Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование генов, контролирующих процесс симбиотической азотфиксации у гороха

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование генов, контролирующих процесс симбиотической азотфиксации у гороха"

РОССИЙСКАЯ Л.КАД£МИЯ НА"! СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах руксппса

РГ Б ОД

ТЕМНЫХ Светлана Васильевна

УДК 575.116.4:577.112:633.35

КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС СИМБИОТИЧЕСКОЙ АЗОТФИКСАЦИИ У

ГОРОХА

03.00.15 - ГЕНЕТИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск — 1994

Работа вьтолнена в ¿Тнепггуте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск при сотрудничествз с проф. Виденом и проф. Лару Корнгльского университета, США.

Официальные опгюг'еьты: доктор биологкчесгагх наук

К. К. Сидорова

Институт цитологии и генетики ) СО РАН, г. Новосибирск

пшдвдцт биологических наук О. В. Агафонова

Центральный Сибирский ботанический сад

СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Московский Государственный

Университет имени Ломоносова, кафедра генетики, г. Москва

Защита состоится 1 ')£•(■ на ^^

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090 г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьевна, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан /V ЛМ*9

Ученый секретарь специализирован!юш совета доктор биологических наук А. Д. Груздев

Введение

Актуальность проблемы

Фиксация молекулярного азота воздуха, осуществляемая бобовыми растениями в симбиозе с бактериями семейства Rhizobiaceae, вносит основной вклад в биологический баланс азота биосферы. Одним из важных направлений изучения симбиотической фиксации азота являются генетические исследования. Данные о генетическом контроле взаимодействий между высшими растениями и бактериями на разных стадиях развития бобово-ризобиалыюго симбиоза необходимы для успешного решения многих фундаментальных и прикладных проблем.

Горох Pisum sativum является традициошгых объектом генетических исследований и представляет собой идеальную модель для изучения молекулярно-генетических основ процесса симбютпгческой азотфиксации. За последние десять лет у данного вэда путем искусственного мутагенеза было получено большое число мутаций, которые вызывают нарушение разных стадий развития и функционирования клубенька. В результате генетического анализа этих мутаций у гороха было идентифицировано около тридцати симбиотических генов (Duc, Messager, 1989; LaRue, Weeden, 1992; Сидорова, Ужинцева, 1992; Kneen et al., 1994). Другой подход к изучению роли бобового растения в данном процессе состоггг в ндентификащт так называемых нодулиновых " генов, которые зкспрессиругатся преимущественно в тканях клубенька (Nap, Bisseling, 1990). У гороха к настоящему времени клонировано около десятка нодулиновых генов. Некоторые из них полностью или частично секвикированы, однако в большинстве случаев функции этих генов до конца не выяснены.

Одним из способов определения функций симбиотических генов и идентификации их продуктов может быть генетическое картирование клонированных генов нодуликов наряду с симбиотичесюми мутациями и поиск возможных пар путем генетического анализа (LaRue, Weeden, 1992; Lu et al., 1994). Перспективным является также поиск тесно сцепленных ДНКовых маркеров, которые могут использоваться для последующего тонкого анализа генов, ответственных за мутантный фенотип. <■ К настоящему времени на генетической карте гороха локализовано около двадцати симбиотических и нодулиновых генов (Weeden et al., 1990; Men et al., 1993; Kneen et al., 1994). Необычное скопление генов, контролирующих разные стадии развития и функционирования клубеньков, было обнаружено в районе геноз d (антоциановое кольцо в основании прилистников) и Idh (изоцитратдегидрогеназа) группы сцепления I. На

основании сцепления с данными маркерами здесь были локализованы гены sym-2 (Young, 1985) sym-5, sym-18, sym-19, а также малое семейство генов леггемоглобина (Weeden et al., 1990), однако расположение симбиотических генов относительно друг друга и генетические растояния между ними не были определены.

Цель и задачи исследования

Цель данного исследования заключалась в более точном картировании симбиотических генов, сцепленных с маркерными локусами d и Idh и образующих скопление в данном районе генетической карты гороха. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Построение подробной генетической карты в районе генов d и Idh с использованием RAPD маркеров и локализация на ней симбиотических генов, сцепленных с данными маркерами

2. Хромосомная локализация суперклубеньковой мутации nod-З.

3. Картирование гена sym-1, контролирующего температуро-зависимую устойчивость дикорастущей формы гороха из Ирана к европейским штаммам клубеньковых бактерий.

4. Уточнение локализации гена sym-18.

5. Определение цитогенетическим методом путем использования реципрокных транслокаций хромосомной локализации сегмента генетической карты гороха, в котором находятся сцепленные с маркерами d и Idh симбиотические гены sym-1, sym-2, sym-5, sym-19, nod-3.

Научная новизна

В данной работе впервые:

- картированы гены sym-1 и nod-З. Было показано, что данные гены сцеплены с маркерами d и Idh и находятся в группе сцепления I;

- с помощью метода полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров были найдены тесно сцепленные RAPD маркеры доя симбиотических генов sym-1, sym-2, sym-5, sym-19, nod-З и определено их положение относительно друг друга. Рассматриваемые гены образуют два кластера тесно сцепленных генов, расположенных по разные стороны от локуса Idh;

- идентифицированы две новые транслокации у гороха. Уникальной особенностью одной из них является тесная ассоциация точки разрыва с доминантной морфологической мутацией Twt;

- цитогенетическим методом проведена хромосомная локализация

сегмента сцепления sym-5—d—Idh—sym-2. Показано, что он находится в хромосоме 6 и является частью соответствующей группы сцепления VI.

Практическая значимость

Полученные в настоящем исследовании результаты вносят определенный вклад в изучение генетических основ симбиотических взаимоотношений между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями. Информация о локализации нескольких симбиотических генов и тесно сцепленных с ними RAPD маркеров может быть использована для дальнейшего более тонкого анализа данных генов, контролирующих разные стадии процесса симбиотической азотфиксации у гороха. Созданные на основе скрещивания Sparkle х JI 73 рекомбинантные инбредные линии в настоящее время используются для глобального картирования генома гороха и локализации симбиотических мутаций, полученных на фоне исходного сорта Sparkle. Идентификация и применение новой транслокации Twt позволило осуществить хромосомную локализацию сегмента сцепления sym-5—Idh—nod-З. Две новые транслокации, обнаруженные в ходе данной работы, могут быть использованы для дальнейших исследований в области цитогенетики гороха.

Апробация работы

Основные результаты данной работы были представлены на I и II Международных конференциях по геному растений (Сан-Днего,США, 1992, 1994); на IV Международной конференции по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994) и I Европейской конференции по фиксации азота (Сегед, 1994).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав, в которых приведены результаты настоящего исследования и их обсуждение, заключения, выводоз и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 175 наименований.

Материалы и методы исследования

Мутантные линии Е2 (sym-5), NEU5 (sym-19), Е54 (sym-18), индуцированные на основе линии Sparkle, суперклубгньковый мутант Nod3 (nod-З) и форма дикорастущего гороха из Ирана (sym-1) были скрещены со стандартными маркерными линиями JI73 (A, i, s, wb, k, b, le, gp, cp, Ust) и Slow. Линия ВС—sym2 была получена в результате шести поколений возвратного скрещивания афганской разновидности гороха с шишей Sparkle и последующего самоопыления. Описание скрещиваний дано в таблице 1. На основе скрещивания Е2 х JI73 были созданы рекомбинантные инбредные линии, которые использовались д,:я локального картирования генома гороха в районе генов d и Idh. Доминантная мутация Twt была получена путем обработки семян линии Спринт-2 0.015%-ным раствором этилметансульфоната. Для идентификации новых транслокаций анализировали мейоз у гибридов F1, полученных при скрещивании линиий — носителей данных перестроек с тестерными транслокационнкми линиями. Анализ пыльцы на ферхильность и нрнготокигние препаратов мейотических хромосом материнских клеток пыльцы проводили по стандартной методике (Lamm, 1951).

При проверке на наличие клубеньков растения выращивали в конических пластмассовых сосудах объемом 50 куб. см, заполненных

Таблица 1.

Скрещивания, использованные при локализации симбиотических генов.-

Родительские

Скрещязалиа jv-,mu Генотипы лапий

А Е2 х JI 73 sym-5, D"Idh" х Sym-5, d, Idhb

В NEU5 x JI 73 sym-19, EfJ Idlf x Sym-19, d, Idli

С BC-sym2 x JI 73 Sym-2, d, Idlf x sym-2, d, Idhfc

D JI 73 x Iran Sym-1, d, Idhb x sym-1, D" Idh"

E Nod 3 x JI 73 nod-3, D" Idh° x Nod-3, d, Idhk

F Nod 3 x Slow nod-3, xf, Idtf x Nod-3, D" Idh"

G_E54 x JI 73 Sym-18, D"ldhd x sym-18, d, Idh

",ь,с три изоформы изоцитратдегидрогеназы с медленной (а), быстрой

(Ь) и промежуточной (с) электрофоретической подвижностью. Dw — двойное аигоциановое кольцо; Dco—одинарное кольцо; d—отсутствие кольца в основании прилистников.

вермикулитом, при световом режиме 16 час/8 час день/ночь и температуре 18-20°С. Полив производили питательным раствором, содержащим 5мМ нитрата кальция. На 4-6 день после посадки семян проводили инокуляцию растений суспензией бактерий Rhizobium leguminosarura (штамм 128С53). Проростки проверяли на наличие клубеньков на 21-24 день после посадки.

Изоферменгные маркеры: изощпратдегидрогеназу (Idh), пероксидазу (Pix) и кислую фосфатазу (Аср), — определяли по методике, описанной ранее (Weeden, Marx, 1984). Экстракцию и электрофоретический анализ гистона HI проводили по методу Бердникова и Горель (1975). Для экстракции ДНК для RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) анализа из молодых листьев использовали0.1 М раствор Трис-HCl, содержащий 0.2 МЭДГА, 1.4MNaCl и 2 % СТАВ (гексадецилтриметилбромид аммония). Реакцию амплификации проводили на программируемом амплификаторе РТС-100 при режиме: 1 мин при 94С, затем 38 повторяющихся циклов 1 мин при 72°С, 2 мин при 37*С, 2 мин при 72"С и заключительный цикл — 8 мин при 72°С. Использованные праймеры являлись 10-мерами и были получены из биотехнологических лабораторий США. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов проводили в 2%-ном агарозном геле с использованием TBE буферной системы (0.1 М Трис, 0.1 М борной кислоты, 0.025 М ЭДГА). Гели окрашивали раствором бромистого этиидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Поиск RAPD маркеров для заданного района генома проводили по методу, описанному Миче'лмором и др. (Michelmore et al., 1991). Из сегрегирующей по генам sym-5 , d, Idh популяции растений F3 скрещивания Е2 х JI73 были выбраны особи, гомозиготные и нерекомбинантные в отношении рассматриваемых генов. Сравнение 8—10 растений мутантного (или нормального) типа с родительскими линиями позволяло выявлять R APD маркеры, сцепленные с генами d и Idh.

Частоту рекомбинации между генами рассчитывали по данным расщепления в F2 с помощью компьютерной программы LINKAGE-1 (Suiter et al., 1983). Построение генетической карты на основании данных анализа рекомбинантных инбредных линий проводилось с использованием программы JoinMap (Stem, 1993).

Результаты и обсуждение

Лсхалшация агмоиагкчеаак гспов ^ т-1 ,зут-2, вуга-3,вут-18, кут-19, шм1-3

Результаты сегрегационного анализа потомства второго поколения скрещиваний между мутантными в отношении клубенькообразовашм линиями и тестерными линиями приведены в таблице 2. Данные свидетельствуют о том, что кроме генов $ут-2, $ут-5 и эут-! 9, ранее локализованных в районе локусов с1 и МЬ (Weeden, 1990), еще два симбиотических гена ($ут-1 и nod-3) сцеплены с данными маркерами. Следует отметить, что устойчивость к штамму Л. иттовагит 128С53 наследуется как рецессивный признак в случае гена яут-1 и как доминантный Таблаца 2.

Анализ совместного наследования симбиотических генов зут-1,5уш-2, Бут-б, $ут-19, nod-3 и маркеров Б и 1с1л в потомстве второго поколения скрещиваний А-Р.

« 1 й 8- б Шры тгпаи Чксло расче:п;й с дашгьш фенотипом | N "X Частота рекомб. ± стаад.

АЛ? АЛ1 А/Ъ а/В д/Ь Г.Ь

А 5ут 5—Б 57 - 19 27 - 1 104 5.77** 0.23±0.09

<;ут 5—МЬ 17 50 13 0 15 16 111 0.25±0.05

В вут 19—Б 57 - 38 26 - 6 127 4.77* 0.36±0.08

вут 19—1сШ 31 50 21 6 13 25 146 18.9*** 0.31 ±0.04

С Буш 2—1сШ 24 39 3 0 7 5 88 0.12±0.04

Б Буш 1 —Б 45 - 16 23 - 0 83 6.86** неопред.

Буш 1—МЬ 16 42 3 0 4 19 83 49.5**** 0.09±0.03

Е гкх! 3—О 43 - 28 26 - 0 97 14 4*** неопред.

nod З-ЫЬ 23 32 1 0 6 10 72 0.11±0.04

Р nod З-ИЬ 38 51 14 1 14 21 139 33 7**** 0.23±0.04

А, а — первый ген, В,Ь — второй ген, Ь — гетерозигота. Если оба гена доминантны, заглавные буквы обозначют доминантные аллели. Если второй ген является кодоминантным, заглавная А обозначает доминантный аллель первого гена, заглазная В в этом случае обозначает аллель второго гена, который находится в фазе притяжения с А.

*,*»,***,**»* Р< 0.05,0.01,0.001,0.0001, соответственно.

или полудоминантный признак в случае гена Sym-2.

Предполагаемая принадлежность гена syrn -13 к кластеру спепленных с локусом Idh симбиотических генов не подтвердилась. При анализе скрещивания Е54 X Л 73 было обнаружено сцепление гена sym-18 с маркерами wb и к. Рассматриваемые гены находятся ¡: группе сцепления II и расположены в следующей последовательности:

wb—8.0 сМ—к—10.0 сМ—■sym-18

В ходе анализа скрещиваний Nod-3 х JI 73 и Nod-3 х Slow была идентифицирована реципрокная транслокация, носителями которой оказались линия Nod-3 и исходный сорт Рондо. Было показано, что точка разрыва данной транслокации не сцеплена с генами nod-3, d, Idh и локализована в 4 единицах кроссинговера от гена b в хромосоме, соответствующей Щ группе сцепления. Вторым партнером обнаруженной транслокации является сателлитная хромосома, которой соответствует группа сцепления IVA.

Таблица 3.

Характеристика RAPD маркеров, сцепленных с генами Idh, D, sym-5, sym-19.

Размсо

соответствующего

Наззгпие Псрпичная структура Обоз5тчега:с фрзтеяпаДКК

пвайЬкта праймера f (пар оснсзаипй)

ОР 4 5-AATCGGGCTG -3' OP 4b 450

Р 198 5'-CTGTTTGCGG -3' P 198* Sparkle-тип -850 Л73-ТИП- 1200

В 318 5'-CGGAGAGCGA -3' В 318b 950

В 322 5'-GCCGCTACTA -3' ß 322b 520

В 340 5'-GAGAGGCACC -3' В 340b 670

В 374 5'- GGTCAACCCT -3' В 374 1000

В 389 5'- CGCCCGCAGT -3' В 389a 1800

В 150 5'-GAAGGCTCTG -3' В 150b 900

В 409 5 -TAGGCGGCGG -3' В 409c 590

В 450 5-CGGAGAGCCC-3' В 450b 550

В 474 5-AGGCGGGAAC -3' В 474b 380

маркер с кодомипантным типом наследования. _ ? j

Построение подробной карты d-райова

Для более точной локализации симбиотических генов 8уш-1, 8уш-2, 5ут-5,5ут-19ишх1-3,относительно маркеров ё и 1сШ, а также по отношению друг к другу была построена подробная генетическая карта данного района группы сцепления I. В результате проверки 400 праймеров с целью поиска ИАРБ маркеров для заданного района генома по методу Мичелмора (см. Материалы и Методы) было найдено 11 И АРБ маркеров, сцепленных с генами $ут-5, d и ИЬ (таблица 3). Соответствующие праймеры использовались дня И АРБ анализа 58 рекомбинантных инбредных линий, созданных на основе скрещивания Е2 х Л 73. Каждая линия была представлена единсгвеным растением Рб, которое было описано по признакам наличия клубеньков, наличию антоцианового кольца, охарактеризовано по изоцитратдегидрогеназе и ИАРО маркерам. Сегмент генетической карты длиной 46.9 сМ, построенный на основании полученных данных, представлен на рис. 1.

10 сМ

I-1

t

«t: ti ■о Е Е о Ss сии

Рисуиок 1. Сегмент генетической карты гороха в районе гена d.

Прямым результатом выше описанного анализа явилась локализация гена sym-5, который оказался тесно сцеплен с маркером ОР4Ь (рис. 1). Для локализации гена sym-19 было проанализировано с использованием праймеров В150, В474 и ОР4 сорок два бесклубеньковых растения второго поколения скрещивания NEU5 х JI 73. Было зарегестрировано два рекомбинационных события между геном sym-19 и маркером В474Ь и одно — между sym-19 и ОР4Ь. Таким образом, ген sym-19, мутации по которому приводят к полной устойчивости растений гороха к ризобиальной инфекции, локализован в непосредственной близости от гена sym-5 (рис. 1).

Гены sym-1 и nod-З были картированы на основании данных посемейного анализа потомства индивидуальных растений F3 скрещиваний

Л 73 х Иран и №х!-3 х Л 73, соответственно. Результаты рекомбинационного анализа растений Р3 этих двух скрещиваний приводятся в таблицах 4 а, б, из которых видно, что гены хуш-1 и поё-З тесно сцеплены с маркером В450Ь. Ген Бут-2 был локализован на основании данных ИАРБ анализа потомства второго поколения скрещивания ВС-вупгё х Л 73. Среди 48 проанализированных растений не было обнаружено ни одного случая рекомбинации между геном Бут-2 и маркером В450Ь, что свидетельствовало о их тесном сцеплении.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в данном районе генома находится два кластера тесно сцепленных симбиотических генов, которые расположены по разные стороны от локуса изоцитратдещдрогеназы

Таблица 4.

а).

Рекомбинационный анализ растений скрещивания Е: №>с!-3 х Л 73.

Хромосомы с дайной Интервал, в котором Число

комбинацией маркеров произошла хромосом

Idh В 450b nod-3 B409 рекомбинация данного тала

s s s f NR*nina Nod-3 19

f f f s NR типа JI73 8

f s s f Idh-B 450 6

f f s f В 450-nod 3 2

f f f f nod 3- В 409 1

N11 — нерекомбинантные растения с исходной комбинацией маркеров.

б).

Рекомбинационный анализ растений ЕЗ скрещивания Б: Л 73 х "Иран".

Хромосомы с данной Интервал, в котором Число

комбинацией маркеров произошла хромосом

В322Ь Mi B450b sym-1 рекомбинация данного типа

f s s s Ж типа Иран 13

s f f f Ж типа Л 73 И

S s ' s s В 322 - ИЬ 3

f f f f В 322 - 1(111 1

s f s s ЫЬ - В450 5

f s f f Ш - В450 1

f s s f зуш! - В450 1

*

1 „i расстоянии около 40 единиц кроссинговера друг от друга. Тест на аллелизм псказ;п, что муташи Е2 и NEU5 затрагавают разные гены — sym-5 и sym-19, соответственно (Knien, LaRue, 1994). Число симбиотических генов, локализованных вблизи маркера В450Ь, не известно. Сходный тин час-ычнои угю;:чивоети дикорастущих форм гороха из Ирана и Афганистана к европейским штаммам R. leguminosarum и результаты картирования симбиотических генов sym-1 и Sym-2, контролирующих данный данный признак, свидетельствуют о том, что sym-1 и Sym-2, возможно, являются аллелями одного и того же гена.

Идентификация новой траислокации, ассоциированной с морфологической мутацией Twt

Доминантная мутация Twt (Twisted tendrils), вызывающая сильное закручивание, усиков, была обнаружена нами в 1988 году после обработки семян линии гороха Спринт-2 0.015 % раствором этилметансульфоната. В результате анализа 72 растений г2 скрещивания

JI73 (A, twt, i, s, wb, k, b, le, gp, cp, tl, Ust) x Спршгг-2 (a, Twt)

было обнаружено слабое сцепление гена Twt с маркером А (ингибитор синтеза антоциана). Частота рекомбинации между генами Twt и А равнялась 37.5±10 единиц кроссинговера. Для более точной локализации гена Twt по отношению к маркерам группы сцепления 1 А и His(2-6) были проведены

Таблица 5.

Распределение потомства анализирующих скрещивании 1) и 2) по фенотипическим классам.

1) А/а, 1021/1133 xtwt/twt, а/а, 1123/1123

2) twt/twt, а/а, 1123/1123 хТлг^, А/а, 1021/1133

Фенотип Номер скрещивания

Морфологические признаки Гистои III 1 2

twt, А 1133/1123 171 91

Twt, а 1021/1123 150 107

twt, А 1021/1123 13 9

Twt, а 1133/1123 7 3

twt, а 1021/1123 22 6

Twt, А 1133/1123 7 13

Twt, А 1133/1021/1123 21 7

реципрокные анализирующие скрещивания гибридов Т^ (К-3953 х Спринт-2) с линией 5-11.

К, [К-3953 (1нх2-6)а , А, ГМ) х Спринг-2 (г(:5(2-б)ь, а, Т\',-()1 х5-11(Н1я(2-б);,а.ПуО

Лшпш К-3953, Спркнт-2 и 5-11 имели разные электрофоретнческие варианты гистона Н1, которые кодируются тесно сцепленными генам!! Шя(2-6), локализоваными в 4 сМ от гена А (Беляев, Бердникез, 1981). Получе:пгые результата, представленные в таблице 5, слидетелестпугог о тон. что рассматриваемые гены расположены в следующем порядке:

№5(2-6)—5.3 сМ-А-8.0 сМ-ТуД

В потомстве анализирующего скрещивания среди растений с фенотипом А, ТуД были обнаружены особи, которые имели три дозы генов гистона Н11ш(2-6) (Таблица 5) и характеризовались меньшими размерами, замедленным раззитием и измененной формой прилистников. Цитологический анализ мейоза г.ыявил наличие одной дополнительной хромосомы в кариотипе одного из таких растений. Эти наблюдения свидетельствовали о том, что данные растения являются трисомиками в отношении сегмента хромосомы 1, несущего гены Н1з(2-б) и А. Изпестно, что трисомики могут возникать в потомстве растений, гетерозиготных по транслекашш (ЗиИоп, 1939). Действительно, были полу гены доказательства того, что линия "Тм" является носителем реципрскной транслокацнн, т о' ¡ка разрыва которой тес.чо сцеплена с доминантной мутацией Т''Л. Во-перг-ых, было показано, чю гетерозиготные растения Т\у{А\'Д характеризуются 35-50%-нсй стерильностью пыльцы, тогда как гомозиготы обоих тшгап — Т\у1/ТМи 1\\'1/ГуД — фертилыш; зо-втсрых,у гстерозиготТ«'1Л\\'1 на стадии метафазы М1 мейоза в материнских клетках пыльцы наблюдается конфигурация "пять бивалентов плюс кольцо из четырех хромосом".

Хромосомная локализация сегмента сцепления ву п -5—I 'Л ¡1—<1—п с с! 3

Исходя из того, что симбиотические мутации, локализованные по разные стороны от гена 1с'Н, могут быть использованы в качестве фланговых маркеров данного сегмента карты был предпринят поиск сцепления между точкой разрыва транслокации Т.'Д и геном зуш-5. Распределение потомства анализирующего скрещивания

[Тлч (Тм, 5ут-5) х Е2 (1\\Ч, $уш-5)] х Е2 (гм, зут-5)

по фенотипическим классам было следующим:

Twt, Sym-5 Twt, sym-5 twt, Sym-5 twt,sym-5 45 10 1 29

Частота рекомбинации между генами Twt и sym-5 составила 13.0± 3.7 единиц кроссинговера. Однако из-за сильного отклонения от ожидаемого соотношения 1 : 1 по признаку Twt (36=7.35, р<0.01) результаты могли рассматриваться как предварительные. Кроме того, было обнаружено, что растения линии Twt характеризуются неэффективным клубенько-образованием,

С целью более точной локализации Twt по отношению к генам двух сегментов группы сцепления I и выяснения вопроса о том, действительно ли ген Twt ассоциирован с симбиотической мутацией, было проанализировано 96 растений второго поколения скрещивания:

JI73 (A, His7F, d, IdhF) х Twt (a, His7s, D™, Idhs)

Полученные данные подтвердили предположение о существовании взаимосвязи между мутантным фенотипом Twt и неэффективным клубенькообразованием. Фертильные растения с фенотипом Twt не имели клубеньков, тогда как растения twt/twt и полустерильные особи с фенотипом Twt характеризовались нормальным клубенькообразованием.

Результаты сегрегационного анализа по генам a, His7, Twt, d, Idh представлены в таблице 6, из которых видно, что ген Twt, маркирующий точку разрыва соответствующей транслокации, сцеплен со всеми использованными маркерами и гены двух сегментов (A—His7 и d—Idh) сцеплены между собой. Ранее было показано, что при у линий гороха с нормальным кариотипом сцепление между генами А и d, а также между His7 и d отсутствует (Kosterin, 1992,1993). Таким образом, транслокация Twt вызывает псевдосцепление между маркерами, которые, по-видимому, принадлежат двум разным хромосомам, вовлеченным в данную транслокашво.

Идентификация второго партнера транслокации Twt

Результаты цитологического анализа мейоза у гибридов F, между линией Twt и транслокационными линиями известных структурных типов приведены в таблице 7. Структура "одно кольцо из шести хромосом плюс четыре бивалента" наблюдалась в трех случаях (скрещивания 1,4,5). Данные свидетельствуют о том, что в транслокацию Twt вовлечены хромосомы 1 и 6.

Таблица 6.

Данные сегрегационного анализа растений Р2 скрещивания Л 73 (А, Ш, с!, 1сШр) х Т\п (а, Тм, 0е0,ЫЬ:4).

и)

I

Пара щюа Фаза или отгалкггсашгя Число потомков с данным г?:енг/л;ш.:м + X3 Частота рекэмб. ±сгацдмрт. онк.б;га

А/В АЛ1 А/Ь т ЬЛг а/В а/11 с/1»

а—Т\у1 И о 45 22 - - 21 5 0 63.1**** 0.07±0.03

(1—Т^ С 6 42 о - - - 0 3 16 8**** 0.11±0.04

№57—Т^Ч с 18 3 0 2 35 6 0 Л ¿¡. 11 30 1**** 0.10±0.03

ЬШ-ТМ с 18 5 1 5 41 6 0 6 15 77 д**** 0.13А-0.03

а—№$7 с 15 36 5 - - - 0 6 14 30.5**** 0.14±0.04

а-ИЬ с 20 42 8 - - - 0 9 16 29 з**** 0.18±0.04

с!—Н1з7 с 7 30 6 - - - 0 6 9 13.2** 0.21±0.06

(1-1с111 с 9 41 4 - - - 0 3 16 41 д**** 0.09±0.03

№.47—МЬ с 9 6 2 4 32 4 0 6 15 47 з#*** 0.17±0.03

** ****

А,а — первый ген, В,Ь — второй ген, Ь — гстерозигота. Если оба гена доминанты, заглавные буквы используются для обозначения доминантных аллелей. Если второй ген является кодомикантным, заглавная А обозначает доминантный аллель первого гена, заглавная 3 в этом случае обозначает аллель второю гена, который находится в фа:.е притяжения с А. Если оба гена кодсмицанткы, заглавной буквой обозначен аллель первого родителя. Р< 0.01,0.0001, соответственно.

Таблица 7.

Данные цитологического анализа гибридов Б, между тестерными транслокациями и линией Тм.

Номер скрещивания Родительские линии* Конфшурацыя хромосом на стадии М1 мейоза

1 Ь-84 (1-5) х 10 6 + 4 бивалента

2 Ь-83 (3-5) х Т\П 2 0 4 + 3 бивалента

3 Ь-21 (4А-5) х Т«* 2 0 4 + 3 бивалента

4 Ь-114 (4В-6) х 1 О 6 + 4 бивалента

5 Ь-108 (6-7) х Т\У1 10 6 + 4 бивалента

* Хромосомы обозначены в соответствии с труппами сцепления (согласно новой версии генетической карты гороха), в которых локализованы точки разрывов данных транслокаций.

Следовательно, сегмент сцепления вут-б— с1—ЫЬ—пос1-3 локализован в хромосоме 6 и является частью соответствующей группы сцепления VI.

Выводы

1. Впервые были локализованы симбиотические гены 5уш-1 и поё-З. Было обнаружено сцепление данных генов с локусом изоцтратдепадрогеназы ЫЬ. Расстояние между генами 5ут-1 и Ш составило 9±3; между генами по<1-3 и 1сШ — 11±4 единиц кроссинговера.

2. Сцепление гена 5уш-18 с маркерами с! и 1<±Ь не подтвердилось. На основании сцепления с генами \уЬ и к он был локализован в группе сцепления П. Данные свидетельствуют о том, что рассматриваемые гены расположены в последовательности wb—8 сМ—к— ЮсМ—яупИв.

3. С помощью метода полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров было найдено II дополнительных ИАРЭ маркеров, сцепленных с генами Бут-б, с1 и ЫЬ ИАРБ маркеры и построена подробная генетическая карта данного ё-района длиной 46.9 сМ.

4. Использование универсальной тестерной линии Л 73 позволило локализовать пять симбиотическх мутаций, полученных на основе разных сортов, относительно общих морфологических и ДНК маркеров. Было показано, что гены Бум-5 и Буш-19 тесно сцеплены и локализованы по одну

сторону от локуса изоцигратдегидрогеназы Idh, тогда как остальные (sym-1, sym-2, nod-3) образуют второй кластер по другую сторону от этого маркера.

5. В ходе локализации гена nod-3 была обнаружена и идентифицирована новая транслокация, носителем которой является мутантная линия Nod-3, а также исходный сорт Рондо.

6. После обработки этилметансульфонатом семян гороха линии Спринт-2 была обнаружена еще одна транслокация. Точка разрыва данной транслокации тесно ассоциирована с доминантной мутацией Twt, которая вызывает сильное закручивание усиков и влияет на эффективность клубенькообразования.

7. Точка разрыва транслокащш Twt была локализована в хромосоме 1 относительно маркеров His (2-6), A, His7. Полученные данные свидетельствуют о следующем порядке генов:

His(2-6)—5.3 сМ-А-8.0 cM-Twt-10cM-His7.

8. Было обнаружено тесное сцепление точки разрыва транслокации Twt с генами d, Idh, sym-5. Результаты цитогенетического анализа свидетельствуют о том, что эти гены локализованы в хромосоме 6.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горель Ф.Л., Темных С. В., Бердников В. А. Хромосомная локализация новых мутаций у гороха // Тез. конф. "Частная генетика растений".— Киев, 1989.

2. Gorel' F. L„ Temnykh S. V., Lebedeva I. P., Berdnikov V. A. Twisted tendrils (Twt) — aphenotype associated with a translocation involving chromosome I // Pisum Genetics. 1992. V. 24. P. 48-51.

3. Temnykh S. V., Weeden N. F. A breaf synopsis of the current status of pea cytogenetics И Pisum Genetics. 1993. V. 25. P. 1-3.

4. Berdnikov V. A., Gorel' F. L., Temnykh S. V. A more precise location of the breakpoint in Hammarlund's K-line. Pisum Genetics. 1993. V. 25. P. 18-21.

5. Rozov S. M„ Temnykh S. V., Gorel' F. L., Berdnikov V. A. A new version of pea linkage group 5 // Pisum Genetics. 1993. V.25. P.46-51.

6. Weeden N. F., Lu J., Temnykh S. V., Kneen В. E., LaRue T.AMapping and tagging host genes involved in legume microbe interactions. Abstracts of confer. "Plant Genome 1",— San Diego, 1992.

7. Temnykh S. V., Weeden N. F., LaRue T. A. Fine mapping of pea nodulation mutants located in the Idh-d redion of linkage group I //Abstracts of confer. "Plant Genome II".— San Diego, 1994. P. 66.

8. Weeden N. F„ Temnykh S. V., Paruvangada V. G„ Lu J., Yu I., LaRueT. A. Mapping and tagging host genes influencing nodule development and function in pea //Abstracts of the IV International Conference on Plant Molecular Biology.— Amsterdam, 1994.

9. WeedenN.F.,Temnykh S. V.,Paruvandaga V. G., Lu J., Yu J., LaRue T. A. Mapping host genes influencing nodule development in pea. — I European Conference on Nitrogen Fixation. — Syeged, 1994.