Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение таксономии и экологии рекомбинантных штаммов E. Coli, продуцирующих белки ВИЧ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение таксономии и экологии рекомбинантных штаммов E. Coli, продуцирующих белки ВИЧ"

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ И. М. СЕЧЕНОВА

в од

На правах рукописи

1чмЧ

УДК: 575.27 :579.26 : 57.06

СЕЛЕЗНЕВА Ольга Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ ТАКСОНОМИИ И ЭКОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Е.СОЫ,

ПРОДУЦИРУЮЩИХ БЕЛКИ ВИЧ

03.00.07 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова.

Научный руководитель

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. А. Воробьев.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Д. Д. Меньшиков, доктор биологических наук, профессор Г. И. Ежов.

Ведущее учреждение — Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1994 г.

в 14 часов на заседании специализированного совета Д.074.05.10 в Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова по адресу: 119881, Москва, ул. Б. Пироговская, 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: Зубовская пл., д. 1.

Автореферат разослан « АЛ. » £ р . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. Ю. Миронов

- i -

Обшая характеристика работы

Актуальность проблеки:

ВИЧ-инфекция привлекает к себе с клядын годон see больяее внимание. В связи с сирокин распространенней ВИЧ-ннФекпки лабораторная диагностика заболевания и илфиаированноегд er; новитск одним из важнейших и эффективных рычагов, способствую®« профилактике этой болезни {Хаитов P. St., Игнатьева Г. А., 1992). Поэтому важное значение придается получений антигенов ВИЧ, путей создания рекокбН!!а;гпшк атаниоз геино-иняенерннии методами. В качестве продуцентов ВИЧ используют различные микроорганизмы с аороыо изученными генетическими спойстадии а поййоляшдан для бкотехнологмческого производства параметрами (Воробьев A.A., i 993; Казеннова Е.В. и солит., 1991). В результате напииулншШ аа генетической уровне "вновь созданные* ннкроорганизиы коггг приобретать свойства не характерные для исходного штанна (Про-данчук Н. Г. I Сяиченко В. Г.» 1991; Detlef D., 1790!,

К иккроерганизнхч, используемым для получения антигенов ВИЧ, относятся различные итанны Е. coll - вида бзхтсркй, вкодя-яего в состав нормальной нккроФлоры тела человека. В связи зп'н. распространение тагах генетически измененных никроорга-ш1эйов а скругаиаей с реле ковет привести к ослохнони» зкологе«-ческойг обстановка поскольку рекоибинантяые атанмы могут пркоб-ррсгл жогестзеш!/» лекарственную устойчивость, вшивать аис€нози, варляеине п ккиуняой систеке, следстиаея чего яаиет-ci шжазение частот« гнойио-воспллитедышх и мкошюнно-аяяср-гачеаж заболеваний к т.д. Шендая в. П. и соаят., 19" I; Покат«-лов А.Б., 1993). Исследования с исходшш штакнаки Е.coll влк таичака-рекомеинантани я основном проводились только в отпс :е-

mm HS активности к выделения целевого продукта к были направлены на оптгошзашш условий проявшш соответствуют биолюш-ческнг процессов в клетке (Гараев п. и. и соавт. .1991; Horvathova И. et al., 1992), а изучению биологических свойсте генетически измененных микроорганизмов, в частности: вирулентности. способности к адгезии, устойчивости к воздействия факторов окружашей среди, взаимодействие с другими пикроорганизна-ш, влияние на защитные силы макрсорганизка, не уделялось колакого внимания, До настоящего времен» не разработана единая система анализа экологической безопасности работы с 'новыми" никроорганизнани, а такхе не рассматривался вопрос об определе-шш кх таксононического положения.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы явилось изучение таксононического положения и определение степени экологической опасности рекомбинантных штаннов E.coll HBlOl/pGagl-раг и СбОО/ PuBEVbo, продуцирующих белки ВИЧ.

В соответствие с поставленной целью требовалось решить следующие задачи:

1) Изучить норФологические. культуралыше. биохимические и антигенные свойства рекоибинанпшх итакиов Е.coli и, таким образок, определить таксононическое положение "вновь созданные" микроорганизмов;

2) Изучить Факторы патогенности генетически измененных ¡шкроорганизиов;

31 Исследовать влияние на итанны-продуценты дезинФектантов и антибактериальных препаратов;

4) Определить поведение реконбивантных штакиов Е. coli, продущфуших белки СИЧ, в различных биоценозах.

нагншя_шши: в результате ароеедешша нссяедсвзгай «а-ределено таксономическое пояснение реконбанаатзш: зтаииоз Е.coli, продлшрушж белки ВИЧ. Установлено, что "шози" скоастртювашше кжрооргааазт желн некоторые отлита? so К7яьтуралышн, биохимическим свойствам, ао-сравневиэ с acsojues-ми оташами Е.coll, однако сожраваяи основные свойства, прнсу-ше виду.

В работе впервые определены Фактора патогенност s шз числе: токскчность. токсигеиность, адгезивная способность) ре-конбжштного этаина Е. coll HBSOl/pGagi-par, продувдршзего белю? ШЧ. В экспершентаг in vivo в in vitro взереае юшо влияние данного рекоибкнантаого птанма на фагощггарау© акткз-иость пояшорФноядерг^г? лейкоцитов а альвеолярная какро$згов.

Проведение нссдедооанйя позволили выявить, возможность приобретения "вновь* сконструнровашшш южрсоргаетзйакз та-гествениой лекарственной устойчивости, непредусмотренной та as создании. Впервые изучена чувствительность реконбшштнш главно d е. сои, продудирушйх бедки внч, к разшчнш группой дезш-^пшрушкк средств, as доведение в различных биоцеаозаз. а также колшдаотщщроваяне данных микроорганизмов.

Практическая значимость: Результата шоведешшх исследований обосновывает эффективность нероцрйятлй при работе с гонк poKoi зянантнодх штэташ S. coli, продушфлютш беакн БД*!

Преядог.еняая сжека исследования генетически юигикшых шодюоргзнкзкоз иозет бить кспояьзозава ари оцекке стгаеян 58-зо паевое та работ с другими продуцентами бкояогачесчя актнвшн вгаестз. получешшни кетодаш гепиоа дняеперии.

- б -

Натериа® диссертационной работа кспользуйтся при чтецда аекцнй is проведении практически эзппигй иа кафедре ¡:®сробколо-гшш, вирусологии н шдаунологии НИЛ им. И. Н. Сеченова.

Апробация: Основные результаты работа были дологены на V Объединенной съезде гигиенистов, зпидениологоо, иккробиологоз, паразитологов и шФекяионистов Казахстана, Аяш-Ата, 1591г.; 1-ой Неядзпзарокной конференции "СПИД, рак н ретровярусы чевове-ita". Ст. -Петербург, 1992г.; на научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и шшупологкн шл ии. 8. Н. Сеченова 26 августа 1993 г.

ШШдащщ: По гене диссертзпии опубликовано 4 научные работы.

Структура к обьен работы: Диссертация .изложена на 145 страницах наазшоцисного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включавшей одну главу материалов и кетодов к шесть глав результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Работа иллюстрирована 9 рисункаии и 15 таблицами. Список литературы содержит 266 названия.

Собственные исследования

Натериалы и методы: "" Для исследования были взяты следующие генетически изкенеп-ные микроорганизмы: реконбюштиый штааи Е.coll HBlOl/pGael-par н исходный штакн Е. coli НВ101, полученное в Институте Bsipycoao-гш нн. Д. И. Ивановского; рекоибикаетннй итаин Е. coli

- Т -

С600/риШ50 и исюш&й атаки Е. coll С600, получений в институте биоорганнческой хннт им. rt. К. Иэияхинэ. V иссдедуеииг яш-росргакизиов определяли таксономическое пологенке. влияние Факторов окрухагаей среды. дезннфектаятов. антибактериальны* препаратов а поведение в различный биоценоза*. V рекокбшзаатао-го втанна Е.coli ¡ffliOt/pGasi-par крохе этого проводилось изучение факторов патогенностя Перед началом кавдой сер:® экспериментов проводил ось определение способности продуцента синтезировать цеяевой продукт с аоношш электрофореза а цояяак-ркланидком геле (Laessali U.S., 1970).

Бактериосконкческнг исследования проводились с нсвоаьзова-яиеи методов световой и электронной микроскопии.

Куаьтуралыше свойства изучались на плотник питательная средах с псиошью бинокулярной лупы и косопрогодетего света so йбтсду Landay ("Знтеробактернм. Руководство для практических врачей, 1993г.). а также на зияния шггатедышж с ре дай с использованием тернокачалок (100 к 220 об/мин). Для построения кртш роста оптическую плотность культур определяли при длине вояяы 550 нн., количество КОЕ определяли при параллельных высевах на плотные питательные среды. При этой исследовалось влияние ud скорость роста сяедуших паранетров: температуры: ♦<!.

<37С, кислотности питательной среды: 5. у, 6,5; 7,5 и состава питательной среды (!И1Б, L-бульон).

Ферментативную активность оценивали с вомояьв тест-скстеи Enterotest, различных кодификаций APi-систен, а такхе с а«-йне-Н1'кием автоматизированных микробиологических систеи "Avantage* и "QvantUB" с компьютерной обработкой результатов .

Антигенную структуру изучали в реакциях агглютинация с эшернхиозныни поли- н ноноредепторныни OS- и И-сыаороткзкя.

- » -

Оценку Факторов патогенное™ осуеэстешет с кееойьзованкен 750 экспериментальная животных, в качеств* которая база вкбракн икая (нелинейные белые, обоих полов, кассой 18-ао граш>. Определение средневирулентнол доза токсичности и токсигенности проводил!! по общепринятой методике. Обсеменеввость вяггреяшх органов изучали пгген приготовления назков-отпечатков й 2i>ose~ дегшен параллельных количественных высево®.

Наличие адгезинов определяли » реакции яряйой геиаггяота-нащщ (Evans D.J. et al., 1984! с зритрошпани различных вквот-еш, птиц к групп крови человека. Наличие адгезинов энтероаато-генныа кишечных палочек ( ш, К99. F41, Р987, А20) определим в реакции агглютинации на стекле с соответствующим» нонореиев-торныни сывороткани.

Способность к колонизации толстого кишечника изучалась ва нелинейных ô-iO дневных крысах-сосункак (Wells 6.L. et al.,1979). Заражение проводилось перорально с использованием ла-тексовах зондов, дозы для заражения составили 500 или. кл. ка

крысу.

Фагоцитарная функция альвеолярных накрофагоз и пояиморФноя-дерных лейкоцитов изучалась по общепринятой методике на нелинейных белых крысах. Определяли следующие показатели: фагоцитарное число, Фагоцитарная активность, процент завершенности Фагоцитоза.

Влияние антибактериальных препаратов изучалось с поновью автонатического анализатора "Avantage" и методой диффузии в агар. Определяла НЖ к 20 антибактериальным препаратам.

йзученве воздействия дезинфектантов проводилось с использованием батистовых тест-обьектов ("Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезннфидирухшх средств". 1971г.).

Взаимодействие с представителями нормоФдоры тела человека.

условно-патогенными микроорганизмами широко распространенными в окруаашэй среде, а такм определение колмщшочувствйтеяьвоста проводили йетоаом отсроченного антагогаша (Лебедева й.11, 1963).

Исследование возможности передачи паркера ампшшялнвоус-тойчнвоста проводили путем постановки коаьюгашш с F- пташои Е. coli СП-63 (Кааус P.. Хейс V.. 1970г. ).

Все полученные цифровые данные обрабатывали с применением методов вариационной статиста::!, тестов Стьадеата u Наяна-Унта? (АГС!?.гин И. П., Воробьев А. А., 1962).

Результата исследований н на обсуждение:

Па первой этапе работа определяли таксономическое полозе-ние реко«бипаитныз итаимоо S. coli (S. coll H8l0l/pGasl-?ar a E. coll C600/PUBCV50), продуияруавшг бедки ШЧ. Изучали tiopfoao-гнческие , к/льтуралише. биохимические а антагеннке свойства дгшлш зташоа-продуцентов no-сравнет® с исходники сташа^ш. Результата исследований показали, что с аоиошьга аетодоа сотовой и электронной пгасросковим не удалось выявить различий иожду исходными я генетически "измененными микроорганизмами. Все нес ледуекые штагаш обладали одинаковыми морфологическими и •пшкто-риальннмн свойствами, характерными для род^. E. coll.

DP« из тении кудътурадыша свойств было установлено, что оо характеру роста аа алотиых питательных средах üfflA, агар Хоттннгера, IB-агар) х>еко.чбинантине птакин £. jo 11

iimoi/rcaai-par a S. coli C6C0/puBSV50 не отличались от исходных этанисв. Все иссаедтже зтанны Е.coli образовывала е<о-

яонкй.. При культивировании аа нидкия пнтатеяыкк cpoaas зтгнна Е. coil ifflioi имели различия: рост рекоябнигштпого птэ.чна Е. oll

IffilOl/pGaei-par в l. 5-2,0 раза (а зависимости от усл&зяй культивирования) ероисходил быстрее, чей ксзодпого штанна (ркс. 1); также имелись различия в опткнальном значении кислотности питательной среды: для ппанна-продуцента оптимальное значение pH накодшюсь в интервале 5,5-6,5, тогда как эта величина для исходного нташа составляла 0,5-7,5. Выявленные различия свидетельствует об изменении веек регулятора. биохимические, энергетически я других ировессов у генетически измененных шжроорганнзиов, вследствие "вынужденного" синтеза чужеродного вевества.

Исследования биохимических свойств рекокбинактных штаммов Б. coli HBlOl/PGagl-Par H C600/PUBEV50, продупирушкх белки ВИЧ, с поношью коммерческих тест-систен Qvantum и Avantage по 33 признакам не выявили различий в ферментативной активности иезцу этиш генетически изменениями микроорганизмами и исходными птакнаш.

Определить О-серогруппу у исследуемых рекоибинантцын штан-иов в реакпш агглютинации с поливалентными к типовыми ОК-сыво-роткаии ве удалось, поскольку все исследуемые ннкроорганкзны находились в R-Форне. Определение Н-антигена с помощь» ра-шш-систенн (Ратинер с. А., 1982) показало, что все используемые в эксперикенте птамкы Е.coll имели Н48 антиген.

Таким образом, результата изучения морфологических, тинк-торнальнда, культуралышх, биохимических, антигенных свойств реконбинавтных штанков HBlOi/pGagl-par и C60Q/puBEV50, продуцирующих белки ВНЧ. показали, что эти штаииы-продуценты, такле как и исходные итамны относятся к виду Escherichia coli.

Следтлки этапом исследований явилось изучение влияния ре-конбинантной илазкиды на вирулентность штакна Е. coli

кок

ко г

IT'f

■ ■) и e» » i

.12 ч

rue. . ; Î ;> M ч г ч л и и с : I

I ¡ ;¡ , n g, г

jr JHn, <°,1 a; i

» î' . 14/ î i

рост 'ЛТ.ЧМ UOH M pH ТС llih' р<1 ту pe * - î * С

i n .et т. i Miioii при Tcuiic рагу jn- i .17 *C

¡ЮГ l' ({¿ж IIMTOHCIIIIIIOCTil UJp.'iJ^HH - 100 v'ifs/Mlllt

рост при и utuií сиплости a'Jрации - 2?.f) oß/miii

не«одним пт.чии К. со П ИП I 0 i

pt!KOMÎÎH!IUl»T • Si UÎTilUH Г. col I 1Ш10 l /pCl.'íM "píir

HBlGl/PGagl-par> продуцирующего белки ВИЧ. Установлено, что

LD50 при внутрнбршиннон способе введешь для реконбинантного

ö

еташа составляет 7,5*0, £1 х ю н. кл. /мл, значение LD50 для исходного атанма Е. coll 1П101 - 5, Oto, 13 х W5 н. кл. /нл., тогда как дня энтеротоксигенних вгганнов кишечной палочки LD50 равно

10 (Кулинкч п. й. , 1990). При пероральнон введении оказалось, что >0

LD50 больие 10 и.кл. /ил. как для исходного штакиз, так и для рекоибинаятного штамма, так как данная доза вызывала гибель только 20/. опытных дипотных. Результаты исследования токсичности! к токсигенности показали, что реконбинантный итакм Е. col 1 HBlOi/pGagl-par, так se как и исходный штамм, не продуцирует экзотоксин и обладает слабым эндотоксином.

При изучении обсенененности внутренних органов рекомби-нантнын штаммом Е.coli iffiiOl/pGagi-par было установлено, что исследуемый генетически и™ененкый микроорганизм элиминировал из организма животных (мышей) уже через 24 часа (клиренс - V00-> (рис. 2). Наибо^шей обсенененности из веек исследуемы* внутренних органов были подвержены печень к селезенка (клиренс у дашшх органов в первые часы после введения культуры ишероогга-низнов наименьший и составляет 23Z и ifi'/., соответственно). Иеньве всего было высеяно микроорганизмов из гоногенатов сердпа {клиревс^гх). Все посевы крови были стерильны. Различий в степени обсенененности внутренних органов и скорости элиминации из макрооргашзна между рекоибинантнын и исходным штаммами Е. coll KB10I ве выявлено.

В работе было проведено изучение способности рекокбипакт-ного итанна Е. coll HBlOi/pGagl-par колонизировать толстый кишечник крыс-сосунков. Для контроля был взят вггами Е. coli 0-83 из коллекции лаборатории генетики и вирулентности бактерий ИИ-

сердце

к 7,

К Г.Л

12 {?> 2\

\г зк 24 •

К Г.

12 !* 24

Рис. М 2 Динамика пПс«-мепеппостн орг-'Шои (Тслых мышеи посла ПНСДиППП рокомоип.штпого и исходного •птаммоп Е.соП И1И01

!!рн'1ич;Ш1(с :

"........." тлсгпло:.!осч и нгг.чглм.т Г..со! 1 ПИ 10 3

" - - ШиСгиасмосп, исходного рскомбншипчгого штамма

Е.<:о1 I !1П!01/рС.арЛ-рнг

. - 14 -

ЕЗН т. Н. Ф. Гамалея. Установлено, что штанк-продуцент, такае ¡сак и исходный штанн. не обладал способностью колонизировать слизистую толстого кишечника крас-сосунков (исходный штанн не высевался из кишечного содержимого на 7 сутки от монента его введения (клиренс;100/4, реконбинантный штанн не высевался из кишечного содержимого ухе на вторые сутки (клиренс; ЮОХ). в то же время контрольный итанм Е. coli 0-83 колонизировал слизистую елевой и подвздошной кишки (штамм высевался из кишечного содержимого крыс-сосунков спустя 30 дней от монента его введения (клиренс

Адгезивные свойства штаммов Е.coli НБЮ1 изучались в реакции гекагглютинации эритроцитов (РГА) человека и разних видов животных. а такхе в РА на стекле с агглютиндаушийи сывороткам« К88. К99, 9873. Ftl и А20. Установлено, что реконбинаитный штанн Е. coll HBlOl/pGagl-par, так is как и исходный штанн, обладал напиозочувствителышт Фимбриями (Пип), слабо аггмтши-ровая эритроцита хивотиых и человека (РГА и не обладал адгезивными антигенами энтеропатогешшх эаерихий.

С целью определения влияния генетически измененных микроорганизмов на Фагоцитарную активность перктонеалышх полннор4~ ноядернш лейкоцитов и альвеолярных макрофагов проведено изучение показателей фагоцитоза рекоибинантного штаииа Е.coll НВ101/ pGagl-par. Установлено. что штамм-продуцент, так Ее как и ис-аодный штакн. поглошался перитонеальныни полияерфкоядерньш лейкоцитами с низкой активностью ($А= 16,9*1.0 и 16. öii.J, соответственно), Однако показатели переваривающей способности оказались высокими и для рекоибинантного ¡птанма и для исходного ШЗФ-68,6tl. ( к 69.7il,6, соответственно). При изучении активности альвеолярных макрофагов бнло установлено, что соотношение

8 показателен Фагоцитоза исходного и рекокбкнаятного итаннов Е. coll НШ01 сохраняется такое хе, как и в показателях фагоцитоза полннорфиоядерных лейкоцитов. Показатели поглотительной активности и перевзкгоашей способности Фагоцитов (полнкорфноядершге лейкоцитов к альвеолярных накроФагов) г рекомбгшантиого итаняа g. coli >roiot/rGapi-rar достоверно не отлетались от тех же показателей у исходного итанна.

Такки образон генетически измененный микроорганизм Е. coll HElOl/pGasl-par по всей показателям не отличался от исходного штампа и молет быть отнесен к непатогенный, нетокснггпзкн п слабоадге.зишшн ттзкман.

При исследовании актибнотикогранн культур Е.coli HB101 и Е. coli imiOl/pGagl-par, Е. coli СбОО И Е. coli C600/puBEV50 установлено, что у рекоибинаптных шташов яаблвдалось увеличение зон задержки роста ко всен используекш в эксперименте антибактериальны« препаратам в среднем на 4-10Z. Реконбинантный атаки Н. coli HBlOl/pGagl-par отличался от исходного пггамма только запрогранированной устойчивостью к ампициллину. Реконбинантный штамм Е.coli CSOO/puBEVSO, в результате гепно-шгенерныж нанн-нулявдй, приобрел перекрестную лекарственную устойчивость к аз-лоцнялину, карбеншшллину, пинерациллину и аггнентину. Разлитая в минимальных ингибируюпмх концентрациях нехду рекомбииантннн и исходным штаммами Е. coli ifflioi и Е. coli CÖ00 были статистически недостоверны.

С цель» изучения коньюгативннх свойств реконбшантаой плазмиды r-Gagl-par исследовали вознояюсть передачи гена анпн-пиллинрезистентиости из штамма Е. coli HB101/pGag!-par 0 штани Е, coli CR-бз, который является F-, Aap-. Результата исследований показали, что передача признака аштпшшшорезистентности в

- 16 -

решшгентшй иташ не происходило.

Изучение антагонистических свойств генетически изненешш микроорганизмов проведено в отношении исходных вташоы. представителей нормальной микрофлоры тела человека и наиболее часто встречающийся во внешней среде условно-патогешшгш шкроорга-нязмавд. Установлено, что бактерии. Формирующие норнадьнуа микрофлору тела человека, такие как шзечная палочка (ьтакн Ш7), лактобашша (L. Plantarías Н36.39), подавляли рост все а. исследуемых ншсроорганнзнов (табл. Ii. Антагонистической активностью в отношений генетически модифицированных микроорганизмов обладали S. aureus и Рз. aeruginosa. Реконбинантаые штаиш Е. coli HBtOl/pGagi-par н Е. coli C600/puBEV50 не обладала антагонистической активностью в отношении иикроорганизнов, используемых в эксперименте. •

Результаты исследования колгошночувствительности реконба-нантанх итаннов Е.coli HBiOl/pGaei-par и C600/pulsEV50 иоказалп. что оба генетически измененных микроорганизма чувствительны ко всей эталонный кодшшногешшн атамиан. так se как и исходные штаины, то есть имеют одинаковый колшшотин.

Кроке исследований по опенке риска распространения рекой-бинавтных штаммов бактерий, определения их вирулентности и точного таксономического нолояешш, было проведено определение чувствительности этих генетически измененных микроорганизмов к дезинфицирующим средствам. Для эксперимента были изнти следующие дезсредства: полисепт, амфолан, перекись водорода и хлора-шш. В качестве контроля был взят штаня Е.coli 1£57 из коллекции ШИИ стерилизации и дезинфекции. В результате проведении исследований было установлено, что все реконбняантшге птая-ш-нродуценты в 1, 5-2,0 раза были более чувствительны к де<»с-

Табиша н i

Изучение активности шпсроорганизнов, широко распространенных в окрудзшей среде к предстазитсдей порийФлош тела человека в отношении рекоябшантныж и исюдвих ятамкоз Е. coli.

йссяедуеиий гатаин E. coli E. COll E. coli E. coll

HBiOl HBiOi/ pGagl-par C600 €600/ PUBSV50

Антагониста >

Е.col? IU7 ♦ ♦

S. aureus 209 + ♦ + .

Ent. cloacae - - -

Candida albicans - - - -

I. plantarura Я38 i 4 ♦

L, plantama ]U4 + + + +

Вас. сегеиз - - - -

Рз.aeruginosa + + - -

Примечание:

* - ' - отсутствие антагонистической активности " ♦ " - микроорганизм обладает антагонистической активность» в отноиешш другого никрооргашзиа

r«s. И 3 "«•.'cTori! д«гчк;.ф«-кткнюи к

Хлорамин

to

45

ГТ-IVVIJ П. ее

контроль E.ccli Е.col i HBîOt Е.col i

HB 10 í/pGag!-pa f t. cot: C600 К.col i

CGOC/pu BCV5Í>

TBI!» испояьзуеиыз в эксперименте деэгшФектантов, по-сравтош® с контрольна! и исходника атанианн (ркс. 3). Следовательно, к Дания« рекоибилаитаын итамнан, яродуцирумни белки ВИЧ. можно применять обэепротятые противоэпидемические неротттт по щредт-реадешш возйояности попадания их а окруяащуи среду.

выводи

г

!. Ясследоьатше агганны-продуценты Е. coll KBiOi/pGael-par н C600/pîiBEV50, продупирушке белки ЮТ, по совокупности наркологических, тинкториальных, культуралькня. биохимических, антигенных свойств принадлежат к виду Escherichia coll.. H. Стабильность роста реконбинаптного штанна Е..соЦ HBiOl/pGagl-par не зависит от состава питательной среди й отличается от режима культивирования исходного штата по интенсивности аэрации и оптимальной pH среды.

3. Вследствие внедрения в состав птакма Б.coil C8G0 рекоиби-нэнтяой плазнияы puBEVSO, содеряааей ген, детерюшкрлхаШ устойчивость к ампициллину, итанн приобрел перекрестную лекарственную устойчивость к четырем -лакталнш антибкотккан.

4. Реконбшшитные таит Е. coli HBiOl/PGagl-par и C600/puEEV50 достоверно более чувствительны к действию дезшфгапфуших препаратов (перекиси водорода, полксепту, акфодапу). пен исходные штанин, что позволяет применять к нин общепринятые дезинфекционные мероприятия.

5. Рекокбшштгаае втамш Е.coli HBlOi/pGagt-par и C600/puBSV30 в опытах in vitro не обладают антагонистической активность» в отвomeiimi предстзштеяей нормальной гкгсроф.яоры тела чело-

века и наиболее часто встречающимися во шелшей среде условао-патггеишни мнкроорганизнанм; реконбинантный втанн E.coli HBlOl/pGagi-par не способен колонизировать слнзистуа толстого кшечника у крыс-сосунков вследствие антибиотического влияния нориоФдоры и отсутствия адгезипов к клеткак эпителия толстой кишки. В. Реконбинантнкй штаг® Е.coll HBlOi/pGael-par, так ае как и исходный игами Е. coli IffllOi, яшшется иаловируленташь сда-боадгезивнын, не -гексагенный, быстро злишшкруется из орга-1лзна, а, следовательно, должен быть отнесен к 3-4 классу опасности по "Классификации штаниов промшлеиаых микроорганизмов по степени опасности*. 1. Реконбинантная плазнида pGagl-par не является конызгатнв-ной, поэтому не представляет экологической опасности ври нонаданин в окружают) среду. 6. Примененная схема исследования может стать основой практических рекомендаций для тестирования генетически изненеавых микроорганизмов в отношении их экологической опасности

Список научных работ

1. Воробьев A. A. j Хорошко Н. В., Селезнева 0. П. Реконби-ванткне иташш: биологические свойства и пера безопаскости при работе // Вес та. РАИН, - 1993.- Н2. - с. 31-37.

2. Воробьев А. А,, Селезнева 0. Ю. Биологические свойства реконбинаптяых атакмов Е. coll - продуцентов б-чжов ЬЯЧ // 1 Незедународная КокФ, "СПЯД, рак и ретрозирусы человека*, Тез. докл., 10-22 нояб., Ст.-Петербург, 1992 с. 70.

3. Воробьев А, А., Хорсзсо Н. В., Селезнем О. Ю. S вроблэлг экогогнческсй безопасности рвиспвявавпш trnsmon бактгрнй -продуцентов ЕАВ //Обьедкаеняай сьеэд гнгиевнстоз, запдегтояо-гов, йикробиояогов, паразитологов и пзфетаюнкстов £азаз?стапа. 5-й; Иатеркаян; Алма-Ата, 1991.- т. 5. - с. 105-107.

4. Хоропко Н. В., Селезнева О. Ю. Реяонбтаантшг Етагзса икн-рооргагшзнов и зкоаопш // Гигнешиесккг аспекта ospams ога»уга- • кзей среды и здорсвья человека. Иауч. труди иедкко-ировмакт-ческсго ф-тз., 1L- 1992. - с. 120-122.