Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли субстанции в регуляции активности дофаминергических систем мозга при экспериментальном паркинсонизме

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли субстанции в регуляции активности дофаминергических систем мозга при экспериментальном паркинсонизме"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КРАСНОВА Ирина Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СУБСТАНЦИИ Р В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ СИСТЕМ МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ПАРКИНСОНИЗМЕ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной нейробиологии Института

мозга человека РАН.

Научный руководитель-

доктор биологических наук, профессор С.А.Дамбинова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.В.Арутюнян доктор биологических наук, профессор К.Б.Шаповалова

Ведущее учреждение-

Биологический факультет Московского государственного университета

заседании диссертационного совета К 063.57.09 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, С.-Петербург, Университетская наб., 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан PKnuxijlJL- 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Р.И.Коваленко

Защита состоится

часов на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Паркинсонизм является одной из наиболее распространенных форм экстрапирамидной патологии, возникающей вследствие выраженной дегенерации нигростриатных дофаминергических нейронов, которая приводит к снижению содержания дофамина (ДА) в стриатуме (Волошин, 1990; Aotsuka, Paulson, 1993; Bernheimeret al., 1973).

Препараты [_-3,4-дигидроксифенилаланина (L-ДОФА), предшественника ДА, компенсируют дефицит этого нейромедиатора в мозге, существенно сглаживая двигательные расстройства, наблюдаемые при данном заболевании. Однако, некоторые симптомы паркинсонизма толерантны по отношению к L-ДОФА; часто у пациентов появляются побочные эффекты, которые невозможно контролировать изменением дозировки препарата или режима терапии (Caraceni et al., 1991; Nutt, 1990; Ogawa, 1994). Кроме того продемонстрирована токсичность L-ДОФА по отношению к нейронам мезэнцефалона в культуре (Mena et al., 1993; Mytilineou et al., 1993) и эмбриональным ДА-ергическим нейронам, пересаженным крысам, с повреждениями, вызванными 6-гидроксидофамином (6-ГОДА) (Steece-Collier et al., 1990; Yureket al., 1991).

Участие других медиаторных систем, включая нейропептиды, в патогенезе паркинсонизма в последние годы привлекает пристальное внимание в попытке объяснить и скорректировать клиническую симптоматику при данном заболевании.

Предпосылкой к изучению роли субстанции Р (CP) при паркинсонизме послужило применение в клинике метода лечебных электростимуляций через долгосрочно вживленные электроды, разработанного академиком Н.П.Бехтеревой (1988). Анализ крови и спинномозговой жидкости пациентов на фоне выраженного эффекта лечебных электростимуляций показал повышение содержания веществ во фракциях с молекулярной массой, близкой к пептидам группы CP - тахикининам (Дамбинова, Корольков, 1990). На основе применения этих фракций, выделяемых из собственной плазмы крови больных, был разработан новый метод для лечения паркинсонизма, названный аутогемоликворотрансфузией (АГЛТ) (Бехтерева и др., 1987). Дальнейшим развитием метода АГЛТ явилось изучение возможностей коррекции двигательных расстройств у больных паркинсонизмом аналогами CP (Дамбинова и др., 1995).

Кроме того, анатомические, биохимические и фармакологические исследования последних лет показали наличие тесных функциональных связей между ДА-ергическими нейронами, и нейронами, синтезирующими CP в базальных

ганглиях (Hokfelt et al., 1991; Mendez et al., 1992; Reíd et al., 1990; Tamiya et al., 1990). Также было обнаружено, что повреждение ДА-ергических нейронов в черной субстанции, стриатуме и прилежащем ядре мозга больных паркинсонизмом сопровождается снижением уровня CP в этих структурах (Agig, Javoy-Agid, 1985; Fernandez et al., 1992; Sivam, 1991).

Однако, нейрохимические аспекты участия CP в метаболизме ДА при паркинсонизме практически не исследованы. В частности, не изучено влияние нейропептида на содержание ДА и на интенсивность обмена данного медиатора в структурах мозга, которые в первую очередь вовлекаются в патогенез заболевания. Казалось целесообразным исследовать проблему, связанную с определением роли CP при паркинсонизме.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение участия CP в регуляции активности ДА-ергических систем мозга при экспериментальном паркинсонизме.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать экспериментальную модель паркинсонизма у крыс, полученную при интравентрикулярном введении 6-ГОДА.

2. Изучить на экспериментальной модели паркинсонизма влияние интравен-трикулярного введения CP на содержание ДА и его основных метаболитов 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК) в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре мозга.

3. Исследовать действие CP на интенсивность метаболизма ДА в разных структурах мозга при экспериментальном паркинсонизме.

4. Изучить с помощью селективного антагониста специфичность действия CP на функциональную активность ДА-ергических систем мозга при экспериментальном паркинсонизме.

Научная новизна работы. Комплексно охарактеризована экспериментальная модель паркинсонизма, вызванная интравентрикулярным введением 6-ГОДА. Получены данные о том, что в результате у крыс развивается паркинсонический синдром, характеризующийся снижением двигательной активности, а также уменьшением уровня ДА и его метаболитов в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре мозга и соответствующим изменением величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА.

Впервые проведен анализ изменения активности ДА-ергических систем мозга, отражающих функциональные перестройки, вызванные введением CP, при

экспериментальном паркинсонизме. В результате работы установлено увеличение интенсивности обмена ДА в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре -структурах, непосредственно участвующих в организации двигательных и эмоциональных функций.

Впервые показано, что влияние СР на активность метаболизма ДА в исследованных структурах мозга при экспериментальном паркинсонизме является специфичным и полностью блокируется антагонистом этого нейропептида Спант 1.

Теоретическая значимость работы. Представленные в работе экспериментальные данные вносят существенный вклад в понимание механизмов нейропепти-дной регуляции и поддержания функций ДА-ергических систем мозга при паркинсонизме. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли СР в компенсаторных процессах, происходящих при экстрапирамидных расстройствах.

Практическая значимость работы. Модель экспериментального паркинсонизма может быть использована в целях скрининга фармакологических средств для лечения двигательных расстройств экстрапирамидной природы.

Результаты исследования демонстрируют возможность использования нейропептида СР и его синтетических аналогов для коррекции активности ДА-ергических систем мозга при паркинсонизме. Предполагается, что СР может стать основой в создании альтернативных или дополнительных препаратов пептидной природы для оптимизации терапии экстрапирамидных двигательных расстройств.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование интравентрикулярного введения 6-ГОДА является адекватной моделью для исследования механизмов ДА-ергической регуляции при паркинсонизме. Введение нейротоксина вызывает развитие тяжелого паркинсо-нического синдрома, проявляющегося в уменьшении двигательной активности экспериментальных животных и снижении уровня ДА и его метаболитов в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре - структурах мозга, участвующих в организации двигательных и эмоциональных функций.

2. Введение СР активирует метаболизм ДА в мозге при экспериментальном паркинсонизме. Изменения носят однонаправленный характер: в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре наблюдается повышение содержания ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в ответ на введение нейропептида. Наиболее выраженное влияние на интенсивность метаболизма ДА СР оказывает в стриатуме, где происходит нормализация величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА.

3. Эффект влияния CP на метаболизм ДА в мозге является специфичным. Увеличение концентрации ДА и его метаболитов в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре при экспериментальном паркинсонизме, вызванное введением CP, блокируется антагонистом Спант 1.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 1-м Европейском Конгрессе по клинической нейрофармакологии (Фрайбург, 1994), на Международном Симпозиуме "Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга" (Санкт-Петербург, 1994), на конференции Международной зимней школы молодых ученых по нейробиологии "Современные проблемы в изучении метаболизма мозга" (Санкт-Петербург, 1995), на 11-м Конгрессе Европейского нейрохимического общества (Гренинген, 1996), на Научной конференции по функциональной нейрохимии (Пущино, 1996).

По теме диссертации опубликовано 6 работ в отечественной и зарубежной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, иллюстрирована 12 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 270 наименований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на крысах-самцах линии Вистар весом 180220 г. Под гексеналовым наркозом (200 мг/кг) животным стереотаксически имплантировали в правый боковой желудочек мозга проводящие канюли по координатам: АР—ОД L—1.5, Н=3.5 (Фифкова, Маршал, 1962). Паркинсонизм моделировали при помощи интравентрикулярного введения 6-ГОДА (Serva) на седьмой день после операции. Для защиты норадренергической системы мозга животным внутрибрюшинно вводили мелипрамин в дозе 25 мг/кг за 30 мин до иньекции нейротоксина. 6-ГОДА вводили в дозе 300 мкг/крысу в 10 мкл физиологического раствора со скоростью 2.5 мкп/мин при помощи микрошприца объемом 25 мкл (Hamilton), соединенного с иньекционной канюлей. В качестве контроля использовали крыс, получавших иньекцию физиологического раствора.

Двигательную активность животных оценивали в тесте "открытого поля" (Буреш и др., 1991) через 14 дней после введения 6-ГОДА и сравнивали с двигательной активностью крыс контрольной группы.

В серии предварительных экспериментов были отработаны дозы СР, вызывающие повышение содержания ДА и его метаболитов в мозге и дозы Спант 1, специфически блокирующие действие СР.

В опытах с изучением влияния СР (НПО "Диа-фарм") на метаболизм ДА в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре крыс с экспериментальным паркинсонизмом животные были разделены на четыре группы: 1-я - абсолютный контроль (ложнооперированные крысы), 2-я - контроль по 6-ГОДА (6-ГОДА, 300 мкг + 10 мкп 0.9% NaCI), 3-я - экспериментальная группа (6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.065 нмоль), 4-я - экспериментальная группа (6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.65 нмоль).

В опытах nö' исследованию специфичности действия СР на метаболизм ДА в

1 7 9 11

мозге с помощью антагониста [D-Arg D-Trp ■ Leu ]СР (Спант 1) (НПО "Диа-фарм") животные были разделены на пять групп: 1-я - абсолютный контроль (ложнооперированные крысы), 2-я - контроль по 6-ГОДА (6-ГОДА, 300 мкг + 10 мкл 0.9% раствора NaCI), 3-я - контроль по СР (6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.4 нмоль), 4-я -экспериментальная группа (6-ГОДА, 300 мкг + Спант 1, 0.4 нмоль + СР, 0.4 нмоль), 5-я - экспериментальная группа (6-ГОДА, 300 мкг + Спант 1, 4.0 нмоль + СР, 0.4 нмоль).

Через 30 мин после введения исследуемых веществ животных декапити-ровали и выделяли стриатум, прилежащее ядро и фронтальную кору по атласу (Konig, Klippel, 1963). После выделения из мозга структуры взвешивали, затем гомогенизировали в 0.5 мл 0.1М хлорной кислоты, центрифугировали (10.000g, 20

мин, +4°С), осадок отбрасывали, а супернатант хранили при -70°С до проведения хроматографического анализа.

Количественный анализ ДА, ДОФУК и ГВК в структурах мозга проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим детектором (Краснова и др., 1996). Концентрации ДА и его метаболитов рассчитывали в нанограммах на милиграмм веса ткани.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли при помощи компьютерной программы Microstat с использованием t-параметра Стьюдента. В качестве критерия достоверности принимали р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика двигательной активности животных и содержания ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в структурах мозга после интравентрикулярного введения 6-ГОДА

В результате проведенного исследования обнаружено, что введение 6-ГОДА вызывает у животных отчетливые явления паркинсонического синдрома в виде олигокинезии, проявлявшейся резким снижением числа пересеченных квадратов до 7.4+1.8 по сравнению с 27.5±1.5 у крыс контрольной группы (р<0.01) и уменьшением количества вертикальных стоек до 0.2±0.1 при контрольных значениях 7.1 ±0.8 (р<0.01).

Введение 6-ГОДА вызывало резкое снижение концентрации ДА в стриатуме с 7.348±0.323 нг/мг ткани до 1.244±0.266 нг/мг ткани, на 83% по сравнению с уровнем этого соединения в контрольной группе (р<0.01). Содержание ДА в других исследованных структурах мозга изменялось аналогично: в прилежащем ядре наблюдалось уменьшение его концентрации с 6.060±0.257 нг/мг ткани до 1.538+0.233 нг/мг ткани, на 75%, во фронтальной коре - с 0.166±0.028 нг/мг ткани до 0.065+0.004 нг/мг ткани, на 61% по сравнению с контролем (р<0.01).

Функциональную активность ДА-ергических систем мозга оценивали по изменению уровней метаболитов ДА и по величине отношений метаболит/медиатор: ДОФУК/ДА И ГВК/ДА (Русоск, ТаЬегпег, 1981).

В результате введения 6-ГОДА в стриатуме наблюдалось резкое снижение концентрации ДОФУК до 0.193±0.032 нг/мг ткани, на 76%, при контрольной величине 0.790±0.049 нг/мг ткани (р<0.01) и ГВК до 0.166±0.022 нг/мг ткани, на 69% по сравнению с 0.424±0.035 нг/мг ткани в контроле (р<0.01). В прилежащем ядре отмечалось аналогичное уменьшение уровней ДОФУК и ГВК с 0.838±0.040 нг/мг ткани и 0.352+0.019 нг/мг ткани в контроле до 0.262±0.032 нг/мг ткани и 0.139+0.023 нг/мг ткани, (на 69% и 61%, соответственно), р<0.01. Во фронтальной коре введение нейротоксина также вызывало снижение концентрации метаболитов: ДОФУК с 0.034±0.003 нг/мг ткани до 0.014±0.001 нг/мг ткани, на 59% (р<0.01) и ГВК с 0.03210.005 нг/мг ткани до 0.019±0.002 нг/мг ткани, на 41% (р<0.05).

В стриатуме отношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА, возрастали вследствие введения 6-ГОДА с 0.139+0.007 в контроле до 0.174+0.010, на 51% (р<0.01) и с 0.058±0.003 до 0.091+0.011, на 47% (р<0.01), соответственно. Отношения метаболит/медиатор в прилежащем ядре также достоверно увеличивались:

ДОФУК/ДА до 0.162±0.020 при контрольной величине 0.107+0.003, на 25% (р<0.01) и ГВК/ДА до 0.091 ±0.011 по сравнению с контрольным значением 0.058±0.003, на 57% (р<0.01). Во фронтальной коре введение нейротоксина не вызывало достоверных изменений в величинах отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА.

Полученные данные свидетельствуют об изменении функциональной активности ДА-ергических систем мозга при экспериментальном паркинсонизме у крыс. Отмечается резкое снижение концентраций ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в структурах мозга: стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре вследствие интравентрикулярного введения 6-ГОДА, особенно выраженное в стриатуме.

. 2. Изменение содержания ДА и его метаболитов в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре крыс с экспериментальным паркинсонизмом после интравентрикулярного введения СР.

Данные, отражающие влияние нейропептида на концентрации ДА и его метаболитов в стриатуме представлены на рис. 1. При экспериментальном паркинсонизме наблюдалось резкое снижение уровней ДА, ДОФУК и ГВК в этой структуре. СР в дозе 0.065 нмоль не вызывала достоверных изменений в содержании исследованных соединений. Введение СР в дозе 0.65 нмоль за 30 мин до декапи-тации приводило к значительному повышению содержания ДА и его метаболитов в стриатуме крыс не фоне разрушения ДА-ергических нейронов, вызванного 6-ГОДА. Концентрация медиатора повысилась на 233%, метаболитов: ДОФУК - на 159% и ГВК - на 106% по сравнению с данными, полученными для животных, которым вводили физиологический раствор. Иньекция 6-ГОДА приводила к увеличению индексов ДОФУК/ДА и ГВК/ДА по сравнению с контролем. В результате введения СР в дозе 0.65 нмоль наблюдали нормализацию величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА, которая выражалась в их снижении на 25 и 41% соответственно.

На рис. 2 представлены данные о влиянии СР на концентрации ДА, ДОФУК и ГВК в прилежащем ядре крыс с экспериментальным паркинсонизмом. Введение нейротоксина вызывало снижение содержания ДА и его метаболитов в этой структуре мозга. Через 30 мин после иньекции СР в дозе 0.065 нмоль не происходило достоверных изменений содержания исследованных соединений в прилежащем ядре по сравнению с таковыми для животных, которым вводили физиологический

ДА

**

1,0 л

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

ДОФУК

гвк

в

**

о

12 3 4

-1-"Г" "Г

12 3 4

1.0

0,8

0,6 -

0,4 -

0,2 -

0,0

Р I

1 г

2 3 4

Рис. 1. Влияние интравентрикулярного введения субстанции Р на концентрации ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом. По оси ординат: содержание ДА, ДОФУК и ГВК (нг/мг ткани), по оси абсцисс: 1 - контроль (ложнооперированные крысы); 2 - 6-ГОДА, 300 мкг + 0.9% NaCI; 3 - 6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.065 нмоль; 4 - 6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.65 нмоль.

* - р,_2 < 0.01, **-рм<0.05.

о

1

ДА

-**

Щ

У/У

ш

3 4

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

ДОФУК

1

1 г 0 12 3 4

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

0

гвк

**

I г 12 3 4

Рис. 2. Влияние интравентрикулярного введения субстанции Р на концентрации ДА, ДОФУК и ГВК в прилежащем ядре мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом. По оси ординат: содержание ДА, ДОФУК и ГВК (нг/мг ткани), по оси абсцисс: 1 - контроль (ложнооперированные крысы); 2 - 6-ГОДА, 300 мкг + 0.9% ЫаС1; 3 - 6-ГОДА, 300 мкг +

СР, 0.065 нмоль; 4 - 6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.65 нмоль. * **

-р,.2<0.01, - Р2_4 0.05.

ДА

ДОФУК

ГВК

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00

1

I 2

I

3

0,04 г

0,00

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00

0

1

Рис. 3. Влияние интравентрикулярного введения субстанции Р на концентрации ДА, ДОФУК и ГВК во фронтальной коре мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом. По оси ординат: содержание ДА, ДОФУК и ГВК (нг/мг ткани), по оси абсцисс: 1 - контроль (ложнооперированные крысы); 2 - 6-ГОДА, 300 мкг + 0.9% №С1; 3 - 6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.065 нмоль; 4 - 6-ГОДА, 300 мкг + СР, 0.65 нмоль. * - р,.2 < 0.01. ** - р2_4< 0.05.

раствор. СР в дозе 0.65 нмоль вызывала значительное увеличение концентрации данных веществ: ДА - на 185%, ДОФУК - на 232%, ГВК - на 139%. Введение 6-ГОДА приводило к повышению индексов ДОФУК/ДА и ГВК/ДА в прилежащем ядре по сравнению с контролем. При изучении эффектов введения СР в дозах 0.065 и 0.65 нмоль на величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА обнаружено, что нейропептид не оказывал влияния на значения индексов метаболит/медиатор в прилежащем ядре животных с экспериментальным паркинсонизмом.

Результаты опытов по влиянию СР на содержание ДА, ДОФУК и ГВК и на значения индексов метаболит/медиатор во фронтальной коре крыс с экспериментальным паркинсонизмом представлены на рис. 3. Вследствие введения нейрото-ксина в этой структуре наблюдали снижение концентраций ДА, ДОФУК и ГВК по сравнению с контролем, однако различий в величинах отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА отмечено не было. СР в дозе 0.065 нмоль не вызывала изменения содержания рассматриваемых соединений и значения индексов метаболит/медиатор во фронтальной коре крыс по сравнению с группой животных, которой вводили физиологический раствор. В дозе 0.65 нмоль СР повышала концентрации ДОФУК на 107% и ГВК на 79% у животных с разрушением ДА-ергических нейронов, вызванным 6-ГОДА, однако достоверных различий в содержании ДА отмечено не было. Отношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА не отличались от таковых для животных с экспериментальным паркинсонизмом, которым вводили физиологический раствор.

3. Влияние введения СР в сочетании со Спант 1 на содержание ДА и его метаболитов в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом.

Оценка специфичности влияния нейропептида на интенсивность метаболизма ДА в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре мозга при экспериментальном паркинсонизме проведена при помощи его тетразамещенного аналога Спант 1, обладающего свойствами антагониста СР (Ро1кегз е( а1„ 1984; ЯоззеН е1 а1„ 1983).

В результате исследования влияния СР в дозе 0.4 нмоль в сочетании со Спант 1 в дозе 0.4 и 4.0 нмоль на содержание ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме установлено, что более низкая доза (0.4 нмоль) Спант 1 частично блокировала вызванное СР повышение уровней исследуемых соединений в стриатуме. Содержание ДОФУК и ГВК достоверно не отличалось от такового у крыс с введением физиологического раствора, в то время как концентрация ДА была на 19% выше (р<0.05%). Однако в дозе 4.0 нмоль Спант 1 полностью блокировал

активирующее влияние СР на содержание исследуемых веществ в стриатуме. Концентрации ДА, ДОФУК и ГВК достоверно не отличались от таковых у крыс с экспериментальным паркинсонизмом, которым вводили физиологический раствор.

При изучении эффектов введения СР в сочетании со Спант 1 на содержание ДА и его метаболитов в прилежащем ядре обнаружено, что в дозе 0.4 нмоль антагонист СР не вызывал изменения активации метаболизма ДА в данной структуре: наблюдалось повышение содержания медиатора на 25%, ДОФУК - на 21% и ГВК - на 28% по сравнению с животными, которым вводили физиологический раствор (р<0.05). Однако в дозе 4.0 нмоль Спант 1 блокировал обусловленное введением СР повышение уровней ДА, ДОФУК и ГВК в прилежащем ядре мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом.

Результаты экспериментов, в которых изучали влияние введения СР в сочетании со Спант 1 на концентрации ДА, ДОФУК и ГВК во фронтальной коре мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом показали, что Спант 1 в дозе 0.4 нмоль не оказывал влияния на эффекты СР: содержание ДА и ГВК не отличалось от такового у крыс с введением физиологического раствора, но концентрация ДОФУК была на 18% выше (р<0.05). Однако в дозе 4.0 нмоль антагонист СР блокировал стимулирующее действие нейропептида: концентрации ДА и его метаболитов достоверно не отличались от содержания этих соединений у животных с экспериментальным паркинсонизмом, которым вводили физиологический раствор.

Таким образом, интравентрикулярное введение СР в физиологической дозе 0.65 нмоль приводило к повышению концентрации ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре, а также вызывало нормализацию интенсивности метаболизма ДА в стриатуме крыс на фоне экспериментального паркинсонизма. Введение СР в дозе 0.4 нмоль в сочетании с антагонистом Спант 1 в дозе 4.0 нмоль не оказывало влияния на содержание ДА, ДОФУК и ГВК в исследованных структурах мозга животных с разрушениями, вызванными 6-ГОДА.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате введения 6-ГОДА у животных развивался паркинсонический синдром, проявлявшийся резким снижением двигательной активности в тесте "открытого поля": практически полным исчезновением вертикальных стоек и уменьшением локомоции до четверти контрольного уровня. Изменение вертикальной активности является наиболее чувствительным показателем, коррелирующим со степенью повреждения нигростриатной ДА-ергической системы, по сравнению с

горизонтальной активностью и расстоянием общего пробега (Sakai, Gash, 1994). По данным этих авторов двигательные нарушения, вызванные введением нейротокси-на, наблюдаются у животных с разрушением более 80% ДА-ергических нейронов черной субстанции.

Введение 6-ГОДА, проведенное в нашем эксперименте, оказало выраженное влияние на активность как нигростриатной, так и мезокортиколимбической систем мозга, что соответствует нейрохимическим изменениям при паркинсонизме у человека. Наблюдалось снижение уровней ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре по сравнению с таковым у ложнооперированных животных. Величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА возросли в стриатуме и прилежащем ядре в ответ на введение 6-ГОДА, что согласуется с данными литературы (Brannan et al., 1990; Ogawa et а!., 1994; Schultz et al., 1990) и свидетельствует о компенсаторной интенсификации синтеза ДА сохранными нейронами и об усилении его высвобождения. Во фронтальной коре значения индексов метаболит/медиатор достоверно не отличались от контрольных значений, что отражает более слабое нарушение метаболизма ДА в этой структуре.

При изучении изменения концентраций ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре крыс с экспериментальным паркинсонизмом после введения СР выявлено вовлечение ДА-ергических систем в реакцию на нейро-пептид.

Анализ нейрохимических эффектов в ответ на введение СР позволил установить, что наиболее выраженные изменения наблюдались в стриатуме, где концентрации ДА, ДОФУК и ГВК были значительно выше таковых у крыс с разрушениями, вызванными 6-ГОДА, которым вводили физиологический раствор, а величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА достоверно понижались. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в данной структуре корректирующее влияние СР было наиболее сильным и проявлялось не только в повышении концентрации ДА и его метаболитов, но и в нормализации скорости обмена ДА. В прилежащем ядре введение СР приводило к повышению уровня исследуемых соединений, однако не вызывало изменения величины индексов ДОФУК/ДА и ГВК/ДА, что свидетельствует о менее выраженном влиянии нейропептида на метаболизм ДА в этой структуре мозга при экспериментальном паркинсонизме. Наиболее слабые эффекты от введения СР отмечались во фронтальной коре, где об активации метаболизма ДА можно судить лишь по увеличению концентраций ДОФУК и ГВК, уровень медиатора достоверно не менялся.

Установленное нами увеличение интенсивности метаболизма ДА в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре при экспериментальном паркинсонизме после введения нейропептида согласуется с ранее полученными данными об активации нигростриатной и мезокортиколимбической ДА-ергических систем в норме (Reid et al., 1990; Elliott et al., 1986). Введение близких к применяемым в нашем исследовании доз (0.007-0.7 нмоль) CP или ее стабильных аналогов в черную субстанцию или вентральную тегментальную область повышало высвобождение ДА соответственно в стриатуме или прилежащем ядре. Интраперитонеальная иньекция нейропептида в физиологических условиях также усиливала высвобождение ДА в прилежащем ядре и стриатуме (Boix et al., 1992). Эффект наблюдался при введении CP в дозе 60 нмоль, что значительно выше дозы, вызывающей повышение уровня ДА и его метаболитов в структурах мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом в нашем исследовании (0.4 и 0.65 нмоль). Вероятно, такое различие обусловлено ферментативным разрушением CP в крови с образованием С- и N-концевых фрагментов нейропептида (Conlon, Goke, 1984) в сочетании со слабой проницаемостью ГЭБ для соединений данного класса, содержащих в своей структуре заряженные группировки (Banks, Kastin, 1985).

Существенно, что в естественных условиях при развитии нейрохимических реакций в ответ на введение CP отмечаются аналогичные нейромедиаторные изменения, что позволяет предположить включение этого нейропептида в мозге в постоянно действующую и значимую систему нейрохимической регуляции двигательных и эмоциональных функций.

Временной интервал, выбранный в нашем эксперименте (30 минут после иньекции CP), соответствует выраженному повышению содержания ДА в ответ на интранигральное введение нейропептида в физиологических условиях (Reid et al., 1990) и максимальному восстановлению двигательных функций у животных с паркинсоническим синдромом, вызванным МФТП, в тесте "открытого поля" после интранозального введения CP (Крыжановский и др., 1992).

Спант 1 является потенциальным блокатором тахикининовых рецепторов типа NK1 и, соответственно, антагонистом СР. Повышение уровня ДА и его метаболитов в стриатуме, вызванное введением CP, частично ингибировалось Спант 1 в дозе 0.4 нмоль и полностью блокировалось антагонистом в дозе 4.0 нмоль, что соответствует данным литературы (Reid et al., 1990). В прилежащем ядре и фронтальной коре более низкая доза Спант 1 не оказывала влияния на эффекты CP по отношению к уровням ДА, ДОФУК и ГВК, но более высокая доза антагониста

блокировала повышение концентрации исследованных соединений в данных структурах мозга.

Продемонстрированное влияние совместного введения Спант 1 и СР на содержание ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре свидетельствуют о специфичности воздействия исследуемого нейропептида на метаболизм ДА в мозге при экспериментальном паркинсонизме. Влияние Спант 1 на эффекты СР объясняется тем, что антагонист, вводимый интравентрикулярно, блокирует участки связывания СР в мозге.

Таким образом, результаты нашего исследования показывают, что СР специфически активирует все звенья метаболического оборота ДА в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре животных с экспериментальным паркинсонизмом. Однонаправленность реакции исследованных структур мозга в отношении изменения концентраций ДА и его метаболитов свидетельствует о формировании согласованных нейрохимических перестроек в ответ на введение СР. При интравентрикулярном введении СР компенсирует снижение уровня ДА в мозге, вызванное разрушением ДА-ергических нейронов вследствие воздействия 6-ГОДА, за счет активации метаболизма эндогенного медиатора.

ВЫВОДЫ

1. Нейропептид СР является важным компонентом регуляции ДА-ергических механизмов при паркинсонизме. В исследованиях на модели паркинсонизма у крыс продемонстрировано влияние СР на функциональную активность ДА-ергических систем мозга, заключающееся в том, что нейропептид увеличивает интенсивность метаболизма ДА.

2. Охарактеризована экспериментальная модель паркинсонизма, полученная при интравентрикулярном введении б-ГОДА. Установлено снижение двигательной активности у крыс, уменьшение концентрации ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме, прилежащем ядре и фронтальной коре, а также повышение величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА в стриатуме и прилежащем ядре.

3. При сравнении исследованных структур мозга животных с экспериментальным паркинсонизмом показано, что наибольшее влияние СР оказывает на интенсивность метаболизма ДА в стриатуме, где зафиксировано повышение содержания ДА и его метаболитов, а также нормализация величины отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА в ответ на введение нейропептида.

4. В прилежащем ядре мозга животных с экспериментальным паркинсонизмом наблюдается выраженное увеличение уровней ДА, ДОФУК и ГВК вследствие введе-. ния нейропептида, но значения отношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА не изменяются.

5. Введение CP вызывает повышение концентрации ДОФУК и ГВК во фронтальной коре животных с экспериментальным паркинсонизмом, при этом содержание ДА в этой структуре достоверно не отличается от такового у крыс, которым вводили физиологический раствор.

6. Эффект увеличения концентраций ДА, ДОФУК и ГВК в исследованных структурах мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом, выявляемый при интравентрикулярном введении CP, блокируется антагонистом Спант 1, полученным на основе структуры CP при замене аминокислот в 1-м положении на D-аргинин, 7-м и 9-м положениях на D-триптофан и 11-м положении на лейцин

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дамбинова С.А., Бычков Е.Р., Краснова И.Н., Шевченко К.А., Корольков А.В. Влияние комплексной терапии антипаркинсантами и аутогемоликворотрансфузии на активность нейромедиаторных систем мозга больных паркинсонизмом // Нейрохимия.-1991,- Т.Ю.- Вып.1-2.-С.3-9.

2. Krasnova I.N., Bychkov E.R., Dambinova S.A. Antiparkinsonian-lile effects of substance P on the dopamine metabolism in 6-hydroxydopamine lesioned rats // Proc. 1st Eropean Congress of Clinical Neuropharmacology. Freiburg, Germany.-1994.- P.41.

3. Krasnova I.N., Bychkov E.R. Activation of dopamine metabolism in 6-hydroxydopamine lesioned rats following intraventricular administration of substance P II Abstr. Intern. Symposium "Physiological and biochemical basis of brain activity". Russia, St.Petersburg.- 1994,- P.54.

4. Краснова И.Н., Бычков E.P., Дамбинова С.А. Влияние нейропептида субстанции Р на активность дофаминергической системы мозга при экспериментальном паркинсонизме // Физиология человека.- 1995.- Т.21.- N4,- С.31-37.

5. Krasnova I.N., Bychkov E.R., Dambinova S.A. Substance P but not substance P (5-11) activates dopamine metabolism in the brain in an animal model of Parkinson's disease II J. Neurochem.- 1995.- Vol.65.- Suppl.- S45A.

6. Krasnova I.N., Ludino V.I., Dambinova S.A. The role of substance P in the regulation of dopamine metabolism in the parkinsonian brain // J. Neurochem.- 1996.-Vol.66.- Suppl.2,- S52D.