Кальций-зависимые механизмы реакций коры головного мозга на гипоксию

Семенов, Дмитрий Германович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кальций-зависимые механизмы реакций коры головного мозга на гипоксию
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Кальций-зависимые механизмы реакций коры головного мозга на гипоксию"

РГБ ОД

1 ■ ____

..л- - •

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П.ПАВЛОВА

на правах рукописи

Семенов Дмитрий Германович

I-

КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫЕДОЕХАНИЗМЫ РЕАКЦИЙ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА ГИПОКСИЮ

Специальность: 03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1999

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН (лаборатория регуляции функций нейронов мозга)

Научный консультант: д.м.н.. профессор М.О.Самойлов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биол. наук, профессор И.Т. Демченко, доктор биол. наук, профессор А.А. Александров, доктор биол. наук, Е.В. Савватеева-Попова

В ЕДУ ЩЕЕ УЧ РЕЖД ЕНИ Е:

Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва.

Защита состоится " Ъгс&лЛ 2000 г., в часов

на заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 002.36.01) при Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН

по адресу: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П.Павлова РАН.

Автореферат разослан " I ^ " __1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биол. наук Н.М.Вавилова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Нарушение кислородного снабжения мозга независимо от его формы и генеза является ведущим нейропатологи-ческпм фактором и конечным звеном п причинно-следственной цепи большинства тяжелых заболеваний. Изучение механизмов гипокси-чесого повреждения мозга и возможностей его предотвращения было и остается актуальной задачей нейробиологии и медицины.

Несмотря на длительную историю изучения гипоксических состояний мозга, лишь в последнее десятилетие появилась реальная возможность вскрытия глубинных молекулярных механизмов повреждения нейронов при гипоксии благодаря бурному развитию исследований на молекулярно-клеточном уровне с использованием современных электрофизиологических, нейрохимических, биофизических и генетических методик. Поэтому исследования воздействия гипоксии на клетки мозга, проведенные с учетом последних достижений молекулярной биологии, приобретают особую актуальность.

Новые методические возможности изучения функций и метаболизма нейронов на молекулярном уровне потребовали применения относительно простых биологических моделей in vitro. В результате нередко возникаюттрудности, а иногда и противоречия при сопоставлении концепций, развиваемых на базе исследований таких моделей, с классическими представлениями, основанными па многолетних исследованиях мозга в условиях in vivo. В этом плане актуальность настоящей работы заключается еще и в том, что она позволяет сопоставить, а в некоторых разделах и синхронизировать, исследования гипоксических реакций на организменном и молекулярно-клеточном уровнях.

В последнее десятилетие огромное внимание исследователей привлекают кальций-зависимые механизмы, обеспечивающие широкий спектр сложнейших реакций нервной клетки, связанных с регуляцией ее метаболизма, формированием и поддержанием структуры, трансдукцией химических и биоэлектрических сигналов, синаптической пластичностью, формированием элементарных процессов обучения и памяти. Особое место в этом ряду занимают исследованияния кальций-зависимых механизмов реагирования нейронов мозга на гипоксию (Hansen, 1982; Peters, 1986; Choi,

1988, 1995; Mayer. Miller. 1990; Kluge, 1991; Siesjo. 1981. 1994: Siesjo. Bengtsson, 1989; Kristian. Siesjo. 1996. 1997; Koctiok. 1997 и мн. др.). Несмотря на интенсивное изучение этой проблемы, бодьшинство исследователей сосредоточивают свое внимание на патогенных эффектах нарушения проницаемости мембран нейронов для внеклеточного Са2+ (Са2+сх), вызванных относительно дл птельнымдействи-ем гипоксии/ишемии. Вместе с тем, наиболее ранние реакции нейронов на гипоксию а также постгипоксические процессы, протекающие с вовлечением внутриклеточных пулов связанного кальция (Са-с) и роль этих пулов в механизмах клеточной адаптации и повреждения мало изучены. В этом плане настоящая работа относится к немногочисленным, но актуальным современным исследованиям, показывающим ключевую роль кальциевой внутриклеточной регуляторной системы (ВРС) в инициации как патогенных (Самойлов, 1985; Fasolato et al., 1994; Belousov et al.. 1995; Kaplin et al., 1996), так и адаптивных (Самойлов, 1995; Самойлов, Мокру-шин, 1999) реакций нервных клеток на гипоксию.

Для борьбы с повреждающим действием гипоксии на мозг фармакологами предложен огромный арсенал медикаментозных средств - антигипоксантов, обладающих различными специфическими свойствами, повышающими резистентность организма к кислородному голоданию и облегчающими постгипоксическую нормализацию метаболизма и функций. Особое внимание уделяется средствам, препятствующим нарушению гомеостаза Са2+ в нейронах. В связи с этим класс кальциевых антагонистов (блока-торы входа Са2+ и «кальциевой перегрузки», модуляторы Са2+-свя-зывающих белков и др.) интенсивно исследуется и пополняется. Одним из ведущих Са2н-опосредованных механизмов необратимого повреждения нейронов, вызванного гипоксией, является перекисное окисление липидов и белков. Для предупреждения (подавления) этих патологических явлений используют препараты антиоксидативного действия (Жданов и др., 1989; ВопГосо et al., 1995 и др.). Замечено, что антигипоксанты, относящиеся к различным классам фармакологических препаратов, нередко обладают единым неспецифическим эффектом па механизмы клеточного адаптогенеза. В некоторых классификациях такие препараты выделяются в отдельную группу антигипоксантов неспецифического нейротропного действия (Лукьянова, 1987). Определение

роли внутриклеточных регулятррныхсистем в механизмах этого явления, которые до настряшего времени мало изучены, актуально для разработки новых фармакологических средств и тактики фармакотерапии, повышающей резистентность мозга человека к гипоксии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы -изучение роли Са2" в индукции и формировании адаптивных и патологических реакций коры головного мозга, вызванных временным прекращением кислородного снабжения. Основные задачи исследования:

1. Изучить динамику фоновой биоэлектрической активности нейронов коры мозга во время и в течение десятков минут после аноксии различной длительности в экспериментах in vivo.

2. Выявить в этих условиях закономерности изменения активности кальциевой ВРС, характеризуемой динамикой содержания Са-с, и установить их связь с изменениями биоэлектрической активности нейронов.

3. Оценить влияние аноксии различной длительности на Са2 '-зависимые механизмы глутамат- и холинергической передачи сигналов в коре мозга.

4. Провести сравнительное исследование роли Са2+-зависимых механизмов в формировании нейропротектирующего действия гипок-сического стресса (прекондиционирующая аноксия) и представителей разных классов антигипоксантов (оксиметацил, флунаризин).

5. В экспериментах in vitro на срезах обонятельной коры мозга изучить динамику содержания Са-с и свободного внутриклеточного кальция (Са2+|п) во время и после аноксии различной длительности. Оценить вовлечение NMDA рецепторов в процессы изменения внутриклеточного кальциевого гомеостаза в этих условиях.

6. На этой же экспериментальной модели изучить особенности протекции кальциевой ВРС в условиях аноксического преконди-ционирования.

7. Исследовать эффекты нейромодуляторных факторов, выделяемых срезами-донорами, пережившими кратковременную анок-сию (КА). на состояние кальциевой ВРС срезов-реципиентов - ин-тактных и подвергнутых долговременной аноксии (ДА).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Кальций-зависимые процессы вовлекаются в приспособительные реакции нейронов мозга на КА, проявляясь в стойком умеренном повышении активности кальциевой ВРС. Вместе с тем. кальциевые механизмы лежат и в основе повреждающего воздействия ДА и выражаются длительной гиперактивацией ВРС.

2. Инициация сложной цепи реакций на анокспю связана с мобилизацией внутриклеточного связанного кальция. При усилении гипоксического воздействия добавляется фактор резкого повышения проницаемости плазмолеммы для Са2+сх. При реоксиге-нации после КА и ДА в устойчивое изменение кальциевого гомеос-таза вносят вклад как Са-с, так и Са2+ех. Важную роль в этих процессах играет модификация активности глутаматных рецепторов.

3. Аноксические воздействия различной продолжительности вызывают характерные изменения активности Са^-зависимых механизмов холин- и глутаматергической сигнальной трансдукции.

4. Протектирующий эффект фармакологических средств анти-гипоксического действия (антиоксиданты, кальциевые антагонисты) и прекондиционирующей КА связан с умеренной активацией кальциевой и фосфоинозитидной регуляторных систем клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые в условиях in vivo и in vitro установлена и проанализирована динамика содержания Са-с в коре головного мозга млекопитающих на различных этапах аноксии и в раннем периоде постаноксического восстановления. Использование комплексного методического подхода в экспериментах in situ позволило совместить изучение этих процессов с анализом динамики импульсной активности нейронов коры и сопоставить полученные данные с динамикой ряда функциональных и метаболических показателей органного и организменного уровней, определяемых в тех же экспериментальных условиях.

Установлена ведущая роль пула Са-с в индукции комплекса Са2+-опосредованных внутриклеточных метаболических реакций, развивающихся в нейронах в пределах 5 мин аноксии и в течение 60 мин реоксигенации in situ. В этих экспериментах исследовано вызванное КА (до 2.5 мин) явление постанокснческой гиперактивации нейронов коры мозга в сопоставлении с динамикой активности кальциевой ВРС. Показано, что в основе постанокснческой

гиперактпвашш лежит усиление Ca2t-опосредованных процессов глутаматергической сигнальной трансдукции.

Установлена важная роль умеренной активации кальциевой и связанной с ней фосфоинозитидной ВРС в молекулярно-клеточ-ных механизмах антигипоксической протекции коры мозга, инициируемых как антигипоксантами (флунаризин, оксиметацил), так и превентивной КА. Определены оптимальные условия для реализации Са:'-зависимых реакций клеточного адаптогенеза, индуцируемого указанными нейропротектирующими средствами.

В модельных экспериментах на срезах коры головного мозга впервые проведено параллельное синхронизированное измерение динамики содержания Са-с и Са2+.п во время и после аноксии различной длительности. Установлено, что КА (2 мин) создает длительную умеренную активацию кальциевой ВРС в постаноксическом периоде, выражающуюся в небольшом повышении содержания внутриклеточного Са2+ как связанного, так и свободного. Важную роль в этой активации играют NMDA рецепторы. В то же время ДА(10 мни) инициирует гиперактивацию ВРС, которая сопровождается мощным NMDA-опосредованным входом Са2+сх во время и после ДА. На самых ранних этапах реоксигенации рост содержания Са2+ш может сдерживаться внутриклеточными системами кальциевого гомеостаза, но после 20-30 мин накопление Ca2fin возобновляется.

В экспериментах in vitro установлен новый факт, свидетельствующий о том, что нейромодуляторные факторы (НМФ), выделяемые после КА срезом-донором в перфузат в период умеренной адап-тогенной активации его ВРС, способны вызывать в интактном срезе-реципиенте идентичную активацию. Протектирующий эффект этих факторов, как и самой превентивной КА, проявляется в предотвращении патогенной гиперактивации ВРС в срезе-реципиенте, подвергнутом ДА.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Продемонстрированные в работе закономерности изменения активности кальциевой ВРС и связанная с ними динамика биоэлектрической активности коры мозга животного, подвергнутого аноксии различной длительности, выявляют ключевую роль внутриклеточных Са2* -зависимых процессов в индукции и формировании широкого спектра реакций нейронов, вызванных нарушением их кислород-

ного снабжения. Эти данные, наряду с результатами, раскрывающими Са2'-зависимые неспецифические механизмы адаптации мозга к гипоксии, инициируемые на молекулярно-клеточном уровне фармакологическими и немедикаментозными средствами, вносят вклад в решение крупной научной проблемы определения роли внутриклеточного Са2+ и Са2+-зависимых процессов в развитии адаптивных и патологических состояний мозга. Выявленные механизмы и условия реализации протектируюших антигипоксических эффектов примененных фармакологических препаратов и анокси-ческого ирекондиционирования могут найти применение в сфере практической медицины (реаниматология, нейро- и психопатология, травматология и др.), в профилактических направлениях спортивной и военной медицины, а также во многих сферах человеческой Деятельности, связанных с высокой вероятностью экстремальных ситуаций, приводящих к гипоксии мозга (подводные и высокогорные работы, авиация, космонавтика, работы в очагах природных и техногенных катастроф и др.).

Развиваемые в работе теоретические представления о механизмах реагирования нейронов мозга на кислородное голодание могут найти практическую реализацию в учебных процессах медицинских и биологических высших учебных заведений.

Методические разработки и усовершенствования, описанные в работе, опубликованные и оформленные автором в виде изобретений и рационализаторских предложений, могут найти применение в экспериментальной практике микрофизиологических и биохимических исследований мозга in vivo и in vitro.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на 13-ом Всесоюзном съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Алма-Ата, 1979), 1-ом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); на Всесоюзных и Всероссийских конференциях, симпозиумах: "Аппаратура и методы количественной микроскопии" (Ленинград, 1980), "Применение контактной микроскопии в биологии и медицине" (Москва, 1981), "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино. 1990), "Токсикологические проблемы химических катастроф" (Ленинград, 1991), "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991),"Антигипоксанты и актопротекторы" (С.-Петербург, 1994). "Молекулярно-клеточные и генетические механизмы адаптивного

поведения" (С-Петербург, 1994), "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1997); на 10-м и 13-м международных Конгрессах Европейской Неврологической Ассоциации (Стокгольм, 1986, 1990), 1-ом Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991), 33-м Всемирном Конгрессе физиологических наук (С.-Петербург, 1997); международных конференциях, симпозиумах "Физиологические и биохимические основы активности мозга" (С.-Петербург, 1994), "Контактная и конфокальная микроскопическая техника" (Варшава, 1996), "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (С.-Петербург, 1997), "Экспериментальная и клиническая патофизиология" (Варшава, 1997), "Гипоксия в медицине" (Москва, 1998, 1999); на заседаниях отдела нейрохимии Медицинского Исследовательского Центра ПАН (Варшава, 1996, 1997, 1998) и отдела физиологии и патологии высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (С.-Петербург, 1999).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 53 научные работы в отечественной и зарубежной печати, среди них глава в коллективной монографии и 2 изобретения.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографии. Диссертация изложена на 320 стр. печатного текста, иллюстрирована 85 рисунками. Библиография включает 81 русский и 236 иностранных источников.

1МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основная часть работы in vivo выполнена на 223 кошках самцах весом 3-3.5 кг. Животные были легко наркотизированы нембу-талом, обездвижены трикураном и переведены на искусственное дыхание. Основным методическим подходом in vivo являлось совмещенное определение параметров биоэлектрической активности нейронов коры мозга и динамики содержания в ней внутриклеточного связанного кальция (Са-с). Биоэлектрическую активность нейронов коры мозга характеризовали главным образом частотой спонтанной спайковой импульсации, регистрируемой стандартными электрофизиологическими методами с помощью металлических микроэлектродов (Samoilov et al., 1992; Семенов,

Ермолин, 1994). В ряде экспериментов применяли регистрацию суммарной фоновой активности сенсомоторной области коры (ЭКоГ) и прямого коркового ответа на афферентную электростимуляцию. Динамику содержания Са-с «различных экспериментальных условиях определяли спектрофлуориметрическим методом в микроучастках специально изготовляемого живого препарата коры мозга (Самойлов, Семенов, 1978) с помощью хлортетрацик-линовойфлуоресцентной пробы, используя контактный микроскоп ЛЮМАМ-КФ (ЛОМО, СПб) (Самойлов и др., 1984; Семенов. Ермолин, 1993,1994). В качестве дополнительного методического приема, предназначенного для определения проницемости гемато-энцефалического барьера, внутрикоркового содержания Са2+ и свободных аминокислот в ходе опытов in vivo, применяли внутрикор-ковую микродиализную перфузию коры мозга с последующим флу-ориметрическим, радиологическим или хроматографическим анализом диализата, соответственно (Ungerstedt, 1984; Lazarewicz et al., 1986). Помимо указанных методик исследования мозга применяли некоторые стандартные методические приемы оценки функционального состояния подопытного животного на организменном уровне с использованием соответствующих лабораторных процедур и оборудования. - • . .

Исследования in vitro проведены на инкубируемых срезах обонятельной коры мозга 92 крыс самцов линии Вистар-Киото весом 180-220 г. Срезы толщиной 300-400 мкм инкубировали в искусственной среде следующего состава (в мМ): NaCl-124, КС1-5, СаС1г2.6, MgS04-1.2, К2НР04-1.24, NaHCO,-3, глюкоза-10, трис-НС1-23; температура 37°С, рН-7.4 (Митюшов и др., 1986). Для определения содержания Са-с применяли модифицированную для условий in vitro микрофлуориметрическую методику с использованием маркера хлортетрациклина (Семенов и др.. 1999). Содержание Ca2+inопределяли наспектрофлуориметре HITACHI F-2000(Tokio) с помощью флуоресцентного маркера fura-2 (Zielonka et al.. 1996). Проникновение Ca24 из экстраклеточной среды, опосредованное активацией NMDA-ассошшрованных кальциевых каналов, оценивали, используя неконкурентный антагонист NMDA рецепторов -МК-801. В экспериментах in vitro, с целью повышения корректности контрольных измерений, использованы перфузионные камеры, сконструированные автором, рассчитанные на одновременную

(но независимую по режиму) инкубацию двух срезов одного мозга и их параллельную спектрофлуориметрию (Семенов, 1999).

Большинство экспериментов in vivo и in vitro было выполнено по единой схеме: 1 -измерения контрольных уровней определяемых биоэлектрических и/или метаболических параметров и динамики их спонтанного дрейфа; 2 -регистрация их изменений в ответ па определенные кондиционирующие воздействия (агонисты или антагонисты рецепторов, антигипоксанты, кратковременная анок-сия и др.); 3 -мониторинг этих параметров и реакций в условиях аноксии различной длительности и в течение 1-2 часов соответствующих периодов реоксигенации на фоне или вследствие кондиционирующих воздействий и/или без них. В экспериментах in vivo анок-сию создавали путем временного (на 1-5 мин) отключения искусственного дыхания иммобилизированного животного; на срезах коры аноксию моделировали временной заменой (на 2 или 10 мин) кисло-род-содержаших жидкой и газовой инкубационных сред на азот-со-держащие. Все данные обрабатывали статистически, используя стандартные пакеты компьютерных программ: STATGRAPH, SIGMAPLOT, SIGMASTAT и программы математической обработки, инсталлированные в соответствующие аналитические приборы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЭФФЕКТ АНОКСИИ IN VIVO. В экспериментах in vivo применялись аноксические воздействия, не превышающие 5 мин, поскольку более длительная аноксия вызывала, как правило, необратимую ишемию коры головного мозга и значительно повышала летальность, что исключало возможность исследования интересующих нас постаноксических процессов.

В мнкропробах артериальной крови животных к 2.5 и 5 мин аноксии выявлено снижение рО,до 10 и 5 mmHg, pH - до 7.3 и 7.14 и повышение рС02 до 45 mmHg, соответственно. При этом р02 в гканях коры мозга, измеренное полярографическим микроэлектродом, приближалось к "0" уже на 30 — 40 с аноксии.

Биоэлектрическая активность коры претерпевала в течение аноксии фазные изменения. В первые 30-70 с развивалась десин-хронизания тета-, синхронизации альфа- и подавлении дельта - компонентов ЭКоГ, что соответствовало изменению паттерна импульсной активности отдельных нейронов (ИАН) без достоверного

изменения ее частоты (фаза дезорганизации). Вторая фаза характеризовалась угнетением альфа- и временным восстановлением дельта-ритма, достигавшего своей максимальной выраженности к 1.5-2 мин аноксии. В этот период отмечена кратковременная вспышка ИАН, в 5-10 раз превосходящая по частоте ее фоновый уровень (фаза гиперактивации). Третья фаза соответствовала стремительному угнетению суммарной биоэлектрической активности коры и ИАН вплоть до полного их прекращения к 2-2.5 мин. (фаза депрессии).

Первые достоверные изменения уровня Са-с в тканях коры мозга отмечены уже после 15 с аноксии. Его содержание снижалось вначале плавно, а после вспышки нейрональной активации более стремительно. К 1.5, 2.5 и 5 мин уровни Са-с составляли всреднем93.%, 89% и 73% исходныхзначений,соответственно. При использовании методов микродиализной перфузии коры мозга и радиоизотопного анализа концентрации CaHcx до 5 мин аноксии не выявлено увеличения входа в клетки ионов Са2+ из внеклеточного пространства

Таким образом, примененная модель аноксического воздействия in vivo позволила установить определенную фазность биоэлектрических изменений в коре мозга и соответствующую ей динамику процесса высвобождения Са2+ внутриклеточными доменми.

Ниже изложенные результаты касаются процессов, происходящих при возобновленном дыхании животного (реоксигенация) после периода аноксии различной длительности. Применялась 1-1.5 мин кратковременная аноксия (КА) и 5 мин долговременная аноксия (ДА). Выбор этих сроков обусловлен характерными особенностями биоэлектрических и метаболических изменений в коре мозга кошек, вызываемых аноксическими воздействиями различной продолжительности (Самойлов. 1985).

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПОСЛЕ 1.5 МИН АНОКСИИ. В данном разделе исследований были поставлены две серии опытов с КА. В первой серии реоксигенацию начинали немедленно после реализации фазы аноксической гиперактивации нейронов, но не позднее 100с, а во второй - аноксия прерыватась реоксигенацией до указанной фазы, но не ранее 60 с. Если стартовая динамика восстановления в обеих сериях была одинаковой и выражалась в кратковременном торможении ИАН и резкой тенденции к нормализа-

ции содержания Са-с. то после 10-15 мин выявлены различия в динамике этих показателей в двух сериях. В первой отмечена нарастающая активация нейронов и снижение уровней Са-с со стабилизацией после 50 мин реоксигенаиии на уровнях в среднем 160% и 91%, соответственно; во второй серии эти показатели в течение первых 20-30 мин плавно нормализовались.

Таким образом, установлено, что явление аноксической высокочастотной активации нейронов отражает включение триггерных механизмов развития умеренной стойкой активации кальциевой ВРС в восстановительном периоде после КА.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПОСЛЕ 2.5 МИН АНОКСИИ. Возобновление искусственного дыхания животного после 2.5 мин анок-сии практически нормализовало измеряемые параметры газов крови уже к 5 мин. Спонтанная ИАН, заблокированная аноксией, возникала в течение первых 5-7 мин реоксигенации и, стремительно нарастая по частоте, превышала доаноксический уровень уже после 10 мин (постаноксическая гиперактивация). В этот период увеличивалось в несколько раз и количество спонтанно активных нейронов в коре. Анализ динамики этого показателя выявил две основных волны постаноксической гиперактивности с пиками на 25 и 50 мин. ЭКоГ после 10 мин демонстрировала быстрый рост амплитуды всех трех основных ритмов (особенно альфа-подобного), однако дальнейшая их постаноксическая динамика носила сложный характер. Если в ранней волне гиперактивации предшествовала повышенная синхронизация и преобладание в спектре ЭКоГ альфа-подобных осцилляций, то для поздней волны было характерным повышение синхронизации и низкочастотных периодических дельта-подобных волн и рост частоты их появления (рис.1 А). Именно в поздней фазе гиперактивности (в отличие от ранней) обнаружено стойкое повышение (на 30-40%) амплитуды позитивной волны первичного коркового ответа на афферентную электростимуляцию. Следовательно, в коре мозга в течение длительного времени после 2.5 мин аноксии, как и при указанных условиях после 1.5 мин аноксии, поддерживалось состояние гиперактивности нейронов, имеющее неоднородный электрогенез и характеризующее, очевидно, развитие долговременной потенциации синаптической сигнальной трансдукции. В первые 10 мин реоксигенации уровень Са-с возрастал в направлении нормализации, но,

достигнув93-95% доаноксического значения, стабилизировался на весь период реоксигенании, в течение которого возбудимость нейронов оставалась повышенной (рис. 1С).

Для оценки вовлечения кальциевой ВРС I! процессы постаноксической потенииации биоэлектрической активности нейронов определяли Са-ответ (изменение содержания Са-с) в микроучастках живого препарата коры мозга на ортодромную стимуляцию нейронов (раздражение бедренного нерва) и аппликацию глутамата и ацетилхолина на поверхность препарата. Обнаружено, что если в контроле короткая низкочастотная серия электрических стимулов вызывала в клетках коры быстро обратимое снижение уровня Са-с на 5-6%, то в период постаноксической потенциации это негативное смещение усиливалось в полтора раза и сопровождалось временным (до 8 мин) позитивным колебанием уровня Са-с. Это указывает как на усиленное вовлечение внутриклеточного процесса высвобождения Са2+, так, вероятно, и на активацию механизмов входа Са2ч,ч в этот период с последующим его связыванием. Ацетилхолин (АХ), апплици-рованный в концентрациях 5 и 10 мкМ в течение 2 мин в контроле вызывал возбуждение нейронов, сопровождающееся двухфазным негативно-позитивным изменением уровня Са-с в микро-скопируемыхучастках коры. При этом начальная негативная фаза ответа (высвобождение Са2ь) была более выраженной при более высокой концентрации АХ. На фоне развившейся постаноксической потенциации даже низкие концентрации АХ способны были вызвать Са-ответ с выраженной начальной негативной фазой. В этот период отмечен и более сильный возбуждающий эффект АХ, чем в контрольных тестах. Применение глутамата (ГЛУ) (5 и 10 мкМ) в исходном состоянии-вызывало, сложную многокомпонентную динамику содержания Са-с. При аппликации ГЛУ (5 мкМ) первичный компонент Са-ответа, как и в случае АХ, был представлен негативно-позитивным двухфазным смещением уровня Са-с и сопровождался активацией нейронов. При повышении концентрации ГЛУ до 10 мкМ позитивная фаза, очевидно отражающая процесс связывания внутриклеточными депо Са2+, вошедшего в клетки при активации ионотропных глутамат-ных рецепторов, усиливалась и маскировала начальный негативный компонент. В постаноксическом периоде те же концентрации

Рис. 1. Постаноксическая модификация биоэлектрической активности, Са2*-зависимых процессов сигнальной трансдукции и состояния кальциевой ВРС нейронов, вызванная 2.5мин аноксией ¡n vivo.

-100

-ю о ю га зо «о бо во ?о

1 . \ S ,г\ \ GLU

V J

100

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 90

— 100

А: вверху - изменения амплитуды основных ритмов ЖоГ, внизу - изменения индексов периодических высокоамплитудных ритмов (альфа и дельта) и количества активных нейронов (КАН) (%). Ось абсцисс - время реоксигена-ции (мин). В: Са-ответына аппликацию АХ (вверху) и ГЛУ (внизу) до аноксии (светлые точки) и на 40 мин реоксигенации (черные точки). Оси ординат -изменение уровня Са-с(%), ось абсцисс - время (мин). С: изменения содержания Са-с (левая ось) и частоты ИАН (правая ось) (%). Ось абсцисс - время реоксигенации (мин). Черная отметка - время действия аноксии (А и С) или агониста (В).

апплицируемого ГЛУ вызывали первичный Са-ответ с более чем двукратным усилением позитивной волны и более мощным возбуждающим эффектом (рис. 1 В).

Приведенные результаты показывают, что кратковременная аноксия, инициирует умеренную активацию кальциевой В PC и механизмов, обеспечивающих постаноксическую гиперактивность нейронов. При этом активируются процессы как холинергической, так и, особенно, глутаматергической сигнальной транедукции.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПОСЛЕ 5 МИН АНОКСИИ. Аноксия in vivo длительностью 5 мин вызывает сильные изменения функциональных и метаболических характеристик на всех уровнях от моле-кулярно-клеточного до организменного. В отличие от экспериментов с более короткими аноксическими воздействиями, в данной серии спонтанное восстановление системного артериального давления после начала реоксигенации происходило лишь у 73% животных. Динамика систолического артериального давления в восстановительном периоде у этих животных значительно варьировала, но, как правило, приводила к полной его нормализации после 10 мин.

Результаты, полученные при определении концентрации Са2+ех в межклеточном пространстве тканей коры методом микродиализной перфузии после аноксии, указывают на отсутствие в этот период (как и во время аноксии) усиленного входа Са2+ в нейроны. Измерение с помощью того же метода экстраклеточного содержания свободных аминокислот (глутамин, глутамат, аспартат, метио-нин, таурин и др.) продемонстрировало общую для всех аминокислот картину изменения их концентраций в постаноксическом периоде. При этом анализ математической модели этого процесса, которая учитывала сосуществующие нарушения гемато-энцефали-ческого барьера, показал, что именно эти нарушения наряду с изменениями объема ткани играют определяющую роль в формировании обнаруженной постаноксической динамики концентраций аминокислот, и не показал селективного накопления глутамата и аспартата в это период. У большинства животных спайковая активность одиночных нейронов возникала лишь к 20 мин реоксигенации, а к 30 мин частота ИАН едва достигала 25% исходного уровня (рис. 2С). Паттерны ритмической активности ЭКоГ так же не нормализовались по меньшей мере в течение 70 мин реоксигенации (рис. 2А). Тенденция к восстановлению содержания Са-с

Гнс.2. Динамика восстановления биоэлектрических характеристик состояния коры мозга и активности кальциевой БРС после 3мин аноксии in vivo. Сравнение некоторых показателей реакции мозга на аноксию у животных с различной резистентностью (В).

А: вверху - динамика амплитуды основных ритмов ЭКоГ, внизу - динамика индексов периодических высокоамплитудных ритмов и количества активных нейронов. С: Динамика содержания Са-с и частоты HAH. На А и С обозначения те же, что на рис. 1А и 1С. В: Сравнительные характеристики максимальной частоты И АН при аноксической гиперактивации (AGA), периода блока активности во время (tBA) и после (tBR) аноксии, времени достижения 25% уровня восстановления ИАН при реоксигенации (tF25%) и смещение уровня Са-с к 30 мин реоксигенации (СаЗО') в группе менее резистентных животных по отношению к соответствующим показателям в группе более резистентных животных (пунктир).

наблюдалась лишь и течение первых 15-20 мин реоксигенации. затем его значение стабилизировалось на уровне 80-85% пли повторно начинало снижаться, свидетельствуя о чрезмерной активации кальиий-высвобождаюших процессов и/или о нарушениях гомео-статических механизмов его связывания (рис. 2С). Ни афферентная стимуляция коры на 30-40 мин реоксигенации, ни аппликация АХ не вызывали биоэлектрической реакции и не смешали уровень Са-с в коре. Са-ответ на аппликацию ГЛУ все же был отмечен, однако в нем не проявлялась позитивная волна, что указывает на сниженную кальций-связываюшую способность мобильных внутриклеточных доменов. Характерной особенностью восстановления функциональных и метаболических параметров во время реоксигенации после 5 мин аноксии по сравнению с 2.5 мин, была значительная индивидуальная вариабельность в его темпе и фазах у раз-ныхживотных, потребовавшая их разделения на две основные (приблизительно равные) группы (рис. 2В). Результаты оценки исходной активности кальциевой ВРС и анализа постаноксической динамики биоэлектрических показателей и изменений уровня Са-с у различных животных привели к заключению, что успешность восстановления нейрональных функций после столь сильного гипок-сического воздействия в значительной мере определяется степенью индивидуальной устойчивости кальциевой ВРС к повреждающему действию гипоксии.

ВЛИЯНИЕ СРЕДСТВ, ПОВЫШАЮЩИХ ТОЛЕРАНТНОСТЬ НЕЙРОНОВ КОРЫ К ГИПОКСИИ. Исходя из предположения, что устойчивость нейронов коры к гипоксии может быть связана с исходным состоянием их ВРС, мы предприняли серию экспериментов с применением фармакологических и немедикаментозных воздействий, которые обладают нейропротективной анти-гипоксической эффективностью и, следовательно, могут выступать в качестве средств, стимулирующих адаптивные перестройки ВРС нейронов. В качестве таких средств были выбраны оксиметацил (ОМ) и флунаризин (РЬ), принадлежащие по своей фармакологической специфике к различным классам антигипоксантов. а также кратковременное гипоксическое воздействие. Препараты вводились внутривенно в концентрациях 5 мг/кг и 1:5 мг/кг для ОМ и ЯЬ, соответственно, за 60-80 мин до 5 мин аноксии. В течение этого периода как ОМ, так и ЯЬ вызывали постепенное учашение

И АН с преобладанием пачкового паттерна. Частота ИАН прекращала возрастать и стабилизировалась через 30-40 мин после инъекции на повышенном уровне на десятки минут. В обоих случаях спектрофлуориметрическое зондирование микроучастков живого препарата коры выявило небольшое снижение содержания Са-с, развивающееся параллельно с активацией нейронов и стабилизирующееся к моменту стабилизации частоты ИАН. Указанная динамика частоты ИАН и уровня Са-с совпадала с таковой, инициируемой КА (1.5 мин) (рис.ЗА). Применение ДА (5 мин) на фоне установившихся сдвигов ИАН и уровня Са-с показало, что оба препарата так же, как и прекондиционирующей КА, оказывали сходное протектирующее воздействие на нейроны коры, оцениваемое по

Рис.3. А: динамика Са-с (вверху) и частоты ИАН (внизу), индуцированная оксимстацилом (ОМ), флунаризином (FL) и кратковременной аноксией (КА). В: протектирующие эффекты ОМ, FLuKA на динамику Са-с и ИАН в периодреоксигенации после 5мин аноксии in vivo (ОМ+А5, FL+A5, КА+А5) по сравнению с реакциями не кондиционированных животных (control).

По осям ординат - изменение содержания Са-с и частоты ИАН в %к исходному уровню, по осям абсцисс - время воздействия (слева) и время реоксигенации носче 5мин аноксии (справа). Черная отметка - время действия аноксии.

ряду параметров во время и после аноксии. В посганоксическом периоде отмечено более раннее возникновение ИАН и полная нормализация ее частоты после 30 мин реоксигенаиии, а также быстрое и более полное восстановление пула Са-с (рис.ЗВ).

Во всех случаях постаноксического применения АХ и ГЛ У is этих экспериментах биоэлектрические и Са-ответы на аппликацию аго-нистов отчетливо проявлялись.

Адаптивный нейропротективный эффект умеренного гипокси-ческого воздействия (или прекондиционируюшей гипоксии/ише-мии|становится объектом интенсивного изучения все более широкого круга исследователей, которые признают кратковременный гипоксический стресс мощным и перспективным немедикаментозным средством антигипоксической протекции мозга. С целью углубления представлений о характере вовлечения кальциевой В PC в механизмы повреждающего и адаптогенного действия ДА и КА, соответственно, и более детального изучения молекулярно - клеточных механизмов нейропротекции, вызываемой аноксическим прекондиционированием с использованием КА, были поставлены несколько серий опытов на переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс.

АНОКСИЯ И РЕОКСИГЕНАЦИЯ IN VITRO. В срезах коры аноксия снижала содержание Са-с. Ко 2 минуте его уровень падал в среднем до 95% исходного значения. Последующая реоксигена-ция приводила к быстрому росту содержания Са-с, которое превышало доаноксическое после 20 мин и стабилизировалось после 70 мин на уровне около 108%. При определении динамики свободного внутриклеточного Саи с помощью индикатора fura-2 в срезах, суперфузируемых в кюветахспектрофлуориметра HITACHI F-2000, обнаружено, что 2 мин аноксия вызывала небольшое, но отчетливое повышение уровня Ca2+in, которое устранялось с началом реок-сигенации. Однако уже после 10 мин нормоксической суперфузии отмечалась тенденция к его повторному повышению, усиливающаяся после 25 мин. Блокада кальциевых каналов, ассоциированных с NMDA рецепторами, которая осуществлялась переводом среза за 15-20 мин до аноксии на суперфузию раствором, содержащим МК-801 (ЮмкМ), не влияла на величины сдвигов Са-с и Са2нп, во время аноксии, однако, в постаноксическом периоде обнаружено существенное подавление фазы возрастания уровня Са-с и полное

Рис. 4. Динамика Са-с (вверху) и Си- (внизу), индуцированная в срезах обонятельной коры кратковременной (Л) и долговременной (В) аноксией.

Обозначения те же, что на предыдущих рисунках.

в! А

4т

Ят я Г..-"

-»; ! "1 и -в1 / ~ —• соп1го1 —■ МК-801

Г-

I >1

1/1" 1

-1С о ю го зо 40 60 ео

ю о -10 -80

30 20 Ю О -10

— соп1го1 МК-601 КА

-10 0 10 ЙО 30 40. 60 ВО

предотвращение накопления Са2+ш (рис.4А). Эти результаты указывают на то, что высвобождение Са-с во время КА является, очевидно, единственной причиной некоторого повышения внутриклеточной концентрации Са2+. Во всяком случае, вход Са2+сх через NMDA - ассоциированные каналы в этот период не развивается. Однако последний механизм заметно активируется в период реок-сигенации (к 20-25 мин) и приводит к активации кальциевой ВРС, проявляющейся в умеренном повышении содержания в клетках Са2+ и его "захвата" гидрофобными кальций-связывающими доменами.

По сравнению с КА, 10-ти минутная ДА вызывала вдвое большее сокрашениение пула Са-с, а уровень Са24\п повышался в среднем до 135%. В постаноксическом периоде уровень Са-с быстро нарастал, достигая к 70 мин в среднем 118%. Содержание Са2+1п на ранней стадии реоксигенации временно нормализовалось, но после 20 мин вновь начинало расти. На фоне применения МК-801 резкий рост содержания Са2+ш во время ДА подавлялся, но негативное смешение уровня Са-с к 10 мин аноксии оказывалось вдвое большим (в среднем до 84%) (рис. 4В). Этотфеномен, очевидно, вызван

не дополнительной стимуляцией высвобождения Са-с. а лишь "демаскировкой" этого процесса в результате устранения in интегрального флуоресцентного сигнала компонента, который характеризовал в контрольных экспериментах (без МК-801) процесс связывания входящих при аноксии ионов Ca2'. В постаноксическом периоде наблюдалась быстрая нормализация уровней как Са-с. гак и Са:" (рис. 4В). Представленные в этом разделе результаты показывают, что 10 мин аноксия инициирует в срезах коры не только значительное высвобождение Са-с, но и массивное проникновение в них Са24ех через NMDA-ассоциированные кальциевые каналы во время и после ДА. Эти два процесса создают гиперактивацию кальциевой ВРС, приводя к росту концентрации Са2+щ и «перенапряжению» компенсаторных гомеостатических механизмов его связывания.

На срезах коры была применена модель аноксического прекон-диционирования, которая заключалась, как и в экспериментах in vivo, в использовании превентивной КА за 90-100 мин перед ДА. Было обнаружено, что сдвиги уровней Са-с и Са2'.ш во время и после ДА в прекондиционированных срезах уменьшались в несколько раз, что свидетельствует о предотвращении в нейронах гиперактивации кальциевой ВРС, индуцируемой ДА. В тех случаях, когда превентивная КА и первые 60 мин реоксигенации после нее проводились на фоне действия МК-801, ее протектирующий эффектна кальциевую ВРС во время и после последующей ДА не проявлялся. Это указывает на важную роль активации NMDA рецепторов, происходящую через некоторое время после КА, в развитии адаптивных процессов в нейронах.

Недавно показано, что КА инициирует 15 срезах обонятельной коры синтез и высвобождение в экстраклеточное пространство ней-ромодуляторных факторов (НМФ) пептидной природы, которые, будучи перенесенными на срез-реципиент, препятствуют развивающимся в нем вследствие ДА нарушениям биоэлектрических характеристик нейронов (Самойлов, Мокрушин, 1997, 1999). Вместе с тем до сих пор остается не ясным механизм нейропротективного действия НМФ. Нами обнаружено, что донорский перфузат, собранный в период с 50 по 90 мин реоксигенации после КА («поздний» постаноксический перфузат), вызывает умеренное усиление кальций - связывающих реакций в срезе-реципиенте.

подобное тому, которое вызывает непосредственное воздействие К.А. В то же время, «ранний» постаноксический перфузат, собранный в первые 20 мин реоксигенашш, а также контрольные (доаноксические) его порции, таким свойством не обладают. При со ¡лании ДА в срезах-реципиентах, омываемых «поздним» пер-фузатом доноров, обнаружено, как и в экспериментах с анокси-ческим прекондшшонированием, что патогенная гиперактива-пия кальциевой ВРС не развивается. Контрольный и «ранний» перфузаты не оказывали такого защитного эффекта на срезы-реципиенты.Следовательно, КА индуцирует продукцию и выделение из клеток НМФ на относительно позднем этапе реоксигенаиии. Важный механизм реализации НМФ-опосредованного адаптивного сигнала заключается в умеренной активации кальциевой ВРС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выяснение роли Са2+-зависимых внутриклеточных процессов в инициации и формировании функциональных и метаболических реакций нейронов коры мозга на гипоксические воздействия в течение многих лет является одной из актуальных проблем нейроби-ологии. Только в 90-х годах ей посвящено несколько крупных обзорных работ (Mayer, Miller 1990; Kluge, 1991; Siesjo, 1994; Choi, 1995; Kristian, Siesjo, 1996, 1997; Костюк, 1997 и др.). Результаты современных исследований позволяют также отвести Са2+-зависимым внутриклеточным процессам ключевую роль в развитии комплекса адаптивных реакций нейронов мозга, инициированных кратковременным гипоксическим стрессом (Самойлов и др., 1994; Самойлов 1995: Самойлов, Мокрушин, 1997,1999 и др.). Полученные нами данные углубляют представления о Са2+-опосредованных механизмах внутриклеточной регуляции и раскрывают их ведущую роль как в патологических, так и адаптивных процессах в нейронах коры мозга, развивающихся вследствие гипоксии различной степени тяжести.

И зучение динамики содержания свободного и связанного внутри клеточного Ca2 f в экспериментах in vivo и in vitro и особенностей изменения биоэлектрических характеристик нейронов (in vivo) во время и после аноксического воздействия различной длительности позволило установить два основных этапа переживания

нейронами углубляющегося состояния аноксии. которые, будучи прерванными реоксигенанией, сопровождаются разни гнем соответствующих принципиально различных постаноксических процессов.

Первый (ранний) этап, занимающий в условиях аноксии in vivo около 2.5 мин, характеризуется определенными компенсаторными реакциями организменного уровня и стереотипной перестройкой биоэлектрической активности нейронов и внутриклеточного кальциевого гомеостаза, которые, очевидно, отражают включение триг-герных механизмов клеточной адаптации. Активация этих механизмов проявляется возникновением непродолжительной вспышки высокочастотной импульсации нейронов, соответствующей мощной синхронизации дельта-подобных осцилляции ЭКоГ, и прогрессирующим высвобождением Са2+ внутриклеточными Са2+-связы-вающими доменами. Это высвобождение приводит к соответствующему умеренному увеличению пула свободного Са2+ в клетках коры. Результаты исследования динамики обмена полифосфоино-зитидов, полученные нами в тех же методических условиях (Тюль-коваидр., 1991,1998), а также ряд данных, характеризующих кинетику обмена Са2+ в срезах мозга при различных моделях гипоксии (Belousovetal., 1995; Kaplinetal., 1996) позволяют считать, что важным внутриклеточным источником Са2' в этот период является опосредованный инозит-три-фосфатом механизм его высвобождения из эндоплазматического ретикулума. Уменьшение содержания Са-с при гипоксии может быть обусловлено также процессом замещения Са2+ в кальций-связывающих макромолекулах ионами водорода (Самойлов, 1985; Peters, 1986). Паши данные показывают, что на раннем этапе аноксии вход Са2'сч через каналы, управляемые NMDA рецепторами, не задействован. Очевидно, обнаруженная модификация активности кальциевой ВРС является пусковым механизмом ряда внутриклеточных Са21-зависимых процессов, которые при своевременном прекращении аноксического воздействия способствуют развитию в постаноксическом периоде приспособительных реакций нейронов мозга.

Реоксигенация, начатая немедленно rio завершении раннего этапа аноксии приводит к быстрой нормализации внутриклеточного кальциевого гомеостаза, вслед за которой постепенно развивалось состояние умеренной активация кальциевой ВРС, проявляющееся в некотором повышении содержания Са2' п, обеспечиваемом

как внутриклеточными, так и NMDA-опосредованным внеклеточным его источниками. При этом, вероятно, задействованы и мета-ботропные глутаматные рецепторы (мГЛУр1,5), о чем косвенно свидетельствует обнаруженное нами в этот период умеренное усиление гидролиза полифосфоинозитидов и появление фосфоинозитид-ного ответа на аппликацию глутамата (Самойлов и др., 1994; Тюль-кова и др., 1998; Семенов и др., 1999). Эксперименты in vivo позволили обнаружить и важные изменения биоэлектрической активности коры мозга после КА, (повышение возбудимости и частоты фоновой импульсации нейронов, характерная фазная динамика синхронизации периодических волн ЭКоГ), которые свидетельствуют о развитии стойкой постаноксической активации нейронов. Это состояние обеспечивается усилением прежде всего глутаматерги-ческой сигнальной трансдукции, что соответствует современным представлениям о механизмах долговременной потенциации биоэлектрической активности нейронов мозга, играющих ключевую роль как в процессах обучения (Bashir et al., 1993; Самойлов и др., 1993; Ben-Ary, Aniksztejn, 1995; Емельянов, Самойлов, 1996; Riedel et al., 1996; Toms, Roberts, 1997; Berridge et al., 1998), так и в формировании адаптивных процессов в мозге, индуцированных кратковременным гипоксическим стрессом. (Hammond et al., 1994; Самойлов, 1995; Самойлов, Мокрушин, 1999).

Второй (поздний) этап аноксии, наступающий в экспериментах in vivo после 2.5 мин, характеризуется подавлением функциональной активности нейронов, развитием метаболических нарушений, граничащих с необратимым повреждением, стремительным снижением артериального давления и нарушением кровоснабжения нейронов. На данном этапе высвобождение Са2+ внутриклеточными секвестрами значительно усиливается. Вместе с тем не удалось обнаружить используемыми методами (микродиализная перфузия, изотопный анализ) массивного входа Са2+ в клетки коры вплоть до 5 мин. В экспериментах на срезах коры поздний этап развития аноксических реакций был прослежен до 10 мин и характеризовался не только мощным снижением содержания Са-с (как и in vivo), но и входом Ca2fcx через NMDA-зависимые кальциевые каналы. Оба эти источника создают значительное повышение внутриклеточной концентрации Са2+, что соответствует классическим представлениям об инициации при тяжелой гипоксии (обычно

ишемии) Са:<-опосредованных повреждений нейронов (Siesjo. Bengtston, 1989: Kluge, 1991; Siesjo, 1994; Szatkowski. Attwell. 1994; Choi, 1995; Костюк, 1997; Be.rridge et al., 1998).

Реоксигенания, предпринятая г-экспериментах in vivo после 5 мин аноксии, способствовала относительно успешному спонтанному восстановлению биоэлектрической активности корковых нейронов и коры мозга в целом, лишь в 45% опытов; в остальных, если оно и происходило, то развивалось медленно и не было полноценным. Существенно пониженный уровень Са-с. индуцированный аноксией, в большинстве случаев сохраняется и при реоксигенации. Реоксигенация после 10 мин аноксии in vitro не устраняет процеса усиленного глутамат-опосредованного входа в клетки Са2+ . Пост-аноксическое накопление свободного Са2+, вызванное этим процессом, лишь в течение первых 20-25 мин реоксигенации сдерживается внутриклеточными буферными механизмами, но, очевидно, из-за их перегрузки (Randall, Thayer, 1992; Choi et al., 1998) на более поздних сроках рост концентрации Са2+.п возобновляется. Вероятно, помимо NMDA-опосредованного механизма существенный вклад в кальциевую перегрузку в период реоксигенации после ДА вносит и активация метаботропных глутаматныхрецепторов (Opitzet al. 1995; Mody, MacDonald, 1995; Riedel et al., 1996). В пользу этого свидетельствует гиперактивация фосфоинозитидной ВРС (Тюлькова и др., 1998), приводящая, очевидно, к избыточной продукции вторичных посредников (инозит-три-фосфата и диацил-глицерола). В данных условиях эти вторичные посредники совместно с высокой концентрацией внутриклеточного Са2+ выступают триггерами последующих каскадов патогенных внутриклеточных процессов (Kirino, 1982; Wicloch et al., 1991; Aronovski et al.,1992; Zhang at al.,1993; Siesjo, 1994; Choi et al.,1998 и др.), приводящих к некротическим иапоптозным необратимым повреждениям нейронов (Olanow, 1993; Bonfocoet al., 1995; Berridgc et al., 1998 и др.). Таким образом, полученные результаты подтверждают представления о центральной роли гиперактивации кальциевой и фосфоинозитидной систем регуляции, атак же глутаматергической сигнальной трансдукции в повреждениях мозга, инициируемых ДА (Самойлов и др., 1997, 1998).

КА in vivo (1.5 мин), использованная в качестве прекондиии-онирующего фактора, защищает корковые нейроны от повреждающего действия последующей ДА (5 мин), способствуя быстрой

нормализации биоэлектрической активности и состояния ВРС. Такой нейропротективный эффектаноксического прекондициони-ронания достигается, однако, лишь при условии полноценного развития долговременной адаптогенной перестройки активности кальциевой и фосфоинозитидной ВРС, которая, в свою очередь, возникает лишь вследствие КА, обладающей гиперактивационным эффектом на нейроны. Не соблюдение этих условий предотвращает нейропротектируюший эффект превентивной КА. При анокси-ческим прекондиционировании срезов мозга установлено, что КА инициирует адаптивную перестройку кальциевой ВРС, вовлекая NMDA-зависимый механизм входа Са2+сх в постаноксическом периоде. При блокировании этого механизма с помощью МК-801 гиперактивация кальциевой ВРС, индуцируемая последующей ДА, не предотвращается.

Исследования in vitro с переносом постаноксического перфуза-та от среза - донора, подвергнутого КА, на срез - реципиент показали, что порция перфузата, собранная на относительно позднем этапе реоксигенации среза-донора и содержащая, очевидно, адапто-генные нейромодуляторные пептиды, синтезируемые и выделяемые им в этот период (Самойлов, Мокрушин, 1996, 1997,1999), оказывала активирующий эффект на кальциевую и фосфоинозитидную ВРС среза-реципиента, подобный тому, который производит непосредственно КА (Семенов и др. 1999). Прекондиционирование среза-репипнента с помощью такого перфузата, как и в модели анокси-ческого прекондиционирования, предотвращало в нем патологическую гиперактивацию ВРС, индуцируемую ДА. Эти данные подтверждают представления о мобилизации вследствие КА процессов долговременной адаптации, включающих экспрессию генома, синтез и секрецию нейромодуляторных пептидов (Самойлов, 1995), распространяющихся по тканям мозга путем межклеточной «объемной» передачи сигналов (Самойлов, Мокрушин, 1996, 1998, 1999) и способных индуцировать и/или модулировать адаптивную мобилизацию внутриклеточных регуляторных систем в целых популяциях нейронов.

Таким образом, кальциевая, как и фосфоинозитидная (Самойлов и др., 1992, 1994; Тюлькова и др., 1997; Семенов и др., 1999) ВРС вовлекаются в формирование как патологических, так и адаптивных состояний коры головного мозга, вызываемых гипоксическими

воздействиями различной степени тяжести. Производимая ими индукция того или другого состояния обусловлена уровнем их активации. Умеренное, но устойчивое повышение активности качьцневоп ифосфоинозитидной ВРС. вызываемое в наших экспериментах фармакологическими (оксиметацил, флунаризин) или немедикаментозными (КА) способами, запускает каскад механизмов внутриклеточной сигнальной трансдукции, очевидно с вовлечением генома, направленных на развитие приспособительных реакций к тяжелым ги-поксическим воздействиям. Согласно результатам настоящего исследования, ведущим триггерным механизмом повышения активности кальциевой ВРС в ответ на кратковременное аноксическое воздействие в коре головного мозга является умеренная стимуляция глу-таматергической сигнальной трансдукции. Однако чрезмерная, вероятно, выходящая из-под контроля ее активация приводит к развитию патологических реакций.

Как нам представляется, к перспективным направлениям дальнейшего изучения молекулярных механизмов приспособительных и патологических состояний нейронов мозга, обусловленных гипоксией, следует отнести:

- изучение роли различных подтипов ионотропных и метабо-тропных глутаматных рецепторов в гипоксических реакциях и разработка эффективных способов воздействия на их активность;

- изучение динамики связывания/высвобождения Са2' различными внутриклеточными кальций-связывающими сайтами и разработка способов управления внутриклеточными рецепторными аппаратами, обеспечивающими активность этих структур;

- изучение роли Са2+-зависимых протеинкиназ и протеаз, участвующих в модуляции активности нейромедиаторных рецепторов и ионных каналов, вовлекаемых в развитие адаптивных и патологических внутриклеточных процессов;

- изучение Са2+-обусловленных механизмов экспрессии генома и синтеза нейромодуляторных пептидов в условиях гипоксических воздействий различной степени тяжести с целью разработки способов управления этими процессами.

выводы

С использованием комплекса методических приемов, включающих оценку динамики содержания внутриклеточного кальция, биоэлектрической активности и других функциональных и метаболических показателей в экспериментах in vivo и in vitro, установлены следующие закономерности участия кальциевой ВРС в реакциях коры головного мозга млекопитающих на гипоксическое воздействие различной степени тяжести:

1. Кальциевая ВРС вовлекается в механизмы формирования как патологических, так и приспособительных реакций нейронов коры головного мозга, вызываемых долго- и кратковременной анокси-ей (ДА и КА). соответственно. Развитие этих реакций обусловлено не только изменениями содержания кальция в клетках за счет усиления его входа из экстраклеточной среды, но и определенной динамикой связывания и высвобождения кальция гидрофобными внутри клеточными доменами.

2. Клетки коры мозга реагируют на аноксическое воздействие быстрой (в течение первых десятков секунд) перестройкой активности кальциевой ВРС, проявляющейся уменьшением содержания кальция, связанного с внутриклеточными гидрофобными доменами и накоплением за счет этого свободных ионов Са2+ в ци-то юле. При этом до 5 минуты аноксии in vivo у кошек не обнаружено усиления входа Са2+сх. Следовательно, инициация кальций-зависимых гипоксических реакций обусловлена механизмами высвобождения Са2+ внутриклеточными кальций-связываюшими макромолекулами. Более длительное аноксическое воздействие (10 мин)- примененное на срезах обонятельной коры мозга крыс, индуцирует на фоне продолжающегося высвобождения Са-с увеличение входа Са2+сч, опосредованного NM DA рецепторами. Следствием этих процессов является значительное накопление в клетках свободного кальция.

3. Определенные этапы аноксического процесса высвобождения Са-с соответствуют фазной динамике функциональной активности коры головного мозга. В экспериментах in vivo на кошках выделены три основные, последовательно сменяющиеся фазы изменения биоэлектрических нейрональных характеристик: дезорганизация (до 60-80 с), гиперактивация (80-100 с), депрессия (после 120-150 с).

4. Реоксигенация после KA (1.5-2.5 мин) i¡ условиях in vivo в первые минуты вызывает относительно быструю нормализацию исходных биоэлектрических характеристик и состояния кальциевой ВРС. Однако, после 15-20 мин возникает умеренное высвобождение Са-с на фоне стойкого возбуждения нейронов и определенной модификации спектра ЭКоГ. В этом состоянии происходит усиление глутаматергической сигнальной трансдукшш. Указанные постаноксические процессы развиваются лишь при условии реализации аноксической фазы гиперактивации нейронов.

5. При реоксигенации, проводимой в условиях in vivo после ДА (5 мин), в большинстве случаев уровень содержания Са-с остается существенно пониженным, что свидетельствует о длительной гиперактивации кальциевой ВРС за счет пролонгированного высвобождения Са-с и/или нарушения механизмов связывания Ca2t с гидрофобными доменами. При этом отмечено существенное подавление импульсной активности нейронов и амплитуды осцилляшш ЭКоГ с преобладающим угнетением дельта-ритма.

6. В экспериментах in vivo на клеточном уровне обнаружены похожие эффекты антиоксидантаоксиметацила и кальциевого антагониста флунаризина, оказывающих протективное действие на функциональное состояние нейронов, подвергаемых ДА. Эти эффекты проявлялись активацией кальциевой ВРС, характеризуемой стойким но умеренным высвобождением Са-с и долговременным повышением частоты импульсной активности нейронов, опосредованным преимущественно глутаматными рецепторами.

7. KA in vivo (1.5 мин), вызывающая сходную с действием окси-метацила и флунаризина модификацию состояния кальциевой ВРС (см. пункт 4), предупреждает производимые последующей (через 60-90 мин) ДА нарушения кальциевой ВРС и биоэлектрической активности нейронов. Таким образом, обнаружен неспецифический характер вовлечения кальциевой ВРС в приспособительные реакции нейронов коры мозга, индуцируемые примененными антиоксидантами или умеренным гипоксическим воздействием.

8. Эксперименты in vitro углубили представления о механизмах адаптирующего действия КА(2 мин) на нейроны коры мозга, показав, что при ее превентивном (прекондиционируюшем) применении блокируется опосредованная NMDA рецепторами «кальциевая перегрузка» нейронов, вызываемая последующей ДА (10 мин).

9. Неиромодуляторные факторы, выделяемые срезами - донорами в период 50-90 мин реоксигенации после КА и апплицирован-ные на срезы-реципиенты. умеренно активируют в них кальциевую ВРС в пнтактном состоянии и предотвращают обусловленное ДА нарушение внутриклеточного кальциевого гомеостаза. Следовательно, механизм формирования приспособительных реакций нейронов к гипоксии, активируемый аноксическим прекондиционированием, включает выработку клетками коры нейромодуляторных факторов, осуществляющих адаптивную модуляцию кальциевой ВРС в популяциях нейронов путем «объемной» передачи сигналов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самойлов М.О., Семенов Д.Г. Прижизненное морфологическое исследование коры больших полушарий мозга. В кн.: Прижизненная микроскопия нейрона. JI. Наука. 58-72. 1978.

2.Дерий А.Н., Иванов К.П., Семенов Д.Г., Константинов С.И. Устройство для крепления головы животных. Бюл. Изобр. N31. 230881. 1981.

3. Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Бодрова J1.В., Майоров В.Н. Применение контактной микроскопии в прижизненных исследованиях мозга. Цитология. 24(1): 119-123. 1982.

4. Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г. Ранние изменения содержания связанного кальция в структурах коры головного мозга, вызванные аноксией. Доклады АН СССР. 274(5): 1271-1273. 1984.

5. Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Майоров В.Н. Динамика содержания связанного кальция в коре головного мозга после прекращения снабжения кислородом. Физиолог, журн. им. И.М. Сеченова. 70(5):601-608. 1984.

6. Samoilov М.О., Semenov D.G., Yarancev N.G., Evdokimov S.A. Sensitivity of "silent" and background-active neurons of the cat cortex to anoxia. Neurosci. Behav. Physiol. 14(4): 307-312. 1984.

7. Lazarewicz J.W., Samoilov M.O., Semenov D.G. Changes of intracellular calcium homeostasis in brain cortex structures during anoxia in vivo and in vitro. Resuscitation. 15: 245-255. 1987.

8. Лазаревич E.B., Самойлов M.O., Семенов Д.Г. Изменение обмена кальция в структурах коры головного мозга при аноксии. Бюл. экпер. биологии и медицины. 3: 261-264. 1988.

9. Семенов Д.Г., Данилов Ю.П. Динамика систолического артериального давления и частоты сердечных сокращений как

показатель функционального состояния животного при аноксии. .¡•Материалы гор. конференции молодых ученых. Ленинград. С.147. 1988.

Ю.Дудкин К.Н.. Кручинин В.К.,Чуева И.В.. Скрыминскпй Ю.В.. Семенов Д.Г., Самойлов М.О. Способ моделирования гипоксии. Бюл. изобретений. 16: 300490. 1990.

11. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О. Влияние окси-метацила на динамику биоэлектрической активности, содержание мембраносвязанного кальция и полифосфоинозитидов в коре головного мозга кошки при аноксии. Материалы Всес. конференции "Физиология и биоэнергетика гипоксии". Минск. С.87.1990.

12. Semenov D.G. Bound calcium content in cerebral cortex and some physiological indications of postanoxic recovery. Mater, of 1-st Congr.of Int.Soc.for Patophysiology. Moskow. P.216. 1991.

13. Семенов Д.Г., Самойлов M.О., Тюлькова Е.И. Вовлечение внутриклеточныхрегуляторных систем в механизмы нейротропного протекторного действия антиоксидантов. Матер. Всес. конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний". Гродно. 3: 475-476. 1991.

14. Тюлькова Е.И., Семенов Д.Г., Самойлов М.О. Влияние аноксии на изменение содержания фосфоинозитидов и биоэлектрическую активность в коре головного мозга кошки. Бюл. эксп. биол. и медицины. 111(10): 239-241. 1991.

15. SamoilovM.O., Semenov D.G.,Tulkova E.I., LazarevviczJ.W. Early postanoxic changes of poliphosphoinositides and bound Ca contents in relation to neuronal activity in brain cortex. Resuscitation. 23: 33-43. 1992.

16. Самойлов M.О., Семенов Д. Г., Тюлькова Е.И., Болехан Е.А. Вовлечение внутриклеточных регуляторных систем в механизм восстановления активности нейронов коры головного мозга после аноксии. Физиолог, журн. им. И.М.Сеченова. 78(6): 11-17. 1992.

17. Самойлов М.,0., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И. Влияние ан-■ тиоксиданта на кальциевый и фосфоинозитидный ответы при активации холинорецепторов в коре головного мозга. Биологические мембраны. 9(10-11): 1109-1110. 1992.

18. Семенов Д.Г., Ермолин С.И. Автоматизация микрофлуори-метрии изменений содержания мембраносвязанного кальция в коре головного мозга кошки. Физиолог, журн. им. И.М. Сеченова 79(9): 114-116.1993.

19. Самойлов М.О., Семенов Д.Г.. Тюлькова Е.И., Болехан Е.А. Влиние краткосрочной аноксии на механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции в коре головного мозга. Физиолог, журн. им. И.М. Сеченова 80(11): 37-43. 1994.

20. Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Болехан Е.А. Молекулярно-клеточные механизмы протектируюшего эффекта краткосрочной аноксии. Физиолог, журн. им. И.М. Сеченова80( 12): 71-75. 1994.

21. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О. Адаптивная перстройка регуляторных систем нейронов коры мозга, вызванная краткосрочной аноксией, модифицирует глутаматную сигнальную трансдукцию. Матер. 1-го Рос. конгр. патофизиол. Москва. 126.1996.

22. Semenov D.G., Ermolin S.I. Synchronous recording of neuronal activity and dynamics of the content of intracellular bound calcium in the cerebral cortex of the cat. Neurosci. and Behav. Physiol. 26:256-258.1996.

23. Semenov D.G. Contact microscopy of brain cortex. Abstr. of Int. Conf. "Contact and confocal microscopic techniques". Warsaw. 24.1996.

24. Semenov D.G., Tyulkova E.I., Samoilov M.O. Intracellular mechanisms of glutaminergic and cholinergic signal transduction in the . cerebral cortex. Neurosci. and Bechav. Physiol. 27: 240-244. 1997.

25. Semenov D.G., Tulkova Е.1., Samoilov M.O. Adaptive effect of neuromodulatory factors released after short-term anoxia on the activity of calcium and phosphoinositide regulatory systems in olfactory cortex slices. Abstr. of Sat. Symp. of33-d Int. Congr. ofPhysiol. Sci. "Molecular and genetic bases of adaptive behavior". SPb. P.54. 1997.

26. Тюлькова Е.И., Семенов Д.Г., Самойлов M.O. Участие кальциевой и фосфоинозитидной систем внутриклеточной регуляции в адаптации нейронов срезов обонятельной коры мозга к гипоксии in vitro. Б юл. эксп. биол. и мед. 125(3): 259-263. 1998.

27. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О..Лазаревич Е.В. Учстие внутриклеточных регуляторных систем в адаптивных эффектах краткосрочной аноксии in vitro. Рос. физиол. журн. . им. И.М. Сеченова. 85(1): 137-145. 1999.

28. Семенов Д.Г. Двухкамерная подвижная инкубационная система для контактной микрофлуориметрии срезов мозга. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 85(8): ll2Y-112f 1999.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Семенов, Дмитрий Германович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Нарушения функций коры мозга при гипоксии.

2.2. Кальциевая внутриклеточная регуляторная система.

2.3. Вовлечение кальциевой внутриклеточной регуляторной системы в молекулярно-клеточные механизмы действия гипоксии.

2.4. Молекулярно-клеточные механизмы адаптации нейронов мозга к гипоксии.

2.5. Фармакологические и немедикаментозные средства коррекции гипоксических состояний,.

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Эксперименты на коре головного мозга in vivo.

3.2. Эксперименты на переживающих срезах коры мозга.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Аноксия in vivo.

4.1.1. Кардиологические и гемодинамические показатели.

4.1.2. Динамика биоэлектрической активности нейронов.

4.1.3. Динамика содержания внутриклеточного связанного кальция.

4.2. реоксигенация in vivo.

4.2.1. Динамика артериального давления.

4.2.2. Реакции на реоксигенацию после кратковременной

1-1.5 мин) аноксии.

4.2.3. Реакции на реоксигенацию после 2.5 мин аноксии.

4.2.3.1. Динамика биоэлектрической активности мозга.

4.2.3.2. Вызванные потенциалы при афферентной стимуляции.

4.2.3.3. Кальциевый ответ на афферентную стимуляцию.

4.2.3.4. Реакции нейронов на аппликацию ацетилхолина и глута-мата.

4.2.3.5. Динамика содержания внутриклеточного связанного Са2+. 158 4.2.4. Реакции на реоксигенацию после 5 мин аноксии.

4.2.4.1. Динамика биоэлектрической активности и состояния Са и

ПФИ ВРС у низкорезистентных животных.

4.2.4.2. Динамика биоэлектрической активности и состояния Са и

ПФИ ВРС у более резистентных животных.

4.3. Вовлечение Са ВРС в механизмы повышения толерантности нейронов коры головного мозга к острой гипоксии.

4.3.1. Эффект оксиметацила.

4.3.2. Эффект флунаризина.

4.3.3. Эффект аноксического прекондиционирования.

4.4. Аноксия и реоксигенация In vitro.

4.4.1. Динамика внутриклеточного кальция, вызванная кратковременной аноксией.

4.4.2. Динамика внутриклеточного кальция, вызванная долговременной аноксией.

4.4.3. Протектирующий эффект аноксического прекондиционирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кальций-зависимые механизмы реакций коры головного мозга на гипоксию"

актуальность

Нарушение энергоснабжения мозга независимо от его формы и ге-неза является ведущим невропатологическим фактором и конечным звеном в причинно-следственной цепи большинства заболеваний, приводящих к смерти. Таким образом, изучение механизмов гипоксичесого повреждения мозга и возможностей его предотвращения неизменно является актуальной задачей нормальной и патологической физиологии.

Несмотря на длительную историю исследований гипоксических состояний мозга лишь в последнее десятилетие появилась реальная возможность вскрытия глубинных молекулярных механизмов гипоксичес-кого повреждения нейронов благодаря бурному развитию исследований на молекулярно-клеточном уровне, базирующихся на современных злек-трофизиологических, нейрохимических, биофизических и генетических методиках. Поэтому исследования воздействия гипоксии на клетки мозга, проведенные с учетом последних достижений молекулярной биологии, приобретают особую актуальность.

Новые методические возможности изучения функций и метаболизма нейронов на молекулярном уровне потребовали применения относительно простых биологических моделей In vitro. В результате нередко возникают трудности, а иногда и противоречия при сопоставлении концепций, развиваемых на базе исследований таких моделей, с классическими представлениями, основанным на многолетних исследованиях мозга в условиях in vivo. В этом плане актуальность настоящей работы заключается еще и в том, что она позволяет сопоставить, а в некоторых разделах и синхронизировать исследования гипоксических реакций на организменном и молекулярно-клеточном уровнях.

В последнее десятилетие огромное внимание исследователей привлекают кальций-зависимые механизмы, действующие в нервной системе на молекулярно-клеточном уровне, которые обеспечивают практически весь спектр сложнейших реакций нервной клетки, связанных с регулящией ее метаболизма, формированием и поддержанием структуры, трансдукцией химических и биоэлектрических сигналов, синаптической пластичностью, формированием элементарных процессов обучения и памяти и многих других. Особое место в этом ряду занимают исследования Ca2+-зависимых механизмов реагирования нейронов мозга на гипоксию (Hansen, 1982; Peters, 1986; Choi, 1988, 1995; Mayer, Miller, 1990; Kluge, 1991; Siesjo, 1981,1994; Slesjo, Bengtsson,1989; Kri-stlan, Slesoo, 1996,1997; Костюк, 1997 и мн. др.). Несмотря на интенсивное изучение этой проблемы, большинство исследователей сосредоточивают свое внимание на патогенных эффектах нарушения кальциевой проницаемости мембран нейронов, вызванных относительно длительным действием гипоксии/ишемии. Вместе с тем, наиболее ранние реакции нейронов на гипоксию, протекающие с вовлечением внутриклеточных пулов связанного кальция (Са-с), и роль этих пулов в механизмах клеточной адаптации и повреждения остаются мало изученными. В этом плане настоящая работа относится к немногочисленным, но актуальным современным исследованиям, показывающим ключевую роль кальциевой системы внутриклеточной регуляции (Ca ВРС) в инициации как патогенных процессов (Самойлов, 1985; Fasolato et al.,1994; Belousov et al., 1995; Kaplln et al., 1996), так и механизмов клеточной адаптации (Самойлов, 1995; Самойлов, Мокрушин, 1999).

Для борьбы с повреждающим действием гипоксии на мозг фармакологами разработан огромный арсенал медикаментозных средств - анти-гипоксантов, обладающих различными специфическими свойствами, повышающими резистентность организма к кислородному голоданию и облегчающими постгипоксическую нормализацию метаболизма и функций. Особое внимание уделяется средствам, препятствующим нарушению го-меостаза Са2+ в нейронах. В связи с этим класс кальциевых антагонистов (блокаторы входа Са2+ и "Са2+ перегрузки", модуляторы Са2+-связывающих белков и др.) интенсивно исследуется и пополняется (СосДГгашй, 1985; 1Раифпег е1 а1.,1985). Одним из ведущих Са2+-опо-средованных механизмов необратимого повреждения нейронов, вызванного гипоксией, является перикисное окисление липидов и свободно-радикальные процессы. Для предупреждения (подавления) этих патологических явлений используют препараты антиоксидативного действия (Жданов и др. ,1989; ВопТосо еЪ а1., 1995 и др.). Замечено, что ан-тигипоксанты, принадлежащие различным классам фармакологических препаратов, нередко обладают единым неспецифическим эффектом на механизмы клеточного адаптогенеза. В некоторых классификациях такие препараты выделяются в отдельную группу антигипоксантов неспецифического нейротропного действия (Лукьянова, 1987). Определение роли ВРС в механизмах этого явления, которые до настоящего времени мало изучены, актуально для разработки новых фармакологических средств и тактики фармакотерапии, повышающей резистентность мозга человека к гипоксии. цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - изучение роли Са2+ в индукции и формировании адаптивных и патологических реакций коры головного мозга, вызванных временным прекращением кислородного снабжения.

Основные задачи исследования:

2. Выявить в этих условиях закономерности изменения активности Са ВРС, характеризуемой динамикой содержания Са-с, и установить их связь с изменениями биоэлектрической активности нейронов.

3. Оценить влияние аноксии различной длительности на Са2+-зави-симые механизмы глутамат- и холинергической сигнальной трансдукции.

4. Провести сравнительное исследование роли Са2+-зависимых механизмов в формировании нейропротектирующего действия гипоксичес-кого стресса (прекондиционирующая аноксия) и представителей разных классов антигипоксантов (оксиметацил, флунаризин).

5. В экспериментах in vitro на срезах обонятельной коры мозга изучить динамику содержания Са-с и свободного внутриклеточного Са2+ во время и после аноксии различной длительности. Оценить вовлечение NMDA рецепторов.в процессы изменения Са2+ гомеостаза в этих условиях.

6. На этой же экспериментальной модели изучить особенности протекции Са ВРС в условиях аноксического прекондиционирования.

7. Исследовать эффекты нейромодуляторных факторов, выделяемых срезом-донором, пережившим кратковременную аноксию, на состояние Са ВРС срезов-реципиентов (интактных и подвергнутых долговременной аноксии). положения, тностш на защиту

1. Кальций-зависимые процессы вовлекаются в приспособительные реакции нейронов мозга на кратковременную аноксию, проявляясь в стойком умеренном повышении активности кальциевой ВРС. Вместе с тем, кальциевые механизмы лежат и в основе повреждающего воздействия долговременной аноксии и выражаются в длительной гиперактивацией ВРС.

2. Инициация сложной цепи реакций на аноксию связана с мобилизацией внутриклеточного связанного кальция. При усилении гипокси-ческого воздействия добавляется фактор резкого повышения проницаемости плазмолеммы для Са2+ех. При реоксигенации после КА и ДА в устойчивое изменение кальциевого гомеостаза вносят вклад как Са-с, так и Са2+ех. Важную роль в этих процессах играет модификация активности глутаматных рецепторов.

3. Аноксические воздействия различной продолжительности вызывают характерные изменения активности Са2+ - зависимых механизмов холин- и глутаматергической сигнальной трансдукции.

4. Протектируюпрй эффект фармакологических средств антигипок-сического действия (антиоксиданты, кальциевые- антагонисты) и пре-кондиционирующей кратковременной аноксии связан с умеренной активацией кальциевой и фосфоинозитидной регуляторных систем. научная новизна.

Впервые в условиях in vivo и in vitro установлена и проанализирована динамика содержания Са-с в коре головного мозга млекопитающих на различных этапах аноксии и в раннем периоде постанокси-ческого восстановления. Использование комплексного методического подхода в экспериментах in situ позволило совместить изучение этих процессов с анализом динамики импульсной активности нейронов коры и сопоставить полученные данные с динамикой ряда функциональных и метаболических показателей органного и организменного уровней, определяемых в тех же экспериментальных условиях.

В этих экспериментах исследовано вызванное КА (до 2.5 мин) явление постаноксической гиперактивации нейронов коры мозга в сопоставлении с динамикой активности кальциевой ВРС. Показано, что в основе постаноксической гиперактивации лежит усиление Са2+-опосредованных процессов глутаматергической сигнальной трансдукции.

Установлена важная роль умеренной активации кальциевой и связанной с ней фосфоинозитидной ВРС в молекулярно-клеточных механизмах антигипоксической протекции коры мозга, инициируемых как неспецифическими антигипоксантами (флунаризин, оксиметацил), так и превентивной КА. Определены оптимальные условия для реализации Са2+ - зависимых реакций клеточного адаптогенеза, индуцируемого указанными нейропротектирующими средствами.

В модельных экспериментах на срезах коры головного мозга впервые проведено параллельное синхронизированное измерение дина

- И мики содержания Са-с и Са2+1п во время и после аноксии различной длительности. Установлено, что КА (2 мин) создает длительную умеренную активацию Са ВРС в постаноксическом периоде, выражающуюся в умеренном повышении содержания внутриклеточного Са2+ как связанного, так и свободного. Важную роль в этой активации играют NMDA рецепторы. В то же время ДА(10 мин) инициирует гиперактивацию ВРС, которая сопровождается мощным NMDA-опосредованным входом Са2+ех во время и после ДА. На самых ранних этапах реоксигенации рост содержания Са2+1п может сдерживаться внутриклеточными системами Са2+ гомеостаза, но после 20-30 мин накопление Са2+1п возобновляется.

В экспериментах in vitro установлен новый факт, свидетельствующий о том, что нейромодуляторные факторы (НМФ), выделяемые после КА срезом-донором в перфузат в период умеренной адаптогенной активации его ВРС, способны вызывать в интактном срезе-реципиенте идентичную активацию. Протектирующий эффект этих факторов, как и самой превентивной КА, проявляется в предотвращении патогенной гиперактивации ВРС в срезе-реципиенте, подвергнутом ДА. теоретическое и практическое значение.

Продемонстрированные в работе закономерности изменения активности Са ВРС и связанная с ними динамика биоэлектрической активности коры мозга животного, подвергнутого аноксии различной длительности, выявляют ключевую роль внутриклеточных Са2+ - зависимых процессов в индукции и формировании широкого спектра реакций нейронов, вызванных нарушением их кислородного снабжения. Эти данные наряду с результатами, раскрывающими Са2+ - зависимые неспецифические механизмы адаптации мозга к гипоксии, инициируемые на молеку-лярно-клеточном уровне фармакологическими и немедикаментозными средствами, вносят вклад в решение крупной научной задачи определения роли внутриклеточного Са2+ и кальций - зависимых процессов в развитии адаптивных и патологических состояний мозга.

Выявленные механизмы и условия реализации протектирующих ан-тигипоксических эффектов исследованных фармакологических препаратов и аноксического прекондиционирования могут найти применение в сфере практической медицины (реаниматология, нейро- и психопатология, травматология, депривационная физиотерапия и др.), в профилактических направлениях спортивной и военной медицины, а также во многих сферах человеческой деятельности, связанных с высокой вероятностью возникновения экстремальных ситуаций, приводящих к гипоксии мозга (подводные и высокогорные работы, авиация, космонавтика, работы в очагах природных и техногенных катастроф и др.).

Развиваемые автором теоретические представления о механизмах реагирования нейронов мозга на кислородное голодание могут найти практическую реализацию в учебных процессах медицинских и биологических высших учебных заведений.

Методические разработки и усовершенствования, описанные в работе, опубликованные и оформленные автором в виде изобретений и рационализаторских предложений, могут найти широкое применение в экспериментальной практике, микрофизиологических и биохимических исследований мозга In vivo и In vitro. апробация работы.

Материалы, представленные в диссертации, были доложены на 13-ом Всесоюзном съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Алма-Ата,1979), 1-ом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); на Всесоюзных и Всероссийских конференциях, симпозиумах: "Аппаратура и методы количественной микроскопии" (Ленинград, 1980), "Применение контактной микроскопии в биологии и медицине" (Москва, 1981), "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990), "Токсикологические проблемы химических катастроф" (Ленинград, 1991), "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), "Антигипоксанты и актопротекторы" (С.-Петербург, 1994), "Молекулярно-клеточные и генетические механизмы адаптивного поведения" (С-Петербург, 1994), "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1997); на международных конгрессах: 10-м и 13-м международных Конгрессах Европейской Нейрологической Ассоциации (Стокгольм, 1986, 1990), 1-ом Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991), 33-м Всемирном Конгрессе физиологических наук (С.-Петербург, 1997); международных конференциях, симпозиумах "Физиологические и биохимические основы активности мозга" (С.-Петербург, 1994), "Контактная и конфокальная микроскопическая техника" (Варшава, 1996), "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (С. - Петербург, 1997), "Экспериментальная и клиническая патофизиология" (Варшава, 1997), "Гипоксия в медицине" (Москва, 1998); на заседаниях отдела нейрохимии Медицинского Исследовательского Центра ПАН (Варшава, 1996, 1997,1998) и отдела физиологии и патологии высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (С.-Петербург, 1999).

- 14 публикации.

По теме диссертации опубликованы 53 научные работы в отечественной и зарубежной печати, среди них глава в коллективной монографии и 2 изобретения. структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографии. Диссертация изложена на 320 страницах печатного текста, иллюстрирована 85 рисунками. Библиография включает 81 русский и 236 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Семенов, Дмитрий Германович

6. ВЫВОДЫ

1. Кальциевая ВРС вовлекается в механизмы формирования как патологических, так и приспособительных реакций нейронов коры головного мозга, вызываемых долго- и кратковременной аноксией (ДА и КА), соответственно. Развитие этих реакций обусловлено не только изменениями содержания кальция в клетках за счет усиления его входа из экстраклеточной среды, но и определенной динамикой связывания и высвобождения кальция гидрофобными внутриклеточными доменами.

2. Клетки коры мозга реагируют на аноксию быстрой (в течение первых десятков секунд) перестройкой активности кальциевой ВРС, проявляющейся уменьшением содержания кальция, связанного внутриклеточными гидрофобными доменами и накоплением за счет этого свободных ионов Са2+ в цитозоле. При этом до 5 мин аноксии in vivo у кошек не обнаружено усиления входа Са2+ех.Следовательно, инициация Са2+-зависимых гипоксических реакций обусловлена механизмами высвобождения Са2+ внутриклеточными кальций-связывающими макромолекулами. Более длительное аноксическое воздействие (10 мин), примененное на срезах обонятельной коры мозга крыс, индуцирует на фоне продолжающегося высвобождения Са-с увеличение входа Са2+ех, опосредованного NMDA рецепторами. Следствием этих процессов является значительное накопление в клетках свободного кальция.

3. Определенные этапы аноксического процесса высвобождения Са-с соответствуют фазной динамике функциональной активности коры головного мозга. В экспериментах in vivo на кошках выделены три основные, последовательно сменяющиеся фазы изменения биоэлектрических нейрональных характеристик: дезорганизация (60-80с), гиперактивация {80-100 с) и депрессия (после 120-150 с).

4. Реоксигенация после КА (1.5-2.5 мин) в условиях in vivo в первые минуты вызывает относительно быструю нормализацию исходных биоэлектрических характеристик и состояния кальциевой ВРС. Однако, после 15-20 мин возникает умеренное высвобождение Са-с на фоне стойкого возбуждения нейронов и определенной модификации спектра ЭКоГ. В этом состоянии, характеризуемом как постаноксическая потен-циация, происходит усиление глутаматергической сигнальной трансдук-ции. Указанные поетаноксические процессы развиваются лишь при условии реализации аноксической фазы гиперактивации нейронов.

5. При реоксигенации, проводимой в условиях in vivo после ДА (5 мин), в большинстве случаев уровень содержания Са-с остается существенно пониженным, что свидетельствует о длительной гиперактивации кальциевой ВРС за счет пролонгированного высвобождения Са-с и/или нарушения механизмов связывания Са2+ гидрофобными доменами. При этом существенно подавляется импульсная активность нейронов и амплитуда осцилляции ЭКоГ с преобладающим угнетением дельта-ритма.

6. В экспериментах in vivo на клеточном уровне обнаружены похожие эффекты антиоксиданта оксиметацила и кальциевого антагониста флунаризина, оказывающих протективное действие на функциональное состояние нейронов, подвергаемых ДА. Эти эффекты проявлялись активацией кальциевой ВРС, характеризуемой стойким, но умеренным высвобождением Са-с и долговременным повышением частоты импульсной активности нейронов, опосредованным преимущественно глутаматными рецепторами.

7. КА in vivo (1.5 мин), вызывающая сходную с действием окси-метацила и флунаризина модификацию состояния кальциевой ВРС (см. п. 4), предупреждала производимые последующей (через 60-90 мин) ДА нарушения кальциевой ВРС и биоэлектрической активности нейронов. Таким образом, обнаружен неспецифический характер вовлечения кальциевой ВРС в приспособительные реакции нейронов коры мозга, индуцируемые примененными антигипоксантами или умеренным гипоксическим воздействием.

8. Эксперименты in vitro углубили представления о механизмах адаптирующего действия КА (2 мин) на нейроны коры мозга, показав, что при ее превентивном (прекондиционирующем) применении блокируется опосредованная NMDA рецепторами кальциевая внутриклеточная "перегрузка", вызываемая последующей ДА (10 мин).

9. Нейромодуляторные факторы, выделяемые срезами-донорами в период 50-90 мин реоксигенации после КА и апплицированные на срезы -реципиенты, умеренно активировали в них кальциевую ВРС в интакт-ном состоянии и предотвращали обусловленное ДА нарушение внутриклеточного кальциевого гомеостаза. Следовательно, механизм формирования приспособительных реакций нейронов на гипоксию, активируемый аноксическим прекондиционированием, включает выработку клетками коры нейромодуляторных факторов, осуществляющих адаптивную модуляцию кальциевой ВРС в популяциях нейронов путем "объемной" передачи сигналов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самойлов М.О., Семенов Д. Г. Прижизненное морфологическое исследование коры больших полушарий мозга. В кн.: Прижизненная микроскопия нейрона. Л. Наука. 58 - 72. 1978.

2. Самойлов М.0., Семенов Д.Г. Исследование нейронов коры мозга в условиях кислородного голодания. Материалы 13-го съезда физиологов. Алма-Ата. С.33. 1979.

3. Дерий А. Н., Иванов К. П., Семенов Д. Г., Константинов С.И.

Устройство для крепления головы животных. Бюл. Изобр. N31. 230881. 1981.

4. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Бодрова Л.В., Майоров В.Н. Применение контактной микроскопии в прижизненных исследованиях мозга. Цитология. 24(1): 119-123. 1982.

5. Евдокимов С.А., Самойлов М. 0., Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г.

Чувствительность молчащих и фоновоактивных нейронов мозга кошки к аноксии. Физиолог, журн. 68(1): 3-9. 1982.

6. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г. Особенности реагирования пирамидных нейронов коры на прекращение кислородного снабжения на фоне воздействия цАМФ. Физиолог, журн. 68(10): 1313-1321. 1982.

7. Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г. Возбуждение нейронов коры при аноксии. Материалы Всес. конференции молодых ученых. Омск. С. 62. 1982.

8. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г. Ранние изменения содержания связанного кальция в структурах коры головного мозга, вызванные аноксией. Доклады АН СССР. 274(5): 1271 - 1273. 1984.

9. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Майоров В.Н. Динамика содержания связанного кальция в коре головного мозга после прекращения снабжения кислородом. Физиолог, журн. 70(5): 601 - 608. 1984.

10. Samoilov М.0., Semenov D.G., Yarancev N.G., Evdokimov S.A. Sensitivity of "silent" and background-active neurons of the cat cortex to anoxia. Neurosci. Behav. Physiol. 14(4): 307312. 1984.

И. Самойлов M. 0., Семенов Д. Г., Яранцев H. Г. Нарушения обмена внутриклеточного кальция в коре мозга, выявленные при аноксии. Материалы Всес. конференции "Физиология мозгового кровообращения". Ереван. 1: С. 40. 1984.

12. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Лазаревич Е.В. Влияние каиновой кислоты на обмен внутриклеточного кальция и окислительновос-становительные процессы в структурах коры мозга. Физиол.журн. 72(7): 874-881. 1986.

13. Samoilov М.0., Semenov D.G.,Lazarewicz J.W. Early reactions of cortical neurons to anoxia and kainate application in vivo and in vitro. Cur. Rep. in Neurology. 9(1): P.37. 1987.

14. Lazarewicz J.W., Samoilov M.0., Semenov D.G. Changes of intracellular calcium homeostasis in brain cortex structures during anoxia in vivo and in vitro. Resuscitation. 15: 245-255. 1987.

15. Самойлов M.0., Семенов Д.Г., Дудкин К.Н. и др. Некоторые молекулярно-клеточные корреляты нарушения интегративной деятельности нейронов коры головного мозга при остром кислородном голодании. В кн.: Интегративная деятельность нейронов М., 108-109. 1988.

16. Лазаревич E.B., Самойлов М.0., Семенов Д.Г. Изменение обмена кальция в структурах коры головного мозга при аноксии. Бюл. экспер. биологии и медицины. 3: 261-264. 1988.

17. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И. Динамика содержания полифосфоинозитидов в корреляции с изменениями импульсной активности нейронов коры головного мозга кошки после нарушения кислородного снабжения. Материалы гор. конференции молодых ученых. Ленинград. С. 112. 1988.

18. Семенов Д.Г., Данилов Ю.П. Динамика систолического артериального давления и частоты сердечных сокращений как показатель функционального состояния животного при аноксии. Материалы гор. конференции молодых ученых. Ленинград. С.147. 1988.

19. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Чернятчик Г.Ю. Влияние кобальта на динамику содержания мембраносвязанного кальция в структурах коры головного мозга. Биофизика. 34(6): 1024 - 1027. 1989.

20. Дудкин К.Н., Кручинин В.К., Чуева И.В., Скрыминский Ю.В., Самойлов М.0., Семенов Д.Г. Способ моделирования гипоксии. Бюл. изобретений. 16: 300490. 1990.

21. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М. 0. Влияние оксиметацила на динамику биоэлектрической активности, содержание мембраносвязанного кальция и полифосфоинозитидов в коре головного мозга кошки при аноксии. Материалы Всес. конференции "Физиология и биоэнергетика гипоксии". Минск. С.87. 1990.

22. Samollov М. 0., Semenov D.G., Tulkova Е.I. Action of antioxidative drugs on electric activity bound calcium level and poli-phosphoinositide content in brain cortex of cat before and after anoxia. Europ. J. Neurosci. Suppl.3. P. 133. 1990.

23. Каменев А.Л., Семенов Д. Г., Самойлов М.0., Сафронов Г.А. Протектирующий нейротропный эффект оксиметацила при остром отравлении фосфаколом. Мат. Всесоюзн. конф. "Актуальные проблемы лекарственной токсикологии". М. 2: 128. 1990.

24. Semenov D.G. Bound calcium content in cerebral cortex and some physiological indications of postanoxic recovery. Mater, of 1-t Congr. of Int.Soc.for Patophysiology. Moskow. P. 216. 1991.

25. Семенов Д. Г., Тюлькова Е. И., БолеханЕ.А., Самойлов М. 0. Влияние аноксического фактора на внутриклеточные системы регуляции нейронов мозга. Матер. Всес. конференции "Токсикологические проблемы химических катастроф". Ленинград. СЛ03. 1991.

26. Самойлов М.0. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И. Вовлечение внутриклеточных регуляторных систем в механизмы нейротропного протекторного действия антиоксидантов. Матер. Всес. конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний". Гродно. 3: 475-476. 1991.

27. Тюлькова Е.И., Семенов Д.Г., Самойлов М.0. Влияние аноксии на изменение содержания фосфоинозитидов и биоэлектрическую активность в коре головного мозга кошки. Бюл. эксп. биол. и мед. 111(10): 239-241. 1991.

28. Каменев А.Л., Сафронов Г.А., Самойлов М. 0., Семенов Д.Г. Влияние оксиметацила на микроциркуляцию и импульсную активность нейронов в коре мозга кошки при остром отравлении фосфаколом. Бюлл. экспер. биологии и медицины. 8: 115-117. 1991.

29. Samoilov M. 0., Semenov D. G., TulkovaE.I., Lazarewicz J. W.

Early postanoxic changes of poliphosphoinositides and bound Ca contents in relation to neuronal activity in brain cortex. Resuscitation. 23: 33-43. 1992.

30. Самойлов М. 0., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Болехан Е.А. Вовлечение внутриклеточных регуляторных систем в механизм восстановления активности нейронов коры головного мозга после аноксии. Физиолог, журн. 78(6): 11-17. 1992.

31. Самойлов 1.0., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И. Влияние антиоксиданта на кальциевый и фосфоинозитидный ответы при активации холи-норецепторов в коре головного мозга. Биологические мембраны. 9(10-11):. 1109-1110. 1992.

32. Семенов Д.Г., Ермолин с.И. Автоматизация микрофлуориметрии изменений содержания мембраносвязанного кальция в коре головного мозга кошки. Физиолог, журн. 79(9): 114-116. 1993.

33. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Болехан Е.А. Влияние краткосрочной аноксии на механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции в коре головного мозга. Физиолог, журн. 80(11): 37-43. 1994.

34. Самойлов М.0. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Болехан Е.А. Молекулярно - клеточные механизмы протектирующего эффекта краткосрочной аноксии. Физиолог, журн. 80(12): 71-75. 1994.

35. Семенов Д.Г., Ермолин С.И. Синхронная регистрация нейрональной активности и динамики содержания внутриклеточного связанного кальция в коре головного мозга кошки. Физиолог, журн. 80(12): 131-134. 1994.

36. Samoilov М.0., Semenov D.G., TulkovaE.I., Bolekhan Е.А. Intracellular mechanisms of adaptive effect of short-term anoxia. Abstr. of Internat. Symp. "Physiological and biochemical basis of brain activity". SPb. P.87. 1994.

37. Самойлов M.0., Сафронов Г.А., Семенов Д.Г., Каменев А.Л.,

Тюлькова Е.И. Участие внутриклеточных регуляторных систем в реакциях нейронов коры головного мозга кошки на фосфокол. Экспер. и клин, фармакол. 57(4): 13-16. 1994.

38. Болехан Е.А., Семенов Д.Г., Герасимова И.А., Самойлов М.0. Использование фенилтиокарбамида для оценки степени цАМФ-зависн-мой резистентности животных к гипоксии. Физиолог, журн. 81(8): 85-89. 1995.

39. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М.0. Внутриклеточные механизмы глутамат- и холинергической сигнальной трансдукции, вовлекаемые в адаптивные реакции коры головного мозга. Физиолог. журн. 81(8): 51-56. 1995.

40. Семенов Д.Г., Тюлькова Е. И., Самойлов М.0. Адаптивная перестройка регуляторных систем нейронов коры мозга, вызванная краткосрочной аноксией, модифицирует глутаматную сигнальную трансдукцию. Матер. 1-го Рос. конгр. по патофизиол. Москва. С.126. 1996.

41. Semenov D. G., ErmollnS.I. Synchronous recording of neuronal activity and dynamics of the content of intracellular bound calcium in the cerebral cortex of the cat. Neurosci. and Behav. Physiol. 26: 256-258. 1996.

42. Semenov D.G. Contact microscopy of brain cortex. Abstr. of

Int. Conf. "Contact and confocal microscopic techniques". Warsaw. P.24. 1996.

43. Semenov D.G., Tyulcova E. I., SamoilovM. 0. Intracellular mechanisms of glutaminergic and cholinergic signal transduction in the cerebral cortex. Neurosci. and Bechav. Physiol. 27: 240-244. 1997.

44. Bolekhan E.A., Semenov D.G., Gerasimova I.A., Samoilov M.0.

Use of phenylthiocarbamide for assesing cAMP-dependent resistance to anoxia in animals. Neurosci. and Behav. Physiol. 27: 268-271. 1997.

45. Samoilov M.0.,Mokrushin A.A.,Semenov D.G.,Tulkova E.I., Bolekhan E.A. Molecular-cellular mechanisms of long-term anoxic potentiation of synaptic transmission. Abstr. of 33-d Int. Congr. of Physiol. Sci. SPb. P075.48. 1997.

46. Semenov D.G., Tulkova E.I., Samoilov M. 0. Adaptive effect of neuromodulatory factors released after short-term anoxia on the activity of calcium and phosphoinositide regulatory systems In olfactory cortex slices. Abstr. of Sat. Symp. of 33-d Int. Congr. of Physiol. Sci. "Molecular and genetic bases of adaptive behavior". SPb. P.54. 1997.

47. Tulkova E.I., Semenov D.G., Samoilov M.0. Participation of intracellular regulatory systems in the adaptive effect of short-term anoxia In vitro. Abstr. of Sat. Symp. of 33-d Int. Congr. of Physiol. Sci. "Molecular and genetic bases of adaptive behavior". SPb. P.64. 1997.

48. Самойлов M.0., Мокрушин A.A., Семенов Д. Г., Тюлькова Е.И., Милякова Е.Ф. Механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции, вовлекаемые в формирование индуцируемых гипоксией адаптивных и патологических состояний мозга. Матер. Всерос. конф. "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". Москва. С.106-107.1997.

49. Тюлькова Е.й., Семенов Д.Г., Самойлов М. 0. Участие кальциевой и фосфоинозитидной систем внутриклеточной регуляции в адаптации нейронов срезов обонятельной коры мозга к гипоксии in vitro. Бюл. эксперим. биол. и медицины. 125(3): 259 - 263. 1998.

50. Самойлов М.0., Мокрушин А.А., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И.,

Милякова Е.А., Герасимова И.А., Романовский Д.Ю. Механизмы развития адаптивных и патологических состояний мозга, индуцированных гипоксией: роль глутаматергической сигнальной трансдукции. Hypoxia Medical Journal. 6(2): 61-62. 1998.

51. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М.0., Лазаревич Е.В.

Участие внутриклеточных регуляторных систем в адаптивных эффектах краткосрочной аноксии in vitro. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 85(1): 137-145. 1999.

52. Семенов Д.Г. Двухкамерная подвижная инкубационная система для контактной микрофлуориметрии срезов мозга. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 85(8): 1Ш-112£. 1999.

53. Semenov D.G., Samoilov М.0., Zielonka P., Lazarewicz J. Responses of Intracellular free and bound Ca2+ in rat cortical slices to reversible anoxia. Resuscitation (in press). 1999.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученный экспериментальный материал разделяется на две основные части. Первая часть, охватывающая разделы 4.1-4.2, включает результаты нескольких серий экспериментов in vivo, главным образом направленных на выяснение динамики биоэлектрической активности и активности внутриклеточных регуляторных систем во время и в течение относительно раннего периода (десятки минут) после аноксичес-кого воздействия различной длительности. Вторая часть, описанная в разделе 4.3, посвящена исследованию механизмов клеточной адаптации к аноксии, мобилизуемых различными фармакологическими средствами или аноксическим прекондиционированием. Кроме этого раздел 4.4 содержит результаты экспериментов, проведенных in vitro с целью углубления представлений о вовлечении механизмов внутриклеточной регуляции в развитие патологических и адаптивных постаноксических процессов на молекулярно-клеточном уровне.

Методология, примененная в проведенном исследовании, позволила в рамках традиционных методических условий in situ в реальном масштабе времени и в динамике измерять некоторые биоэлектрические и метаболические параметры как на организменном, так и на тканевом и молекулярно-клеточном уровнях. Кроме этого она дала возможность впервые исследовать не только очередность и закономерности сменяемости различных стадий в углублении аноксического состояния нейронов, но и выявить динамику различных восстановительных процессов, которые могли быть произвольно "запущены" при включении режима ре-оксигенации на любом из интересующих нас этапов аноксии.

В условиях аноксии были определены два основных этапа переживания нейронов, которые, будучи прерванными реоксигенацией, сопровождались принципиально различными комплексами постаноксических процессов.

Первый (ранний) этап включал компенсаторную перестройку функциональной и метаболической активности нейронов в пределах 1.5 -2.5 мин аноксии. С первых десятков секунд менялся паттерн импульсной активности нейронов, что сопровождалось высвобождением Са2+ из внутриклеточных пулов Са-с. К 60 - 90 с начиналась относительно короткая вспышка генерализованной высокочастотной импульсации (аноксическая гиперактивация). Эксперименты In vitro не показали в этот период входа Са2+ через IMDA-ассоциированные каналы, вместе с тем наблюдалось некоторое повышение концентрации Са2+щ, происходящее вероятно только за счет внутриклеточных источников. На ЭЭГ аноксическая гиперактивация проявлялась в виде мощной синхронизации периодических высокоамплитудных осцилляций (волна дельта-подобной активности). Это явление затем быстро сменялось торможением ИАН и прекращением суммарной активности коры. Выявленная динамика биоэлектрических явлений в мозге, очевидно, должна коррелировать с изменениями многих регуляторных процессов на организменном уровне. Такая связь была установлена для некоторых гемодинамических характеристик (разделы 4.1 и 4.2). В частности, период аноксической гиперактивации совпадал с моментом смены тенденций в динамике систолического артериального давления (переход от фазы его роста к фазе снижения). Прекращение суммарной биоэлектрической активности мозга в интервале 2-2.5 мин аноксии in vivo с высокой точностью соответствовало определенной величине переменной кардиологической характеристики (показатель "Кн или "rate-pressure index"), учитывающей динамику АД и частоты сердечных сокращений.

Если реоксигенацня была начата немедленно по завершении раннего этапа аноксии (т.е. во время или сразу после аноксической гиперактивации), то в постаноксическом периоде после начальной фазы быстрой и практически полной нормализации измеряемых параметров (в пределах первых 15-25 мин) происходили следующие стереотипные процессы. Постепенно развивалась умеренная активация кальциевой системы внутриклеточной регуляции, проявляющаяся в некотором повышении содержания Са2+1п, обеспечиваемом как внутри-, так и внеклеточными его источниками. Активация первого источника определена в экспериментах In vivo как непосредственно наблюдаемое умеренное снижение уровня Са-с, а второго - в экспериментах In vitro как рост содержания Са2+1п и повышение уровня Са-с из-за частичного его связывания (раздел 4.4). Тот факт, что оба эти процесса, зарегистрированные In vitro, не развивались, если аноксия и реоксиге-нация проводились на фоне действия МК-801, свидетельствует об NMDA -опосредованном входе Са2+ех на данном этапе реоксигенации. Вероятно, в активации Са ВРС в этот период задействованы и метаботроп-ные глутаматные рецепторы, ассоциированные с G-белок/ФЛС-опосредо-ванным путем внутриклеточной сигнальной трансдукции (мГЛУр1,5), о чем может свидетельствовать умеренное усиление в этот период гидролиза ТФИ и появление фосфоинозитидного ответа на аппликацию глута-мата, как описано в разделах 4.2 и 4.4 и опубликовано ранее (Самойлов и др.,1994а; Тюлькова и др., 1998; Семенов и др.,1999). Другой важной характеристикой постаноксического состояния нейронов коры служит их повышенная возбудимость и уровень биоэлектрической активности (постаноксическая длительная умеренная гиперактивация). В развитии этого состояния, как показали эксперименты in vivo, участвует усиление глутаматергической сигнальной трансдукции, что соответствует современным представления о ключевой роли активации глутаматных рецепторов в развитии и поддержании состояний долговременной потенциации биоэлектрической активности нейронов мозга как в процессе обучения (Basfrlr et al.,1993; Самойлов и др., 1993; Ben-Ary, Aniksztejn, 1995; Емельянов, Самойлов, 1996; Riedel et al., 1996а; Toms, Roberts, 1997; Berridge et al., 1998), так и в формировании (мобилизации) адаптивных внутриклеточных процессов, инициированных гипоксическим стрессом (Hammond et al., 1994; Самойлов, 1995; Самойлов, Мокрушин, 1997). Ключевым звеном адаптивной перестройки метаболизма и функций нейрона выступает постепенно развивающаяся умеренная и стойкая активация внутриклеточных регуляторных систем, важнейшими механизмами которой является использование клеткой мобильного секвестрированного кальция и HMD А -опосредованного умеренного притока Са2+ех для осуществления многочисленных срочных и долговременных кальций-зависимых модификаций механизмов сигнальной трансдукции. Полученные результаты подтверждают и углубляют современные представления о механизмах адаптации нейронов мозга к гипоксии, развиваемые в нашей лаборатории (Самойлов, 1995; Самойлов, Мокрушин, 1996,1997,1998; Самойлов и др.,1998).

Второй (поздний) этап аноксии, наступающий в экспериментах in vivo после 2.5 мин, характеризовался подавлением функциональной активности нейронов, развитием метаболических нарушений, граничащих с необратимым повреждением, стремительным снижением артериального давления и нарушением кровоснабжения нейронов. На данном этапе значительно усиливалось высвобождение Са2+ из мобильных внутриклеточных секвестров. Вместе с тем не удалось обнаружить используемыми методами (микродиализная перфузия, изотопный анализ) массивного входа Са2+ех в клетки коры вплоть до 5 мин (раздел 4.5). В экспериментах на срезах коры поздний этап развития аноксических реакций был прослежен до 10 мин и характеризовался не только мощным снижением содержания Са-с (как и In vivo), но и NMDA-опосредованным входом Са2+ех, возникающим к 5 мин аноксии и усиливающимся до 10 мин. Оба эти источника создают наблюдаемое в опытах in vitro значительное повышение концентрации Са2+1п (раздел 4.4), что соответствует классическим представлениям об инициации при тяжелой гипоксии (обычно ишемии) Са-опосредованных повреждений нейронов (Si-esjo, Bengtston, 1989; Kluge, 1991; Siesjo,1994; Szatkowski, At-twell, 1994; Chol, 1995; Костюк, 1997; Berridge et al., 1998 и др. обзоры).

Реоксигенация, предпринятая в экспериментах in vivo после 5 мин аноксии, способствовала относительно успешному спонтанному восстановлению биоэлектрической активности корковых нейронов и коры мозга в целом, лишь в 45% опытов; в 55%, если оно и происходило, то развивалось медленно и было далеко не полным (раздел 4.2). Существенно пониженный уровень Са-с, индуцированный аноксией, в большинстве случаев сохранялся и при реоксигенации. Реоксигенация после 10 мин аноксии, производимая в экспериментах in vitro, очевидно не прекращала процесса NMDA-опосредованного притока в клетки Са2+ех. Постаноксический рост содержания Ca2+in, вызванный этим процессом, лишь в течение первых 20-25 мин реоксигенации сдерживался внутриклеточными буферными механизмами, но на более поздних сроках, очевидно из-за их перегрузки (Randall, Thayer, 1992; Choi et al., 1998) возобновлялся рост концентрации Са2+1п. Хотя имеющиеся данные противоречивы, но, вероятно, помимо NMDA-опосредованного механизма определенный вклад в Са2+ перегрузку в период реоксигенации после ДА вносит и активация метаботропных (мГЛУр1,5) глутаматных рецепторов (Opitz et al., 1995; Mody, MacDonald, 1995; Riedel et а!., 1996). В пользу существования этого механизма свидетельствует динамика содержания и скорости обмена ПФИ в этот период, указывающая на усиленный их гидролиз (Тюлькова и др., 1998), что приводит к избыточной продукции вторичных посредников ИФЗ и ДГ. В данных условиях эти вторичные посредники совместно с высокой концентрацией Са2+1п выступают триггерами последующих каскадов патогенных внутриклеточных процессов (К1г1по,1982; №1е1осЬ е! а1.,1991; Агопоуэк! е% а1., 1992; гьащ вХ а1., 1993; 31еБ0'о, 1994; СЗао! еХ а1., 1998 и др.), приводящих к некротическим или апоптотическим необратимым повреждениям нейронов Шашж, 1993; ВопГосо еъ а1., 1995; ВегПс^е et а1., 1998 и др.). Таким образом, результаты этих экспериментов подтверждают представления о центральной роли гиперактивации кальциевой и фосфоинозитидной систем регуляции и глута-матергической сигнальной трансдукции в патологии мозга, инициируемой долговременной аноксией (Самойлов и др., 1997, 1998).

Вместе с тем, в экспериментах с долговременной аноксией 1п ч1чо (5 мин) отмечена значительная индивидуальная вариабильность течения постаноксических процессов. Скорость и степень восстановления биоэлектрической активности нейронов находились в обратной зависимости от степени гиперактивации Са ВРС (см. раздел 4.2: МР и БР группы животных). Исследование причин различной "успешности" восстановительных реакций после 5 мин аноксии не входило в круг наших основных задач. Тем не менее, обсуждение проблемы различной индивидуальной толерантности животных одного вида и пола к гипоксии, проведенное в разделе 4.2, представляется важным для анализа результатов второй части исследований, посвященных использованию экспериментальных приемов повышения толерантности клеток мозга к аноксическому воздействию.

В результате применения фармакологических и немедикаментозных воздействии» различных по специфике своего эффекта, но оказывающих в целом антигипоксическое защитное влияние на организм, были выявлены определенные сходные неспецифические проявления их воздействия на состояние внутриклеточных регуляторных систем и биоэлектрическую активность нейронов в интактных условиях и близкие по своей эффективности протектирующие свойства в отношении нейронов коры, переживших 5 мин аноксию. Были испытаны фармакологические агенты (оксиметацил и флунаризин), механизмы протектирующих эффектов которых не вполне ясны до сих пор» хотя сами эффекты антиоксидантов и кальциевых антагонистов были определены достаточно четко во многих исследованиях гипоксического (обычно ишемического) состояния мозга (Gisvold, Steen, 1985; Van Zwleten, 1986; Лукьянова, 1989; Жданов и др.,1989; Feuerstein et al.,1992; Spedding, Paoletti,1992; Siesjo, 1992; Hunter, 1997 и др.). В разделе 4.3 приводятся доводы о том, что существующие объяснения природы антигипоксического влияния оксиметацила и флунаризина нельзя считать удовлетворительными для интерпретации их эффектов, зарегистрированных в наших экспериментальных условиях. Задача состояла в том, чтобы качественно и количественно охарактеризовать адаптивные сдвиги в состоянии ВРС, которые производят эти агенты. Были определены основные проявления модификации механизмов внутриклеточной сигнальной трансдукции, сходные с теми, которые возникали после КА: умеренная активация Са-высвобождающей функции внутриклеточных мобильных секвестров, вероятно связанная с активацией ПФИ ВРС и изменением внутриклеточного редокс-состояния, и умеренное повышение биоэлектрической активности нейронов, обеспечиваемое прежде всего потенциащей гута-матергической трансдукции. "Умеренность" этих сдвигов характеризуется соответствующими количественными показателями динамики смещений уровня Са-с и повышения частоты ИАН (раздел 4.3). Как правило, эти изменения развивались не моментально после инъекции соответствующих препаратов в отличие от сосудистой реакции. Для достижения указанных стойких сдвигов требовалось 40-60 мин, после чего они стабилизировались в течение не менее 1.5 часов.

Кратковременная аноксия in vivo (1.5 мин), использованная в качестве прекондиционирующего фактора защищала корковые нейроны от повреждающего действия последующей долговременной (5 мин) аноксии при определенных условиях, способствуя, как и фармакологические нейропротекторы, быстрой нормализации биоэлектрической активности и состояния BPG. В экспериментах с аноксическим прекондиционирова-нием более детально исследованы условия, необходимые для реализации нейропротектирующих эффектов. Они заключаются в достижении определенной "пороговой силы" самого адаптирующего воздействия (в данном случае - длительности КА) и определенного латентного периода до предъявления ДА (в данном случае - достаточной длительности реоксигенации после КА). Только при соблюдении этих условий наблюдалось развитие адаптогенной перестройки в активности ВРС, необходимой для полноценного восстановления биоэлектрического статуса нейронов и предотвращения патологической гиперактивации их ВРС в период реоксигенации после ДА. Адаптивное состояние ВРС при реоксигенации после КА не развивалось, если КА была недостаточно длительной, чтобы возникла аноксическая гиперактивация нейронов, выполняющая, очевидно, роль триггера в клеточном адаптогенезе, или если реоксигенационный период между КА и ДА был слишком короток для полноценного развития адаптивной перестройки ВРС (раздел 4.3). В экспериментах in vitro было показано, что КА не способна инициировать адаптивную перестройку кальциевой системы внутриклеточной регуляции в условиях блокады NMDА-опосредованного входа Са2 + в пос-таноксическом периоде (раздел 4.4). В такой ситуации патогенная гиперактивация Са ВРС, индуцируемая последующей ДА, не предотвращалась. Важный результат дали исследования in vitro с переносом постаноксического перфузата от среза-донора, пережившего КА, на срез-реципиент. Обнаружено, что порция перфузата, собранная на относительно позднем этапе реоксигенации среза-донора (60-90 мин) и содержащая, очевидно, адаптогенные нейромодуляторные пептиды, синтезируемые и выделяемые клетками в этот период (Самойлов, Мокрушин, 1996, 1997, 1998), оказывала на кальциевую и фосфоинозитидную регу-ляторные системы среза-реципиента умеренный активирующий эффект, подобный тому, который производит непосредственно КА. Также как и в экспериментах с непосредственным аноксическим прекондиционирова-нием, ДА не вызывала в таких срезах гиперактивации ВРС. Если срез-реципиент инкубировали в донорском перфузате, собранном в более ранний постаноксический период (первые 30 мин), адаптивные процессы в нем не развивались и после воздействия ДА патологическая гиперактивация ВРС не устранялись. Эти данные подтверждают представления о мобилизаций вследствие КА не только кратковременных пластических механизмов адаптивной направленности, но и более фундаментальных процессов долговременной адаптации, включающих экспрессию генома, синтез и секрецию нейромодуляторных пептидов (Самойлов, 1995), распространяющихся по тканям мозга путем межклеточной объемной сигнальной трансдукции (Самойлов, Мокрушин, 1996, 1999) и способных индуцировать и/или модулировать адаптивную мобилизацию внутриклеточных регуляторных систем в целых популяциях нейронов.

Таким образом, результаты настоящей работы позволяют рассматривать адаптивные и патологические явления, развивающиеся в нейронах мозга вследствие аноксического воздействия различной длительности, как процессы, инициируемые на молекулярно-клеточном уровне макросистемой внутриклеточной регуляции, центральную роль в которой выполняет внутриклеточный кальций. По образному выражению М. Бер-риджа "Кальций есть сигнал жизни и смерти и важнейшая задача будущего состоит в том, чтобы понять, как происходит внезапная трансформация первой его функции во вторую" (Вегг^е et а1. 1998). Результаты показали также, что механизм инициации и поддержания адаптивного состояния внутриклеточных регуляторных систем имеет неспецифические черты и по-видимому при определенных условиях может быть активирован различными фармакологическими и немедикаментозными средствами помимо использованных в настоящей работе (НогкЗ е1 а1., 1994; ТотЬаи^Ь. ей а1., 1994). Цитохимическая расшифровка этого механизма только начинается в современных исследованиях, но уже сейчас можно считать, что важным его компонентом, как и в патологических процессах гиперактивации регуляторных систем, является глутаматергическая сигнальная трансдукция.

Материалы настоящей работы и анализ литературных данных позволяют выделить в перспективных исследованиях клеточных механизмов адапто- и патогенеза, индуцированного гипоксическими воздействиями, несколько направлений. Вот только некоторые из них:

1 - изучение рож разжчных подтипов ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов и разработка эффективных способов их регуляции в условиях гипоксических воздействий;

2 - изучение динамики связывания/выявобождения Са2+ разжчными внутриклеточными кальций-связывающими сайтами и разработка спосо

- 272 бов управления внутриклеточными рецепторными аппаратами, обеспечивающими активность этих структур;

3 - изучение роли Са2+-зависимых протеинкиназ и протеаз, участвующих в модуляции активности нейромедиаторных рецепторов и ионных каналов, вовлекаемых в развитие адаптивных и патологических внутриклеточных процессов;

4 - изучение Са2+-обусловленных механизмов экспрессии генома и синтеза нейромодуляторных пептидов в условиях гипоксических воздействий различной степени тяжести с целью разработки способов управления этими процессами.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Семенов, Дмитрий Германович, Санкт-Петербург

1. Антони Г.(Antoni Н.) Функция сердца. В кн.: Физиология человека М. Мир. 3: 44-100. 1986.

2. Ашофф Т. Обзор биологических ритмов. В кн.: Биологические ритмы. М. Мир. 1: С.12. 1984.

3. Болехан Е. А, Семенов Д. Г, Герасимова И. А., Самойлов М. 0. Использование фенилтиокарбамида для оценки степени цАМФ-зави-симой резистентности животных к гипоксии. Физиолог, журн. им. И.М.Сеченова. 81(8): 85-89. 1995.

4. Брумберг Е.М. Флуоресцентная микроскопия биологических объектов при верхнем освещении. Биофизика. 4(4): 471-475. 1959.

5. Брумберг Е.М., Якубенас A.B. Контактная микроскопия в отраженном свете. Оптико-механ. промышл. 12: С.27. 1972.

6. Бурлакова Е.Б., Хохлов Е.П. Изменения структуры и состава ли-пидной фазы биологических мембран при действии синтетических антиоксидантов. Биолог, мембр. 9(6): 557-565. 1985.

7. Вакарица А.Ф., Мышкин В.А, Гизатуллин А. Г. Влияние производных пиримидина и ионола на свободнорадикальное окисление липидов и состояние мембран животных при острых отравлениях. Матер. 4-го Всесоюзн. съезда патофизиологов. М. С.471. 1989.

8. Власова И.Г., Агаджанян Н.А., Лукьянова Л. Д. Влияние некоторых фармакологичесих препаратов на электрическую активность срезов мозжечка в условиях гипоксии. Фармакология и токсикология. 52(1): 12-16. 1989.

9. Власова И.Г., Лукьянова Л.Д. К вопросу о клеточном уровне индивидуальной резистентности. В кн.: Физиология и биоэнергетика гипоксии. Минск. С.40. 1990.

10. Вицлеб Э.(Witzleb Е.) Функция сосудистой системы. В кн.: Физиология человека. М. Мир. 3: 101-190. 1986.

11. Гурвич А.М., Астапенко И.И. Угасание и восстановление функций центральной нервной системы. В кн.: Основы реаниматологии. Ташкент. Медицина. 78-100. 1977.

12. Дерий А. Н., Иванов 0. В., Константинов В. А., Семенов Д.Г. Устройство для крепления головы животных. Авторское свидетельство N 856454. Вюлл.изобр. СССР. N.31. 1981.

13. Дудкин К. Н., Кручинйн В. К., Скрыминский И. В., Чуева И. В. Методы автоматизированных исследований нейронных механизмов поведения. Л. Наука. 1989(а).

14. Дудкин К.Н., Кручинин В.К., Чуева И.В., Самойлов М.О. Влияние кратковременной гипоксии на импульсную активность нейронов зрительной коры обезьян в хроническом эксперименте. Физиол. журн. СССР. 75(7): 1009-1012. 1989(6).

15. Дудкин К.Н., Кручинин В.К., Чуева И.В., Самойлов М.0. Влияние краткосрочной гипоксии на когнитивные процессы и их нейронные корреляты у обезьян. Доклады. Р.А.Н. 333(4): 543-545. 1993.

16. Емельянов Н.А., Самойлов М.0. Молекулярно-клеточные механизмы долговременной потенциации. Успехи физиологических наук. 26(3): 12-30. 1996.

17. Жданов Г.Г., Нечаев В.Н., Нодель М.Л. Свободно-радикальные процессы, гипоксия и применение антигипоксантов в реаниматологии. Анестезиология и реаниматология. 4: 63-68. 1989.

18. Зарубина И.Л., Кулаков А. А., Спитковокая Л.В. Новые оптические системы, используемые для прижизненной микроскопии нейрона. В кн: Прижизненная микроскопия нейрона. Л. Наука. 101-120. 1978.

19. ЗенинаТ.А., Голубева Л.Ю., Салтыкова В.А., Манухина Е.Б., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А. Ф., Малышев И.Ю. NO-зависи-мые механизмы адаптации к гипоксии. Известия РАН. Серия биологическая. 4: 506-512. 1998.

20. Иванов К.П. Основы энергетики организма. Т.2. Биологическое окисление и его обеспечение кислородом. СПб. Наука. 1993.

21. Иванов К.П., Кисляков Ю. Я. Энергетические потребности и кислородное обеспечение головного мозга. Л. Наука. 1979.

22. Коган А.Б. Электрические проявления деятельности коры головного мозга. В кн.: Частная физиология нервной системы. Л. Наука. 605-689. 1983.

23. Колчинская А.3. О классификации гипоксических состояний. Патофи-зиол. и экспер. терапия. 4: 3-10. 1981.

24. Костюк П.Г. Исследования механизмов гомеостаза ионов кальция в нервных клетках и его нарушений при мозговой патологии. Рос-сийск. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 83(5-6): 2-10. 1997.

25. Кузьмина Т.Р., Январева И.Н., Вербианова О.М. О резистентности корковых и гипоталамических нейронов к повторным асфиксиям. Физиол. журн. СССР. 70(4): 411-417. 1984.

26. Кэндел Э.(Kandel Е.) Клеточные основы поведения. М. Мир. 1980.

27. Лазаревич Е.В., Самойлов М.0., Семенов Д.Г. Изменения обмена кальция в структурах коры головного мозга при аноксии. Бюл. эксп. биол. и мед. 3: 261-264. 1988.

28. Лукьянова Л.Д. Биологические механизмы формирования гипоксичес-ких состояний и подходы к их фармакологической коррекции. В кн.: Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. М. 11-44. 1989.

29. Лукьянова Л.Д., Власова И.Г. Энергетический механизм фазных изменений спонтанной электрической активности нейронов при гипоксии. Бюлл. экспер. биол и мед. 9: 266-269. 1989.

30. Мищенко В.А., Горюхина O.A. Структура, проницаемость ГЭБ и перспективы доставки через него лекарственных средств. Журн. неврологии и психиатр. 96(4): 116-120. 1996.

31. Митюшов М.И., Емельянов Н.А., Мокрушин А.А., Войнер И.А., Багаева Т.Р. Переживающий срез мозга как объект нейрофизиологического и нейрохимического исследования. Л. Наука. 1986.

32. Мышкин В.А., Ерохина А.И., Бикбулатов Н.Т., Вакарица А.Ф. Анти-оксиданты и вопросы резистентности организма к экстремальным воздействиям. В кн.: Труды Башкирского мед. ин-та "Токсикология и фармакология антиоксидантов". Уфа. 30-31. 1983.

33. Павлова М.Б. Сравнительное изучение вкусовой чувствительности к фенилтиокарбамиду у крыс, различающихся по порогу возбудимости нервной системы. Журнал ВНД. 47(1): 123-129. 1997.

34. Пастушенков Л.В. Основные методы оценки протекторного действия антигипоксантов в эксперименте и особенности их влияния на обменные процессы в клетке. В кн.: Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. М. 118-124. 1989.

35. Поленов С.А. Гипоксия и гиперокеия. В кн.: Физиология кровообращения. Регуляция кровообращения. Л. Наука. 384-397. 1988.

36. Поткевская В.И. Лечебно-профилактическое применение гипоксии. Клин. мед. 69: 11-15. 1991.

37. Прайор П.Ф.(Prior P.F.) Электроэнцефалограмма при острой аноксии мозга. М. Медицина. 1979.

38. Ройтбак А. И. Вызванные потенциалы коры больших полушарий.В кн.: Современные проблемы электрофизиологических исследований нервной системы. М. Медицина. 1964.

39. Савватеева Е.В. Генетический контроль систем вторичных посредников и их роль в обучении. Успехи современной генетики. 17: 33-99. 1991.

40. Самойлов М.0. Методика морфологической идентификации отдельных нейронов мозга в прижизненном состоянии и после фиксации. Цитология. 17: 1109-1112. 1975.

41. Самойлов М.0. Реакции нейронов мозга на гипоксию. Л. Наука. 1985.

42. Самойлов М.0. Роль кальция в механизмах холинергической и глу-таматергической сигнальной трансдукции в центральной нервной системе. Журн. зволюцион. биохимии и физиолог. 28(2): 156-169. 1992.

43. Самойлов М.0. Базисные молекулярно-клеточные механизмы адаптивных реакций мозга. Физиолог, журн. им. И.М.Сеченова. 81(8): 3-11. 1995.

44. Самойлов М.0., Емельянов Н.А., Никитин В.П., Мокрушин А.А. Современное состояние проблемы молекулярно-клеточных механизмов обучения. Физиол.журн. им. И.М.Сеченова. 79(5): 89-97. 1993.

45. Самойлов М.0., Мокрушин А.А. Молекулярно-клеточные механизмы "объемной" передачи информации в мозге. Труды научн. совета РАМН по экспер. и прикл. физиологии. Нейрохим. механизмы ин-теграт. деятельн. нервной системы. М. Е.6: 12-31. 1996.

46. Самойлов М.0., Мокрушин А.А. Пептидная модуляция синаптической пластичности, индуцируемая аноксией. Докл. РАН. 357(4): 565567. 1997.

47. Самойлов М. 0., Мокрушин A.A. Роль эндогенных нейромодуляторных пептидов в повышении функциональной толерантности нейронов мозга к аноксии. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 125(5): 163-167. 1998.

48. Самойлов М.0., Мокрушин A.A. Роль объемной передачи адаптоген-ных сигналов в формировании приспособительных реакций мозга. Российский физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 85(1): 4-20. 1999.

49. Самойлов М.0,, Семенов Д.Г. Прижизненное микроскопическое изучение коры больших полушарий головного мозга. В кн: Прижизненная микроскопия нейрона. Л. Наука. 1978.

50. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Дерий А.Н. Динамика состояния ре-доке систем структурных элементов коры мозга при кислородном голодании. Докл. АН СССР. 255(3): 766-768. 1980.

51. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Евдокимов С.А. К механизму реагирования нейронов коры мозга на прекращение их кровоснабжения. В кн.: Механизмы реагирования нейронов на раздражающие воздействия. Л. Наука. 128-148. 1981.

52. Самойлов М. 0., Семенов Д. Г., Яранцев Н. Г., Евдокимов С.А. Чувствительность молчащих и фоновоактивных нейронов коры мозга кошки к аноксии. Физиол. журн. СССР. 68(1): 3-8. 1982.

53. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Майоров В.Н. Динамика содержания связанного кальция в коре головного мозга после прекращенияснабжения кислородом. Физиолог, журн. СССР 70(5): 601-608. 1984(а).

54. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г. Ранние изменения содержания связанного кальция в структурах коры головного мозга, вызванные аноксией. Докл. АН СССР. 274(5): 1271-1273. 1984(6).

55. Самойлов М.0., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И. Влияние антиокси-данта на кальциевый и фосфоинозитидный ответы при активации холинорецепторов в коре головного мозга. Биолог, мембраны. 9(10-11): 1109-1110. 1992(а).

56. Самойлов М. 0., Семенов Д. Г., Тюлькова Е. И., Болехан Е. А. Вовлечение внутриклеточных регуляторных систем в механизмы восстановления активности нейронов коры головного мозга после аноксии. Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 78(6): И 17. 1992(6).

57. Самойлов М. 0., Семенов Д. Г., Тюлькова Е. И., Болехан Е. А. Влияние краткосрочной аноксии на механизмы внутриклеточных регуляторных систем в коре головного мозга кошки. Физиолог, журн. им. И.М.Сеченова. 80(11): 37-43. 1994(а).

58. Самойлов М. 0., Семенов Д. Г., Тюлькова Е. И., Болехан Е. А. Молекулярно-клеточные механизмы протектирующего эффекта краткосрочной аноксии. Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 80(12): 71-75. 1994(6).

59. Семенов Д.Г. Мембранный потенциал переживающих нейронов коры мозга. Физиолог, журн. СССР. 64(3): 410-413. 1978.

60. Семенов Д.Г. Двухкамерная подвижная инкубационная система для контактной микрофлуориметрии срезов мозга. Российск. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 85(8): 1117-1121. 1999.

61. Семенов Д.Г., Яранцев Н.Г. Возбуждение нейронов коры мозга при аноксии. Матер. Всес. конф. мол. ученых. Омск. С.62. 1982.

62. Семенов Д.Г., Данилов Ю.П. Динамика систолического артериального давления и частоты сердечных сокращений как показатель функционального состояния животного при аноксии. Материалы гор. конф. мол. ученых. Л. С.147. 1988.

63. Семенов Д.Г., Ермолин С.И. Автоматизация микрофлуориметрии изменений содержания мембраносвязанного кальция в коре головного мозга кошки. Физиолог, журн. им. И.М.Сеченова. 79(9): 114116. 1993.

64. Семенов Д.Г., Ермолин С.И. Синхронная регистрация нейронной активности и динамики содержания внутриклеточного связанного кальция в коре головного мозг кошки. Физиолог, журн. им. И.М.Сеченова. 80(12): 131-134. 1994.

65. Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Самойлов М.0. Внутриклеточные механизмы опосредования глутамат- и холинергической сигнальной трансдукции коры головного мозга. Физиол. журн. им. И.М.Сеченова 81(8): 51-55. 1995.

66. Семенов Д.Г., Тюлькова Е. И., Самойлов М.0., Лазаревич Е.В. Участие внутриклеточных регуляторных систем в адаптивных эффектах краткосрочной аноксии in vitro. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 85(1): 137-145. 1999.

67. Соколов Е.И. Архитектура рефлекторной дуги. Журн. высш. нервн. деят. 42(6): 1064-1074. 1992.

68. Тюлькова Е.И., Семенов Д.Г., Самойлов М.0. Влияние аноксии на изменение содержания фосфоинозитидов и биоэлектрическую активность в коре головного мозга кошки. Бюл.эксп. биол. и мед. 111: 239-241. 1991.

69. Тюлькова Е.И., Следков А.Ю. Изменение полифосфоинозитидного ответа, вызванного различными нейромедиаторами после воздействия гелиокислородной среды под повышенным давлением. Физи-ол. журн. СССР. 78(3): 73-77. 1992.

70. Тюлькова Е.И., Семенов Д.Г., Самойлов М.О. Участие кальциевой и фосфоинозитидной систем внутриклеточной регуляции в адаптации нейронов срезов обонятельной коры мозга к гипоксии in vitro. Бюл. эксп. биол. и мед. 125(3): 259-263. 1998.

71. Хватова Е.М., Мартынов Н.В. Метаболизм острой гипоксии. Горький. 1977.

72. Хватова Е.М., Шуматова Е.Н., Семенова Т.С., Якобсон Л.И. Энергетические аспекты метаболической адаптации к кислородной недостаточности головного мозга. В кн.: Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний. Горький. 41-47. 1989.

73. Хочачка П., Сомеро Д. Биохимическая адаптация. М. Мир. 1988.

74. Храпова Н.Г. О взаимозаменяемости природных и синтетических ан-тиоксидантов. В кн.: Биоокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М. Наука. 59-73. 1982.

75. Чернобаева Г.Н., Лукьянова Л.Д. Роль индивидуальной резистентности к гипоксическому фактору при поиске антиоксидантов и оценке эффективности их действия. В кн.: Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. М. 160-164. 1989.

76. Якубенас А.В., Брумберг Е.М. Флуоресцентно абсорбционная контактная микроскопия. Оптико-мех. пром. 5: С.37. 1971.

77. Январева И.Н., Кузьмина Т.Р. О различной резистентности нейронов головного мозга к гипоксии. В кн.: Специальная и клиническая физиология гипоксических состояний. Киев. Наукова Думка. i9-24. i979.

78. Январева И. Н., Кузьмина Т.Р., Вербианова О.М. Участие нейронов различных отделов гипоталамуса в реакции организма на гипоксию. ФИЗИОЛОГ, журн. СССР. 70(6): 747-752. 1984.* *

79. Abe Н. Nowak Jr. Т. S. Gene expression and induced ischemic tolerance following brief insults. Acta Neurobiol. Exper. 56: 3-8. 1996.

80. Adams D. J., Takeda K., Umbach J.A. Inhibitors of calcium buffering depress evoked transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol.(Lond.). 369: 145-159. 1985.

81. Agnati L., Bjelke B., Fuxe K. Volume transmission in the brain. Amer. Sci. 80(4): 362-373. 1992.

82. Aitken P.G., Jing J., Young J., Somjen G.G. Ion channel involvement in hypoxia-induced spreading depression in hippocampal slices. Brain Res. 541: 7-11. 1991.

83. Aizenman E., Lipton S.A., Loring R.H. Selective modulation of NMDA receptors by reduction and oxydation. Neuron. 2: 257-263. 1989.

84. Allbritton N. L., Meyer Т., Streyer L. Range of messenger action of calcium ion and inositol 1,4,5-trisphosphate. Science.258: 1812-1815. 1992.

85. Alema S. Calcium and brain proteins. Metal Ions Biol. Syst. 17: 275-317. 1984.

86. Andressen C., Blumcke I., Cello M.R. Calcium-binding proteins: selective markers of nerve cells. Cell Tissue Res. 271: 181208. 1993.

87. Arenas M.J., Morris R.G., Wyllie A.H. Apoptosis the role of the endonuclease. Am. J. Pathol. 136: 593-608. 1990.

88. Aronowski J., Grotta J.C., Waxham M.N. Ischemia-induced trans-locatoin of Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II: potential role in neuronal damage. J. Neurochem. 58: 593-608. 1992.

89. Ashton D., Reid K., Willems R., Wanquier A. NMDA and hypoxia induced Ca2+ changes in the CA1 region of the hippocampal slice. Brain Res. 385: 185-188. 1986.

90. Astrup J.,Siesjo B.K. ,Symar L. Thresholds in cerebral ischemia the ischemic penumbra. Stroke. 12: 723-725. 1981.

91. Balestrino M., Somjen G.G. Chlorpromazine protects brain tissue in hypoxia by delaying spreading depression-mediated calcium influx. Brain Res. 385: 219-226. 1986.

92. Bashir Z.I., Bortolotto Z.A., Davies C., Berretta N., Irving A., et al. The synaptic activation of glutamate metabotropic receptors is necessary for the induction of LTP in the hippo-kampus. Nature. 363: 347-350. 1993.

93. Bazan N.G., Deturco E.B. R., Allan G. Mediators of injury in ne-urotrauma -intracellular signal-transduction and gene expression. J. Neurotrauma. 12(5): 791-814. 1995.

94. Beck T., Nuglisch J., Sauer D., Bielenberg G.W. Effects of flu-narizine on postischemic blood flow, energy metabolism andneuronal damage In the rat brain. Eur. J. Pharmacol. 158: 271-274. 1988.

95. Belousov A.B., Godfraind J.M., Krnjevic K. Internal Ca2+ stores involved in anoxic responses of rat hipocampal neurons. J.Physiol. 486(3): 547-556. 1995.

96. Ben-Ary Y., Aniksztejn L. Role of glutamate metabotroplc receptors in long-term potentiation in the hippokampus. Seminars In Neurosci. 7: 127-132. 1995.

97. Benrabh A., Lefauconnler J.M. Glutamate is transported across the rat blood-brain barrier by a sodium-independent system. Neurusci. Lett. 210: 9-12. 1996.

98. Benveniste H., Drejer J., Schousboe A., Diemer N.H. Elevation of extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral iscemia monitored by intracellular microdialysis. J. Neuruchem. 43: 1369-1374. 1984.

99. Benveniste H., Jorgensen M.B., Diemer N.H., Hansen A.J. Calcium accumulation by glutamate activation is involved in hippocam-pal cell damage after ischemia. Acta Neurul. Scand. 78: 529536. 1988.

100. Berridge M.J. Regulation of ion channels by inositol triphosphate and diacylglicerol. J. Experiment. Biol. 126: 333-335. 1986.

101. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361: 315-325. 1993.

102. Berridge M.J., Irvine R.F. Inositol trisphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction. Nature. 312: 315-321. 1984.

103. Berridge M.J., Bootman M. D., Lipp P. Calcium a life and death signal. Nature. 395: 645-648. 1998.

104. Bickler P., Litt L., Severinghaus J. Effects of acetazolamide on cerebrocortical NADH and blood volume. J. Appl. Physiol. 65: 428-433. 1988.

105. Bickler P.E., Gaiiego S.M., Hansen B.M. Developmental changes in intracellular calcium regulation in rat cerebral cortex during hypoxia. J. Cereb.Blood Flow Metab. 13(5): 811-819.1993.

106. Bickler P.E., Hansen B.M. Causes of calcium accumulation in rat cortical brain slices during hypoxia and ischemia: role of ion changes and membrane damage.Brain Res. 665: 269-276. 1994.

107. Bickler P.E., Hansen B.M. Adrenergic agonists reduce glutamate release and glutamate receptor-mediated calcium changes in hippokampal slices during hypoxia. Neuropharmac. 35(6): 679687. 1996.

108. Binnie C.D., de Beukelaar F., Meijer J.W.A., Overweg M.J. et al. Open dose ranging trial of flunarizine as add on therapy in epilepsy. Epilepsia. 26: 424-428. 1985.

109. Blaustein M. Calcium transport and buffering in neurons. Trends in Neuroscience. 11: 438-443. 1988.

110. Borgstrom L., Johannsson H., Siesjo B.K. The relationship between arterial p02 and cerebral blood flow in hypoxic hypoxia. Acta Physiol. Scand. 93: 423-432. 1975.

111. Bosley T.M., Woodhams P.L., Gordon R. D., Balazs R. Effect of anoxia on the stimulated release of amino acid neurotransmitters in the cerebellum in vitro. J.Neurochem. 40:189-201.1983

112. Bradbury M.W.B. The blood brain barrier. Exp. Physiol. 78(4): 453-472. 1993.

113. Brierly J.B., Meldrum B.S., Brown A.W. The threshold and neuropathology of cerebral "anoxic-ischemic" cell changes. Arch, of Neurology. 29: 367-374. 1973.

114. Campbell I.e., Abdulla E.M. In vitro systems for the investigation of calcium homeostasis and calcium-Induced cell damage. In: Neurotoxicology: approaches and methods (Eds. L.W.Chang and W. Slikker). Acad. Press. San Diego.595-602. 1995.

115. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis. Annu. Rev.Biochem. 56: 395-433. 1987.

116. CarewT.J., SahleyC.L. Invertebrate learning and memory: from behavior to molecules. Ann. Rev. Neurosci. 9: 435-487. 1986.

117. Carvalho C.A.M. Chlorotetracyclin as an indicator of the interaction of calcium with brain mrmbrane fractions. J.Neurochem. 30: 1149-1155. 1978.

118. Carvalho A.P. Calcium in the nerve cell. In: Handbook of Neuro-chem. London.1: 69-116. 1982&

119. Caspers H., Spekmann E. J., Lehmenkuhler A. DC potentials of the cerebral cortex. Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol. 106: 127-178. 1987.

120. Caswell A.H. The migration of divalrnt cations in mitochondria visualized by a fluorescent helate probe. J. Membrane Biol. 7(4): 345-364. 1972.

121. Caswell H.H. Methods of measuring intracellular calcium. Int. Rev. of citology. 56: 145-181. 1979.

122. Caswell A.H., Hutchison J.D. Selectivity of cation helation to tetracyclines: Evidence for special conformation of calcium chelate. Biochem. and Biophys. Res. Communs. 43(3): 625-630. 1971.

123. Chen Ch.-K., Silverstein F.S., Fisher S.K. et al. Perinatal hy-poxic-ishemic brain injury enhances quisqualic acid stimulated phosphoinositide turnover. J.of Neurochem. 51: 353-359. 1988.

124. Choi D.V. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron. 1: 623-634. 1982.

125. Choi D.V. Calcium-mediated neurotoxicity: relation to specific channel types and role in ischemic damage. Trends Neurosci. 11: 465-469. 1988(b).

126. Choi D.V. Calcium and excitotoxic neuronal injury. Ann. New. York Acad. Sci. 747: 162-171. 1994.

127. Choi D.V. Calcium: still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death. Trends Neurosci. 18: 58-60. 1995.

128. Choi D.V., Lobner D., Dugan L.L. Glutamate receptor-mediated neuronal death in the ischemic brain. In: Ischemic stroke: from basic mechanisms to new drug development. Monogr. Clin. Neurosci. Basel, Karger. 16: 2-13. 1998.

129. Clark W.M., Madden K.P., Zivln J.A. The lack of effect of fluna-rizine on preserving neurological deficit after experimental stroke. Soc. Neurosci. Ab. 16: 935. 1990.

130. Cohen M.M. Biochemistry of cerebral anoxia, hypoxia and ischemia. Monogr. Neurol. Sci. 1: 1-49. 1973.

131. Collewijn H. Van Harreveld A. Membrane potential of cerebral cortical cells during spreading depression and asphyxia. Exp. Neurol. 15: 425-436. 1966.

132. Crain B.J., Westerkam W.D., Harrison A.H., Nadler J.V. Selective neuronal deth after transient forebrain ischemia in the Mongolian gerbil: a silver impregnation study. Neurosci. 27: 387402. 1988.

133. Czeh G., Somjen G.G. Hypohic failure of synaptic transmission in the isolated spinal cord, and the effects of divalent cations. Brain Res. 527: 224-233. 1990

134. Dahl N. A., Balfour W.M. Prolonged anoxic survival due to anoxia pre-exposure: brain ATP, lactate and pyruvate. Amer. J.Physiol. 207: 452-456. 1964.

135. Dalkara T., Sofuoglu M., Onur R. Glutamate without GABA antagonists induces synchronized discharges in intact hippocampus via NMDA receptors. Brain Res. 498(1): 123-130. 1989.

136. Dalkara T., Moscow!tz M.A. The complex role of nitric oxide in the pathophysiology of focal cerebral ischemia. Brain Pathol. 4: 49-57. 1994.

137. De Rick M., Van Reempts J., Borgers M., Wauquier A., Janssen P. Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats. Stroke. 20: 1383-1390. 1989.

138. Domanska-Janek K., Zalewska T. Effect of brain ischemia on protein kinase C. J. Neurochem. 58: 1432-1439. 1992.

139. DrewesL.R., GilboeD.D., BetzA.L. Metabolic alterations in brain during anoxia and subsequent recovery. Arch. Neurol. 29: 385-390. 1979.

140. Duchen M.R. Effect of metabolic inhibition on the membrane properties of isolated mouse primary sensory neurons. J. Physiol. (Lond.). 426: 387-409. 1990.

141. Duffy S., MacVicar B.A. In vitro ischemia promotes calcium influx and intracellular calcium release in hippocampal astrocytes. The J. of Neuroscience. 16(1): 71-81. i996.

142. Dumermuth G., Molinari L. Spectral analysis of EEG bakground activity. In: Handbook of electroencephalography and clinical neurophysiology. Ed. by Gevins A.S., Remond A. Elsevier. Ams-terdam-N.Y.-Oxford. 1: 85-130. 1987.

143. DuxE., Schubert P., Kreutzberg G.W. Ultras true tural localization of calcium in ischemic hippocampal slices: the influence of adenosine and theophylline. J. Cereb.Blood Flow Metab. 12: 520-524. 1992.

144. Erecinska M., Nelson D., Wilson D., Silver I. Neurotransmitter amino acids in the CNS: Regional changes in amino acid level in rat brain during ischemia and reperfusion. Brain Res. 304: 9-22. 1984.

145. Fasolato C., Innocenti B., Pozzan T. Receptor activated Ca2+ influx: how many mechanisms for how many channels? Trends Pharmacol. Sci. 15: 77-83. 1994.

146. Feuerstein G.S., Hunter A.J., Barone F. Calcium channel blockers and neuroprotection. In: Emerging strategies in neuroprotection. Birkhauser. 129-150. 1992.

147. Fisher S.K., Agranoff B.W. Receptor activation and inositol lipid hydrolysis In neuronal tissues. J. of Neurochem. 48: 999-1017. 1987.

148. Folbergova J., Minamisawa H., Ekholm A., Siesjo B.K. Phosphorylase A and labile metabolites during anoxia: correlation to membrane fluxes of K+ and Ca2+. J. Neurochem. 55: 1690-1696. 1990.

149. Fujiwara N., Higashi H., Shimoji K., Yoshimura M. Effects of hypoxia on rat hippocampal neurons in vitro. J. Physiol (Lond.). 384: 131-151. 1987.

150. Furukawa K., Yamana K., Kogure K. Postischemic alterations of spontaneous activityes in rat hippocampal CA1 neurons. Brain Res. 530: 257-260. 1990.

151. Gage A. T., Stanton P.K. Hypoxia triggers neuroprotective alterations in hippocampal gene expression via a heme-containing sensor. Brain Research. 719: 172-178. 1996.

152. Gall C.M., Lauterborn J.C. Activity-dependent neuronal gene expression: a potential memory mechanisms? Memory: organisation and locus of change. N.Y. Oxford. 301-329. 1991.

153. Gisvold S.E., Steen P.A. Drug therapy in brain ischaemia. Brit. J. Anaesth. 57: 96-109. 1985.

154. Gleitz J., Belle A., Khan S. et al. Anaerobic glycolysis and postanoxic recovery of respiration of rat cortical synaptoso-mes are reduced by synaptosomal sdium load. Brain Res. 611: 286-294. 1993.

155. Glotzner F. Intracellular Potentiale, EEG und cortleale Gleichspannung an der sensomotorischen Rinde der Katze bei akuter Hypoxie. Arch. Psychiat. Nervenkr. 210: 274-296. 1967.

156. Goldberg M.P., Chol D.W. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury. J. of Neurosci. 13:3510-3524. 1993.

157. Goldberg M.P., Monyer M., Weiss J.H., Choi D.W. Adenosin reduces cortical neuronal injury induced by oxygen or glucose deprivation in vitro. Neurosci. Let. 89: 323-327. 1988.

158. Gozlan H., Khazipov R., Ben-Ari Y. Multiple forms of long-term potentiation ana multiple regulatory sites of N-methil-D-as-partate receptors role of the redox site. J. of Neurobiol. 26(3): 360-369. 1995.

159. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J.Biol.Chem. 260: 3440-3450. 1985.

160. Haddad G. G., Donnelly D.F. 02 deprivation induces a major depolarization in brain stem neurons in the adult but not In the neonatal rat. J. Physiol. (Lond.). 429: 411-428. 1990.

161. Hagberg H., Lehmann A., Sandberg M., Nystrom B., Jacobson I., Hamberger A. Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments. J. Cereb. Blood Flow Metab. 5: 413-419. 1985.

162. Halberg F.,Cornellis G. More on chronomes: circaseptans and cir-casemiseptans In Marburg, Germany and 47 other locatios. Chronobiol. 20(1-2): 119. 1993.

163. Hammond C., Crepel V., Gozlan H., Ben-Ari Y. Anoxic LTP sheds light on the multiple facets of NMDA receptors. Trends in

164. Neurol. Sciences. 17: 497-502. 1994.

165. Hansen A.J. Effect of anoxia on ion distribution in the brain. Physiol. Rev. 65: 101-148. 1985.

166. Hansen A.J., Hansgaard J.,Jansen H. Anoxia increases Potassium conductance in hippocampal nerve cells. Acta Physiol. Scand. 115: 3ui-3i0. 1982.

167. Hauptman M., Nelson D., Wilson D., Erecinska M. Neurotransmitter amino acids in CNS: Some changes in amino acid levels in rat brain synaptosomes during and after in vitro anoxia and simulated ischemia. Brain Res. 304: 23-35. 1984.

168. Hershkowitz N., Katchman A.N., Veredge S. Site of synaptic depression during hypoxia: a patch-clamp analysis. J. of Neurophysiology. 69(2): 432-441. 1993.

169. Hertz L., Schousboe A. Ion and energy metabolism of the brain at the cellular level. Inter. Rev. Neurobiol. 18: 141-211. 1975.

170. Heuser D.The significance of cortical extracellular H+, K+ and Ca++ activities for regulation of local cerebral blood flow under conditions of enhanced neuronal activity. CIBA Fond. Symp. 56: 339-353. 1978.

171. Holmes B., Brogden R.N., Meel R.C., Speight T. M., Avery G.S. Flunarizine: a review of its pharmacokinetic properties and terapeutic use. Drugs. 27: 6-44. 1984.

172. Hondo T., Fujiwara N., Abe T., Kumanishi T., Yoshimura M., Shimoji K. Prior mechanical injury inhibits rise in intracel-\ lular Ca2+ concentration by oxygen-glucose deprivation in mouse hippocampal slices. Brain Res. 666: 263-269. 1994.

173. Hossmann K.-A. Glutamate-mediated injury in focal cerebral ischemia: the excitotoxic hypothesis revised. Brain Pathol. 4:23.36. 1994.

174. Jilek L. The reaction and adaptation of the central nervous system to stagnat hypoxia and anoxia during ontogeny. In: H. Himwich (Ed.) Development neurobiology. Springfield. 331-369. 1970.

175. Jing J., Atken P.G., Somjen G.G. Effects of cobalt and nickel ions on spreading depression in rat hippocampal slices. Soc. Neurosci. Abstr. 17: 1271. 1991.

176. Johannssen H., Siesjo B.K. Cerebral blood flow and oxygen consumption in the rat in hypoxic hypoxia. Acta Physiol. Scand. 93: 269-276. 1993.

177. Kaplin A.I., Snyder S.H., Linden D.J., Reduced nicotinamide adenine dinucleotide selective stimulators of inosirtol 1,4,5-trisphosphate receptors mediates hypoxic mobilization of calcium. J. of Neurosci. 16: 2002-2011. 1996.

178. Kass I.S., Lipton P. Calcium and long-term transmission damage following anoxia in dentate gyrus and CA1 regions of the rat hippocampal slice. J. Physiol. (G. B.). 378: 313-334. 1986.

179. Katchman A.D., Hershkowitz N. Early anoxia induced vesicular glutamate release results from intracellular stores. J.of Ne-urophyslol. 70: 1-7. 1993.

180. Katsura K., Rodriguez de Turco E.B., Folbergova J., Bazan N.G. Siesjo B.K. Coupling among energy failure, loss of ion homeostasis and phospholipase kz and C activation during ischemia. J. Neurochem. 61: 1677-1684. 1993.

181. Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus. Brain Res. 239: 57-69. 1982.

182. Kitagawa K., Matsumoto M., Tagaya M. et al. "Ischemic tolerance" phenomenon found in the brain. Brain Res. 528(1): 21-24.1990.

183. Kjellmer I. Mechanisms of perinatal brain damage. Ann. Med. 23: 675-679. 1991.

184. Kluge H. Calcium and hypoxic/ischemic brain damage some critical and conceptual remarks. Exper. Pathol. 42: 239-244. 1991.

185. Kolmodin G.M., Scoglund C.R. Influence of asphyxia on membrane potential leveland action potentials of spinal moto- and in-terneurons. Acta. Physiol. Scand. 45: 1-18. 1958.

186. Kostyuk P., Verkhratski A. Calcium stores in neurons and glia. Neuroscience. 63(2): 381-404. 1994.

187. Kristian T., Katsura K., Gido G., Siesjo B.K. The influence of pH on cellular calcium influx during ischemia. Brain Res. 641: 295-302. 1994.

188. Kristian T., Siesjo B.K. Calcium-related damage in Ischaemia. Life Sci. 59: 357-367. 1996.

189. Kristian T., Siesjo B.K. Changes in ionic fluxes during cerebral ishaemia. In: Neuroprotective agents and cerebral ishaemia. Acad.Press Ltd. N.Y. 27-45. 1997.

190. Krnjevic K. Coupling of neuronal metabolism and electrical activity. In Ingvar D.H. and Lassen N. A. (Eds) Brain Work. Copenhagen. 65-78. 1975.

191. Krnjevic K., Leblond J. Anoxia reversible suppresses neuronal calcium currents in rat hippocampal slices. Can. J. Physiol. Pharmacol. 65(10): 2157-2161. 1987.

192. Krnjevic K., Leblond J. Changes in membrane currents of hippocampal neurons evoked by brief anoxia. J. of Neurophysiol. 62(1): 15-30. 1989.

193. Krnjevic K., Xu Y.Z., Zhang L. Anoxic block of GABAergic IPSPs. Neurochem. Res. 16: 279-284. 1991.

194. H., Buchan A.M. Treatment with an AMPA antagonist 12 hours following severe normothermic forebrain ischemia prevents CA1 neuronal injury. J.Cereb.Blood Flow Metab. 13: 933-939. 1993.

195. Majewska M.D., Stroscnajder J., Lazarewicz J. Effect of ischemic anoxia and barbiturate anesthesia on free radical oxidation of mitochondrial phospholipids. Brain Res. 158:423-434. 1978.

196. Meyer F.B. Calcium, neuronal hyperexitability and ischemic injury. Brain Res. Rev. 14: 227-243. 1989.

197. Mayer M.L., Miller R.J. Excitatory amino acid receptors, second messengers and regulation of intracellular Ca2+ in mammalian neurons. Trends Pharmac. Sci. 11: 31-42. 1990.

198. Mcllwain H. Cerebral isolates and neurochemical discovery. Bio-chem. Soc. Trans. 3(5): 579-590. 1975.

199. Meldrum B. Possible terapeutic application of antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters. Clin. Sci. 63: 113122. 1985.

200. Metzger H.P.,Savas Y. The influence of the calcium antagonists flunarizine and verapamil on cerebral blood flow and oxygen tention. Adv.Exp.Med. and Biol. 248: 411-418. 1988.

201. Miljanich G.P.,Ramachandran J. Antagonists of neuronal calciun channels. An. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35: 707-734. 1995.

202. Miller R.J. Calcium signalling in neurons. Trends Neutosci. 11: 415-419. 1988.

203. Miller R.J. The control of neuronal Ca2+ homeostasis. Prog. Neu-robiol. 37: 255-285. 1991.

204. Molinary G.F., Laurent J.P. A classification of experimental models of brain ischemia. Stroke. 7: 14-17. 1976.

205. Monroe R.G., French G.N. Left ventricular pressure-volume relationships and myocardial oxygen consumption in the isolatedheart. Circulation Res. 9: 362. 1961.

206. Morgan J.I., Curran T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends Neurosci. 12: 459-462. 1989.

207. Mori M., Nishizaki T., Okada Y. Protective effect of adenosine on the anoxic damage of hlppocampal slice. Neuroscience. 46: 301-307. 1992.

208. Morley P., Hogan M.J., Hakim A.M. Calcium-mediated mechanisms of ischemic injury and protection. Brain Pathol. 4: 37-47. 1994.

209. Mourre Ch., Ben Ari Y., Bernardy H. et al. Antidiabetic sulfonylureas: localization of binding sites in the brain and effects on the hyperpolarization induced by anoxia in hlppocampal slices. Brain Res. 486: 159-164. 1989.

210. Neher E. The use of fura-2 for estimating Ca buffers and fluxes. Neuropharm. 34: 1423-1442. 1995.

211. Nicholson C., Bruggencate G., Steinberg R., Stockle H. Calcium modulation in brain extracellular microenvironment demonstrated with ion-selective micropipette. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(3): 1287-1290. 1977.

212. Nicholls D. G., SihraT.S., Sanchez-Prieto J. Calcium-dependent and -independent release of glutamate from synaptosomes monitored by continuous fluorometry. J.Neurochem. 49:50-57. 1987.

213. Nishizuka Y. Turnover of Inositol phospholipids and signal transduction. Science. 233: 305-312. 1986.

214. Olanow C.W. A radical hypothesis for neurodegeneration. Trends Neurosci. 16: 439-444. 1993.

215. Opitz E., Schneider M. Uber die SauerstoffVersorgung des Gehirns und den Mechanismus von Mangelwirkung. Ergeb. Physiol. 46: 126-260. 1950.

216. Opitz T, Richter P., Carter A., Kozikowski A., Shinozaki H., Reymann K. Metabotropic glutamate receptor subtypes differentially influence neuronal recovery from in vitro hypoxia/ hypoglycemia in rat hipocampal slices. Neurosci. 68:989-1001. 1995.

217. OzyurtE., Graham D. I., Woodruff G.N., McCulloch J. Protective effect of the glutamate antagonist MK-801 in focal cerebral ischemia in the cat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8: 138-143. 1988.

218. Partridge L.D., Swandulla D. Control of cell function by neuronal calcium-activated nonselective (CAN) cation channels. In: Nonselective cation channels (Eds. D.Siemen and J.Hesche-ler). Birkhauser Verlag. Basel. 175-183. 1993.

219. Peters T. Calcium in physiological and pathological cell function. Eur. Neurology. 25(1): 27-44. 1986.

220. Phillis J., Delong R., Towner J. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow durtng anoxia. In: Adenosine: receptors and modulation cell functions. Proc.Int. Workshop adenosine and xantine deriv. Oxford, Washington. 145-164. 1986.

221. Przybylski A. Activity pattern of visceral cortex neurons during asphyxia. Exp. Neurol. 32: 12-21. 1971.

222. Przybylski A. Funkcja mozgu w hipoksji. Warszawa. 1976.

223. Pulslnelll W.A. Strokes Involving gray matter: studies on in situ models of cerebral ischemia. In: Molecular and cellular approaches to the treatment of neurological disease. Edit, by S.G.Waxman. Raven Press Ltd. N.Y. 107-120. 1993.

224. Rami A., Rabie A., Thomasset M., Krieglstein J. Calbindin-D28K and ischemic damage of pyramidal cells In rat hippocampus. J. Neurosci. Res. 31: 89-95. 1992.

225. Randall R.0., Thayer S.A. Giutamate-induced calcium transient triggers delayed calcium overload and neurotoxicity in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. 12: 1882-1895. 1992.

226. Rasmussen C.D., Means A.R. Calmodulin, cell growth and gene expression. Trends Neurosci. 12: 433-438. 1989.

227. Rledel G., Wetzel W., Reymann K.G. Comparing the role of metabo-tropic glutamate receptors In long-term potentiation and in learning and memory. Prog. Neuro-Psychopharmacol. & Biol. Psy-chiat. 20: 761-789. 1996(a).

228. Riedel G., Opitz T., Reymann K.G. Blockade of metabotropic receptors protects hippocampal neurons from hypoxia-induced cell death in rat in vivo. Prog. Neuro-Psychopharmacol. & Biol. Psychiat. 20: 1253-1263. 1996(b).

229. Roberts E. Glycollysis and recovery of potassium ion homeostasis and synaptic transmission in hippocampal slices after anoxia or simulated potassium release. Brain Res. 620: 251-258.1993.

230. Robinson B. Relation of heart rate and systolic blood pressure to the onset of pain in angina pectoris. Circulation. 35: 1073-1083. 1967.

231. Rosen A., Morris M. Anoxic depression of excitatory and inhibitory postsynaptic potentials in rat neocortical slices. J. Neurophys. 69: 109-117. 1993.

232. Rothman S.M., Olney J.W. Glutamate and the pathophysiology of hypoxic-ischemic brain damage. Ann. Neurol. 19: 105-111. 1986.

233. Rubio R., Berne R., Bockman E., Curnish R.R. Relationship between adenosin concentration and oxygen supply in rat brain. Amer. J. Physiol. 228: 1896-1902. 1975.

234. Rubio I., Torres M., Miras-Portugal M.T., Sanchez-Pietro J. Ca2+ independent release of glutamate during in vitro anoxia in isolated nerve terminals. Neurochem. 57: 1159-1164. 1991.

235. Samoilov M.0., SemenovD.G., Tulkova E.I. Action of antioxyda-tive drugs on electric activity, bound calcium level and po-liphosphoinositide content in brain cortex of cat before and after anoxia. Eur. J. of Neurosci. 3: 133. 1990.

236. Samoilov M.0., SemenovD.G., Tulkova E.I., Lazarewicz E.W. Early postanoxic changes of poliphosphoinositides and bound. Ca contents in relation to neuronal activity in brain cortex. Resuscitation. 23: 33-43. 1992.

237. Samoilov M.0., Mokrushin A.A., Semenov D.G., Tylkova E.I., Bole-khan E.A. Molecular-cellular mechanisms of long-term anoxic potentiation of synaptic transmission. Abstr. of XXXIII Int. Congr. of Physiol. Sci. St.-Petersburg. P075.48. 1997.

238. Sánchez-Prieto J., Gonzalez P. Occurence of a large Ca2+-indepen-dent release of glutamate during anoxia in isolated nerve terminals. J. Neurochem. 50: 1322-1324. 1988.

239. Sarnoff S., Braunwald E., Welch G. et al. Determinants of oxygen consumption of the heart with special reference to the tentlon time index. Amer. J. Physiol. 192: 148. 1958.

240. Sohaffer W.T., Olson M.S. Chlorotetraoycline-associated fluorescence changes during calcium uptake and release by rat brain synaptosomes. J. Neurochem. 27: 1319-1325. 1976.

241. Sheardown M.J., Suzdak P.D., Nordholm L. AMPA, but not NMDA, receptor antagonism is neuroprotective in gerbil global ischae-mia even when delayed 24 h. Eur. J. Pharmac. 236: 347-353. 1993.

242. Scheller D., Xie Y., Bock A. et al. Flunarizine and R-56865 improve antiischemic/antianoxic resistance of brain cells. Arch. Pharmacol. 339: 107. 1989.

243. SchiffS.J., Somjen G.G. Hyperexcitability following moderate hypoxia in hippocampal tissue slices. Brain Res. 345: 279-284. 1985.

244. Schurr A., Reid K., Tseng M. et al. Adaptation of adult brain tissue to anoxia and hypoxia in vitro. Brain Res. 347(2): 244248. 1986.

245. Schurr A., Rigor B.M. The mechanism of neuronal resistance and adaptation to hypoxia. FEBS Let. 224: 4-8. 1987.

246. Schurr A., Rigor B.M.(eds.) Cerebral ischemia and resuscitation. Boca Raton. Fl. CRC Press. 1990.

247. Schurr A., Payne R.S., Rigor B.M. Protection by MK-801 against hypoxia-, excitotoxin-, and depolarization-induced neuronal damage in vitro. Neurochem. Int. 26(5): 519-525. 1995.

248. Schwartz J.,Greenberg S. Molecular mechanisms for memory: second -messenger induced modification of protein kinases in nerve cells. Annu. Rev. Neurosci. 10: 459-476. 1987.

249. Semenov D.G., Tyulkova E.I., Samoilov M.0. Intracellular mechanisms of glutaminergic and cholinergic signal transduction in the cerebral coretex. Neurosci.and Behav.Physiol. 27: 240-244. 1997(b).

250. Shay J. Does calcium influx into ischemic cells stops ADP phospharilation? Lancet. 2: 1392. 1973.

251. Sheng M., Greenberg P. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the neurons system. Neuron. 4: 477-485. 1991.

252. Shigeno T., Mimo T., Takakura K. et al., Amelioration of delayed neuronal death in Hippokampus by nerve growth factor. J. of Neurosci. 11(9): 2914-2919. 1991.

253. Siesjo B.K. Cell damage in the brain: a speculative synthesis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1: 155-185. 1981.

254. Siesjo B.K. Historical overview. Calcium, Ischemia and deth of brain cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 522: 638-661. 1988.

255. Siesjo B.K. Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia. II. Mechanisms of damage and treatment. J.Neurosurg. 77: 337-354. 1992.

256. Siesjo B.K. Calcium-mediated processes in neuronal degeneration. Ann. N.Y. Acad. Sci. 747: 140-161. 1994.

257. Siesjo B., Bengtsson F. Calcium fluxes, calcium antagonists and calcium-related pathology in brain ischemia, hypoglycemia and spreading depression: a unifying hypothesis. J.Cerebr. Blood Flow and Metab. 9: 127-140. 1989.

258. Silver I.A. Changes of p02 and ion fluxes in cerebral hypoxia-ischemia. In: Tissue hypoxia and ischemia. Advances in experimental medicine and biology. N. Y., London. 78:299-317.1977.

259. Silver I.A., Erecinska M. Intracellular and extracellular changes of Ca2+. in hypoxia and ischemia in rat brain in vivo. J.Gen. Physiol. 95: 837-866. 1990.

260. Silver I.A., Erecinska M. Ion homeostasis in rat brain in vivo: intra- and extracellular Ca2+. and [H+] In the hippocampus during recovery from schort-term, transient ischemia. J.Cereb. Blood Flow Metab. 12: 759-772. 1992.

261. Simpson L., Barraco R., Phillis J. A central role of adenosine in the hypotension elicited by hypoxia in anesthetized rats. Brain Res. Bull. 23: 37-40. 1989.

262. Simpson L., Phillis J. Adenosin deaminase reduces hypoxic and hypercapnic dilatation of rat pial arterioles: Evidence for mediation by adenosine. Brain Res. 553: 305-308. 1991.

263. Simon P.B., Challiss R.A.J., Nahorski S.R. Involvement of intracellular stores in the Ca2+ responses to N-methil-D-aspartate and depolarization in cerebellar granule cells. J. Neurochem. 61: 760-763. 1993.

264. Sims N.R. Selective impairment of respiration in mitochondria isolated from brain subregions following transient forebrain ischemia in the rat. J. Neurochem. 56: 1836-1844. 1991.

265. Sladeczek F. Putative role of inositol phospholipid metabolism in neurons. Biochemie (Paris). 69(2): 287-296. 1987.

266. Smith M.-L., Auer R.N., Siesjo B.K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat folluwing two to ten minutes of forebrain ischemia. Acta of Neuropathol. (Berl.). 64: 319-332. 1984.

267. Smith!. -L., Kagstrom T., Rosen I., Siesjo B.K. Effect of the calcium antagonist nimodipine on the delayed hypoperfusion following incomplete ischemia in the rat. J.Cereb. Blood Flow Metab. 3: 543-560. 1983.

268. Smith D., Miyake H., Nioka S. et al. The relationship between EEG and brain high energy metabolites in vitro during hypoxia. Anesthesiol. 69: 585. 1988.

269. Somjen G.G. Mechanism of the reversible arrest of function during transient cerebral hypoxia and ischemia. In: Shurr A., Rigor B (eds.) Cerebral ischemia and resuscitation. Boka Raton. Fl.CRC Press. 301-317. 1990.

270. SomjenG.G., AtkenP.G., Czeh G., Jlng J., Young J.N. Cellular physiology of hypoxia of the mammalian central nervous system. In: Molecular and cellular approaches to the treatment of neurological deseases. Raven Press. N.Y. 51-65. 1993.

271. Spedding M., Paoletti R. Classification of calcium channels and the sites of action of drugs modifying channel function. Pharmacol. Rev. 44: 363-376. 1992.

272. Stamler J.S., Singel D.J., Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms. Science. 258: 1898-1902. 1992.

273. Strosznajder J., Calimoniuk M. Biphaslc enhacement of nitric oxide syntase activity and cGMP level following brain ischemia in gerbils. Acta Neurobiol. Exp. 56: 71-81. 1996.

274. Suzuki R., Yamaguchi T., Li C.-L., Klatzo I. The effect of 5-mi-nute ischemia in Mongolian gerbils: II Changes of spontaneous neuronal activity in cerebral cortex and CA1 sector of hippocampus. Acta Neuropath.(Berl.). 60: 217-222. 1983.

275. SweattJ.D., Kandel E.R. Persistent and transcriptionally-de-pendent increase In protein phosphorilation in long-term facilitation of Apllsia sensory neurons. Nature. 339(6219): 51-54. 1989.

276. Szatkowski M., Attwell D. Triggering and execution of neuronal death in brain ischaemia: two phases of glutamate release by different mechanisms. Trnds in Neur. Sciences. 17: 359-365. 1994.

277. Tang C.-M., Dichter M., Morad M. Modulation of the N-metyl-D-aspartate channel by extracellular H+. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 6445-6449. 1990.

278. Tombaugh G.C. Mild acidosis delays hypoxic spreading depression and improves neuronal recovery in hyppocampal slices. J. Neu-rochem. 14: 5635-5643. 1994.

279. Toms N. J., Roberts P.J. Metabotroplc glutamate receptors. In: Receptor and ion channels nomenclature. Elsevier Trends Journal. 1997.

280. Ueda N., Walker P.D., Hsu S.-M., Shah S. Activation of 15-kDa endonuclease in hypoxia/reoxygenation injury without morphologic features of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7202-7206. 1995.

281. Ungerstedt U., Forster C., Herrera-Marschitz M. et al. Brain dialysis. A new in vivo technique for studying neurotransmitter release and metabolism. Neurosci. Lett. Sup.10. 493.1982.

282. Urban L., Neill K.H., Crain B. J., Nadler J.V. Somjen G.G. Postishemic synaptic physiology in area CA1 of the gerbil hippocampus studied in vitro. J. Neurosci. 9: 3966-3975. 1989.

283. Urban L., Neill K.H., Crain B. J., Nadler J.V. Somjen G.G. Postishemic synaptic excitation and N-metyl-D-aspartate receptor activation in gerbils. Stroke. 21: 11123-11127. 1990.

284. Van Harreveld A. Compounds in brain extracts cousing spreading depression of cerebral cortical activity and contraction of crustacean muscle. J.Neurochem. 3: 300-315. 1959.

285. Van Nueten J.M., Janssens W.J. Cerebral antivasoconstrictive effects of flunarisine. Acta oto-laring. Suppl. 460:42-49.1988.

286. Van Zwieten P. A. Differentiation of calcium entry blockers into calcium channel blockers and calcium overload blockers. Eur.Neurol. 25(1): 57-67. 1986.

287. Volterra A., Trotti D., Tromba C., Floridi S., Recagni G. Glutamate uptake inhibition by oxygen free radicals in rat cortical astrocites. J. Neurosci. 14: 2924-2932. 1994.

288. Vyklicky L., Vlachova V., Krusek J. The effect of external pH changes on responses to excitatory amino acids in mous hippo-campal neurones. J. Physiol. 430: 497-517. 1990.

289. Wahl M. Local chemical, neural and humoral regulation of cerebrovascular resistance vessels. J. Cardlovasc. Pharm. 7(3): 36-46. 1985.

290. Wang B., Sundet W., Goetz K. Vasopressin in plasma and cerebrospinal fluid of dogs during hypoxia or acidosis. Amer. J. Physiol. 247(4): E449-E455. 1984.

291. Xie Y., Zacharias E., Hoff P.*, Tegtmeier F. Ion channel Involvement in anoxic depolarization induced by cardiac arrest in rat brain. J.Cerebr. Blood Flow Metab. 15: 587-594. 1995

292. Young J., Somjen G. G. Suppression of presynaptic calcium currents by hypoxia in hippocampal tissue slices. Brain Res.573: 70-76. 1992.

293. Zhang L., Andou Y., Masuda S., Mitani A., Kataoka K. Dantrolene protects against ischemic, delayed neuronal death in gerbil brain. Neurosci. Lett. 158: 105-108. 1993.

294. Zielonka P., Salinska E., Foltynski P., Lazarewicz J.W. Application of a quartz fibre optic probe for the monitoring of changes in intracellular Ca2+ in the rat hippocampal slices. Pol. J. of Med. Physics and Engineering. 2: 49-58. 1996.- 320

295. Цитируемые рационализаторские предложения автора, принятые в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН.

296. Головодержатель для кошки. N29. 1980.

297. Инкубационная ванночка для опытов In situ. N30. 1980.

298. Микроэлектродный манипулятор в условиях микроскопии коры головного мозга. N8. 1989.

299. Устройство микродиализной перфузии коры мозга. N29. 1989.

Информация о работе

Семенов, Дмитрий Германович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1999
ВАК 03.00.13

Диссертация

Кальций-зависимые механизмы реакций коры головного мозга на гипоксию - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы