T., Reisberg Т., Tapiovaara H., Pedersen N., Grondahl-Hansen J., Llinas M., and Vaheri A. Heparin binding to the urokinase kringle domain. // Biochemistry 1992. V. 31. P. 7572-7579.

84. Lijnen H.R., Stump D.C., Collen D.C. Single-chain urokinase-type plasminogen activator: mechanism of action and thrombolytic properties. // Seminars in Thromb. and Hacmost.1987. V.13. P. 152-159

85. Christensen L.R. Quantitative determination of activity of streptococcal fibrinolysin. // Proc. Soc. Biol. Med. 1941. V. 46. P. 674-679.

86. Astrup Т., Mullerts S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. // Arch. Biochem. Biophys. 1952. V. 40. P. 346 351.

87. Kline D.L., Reddy K.N. Proactivator and activator levels of plasminogen in plasma as measured by caseinolysis. //J. Lab. Clin. Med. 1977. V. 89, P. 1153-8

88. Liu J.N. and Gurewich V. Inactivation of the intrinsic activity of pro-urokinase by diisopropyl fluorophosphate is reversible. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 8408-8410

89. Pannell R. and Gurewich V. Activation of plasminogen by single-chain urokinase or by two-chain urokinase a demonstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (pro-urokinase). // Blood. 1987 V. 69. P. 22-26;

90. Ellis V., Scully M.F., Kakkar V.V. Plasminogen activation by single-chain urokinase in functional isolation. A kinetic study. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 14998-15003

91. Manehanda N., Schwartz B.S. Interaction of single-chain urokinase and plasminogen activator inhibitor type 1. // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P. 20032-35

92. Violand B.N. and Castellino F.J. Mechanism of urokinase-catalysed activation of human plasminogen.//J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 3906-3912

93. Watahiki Y., Takada Y. and Takada A. Kinetic analysis of the activation of Glu-plasminogen by urokinase in the presence of fibrin, fibrinogen or its degradation products. //Thromb. Res. 1987. V. 46. P. 9-18

94. Ellis V., Behrend N. and Dano K. Plasminogen activation by receptor-bound urokinase. A kinetic study with both cell-associated and isolated receptor. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 12752-12758.

95. Stump D. C., Lijnen H. R. and Collen D. Purification and characterization of a novel low molecular weight form of single-chain urokinase-type plasminogen activator. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 17120-17126.

96. Lijnen H.R., Van Hoef B. and Collen D. Influence of cyanogen-bromide-digested fibrinogen on the kinetics of plasminogen activation by urokinase. // Eur. J. Biochem. 1984. V. 144. P. 541-544.

97. Lijnen H.R., Van Hoef В., De Cock F. and Collen D. The mechanism of plasminogen activation and fibrin dissolution by single chain urokinase-type plasminogen activator in a plasma milieu in vitro. // Blood. 1989. V. 73. P. 1864-1872

98. Collen D., Zamarron C., Lijnen H.R. and Hoylaerts M. Activation of plasminogen by pro-urokinase. II. Kinetics. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1259-1266.

99. Wohl R. C., Summaria L. and Robbins К. C. Kinetics of activation of human plasminogen by different activator species at pH 7.4 and 37°C // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. №5. P. 2005-2013.

100. Dewerchin M., Lijnen H. R., van Hoef В., De Cock F. and Collen D. Biochemical properties of conjugates of urokinase-type plasminogen activator with a monoclonal antibody specific for cross-linked fibrin. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 185. P.141-145.

101. Lubin T.M., Caban R. and Runge M.S. The tissue plasminogen activator finger domain confers fibrin-dependent enhancement of catalytic activity to single-chain urokinase-type plasminogen activator. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 5550-56.

102. Kuiper J., Rijken D. C., de Munk G. A., and van Berkel T. J. In vivo and in vitro interaction of high and low molecular weight single-chain urokinase-type plasminogen activator with rat liver cells. // J.Biol.Chem. 1992. V. 267. P. 1589-1595.

103. Nielsen L.S., Kellerman G.M., Behrendt N., Picone R., Dano K. and Blasi F. A 55,000 60,000 Mr receptor protein for urokinase-type plasminogen activator. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 2358-2363.

104. Ploug M., Ronne E., Behrendt N. Jensen A.L., Blasi F. and Dano K. Cellular receptor for urokinase plasminogen activator. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 1926-1933.

105. Vassalli J.D. The urokinase receptor. // Fibrinolysis. 1994. V. 8. P. 172-181.

106. Appclla E., Robinson E. A., Ullrich S. J., Stoppelli M. P., Corti A., Cassani G., and Blasi F. The receptor-binding sequence of urokinase. A biological function for the growth-factor module of proteases. // J.Biol.Chem. 1987. V. 262. P. 4437-4440.

107. Kounnas M. Z., Henkin J., Argraves W. S., and Strickland D. K. Low density lipoprotein receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor mediates cellular uptake of pro-urokinase. //J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 21862-21867.

108. Lijnen H.R., Collen D. Matrix metalloproteinase and coagulation system. // Thromb. Hacmost. 1999, 82: 837-845

109. Ugwu F., Van Floef В., Bini A., Collen D. and Lijnen H.R. Proteolytic cleavage of urokinase-type plasminogen activator by stromelysin-1 (MMP-3). // Biochemistry 1998. V. 37. P. 7231-7236.

110. Lijnen H.R., Ugwu F., Bini A. and Collen D. Generation of an angiostatin-like fragment from plasminogen by stromelysin-1 (MMP-3). // Biochemistry 1998. V. 37. P. 4699-4702

111. Mutch N.J., Thomas L„ Moore N.R., Lisiak K.M. and Booth N.A. TAFIa, PAI-1 and a2-antiplasmin: complementary roles in regulating lysis of thrombi and plasma clots. J Thromb Haemost 2007.V. 5. P. 812-7.

112. Collen D. On the regulation and control of fibrinolysis. // Tromb. Haemost. 1980. V. 43. P. 77-89.

113. Cederholm-Williams S. A., De Cock F., Lijnen H.R. and Collen D. Kinetics of the reactions between streptokinase, plasmin and a2-antiplasmin. // Eur. J. Biochcm. 1979. V. 100. P. 125-132.

114. Nillson T. and Wiman B. On the structure of the stable complex between plasmin and a2-antiplasmin. // FEBS Lett. 1982. V. 142. P. 111-114.

115. Mimuro J., Kimura S. and Aoki N. Release of a2-plasmin inhibitor from plasma fibrin clots by activated coagulation factor XIII. // J. Clin. Invest. 1986. V. 77. P. 1006-1013.

116. Goodnight SH, Hathaway WE. Disorders of Hemostasis and Thrombosis: a Clinical Guide, 2nd edn. New York, NY: McGraw-Hill, 2001: 187-9.

117. Anonick P.K., Gonias S.L. Soluble fibrin preparations inhibit the reaction of plasmin with Cb-macroglobulin // Biochem. J. 1991. V. 275. P. 53-59.

118. Kolev K., Lerant 1., Tenekejiev K., Machovich R. Regulation of fibrinolytic activity of neutrophil leukocyte elastase, plasmin, and miniplasmin by plasma protease inhibitors //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 17030-17034

119. Aoki N. Natural inhibitors of fibrinolysis. // Prog. Cardiovasc. Dis. 1979. V. 21. P. 267-286.

120. Brogren H, Karlsson L, Andersson M, Wang L, Erlinge D, Jern S. Platelets synthesize large amounts of active plasminogen activator inhibitor 1. (2004) Blood. 2004; 104:39433948.

121. Simpson AJ, Booth NA, Moore NR, Bennett B. The platelet and plasma pools of plasminogen activator inhibitor (PAI-1) vary independently in disease. Br J Haematol. 1990. V. 75. P. 543-548.

122. Blasi F., Vassali J.-D., Dano K. Urokinase-type plasminogen activator proenzyme, receptor and inhibitors. //J. Cell. Biol. 1987. V. 104. P. 801-804

123. Максименко A.B. Молекулярные взаимодействия при фибринолизе. Поиск новых активаторов плазминогена. // Молекул. Биол. 1995. Вып. 1. С. 38-60.

124. Wulf. R., Mertz Е. Studies of plasminogen. VIII. Species specifity of streptokinase. // Canad. J. Biochem. 1969. V. 49. P. 927-931.

125. McClintock D.K., Bell P.H. The mechanism of activation of human plasminogen by streptokinase. // Biochem Biophys Res Commun. 1971.V. 43. P. 694-702.

126. Reddy K.N.N, and Marcus G. Esterase activities in the zymogen moiety of the streptokinase-plasminogen complex. //J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 4851-4857.

127. Chibber B.A.K., Radek J.M., Morris J.P. and Castellino F.J. Rapid formation of an anion-sensitive active site in stoichiometric complexes of streptokinase and human Glulplasminogen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V. 83. P. 1237-1241.

128. Buck F.F., Hummel B.C.W., De Renzo E. C. Interaction of streptokinase and human plasminogen. V. Studies on the nature and mechanism of formation of the enzymatic site of the activator complex. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 3648-3654.

129. Lack C.H. Staphylokinase; an activator of plasma protease. Nature. 1948 Apr 10;161(4093):559. No abstract available.

130. Sako T. Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization. Eur J Biochem. 1985 Jun 18;149(3):557-63.

131. Schlott В., Hartmann M., Guhrs K.H. et al. High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy // Biotechnology 1994. V. 12. P. 185-189.

132. Collen D., De Mol M., Demarsin E., De Cock F., Lijnen H.R. Isolation and conditioning of recombinant staphylokinase for use in man. // Fibrinolysis. 1993. V. 7. P. 242-247.

133. Collen D., Silence K., Demarsin E., De Mol M., Lijnen II.R. Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. // Fibrinolysis. 1992. V. 6. P. 203-213.

134. Lijnen H.R., Van Hoef В., De Cock F., Okada K., Ueshima S., Matsuo O., Collen D. On the mechanism of fibrin-specific plasminogen activation by staphylokinase. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 11826-11832.

135. Yakovlev S., Golvatov S., Ingham K., and Medved L. Interaction of fibrin(ogen) with heparin: further characterization and localization of the heparin-hinding site. // Biochemistry 2003. V. 42. P. 7709-7716.

136. Weisel J.W. Fibrinogen and fibrin. // Advances in protein chemistry. 2003. Vol. 70. P.247-299.

137. Белицер В.А. Домены крупные, функционально важные блоки молекул фибриногена и фибрина. // Журн. биохим. живот, чел. АН УССР. 1982. №6. С. 3857.

138. Mihalyi E. Changes in pH associated with clotting of fibrinogen. Kinetic studies of the pH shift and correlation of the pH change with the release of fibrinopeptides and the ensuing polymerization. // Biochemistry. 1991. V.30. P.4753-4762

139. Veklich Y.I., Gorkun O.V., Medved' L.V., Nieuwenhuizen , Weisel J.W. Carboxyl-terminal portions of the D-chains of fibrinogen and fibrin. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. №18. P. 13577-13785.

140. Gorkun O.V., Veklich Y.I., Medved' L.V., Henschen A.H. Weisel J.W. Role of the ПС domains of fibrin in clot formation. // Biochemistry. 1994. V. 33. № 22. P. 69866997.

141. Dang C.V., Shin C.K., Bell W.R., Nagaswami C. and Weisel J.W. Fibrinogen sialic acid residues are low affinity calcium-binding sites that influence fibrin assembly. // J.Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 15104-15108.

142. Weisel J.W., Francis C.W., Nagaswami C., Marder V.J. Determination of the topology of factor ХШа-induced fibrin □-chain cross-links by electron microscopy of ligated fragments. Hi. Biol.Chem. 1993. V.268. P. 26618-26624.

143. Lijnen H. R. Plasmin and matrix metalloproteinases in vascular remodeling. // Thromb. Haemost. 2001. V. 86. P. 324-333

144. Randy M. Studies on kinetics of plasminogen activation by tissue plasminogen activator. // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 667. P. 4614-4619.

145. Thorsen S. The mechanism of plasminogen activation and the variability of the fibrin effector during tissue-type plasminogen activator-mediated fibrinolysis. Ann N Y Acad Sci 1992; 667: 52-63

146. Medved L, Nieuwenhuizen W. Molecular mechanisms of initiation of fibrinolysis by fibrin. Thromb Haemost 2003; 89: 409-19

147. Banya L, Patthy L. Importance of intramolecular interactions in the control of the fibrin affinity and activation of human plasminogen. // J. Biol Chem. 1984. V. 259. P. 6466-6471.

148. Takada A, Urano Т., Takada Y. Influence of coagulation on the activation of plasminogen by streptokinase and urokinase. // Thromb. Haemost. 1979. V. 42. P. 901908.;

149. Takada A., Takada Y. Activation of Glu-plasminogen by urokinase in the presence of fibrinogen, fibrin and SK-potentiator. // Thromb.Rcs. 1981. V. 22. P. 497-501.

150. Takada Y., Makino Y., Takada A. Glu-plasminogen I and II: their activation by urokinase and streptokinase in the presence of fibrin and fibrinogen. // Thromb. Res. 1985. V. 39. P. 289-296.

151. Rijken DC, De Munk GAW, Jie AFII. Interaction of plasminogen activators and plasminogen with heparin: Effect of ionic strength. // Thromb. Haemost. 1993. V. 70. P. 867-872.

152. Chibber В., Morris J., Castellino F. Effects of human fibrinogen and its cleavage products on activation of human plasminogen by streptokinase. // Biochemistry 1985. V. 24. P.3429-3434.

153. Urano Т., de Serrano V. S., Gaffney P. J., Castellino F.J. Effectors of the activation of human GIu1 plasminogen by human tissue plasminogen activator. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6522-6528

154. Yarzabal A., Serrano R.L., Puig J. Modulation of staphylokinase-dependent plasminogen activation by mono- and divalent ions. // Braz. J. Med. Biol. Res. 1999. V. 32. P. 39-43.

155. Li W., Johnson D.D., Esmon C.T., Huntington J.A. Structure of the antithrombin-thrombin-heparin ternary complex reveals the antithrombotic mechanism of heparin. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. V. 11. P. 857-862

156. Hirsh J. Low molecular weight heparin. // Thromb. Haemost. 1993. V. 70. P. 204-207.

157. Dementiev A., Petitou V., Herbert J.M., Gettins P.G.W. The ternary complex of antithrombin-anhydrothrombinheparin reveals the basis of inhibitor specificity. // Nat. Struct. Mol. Boil. 2004. V. 11. P. 863-867.

158. Andrade-Gordon P., Strickland S. Interaction of heparin with plasminogen activators and plasminogen: effects on the activation of plasminogen. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 4033-4040.

159. Vinazzer H, Stemberger A, Haas S, Blumel GB. Influence of heparin, of different heparin interactions and of a low molecular weight heparin-like substance on the mechanism of fibrinolysis. //Thromb. Res. 1982. V. 27. P. 341-352.

160. Edelberg J.M, Wcissler M., Pizzo S.V. Kinetic analysis of the effects of glycosaminoglycans on urokinase-mediated plasminogen activation. // Biochem. J. 1991. V. 276. P. 785-791.

161. Kawamura H., Watanabe I., Urano Т., Takada Y, Takada A. The effects of polysaccharides on plasminogen activation by single chain- and two chain-tissue plasminogen activator. // Thromb. Res. 1991. V. 62. P. 481-490.

162. Pirie-Shepherd S R, Blaseo E, Pizzo S V. Heparin as an hyperbolic modulator of plasminogen activation by t-PA. // Fibrinolysis 1994. V. 8. P. 192-188.

163. Zorio E., Gilabcrt-Estelles J., Espana F„ Ramon L.A., Cosin R. and Estelles A. Fibrinolysis: the key to new pathogenetic mechanisms. // Curr. Med. Chem. 2008. V. 15. P. 923-9.

164. Syrovets T. and Simmet T. Novel aspects and new roles for the serine protease plasmin. // Cell Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 873-85.

165. Zhang L., Seiffert D„ Fowler B.J., Jenkins G. R., Thinnes T.C., Loskutoff D. J. et al. Plasminogen has a broad extrahepatic distribution. // Thromb. Haemost. 2002. V. 87. P. 493-501.

166. Ploplis V. A. Gene targeting in hemostasis. Plasminogen. // Front. Biosci. 2001. V. 6. P. 555-569.

167. Лысикова M., Вальд M., Масиновски 3. Механизмы воспалительной реакции и воздействие на них с помощью протеолитических энзимов. // Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3. № 3. С. 48-53.

168. Del Rosso М., Fibbi G. Pucci M., Margheri F., Serrati S. The plasminogen activation system in inflammation. // Front. Biosci. 2008. V. 13. P. 4667-4686.

169. Li W.Y., Chong S.S., Huang E.Y., Tuan T.L. Plasminogen activator/plasmin system: a major player in wound healing? // Wound Repair Regen. 2003. V. 11. P. 239-47.

170. Hamilton J.A. Plasminogen Activator/Plasmin System in Arthritis and Inflammation: Friend or Foe? // Arthritis & Rheumatism. 2008. Vol. 58. P. 645-648.

171. Brommer E.J., Dooijewaard G., Dijkmans B. A. and Breedveld F. C. Plasminogen activators in synovial fluid and plasma from patients with arthritis. // Ann. Rheum. Dis. 1992. V. 51. P. 965-968.

172. Busso N., Peclat V., So A. and Sappino A. P. Plasminogen activation in synovial tissues: differences between normal, osteoarthritis and rheumatoid arthritis joints. // Ann. Rheum. Dis. 1997. V. 56. P. 550-557.

173. Inman R. D. and Harpel P. C. аг-Plasmin inhibitor-plasmin complexes in synovial fluid. //J. Rheumatol. 1986. V. 13. P. 535-537.

174. Cook A.D., Braine E.L., Campbell I.K. and Hamilton J.A. Differing roles for urokinase and tissue-type plasminogen activator in collagen-induced arthritis. // Am. J. Pathol. 2002. V. 160. P. 917-926.

175. Romer J., Bugge Т.Н., Руке С. et al. Impaired wound healing in mice with a disrupted plasminogen gene. //Nature Med. 1996. V. 2. P. 287-292.

176. Kao W.W.-Y., Kao C. W.-C., Kaufman A.H., Kombrinck K.W., Converse R.L., Good W.V., Buge Т.Н. and Degen J.L. Healing of corneal epithelial defects in plasminogen-and fibrinogen-deficient mice. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 502-508.

177. Drew A.F., Schiman H.L., Kombrinck K.W. et al. Persistent corneal haze after excimer laser photokeratectomy in plasminogen-deficient mice. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. P. 67-72.

178. Romer J. Skin cancer and wound healing. Tissue specific similarities in extracellular proteolysis.//APMIS. 2003. Suppl. 107, 111: 1-36.

179. Dano K., Behrendt N., Hoyer-Hansen G., Johnsen M., Lund L.R., Ploug M., and Romer J. Plasminogen activation and cancer. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 676681.

180. Almholt K., Lund L.R., Rygaard J., Nielsen B.S., Dano K., Romer J. and Johnsen M. Reduced metastasis of transgenic mammary cancer in urokinase-deficient mice. // Int. J. Cancer. 2005. V. 113. P. 525-532.

181. Collen D., and Lijnen H.R. Thrombolytic agents. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 627-630.

182. Melchor J.P., and Strickland S. Tissue plasminogen activator in central nervous system physiology and pathology. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 655-660.

183. Carmeliet P., Schoonjans L., Kieckens L., Ream В., Degen J., Bronson R., De Vos R., van den Oord J.J., Collen D. and Mulligan R.C. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. // Nature. 1994. V. 368. P. 419-424.

184. Burtin P., Chavanel G., and Andre J. The plasmin system in human colonic tumors: an immunofluorescence study. // Int. J. Cancer. 1985. V. 35. P. 307-314.

185. Clavel C., Chavanel G. and G. Birembaut P. Detection of the plasmin system in human mammary pathology using immunofluorescence. // Cancer. Res. 1986. V. 46. P. 5743-5747.

186. Burtin P., Chavanel G., Andre-Bougaran J. and Gentile A. The plasmin system in human adenocarcinomas and their metastases. A comparative immunofluorescence study. // Int. J. Cancer. 1987. V. 39. P. 170-178.

187. Ploug M. Structure-function relationships in the interaction between the urokinase-type plasminogen activator and its receptor. // Curr. Pharmaceut. Design. 2003. V. 9. P. 1499-1528.

188. Wojtukiewicz M.Z., Sierko E., Klementyz P. and Rakz J'. The Hemostatic System and Angiogenesis in Malignancy. // Neoplasia. 2001. V. 3. P. 371 384.

189. Dvorak H.F. Angiogenesis: update 2005. // J. Thromb. Haemost. 2005. V. 3. P. 18351842.

190. Daly M.E., Makris A., Reed M. and Lewis C.E. Hemostatic regulators of tumor angiogenesis: a source of antiangiogenic agents for cancer treatment? // J. Natl. Cancer. Inst. 2003. V. 95. P. 1660-73.

191. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. // N. Engl. J. Med. 1971. V. 285. P. 1182-6.

192. Staton C.A. and Lewis C.E. Angiogenesis inhibitors found within the haemostasis pathway. // J. Cell. Mol. Med. 2005. V. 9. P. 286-302.

193. O'Reilly M.S., Holmgren L„ Chen C. and Folkman J. Angiostatin induces canal sustains dormancy of human tumors in mice. // Nat. Med. 1996. V. 2. P. 689 692.

194. Soff G.A., Hong J., Fishman D., Kleinman M., Kaplan E., Zagzag D., Schultz D., Cundiff D., Park S., Enghild J., Stack M.S. and Gately S. Angiostatin 4,5: a naturally occurring human angiogenesis inhibitor. // Blood. 1998. V. 92. P. 174a.

195. Moser T.L., Stack M.S., Wahl M.L., Pizzo S.V. The mechanism of action of angiostatin: can you teach an old dog new tricks? // Thromb Haemost. 2002. V. 87. P. 394-401.

196. Kwon M. and Waisman D.M. Mechanism of angiostatin formation from plasminogen. Plasminogen: Structure, Activation, and Regulation, edited by David M. Waisman. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2003. P.135-156.

197. Wang H., Schultz R., Hong J., Cundiff D.L., Jiang K. and Soff G.A. Cell surface-dependent generation of angiostatin4.5. // Cancer. Research. 2004. V. 64. P. 162-168.

198. Falcone D.J., Faisal Khan K.M., Layne T. and Fernandes L. Macrophage formation of angiostatin during inflammation. //J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 31480-31485.

199. Cao R., Wu H.L., Veitonmaki N. Linden P., Farnebo J., Shi G.Y. and Cao Y. Suppression of angiogenesis and tumor growth by the inhibitor К1-5 generated by plasmin mediated proteolysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 5728 -5733.

200. Wu H.-L., Chang B.-I., Wu D.-H, Chang L.-C., Gong C.-C., Lou K.-L. and Shi G.-Y. Interaction of plasminogen and fibrin in plasminogen activation. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P.19658-19664.

201. Cao Y. Therapeutic potentials of angiostatin in the treatment of cancer. Haematologica. 1999. V. 84. P. 643 650.

202. Sim B.K., O'Reilly M.S., Liang H., Fortier A.H., He W., Madsen J.W., Lapcevich R. and Nacy C.A. A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. // Cancer Res. 1997. V. 57. P. 1329-1334.

203. Chen Q.R., Kumar D., Stass S.A., and Mixson A.J. Liposomes complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. // Cancer Res. 1999. V.59. P. 3308-3312.

204. Moscr T.L., Stack M.S., Asplin I., Enghild J.J., Jrup P., Everitt L., Hubchak S., Schnaper H.W. and Pizzo S.V. Angiostatin binds ATP synthase on the surfacc of human endothelial cclls. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 2811-2816.

205. Reijerkerk A., Mosnier L.O., Bouma B.N., Mcijers J.C.M., Voest E.E. and Gcbbink M.F. Endostatin stimulates tPA mediated plasmin formation. // Meeting Proceedings 2000. Keystone Symposium. Exp Clin Rcgul Angiog V. 87. P. 341.

206. Storm O. Fibrinolytic activity in human tears. Scand. // J. Clin. Lab. Invest. 1955. V. 7. P. 55-58.

207. Wang H.-M., Berman M. and Law M. Latent and active plasminogen activator in corneal ulceration. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 1985. V. 26. P. 511-524.

208. Tozser J., Berta A. and Punyiczki M. Plasminogen activator activity and plasminogen independent amidolytic activity in tear fluid from healthy persons and patients with anterior segment inflammation. // Clin. Chim. Acta. 1989. V. 189. P. 323-332.

209. Thorig L., Winjgaards G. and van Haeringen N.J. Immunological characterization and possible origin of plasminogen activator in human tear fluid. // Ophthalmic Res. 1983. V. 15. P. 268-276.

210. Hayashi K. and Sueishi K. Fibrinolytic activity and species of plasminogen activator in human tears.//Exp. Eye Res. 1988. V. 46. P. 131-137.

211. Bernatchez S.F., Tabatabay C. and Belin D. Urokinasc-type plasminogen activator in human aqueous humor. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1992. V. 33. P. 2687-92.

212. Smalley D.M., Fitzgerald J.E., Taylor D.M., Cone R.E. and O'Rourke J. Tissue plasminogen activator activity in human aqueous humor. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. V. 35. P. 48-53.

213. Ramsby M.L. and Kreutzer D.L. Fibrin induction of tissue plasminogen activator expression in corneal endothelial cells in vitro. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. P. 3207-3219.

214. Berman S., Winthrop D., Ausprunk J., Rose R. and Langer A. Plasminogen activator (urokinase) eausesvaseularization of the corneal. // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 1982. V. 22. P. 191-199.

215. Вереемснко K.H., Кизим А.И. // Вопр. мед. химии. 1984. Т. 30. № 5. С. 13-22.

216. Drew A.F., Kaufman А.Н., Kombrinck K.W., Danton M.J., Daugherty С.С., Degen J.L. and Bugge Т.Н. Ligneous conjunctivitis in plasminogen-deficient mice. // Blood. 1998. V. 91. P. 1616-24.

217. Twining S.S., Wilson P.M. and Ngamkitidechakul C. Extrahepatic synthesis of plasminogen in the human cornea is up-regulated by interleukins-1 a and lb. // Biochem. J. 1999. V. 339. P. 705-712.

218. Sack R.A., Beaton A.R. and Sathe S. Diurnal variations in angiostatin in human tear fluid: a possible role in prevention of corneal neovascularization. // Curr. Eye Res. 1999. V. 18. P. 186-93.

219. Lantz E. and Pandolfi M. Fibrinolysis in cornea and conjunctiva: evidence of two types of activators. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1986. V. 224. P. 393-6.

220. Chan K.Y. Release of plasminogen activator by cultured corneal epithelial cells during differentiation and wound closure. // Exp. Eye Res. 1986.V. 42. P. 417-31.

221. Chan K.Y. Chemical injury to an in vitro ocular system: differential release of plasminogen activator. // Curr. Eye Res. 1986. V. 5. P. 357-62.

222. Mirshahi M., Mirshahi S., Soria C., Soria J., Thomaidis A., Pouliquen Y. and Faure J.P. Production of proteases type plasminogen activator and their inhibitor in cornea. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 160. P. 1021-5.

223. Tripathi B.J., Geanon J.D., Tripathi R.C. Distribution of tissue plasminogen activator in human and monkey eyes. An immunohistochemical study. // Ophthalmol. 1987 V. 94. P. 1434-8.

224. Tripathi R.C., Tripathi B.J., Park J.K. Localization of urokinase-type plasminogen activator in human eyes: an immunocylochemical study. // Exp. Eye Res. 1990. V. 51. P. 545-52.

225. Smalley D. M., Fitzgerald J. E., O'Rourke J. and Kreutzer D.L. Plasminogen activator in aqueous humor.// Invest. Ophthal. 1992. Vol. 33. P. 1880.

226. Nakamura M., Sato N., Chikama Т., Ilasegawa Y. and Nishida T. Fibronectin facilitates corneal epithelial wound healing in diabetic rats. // Exp Eye Res. 1997 V. 64. P. 355-9.

227. Tozser J and Berta A. Plasminogen activator inhibitors in human tears. // Acta ophthal. (Copenh). 1991. V. 69. P. 426-31.

228. Tervo Т., Tervo K., van Setten G.B., Virtanen I., Tarkkanen A. Plasminogen activator and its inhibitor in the experimental corneal wound. // Exp. Eye Res. 1989 V. 48. P. 4459.

229. Watanabe M., Yano W., Kondo S„ Hattori Y., Yamada N„ Yanai R. and Nishida T. Up-regulation of urokinase-type plasminogen activator in corneal epithelial cells induced by wounding. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. P. 3332- 3338.

230. Barlati S., Marchina E., Quaranta C.A., Vigasio F. and Semeraro F. Analysis of fibronectin, plasminogen activators and plasminogen in tear fluid as markers of corneal damage and repair. // Exp. Eye Res., 1990. V. 51. P. 1-9.

231. Berman M., Leary R. and Gag J. Evidence for a role of the plasminogen activator-plasmin system in corneal ulceration. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1983. V. 24. P.1358- 1366.

232. Fujikawa L.S., Foster C.S., Gipson I.K. and Colvin R.B. Basement membrane components in healing rabbit corneal epithelial wounds: immunofluorescence and ultrastructural studies. // J. Cell Biol. 1984. V. 98. P. 128-38.

233. Yang H.Y.T., Erdos E.G. and Levin Y. A dipeptidyl carboxypeptidase that converts angiotensin I and inactivates bradykinin. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 214. P. 374376.

234. Кост O.A., Гринштейн С.В., Никольская И.И., Шевченко А.А., Биневский Г1.В. Выделение солюбилизированной и мембранной форм соматического ангиотензин-превращающего фермента каскадной аффинной хроматографией. // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 375-383.

235. Reilly Ch., Tewksbury D., Schechter N., and Travis J. Rapid conversion of angiotensin I to angiotensin II by neutrophil and mast cell proteinases. // Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 8619- 8622.

236. Hollenberg N.K., Fisher N.D.L. and Price D.A. Pathways for angiotensin II generation in intact human tissue: evidence from comparative pharmacological interruption of the renin system. // Hypertension. 1998. V. 32. P. 387-392.

237. Unger Т. and Gohlke P. Tissue renin-angiotensin systems in the heart and vasculature: possible involvement in the cardiovascular actions of converting enzyme inhibitors. // Am J. Cardiol. 1990. V. 65. P. 31-101.

238. Akasu M., Urata H., Kinoshita A., Sasaguri M., Ideishi M. and Arakawa, K. Differences in tissue angiotensin II-forming pathways by species and organs in vitro. // Hypertension. 1998. V. 32. P. 514-520.

239. Dzau V.J. Vascular renin-angiotensin: a possible autocrine or paracrine system in control of vascular function. // Cardiovasc. Pharmacol. 1984. V. 6. S377-S382.

240. Kifor I., and Dzau V.J. Endothelial renin-angiotensin pathway: evidence for intracellular synthesis and secretion of angiotensins. // Ore. Res. 1987. V. 60. P. 422-428.

241. Huckle W.R., Earp H.S. Regulation of cell proliferation and growth by angiotensin II. // Prog. Growth Factor Res. 1994. V. 5. P. 177-194.

242. Escobar E., Rodriguez-Reyna T.S., Arrieta O., Sotelo J. Angiotensin II, cell proliferation and angiogenesis regulator: biologic and therapeutic implications in cancer. // Curr. Vase. Pharmacol. 2004. V. 2. P. 385-399.

243. Goodfriend T.L., Elliott M.E. and Catt K.J. Angiotensin receptors and their antagonists. //N. Engl. J. Med. 1996. V. 334. P. 1649-54.

244. Campbell D.J. Circulating and tissue angiotensin systems. // J. Clin. Invest. 1987. V. 79. P. 1-6.

245. Paul M., Poyan Mehr A, Kreutz R. Physiology of local renin-angiotensin systems. // Physiol. Rev. 2006. V. 86. P. 747-803.

246. Bader M. and Ganten D. Update on tissue renin-angiotensin systems. // J. Mol. Med. 2008. V. 86. P. 615-21.

247. Todd P.A. and Heel R.C. Enalapril. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in hypertension and congestive heart failure. // Drugs. 1986. V. 31. P. 198-248.

248. Мареев В.Ю. Лечение сердечной недостаточности: инотропная стимуляция или разгрузка ссрдца. // Кардиология (Kardiologia). 1994. Т. 34. С. 4-11.

249. Елисеева Ю.Е. Структурно-функциональные особенности ангиотензинпревращающего фермента. //Биоорган, химия. 1998. Т. 24, 262-270.

250. Corvol P., Williams Т.А. and Soubrier F. Peptidyl dipeptidase A: angiotensin 1-converting enzyme. // Methods Enzymol. 1995. V. 248. P. 283-305.

251. Кост О.А., Чеснокова Н.Б., Макаров П.В., Никольская И.И., Безнос О.В., Биневский П.В. Способ лечения и профилактики глазных болезней, связанных с ишемией тканей глаза. Патент RU 2 268 722 С2.

252. Brown N.J., Agirbasli М.А., Williams G.H., Litchfield W.R. and Vaughan D.E. Effect of activation and inhibition of the renin-angiotensin system on plasma PAI-1. // Hypertension. 1998. V. 32. P. 965-971.

253. Brunner HR, Laragh JH, Bacr L, Newton MA, Goodwin FT, Krakoff LR, Bard RH, Buhler FR. Essential hypertension: renin and aldosterone, heart attack and stroke. N Engl J Med. 1972. V. 286. P. 441-^149.

254. Alderman M.I I., Madhavan S., Ooi W.L., Cohen H„ Sealey J.E., Laragh J.H. Association of the renin-sodium profile with the riSK of myocardial infarction in patients with hypertension. //N. Engl. J. Med. 1991. V. 324. P. 1098-1104.

255. Pitt B. The anti-ischemic potential of angiotensin-converting enzyme inhibition: insights from the heart outcomes prevention evaluation trial. // Clin. Cardiol. 2000. V. 23. Suppl.4. IV9-14.

256. Fennessy P.A., Campbell J.H., Mendelsohn F.A. and Campbell G.R. Angiotensin-converting enzyme inhibitors and atherosclerosis: relevance of animal models to human disease. // Clin. Exper. Pharmacol. Physiol. 1996. V. 23. P. S30-S32.

257. Chobanian A.V., Haudenschild C.C., Nickerson C., Drago R. Anti-atherogenic effect of captopril in the Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit. // Hypertension. 1990. V. 15. P. 327-331.

258. Hayek Т., Keidar S., Mei-Yi., Oiknine J. and Breslow J. Effect of angiotensin converting enzyme inhibitors on LDL lipid peroxidation and atherosclerosis progression in apo E deficient mice. // Circulation. 1995. V. 92. P. 625.

259. Maschio G., Oldrizzi L., Marcantoni C., Rugiu C. Hypertension and progression of renal disease. // J. Nephrol. 2000. V. 13. P. 225-227.

260. Vaughan D.E., Lazos S.A., Tong K. Angiotensin II regulates the expression of plasminogen activator inhibitor-1 in cultured endothelial cells. // J. Clin. Invest. 1995. V. 95. P. 995-1001.

261. Ridker P.M., Gaboury C.L., Conlin P.R., Seely E.W., Williams G.H., Vaughan D.E. Stimulation of plasminogen activator inhibitor in vivo by infusion of angiotensin II. Circulation. 1993. V. 87. P. 1969-1973.

262. Sprengers E.D. and Kluft C. Plasminogen activator inhibitors. // Blood. 1987. V. 69. P. 381-387.

263. Hamsten A., de Fairde U., Walldius G., Dahlen G., Szamosi A., Landou C., Blomback M. and Wiman B. Plasminogen activator inhibitor in plasma: risk factor for recurrent myocardial infarction. // Lancet. 1987. V. 2. P. 3-9.

264. Juhan-Vague I. and Alessi M.C. PAI-1, obesity, insulin resistance and risk of cardiovascular events. // Thromb Haemost. 1997. V. 78. P. 656-660.

265. Mogielnicki A., Chabielska E., Pawlak R., Szemraj J. Buczko W. Angiotensin II enhances thrombosis development in renovascular hypertensive rats. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 1069-1076.

266. Brown N.J., Nadeau J. and Vaughan D.E. Selective stimulation of tissue-type plasminogen activator (t-PA) in vivo by infusion of bradykinin. // Thromb Haemost. 1997. V.77. P. 522-525.

267. Smith D., Gilbert M. and Owen W.G. Tissue plasminogen activator release in vivo in response to vasoactive agents. // Blood. 1985. V. 66. P. 835-839.

268. Emeis J.J. and Tranquille N. On the role of bradykinin in secretion from vascular endothelial cells. // Agents Actions. 1992. V. 38. P. 285-291.

269. Yang H.Y., Erdos E.G. and Levin Y. Characterization of a dipeptide hydrolase (kininase II: angiotensin I converting enzyme). // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1971. V. 177. P. 291-300.

270. Hasan A.A., Amenta S., Schmaier A.H. // Bradykinin and its metabolite, Arg-Pro-Pro-Gly-Phe, are selective inhibitors of alpha-thrombin-induced platelet activation. // Circulation. 1996. V. 94. P. 517-528.

271. Erdos EG. The angiotensin I converting enzyme. // Fed Proc. 1977. V. 36. P. 1760— 1765.

272. Brown N.J., Ryder D., Gainer J.V., Morrow J.D. and Nadeau J. Differential effects of ACE inhibitors on the vasodepressor and prostacyclin responses to bradykinin. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. // V. 279. P. 703-712.

273. Pretorius M., Rosenbaum D.A. Vaughan D.E., Brown N.J. // Angiotensin-converting enzyme inhibition increases human vascular tissue-type plasminogen activator release through endogenous bradikinin. // Circulation. 2003. P. 107. P. 579-585.

274. Yusuf S. and Lonn E. // Anti-ischaemic effects of ACE inhibitors: review of current clinical evidence and ongoing clinical trials. // Eur. Fleart. J. 1998. V. 19. P. J36-44.

275. Oshima S., Ogawa H., Mizumo Y. et al. // The effects of the angiotensin-converting enzyme inhibitor imidapril on plasma plasminogen activator inhibitor activity in patienta with acute myocardial infarction. // Am. Heart J. 1997. V. 34. P. 961-966.

276. Dzau V.J. Multiple pathways of angiotensin production in the blood vessel wall: evidence, possibilities and hypotheses. // J. Hypertens. 1989. V. 7. P. 933-936.

277. Tang S.S., Loscaizo J. and Dzau V.J. // J. Vase. Med. Biol. 1989. 1, 67-74

278. Ferres H. Preclinical pharmacological evaluation of anisoylated plasminogen streptokinase activator complex. // Drugs. 1987. V. 33. Suppl. 3. P. 33-50.

279. Deutsch D.G. and Mertz E.T. Plasminogen. Purification from human plasma by affinity chromatography. //Science. 1970. V. 170. P. 1095-1096.

280. Kost O.A., Bovin N.V., Chemodanova E.E., Nasonov V.V., Ort T.A. New feature of angiotensun-converting enzyme: carbohydrate-recognizing domain. // J. Mol. Recog. 2000. V. 13. P. 360-369.

281. Lowry O.FL, Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-75.

282. Айсина Р.Б., Житкова Ю.В., Еремеев И.Л, Попова Г.Ю., Казанская Н.Ф. Кинетика фибринолиза in vitro плазмином и эквимолярным комплексом плазмин-стрептокиназа. // Укр. биохим. журн. 1991. Т. 63. № 1. С. 20-26.

283. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-5.

284. Айсина P.Б., Житкова Ю.В., Федоренко Я.Э. Казанская Н.Ф. Каталитические свойства плазмина и эквимолярного комплекса плазмин-стрептокиназа в реакциях с различными субстратами и ингибиторами. // Укр. биохим. журн. 1991. Т. 63. № 1.1. C. 13-20.

285. Passanti A., Taylor R.V., Pili R., Guo Y., Long P.V., Haney J.A., PaulyR.R., Grant

286. D.S. and Martin G.R. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. // Lab. Invest. 1992. V. 67. P. 519-528.

287. Chibber B.A., Morris J.P., Castellino F.J. Effects of human fibrinogen and its cleavage products on activation of human plasminogen by streptokinase. // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 3429-34.

288. Ferrari-Dileo G., Ryan J.W., Rockwood E.J., Davis E.B. and Anderson D.R. Angiotensin-converting enzyme in bovine, feline, and human ocular tissues. // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1988. V. 29. P. 876-81.

289. Weinreb R.N., Sandman R., Ryder M.I. and Friberg T.R. Angiotensin-converting enzyme activity in human aqueous humor. // Arch Ophthalmol. 1985. V. 103. P. 34-6.

290. Brandt C.R., Pumfery A.M., Micales В., Bindley C.D., Lyons G.E., Sramek S.J. and Wallow I.H. Renin mRNA is synthesized locally in rat ocular tissues. // Curr. Eye. Res. 1994. V. 13. P. 755-63.

291. Danser A.H., Derlc F.H., Admiraal P.J., Deinum J., de Jong P.T., Schalekamp M.A. Angiotensin levels in the eye. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. V. 35. P. 1008-18.

292. Чеснокова Н.Б. Клиническое значение биохимического исследования слезной жидкости // Мед. Реф. Журнал. 1986. - т.З. - с.7-11

293. Безнос О.В., Чеснокова Н.Б. Роль ферментов фибринолитической системы в изъязвлении роговицы. // Вестник офтальмологии. 1999. Т 4. С. 42-44.

294. Сергеев И.Ю. Особенности влияния на тонус сосудов активаторов плазминогена тканевого и урокиназпого типов. // Доклады Академии Наук. 1997. Т.356. №4. С.555-557.

295. Wang Y., Gillies C., Cone R.E., O'Rourke J. Extravascular secretion of t-PA by the intact superfused choroid. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. V. 36. P. 1625-32.

296. Grant M.B., Guay C. Plasminogen activator production by human retinal endothelial cells of nondiabetic and diabetic origin. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991 V. 32. P.

297. Kranzhofer R., Browatzki M., Schmidt J., Kiibler W. Angiotensin II activates the proinflammatory transcription factor nuclear factor-kappaB in human monocytes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 257. P. 826-8.

298. Steckelings U.M., Wollschlager Т., Peters J., Henz B.M., Hermes В., Artuc M. Human skin: source of and target organ for angiotensin II. // Exp. Dermatol. 2004 V. 13. P. 148-54.

299. Чеснокова Н.Б. Григорьев, A.B., Павленко T.A., Никольская И.И., Кост О.А., Казанская Н.Ф. Роль компонентов ренин-ангиотензиновой системы в тканях глаза в

300. Suzuki Y., Ruiz-Ortega М., Lorenzo О., Ruperez М., Esteban V., Egido J. Inflammation and angiotensin II. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2003. V. 35. P. 881-900.

301. Чеснокова Н.Б., Кузнецова Т.П., Кост О.А. Способ профилактики и лечения изъязвлений роговицы. (1998) Патент № 2119314.

Информация о работе

Гулин, Дмитрий Андреевич
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Кинетические закономерности и механизм регуляции активности фибринолитической системы различными эффекторами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы