Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение условий биосинтеза, выделения и свойств рестриктазы Sal Gl из Streptomyces albus G.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ла Сын Рён, 0

ВВЕДЕНИЕ .б

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Явление рестрикции-модификации

1.2. Номенклатура и классификация ферментов систем рестрикции-модификации

1.3. Рестриктазы I типа.

1.3.1. Специфичность ферментов I типа

1.3.2. Взаимодействие ферментов I типа с ДНК.

1.4. Ферменты рестрикции-модификации Ш типа.

1.4.1. Специфичность ферментов Ш типа

1.4.2. Механизм действия ферментов Ш типа

1.5. Рестриктазы П типа

1.5Л. Специфичность рестриктазы П типа.

1.5.2. Свойства ферментов рестрикции П типа

1.5.3. Влияние условий культивирования и состава среды на содержание рестриктаз в биомассе.

1.5.4. Выделение и очистка рестриктаз П типа

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Аппаратура

2.2. Материалы

2.3. Бактериальные штаммы и бактериофаг

2.4. Среды

2.5. Использованные в работе буферные растворы.

2.6. Получение ДНК бактериофага

2.7. Выращивание и разрушение мицелия штамма s. albus G для выделения рестриктазы

2.8. Применение математических методов планирования экспериментов

2.9. Электрофорез ДНК

2.10. Определение активности рестриктазы

Sal gi

2.11. Определение концентрации белка

2.12. Приготовление 10% (об./об.) раствора полиэтиленимина

2.13. Подготовка сорбентов для колоночной хроматографии

2.I4-. Очистка рестриктазы Sal gi

2.15. Оценка неспецифических нуклеаз

2.16. Электрофорез белков

2.16.1. Электрофорез в денатурирующих условиях

2.16.2. Электрофорез нативных белков

2.17. Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации

2.18. Изоэлектрическое фокусирование

2.19. Определение оптимальных условий для эндонуклеазной реакции

2.20. Определение Km и Vmecc

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение условий культивирования.643.1Л. Исследование влияние фазы роста на содержание рестриктазы sal gi в биомассе. 643.1.2. Оптимизация состава питательной среды математическими методами планирования эксперимента

3.2. Исследование условий осаждения ДНК

3.2.1. Фракционирование рестриктазы sal gi и белка стрептомицин-сульфатом

3.2.2. Фракционирование рестриктазы sai gi и белка полиэтиленимином

3.3. Исследование условия фракционирования сернокислым аммонием белка и рестриктазы Sal gi

3.4. Выделение и очистка рестриктазы

Sal GI 3.4.1. Получение суспензии белков и фермента

3.4.2. Хроматография рестриктазы Sai gi на фосфоцеллюлозе PII

3.4.3. Хроматография рестриктазы Sai gi на ДЭАЭ-трисакриле

3.4.4. Хроматография рестриктазы sai gi на гепаринсефарозе

3.4.5. Исследование чистоты ферментного препарата

3.4.5.1. Чистота препарата рестриктазы

Sal GI

3.4.5.2. Определение электрофоретической гомогенности

3.5. Физико-химические и каталитические свойства рестриктазы Sai gi

3.5.1. Молекулярная масса

3.5.2. Определение изоэлектрической точки

3.5.3. Исследование влияния различных факторов на активность фермента

3.5.3.1. Изучение условий оптимальных для проявления активности рестриктазы

Sal GI

- 4 - Стр.

3.5.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость его расщепления рестриктазой Sal GI

3.5.3.3. Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы Sal gi

ВЫВОДЫ . ЮЗ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение условий биосинтеза, выделения и свойств рестриктазы Sal Gl из Streptomyces albus G."

Актуальность темы.

Открытие ферментов рестрикций-модификаций оказало значительное влияние на исследование в области нуклеиновых кислот.

На сегодняшний день из двух составляющих систем рестрикций-модификаций наибольшее практическое применение нашли рест-рикционные эндонуклеазы П типа. Рестриктазы в наши дни стали важнейшими инструментами молекулярной биологии, поскольку они дали возможность расщеплять ДНК у специфических нуклеотидных последовательностей. Благодаря этому стало возможным бурное развитие физического картирования ДНК, определение ее нуклео-тидной последовательности и, что самое важное, открыло широкие возможности для развития генной инженерии. Все эти успехи стали реальностью в большой степени благодаря открытию рестрикционных эндонуклеаз П типа.

Применение в широких масштабах рестрикционных эндонуклеаз делает актуальным поиск новых методов их очистки с целью получения чистых ферментов с большим выходом и за более короткое время. Поэтому большое научное и практическое значение имеют исследования по поиску продуцентов рестриктаз, изучению условий их выделения и очистки.

В настоящее время, несмотря на то, что известно большое количество рестриктаз, применяемых в генной инженерии, их свойства недостаточно изучены. Также мало сведений о факторах, влияющих на их биосинтез в клетке, так как в основном рестрик-ционные эндонуклеазы П типа используются в качестве аналитических инструментов. Важно отметить и то, что производство чистых препаратов рестриктаз мало развито и поэтому разработка технологии получения данных ферментов является задачей важной и актуальной для дальнейшего развития биотехнологии и методов генной инженерии.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось изучение факторов, влияющих на накопление рестриктазы sai Gl культурой strepto-myces albus g, а также разработка методов выделения и очистки из ее биомассы рестриктазы sal Gl и изучение некоторых ее свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучение влияния фазы роста на содержание рестриктазы Sai Gl в биомассе;

- оптимизация состава питательной среды, обеспечивающей максимальное накопление фермента;

- изучение условий выделения и очистки рестриктазы Sai gi ;

- йсследование некоторых физико-химических и каталитических свойств фермента.

Научная новизна.

Впервые проведена оптимизация состава питательной среды методами математического планирования экспериментов, обеспечивающая высокое накопление рестриктазы sai gi и установлена взаимосвязь между фазой роста культуры s. albus G и ее способностью накапливать в биомассе максимальное количество фермента.

Разработана простая и эффективная схема выделения и очистки рестриктазы sai gi до электрофоретически гомогенного состояния и впервые показана применимость хроматографии на

ДЭАЭ-трисакриле вместо ДЭАЭ-целлюлозы, который ранее не применялся для очистки рестриктаз. Определены Km и vmax фермента и впервые установлена изоэлектрическая точка для рестриктазы

Sal gl ИЗ Streptomyces albus g.

Определены оптимальные для действия фермента условия проведения реакции, и изучены влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы sai gi .

Практическая ценность работы.

В результате проведенных исследований оптимизированы условия культивирования продуцента рестриктазы sai gi : streptomyces albus g и разработан способ выделения в высокоочищенном виде этого фермента. Получены исходные данные, необходимые для создания лабораторного регламента по получению эндонуклеазы рестрикции. Выполненные исследования могут послужить основой для развертывания в КНДР и СССР выпуска этого фермента. Помимо этого, изучение и оптимизация условий осуществления реакции гидролиза ДНК даст возможность более широко и эффективно применять рестриктазу sai c-i в генноинженерных экспериментах.

- 9

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ла Сын Рён, 0

Выход

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ла Сын Рён, 0, Москва

1. Ват Н1 500 2,0 4,0 I 750 19х 137

2. Вв1 I 740 4 0 5 4 — 1,6х 841000 3 0 3 806 953. II 250 6,8 — 13х 18х 80

3. В яр Ш 80 6,4 50 2 200 9050 0,4 8,0 I 600 150

4. Bst I 70 ООО 38,0 0,54 I 797 17 у 18,5х 50б. Взи I 70 0,077 О 7 100 42

5. Есо Щ 350 0,2 0,6 8,5 I 500 3,5 643 200 27,0 I 180 21 НО4 730 53 7 II 4 I 750 28х 10х 132

6. Есо КС1 300 3|4 II 3 256 4

7. Нра I 100 0,06 0,6 17 000 34 74ю. 1Т£0 II 0,34 - 38.8 12 491.. Ра1 I 400 0,21 0,52 I 650 33 26