Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение стеринообразования у целлюлолитических микромицетов рода ASPERGILLUS

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение стеринообразования у целлюлолитических микромицетов рода ASPERGILLUS"

РГБ ОД'

Ite правах рукописи

-о л1/т 4ппс

ЛЕВЫКША "'I

Елена Николаевна

J

ИЗУЧЕНИЙ СТЕГМИ0ЭБРА300А1Ш у цшшаштэтЕскж ШКРОШЦЕТОВ РОДА. ASPERO IIXÜS

Специальность 03.00,23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сояскашэ ученой степени кандидата биологических наук

санк'Г-ПЕТЕРБЖ1 1995

, ■ ■ Работа выполнено на кафедре молекулярной биотехнологии Спккт-ШтерОургского государственного технологического институте (технического университета).

Научные руководители: '

доктор химических наук, * ГЙНАК

ирсфйссот^ .. Анатолий Иосифович,

кандидат биологических наук, ' СОКОЛОВ

доцент Виктор Николаевич ,

Офидаалшю оппоненты:

доктор химических наук, . ДШТРЕНКО

профзссор , - Леонид Васильевич

доктор биологических наук, ' МИХАЙЛОВА

' ' ведущий научный сотрудате ' Ны&тя Павловна

. Ведущая организация: Государственный Научно-Иссдодователь окнй Институт Особо Чистых Биопрепаратов (г. Санкт-Петербург)

Заа^г. а'диссертации состоится с/сУХ^-« 1995 г.

к . -1"' часов на заседании Диссертационного совота Л 033.25.09 при С.-Петербургском 1'осударствотюн Технологическом Институте (Техническом Университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Замечания и отзывы по дагаюй работе, заверенные гербовой печатью, в одном экземпляре просим направлять по адросу: 190013, С.-Петербург, Загородный пр., д. 49, СГОТИ(ТУ), Учешй Совет.

Апторефорат разослан " X( " СС^сг-^^^ 1995 г.

Учоный секретарь

Диссертационного Совета Д 063.25.09,

кандидат технических наук , -и, Лисицкая Т.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAT m

LMLs. Известно» что вешаства стере,ядаой природы находят широкое практические применение. Так, з медицина используют отерсАДдав гормоа. »"сардвчныэ гликозлда. глкксалкалоида; з сельском зозкйстве необходима т-гом ы грукоы 3, получаемые ко стерши, инсектицида, Лу„гшйды, стимуляторы роста растений, в электронной промышюн.юстЕ применяют кидаие кристаллы на основе в^иров халеотарм"а. 2 большинстве случаев эти цядукти пгсизродят яз дофкиитногс и чорогостоящого гашотного сырья. Находят применение и биотехнологический подход к реиеню этой проблем»• Так, создан бань, штаммов мьщрсоргегашсз - продуцентов е-чриноц различного происхождения (Михайлова Н.П. к др., IS87). Однако, подавляюще о большинство ¡.¿бон посвяшепо изучению сте-ринообразования у дрожжей, в частн^тга, сахаромицетов, являющихся на сегодняшний день п-юмышюыныки продуцентами эргосторина. Между тем, существуют данше о том, ч.о мицелий плесневого гриба (отход производстве поничиллдаа) содертат эргостерина в 2 раза изныло, чем в дротах, по стоимость мицелий в 20 р^з тта стоимости дроа~ай (ПЬвопоц-KFlo 1947).

Определенные роде мицблиалшых грибов, обладая модател комплексом целлкшолитическкх фереентейр лхособгш ксг;о.!ч-?о -затъ нетрадиционные целлюлозосодеркааг^ субстраты в качестве едикстввгтчого источника /глеро.ца. Определенного шечккия заслуигаеш" микромицеты роде ¿Epergillus, обличающееся высокой активностью ферментов целлшазнсго комплекса при росте на различных растительных субстратах. Содержание огери-ноз в пределах рода колеблется от С.15 до 0.84? <на сухой вес).

Использование мицэлая микроскопических грибов, культивируемых на дешевых растительных субстратах, ~ качестве енрья для получения старинов позволив значительно ставить кг. себестоимость. Кроме того, появляется оравннтелтно простой способ обогащения сельскохозяйственных кормовых культур Bin'svjm.w,! группы П, предшественниками которых являются соединения стероидной прщюди-

Связь теш с пленом научных раоот. Няс-">ящая раэота

}!йшлясь чагт в Еооледоилнкй заказ-парада 33.94 ГКВО РФ "Раз-,'раг5отха г .учиях лспоп процессе биогрансформпции оргпкичоо-5' кях вещоств и биополимеров".

Цр.*Ш И ^а.иэчп исследования. Настоящее зслодование догчящэко изучению СТОрШШОбрЙ'ЛОБпЩШ у микромицотон, способных. усвагазт . цв^люлозосодержащиэ субстраты в качество одипство.лого источника углерода.

"ля достижения поставленной цели необходимо решить; следующие задача? ...

- отобрать 'наиболее активные штампы микрооргвпизмов-.шлозодеструкторов;

" - изучать <|изисло1,о-йкох1№'часки0 и морфологические характеристики выбранных штаммов;

- пг"анеляпирс ,ать динамику накопления стеркнов микро- ; мяцотомя при вомв'-э источника углерода в среде и оценить качественные изменения в составе неомыляемий лшшдной фракции клоток,

- изучить процесс стеркнообразов&_ля в условиях совместного культивирования микроют'етов с культурами дрожжей.

Клучноя ковизада,, Ваервь' показана и исследована способность микром-дцетов рода Аерег0111ив синтезировать стероид-иш ооедиионил с л6,7-систомой сопряженных двойных связей на дашоцзлл! ;оышх субстратах из кормовых трав (овстмця-ргйгтасозый гибрид), произрастающих в Европейской части Похаяига увеличение количественного содержания стероидных соединений при использовании лигноцеллюлозных субстратов в качестве единственного источника углерода по сраваьчи» с кое -рольной глхясозпой сродой.

Впар&ые исслэдована динамик« синтеза эндоглюканаз, вкзоглязканеа и 0-глвкозидяз мккромацетши рода АврегдШив на лигношллмыаннХ'субстратах при глубинном культивировании.

Щ^куиу^ская значимость. Разработан мшфобиологкческий способ переработки и обогащения ценными штательымн веществами коиловых ку.гьтур (ОРТ); В продукте биоконверсии обнаружено высокое содаржанко. ненасыщенных ккрных кислот С1«:с* С10!Э^' незаменимых аминокислот: 'лизина, г_7ипто^она, циотша, & такаэ стероидных соединений - прад-шестренников витаминов группы Б, Среди представителей родч

s

Aspergillus этобраш ьотенциальныв продуценты стериг^р,

использующие целлкиозу в качестве эди 'стэсшног. источника углерода. '

Анализ оиопогичоскоГ 8iv. JBKC0T1I покачал поз опш'ггь использовашы продуктов биоконверсии в рь'дионьх cojii.cko»o-знйствошщ;. ¡¡твотпых и п-лщ,

Апробвтп работ». Результата работы били прздст.-ъкчин па' ш*71уиарод!гай конференции . , "Biotiiciuiolo^,

St-Petersburg*94" (С.-Петербург, 199-1), па шзэд1г родной симпозиуме "Хроматография и масс-сг^ктрометрия л аксл-те объектов окружающей среда" (С.-Петербург, 1994). По таые ^иссертавдг опубликовано' 1 печатных работа.

Объем и построение раОоч-^. Диссертация состоят .та ызо~ дения» четырех гнав, включаюдрт обзор литераг^ры, маторшш и метода, экспериментальную часть, обсукдогаю результатов, а также выводов и списке литература об-ш объемом 112 страниц машиногйыного текста. Робота содеркит 12 таблиц, 14 рисунков, список литературы включает 143 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ литературц состоит яз б-раздолоь, в которых прел-с'.авлепн сведения о строили и слойств х лт'аоцеллаяозннх материалов, механизме их ферментативного гидролизе, обоощо-ш дапше о структура, функциях и особ(._шоотях синтеза сто-рпнов у микроорганизмов.

Матер)'плы и методы. В работе исжш.зоааж 40 шяш'Мз микромицетов из коллекции кефэдрн молекулярной биотехнологии (Санкт-Петербургский Госудэрстпэшый Технологический Институт (Технический Университет) > я БС культур дротааэй, полученных из МГУ. " '

Отбор активных. целлкмглитичесьих микромицетов вели в два этапа. IIa первом этапе использовали метод двухотадвШо-го отбора: I. в условиях строгого элективного физиологического эксперимента при культивировании штаммов на среде вол Итерсона с фильтровальной бумагой (ФБ); 2. с испо-ъзовенжл» модифицированной среди Чапека-Докса II, содержащей в качестве источника углерода субо/рата с различным содержанием я структурой цолтлоьи: пшеничную солому 'ос), оэсяннцй-райграсовнй гибрид (ОРГ). На втором, этапе проводили глубин-

v.06 ху^ьтиви} эваяие наиболее активных целлюлозодэструкторов йй средах ч.глюгюаой и ОРТ в качестве единственного источника углерода.

Ияуч«нла морфологических и физгилого-С~ ^химических свойств ыикрсдацогов проводили о использованием общепрння-тах методов исс~едо: ашш.

Активность ферментов целлюлазного комплекса по ФБ (АбЯ), а также активность индивидуальны! компонентов определяли по Клвсову и лол1еовой л'й1эоов и др. с 1980; Логинова и др., 1986). Содержание белка в продгчте *) определят методом Лоури.

В получению. продуктах определяли содержание аминокислот, дишупв а жирных кислот. Общую «фракцию отеринов выделяли по методу Крен ка-Овздса а модификации Вудса экстрактов напсляршм рас таритемм чз омыленного путем щелочного гидролиза продукта Woods R.A., 19731. Ccjtbb стериновоЗ Фракции ш'^шзгфовагси методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), ИК-спак1гроокогош» УФ-спектрофо тс натрии. При исгтедо-ьагогл отершох-л фракций методом ТСХ использовал*: оледувдке свид-телн: эргасторин - полуродукт производства витамина Л2 ("Форишт", С.-Петербург), холестерин (Merck, Германия), 7-догвдрохолествриы (Sign». США.).

Эксггертш. алыше данные обрабатывали стандартными стЕтисткчоогам- методами [Ллойд, Ледерман, 193Э].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Oi-iiop мгасродацетов-целлплозодептрукгоров, способных использовать цаллюлоеу в качестве единственного источ-н"кв углевода.

Поиск кшсромяцетсв-цодлшозсдоструктороа na I этапе воли о условиях. поверхностного культивирования изучаемых культур ее селективных сродах с целлзапозосодаржащимя субстратам. Виауыжо наблвдения и макрос-копирование препаратов позволило оценить и сравнить характер и интенсивность роста культур м степень деградации ими источников i.mutwio-зк.

V) здв';ь п далее юд продетом подразумевается мицелий + HeymrtiJäifpoBEiMHfl оуСстрат.

Навд были отмечены культуры, получите ааибольшао кгп-ичество пологзствльнчх оценок ни лротяуэшш все /о времени

культивирования по следующим критер"чы: одабнй сплошной ила зояальшй рост (+); сплошной р от, наята-э атдолышт учагт-ксв деградации субсарьта (++); обильный |,ост, наличии 66-ширкых участков деградации субстргта '»•++); отсутствие роста (--).

Таблица I

Штамш микро?-щб лв-цоллЕ-.озодоптруйторов. ») •

Среда Чахгака-Доксв II Модафадаровьлша средэ Чапека-Докса II о ОРТ

Кс -»лекционный номер штамма V- Содержание белка в биомассе, % ц. г"1 Со/ортя-гаю белка в твердой фаза куль туралыюР жадности, % Степень утилизацот целлюловн, %

Т-060 0.039*0.002 50.3*0.8 0.017*0.00« 7.6*0.4 33.2*2.1

т.-г\2 0.033-0.002 43. <Я.5 0.015*0.001 7.3+0.4 30.4*2.4

Т-001 0.029+0.00? 40.5+2.1 0.014*0.001 7.0т0.3 31.2*2.2

Р-086 0.030*0.001 42.3*1.8 0.015+0. 301 7.2+0.4 29.4*2.0

Т-0Т0-2 0.027+0.00! 35.6+2.2 0.013+0.001 6.4*0.3 30.0*2.2

Р-084 0.025+0.001 32.5+3.5 0.012*0.001 7.0+0.4 28.4*2.1

'Г-059 ■0.019*0.001 40.3*2.6 0.009*0.001 7.5+0.4 25.6+2.0

Т-170 0,021?0.001 25.7*2.8 0.010*0.001 4.9*0.3 .23.1*2.1

2-041 0.017+0.002 31.5+3.6 0.003*0.001 5.5*0.4 22.3*1.6

1-174 0.015*0.001 20.8+0.9 0.СШ*0.001 4.6*0.2 19.1*1.8

* ? Ловэратэльнна интервалы для всех величин -Ю превышают 105.

Проведение: I этапа отбора параллельно в два стадия с использованием в качества силективша субстратов материалов с различным строением целлюлозы (преобладание кристаллических либо аморфних участков) позволило орвлв^ь оцотг/ сба-

в

' 'лансгярованнчсти цб-слюлагдого комплекса той или иной иссло-* дуемо? кухьуурн.

В табл. I продсташгеш .10 штаммов культур микромицо-тов, не'равших наибольиэе количество полонитель^^и оценок и облтдаицих наиболее полным цэллюлазным комплексом. Наиболее активными по ка.лчостау гюлокительшх оценок на данном этапе являются мякромицеты рода Aspergillus (штаммы T-0S0, Т-212, Т-001).

Рез^тьтаты II атапа отбора, проведенного в условиях глубинного культивирования, подтвердили лравомочность пред-п р^толышх оценок, сделанных на I этапе. Максимальными анг'ониями содержания белка в биомассе и продукте, удельных скоростей ^зоста и степени утилизации целлюлозы характеризуйте.. михр~'«щоты рома Aspergillus (табл. I). Два штамма этой культура, откаченные наилучшими показателями в результате двууятагашго отбора, били использованы для дальнейших исследований.

2. Биоиштоз ферментов целлплазного комплекса ышфэмицвтами Aspergillus fumlgatus Т-060 и Aspergillus niger Т~212 при глубинном культпвировапии на ОРГ.

Дшшмкку измонония активности цоллшазного комплекса, В1Угочапдего широкий спектр целлшолитических ферментов,

Рчс. Т Изменение ферыентдтивной активности микромицета Aspergillus fumipatus Т-060 в процессе глубинной ферментации на OFT: I - АФБ; 2 - эвдоглюканазная; з - цэллобиазная.

сцотетпля по яжетгагпш чох юбиазшй акитгосгя, эндомисо-

яаопой скткпсс'д: и по с^.мзртУ' снгчшоатк к й-В фпо. )

Кик шдно кз рис. I, ьшгйилалыюго окачита» вии-имг тгя

ф.грмот;1,-!! иоллю::э::иа!'п УО:М.копатглак.- л^ Б_б с.у'"-ш С-'Т)-"

оо :<;1;./> (к^-.ь пэтата гшт уаги гшчсгг уль-

гури, Обхпг. цо.я.чпльбп^л гк™~постт> АйрйГ£Ш.цв Лго^аеаив Т-050 .три кульи1В1гроп:11:нп ого на ОРТ прояшш'гси* б поркго 73^1 тгул^тянироччния и к кошу стационарной Фаш гюаха доа ;;начо1и^; 0.'""л>С,СП од/1/;; (рпс, II, отмэчоно ошрвьвшб ¡мшгыэшд цг^лаос «п-иопссти по

приоиагга!,-! л пн .ютмшсанавной при выращивать1, и гриба на стадо

-> Арп "«""¡птпщин яничомлб

вило 0.58+0.05 ед/мл, ондоглклапзной -» 0.38*0.02 ед/мл. Такой характер проявления ферментативной актитаости ш..5лн-дался о первых часов и может быть объяснен наличие-д в среде полисахаридов (олигооахаридсв). Закономерно предположит,, что изначальное присутствие в среде поли- а олигасахаридов

1?.0 1"0 100 то 200 22(1 'С.ЧЯО

Рис.2 Изменение ферментативной активности микромицеяа Аврэ^Шиа п1дег Т-212 в процессе культивирования на ОРГ: Т - афв; 2 - эядоглшанэзная; 3 - цоллобиазная.

объясняется частичным гидролизом целлюлозы, содэргащойся п субстрате, пртг провздотвг предобработки последнего.

Оперекаадее образование целлобиазной активности (0.97-тО.СВ ед/мл) наблюдается и щ адравшвшми : а ОРГ гриба Аерс-гуШиз 1й@зг Т-212, что подтвервдает виг сазанное выше

ю

вре^олозакит.(рис. 2). Максимальное значение эвдогликаказ-ной ектив^озти составляет 0.°т0.03 ед/мл.

3. Учкрс-чицет Аэрег^рШив Гш1еа(;ив Т-060 - продуцент бс яка и БАВ на лигноцеллюлозном суострате.

Исслэдозания бчоконворсии растительного субстрата ОРТ культурой гриба Аврег^Шив Гш^гив Т-060 показало, что культура, обладая активным . цeлJ^влoлитичel хим комплексом,, способна утилизировать данный субстрат и накапливать биомассу, сод ежащую 7,62 белка на 2-е сутки в условиях глубинной ферментации (табл.2). Для получеьля более полной информации о биологической ценности полученного продукта, представите го собой бомассу гриба АврегвШив 1ит1§аШв Т-060 и неутилазировашшЯ субстрат (ОНГР) в сравнении с биомассой, полученной ка глшозно" среде, (Р) и субстратом (ОРТ) нами было проведено изучение аминокислотного состава белкового препарата, проанализировано содержание лшшдов и их жирпокислотный состав (табл. 2).

Табища 2

Состав ОРТ, Р, ОРТ Р *), %

Кошоненты ОРТ Р ОРТ Р

Балок 2.30 20.30 7.60

Лизин 0.26 4.30 2.73

Цистш - 3.90 2.50

Липиды 0.70 8.60 5.50

йшолева*. кислота в липидной фракции Т7.40 27.20 35.60

Целлюлоза 35.70 - 19.6Э

*) Доверительные интервалы для всех величин не про витает IOS.

Ь ре ультате культивирования гриба AcpergilluB fuml-f.^tus Т-060 на 01л происходит обогащение субстрата белком, содеркавдам значительные количества практически всех «озамэ-

1t

шшых аминокислот. Так, содерэяшзе .ззша в С^Т F возросло 10.б раза по сравнении с содержанием в на тошном субстрате. Содер&авае цистйна в OFT F соет-аьляе» 2.ЬЖ,- прйЧем - в чио--том субстрате эта аминокислота не обнаружена.

В продукте биотрансформации Bospao.ae- также еодкраа- • ние 12 липидов, меняется их аириокислст-дй состав, а именно, ¡возрастает содержание нонасц^чзннпх жирных кис тот. Значительно возрос то содержание лино левой кислоты (35.(5% в_ CT Р по сравнеш.j с 17.4% в чистом субстрата).

4, Изменение качественного и количественного составов етериновнх Фракций микромкцвтсв рода Aspergillus nptt замене источника углерода ■ срэдэ.

Биологическая ценность продукта возрастает, если он обогащен такими биологически активкпя! Еэр^зтвами как витамины. Нашей задачей в данном случав являлось установить обогащают ли микромчцеты рода AapeiyUlua, утилизируя лиг-поцоллшозный субстрат; провитаминами группа L (старшими о Б,7~сопрлгхппой сксте?.«ой двойных. связей) шщгчазгя1Й продукт.

На данном этапе в раоте гояюльговаяись дна пгакгла-цоллюлозодеструктора: Aspergillus fual^gatxa T-C5Q и Asper-giiluo nlger 1-212.

Культивирование культур вот пзралтлыю не средах о глюкозой и с ОРГ в качестве источника углерода в эдзптичпш: условиях. :

Информация о структура ссздккикй с пндаяенннх пробах бала получена с помощьи метода ШС-свэктроскопип. Инфракрасные спектры регистрировались в тонком сдав на спектрофотометре "ИКС-29". Фракции, шдэлешшэ из различных источников, обладают в целда идентичной структурой, поскольку характеристические частота кооэбгший спрэдаяанншс груш молекул совпадают.

Наличие группировок -О-Я, ^С-И, -СЕ^-, -СЗ^ дает опрело ленные основания полагать, что исеивздашпз сбрязцы обладают структурой, ооответствувдзаг ссздашацян стзроаднов природа. Однако группы )С=0 и ~G-ß-C~ т является характерными для конечных продуктов в щют прзвразопия отеряпов. Можно предположить, что они нршаддаязт полупродуктам превращения стеринов на стадиях синтеза ацдкяаческях предпаст-

Банников стеринов до образования «свалена (группа >0=0, и циклических предшественников, предположительно 2,3-зпокси-сквалену (группа -¿¡С-О-Сс )■ Пока сложно делать однозначные выводы о том, является ли это следствием частичной блокировки синтеза стеринов на определенных стадиях, .либо его объясняется вкладом каких-либо примесей непосредственно из -субстрата, на.хсотором проводшюсь культивирование грибов.

Анализ полученных стериновых фракций методом ТСХ подтвердил присутствие • в экстрактах всех трех веществ-свидетелей (эргосторипа, холестерина, 7-

'дегидрохолэстерина). Однако подашюсти некоторых фракций отличались от поднижностей свидетелей видимо ввиду более варьированного состава стершовых фракций. Идентифицировать эти соединения данным методом не удалось. Кроме того, из литературных источников известно, что величину Rf определяет -'.эличество, а не расположение кратных СЕЯзей в молекуле старина. А это дает основание предположить присутствие р пр-бэх наряду с вьще.стваш-сввдегалши и других ■ веществ стероидной природа, близких к шм по природа двойных связей. ' • . .' '

Наиболее. полная информация 6 ■ присутствии в смеси сте-ринов с Д5,^-сопряженной системой двойных Связей былэ получена нами с помощью метода УФ-спектрофотометрик. Примекешш' в данном случав этого' метода dсновано на - том факте, что независимо'от структуры боковой'цапи • и наличия метальных групп у 0Д и С14 в провитамине D и у его аналогов диеновая система проявляется группой по^ос с максимумами при 261, 270, 282 и 293 нм.' На рис. 3' в 4 представлены УФ-оавктри стершовых фракций, выделенных' из A.niger Т-212 и A.iumlgatuB' Т-060, выращенных на средах, отличающихся источником углерода (глюкоза и ОРГ). 'На рис.• цраставлен Уф-сцвктр стериновой фракции дрожжевой культуры Succharomyces csrevlaxae, выбранный для сравнения.

Как видно из рис. 3, 4, Б, УФ-спектры стершовых фракций грибов имеют некоторые отличия от спектра поглощения стериновой фракции дрпггювой культуры. Они состоят в увеличении интенсивности поглощения в области 210-240 ил, что, возмогшо, указывает на наличиё в сиэси "холтста"-производкых стеринов. Наряду с максимума;«®, свойствешшш

0.5 4.

О. л

>л Г' >

о. г

I ^rv v\v/!

f

I

--1-1--b

220 2¿0 260 280 300 > , ЮЛ

Pite. 3 УФ-спектр стериновых фракций A.niger 'i'-212 I - рост на глюкозе; 2 - рост на ОРГ

А ' -сопряженной системе двойных связей, в УФ-спектрах А. nlger (на ОРГ) отмечаотся чаличио шах при 25¿ йм и плеча в

?,В5-26Л Ш. ЧТО СРИ^СТОЛГ.огпуо'а о етчлг'дэ коиттмготт-?cj с Агг'гл <гв)~соираяттоЯ системой дроШшх связей (про-дттолоки.тп лыго присутствии эргостй-Г>,'/,ий,24(28)-?отраон -3(3 -ол).

Нами '-'ила прояедепп колетестпеппая оценка компонентов с Л5' 7-сощшк>лшоЗ даоно.'юй системой п смэсях. Могодико KOJnrriOCTBOiKIOrO Опродохоняя есиоваип HG 'ГСМ фактп. что икг>я!сиваость полосы о максимумом в poííono 2йи ил иокямон-на. Результата определения стеринов предотавлош. а табл. 4.

Колгто етпоятягй внэ.тия содержания стершов с А5, '-иошзешгошюй системой проводггл« по грздуировочному графику, построенному для ергостерина.

Данные количественного анализа показивают, что с зеленой источника углерода (глюкоза на ОРГ) содержание стершов с л° •' -дионовоА систомой возрастает пртгблипйтзльпо г 1.6 раза.

Ня ОСЯОВПШП? ркспериманто-льних данных, демонстрирующих

нлилнио источника углерода но йиосинтоз отергаов, ногаю предположить, что этот процесс в глотках Ш1кром;п<отов-

Рис. 4 .УФ-спектр стершоБЫХ фракций А.Гш^Шв Т-ОбО. I - рост на глюкозе; 2 - роот на ОРТ

Рио. Б УФ-сгоктр стэршошх фракций БассМготусев сегег?1в1ае

целлшозодэструктсров папрямув связан с процессом ферментативного црэврадоакя 'лоллюлови чер?*з ряд промежуточэдх стадий в хушкозу, которая может функционировать . как индуктор оисоинтэзэ стеркнсв, а после превращения в ацетил-КоА - как субстрат (рис. S)„.

5, Ст0ршс<;(3разование в условиях совместного культивирования ¡асфскицота с ку.^ турами дробей на ОРГ.

Е рядэ случаев использование процессов, основанных на соваоесткзм культгэироЕаэди рааличних.микроорганизмов, дает положительные .результаты. В частности, проводились работы, доказавыиа вовыокиость использования ссмСгатЕчоскях *тяр микрошщв'л'-дроигевая культура для биоконверсии мелкого волокна а результатом которых явилось увеличение содержания белка в биомассе (Назарепко A.B., 1ЭГ,3).

В рамках нашей работы использование симбиотических пар культур микромице -дрожжи такие представляет интерес.

Таблица 4

результата анализов содержания Б.7-диенов в смесях стеринов

КОЛлеК-лйОЩЩЙ номер штачм источник углерода УФ> спектр!, н?л количество стеринов, % ОТ О.В.аЮ2

T-2I2 Aspergillus глюкоза 223, 236, 260,

niger 270, 280, 293 6.1*0.2

ОРГ 223, 234, 252,

2SG, 271, 282,

293' Ю.ОтО.З

Т-060 Aspergillus ГЛШ030 260, 270, 281,

fumigatua 290 11.9*0.2

ОРГ 232, 260, 270,

273, 282, 290 19.2*0.2

вндоглюканаеа , + цоилсОиогвдткзлоэп

целшлпое^ТТМ*-

'фВДОГЯОКВнаЗаДЪ^ , вкзоглгл<птмродаЬа\

цедлобйаза

V

пйрувзт

1 : '

ацетил-КоА.'

. метаболический 11уть '' Эмбдена-Шйе'огофа-Парйасв ,,

сквален'

ШИ

оксидрсквзден

лапостерин

I

°ИС. 6

эргостерин | (или другие конечные

■ продукты стериповой природа)

Биосинтез сторииов у микромицетов-целлшозодеструктороп

IT

Поело провэдегшя тестов на.антагонизм на^а были предложены следуодие пары:

АзрбГьШия fumiga tus T-G6G - Ic^Iol,./cea peaiolliatua;

АврагцШиЬ" "fumlgatus T-080 ~ Rliodotarulb rubia.

Подсадку дрожжевых культур прогодд и r<¡ 6~е сутки культивирования AspergillUs fumlgatua 'Г-060. ^ этот пер-од культура находится в стационарной фазе роста и является рктивяыч продуцентом целлвлаз. Дрохиа! при атом ассшлшшлукт продукты гк чролнза. Результаты анализа стартового состава выделанных фракций представлены в табл. Ь.

Таблица Б .

5 Ф-сцектрц сторнноп с Б,7-менавой системой ira фршалй продуктов, получениях при сгзместном культивировании гриба AspergillU0 fumiga tus Т-060 с культурап дроккей на ОРГ

коллекционный номер наименование культуры ' УФ-сгохтрн., нм

2704 2666 TellosycGs penicillatus Rhodotorula rubia 262, 271, 282, 293 252, 263, 270, 281, 293

ВЫВОДИ

1. В результате двухзтапного скрининга отобраны птыяш микроорганизмов, относящиеся. к' родам АврогзШия, Рвп1с11-11ш, Тг1оЬойегта, способные использовать в качестве одина-твенного источника углерода лзгноцеллшозпне субстратн на основе кормовых культур (ОРГ), Наибольшая способность к биодеградации указанных субстратов отмечена у штаммов: АврегвШия п1^ег Т-212, Азре^Шиз йдйвегёиа Т-060.

2. Показано» что пря глубинном культивировании микро-мидатов АврэгдШиа п1£ег п Аврег^Пиэ ГиайзаЧлв на ОРГ-оубстрате активность ферментов цодлизазпого кегашжеа достигает своего »«аксимума к 140 часу культиьяровалия а составляет для иеллобиазы 0.96 од/ил, А58 - 0.93 од/мл.

3. Впервые обнаружена спосо.'шсть микромяцетов Аврег-

gillus nlger и Aspergillua fumigatus синтезировать стерино-ше соединения с ДБ,7-системой сопряжеьлых двойных связей (предшественников витаминов группы D) на лигноцеллшшзвых субстратах.

4. В прод, .{те биоконверсии ОРТ-субстратов отмечено значительное содержание ненасыщенных жирных кислот - олеиновой (С1в:1),. линоловой (0ta;2), линоленовой (Сш.3).

Б. Аминокислотный анализ позволил установить наличие незаменимых, аминокислот: лизина - 2.73%, цистиыа - 2.Б0Ж в продукте биоконворсии ОРГ-субстрата.

6. Изучение биологической активности исследуемого про' дукта (OPFF) показало возможность использования его в рационах сельскохозяйственных животных и птиц.

Uo материалам диссертации опубликованы • следущие работы:

1. Исследование биоценоза системы биологическс! счистки Выборгского целлюлозно-бумажного комбината/ Е.Н.Яевыет-на, И.С.Марарьян, И.А.Сидоренко, С.А.Онохин, В. Н. Соколов Я.В.Зачиняев, Л.И.Гинак// Охрана'окружающей среда, вопросы экологии и контроль качества продукции. - 1894. - Вт. 3., -0. 17-21.' . .

2. Переработка растительного'сырья с целью получения' аналогов витаминов ■ группы р/. Е.Н.Левыюща,' А.АоГуревкч,

B.Н.Соколов, А.й.Гинэк// Охрана окружающей среда, ьопросы 8кологии и контрЬль качества продукции. - 1995. - Вып. I. -

C. 13-16.

• 3. E.'N.Levykina, A.A.Gurevich, V.U.Sokolov, A.I.Giiiak. Syntoeaie of ergosta-derivativea the predecessora oi group-D vitaailna, by micromycetea utlllßing lignocelluloae subst-ratea/ Program and abstracts, International conierance "Bioteijhnology St.-Petersburg'S4B, Sept..' 21-23, 1994. -St;-Petersburg, Ruaaia. - P. 156-157.

' 4. Е.Н.Левыкина, А.А.Гуревич, В.Н.Соколов, А.Н.Гшак Синтез ергоста-производных - предаествэнникои витаминов группы D микромицеташ, утилизирующими лигноцеллвдозкые субстраты// Тез. докл. международного симпозиума "Хроматография и масс-спектрсметрия в анализе объектов окру»ащэй среды», 3-7 окт» 1994 г.. - С .Петербург- 1994. - С. 247.