Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и экспрессии гена эстеразы S у Drosophila virilis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и экспрессии гена эстеразы S у Drosophila virilis"

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

Сергеев Павел Владимирович

уте ЧТ7 11 ^ *=»

Изучение структуры и экспрессии гена зстеразы 5- у БгозорЪПа узхШз

03.00.03.- Молекулярная биология

7-

ь

Автореферат диссертации на соискание учекои степени кандидата биологических наук

■г

Работа выполнена в ласоратории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярном биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, академик РАН Г.П.Георгиев кандидат биологических наук Г.Н.Ениколопов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: • доктор биологических наук С.М. Деев кандидат биологических наук С.Д.Набирочкин ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биологии развитития им. Н.К.Кольцова РАН

«о

" часов на

Зашита состоится Лс&^в 1992 г.. в " ^

заседании Специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д^З?.

С диссертациеп можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "/6" г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы.

Изучение регуляторных элементов, участвующих в тонкой регуляции работы генов, является з настоящее врекя одним из основных направлений развития молекулярной биологии. *

■Удобной моделью для исследования в этой области, Является система эстераз СгоэорйНа у1г111б, наиболее подробно изученная на генетическом, биохимическом и молекулярном уровнях (КогосЪк1п, 1930,1981,1987!. Большой интерес для изучения тканеспецифичноя экспрессии, генов представляет собой один из генов, кодирующих {З-карбоксилэстеразы ОгоБорЬИа,- ген эстеразы Б ЯгозорЬНа 71г111е. Данный ген активируется только в зякуляторяои (сеыявыносяшеа) луковице самца в определенный период • индивидуального развития. Активность этого гена находится под контролем по меньшей мере трех генов, локализованных • в IV, V и Х-хромосоках, а также под гормональным контролем (Корочкин, 1983!.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение регуляторных элементов, участвующих в работе гена эстеразы г ВгогорЬПа У1г111з и механизмов транскрипционной и трансляционной регуляции работы данного гена ъ онтогенезе ВгогорЬИа. Б задачи исследования входило: •

установление первичной структуры кодируете»! и регуляторной областей гена эстеразы Б ЕгоэоБОр'пПа у1г1Ш и анализ этой последовательности для поиска регуляторных'элеьентов;

определение аминокислотной последовательности эстеразы 5 по нуклеотидной последовательности и проведение сравнительного анализа активных центров эстераз различных видов животных;

картирование 5' областей мРНК эстеразы 3 и подтверждение существования двух альтернативных промоторов у гена эстеразы Э ИгоБорЬПа v3.ri.lis;

изучение работы альтернативных промоторов в оитогенезе ВгоБорЪПа у1П115:'

проведение нуклеотидных 'замен для изучения влияния 5' нетранслируемой области мРНК эстеразы - Б, транскрибируемой с промотора Р1 на уровень трансляции.

Научная вовизна результатов исследования.

Впервые была • определена ■ нуклеотидная последовательность регуляторноя к кодирующих областей гена эстеразы S Drosophila virllis. Определена предполагаемая первичная аминокислотная > структура зстеразы S. Сравнительная анализ аминокислотных последовательностей эстеразы • S Drosophila virilis и зстеразы 6 Srcccphlla Eslir.nr^stsr. Степень го«плпгии этих двух зстераз • составляет 50 Z. Сравнение активных центров эстераз различных видов животных показало консервативность этого участка эстераз. Анализ нуклеотидноя последовательности регуляторноя области гена эстеразы| S выявил наличие . двухобластей характерных для промоторов эукариотических клеток.' Были прозедены эксперименты, которые позволили определить возможность использования этих промоторов в условиях транскрипции In vitro. Оба промотора узнавались факторами, участвующими в инициации транскрипции в эукариотических клетках HeLa, хотя с разной эффективностью. Наличие- двух альтернативных промоторов приводило к появлению двух типов мРНК, которые различались друг от друга по длине на 342 н. 5! нетранслируемая область мРНК большего размера содержала три коротких открытых рамки считывания, .которые могли кодировать короткие полипептиды длиной 9, •4 и " 11 аминокислотных остатков. Были произведены -нуклеотидные замены в' инициирующих и .терминирующих колонах и исследована роль этих' открытых ' рамок" считывания в регуляции трансляции мРНК. Фактически, трансляция полностью подавлялась этими короткими открытыми рамками считывания. Вторичная структура 5' нетрансяируемоя области не влияла на трансляцию.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Обьем диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, содержит.-/^ рисунков и ~f таблицу. Список цитируемой литературы состоит из/2 ¿работ.

• ' ' РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.'

1 .Субклонирование фрагмента геномной ДНК ИгоеорЬИа у1г111е. Для того, чтобы определить первичную структуру гена эстеразы 5- 1)гоБорМ1а У1г111з,' было проведено субклонирование

Рис. 1 Физическая карта плазмиды рУЕ 9, ссдерлэ.;цея ген зстеразы г БгогорГШа у1П11г. Заштрихованные прямоугольники обозначают экзоны гена зстеразы _. Б. Стрелкой обозначено направление транскрипции. 1НЗ-Н1п<!П1, РЛ-ЕсоРЛ, В1-В&11, С1-С1а1, ?1-Рг-и, В2-ВгШ, Х1-Х1ю1, Р.5-ЕсоЕУ, А1-ХЬа1, 21-5а11 )

фрагмента геномной ДНК Drosophlla virllis, содержащего ген.эстеразы S, . на субфрагменты, которые '■ затем были использованы для секвенирования. Область геномной ДНК Drosophlla virllis, содержащей ген эстеразы S. была клонирована в группе Ениколопова ( Yenlkolopov et al 19S3). На рис.1 приведена физическая карта клонированной области ДНК в составе плазмиды pBR322.

- В результате обработки данного клона со вставкой, общей протяженностью около 12 т.п.н., рестрикционноя эндонуклеазои EcoRl, было получено петь фрагментов клона рУЕ9, которые были клонированы в плазмиду'рис 19 в сайт рестрикционноя эндонуклеазы BàmHl.

Ген эстеразы S расположен в двух из пяти фрагментов ДНК, полученных.выше описанным образом. "Эти фрагмены были использованы для получения субфрагыентов ДНК, удобных для определения нуклеотид-ноя последовательности. Данные субфрагменты были получены методом среднестатистического растепления плазмиднои ДНК. ЛНКазоя 1 в присутствии ионов Mn"* (Lin et al., 1965). Затем субфрагменты отбирали при помощи электрофореза в агарозноы геле таким образом, чтобы отобранные клоны отличались друг от друга по длине на 150-250 п.н. Эти клоны были использованы для определения нуклеотидной последовательности ферментативным методом Сенгера I Sanger, 1977). Последовательность ДНК была прочитана несколько раз в обоих направлениях. Для некоторых участков ДНК были синтезированы олигонуклеотиды в качестве, праямеров для ферментативного метода секвенирования.

2. Анализ прочитанной нуклеотидной последовательности ДНК, содержащей ген эстеразы S> Drosophlla virllis.

Была определена нуклеотидная последовательность общей протяженностью 2,3 т.п.н. Компьютерный анализ прочитанной нуклеотидной последовательности выявил наличие длинной открытой рамки считывания.

Определение нуклеотидной последовательности кДНК позволило наяти сайты сплайсинга двух экзонов, из которых состоит ген эстеразы S, и определить длину интрона, разделяющего эти два экзона. Длина интрона составляет 59 н.

Длина ыРНК составляет 1806 нуклеотидов (без учета 3'-концевой polyt А ^-последовательности, добавляемой посттранскрипционно ). Длина полипептидноя цепи составляет - 542 аминокислоты' ! Рис.2). Мы предполагаем, что указанная структура соответствует проферменту и,

agaagaggag cttttataag ATAATTTTAC tattaaagac gcctctataa tgccaatgcc tttctcacgt gctgtctccg

tga cttcaaagta

ttctaagtga tacggggaga

ctcatttgcg ttcactttta

agttgctaag agcggaacaa

cccagaaact aagcgctgaa

aacaaatggc agagtcttaa

aaggggccag »ccatcggaac

gaacaaaact tagactcaag

ATTTTCAAAT ATATAAATTG

tttc jaacaa ttcaagtttg

tttgagctca cgaaagtcag cttagaaatg CCCAACTTCC attttgaaac taatcgaata tgaccataaa agctccgtcc

PI

gctgatattt cgcgtgattc gggaatcatc aaactctgtg tcagtttaac gctgtcttct jlagggagttg tgtgcacacc

ATG Met ACT Thr CAA Gin

GCA Ala TCA Ser ACC Thr

GAA Glu TTG Leu CGG Arg

ATA lie CCT Pro TAT Туг

CCT Pro CGT Arg CCC Pro

CGG CCC Arg Pro CCA Pro

CCT Pro AAT Asn AAG Lys

TAC AAG Tyr Lys CCA Pro

CAT His ATA Ile TTT Phe

GGA GTG' Gly Yal AGG Ar g

АСА Thr ACC Thr АСА Thr

TCT Ser GTG Yal ATT Ile

АТС Ile AAA Lys TGG Trp

33 s3. 123 173 223 •273 323 373 423

АТС Ile GCG Ala TTG Leu CTC Leu TGT CTG Cys Leu TTT Phe GCA Ala 468 15

CTG Leu CTC Leu GTG Yal GAG Glu TTG CCA Leu Pro AAT GGA Asn.Gly 513 30

GGA Gly TTC Phe TAT Туг TAC Туг AGC TAC Ser Туг GAG TCA Glu Ser 558 45

АТС Ile GAT Asp GAT Asp CTG Leu TC-C TTG Cys Leu GAA Glu GAA Glu 603 60

TGG Trp GAA Glu aat Asn ACC Thr TTT GAC Phe Asp GCG Ala act" Thr s48 75

CAG Gin TGG Trp AGTXAA Ser Gin CTC ATT Leu lie TCA Ser CAG Gin 693 90

GAG Glu GAC TGT Asp Су s СТА leu ACC GTC Thr Yal AGC Ser АТС Ile 738 105

CGC Arg АТС Ile tct Ser TTT Phe CCG GTG Pro Yal GTG Yal GCG Ala 783 120

TCA Ser ttt Phe ggt Gly GCT Ala GCG АТС Ala lie GAT, GAC Asp Asp 828 135

AGC Ser GGC Gly AAT Asn GTG Yal ATA GTG lie Yal GTG AAG Yal Lys 873 150

"TTG Leu GGT Gly TTT Phe ATG Met AGC ACT Ser Thr GGT GAT Gly Asp 918 165.

GGA Gly СТА Leu AAG Lys GAT asp CAG CGT Gin Arg CTG Leu GCA Ala 963 180

ATT Ile GCA Ala CGC Arg TTT Phe GGC GGA Gly Gly GAT CCA Asp Pro 1008 195

CAT AAT ATA ATT CTT CTC GGT TTC ACT АСА GGC GGC TCC TCG GTG 1053

His Asn lie lie leu Leu Gly Phe Ser Thr Gly Gly Ser Ser Yal 210

CAC TTG CAG CTT ATG CAC AAG GAA TAT GGA .CAG CTG GTG AAG GGG 1098

His Leu Gin Leu Met His Lys Glu Туг Gly Gin Leu Yal Lys Gly 225

GCC ATA TCC ATT ACT GGA ACT GCA ACG GTT CCC TGG GCT GTA CAG 1143

Ala Ile Ser Ile Ser Gly Thr Ala Thr Yal F¡ro Trp Ala Yal Gin 240

GCC AAT GCA CGT .GAT CTC GCA TTC CGA TAT GGC AAA CTC TTG GGT 1160

Ala Asn Ala Arg Asp Leu Ala Phe Arg Туг Gly Lys Leu Leu Gly 255

TGT AAT AAC CCT AAA AAT TCA CGC GAG CTG AAA GAT TGC CTG AAA 1233

Cys Asn Asn Pro Lys Asn Ser Arg Glu Leu Lys Asp Cys Leu Lys 270

AAA ACG GAT GCG GAA GAA TTC GTC AGC ACC ТТЛ AGG CAC CTT CAG 1278

Lys Jhr Asp Ala Glu Glu Phe Yal Ser Thr Leu Arg His Leu Glh 285

GTG TTT GAG TAT GTG CCT TTT GGT CCG TTT GGC CCA GTC GTA GAG 1323

Yal Phe Asp Tyr Tal Pro Phe Gly Pro Phe Gly Pro Yal Val Glu 300

TCC CCC GAA GTG GAA AGC CCC TTC CTC ACC GAG CTG CCC CTC GAC 1366

Ser Pro Glu Yal Glu SEr Pro Phe Leu Thr Glu Leu Pro Leu Asp 315

ACC АТС AGA ACT GGA AAC TTT GCT CAA GTG CCT TGG TTG GCC ' AGC 1413

Thr lie Arg Ser Gly Ásn Phe Ala Gin Yal Pro Trp Leu Ala Ser 330

TAC АСА CCC GAG AAT GGT АТС TAT AAC GCC GCT CTT CTT TTA GCT 1458

Tyr Thr Pro Glu Asn Gly lie Tyr Asn Ala Ala Leu Leu Leu Ala 345

AAG GAC GCC AAT GGT AAA GAG AGG ATT GAA GAG TTA AAC ACT CGC "l503

Lys Asp Ala Asn Gly Lys Glu Arg Ile Glu Glu Leu Asn Thr Arg 360

TGG AAC GAA CTG GCT CCA TAC TTT TTG GCT TAC CCA TAC АСА TTG 1548

Trp Asn Glu Leu Ala Pro Tyr Phe Leu Ala Tyr Pro Туг Thr Leu 375

AAG AGG.TCT GAA ATG AAT GCT CAT TCT CAG AAA CTG AAA TAT CAA 1593

Lys Arg Ser Glu Met Asn Ala His Ser Gin Lys-Leu Lys Tyr Gin 390

TAT СТА GGA TAT AAG AAC TTC AGC GTC GTA AAC TAT TTC GAT GTT 1638

Tyr Leu Gly lys Tyr Asn Phe Ser 'Yal Val Asn Tyr Phe Asp Yal 405

CAG CGC TTG TTT АСА AAC GAG TTG TAC AAA AAA GGC АТС GAA CTG 16S3

Gin Arg Leu Phe Thr Asn Glu Leu Tyr Lys Lys Gly Ile Glu Leu 420

TCA TTA GAT TCA CAT CGC AAG CAC GGA GCC AGC CCC GTC TAT GCG 1728

Ser Leu Asp Ala His Arg Lys His Gly Ala Ser Pro Yal Tyr Ala 435

TAC CTC TAC GAC AAT CCC GCG GAT AAG TCG CTG GCA CAA TTC CTG 1773

Tyr Yal Туг Asp Asn Pro Ala Asp Lys Ser Leu Ala Gin Phe Leu 450

GCC AAG AGA TCT.GAT ATA TCC TTG GGTAAGATAATGCTAATGCTCGAAATT 1624 Ala Lys Arg Ser Asp Ile SEr Leu G

GTGCAGTAACTAATATCAATGATCTATTCTCAGGC ACC GGA ATG GGC GAC GAT 1877

ly Thr Gly Met Gly Asp Asp 465

TAC TAT CTC TTG ATG AAC AAT CCA CTG CGT GAA CCG CTG CGA GCT 1922

Tvr T\71- Ion Ion liât Apr* àcn I>l-n Ion ¿T-ÍT f.lll Pl-л Toll ivrr £lft 4Я.Г)

X J * |f * Muu fawti ни к. г» л л ь/ * *л ¿ u^u ( i w «Я it« ^ 11 TOU

ГАС САС ААА АТС ОТТ ТСА ТСС ААй СТА СТС ААС АТС СТО САА САТ 1967

Агр С1и 1уз Не Уа1 5ег Тгр Ьув Ьеи Уа1 Ьуз Мег Уа1 С1и Агр 495

ТТС ССС ССС САС САй АСС ТТС втс ТАТ САС САС ТОТ СТС ТТС ССА 2012

РЬе А1а А1а Н1з С1и ТЬт 1еи Уа1 Туг Аэр Аэр Суэ Уа1 РЛе Рго 510

ААС ААС ТТС ССС ААА ААС ААА ТТС САС ТТС СТС СТС АТА ССА ССТ 2057 Авп Аэп 1.еи С1у Ьуэ 1.уз 1.у5 РЪе'СХп'Ьеи-Уа1 Уа1 11е Иу Аг^ . 525

ААС ТАТ ТТС ААС САА ТТС САА СТС САА ТО ТТТ <ХС ССА САС ССТ 2102

Аэп Туг Суз Ьуз С1п Ьеи С1и Уа1 С1и 5ег РИе А1а Агг Н1з С1у 540

СТС САА ТА А ТСТАССАССА ААТССААГГС ТААТТТАСТС АСХССАТСТС 2151

Уа1 Ип 542

ТАТСАААССА . ТСАААТС^АТ АСТССАТОГГ ТСТАААГГТС' ТАТАААТСТА 2201

- ТАТСТОКТА ТСТААТСТТС 1ССАШААА ТСАТСССАТТ АТТТААТААС 2251

ТСААААААААААААА

Рис.2 Нуклеотидная последовательность гена эстеразн 5 РгогорйНа •Лг111г и • предполагаемая аминокислотная последовательность зстеразы 5. Еозможные участки гликозилирования указаны вертикальной стрелкой. Инициирующие трансляция АТС кодоны подчеркнуты. ТАТА-бокса промоторов подчеркнуты воюистой чертой. Мажэркая участок инициации транскрипции взят 5 рамку.

а

что первые 16 триплетов_ гена кодируют сигнальный пептид, отщепляющийся при прохождении белка через мембрану (большая часть молекул эстеразы S секретируетсй в просвет семявыносящея луковицы). Этот участок белка- несет отличительные особенности сигнальных пептидов: "касаденность гидрофобными аминокислотами (12 из 16), наличие нескольких полярных аминокислот на N конце (Met-Thr-Gln) и гидрофобной аминокислоты с короткой.боковой цепью (Ala) в последнем положении сигнального пептида..

На границу между сигнальным пептидом и зрелым ферментом указывают также данные определения N-конца родственного фермента Est 6 Drosophlla melanogaster. Зрелый белок должен иметь, таким образом, длину 526 аминокислЬт и молекулярную массу 59220. Результаты биохимического изучения говорят о том, что белок эстеразы S Drosophlla vlrllls является гликопротеином. Анализ выведенной аминокислотной последовательности выявил несколько потенциальных участков N-гликозилирования по остаткам аспарагина. Данные предполагаемые участки гликозилирования обозначении на рис.2 стрелками. ■ г

3. Анализ аминокислотной последовательности эстеразы S Drosophlla vlrllls.

Сравнение эстеразы S Drosophlla vlrllls с другими исследованными эстеразами демонстрирует значительное сходство с карбоксилэстеразами млекопитающих и ацетилхолинэстеразами различных классов животных. Особенно велико сходство с аминокислотной последовательностью эстеразы 6 Drosophlla melanogaster, по своей физиологической роли соответсвующея"эс.теразе 5 Drosophlla vlrllls. Особенного внимания заслуживает .область белка с координатами 197-213. Данная область полипептиднол цепи максимально похожа на участок активных центров эстераз. Сравнение активных центров, различных эстераз приведено в таблице 1.

Из сравнения структур этих участков может быть выведена усредненная последовательность Gly-Glu-Ser-Ala-Gly-Gly-

-Ala-Ser-Val, общая для эстераз таких эволюционно далеких обьектов, как человек, скат, Drosophlla и др. Обращает на себя внимание тот факт, что положения остатков Gly и Ser весьма консервативно. На рис.. 3 . представлено сравнение аминокислотной последовательности эстеразы S Drosophlla vlrllls и эстеразы 6 Drosophlla melanogaster. Сравнение этих двух эстераз показывает, что наибольшим сходством

EstS AATATAATTCTTCTCGGTTTCAGTACAGGCGGCTCCTCGGTGCACTTGCAG AsnllelleLeuLeuGlyPheSerThrGlyGlySerSerYalHlsLeuGln 197 213

аминокислотная последовательность Происхождение зстеразы активного- центра.

Еб13 ЮгозорЫ1а у1г1115 n i i l l g f 5 т g g ; 3 3 y н i q

Еб-ЬО БговорМ1а пе1апоеаз1ег n y l l y g н s а g g a s y н l q

Ацетилхолинэстераза ската т y т i f g Е s А g g а 3 y g м н

Ацетилхолинзстераза угря g g £ s s е g а а g

Ализстераза лошади р g £ 5 а g а а 5

Холикэстераза человека s y т l f g е 3 а g а а 3 y s l н

Карбоксилзстераза курицы g Е 3 а g g 13

Карбоксилзстераза свиньи g £ 5 а g g е s

Карбоксилзстераза овцы < * g е 3 А g g е s

Карбоксилзстераза быка - g £ s а g g е s

Консенсус С Е 5'А ССА 5 Т

Табл.1 Сравнение активных центров зстераз различных видов и активного центра зстеразы 5 БговорЬПа vi.ri.lis.

зстераза S Drosophlla vlrllls зстераза 6 Drosophlla melanogaster

1 EST S M - T Q I L - L D I A- ,L L С L - - - F A

1 EST 6 • M N Y V G L G L I i Y L S с L W L G S N

16 EST S A S T L S N P L L Y E L P N G E L R G R

21 EST 6 - A S D T D D. P- L L Y -Q L P Q G К L R G R

36 EST. S p N G F Y Y S Y с S I P Y A E P . P I D D

41 EST 6 D Ñ G S Y Y S Y к 5 Í P Y A É P P T G . D

56 EST'S L С L E E P H P Y T E R W £ N T F D A T

61 EST 6 L R F É A 1 P E P Y К Q К W S D I F D Á T

76 EST S К P P Y D С L Q V 5 Q L I s Q P N К L T

SI EST 6 К T P Y A С L Q W D Q F T P G A N k L Y

96 EST S ' ? S E D r L T Y S • I Y К p К N L T R I S

101EST 6 G E к D С l T Y S Y Y k p k N S К R N S

116 EST S F P Y Y A H I F G G G w s F G A A 1 D D

121 EST 6 F P V Y A H i H G G A F M F G A À W Q ' N

136 EST S G Y П P F s- S S G N Y I Y Y К T T T E W

141 EST 6 G H E N Y M R E G К F i L' Y k I S Y R L

156 EST S E R L G F M S T G D S Y I P G N F G L k

161 EST 6 r* VI P L G F4 Y S T G D R D L P G M Y G i к

176 EST S D Q R L A I к У I R N N X A R F G, G D p

161 EST 6 ■ D •Q R L A i. k W ■ i Q N- i Á s p G G г D

196 EST S H N I I L L G F S T G G S Y К L Q M

201 EST 6 Q N V L L V G H S A G G À S Y H L Q M

216 EST S H К

220 EST 6 L P.

235 EST S - P

240 EST 6 D P

255 EST S G С

260 EST 6 G С

275 EST S ЕЕ

280 EST 6 S É

"295 EST S F G

300 EST 6 F S

315 EST 5 D T

320 EST 6 D Y

335 EST S N G

340 EST 6 D G

355 EST S ЕЕ

359 EST 5 1 D D

^ 375 EST S L К

379 EST 6 К T

?.95 EST S К N

399 ESI С Q R

415 EST S К К

419 EST 6 К N

E - Y G - Q L

É D F G Q .L

W A Y Q A N

W Y I Q К G

N N P К К S.

E S A E D S

F Y S T L R

L Y T À Y R

P Y Y E S P

P Y L E P S

I R S G N F

Í- К S G К F

I Y N • A A L

G Y N Á A L

L N T R W N

L' N E R- if L

R S E M N A

К К D M D D

F .S Y Y M Y

F D I E S Y

,G 1 Z j. S L

ST. Q E S L

Y К G A I S A R A A F S

A R D L A , F

 H G R Á F

R ELK 0 С

T S L К К С

H L Q Y F D

к F L i F S

E Y E S P F

D A P D A I

A Q Y P W L

G Q Y P Y? A

L L A К D A

L î. - К Ê H

E L A P Y F

É L Â P Y L

H S Q К L К

Y S R к i К

F D Y Q H L

S È L Q R L

D S H R К H

d l h îî к y

I S G T A "

F R G N A L

R- Y G К L L

E L G H N Y

L К- К T D ■ A

L К S К P A

Y Y P F G F

Y Y P F A F

L T E L P L

I T Q D P R

A S. Y T P E

Y S Y Y T É

N G К E R I

К S G I Y I

L A Y P Y T

L F Y R .D T

Y Q Y L G' Y Q E Y I G N

F T N E L Y

F T D I L F

G A 5 P Y Y

r- К S P A Y

435 ЕЗТ 5 439 £5Т 5

455 ЕЗТ "5 • 459 ЕЗТ б

475 Е5Т 5 479 ЕЗТ 6

494 ЕЭТ Б 499 ЕЗТ 6

512 Е5Т 3 519 ЕЗТ 6

531 ЕЗТ 5 539 ЕЭТ 6

= 542

А Г V V В М А . У У У В N

В I

I Б Т

А О К 3 I А А Ё к С I А

М С Б Б У У

В У. Б Р С Т У К С Б В У

Е

Е

I Н А Б Е К

ебуе мервео

Е Б К А - - А

А В . Р А 5 5 В

N I С -_К К К ' Р

3 У С 3 Е К Р

I Е V Е Э Р А

О Н V к - Р Р

НЕТ N03

о у

т

I У 5

I I г

I У У

¿ К У

О I Н Н С У

г с

Т V

а Р а у

а I

I ' т

У К' Е N

В Б С' Ё

н n i б

i а i а

М N

I У

Р I

С У

с в

У с с с

а з

Е Т

Р I Р У

М У м i

Р N

К ' В

К О n е

Ма1сйеБ/1еп^П = 50.0 регсегЛ

N

О

Рис. 3 Сравнение аюшокислотных ВговорЬПа 71ГШ5 и Ее1апо£аг1ег.' Двумя черточками аминокислотных остатков, двумя структуре аминокислота.

последовательностей эстеразы 3

зстеразы .6. . ВгсзсрЬПа

обозначено полное совпадение

точками обозначены близкие по

обладают N-концевые области зрелых белков, в то время как С-концевая область обладает наименьшей степенью сходства. Разная нуклеотидная • последовательность, не всегда приводит к замене кодируемым триплетом аминокислоты, . так что аминокислотные последовательности обладают большим' сходством по сравнению с нуклеотидными последовательностями мРНК, кодирующими эти эстеразы. На рис.. 4 представлены данные о.распределении гидрофобных участков в зстеразе S Drosophlla virllis.

4. Транскрипция гена эстеразы S In vitro. /'■' ■

В' upstream области гена эстеразы S были обнаружены две , последовательности, характерные для промоторов эукариотических клеток. Эти два участка ДНК, имеющие сходство с TATA боксами промоторов эукариотических клеток, отстоят друг от др'уга на расстоянии 342 пар нуклеотидов. Для того, чтобы определить возможность использования этих последовательностей в качестве промоторов была проведена транскрипция гена эстеразы 3 in vitro.

Система транскрипции РНК в условиях In vitro чувствительна к таким параметрам, как концентрация ■ экстракта и концентрация транскрибируемой ДНК в реакционной смеси iManley et al., 19S3). Так увеличение концентрации бесклеточного экстракта в полтора раза повитает эффективность транскрипции в три раза, а уменьшение концентрации в дза раза-может полностью подавить-транскрипцию. ' На" рНс.5 • представлены результаты S1 анализа транкрипшш РНК • в условиях in vitro с фрагмента гена эстеразы S, содержащего обе последовательности ДНК, имеющие сходство с TATA боксами промоторов эукариотических клеток. Разные концентрации ДНК и клеточного экстракта приводили к ,заметному изменению уровня транскрипции с промотора Р1 и мало влияли на работу промотора Р2. Эти данные позволили сделать предположение о том, что оба участка ДНК, обладающие сходством, с ТАТА-боксами промоторсз эукариотических организмов, являются истинными промоторами и могут быть' использованы в развитии Drosophlla virllis.

5. Транскрипция гена эстеразы 5 в онтогенезе Drosophlla virllis.

На рис.6 представлены результаты гибридизации тотальной РНК Drosophlla virllis с меченым зондом, соответствующим гену эстеразы '

-гзъегазе 3

48 \ 32 1

188 288 388 488 588

Ряс. 4 График распределения гидрофобных и гидрофильных участков 5 зстеразг 2 Вго5ор1Ц1а у1г111в. По оси абсцисс -порядковый ноыер аминокислотных остатков; по оси ординат -нарастание гидрофобности (в отрицательной зоне гидрофильные участки зстеразы 5!.

2.5

i г 5 9_ 5 7 _

622 am — - ' ~ ~ * -

309'1«

; C3

_ _ «„. PZ

; СЭ /<5(5 L

Рис.5 Транскрипция s .условиях In vitro альтернативных промоторов гена эстеразы S 1.-меченые маркерные фрагменты ДНК плазмиды рВН322, обработанной рестриктазой Нра II, 2.-исходный меченый зонд, 3.- контрольная гибридизация с тотальной РНК мыши, 4.- 5 мкл. бесклеточного экстракта, 5.- 7 мкл. бесклеточного экстракта, 6.-10 мкл. бесклеточного экстракта 7.-15 мкл. бесклеточного экстракта.

i 2 3 Ч 5~ С 7

¿3 'S3

Рис.6 Транскрипция гена эстеразы 5 в онтогенезе 1)го5ор!Ша у1гШб. Нозерн анализ. На дорожках приведены потультатм гиО™.1—РНК ."«чикск 2 — РНК 3 —

РНК 3-дневных самок, 4.- РНК 3-дневных самцов, 5.- РНК 10-дневных самок, б.- РНК 10-дневных самцов без бульбуса, 7.-РНК бульбуса 10 дневках самцов.

S.- В гибридизации была использована РНК, выделенная из личинок, куколок, - 3-днеБных санок, 3-дневных самцов, -10-дневных самок, 10-дневных' самцов -без. бульбуса, бульбуса десятидневных самцов. Максимальный уровень транскрипции этого гена наблюдается в бульбусе взрослого самца. Увеличение общего количества мРНК при проведении нозерн анализа позволило выявить слабую транскрипцию у самок после вылета имаго к у личинок третьего возраста (данные не приведены).

Эти данные хорошо согласуются с результатами S1 анализа, проведенным для'картирования 5' концевых областей мРНК эстеразы S Drosophlla vírills, транскрибируемой с промотора Р2. Результаты этого картирования позволили точно локализовать участки кэпирования мРНК, транскрибируемой с промотора ■ Р2. Распределение уровня транскрипции РНК показал, что мРНК эстеразы S появляется впервые у 3-хднезных самцов после вылета имаго. Затем уровень транскрипции заметно повышается и достигает максимального значения у .10-12 дневных -самцов после вылета имаго. У самок была отмечена очень слабая транскрипция мРНК эстеразы S 'с промотора Р2. Уровень транскрипции у самок в 50 раз ниже по сравнению максимальной транскрипционной активностью у самцов (Ениколопов и др., 1889 а) ' Картирование 5' концевой области мРНК гена эстеразы S, транскрибируемой с промотора Р1 ln vivo, показало наличие молекул мРНК, 5' концевые области которых отстоят от кэп сайтов популяции молекул мРНК, транскрибируемых с промотора Р2, на 340 нуклеотидов. Промотор Р1 включается у личинок в имагинальных дисках,'когда не работает промотор Р2. У взрослых самцов промотор Р1 работает в бульбусе, также как и промотор Р2. Уровень транскрипции с промотора Р1 в условиях ln vivo значительно ниже уровня транскрипции ыРНК с промотора Р2. Фактически, уровень транскрипции с'промотора Р1 ниже уровня транскрипции с промотора Р2 около 50 раз и приблизительно равен уровню транскрипции с промотора Р2 у самок.-

S1 анализ позволил выявить наличие этой мРНК только благодаря значительному увеличению обшего количества тотальной РНК, которая .была использована для проведения эксперимента. Так для-Sl анализа 5' концевой области этой мРНК в: реакцию было взято в двадцать раз больше тотальной ■ РНК- по ' сравнению с блот гибридизацией. Эффективность гибридизации в растворе выше по сравненению с гибридизацией ДНК на твердой фазе (Hames, Híggins, 1984). Таким образом сигнал, который может быть выявлен при помощи S1 анализа может быть не идентифицирован блот гибридизацией

(Ениколопов, Георгиев, 1989). Соотношение силы промоторов, также согласуется с данными транскрипции - в условиях In vitro. В этих условиях,- только .подобрав оптимальные для транскрипции условия, удавалось получить транскрипцию с промотора Р1, в то время как транскрипция с промотора Р2 мало зависела от незначительного изменения условий эксперимента.

Разный уровень транскрипции с обоих промоторов обусловлен, вероятно, наличием большого количества энхансероподобных структур, локализованных в'.upstream областгг по отношению к промотору Р2, а также наличием, специфических белковых факторов, которые могут значительно влиять на уровень транскрипции двух разных промоторов. Таким образом, контроль, над ■ уровне'м экспрессии' гена эстеразы S Drosophiia . vlrilis- осуществляется при помощи двух альтернативных промоторов, которые включаются на разных стадиях развития, в разных тканях и работают с разной эффективностью. Сила промотора Р2 значительно превышает силу промотора Р1 на всех стадиях развития Drosophiia. SI анализ мРНК, транскрибируемой с промотора Р1 на разных стадиях развития Drosophiia vlrilis, показывает, что эта мРНК появляется впервые у личинок III - возраста и локализуется в имагинальных' дисках. У куколок- не было отмечено появления этой мРНК. Эти данные говорят о том, что произошла временная активация промотора Р1, которая привела к синтезу мРНК гена зстеразы S с длинной лидерноя-последовательностью.. Затем промотор Р1 включается у однодневных и трехдневных самцов после вылета имаго и затем работает постоянно. У взрослых самцов, у которых удален бульбус, не отмечалось появления этой мРНК. Таким образом, можно сделать вывод о том, что основным местом локализации мРНК с длинным 5' концевым лидером у взрослого самца является бульбус. Интересным является также тот факт, что активация промотора происходит и в мальпигиевых сосудах. У самок Drosophiia vlrilis не отмечается активации промотора Р1 на всех стадиях развития.

Работа промотора Р2 представляет собой яркий пример, когда Функционирование промотора строго зависит от ткани, а также от стадии развития Drosophiia. По всея видимости включение промотора подчиняется- появлению белковых факторов, которые активируют промотор Р2. Работа- промотора Р1 также является стадие- и тканеспецифичноя. Однако, включение промотора на стадии личинки не приводит к синтезу полипептидноя цепи зстеразы S Drosophiia vlrilis (Ениколопов'1969; Ениколопов, Георгиев 1989).

Остается ряд еше не решенных вопросов. Почему сила промотора Р2 намного превосходит силу промотора Р1? Почему происходит в одной ткани работа двух промоторов, которая приводит к появлению двух типов ыРНК, различавшихся между собой длиной 5' нетранслирумой области? Происходит ли процесс появления полипептидной цепи при использовании в качестве матрицы мРНК с длинной 5' лидерной последовательностью?

6. Проведение функционального теста на роль 5' лидерной последовательности в регуляции трансляции.

Анализ -нуклеотиднои последовательности " 5' нетранслируемой области мРНК транскрибируемой с-промотора Р1 показал наличие в этой зоне трех коротких открытых рамок считывания. Эти три короткие открытые рамки считывания могут кодировать короткие пептиды длиной 9, 4, 11 аминокислотных остатка.-

Два инициирующих трансляцию . триплета АУГ находятся в нуклеотиднои окружении, которое хорошо согласуется с нуклеотидным окружением . активных инициирующих колонов, характерных для зукариотичег.ких организмов и уточненных для ЬгозорЪИа. Третья открытая рамка считывания начинается с АУГ кодона, нуклеотидное окружение которого не совпадает с нуклеотидным окружением активного для инициации трансляции кодона. Так>в изложении -3 по отношению к первому нуклеотиду АУГ кодона находится цитозин сместо пурина, в положении +4 вместо . гуанина расположен цитозин. Нуклеотидное окружение терминирующих кодонов пока исследованно недостаточно •полно и не выявленно ' каких-то ' наиболее характерных последовательностей . определявших' _ эффективность термивации трансляции (Сауепег ег а1., 1991 >._Наличие коротких открытых рамок считывания в ряде случаев может приводить к подавлению трансляции основной рамки считывания, кодирующей-полипептидную цепь.

Известно несколько генов, имеющих длинную 5' нетранепируемус область с несколькими короткими открытыми рамками считывания. В случае гена, кодирующего ССИ4. как это уже рассматривалось в литературном обзоре, наличие 4 коротких открытых рамок считывания приводило к- подавлению трансляции. Проведенные нуклеотидным замены в инициирующих кодонах показали разную зависимость изменения уровня трансляции в зависимости от того, какой из четырех АУГ ко дон был заменен на нейтральный. В то же время нуклеотидные замены в инициирующих кодонах коротких открытых

рамках считывания на примере гена С2 человека показали, что уровень трансляции не зависит от 'наличия коротких открытых рамок считывания, а зависит только от вторичной структуры 5' нетранслируемоп области РНК.

Для того, чтобы проверить как влияют открытые рамки считывания на уровень трансляции эстеразы S с мРНК, транскрибируемой с . промот&ра Р1, были проведены нуклеотидные замены в инициирующих и терминирующих кодонах во всех' трех коротких открытых рамках считывания.

Для исследования роли коротких открытых рамок считывания был использован вектор pSV2CAT (Гловер, 1967). В состав данного вектора входит.ген хлорамфениколацетилтрансферазы, который находится после сильного промотора вируса 5 Y 40. Ген CAT ¿¡шляется удобным инструментом для изучения зависимости уровня экспрессии генов от различных регуляторных факторов. Этот бактериальный ген полностью отсутствует в эукариотическмх клетках. Появление ' дата незначительного количества этого белка в лизатах эукариотических клеток легко детектируется. Конструкции pSY2CATt1> и pSY2CAT<2) были- изготовлены .таким образом, чтобы транскрибируемая с этих конструкций мРНК хлорамфениколацетилтрансферазы содерзала в 5' нетранслируемоя области фрагмент, содержащий три открытые рамки считывания эстеразы 3 и тот же фрагмент, но с замененными на 'нейтральные инициирующими и терминирующими трансляцию кодонами. соответственно.

На основании данных CAT Assay видно, что трансфекция конструкцией pSY2CAT(l) не приводила к появлению полипептидной цепи гена хлорамфениколацетилтрансферазы, так как не- было отмечено активности этого фермента в лизатах клеток. В то ж время трансфекция конструкцией pSY2CAT(2) -приводила к появлению полноценной полипептидноя * цепи, кодирующей фермент хлорамфениколацетилтрансферазы. Трансфекция обычной конструкцией pSY2CAT приводила к появлению такоя же активности гена CAT, как и при трансфекции клеток куриных фибробластов. конструкцией pSV2CAT(2). Результаты трансформации приведены на' рис. 7. Схема конструкций, использованных, в трансформации приведена на. рис.а. Таким образом^ можно сделать вывод о том, что вторичная структура 5' нетранслируемоя области мРНК эстеразы S. не влияет на" уровень трансляции белка CAT. В то же время наличие трех коротких открытых рамок считывания практически полностью подавляет инициацию

AcClPh

AcClPh

CIPh

■m

у . w

Рис.7 Результаты. CAT - Assay. ■ ~ . '

1. - хлораыфеникол," 2. - трансфекция конструкцией pSY2CAT(l) 3. - трансфекция конструкцией pSY2CAT(2), 4. - трансфекция .

конструкцией pSV2CAT. CIPh - хлорамфеникол, AcClPh - ацетклированные .формы хлорамфеникола.

0FC1 OPC2 0PC3

£SV2CAT( 1 )

5'cap mPHK CAT

AUG mPHK CAT

/W* ' -, / O'

I 4 > I

1ЛАЛ,

щ>омотор SY 40

CAT

sv 40

opci opes 0PC3

3 AUG заменены

ГШ-:-—-.......

pSY2CAT(2)

5'cap mPHK CAT AÜG mPHK CAT

¡VA

промотор SV 40

CAT

sv 40

Рис. Ô Схема конструкций pSУ2CATП) и р5У2САТ(.2 ).

трансляции ■ с четвертого инициирующего согласуются со сканирующей моделью предложенной М.Когак (Когак, 1978).

7. Заключение.

Для того, чтоОы объяснить существование двух альтернативных промоторов у гена зстеразы 5 СговорЬПа у1г111б можно предложить две гипотезы:

1) В имагикальных дисках личинок включается промотор Р1.

В этот период индивидуального развития в клетках происходит активации многих участков ДНК, но появление зстеразы 3 не желательно. В то же- время другие гены, кодирующие разнообразные ферменты, зависят от активации этих участков ДНК. и необходимы для процесса развития. В этот период индивидуального развития транскрипционные факторы активируют только промотор Р1. Промотор Р2 активируется у трехдневных самцов только в бульбусе.Появление специфического для промотора Р 2 транскрипционного фактора приводит к появлению мРНК, которая содержит только открытую рамку считывания зстеразы Э ВговорЛИа у1г111б , и к синтезу полноценного белка в клетках семявыносяших луковиц. На всех стадиях промотор Р2 сильнее промотора Р1. Появление мРНК большего размера не приводит к синтезу зстеразы Э, а только является следствием активации большего региона ДНК. Эта активация затрагивает локус эстераз и не специфически активирует промотор Р1.

Какие события, происходящие на молекулярно-гекетическом уровне могли привести в эволюции к подобному строению гена? Возможным вариантом могла бы быть последовательная цепь таких событий,. как дупликация гена, дивергенция промоторных областей с приобретением ими различной тканевой и.временной специфичности и далее элиминация .проксимального гена при неравном кроссинговере участков, содержащих сходные последовательности:.'

2) Другим объяснением существования двух промоторов перед геном зстеразы Б может быть наличие внутреннего сайта инициации трансляции в области мРНК, транскрибируемой с промотора Р1, лежащая в регионе от -33 нуклеотида до - 27 нуклеотида, считая от аденина, входящего в инициирующий кодон, с которого начинается трансляция зстеразы Б. Данный внутренний сайт инициации трансляции может быть использован .полирибосомами, которые связаны с клеточным матриксоы или с мембранами. Такие связанные полирибосомы . синтезируют

полипептидную цепь в строго определенную область клетки. В то ж время наличие в 5' нетранслируемои области мРНК, транскрибируемой с ■ промотора Р1, трех коротких открытых рамок считывания приводит к тому, что свободные цитоплазматические рибосомы не могут транслировать в цитоплазму белок эстеразы б. Таким образом, происходит регуляция места синтеза полипептидноя цепи эстеразы Б.

Трансляция мРНК, транскрибируемая с промотора Р2 осуществляется свободными цитоплазматическим полирибосомами в соответствии со сканирующее моделью 1Хо2ак, 1978).

Первая гипотеза предполагает наличие' случайного возникновения промотора Р1 при эволюционном развитии БгозорЬИа у1г111е. Короткие открытые рамки считывания в 5' лидерной последовательности мРНК эстеразы Э нивелируют негативное влияние неспецифической активации этого промотора.

' Второе предположение включает в себя более тонкий механизм регуляции экспрессии гена эстеразы Б и кажется более вероятным.

Какая из этих гипотез правильна покажут дальнейпие эксперименты.

. •■ Выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность "гена эстеразы Э ВгойорЬИа у1г111е обшея протяхеннностью 2250 п.н. Компьютерный анализ нуклеотидноя последовательности позволил найти две последовательности ДНК, имеющие сходство с ТАТА-боксами промоторов генов эукариотических организмов.

2. Определена предполагаемая аминокислотная последовательность эстеразы б. Наядены возможные участки гликозилирования. Проведен' сравнительный анализ аминокислотной последовательности предполагаемого активного центра эстераз животных, принадлежащих разным таксономическим группам.

3. Показано, что транскрипция гена эстеразы 5 ПгогорМ1а vi.ri.lis осуществляется при помощи двух альтернативных промоторов: дистального Р1 и проксимального Р2. '

4. Максимальная активность промотора Р2 наблюдается у 10-12 дневных самцов в бульбусе. Слабая активность промотора Р2. обнаружена у самок 5-10-дневного возраста. . Разница в уровне транскрипции у взрослых самок и самцов составляет более 50 раз. Активация

промотора Р2 приводит к синтезу полноценной полипептиднои цепи эстеразы S Drosophlla vlrllis. •

5; Активация дистального промотора ,Р1 не приводит к . синтезу полипептидной • цепи эстеразы S .Drosophlla vlrllis. 5' лидерная. oöfläcTb мРНК., транскрибируемая с промотора PI, содержит три коротких открытых рамки считывания. Показано, что эти три короткие открытые рамки считывания практически . полностью подавляют трансляцию. 6. Регуляция тканеспецифичноя экспрессии ■ гена эстеразы S у Drosophlla virills осуществляется ка трех уровнях: 1 ) транскрипционном, 2) выборе промотора 3 1 трансляционном.

Список работ опубликованных по теие диссертации:

1.Сергеев П.В., Кастильо Х.Э., Пеунова Н.И., Ениколопов Г.Н. ПерЕичная структура гена эстеразы S Drosophlla ' viriiis.// Биоорганическая химия, 1989, т.15, стр.839-343.

2.Ениколопов Г.Н., Малеванчук O.A., Пеунова Н.И., Ceprees П.В., Георгиев Г.П. Локус EST Drosophlla vlrllis'содержит два'родственных гена.// ДАН, 1989, т.306, стр. 1247-1250.

3.Сергеев П.В., Малеванчук O.A., Пеунова Н.И., Ениколопов Г.Н. Первичная структура локуса EST Drosophlla vlrllis.// Известия СО АН СССР, 1939, выпуск 2-й, стр.12.

4.Sergeev P.V., Yenikolopov ' G.N. The primary- structure of Drosophlla vlrllis esterases locus an¿ attenuation of esterase S gene translation.//- Abstracts 12th European Drosophlla Research Conference 1991 (Mainz).

Подписано к

Отпечатано на ротапринте в Производственном комбинате Литературного фонда СССР

печати/¿?/у>й./Ц

Формат бумаги 30x42/4 Объем 3_Г п.л. Зак. б3 Тир .{¿о