Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурных особенностей отдельных штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурных особенностей отдельных штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

>ГБ ОД

1 5 ДЕК 1996 На правах рукопису

Кириленко Сергій Дмитрович

УДК 619:616:575.11

ВИВЧЕННЯ СТРУКТУРНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ ОКРЕМИХ ШТАМІВ ТА ІЗОЛЯТІВ ВІРУСУ КЛАСИЧНОЇ ЧУМИ СВИНЕЙ

03.00.03 - молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук

Київ-1996

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАНУ та АМНУ професор В. А. Кордюм.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук О. П. Соломко, кандидат біологічних наук О. М. Живолуп. Ведуча організація: Інститут мікробіології і вірусології ім. академіка Заболотного НАН України

СУ,

Захист дисертації відбудеться іг'4 грудня 1996 року о _10_ годині на засіданні спеціалізованої ради Д 016. 011. 01 по захисту дисертацій на пошуканім вченого ступеню кандидата біологічних наук при Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою:

252143, Київ-627, вул. академіка Заболотного, 150. тел.: 266-55-96, факс: 266-97-59.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розіслано Ф листопада 1996 року.

вчений секретар спеціалізованої ради, канд. біол. наук

Вступ. Класична чума свиней (КЧС) с одним з найбільш небезпечних вірусних інфекційних захворювань, що наносить значні економічні збитки тваринництву в багатьох країнах світу, в тому числі, і в Україні. Збудником КЧС с вірус (ВКЧС) роду Ремігігш, віднесений до родини Flariririclae [ J. М. Collett, 1988]. На сьогоднішній день в країнах так званого поясу свинарства в ветеринарній практиці все частіше зустрічаються слабковірулентні ізоляти ВКЧС, які викликають імунну толерантність і довгочасне вірусоносійство, що приводить до появи атипових форм КЧС [А.Л.Семешіхин. 1095). Це, а також наявність перехресних реакцій з іншими пестивірусамн в серологічних дослідженнях, ускладнює діагностику хвороби. Складною проблемою залишається питания диференціації видів, штамів та ізолятів пестивірусів.

Погіршення епізоотичної ситуації по КЧС в останні роки, поява атпповнх форм інфекції на фоні циркуляції слабовірулентних ізолятів вірусу і широкого використання живих вакцин о країнах СНД робить актуальною не тільки своєчасну та точну діагностику збудника КЧС, але і аналіз популяції вірусу КЧС (ВКЧС) в кожному випадку спалаху захворювання. Оскільки ці проблеми постали перед усіма країнами з розвиненим свинарством, така ситуація зумовлює поглиблений вибір стратегічних напрямків досліджень, якими стають:

i) використання моноклональних антитіл (МКА) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для виявлення ВКЧС і диференціації його від інших пестивірусів;

ii) порівняльний аналіз геномів ізолятів, що зустрічаються на території країни;

iii) створення банків генів ВКЧС та їх філогенетичний аналіз; iv) експресія окремих генів ВКЧС в системах про- та еукаріотів та розробка на їх основі рекомбінантних вакцин та компонентів для діагностичних систем.

Як можливий шлях до вирішення проблеми масової скринінгової діагностики пропонується використання дешевого традиційного імуноферментного аналізу (ІФА), але такого, що базується на застосуванні рекомбінантних білків і моноклональних антитіл. Вважається, що висока специфічність таких компонентів дозволить зменшити або уникнути перехресних реакцій ї іншими представниками роду Pestivirus. Крім того,

продуценти рекомбінантних білків є джерелом отримання неінфекційного антигену в значних кількостях.

МЕТА ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. Головною метою пропонованої роботи було проведення досліджень, спрямованих на:- порівняльне вивчення геномів окремих ізолятів вірусу хласично'і чуми свинеіі, створення генно-інженерної системи отримання поверхневого білку ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней та вивчення його властивостей, розробка молекулярно-біологічних методів виявлення окремих ізолятів вірусу класичної чуми свиней.

Для виконання такого завдання було необхідно:

1. Отримати та клонувати фрагмент гену ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней, визначити ного первинну послідовність.

2. Провести пошук гомологііі первинної послідовності фрагменту гену ЕІ штаму Ші-Мшіь вірусу класичної чуми свиней до інших послідовностей, що наявні на цей час в комп'ютерних банках даних.

3. Провести порівняльний філогенетичний аналіз первинної послідовності фрагменту гену ЕІ штаму Ші-Мшіь вірусу класичної чуми свиней та гомологічних послідовностей інших'штамів цього вірусу, шо наявні на цей час в комп’ютерних банках даних.

4. Розробити генно-інженерну систему отримання фрагменту білку ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Е. соїі.

5. Провести дослідження, спрямовані на вивчення фізико-хімічішх властивостей отриманого рекомбінантного білку, з метою подальшого вивчення його імунологічних властивостей та використання як неінфекційного антигену для імуно-фермеитних дівгностикумів та рекомбінантних вакцин.

6. Розробити систему виявлення окремих ізолятів вірусу класичної чуми свинеіі на основі зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції.

7. Розробити систему порівняльного виявлення вірулентних та вакцинних штамів вірусу класичної чуми свиней із застосуванням технології молекулярної гібридизації на основі зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції

з

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ ТА ЇЇ ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ . За результатами роботи було розраховано та хімічно синтезовано оригінальну пару праіімерів, що дозволило розробити систему для виявлення вірусу класичної чуми свиней. на основі зворотпьо-траискриптазиої полімеразної ланцюгової реакиії. Ця система виявилася дуже інформативною і отримала високу оцінку практичних вірусологів. Вперше було клоновано фрагмент гену ЕІ вірулентного штаму Ші-Мннь вірусу класичної чуми свиней. Започатковано роботу по впровадженню розроблених методів в широку ветеринарно-вірусологічну практику. .

Вперше було визначено пфвинну послідовність фрагменту гену ЕІ вірулентного штаму Ші-Мннь вірусу класичної чуми свнней. Це дало змогу провести пошук гомологій первинної послідовності фрагменту гену ЕІ штаму Ші-Мннь вірусу класичної чуми свиней до інших послідовностей, що наявні на цей час в комп’ютерних банках даних. Вперше проведено порівняльний філогенетичний аналіз первинної послідовності фрагменту гену ЕІ вірулентного штаму Ші-Мннь вірусу класичної чуми свиней та гомологічних послідовностей інших штамів цього вірусу, що наявні на цей час в комп’ютерних банках даних. Було встановлено, шо штам Ші-Мннь який використовуються в країнах СНД, в тому числі-, і в Україні, як контрольний, та штам Альфорт, який використовується міжнародними рефереис-иентрами МЕБ як референтний, знаходяться на протилежних полюсах філогенетичного дерева різних штамів ВКЧС, нуклеотидні послідовності яких наявні в банках даних. Це дало змогу зробити деякі практичні висновки щодо доцільності пошуку та характернзації інших вірулентних штамів ВКЧС з метою використання їх в Україні як референтних для практичної вірусології. Інформацію ро иуклеотидну послідовності фрагменту гену ЕІ штиму ШІ-Минь вірусу класичної чуми свннеП було передано до міжнародного банку послідовностей ЕМВЬ.

З використанням аналізу даних різних літературних джерел щодо вклпду конкретних епітопів до загальних Імуногенних властивостей білкв ЕІ ВКЧС, розроблено генно-інженерну систему отримання фрагменту білку ЕІ штячу І1ІІ-

л

Мнмь вірусу класичної чуми свиней в Е. соїі. Отримання конкретно такого фрагменту не було описано раніше. Це дало змогу започаткувати нову роботу по вивченню імунологічних властивості рекомбінантного білка Е1 ВКЧС з -метою створення безвірусних неінфех цінних серологічних діагностикумів та рекомбіїшнтних вакцин. .

СТРУКТУРА І ОБ’ЄМ РОБОТИ. Дисертацію викладено на 100 стор. машинописного тексту та оформлено у відповідності з Інструктивним листом ВАК України № 3 від 5 липня 1994 року. Вона складається з вступу, огляду літератури, методичної частини, опису результатів та їх обговорення, та висновків. Роботу ілюстровано 8 малюнками та 2 таблицями. Список цитованої літератури містить 145 джерел.

• АПРОБАЦІЯ. Матеріали дисертації доповідались на міжнародній робочій нараді за участю провідних європейських вірусологів в ІВМ УААН від 27 вересня 1996 року. Дисертаційна робота пройшла апробацію на спільному науковому семінарі відділу біохімічної генетики та відділу регуляторних механізмів клітини ІМБіГ НАНУ рід 19 вересня 1996 року. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та 4 тези стендових доповідей.

ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ. В роботі використовували вірулентний штам ВКЧС Ші-Мннь, адаптований до леревивної культури клітин нирки свині РК-15, на рівні 37-го пасажу вданій системі (цей штам використовується в Україні для контрольного зараження свиней при перевірці імуногенних властивостей вакцин); зразки патматеріалів з господарств, де спостерігалась юстра форма хвороби, діагностовані на наявність ВКЧС референтними методами. Всі маніпуляції з інфекційними матеріалами проводились в лабораторії епізоотології Інституту ветеринарної медицини (ІВМ) УЛАН; матеріали були люб'язно надані провідним науковим співробітником Гршиок Л. П.. Препарат вакцинного штаму ВКЧС ЛК (культуральний, живий, атенуйований) був люб'язно наданий філією Контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок.

Виділення віріонної РНК проводили за схемою [D. Rasschacrt, 1988] з модифікаціями (освітленим лізат заражених клітин був переварений протеїназою К в присутності ДСН з послідуючою фенольною екстракцією). Комп'ютерний аналіз і підбір олігонуклеотндтіх праіімерів, які фланкують фрагмент гену Е1 ВКЧС, проводили з використанням програмного забезпечення Primer Detective (Clontech Labs., v. 1.01). Прямий праймер CHUM-A мас послідовність 5'* TTACCCACTTCCGTGACATTCG-3' та локалізацію па послідовності РИК шт. Brescia (М31768) 2647-2668, зворотній праймер CHUM-B 5'-

TATCTTCCTCCCAACAGTGCC-3' локалізується в позиціях 3492-3471. Синтез олігоцуклеотидшіх праіімерів був виконаний за фосфорамндитшім методом на ДНК-сннтезаторі Gene Assembler Special (Pharmacia).

Зворотню транскрипцію препарату вірусної РНК проводили за допомогою зворотньої траискриптазії із вірусу міслобластозу птахів, що була виділена у відділі біосинтезу НК та люб'язно надана Кавсаном В. М. (ІМБіГ НАНУ). ПЛР виконували на термоцмклері Gene Ataq Controller (Pharmacia) за звичайною методикою [R. К. Saiki, 1986], з модифікаціями для нашого об'єкту. Фрагмент ЗТ-ПЛР довжиною 845 п. н., що мав близько від країв сайти пізнавання ендопуклеаз рестрикції SacI та EcoRI (позиції на послідовності шт. Brescia 2668 та 3448 відповідно), був обробленийтвідповідиимн рестриктазамн, та вкорочений фрагмент довжиною 776 нт був елюііопаїїиіі із агарозного гелю за методом замороження з фенолом [F. Hojman, 1990], після чого клоноваїшй в вектор загального призначення pUC18 по відповідних сайтах рестнкції [F. Sanbrook, И89]. Перпинна послідовність фрагменту отриманої плазміди pUCl 8-776 було визначено за методикою [F. Sanger, 1977] на автоматизованому лазерному секвенаторі A.L.F. фірми Pharmacia з використанням Auto Read Sequencing Kit цієї ж фірми.

Після виконання електрофорезу в ТБЕх0.5, фарбування бромистим етидієм та фотографування, фрагменти ДНК були перенесені та імобілізовані на нітроцелюлозній мембрані Hybond-C Extra фірми Amersham по методиці [Е. М. Southern, 1975] у відповідності з методичними рекомендаціями цієї ж фірми.. Мічення діджоксідженіном (DIG) фрагментів ДНК, виділених із агарозного гелю, толекулярну гібридизацію та виявлення результатів гібридизації виконували за допомогою DIG DNA Labelling and Detection Kit фірми Boehringer Mannheim в жорстких умовах у відповідності з рекомендаціями виробника.

fi

Індукція культури Е. coli JMI09, що несла експресуючі плазміди, проводилась у відповідності з рекомендаціями фірми Pharmacia. Клітини руйнували на ультрозвуковому. дезінтеграторі MSE. Матеріал центрифугували, аліквоти осаду та сурернатаиту брали для приготування зразків для білкового денатуруючого електрофорезу в 12,5% ПААГ [U. К. Laemmli, 1970].

■ Глютатіон було імобілізовано на елоксі-активовану сефарозу 6В (Pharmacia) як рекомендовано виробником. Афінне очищення проводили в вільному об"смі в пробірках Eppendorf, як рекомендус фірма Pliarmacia. Нерозчинну в нормальних фізіологічних умовах білкову фракцію було розчинено в 8М розчині хлористого гуанідину та діалізовано супроти слабосольового буферного розчину. Діапізовані зразки центрифугували, аліквоти осаду та супернатанту брали для білковото електрофорезу. Сильнорозбавлені білкові зразки перед нанесенням на форез концентрували пересадженням почергово ТХУ та ацетоном у відповідності з рекомендаціями, люб”язно наданими Горловим Ю. І. (ІМБіГ НАНУ).

. Пошук через систему Internet по банках даних GeneBank, EMBL, PDB та DDBG послідовностей, шо мають виражену гомологію до послідовності клонованого фрагменту гену Е1 штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней, було виконано за допомогою сервера BLAST Network Service по алгоритму blastn. Подальший аналіз виконано за допомогою пакету PCGENE. Послідовності різних штамів та ізолятів ВКЧС було вирівняно до послідовності клонованого фрагменту за допомогою програми FSTNSCAN та гомологічні відрізки послідовностей ізольовані з точністю до І нуклеотиду. Далі фрагменти IS послідовностей штамів та ізолятів ВКЧС (включаючи Ші-Минь) довжиною 772 нт. було порівняно, консенсус і та деидрограму побудовано за допомогою програми множинного порівняння CLUSTAL. Сонсснсус 2 було побудовано шляхом порівняння цих же послідовностей та послідовностей, перерахованих нижче (див. » тексті, побудова консенсусу 2, мал. 6).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ. Нами було підібрано та синтезовано оригінальну пару олігонуклеотидних лраймеріа CHUM-A та CHUM-B, за допомогою яких можливо ампіфікувати фрагмент гену ЕІ вірусу класичної чуми свиней довжиною 845 п. н. (мал. І). Для виділення та очищення віріонної РНК був використаний простий метод [Ь. Rasschaert, 1988] лізису за допомогою ДСН та протеїнази К з послідуючою фенольною екстракцісю. Результатом процедури

1 2

3 4 5

щ) и

1968-

1700

1159

1093

805

514

, . і

мйкіаи

Ма.і. І. К-іск’ір^фореграча продуктів М- 11.11* 1

іір;ііімср<іміі СІІСЛІ-Л та СІІЬ'.М-И іа іі(к.мг.і|і.»тчи нук7ісїн<>ви\ кислот.

І - маркер величини фригменіін ДНК (іідроліз /ІН К фигу лямбда рссгрнккііою І’яІ. роїміри фраімсшіи икіНіші ліворуч). 2-5 - продукти ЧТ-ПЛР 1 нрсиара гамн нуклеїнових кислот і» зразків слідуючих іттчаїсріа.тіїг. 2 -

експерті» 45, суспензія лімф<>н\ і іа: .» - експертизи (>7, синения сс.тсііикчі: 4 -експерт іа 8У, с\сиснім селезінки: 5 - експортній

96, суспензія селезінки. Електрофоре! було

проведено а І % агарозі та в б>фері 0.5ХТВЕ.

були препарати сумарно» фракції нуклеїнових кислот, придатні для використаний простий метод-[В. КяіісЬяєгі, <9£І4~ лізису за •догіомогою-ДСЦ-та

Прдтпїіпчн К- і ппгашуіАчтл-ф^цпіт,иліл./-к-.гдудк-ііігіп Рріугіктмтпм прппрпури

були препарати бумарної фракції нуклеїновнх кислот,-придатні для використання в ЗТ-ПЛР навіть після продовженого зберігання під етиловим спиртом на протязі 6 місяців при -20 град. С або протягом 2 діб при кімнатній температурі (дані не приведені). Присутність геномиої ДНК свині або хромосомальної ДНК культур клітин не приводило до хибного відтворення ЗТ-ПЛР з прніімерами СНІШ-А та СНІ/М-В в контрольних експериментах (дані не приведені). Як вихідний матеріал для аналізів було використано зразки польових патматеріалів у вигляді 20 % суспензії різних органів або проморожені та освітлені зразки інфікованих культур клітин (табл. І).

На стадії зворотньої транскрипції для побудови кДНК в реакційну суміш вносилися обидва праймери, хоча для затравлювання РНК-залежного синтезу першого ланцюга кДНК на позитивному ланцюгу РНК необхідний тільки зворотній праймер. Відомо, що присутність прямого праймера стабілізує вихід кДНК [В. Ргепсії, 1994]. Крім того, добавляння обох праіімерів доречно з точки зору мінімізації потенційних похибок піпетування при відтворенні методики

Хгек- Область, спер- господзр-ство ТІШІ Пікова• група, стан ■ Наявність знак Використана вакцина Вид лгатепіалу , Результат тестування в ЛІФА: Результат ВПЯВЛС1ШЯ в:

клі- нічні патомор- фологічнї відби- ток в КК ОТ* Пир-ПЛР я

41 — — — — — Шгам Ші-Мппь, 41 й п*лсаж п ЇСК РКІ5 + НВ + +

— — -— *— — — Вакцина “ЛК"* м. Покров ми ив +/= -

67 Олсська, і

віл злгнолих свиней

“ЛК” Суспензія селезінки

- Покрои (20%)_________________

+/-

І і В

89 Київська,

від вимушено забитих свиней .

СВ

св

ВІНКИ

Сумської

біофабр.

Суспензій селезінки (20%)

ІІВ

95 Полтавська,

ви загішлих

7-місячішх

свішеіі

“ВПІКІГ Суспензія (20%): . Сумської селезінки

біофабр. лімфат. орли

________________________лізат інфік. КК

НВ

+

НВ

НВ

96 Полтавська,

СВ

від 2 * міс. поросяти

“ЛК-К” * Суспензія (20%);

селезінки:

лгснь

_________________________лізат ікфії.-. КК

НВ

НВ

НВ

11В

98 Донецька,

від 2 - міс. поросяти

“ЛК-К" РАН, с.№8

КК І'К-15, інфікована сусне нзісіо легень

103 Чернігівська,

від 2 - міс. поросяти

НД

нд

не вакциновані

Суспензія селезінки (20%) ____________

+/=

104 р-ка Крим,

від вимушено забитих свиней

СВ

вакци-

новані

Суспензія селезінки (20%)

+/=

107 Черкаська,

від безмоло-

зивнмх

поросят

СВ

“ЛК” Суспензія ССЛСЗІІІКН

Покроз (20%): пор. № 1 +

пор. № 2 +

____________________пор. .Уз 3___________+1-

+/=

+/=

Таб. І. Перелік зразків інфекційних матеріхіів, використаних різними методами. Позначення: + - позитивний результат; - -розподілення смужок на гедь-едектрофорезі, шо відрізнялось слабковчражені ознак»: НВ - не шгшячяті- НД -

в роботі. Подано короткі характеристики та результати тестувань негативний результат; +/- - неявно виражений результат; +/= -віл позитивного контролю та повторювалось па деяких зразках; СВ •

персоналом з мінімальною кваліфікацію для широкомасштабних діагностичних процедур. На малюнку І представлено типову картину електрофоретичного розподілення фрагментів ЗТ-ПЛР з праймерами CHUM-A та CHUM-B та препаратами нуклеїнових кислот. На доріжці 3 спостерігається смужка, що відповідає за своїм розміром фрагменту, близькому за величиною до 84S п.и..' Цей матеріал (експертиза 67, табл. 1) був взятий від загиблої дорослої вакцинованої тварини під час спалаху захворювання в Одеській області ЬЯЯЯШЯШШШ- При тестуванні референтним методом (МФА) картина була неявно вираженою. Клінічна та патоморфологічна картина протікання була сильно вираженою та нагадувала картину протікання африканської чуми свиней.

На доріжках 2, 4, 5 характеристичної смужки фрагментів ДНК не спостерігалося. Ці матеріали дали негативні результати виявлення. Цікаво, що на доріжку 2 з негативним результатом було нанесено продукт ампліфікації препарату, виділеного з суспензії лімфовузла, взятого від загиблої 7-місячиої тварини, перпарат селезінки якої (експертиза 95) виявився позитивним при виявленні у цій же системі (мал. 2а)'. Подібні результати були відмічені в роботі [S. Т. Liu, 1991). Така ситуація може розглядатися як випадок типового гострого протікання хвороби, що спричинений ізолятом ВКЧС, який несе свої власні особливості. ' '

Очевидно, що доріжка 3 була завантажена ампліфіковашім матеріалом нуклеїнових кислот з препарату, виділеного зі зразка, що містив геномну РНК ВКЧС. Таким чином, за допомогою ампліфікації послідовностей РНК методом двохстадінної зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції вдалося показати, що цей спалах, вірогідно, був викликаний сильновірулентним ізолятом ВКЧС.

Розбіжності результатів на доріжках 4, 5 (експертизи 89, 96 відповідно) з результатами виявлення референтними методами (див. табл. 1) можно віднести за рахунок наявності серед польових ізолятів атипових форм вірусу. Відомо, що для МФА використовуються поліклональні антитіла супроти вакцинних штамів ВКЧС. У випадку.сильно варіабельного вірусу, яким с ВКЧС, активності таких антитіл може бути недостатньо для ефективного пізнавання. Крім того, можливі варіанти вірусу, при яхих праймери можуть бути недостатньо комплементарні гсномніП РНК вірусу, що може привести до хибнонегатнвннх результатів. При проведенні процедур виявлення ВКЧС методом ЗТ-ПЛР нами було помічено, шо деякі зразки реіультуються в нетиповому розподіленні фрагментів

1 7 3 4 5В 7 В 9 10 11 1? 1.1 М

В

& ".V'~ tv ■

Мал. 2. А) Електрофореграма в 1 % агароіі та буфері 0,5Х THE рсстриктних фрагментів рскомГііііантшіх нлазмід та продуктів УГ-ПЛР. 1 - фрагменти гідролізу ендонуклеазами рестрикції SacI та EcoRI рекомбінаніної плазміди pUC18-776: 2 * 13 - продукти ЗТ-ПЛР з праймерами CHUM-A та CHUM-B та препаратами нуклеїнових кислот із слідуючих зразків: 2 -експертиза 95; 3. 10 - експертиза 104; 4, 6 - вакииниий препарат ЛК; 5 -патматеріал від тварини 2 експертизи 107; 7. 8. 9 - патматерінли експертизи 107 від тварин 3, 2, І відповідно; II - експертиза 103: 12 - 41-й пасаж ВКЧС шт. Ші-Мииь на культурі клітин РК-15; ІЗ - експертиза 98. М ■ маркер величини фрагментів ДНК (гідроліз ДНК фагу ля мода ресірнктаюю РмІ. розміри фрагментів вказані праворуч).

B) Гібридизація по Саузсрну і матеріалом, перенесеним з гелю Л та DIG*

міченим фрагментом 776 п. о. плазміди pUCI8-776, гідролізопаної SacI та КсоКІ. .

C) Контрольні лот-нанессніш для прослідковуванни специфічності та чутливості методів гібридизації та дстекціТ. Пояснення - в тексті.

іііі електрофореграмах (мал. 2а). Так, наприклад, на доріжці і (експертиза 104) відмічалися три смужки різної інтенсивності (приблизно 650, 400 та 300 п. н.), що не відповідають за своїми розмірами характеристичному фрагменту 845 п. и., в тоіі же час не будучи типовою картиною негативного результату (відсутність будь-яких смужок на фоні легкого шмеру). Такі результати в табл. І позначено як Ампліфікація матеріалу, виділеного зі зразка вакцинного препарату

ЯК, результувалася в аналогічне розподілення смужок (доріжки 4, 6). Електрофоретичні фрагменти з гелю, поданого на мал. 2а, було перенесено на нітроцелюлозну мембрану та згібридизовано з фрагментом 776 п. н. гену ЕІ шт. Ші-Минь вірусу КЧС (ЗасІ-ЕсоШ фрагмент плазміди риС!8-776), поміченим ОІС. Результати гібридизації подано на мал. 2а. Видно, що всі три нехарактеристичні фрагменти (650, 400 та 300 п. н.) не гібридизуються з фрагментом гену ЕІ ВКЧС у жорстких умовах, на відміну від характеристичного фрагменту 845 п. н., який добре гібридизується (доріжка 2, експертиза 95). Можно заключит, то нехарактеристичні фрагменти не мають вираженої гомології до фрагменту гену ЕІ ВКЧС. На мал. 2с приведені контрольні дот-нанесення для прослідковування специфічності та чутливості методів гібридизації та дегекції. В верхньому рядку нанесено розбавлення контрольного міченого зонду (контроль детекції), в другому - п'ятикратні розбавлення контрольної мішені (риС18-776), починаючи з 1 нг. Видно, шо чутливість методу була на рівні одиниць пікограмів, що достатньо для виявлення навіть незначної гомології.

Таким чином, за результатами цих дослідів можно припустити, що в деяких зразках патматеріалів (експертиза 103, 104, 107), шо були взяті під час спалахів з атиповим протіканням, викликаними слабовірулентннми формами вірусу КЧС, присутня форма вірусу, яка знаходиться також в зразку вакцинного препарату ЛК супроти чуми свиней.

Серед ідентифікованих структурних білків ВКЧС - капсндного р 14 (С), глікопротеїдів gp44/48 (Е2), ярЗЗ (ЕЗ), і gp55 (ЕІ) найбільш імуногенним € ЕІ: використання його рекомбінантного аналогу (експресованого в еукаріотах) ях субоднничної вакцини, навіть без трансмембранної області, було достатнім для формування у тварин протективної імунної відповіді. Віруснейтралізуючі антитіла формуються головним чином до ЕІ і в меншій мірі до Е2. Експресовані в Е. соїі як "злиті" білки, ЕІ та ЕЗ ВКЧС виявилися активними в 1ФА з МКА до

М:і_і. 3. Електрофореграма ресірикпіих фраімешів рском-^ Сіпаніііііч її.ілімі.і іа іфо.і)кіім К; 11.11*. І • маркер ін'Ліі'іішіі фрагменті ДІІІ\ (іідролії ДНК І;- фаг> лячбда рес ірикта юю РьіІ, І' розміри 'фрагментів вказані |( зліва); 2 - фрагмент іілролііу і ендоиуклеінамн рссірнкнії

ВатНІ та Г.соІІІ рскомоінаніної плазмілп риС 18-776: .> -

1 фрагменти і ілролізу

І епдоиуклеаіамн рссірнкнії

Ваші II іа І'соКІ рекоибіиапіиої плазмілп р(Л:.\-7ХЬ: 4 - продукт ТГ-П.'ІІ’ і ирліпіерамп ('ІІГ\1-Л іа С.ІНМ-В іа ЇМ ІК І$КЧС польовою ііолигу,

і ідралиовашііі ендопчклеа іамп рестрикції ХасІ іа НсоКІ: 5 - юіі же продукт, гідроліювашш тільки ЯасІ: 6 - той же продукт, без обробки рестрнкіазами.

ВКЧС, в т. ч. з такими, шо мали віруснеіітралізуючу активність [Р.А. van Rijn, 1994]. Одною з наших задач було отримання фрагменту поверхневого білку Е1 ВКЧС в Б. соїі. Оскільки послідовність геномної РНК шт. Ші-Мннь ще не було визначено, як вихідну матрицю для розрахунків було використано послідовність ВКЧС шт. Brescia, оскільки картування геномної області, що кодус структурні білки цього штаму, було виконане з синтезом відповідних пептидів і перевіркою специфічності отриманих на них антисироваток з натішними афінно очншеншімп вірусними білками [R. J. Moormami, 1990]. Виходячи з послідовності РНК цього штаму, нами були підібрані та синтезовані праймери CMUM-A та CHUM-B, що фланкують фрагмент гену білку ЕІ з сайтами пізнавання ендонуклеаз рестрикції Sacl (з З’-кінця фрагменту, позиція 2668 на РНК шт. Brescia) та EcoRI (з З'-кінця фрагменту, позиція 3448). На мал. З, доріжка 6, показано фрагмент ЗТ-ПЛР з праймерами CHUM-A та CHUM-B та віріонною РНК вірусу КЧС, шо була виділена зі зразка натматеріалу (експертиза 95). Розмір фрагменту співпадає з розрахунковим значенням в 845 п.н.. Після обробки цього фрагменту ендонуклеазою рестрикції Sacl розмір його зменшується до 819 л.н. (доріжка 5). Обробка EcoRI не приводить до подальшого зменшення розміру до 776 п.н.(доріжка 4), так як наявність нуклеотиднмх замін в РНК польового ізоляту по відношенню до РНК штаму

Brescia призводить до втрати відповідного сайту пізнавання. На доріжці З показано фрагменти подвійного гідролізу SacI та EcoRI рекомбінантної плазміди pUCI8-776, в якій по цих сайтах клоновамо фрагмент 776 п.н. кДНК штаму Ші-Мішь. В цьому штамі зберігаються як сайт SacI (2668), так і EcoRI (3448) (дині не приведені). Клонованіпі фрагмент у складі pUCI 8-776 було секвеновано та його послідовність порівняна з відповідними послідовностями референтних штамів ВКЧС. Це дало змогу зробити висновок, що клоновамиП фрагмент дійсно походить під кДНК вірусу КЧС.

На доріжці 2 приведено фрагменти подвійного гідролізу EcoRI та ВзтНІ рекомбінантної плазміди pGEX-786. В цін плазміді вищезгаданий фрагмент знаходиться у формі злитого з глютатіон S-трансферазою гену під контролем індупибельного промотора рТас. Індукція цієї плазміди u Е.соїі приводить до синтезу злитого білку розміром близько 59 кД (рис.2), в якому 27,5 кД походить під глютатіон S-трансферази та ЗІ кД являє собою рекомбінантно відтворену внутрішню частину білку El (gp51-55) ВКЧС штаму Ші-Минь.

Рекомбінантний білок 59 кД знаходиться голошиїм чином у нерозчиннії! фракції (доріжки 6, 7, 8, 9 ), на відміну від контрольної індукції вихідної плазміди pGEX-2T (доріжки І, 2, 3, 4), де синтезований білок 27 кД знаходиться як в нерозчинній фракції (осад) , так і' в розчинній (супернатаит). Білок 59 кД розчиняється в 8 М розчині хлористого гуанідину, але випадає в осад пріЧ діалізі супроти низькосольових буферних розчинів (дані не приведені).

На послідовності геномної РНК штаму Brescia білок ЕІ кодується нуклеотидними залишками 2428-353S [R. J. Moormann, 1990], розрахункова маса неглікозильованого білку - близько 44 кД; тобто, нами було відтворено значну частину (близько 70 %) білку ЕІ. N-кінець відтвореного фрагменту містить попередньо картований консервативний антигенний домени A [A. van Rijn, 1996], С-кінсць відтвореного фрагменту безпосередньо межує з гідрофобним трансмембранним доменом (кодується нуклеотидами 3454-3507 на РНК штаму Brescia) [[R. J. Moormann, 1990].

Експресія в Е.соїі супроводжується утворенням неглікозильованої форми вірусного білку, шо може накладати певні обмеження на його антигенні та імуногенні властивості. Зменшення імуногенної активності у неглікозильованнх білків може бути викликане зниженням їх резистентності до протеолізу і швидкою деградацією in vivo. В білковії! інженерії запропоновано правило,

и

12 3456 789

Мал. 4. Електрофореграма білкового ДСН-електрофорезу препаратів індукованих культур E.coli J!M109, що несуть експресуючі вектори pGEXIT або pGEX-786. 1,2 - різні кількості препарату осаду після озвучення індукованої культури JMI09[pGEX-2Tl; S, 4 - різні кількості препарату супернатанту після озвучення індукованої культури JMI09[pGEX-2T]; 5 -маркер молекулярних вагів білкових продуктів (LMW Kit фірми Pharmacia), розміри вказані зліва; 6, 7 - різні кількості препарату осаду після озвучення індукованої культури JMI09lpGEX-78(>|. 8, 9 • різні

кількості препарату супернатанту після озвучення індукованої культури J М109[pGEX-786J;

згідно якого амінокислота на N-кііші білку визначає час його деградації in vivo. В нашому випадку рекомбінантний білок ЕІ, експресованніі з вектора pGEX-786, після відщеплення тромбіном від носія глютатіон S-грансферази, несе на амінокіниі залишок глютамінової кислоти, яка може подовжувати час деградації, порівняно з багатьма іншими залишками. Для подальшого підвищення стабільності існують методи, які дозволяють маскувати центри протеолізу на білку. Іншим важливим стабілізуючим фактором білкової молекули е насиченість її дисульфіднпми зв'язками. Кількість і позиції цистеїновпх залишків, що формують иі зв”язки, взагалі відноситься до ро.зряду консервативних. характеристик вірусних гліхопротеїнів. Для Е1 вірусу КЧС показано [P. A. van Rijn, 1996], що його амінокінцева частина несе структурно незалежні дві антигенні субодиниці, на одній з яких знаходиться віісококонсервативний домен А, а на іншій • «консервативні В та С.

Принципове значення для збереження антигениих властивостей Е1 мають цистеїнові залишки Cys-792 {нумерація подана у відповідності і нумерацісю на загальному полі протеїні-попереднику штаму Brescia), що утворює днсульфідниП місток з Cys-856, і Cys-818 з Cys-828, які беруть участь в формуванні доменів А і D. В експресованому нами білху позиції цих амінокислотних залишків збережені, але питання відносно правильного згортання поліпептидного ланцюга і утворення дисульфідннх зв'язків між цими цнстіїновимн залишками потребуе подальшого вивчення.

Відомо, що для правильного згортання поліпептиту in vivo часто необхідне глікозклювання, але внесок олігосахаридніїх ланцюгів в оформлення антигенної унікальності глікопротеїнів ВКЧС ще не визначенні). Для білку ЕІ ВКЧС було показано [Е. Weiland, 1990], що більшість моноклональних антитіл, отриманих до ЕІ референтного штаму Alfort ВКЧС і нейтралізуючих вірус в стандартних серологічних реакціях, реагувала з бактеріальним злитим з глютатіон S-трансферазою фрагментом білку ЕІ .

Отримані нами результати являють собою початковий етап роботи по вивченню антигенних і імуногенних властивостей білків ВКЧС. Рекомбінаитний білок та антитіла до нього будуть використані для розробки систем виявлення пестивірусів серологічними методами; при вивченні антигенної різноманітності ЕІ у штамів ВКЧС різного походження (вірулентних, вакшінннх та польових ізолятів); вивченні механізмів, що визначають формування резистентності до КЧС у вакцинованих тварин, у яких відсутні віруснейтралізуючі антитіла.

Нами було клоновано фрагмент гену El (gp5l-55) штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней довжиною 776 нт та визначено його первинну иуклеотидну послідовність (мал. 5). Визначена послідовність починається з сайту пізнавання ендонуклеази рестрикції SacI (шо на гомологічній послідовності геномної РНК шт. Brcscia локалізується а позиції 2668) та закінчується за 8 нт від сайту пізнавання EcoRl (на РНК шт. Brescia - 3448). праймера у зв"язку з близькістю місця затравлювання до сайту EcoRI.

Визначену послідовність фрагменту гену ЕІ штаму Ші-Минь, довжиною 772 нт, використали для пошуку гомологічних послідовностей, що зареєстровані в банках послідовностей. В результаті пошуку було отримано 51 послідовність пестивірусів різної довжини і ступеню гомології з заданим фрагментом. З отриманного масиву для наступного молекулярно-генетичного аналізу були

Ідешнфі- канійний код (accession) Банк послідов ностеіі Штам чн ізолят ВКЧС Характеристика Позиція ділянки порівняння в послідовності Гомологія 3 Shi-Min

GenBank Shi-Min вірулентний 1 - 772 100 °о .

Х96550 EMBL CAP їірулентниіі 26X1 - 3452 96.8 %

Х717ЯО EMBL Weybridge вірулентний 709- 14X0 95.6 %

Х87939 EMBL Alfort-187 дв 2681 - 3452 95.3 %

Z46258 EMBL Chinese лапінізованний 26R1 - 3452 93.3%

А16790 EMBL Meyers G. дв . 2671 - 3442 82.8 “о

Z22525 EMBL Muylder-mans, G. дв 2667 - 3438 95.5%

J45478 GenBank Glentorf слабковірулентшііі 2661 - 3432 96.9 %

M31768 Gen Bank Brescia сильновірулентннй 2668 - 3439 91.5%

U45477 GenBank Riems вакцинний 2681 -3452 93.3%

J04358 GenBank Alfort елльновірулемтний 2671 -3442 «2.2%

U43924 GenBank Taiwan p97 дв 241 - 1012 83.7 %

L49347 GenBank p97 ДВ 2574 - 3345 83.6 %

D49532 DDBJ ALDflshi-kawu. 1995) ПОЛЬОВИЙ ізолят 2681 - 3452 95.1 %

D49S33 DDBJ CPE(-) вакцинний 2681 - 3452 94.9%

Таблиця 2. Штамп та ізоляти ВКЧС, послідошіості яких були використані при побудові консенсусе 1 та дсндрограмп. дв - дамі відсутні.

підібрані дві групи послідовностей: перша складалася з 14 штамів і ізолятів ВКЧС (таб. 2), вони містили відрізок послідошіості, гомологічний фрагменту 772 нт шт. Llli-Минь цілком; консенсус за результатами порівняння послідовностей в цій групі подано на мал. 5 (солі). До другої були додатково занесені послідовності (неповні) штамів LPC, ALD та ізоляту АІ9 ВКЧС, а також послідовності інших представників групи пестивірусув: 5 послідовностей вірусу вірусної діарс'С ВРХ (в тому числі референтні штами NADL, Oregon C24V, Singer, а також ізоляти BVD-BD3I, FBI.9I/I) та 2 послідовності вірусу прикордонної хвороби овець (штам Clover lane (Х8І8), ізолят L83/84); консенсус для иіс'і групи подано як соп2.

п САССТССТаТТСОАССССЛССААСССАТСААСТСАССЛААТСССЛСАТСАСТТССССТТС 60

ОПІ **, + * м ***** ( ***, •• ,*,*

оп2 * * • * * • * * * * в #в * в **»***•• * * ^ * * * *

СУ5 75;?

п ССССТСТСГССТТТССАТАССАСТССТаТТСТСАЛСССАААСТАСАЛТАСААСССТСТТС 120

ОПІ л*^****** * * * * * ( * * * * * * в * **в**^**^ * ^ ^

оп2' ** * »* ** * ** .* *. ** * .* *..**.* .*.*** .* ** *. *

• суязів суявгв

п ААСССТАСТССТГГСТАТСТТСТСГССХСААТЛССОТСОАСССатСТТАТЛСАС ГСГАСЛ 180

ОПІ ** ** *****,*. ** *■* ** ** ********_*****,***** _*****»*»**_

оп2 ** ** .** *. * * • * ** ** ., *,,***, **. . *... ** * •

П ССАСТаЛССССЛАСЛАСТСТСЛСАЛСАСАЛОТССТЛААОЛССТТСЛССЛСАСЛСЛАСССС 240

ОПІ .********** *♦,** ****,**»*.**.*«• ,■*♦,***♦****,**,»• ♦ *,**

оп2 . *. . ** *.. **.. **..*. ... *. *..*.*

Су5 85 6

п тттссаслслатлтопАТ№7итаАсслсслсаотсолсллтсААалтттАттсТАС'гот эоо

ОПІ *****, * **,.,,** ** ********* * »**,**,,* ***** ***** * **

оп2 * * * * * * * * * *

п ААТТСССаССССААСТССЛСАТСТСТСАЛАССТСААССАСТССТТТАСАСССССССССТС 360

ОПІ * * *********** *** ** * ******^ ** * #**#**** 4

оп2 . . .*.** ** *****,** + ,** * ** , .**.** .

п СТААЛЛСЛАТССАСАТССТСТСССТТССАСТТСЛАТСЛСССТСАСССАСТСССАСЛСТЛС 420 ***+*в*#>** **в******** ** ** ** в* *в# * в* **а*»***(«* ***

Эп2 ** ...***** *# * • ’♦ * * * ••• • * * * * * **. * * *

п ССТАТАОСТААСТССАТТТТССТАААТСССЛСАССТТАСАСААТАСТАСАТТСААСССАС 480 2П1 * * ***** ******** * ^ ^ ***** *********** ****^*** * * * ^ ^ * *

эп2 * **в’** *##** *в * ** * ** 9* ** **# ** ** #*

Г. Т^ТААСАСССЛТСаТСТТСТАЛТСЛССАСАаЛТСССАСТСЛТСАСТССТТОАТСССТЛАТ 54 0 эп1 ** ** **.** ** ** **^** ***** ,*.**,,, *********** ** ** ** эп2 ** .* **... ** ** * ** .. ** . ,.** * **

1 АСААСТаТСАЛССТССАТССАТСАСАТСЛААСАСТССаСССТАТСССЛТССАСАССТЛАЛ 600 эп1 ** ** *********** ** .****,*««* »_»***« *****_»» »*.** **,

і САСЛТТСТСТСТЛСТОСЛССАССГСТАЛССЛЛЛАСТТССТСТЛСАТТСЛЛСТЛСССЛААЛ 660

ЭП1 .*.** .“** ** * .*»****♦*.♦.******. ** ** ******** ***,****, ^

1 АСТТССААСЛАСАЛСТАСТАТСАССССЛССЄАСАССТЛТЇ"ГССАССААТЛТЛТССТСЛАС 720

ЗПІ ** *..** ***********.***** ** »***»_***♦* ***** **#

л ЄСССАСТАТСАСТАСТССТТТСЛССТССЛССТСАСТСАСССССССТАСССТТ 772

** ***** ** ********* * ***** * *** ****( * *% * *

1ал. 5. ЛІПОЖІІІІНЄ поріаііиііня послідошюстсП фрагментів гему Е1 (др51-55) оірусу іасіїчпоТ чуми сиіпісй. Для порівняння взято відрізки послідовностей довжиною ’2 нт, гомологічні послідовності шт. Ші-Минь. Приведено послідовність штаму Ші-инь. Інші послідовності, що порівнювались (див. тнбл. 2), не приведені. $11 -юііловііість шт. Ші-Мішь; соп - консенсус за результатами порівняння послідовностей

• штамів та ізолятів ВКЧС; соп2 - консенсус за результатами порівняння 18 штамі» та злятів ВКЧС, 5 штамів вірусу діареї ОІ’Х та 2 штамів вірусу прикордонної хвороби іець (подано для поіниііі І - 536 відносно нумерації послідовності шт. Ші-Минь), -пииія повністю консервативна, - позиція частково консервативна, відсутність ішачки - варіабельна позиція. Інші пояснення - в тексті.

Результати множинного порівняння нуклеотидних послідовностей наведено на мал. 5. На послідовності підкресленням виділено фрагмент, гомологічний послідовності шт. Brescia, що кодує пептид, антисироватка на який реагувала в імуноблотингу з нативним глікопротеїдом gpSI-SS з інфікованої ВКЧС культури клітин (R. J. Моогшапп, 1990]. Виділенням позначено положення триплетів, що кодують залишки цистеїну, які беруть участь у формуванні просторової структури поверхневого гліколротеїну Е1 ВКЧС в тій його частині, що охоплює попередньо картований внсококомсервативниіі антигенний домени A [P. A. van Rijn, 1996]. Ці залишки цистеїну зберігають консерватисність в приведеному порівнянні послідовностей різних штамів та ізолятів ВКЧС, а також в порівнянні цих же послідовностей з послідовностями S штамів вірусу діареї ВРХ та 2 штамів вірусу прикордонної хвороби овець.

Результати проведеного аналізу дозволяють розрахувати пари праймерів, які б максимально відповідали консенсусу 1 і були б специфічними для будь-якого штаму чи ізоляту ВКЧС. Ступінь гомології по гену Еі зі штамом Ші-Мимь в цій групі становить від 82,8% до 96,9% (uiT.AIfort і uiT.Glentorf, відповідно). Консенсус 2 дас можливість розрахувати праймери, які були б загальними для усіх представників'роду Pestivirus. Гомологія зі штамом Ші-Минь в ціії групі складає 65,2-66,2% для ВВД ВРХ і 68,8-69,0% для ВПХО. Подібні розрахунки доречні при проведенні діагностичних досліджень КЧС і диференціації ВКЧС від інших пестівірусів з використанням ЗТ-ПЛР.

Враховуючи, що в першій групі зібрані ізоляти та штами ВКЧС, які виділені в різних регіонах світу та в різний час, відрізняються між собою по ступеню вірулентності, а частина з них пов'язана між собою родинними взаємозв'язками, було проведено аналіз по визначенню генетичної відстані no ЕІ (gp5l-S5) між ними і штамом Ші-Минь. По результатах аналізу побудовано філогенетичне (еволюційне) дерево (мал. 6). Аналіз деіідрограми свідчить про блиікісгь (по гену ЕІ) штаму Ші'Минь до групи західно-європейських штамів ВКЧС (найбільша • з помірновірулентним штамом GlealorO і велику генетичну відстань з сильноеірулентним штамом Alfort, який використовується при діаіпоетиці КЧС в референс-центрах МЕБ та наукових лабораторіях в якості міжнародного референтного штаму ВКЧС. Позиція, яку займає штам Alfort не еволюційному дереві, вказує на те, що він знаходиться набагато ближче до спільного для усіх штамі» ВКЧС предка, ніж всі інші використані в аналізі

ч_

Shi-Min Glcntorf CAP

Weybridge Mui Hermans, G Alfort/187 ALD GPE (-)

Chinese

Riems

Brescia

_|— ■ Taiwan p/97

•wiWUugr*» or tlw

p/97 Meyers, G. Alfort

Мал. 6. Філогенетичне дерево, побудоване шляхом множішпого порівняння послідовностей фрагменту гену ЕІ (ер 51-55) різних штамів ВКЧС. Довжина гілок пропорційна запропонованій еволюційній дивергенції гілок (послідовностей), шо в свою чергу пропорційна середньому числу відмінностей на однії нуклеотидний Залишок. Точки дихотомічного ділення відповідають точкам еволюційної дивергенції.

ізоляти та штамп ВКЧС. Характер дендрограмн дас підстави припускати, шо для цього штаму характерна мала швидкість антигенного дрейфу порівняно зіншнми штамами ВКЧС. Це знаходить підтвердження в результатах повідомлення [14]: серед моноклональнмх антитіл, отриманих до ЕІ штаму Аіґогі, виявлені антитіла, що були специфічними тільки для цього штаму. Проведення порівняльного епітопного картування глікопротеїну ЕІ різних штамів та ізолятів дозволить ідентифікувати, які мутації нуклеотндної послідовності дали внесок в створення чи руйнування конкретних антигенних детермінант, та визначити характер антигенного дрейфу для штамів, віддалених один від одного на філогенетичному дереві.

Якщо розглядати використання протягом десятиліть штаму Ші-Минь для зцінки і відбору вакцин як своєрідний селекційний тиск на формування юпуляцііі вірусу в Україні, то особливої актуальності набувас рнділення лісцсвнх ізолятів ВКЧС з різною вірулентність», їх молекулярно-генетичний жаліз, епізоотичне картування регіонів по КЧС та оцінка еволюційних геиденцііі в популяціях ВКЧС в Україні. Результати проведеної роботи :творюють необхідні передумови для ефективного виконання таких досліджень.

ВИСНОВКИ

1. Клоновано фрагмент кДНК довжиною 776 пар нуклеотидіи гену ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней, визначено його первинну нуклеотндну послідовність. Інформацію передано до-міжнародного банку послідовностей ЕМВЬ.

2. Проведено пошук гомології) первинної послідовності фрагменту гену ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней до інших послідовностей, що наявні на цен час о комп'ютерних банках даних; знайдено та проаналізовано ступені голомогш, опрацьовано гомологічні послідовності.

3. Проведено порівняльний філогенетичний аналіз первинної послідовності фрагменту гену ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней та гомологічних послідовностей інших штамів цього вірусу; визначено місце, яке займає штам Ші-Минь на дендрограмі в порівнянні з іншими штамами.

4. Розроблено генно-інженерну систему отримання фрагменту білку ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Е. соїі.

5. Досліджено фізнхо-хімічшііс властивості отриманого рекомбінантного білку. Проведено попередні дослідження по вивченню його імунологічних властивостей з метою подальшого вивчення та використання як неінфекиіПного антигену для серологічних діагностнкумів та рекомбінактішх вакцин. Результати проведених досліджень лягли в основу теми державного планового завдання.

6. Розроблено систему виявлення окремих ізолятів вірусу класичної чуми свиней на основі зворотньо-гранскриптазної полімераіиої ланцюгової реакції. Результати направлено до референтного центру міжнародного епізоотологічного бюро (Пулавн, Польша).

«

7. Розроблено систему порівняльного виявлення вірулентних та вакцинних штамів вірусу класичної чуми свиней із застосуванням технології молекулярної гібридизації на основі зворотньо-транскриптизної полімеразної ланцюгової реакції. Результати проведених досліджень лягли в основу теми державного планового завдання.

За матеріалами дисертації опубліковано такі роботи:

S. D. Kirilenko. Е. G. Deriabina, О. N. Deriabin. Expression of Adenovirus Type

4 Hexon Protein in E. coll. II Adenovirus Workshop at the University of St Andrews. St. Andrews, Scotland, July 13-15, 1995, P. 55. •

С. П. Кипиленко. О. H. Дерябин, Е. Г. Дерябина, В. А. Кордюм, В. А. Бусол.

Классическая чума свиней: рекомбинантное воспроизведение оболочечного белка ЕІ для молекулярно-генетического анализа. // Мат. 2-і! междунар. конференции по мол.-ген. маркерам у животных. Киев, 1996, с. 58. ■

Кипиленко С. П. Дерябин О, Н„ Дерябина Е. Г., Кириленко О. Л..

Использование. ПЦР в молекулярно-биологическом анализе корона- п

пестивирусов свиней. // Мат. 2-й междунар. конференции по мол.-ген. маркерам у животных. Киев, 1996, с. 11.

Кипиленко С. П.. Дерябин О. Н., Дерябина Е. Г., Кириленко О. Л.

Молекулярно-генетический анализ корона- и пестивирусов свиней методами ОТ-ПЦР и гибридизации по Саузерну. // Материалы первой российско - украинской международной конференции "Проблемы' сохранения редких пород домашних животных и близкородственных диких видов" Москва, Пушино, 1996, с. 21-22.

С. П. Кипиленко. О. М. Дерябін', О. Л. Кириленко, О. Г. Дерябіна, В. О. Бусол. Клонування та надекспресія фрагменту гену структурного білку ЕІ штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli. Н Біополімери і клітина. -1996. -Т. 12; № 5, -С. 94-100. ' .

С. Д. Кипиленко. О. М. Дерябін, Б. ' М, Трояновський. О. О. Созінов.

Порівняльний філогенетичний аналіз кодуючої частини генів структурного білку ЕІ штаму Ші-Минь та інших штамів вірусу класичної чуми свиней. // Цитологія і генетика, -1997, -Т. ЗІ, (в друці).

С. Д. Кипиленко. О. Л. Кириленко, О. М. Дерябін, Ю. О. Чередник.

Порівняльне виявлення вірусу класичної чуми свинеГі (ВКЧС) за допомогою

зворотньо-транскриптизної полімер изної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) та молекулярної гібридизації. // Біополімери і клітина. -1996. -Т. 12, № 6, (в друці).

В. И. Глачко, С. П. Кипиленко. А. А. Созинов. Межлокусные ассоциации некоторых генетико-биохимических систем у крупного рогатого скота. II Гснетихв, 1997, (в печати).

Кириленко С. Д. Изучение структурных особенностей отдельных штаммов и юолятов вируса классической чумы свіпіеіі.

Защищается 8 научных работ, которые содержат теоретические исследования гомологии первичных последовательностей различных штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней (ВКЧС), а так же результаты экспериментальных исследований. Определена . нуклеотидная последовательность фрагмента длиной 772 п. о. гена El (gp 51-55) шамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней, проведен филогенетический анализ и множественное сравнение гомологичных фрагментов последовательности штамма Шк-Мынь к других штаммов и изолятов ВКЧС. Разработан чувствительный метод быстрого выявления ВКЧС в образцах патматериалов с помощью полимеразной цепной реакции. Получен продуцент рекомбинантного белка, воспроизводящего фрагмент (31 кД) поверхностного полипротеина 131 ВКЧС. Положено начало внеднению разработанных методов в широкую ветеринарпоо-вирусологическую практику.

S. D. Kirilenko. Study of structural peculiarities of some strains and isolates of classical swine fever virus.

The thesis comprises 8 research publications which contain both theoretical investigations of nucleic sequence homology of various strains and isolates of classical swine fever virus (CSFV) and results of experimental investigations. The primary nucleotide sequence 772 nt in length of EI(gp5l-55) gene of strain Slii-Min of CSFV has been determined; phylogenetic analysis and multiple alignment of homologuc fragments of strain Shi-Min and other strains and isolates of CSFV had been carried out. The rapid and sensitive method for detection of CSFV in field samples has been developed. The strain-producent of recombinant protein that reconstructs the internal fragment (31 kD) of envelope protein F.I of CSFV has been obtained. The application of methods developed into routine veterinary virology practice bus been initiated.

Ключові слова:

вірус класичні чуми свиней, поверхневий поліпроте'ні ЕІ, філогенетичний аналіз, рекомбінантний білок, полімеразни линнюгови реакція, виявлення вірус* специфічної нуклеїнової кислоти.