Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение реактивности нейронов неокортекса к повторяющимся изолированным и сочетанным предъявлениям L-глутамата и ацетилхолина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение реактивности нейронов неокортекса к повторяющимся изолированным и сочетанным предъявлениям L-глутамата и ацетилхолина"

~ ■■ * -москозскш ГОСУДШЗТБШНЫИ УНИВЕРСИТЕТ га, м.в. лоыоносовд

РГ8 ОД

^(с

НИОЯОГИЧЕСНШ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГУСЕВ Павел Александрович

УДК: 612.822.3:515.78

изучение реактивности нейронов ' неокоргекса ' '

к побторящшся изолированным и 'сочшшшм

ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ!! 1^ГЛУТДМТА И АЦЕТИЛХОЛКНА.- ' -03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на ксфэдре высшей нервной деятельности Биологического факультета !ДУ им. Ы.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор Оволотачосгаа наук, / [профессор ц.и.нотлЩ

кандидат биологических наук Н.О. Тимофеева

Официальные оппоненты:

доктор Сиологглеосп паук ' О.Х. Коштоянц

доктор биологически: наук, профессор С.А. Чепурнов

V '

Ведущее научно-исследовательское учреждение: Научно-исследовательский институт мозга РАМН

Защита состоится п 2994 г% в/^"часов

в Большой .биологической аудитории. , на. засэдании специализированного Совета Д.053.05.35 при Московском государственном университете им. К.В.Ломоносова по адресу: 119 899 Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией мсшно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ^ - 1994 г.

Ученый се!фетарь . ...

специализированного совета у I

кандидат биологически! наук, -Б.А. Умарова

-1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Р2Е0ТЫ стуэльность проодемц. ■ Исследование роли различных систем гйрошредапихов б механизмах Еэзссоциатавной а ассоциативной лас7£Жостк нейронов головного козга являотся . актуальной роблемой ЕоРтхзфз сзологки. Реакции нейронов нэскортокса на ндщСферентзый раздрактль ногу? бкпь онооредозаны ь-глутаматом Гл), вксвобокдаешм из талатохортихашгк волокон (Salt et al., 9С6; ioz at al., 1990; Glgg et al., 1992), тогда KSC Солевое i£ вдевое подкрепления значительно ахгтнБнрувт хслпнЕргическиэ ®йрона основания пэреднего мозга, что нгзквгэт повышение уровня щетвлкшна (АХ) в ксрэ больисх гголуигриЕ а реакцсз пробугаенпя [Phillis, 1968; Stewart et al., 1984; '.»atari, Vandersrolt, 1987; ЗтороЕук, 1090; Liooro ot al., 1992). Показано, что при ¿работке и /гашении условных . рефлексов (УР> изменяется чувствительность аейронсв к АХ и Гл (Кругликов др., IS77; Коштоянц и др., IS79; оно et al., 1S92). одним из подходов к изучэнею роли отдельннх медиаторов в нейрональной пластичности якгяется • нримененсё нэйронап моделей ассоциативного и негативного обучения, на которых в качестве раздражителей прженягется ьшрсзэвофорети-шскзе аппликации медиаторов (Котляр, Овчаренкс, I98Q;. Котляр и др., I9S3; Котляр, Мясников, 1988). На модзлч ассоциативного обучения, на которой аппликации Гл рассматривался как действие индифферентного стимула, а микроашшшсациЕ АХ кек действие подкрепляющего ргздралитэля, показаны асссаийтаивне перестройки реакций на Гл и ультраструктурн аксодэвдритннх синапсов корковых нейронов (Котляр, -.Овчаронко, I9S0; Котляр и -др., 1934,1989; Хлудова и. др.1931,1992). Однако остаются неизвестными факторы, определяющие направление динамики реактивности к Гл z АХ при интегрированном действш медиатороз. Басто отметить, что скорость

формирования а прочность УР зависят от временных отаозений сочетаемые стимулов, при этом реакции корковых нейронов .на. дод^реттл.ттшз стемул отличается большей продолвительшстью и

интенсанноетьв (Павлов, 1938; Па^оетч, 1957, 1960; Бт1й1 е* а!..

^ ■ -

19Ь9; ДумэБЮ,- Сачэнко, 1979). В связи с выпеуказгнннм цель» настоящего исследования стало изучение пластичности глутамато- и холзноцестивяс. входов нервных клеток при изолированном и сочетанием дайствгя медиаторов, а таске . роли временных и амплитудных 05ПИЕ0ВИЙ ЕЭйронннх реакций на аналоги условного и подкрепляющего стимулов з определении направления данашки вызываемой нз2роыедиаторами активности. Динамика тонической импудьсацеи а реактивности нервных клзток к сочетаемым стимулам служит показатэлэм пластичности центральных нейронов при обучении (Котлар, 1577; Еюгсрзоп еЬ а1., 1976; Котляр, Тимофеева, 1983; Сторохук, 132й). Данное исследование позволит решить проблему соотношения механизмов интеграции условного и безусловного раздражителе? на системном уровне и на уровне взашаде'йстзия глутамато- и хслшоцептивных входов центральных нейронов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работа заключалась в изучении меюфихаций реактивности нейронов неокортокса к Гл и АХ ври их повторяющемся изолированном и сочатанном мшсроионофоретическом анплицяровании.

В работа были поставлены следуетще задачи:

1. Изучение давямяки спонтанной и вызываемой медиаторами спайковой активности щт многократной. изолированной активации глутамато- и ходиноцептивзнх входов

2. изучение зависимости динамики возбудительных реакций нзйр0Е0з на маогокретоз предъявление ¿X от паттерна исходной реакции .нервной клетет на ¿X.

-з -

3. Опредзление взаимодействия глугамато- и холаноцоптивниг входов гш дласплесют. перестройках нейрожой яктивносгн.

4. Изучение роли врэмэнвЕХ и глилитудвых отношений гланду возбудительными компонентами отззтов зейроноз на Гл и ¿X при их сочетавши средьявлениях дтя направлен®: динзмикя газвзнной медчатсргга импульсной жтевбосте.

5. Изучение следопыт явлений в активности. нейронов в результате совхоршцэгося изолированного и ассоциированного подведения Гл и АХ. ■

Научная новизна работа. Вгюрше проведен ерэвкителчай анзлиз изменений активноеги отдельна нейронов неоксртекса з условиях повторяющегося изолированного и сочетсашого подведения Гл Е АХ. Обнаружены особенности дш аники -роста ¿" сштаегшя .возбудгтелъетх реакций на Гл_к АХ. Показаны дссговернне различия в наиразлен№ динампси фоновой антивпостк Оолчкшэтва ьврьнкх плеток в ходе предъявлен® Гл и АХ. Определено значение паттерна реакции на АХ дал" 'направления модафьсацйГ возбудительного' когетоненга ответа на АХ как при его кзолпровгнеом, так и при сочетанном с Гл подведений.

Показано, что при последовательном гредьявлениз Гл н АХ в парах существенное значение для позгаэнпя глута^гтореаутивностц имеет перзхрытие во вреиени возОудительных рэаюдий ка Гл н АХ. При сочетаниям кздиатороз наблядаатса различные соотношения меаду направлением динамики глутаыато- и холлнорэ активности.

Обнаружено, -что модификации фоновой и называемой Гл и 4Х спайксзой- актсЕЕости з результата многократного изолированного и

ассоциированного предъявления медч^тороБ носят кратковременный еле

- *

долговременный характер, и что щш возобновления гпшлказщй иедаатсров монет происходить дальнейшее развгтие пластических

перестроек реакций, щи этом наблидается постоянстве последовательности возбудительных и тормозных компонентой ответог нейронов ва Гл и АХ.

Научво-теоротичаскоэ и практическое значение работа. Полученные результаты расширяют представление о возмогши механизмах участия Гл и АХ в процессах интегративной деятельности 1ИС ? фуналиснальной пластичности в коре головного мозга и могут енть полезны для планирования дальнейших теоретически исслбдОБашй. Выявленные в нашей работе функциональные различи глутакато- и холиноцептившх входов при их повторяющейся раздельной и совместной активации, значение характера реактивноста нервных клэток, временных и ашлитудных отношений возбуждения ш Гл и АХ ДЕ2 перестроек функциональных свойств нейронов -важно дан понимания и моделирования принципов взаимодеЬствш пэйромэдпаторных систем в реализации интегративной деятельноетт ШС, накопнения и хранения информации. Результаты работы могу; битв использованы при разработке компьютерных, систем, .основанныз на функцнанировании нейроноподобных структур, а также дш иссладованзл механизмов действия психофармакологические соединений.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены н; конференцаах молодых ученых на биологическом факультете МГУ (1988; и в Инспсута ВВД и Iffi АН СССР (Москва, 1999); на 3 Всемирно! контрессэ по нейронаукам, организованном . Международно! организаций по исследовании мозга (IBRO) (Монреаль, 1991); на IE (Мюнхен, 1992) и. 16 (Мадрид, 1993) Ежегодных конференцию Европейской ассоциации по иейронаукам (ЕШ; на научной школе "Нейронный механизмы психологического и биологического отсчетг времени", организованной Европейским научным фондом (Поста Брава,

1993); на заседаниях, кафедры высшей нервной дэят&яьносге.

, Публикации. По материалам диссэртаози опубшяовано 12 печатных работ. .

Структура и оЗъа:.: работа. ДнссертацЕ". состоит яе введения, обзора литературы, описания кэтодэв псгледоветия, результатов собствэннх есслэдиэней и иг оЗсугдерш:. заклгнгсзг» з выводсв. Содержание дчесерташи излокеш не 172 страницах и вклотаэт й7 рисунков и 6 таблиц. Список литературы содорзкт 318 к?имвнованг2, та них S4 отечественных з 234 зарубежных авторов.

- методика

Опыте проведена на ПО белых взрослых крысах-сагках, массой 180-250 г, обездЕигэЕннх й-тубокургрипом (20.- кг/кг), анестезированных целновокаином в точках фиксгцнз головы в стер&отаксичэском аппарате' и дареээдзнннх на "гскусствензое даханкз. Под мэствой вовокашовой аяестазибй производили скальпирование животного и трепанацию черьпа; рутам трепанем Бысзэрлгвали отверстие диаметром 2,5 ш в области сенсомотсрной коры. Твердую мозгоЕую" оболочку подрезала под бинохулярлзы (,якроскопом остро заточенной иглой, после чего в обваленный участок коры мозга погружали сложный стеклянный ^^»элэктгюд. Е дальнейшем отверстие згливаж быстро застнвапцэй разогретой смесью воска с вазелиновым маслом, которая предотвращала подсыхание ткани во время эксперимента.

Регистрирующий элемент электрода с кончиком дааяйфом 0,5-2,5 месм заполняли 3 М растворам хлорида натрия. Тэстирризе элементы электрода с ' кончикаки диаметром' 4-3 мш, вугклеепше к' регистриругдаму быстро сохнущсл лаком на основе ацетава, заполняли L-глутаматом натрия (I Н, pH 8, Signa Chenioal Оз., США) или хлсридсы АХ (I Ы, pH 4, Sigma Chomioal Co., США). КОЕЧИК

тестирующего эледанта располагался на расстоянии 12-24 мкм от кончика регистрпругщего, что уменьшало травмирование исследуемых клеток относительно более грубим тестирующим элементом электрода. Продолжительность токов форэза при изолированном и соемэстеоы подведении Гл и АХ составляла 0,5-1 с, диапазон исполыуеуых токов -10-200 НА. Интервалы между предъявлениями медиаторов в. несколько (2-30) раз превышали дштэльность нейронных ответов ж составляли 33-60 с. Дхг выявления пластических перестроек при ассоциированном подведении Гл и АХ в экспериментальные серии было вклвчоно предварительное тестирование реактивности к изолированным подведениям медиаторов: в начале следовали 10 аппликаций Гл, затем 10 предьявхений АХ, после чего вновь 10 аппликаций Гл. Вслед за предварительным тестированием реактивности нейрона проводили многократетз (20-60 раз) ссчетанное подведение Гл и АХ. Для контроля возможных лзыанений з компонентном сосотаве ответов на Гл в процесса сочетаний после каждых трех-пяти совместных предъявлена Гл и АХ апшшцировали лшъ Гл. Длительность и величина насов микроионофореза, временные задержки в предъявлениях АХ относительно начала фореза Гл (-0,5-0,5 с, 1,5 с ш 3 с) оставались неизменными прв регистрации активности каждого отдельного нейрона. Последовательность разрядов отдельных нейронов, усиленная и преобразованная пороговым амплитудным дискриминатором в стандартные импульсы, поступала через интерфейс ввода на кикро-ЭЗУ "ЭлектронЕна" ДЗ-28 (Мясников, 1985) или в ШЭВЫ ЕС 3840 (Мартинсон, Мясников, 1990). Запуск стимулятора я?1 302-Т (США), построение перистимульных ..гистограмм осуществляй с помощью тех же ЭШ. Про^аниа ввода информации разработана Ю.Л. Мартинсон.

В качестве параметров дашашшз спяЯховой активности

использовались вероятность (доля или процент исследованиях вэйронов ), направленность и иптеясЕьность тскичесзих изменений срэдаеа частота фоноЕог (Et) и вызываемой Гл (Егй) язи АХ (АХИ) ишульсзциа.. Для кандой реализации подсчитнбзлзсь средняя частота ишульсгдии до ксмвнта гпплзсашш медиаторов (з тоетке 4 с) и послз аа стропсах одинзчякх перистячульных гястатраь! (бин 50 кс при аппликациях Гл и бил 200 ис. npz подведении ЛХ, эпоха анализа составляла 28 с), г-оторкэ соответствовали возбудкэлкшм фазам ответов нейронов на Гл пли АХ и определялись по сужзпнш (20-100 реализаций) пэристимульниа гистограммам (Котляр и др., I98S).

Достоверность папразлонных изменений (трендов) ГлИ и АХИ з виде их повышения или понижения в ряду последовательных реакций нейронов на Гл и АХ оценивала по 3 критериям. Отличга -от 0 оценки коэффициента прямо?, регрессии указанных параыегроз на номор предъявления медиаторов оценивали по критерии Стьюдента, определялась такта достоверность отличия от 0 коэффициента ранговой корреляции - Спирмзна- мекду- частотой спайкоз в числом аппликаций (Закс, 1975). Кроме того, для установления статистической независимости и выявления трезда в последовательности значений Ш, ГлИ а АХИ . использовался непараыетрический критерий инверсий (Беэдэт, Пирсод, 1971). Тренд считался статистически значимым, если для всех трех критериев икало место достижение статистической оценкой критического значения (р<0,05). Процент нейронов, проявивших определенный паттерн реакции и изменения активности в различных экспериментальных услозиях, сравнивался с помощью четырехклэточного ^-критерия (р<0,1 ; Закс, IS76) и критерия îranepa с псл^авкой Йейтса (Лакин, ISSU). Средняя частота имцульсации нейроноз определялась по уравнениям прямой ретрессии

частоты спайкоз в реакциях на номер предъявления медиатора. Достоверность различий в изменениях уровня активности нейронов в экспериментальных группах клеток оценивала с помощью критерия Вшкоксонг (р<0.05; 5акс, 1976). В качестве показателя корреляционной связи кэаду динамикой ответов на и АХ использовала коэффициент ранговой корреляции Спирмэна (Закс, 1976). Программный комплекс для статистического анализа подготовлен л рэализозан на шши-ЭЕМ EP-964GA A.B. Нарщщщдым.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВШЯ

1.Дзна«яка фоновой и вызываемой Гл и АХ импульсной активности при повторяющемся изолированном действии Гл и АХ.

Проанализирована динамика импульсной активности 229 нейронов: при пэвтораицэшзя изолированном подведении Гл исследгзано швадгннэ .ответов.SS клеток (группа нейронов !), АХ (группа II) -IS3 клеток. Ответам нейронов на АХ било свойственно большее разнообразив паттернов по сравнении с реакциями клеток на Гл, тогда как большинство клеток I группы имело возбудительные (В) реакции на Гл, и гораздо меньшая их часть проявила тормозно -возбудительные (Т-В) или возбудительно- тормозные (В-Т) ответы на Гл (табл.1). Возбудительные реакции на АХ имели большую продолжительность по отношению к реакциям на Гл, соответственно 6,8±4,5 и 2,8*1,7 с.

Все зарегистрированные нейроны продемонстрировали постоянство состава и последовательности В и Т компонентов в ответах на повторные аппликации Гл и АХ, тогда как величина реакций изменялась . (рйс.1). Однонаправленные изменения (тренда) В компонент® наиболее часто наблюдались у нейронов, испытывавших повторяющееся действие Гл. В ходе 20 первых предъявлений Гл 18(18,8%) клеток проявили увеличение количества . спайков в

-Э -

Таблица I. Распределение нейронов по паттернам реакций на мгофоиокофоре тяче ciara аппликации L-глутамата и ацетюлсолина при изолированном подведении медиаторов. ■

Группы нейронов и периоды тестирования Паттерны реакций на апшшцируенаэ медиаторы

возбудительный тормозно-возбудитольный везоудитальвд-термозный

I. Гл (1-20) 84 (87,5Ж) 4 ( 4,2%) 8 ( 8,3«)

II АХ (1-20) 85 (64,55Ь> 35 (27,15) II ( 8,3S)

последовательных ответах на Гл, что прэвьзает до® нейронов, проявивших рост аХИ в груше II (14(10,55!) клеток, р<0,078). После 100 предъявлений Гл ослабление реакций па Гл стало более вероятным, чем их усиление [11(61,12) и 5(27,85S) нейронов соответственно, р<0,045; рисЛА.В]. Снижение Глй в результате 100 аппликаций Гл происходило гораздо чаше, чем ослабление возбуждения на АХ [11(61,1%) и 3(20?;) нейрона^ р<0,018]. Доля клеток с ростом ФИ в периоды меаду реакциями на АХ в ходе 20 первых предъявлений медиатора превышала долв нейронов с уменьшением ® [20(15%) и 11(8,3%) соответственно, рсО,С88], а к 40-ому предъявлению АХ превосходила процент клеток с дина>гикой роста И в I груше [И(23,4Й)и 4(9,8Í), р<0,094; рис. 1Б.Г1. В I грушв в результате 100 предъявлений Гл сннжеьяе ФИ происходило с больше» вороятностыо по сравнению со сходным периодом тестирования во И группе клеток [6(33,356) и 1(6,7%), p<O,0G5; рис. 1А,Б). Вааяо отметить, что максимальная доля нейронов, у которое направления двнамикя И и В ответов на медиаторы совпадали, не прзвыизла 50Z кгэтеж при их длительном тестировании. При соналравленной дипэиике фона и реакций амплитуда их изменений таксе могла различаться. Эти факта свидетельствует о том, что динамика ГлИ и АХИ отражает изменение хеморе активности нервных клеток. Ответ на Гл в средам. в больпеЕ

600

20 i 16 12 В 4 0

1600

800

20 <0 СО 80 100

Рис Л. Характер динамики фона и реакций нейронов при

повторяющемся изолированной действии Гл и АХ.' А-динашка Ш (линия, соединяющая светлые кртазси) и ГлИ (линия, . соединягщзя. .четырехугольники). Б-динамика ,4И и АХИ íлиния, соединяющая темные кружки). По осям абсцисс-номера аппликаций медиаторов; по осям орданат-частота импульсов в 200 мс. В-ПСГ активности нейрона, суммированная по 100 предъявлениям Рл. Ток фореза Га-70 нА, длительность-0,5 с. Г-ПСГ активности, суммированная по 100 предъявлениям АХ. Ток фореза AX-II0 нА, длительность-0,5 с. Ширина бинов ПСГ-200 мс, горизонтальные линии над ПСГ- моменты аппликаций медиаторов, по осям ординат -число импульсов в Сине.

степени редуцировался, чем В реакция на ¿X: ГлИ и АХИ в конце серий из 20, 40 и 60 аппликаций составляли соответственно 56,7-19,7 (в=19) и 70,2-14,1 (n=I5); 57,2*20,5 (n=II) й 78,8±12,1 (п=Ю); 49.4-22,2 (п=Ю) .в 78,8±П,7 (п=8) процентов от. исходного своого уровня (р<0,05). При первых 20 аппликациях АХ достоверно наибольшая доля клеток с динамикой снижения АХИ наблюдается среди нервных каэток с Т-В реакцией на АХ по сравнению с клэткама с В

00000001000300010201485301

-И -

ответом на АХ. Даивая тенденция сохранялась и при большем (40-100) количестве предъявлений АХ. '

Таким образом, при продолжительном повторяющемся изолированном подведения Гл и АХ происходят характерные изменения спонтанной м внзываомой медиаторами импульсной активности, которые nOTji бить отнесены к • разряду Евэосоизатинпых пластических пэрестроек нейронов. При длительном ашлщгровгпии Гл основной является динамика угапэнкл В реакций на Гл и снизэния ФИ, ее демонстрировали соответственно 68,93 и BS,7% нейрогов, проявивших тренды в динаг.гаке Глй и ©I, тогда как в ходе нногократного подведения АХ в динамике ФИ в С8,8% случаев наблщачся рост частоты спайков.

2.Характер изменений нейронной активности щи повторяиэмся сочетанном действии Гл и АХ. ■ •

При ассоциированном ашшщировании Гл и АХ исследовано поведение 54 нейронов (XII" группа). На 31 клетке 'проведены серии экспериментов, вклтаиие предварительное тестирование реактивности к медиаторам, их сочвташое и последующее

У

изолированнее подведение.

Изолированные предъявления АХ в ходо процедуры предварительного тестирования не измзнилв вероятности и направленности модификаций ФИ и ГлИ по сраннениз с ситуацией многократного предъявления одного Гл. В хода сочетаний изменения касалась только величина компонентов реакций па медиаторы, но не их состава и последовательности. Значительное большинство нейронов проявило динамику снижения, а не роста ФИ [соответственно в ходе 60 сочетаний 6(18,2%) и 1(3,ОХ) исследованных клеток, р<0.012], ГлИ [14(42,4%) И 5(15,2%), р<0,015]. АХИ [10(30,3*) Я 1(3,0%),

р<0,003], при этом число клеток с возросшей реакцией на Гл было больше (рсО,ОВ8) числа нейронов с увеличением АЗИ. По данным регрессионного анализа в среднем в III группа уровни ответов на Гл и ¿X после применения 20, 40 и SO сочетаний достигали соответственно 48,7*31,3 (п=5) и 60,8*17,4 (п=10), 54,2* 20,8 (п=12) и 64 »1*20 (а=8), 57,5-22,2 (п=13) и 69,3*11,3 (а=Ю) процентов относительно исходного ответа и ае различались статистически достоверно. Отсутствуют такке значимые различия в степени снияшя ГлИ кекду нейронами I и III групп после применения 40, 60, 80 и 100 аппликаций Гл: соответственно для указанных груш 53,2*26,6% (п=6) и 48,7*31,3% (п=5), 57,2*18,6% (п=8) и 55,9*21,35 (п=13), 58,6*22,7% (п=Э) и 54,3*24,52 (п=15), 59,7*22,8% (в=9) и 52,4*26% (п=9) относительно исходного ответа. В груше III дестоверно реже, чем во II, встречаются нейрслы, которые двмоззтриругт увеличение" ФИ [соответственна 1(2,9%) и 6(25%) клеток. р<0,011).

Для оценки специфики пластических „перестроек глутамато- и холиноцептившх входов и взаимосвязи перестроек при их сочетанной стимуляции бал проведен анализ соотношения модификаций ГлИ и АХИ для каждого отдельного нейрона.

3. Соогашениэ динамики глутамато- и холинореактивности.

В ссеошом у нейронов III группы наблюдались достоверные направленны» изменения В реакций на один из сочетаемых медиаторов без изменена« ответа на другой передатчик (табл.2, б, 7, 8 и 9). В то же время проверка гипотезы о независимости изменения ГлИ и АХИ для нейронов с достоверным трендом в динамике ответа на какой-либо один медиатор показала, что в ходе 60 сочетаний 6(50%) подобных клеток деишстрируят статистически достовернуг полояительную корреляциовдро связь мэвду числом спайков в В компонентах ответов

Таблица 2. Соотношение динамики глутамо- и холинореактивности.

Направление динамики .реакций

Число нейронов, .проявивших направленные изменения ответов на глутамат и ацатилхолин в ходе сочетаний медиаторов

Число сочетанных аппликаций глутаыата и ацетилхолина 20 40 60

ФО

ФО

ф-

«3

Отсутствие изменений ответов (Г)

Уменьшение' 2 ответов на Гл и АХ (2)

Увеличение I ответов на Гл и АХ (3)

Рост ответа •на Гл, снижение на АХ (4)

Рост ответа на АХ, снижение на Гл (5)

Рост ответа на Гл (5)

Рост ответа I на АХ (Г) __

Уменьшение 3 ответа на Гл (8)

Уменьшение 3 ответа на АХ . (9)

32 3 2 37 (68,5%)

3 (5,62)

I (1,9%)

I (1,9%)

2 (3,7%)

3 (5,6%) 4

7 (13%)

Всего нейронов 54 (100%)

15 I 3 19 (43,2%)

2 2 -4 (9,1%)

I (2,3%)

4 (9,1%)

I

3 (6,8%) 2

8 (18,2%) 2

5 (11,4%) 44 (100%)

12

12 (36,4%)

5 (15,2%)

I (3%)

3 (9,1%)

I (3%)

2

9 (27,3%)

2 (6,1%) 33 (100%)

©3 - нет направленных изменений фона, Ф-, Ф+ -снижение и рост ФИ.

2

I

I

3

2

6

7

3

2

на Гл и АХ (коэффициент корреляции Q,4I±0,II). Такие часто происходило одновременное снижение реактивности к обоим медиаторам 1табл.2, 2), а наименее вероятными были клзтки с разнонаправленной динамикой ГлИ и АХИ (табл. 2, 4 и 5) и нейроны с одновременным ■ увеличением ГлИ и АХИ (табл. 2, 3). Дгаакнка визвгшюй активности наблюдалась при различном поведении фона, и далеко не всегда оси были сонапразлсзы (табл. 2).

Таким образом, при совместной стимуляции глутамато- и холиноцептинных входов пластические перестройки могут развиваться только в одном из них (у 35,3% нейронов), либо достоверные направленные изменения реактивности нейроцов к Гл и АХ происходят одновременно (у 27,3% клеток) и характеризуются при этом положительной и рзне негативной корреляционной связью (соответственно в 55,6% и 22,2% случаев).-

4. Изучение роли временных и амплитудных отношений возбудительных реакций нейронов на Гл и АХ в изменении реактивности к ашлицируемыы нейронерэдатчикам при их сочетанном подведении.

У 7 нейронов исследовались изменения реакций на Гл после его сочетаний с АХ при условии, когда В реакции нейронов на Гл целиком развивались на фоне возбуждения, вызванного аппликацией АХ. У. II нейронов возбуждение на АХ начиналось за 0,2-2,4 с до прекращения реакции на Гл. У 43 нейронов В реакции ва Гл и АХ разделялись периодом фоновой активности или тормозными реакциями после аппликаций медиаторов продолжительностью 0,2-4,4 с. Условия полного и частичного перекрытия во времени В реакций на Гл и АХ являются оптимальными для развития данамикл роста ГлИ. В. этих условиях в III груше нейронов 8(61,5%) клеток увеличили. ГлЙ, что достоверно больше доли нейронов с ростом ГлИ в I группе [3(15,8%)

гоо

too

-

1

Рис.2. Различное направление динамики ГлИ при сочетаниях Гл и АХ "с 1,5- и 3-секунднымд задержками АХ для одного и того же нейрона-.. • ...

А,Б-Динамика ФИ, ГлИ и АХИ в ходе сочетаний соответствию с МИ в 1,5 и 3 с. В.Г-ПСГ активности нейрона по «зервнм 20 сочетаниям с Ш 1,5 и 3 с соответственно. Ток фореза "Гл л АХ -140 нА, длитвльность-0,5 с.

нейрона, р<0,02)], а также в III груше при сочетаниях Гл и АХ, когда последовательности разрядов, вызываемые медиаторами, не накладывались друг на друга [3(8,6%) нейрона, р<0,002]. При полном и частичном перекрытии В реакций на Гл и АХ относительный прирост ГлИ составил соответственно 18Э,0±48,1% (п=7) и I72,4±58% (n=II). Вазвно отметить, что процент нейронов с увеличением ГлИ в ходе 20-60 сочэтанных предъявлений при развитии В рескции на - АХ на фоне завершения В реакции на Гл такхе достоверно превышал процент клеток с аналогичными изменениями ГлИ iqra разнесении во времени реакций: 5(45,5%) а 6(14%) клеток соответственно, р<0,1.

Значение врекан^ых отношений В компонентов ответов на Гл и АХ для усиления реахстизности -к Гл проявляется при сочетании Гл п АХ с различными отсташшнияыи АХ на одних е тех га найронаг. На рис.2 показано, что уволиченпе ГлИ происходит при задэргже аппликации АХ на 1,5 с послэ начала фореза Гл, при этой наблюдалось частичное перекрытие во вреиепи ответов на мэдааторы: возбуждение на АХ начиналось на фоне завершающей стадии В реакции нейрона на Гл за 1,2 с до ее прекращения. Снижение ГлИ на этом же нейроне наблюдалось при 3- секундном ME, когда роагадня на АХ развивается после завершения реакции па Гл (рис.2В,Г).

При разнесении во времени В компонентов реакций на Гл и АХ соответственно 82,4$ и 90,95 нейроноз, проявивших изменения в активности, демонстрирует динамику угашения В реакций на Гл к АХ. Эти доли не отличаются достоверно от долей нейронов с аналогичными изменениями реакций при изолированном апшшцярованш медиаторов.

Динамика снижения АХИ в ходе сочетаний была наиболее характерна для нейронов с Т.-Б ответами на АХ. При отс„тавлетом развитии реакций на АХ в ходе 40 сочетаний наблюдалось более глубокое угашение АХИ по сравнении с аналогичным перлодом тестирования во II 'группе: 64,1±20% - (п=8) и 85,4±10% (п=7), р<0,05, непаршй критерий Вилкоксона.

Шла проверена гипотеза о зависимости изменений ГлИ и АХИ от соотношения чисел спайков в В реакциях на Гл (ЧСГл) и АХ (ЧСАХ): К=ЧСАХ/ЧСГл, где 4CAX=(AXll-ffii)*tax, ЧСГл=(ГлМ-®1)*1:гл. У 80S клеток ЧСАХ.. в среднем в 4 раза превосходило ЧСГл. Однако корреляционная зависимость между значениями К и изменениями ГлИ и АХИ оказалась статистически недостоверной: коэффициенты Спирмэна имели значения 0,069 и 0,097 соответственно для ГлИ. и АХИ (р>0„5; р>0,2). - • '

Таким образом, при повторяющейся ассоциированной акгавацви глутамато- и ходицоцоптстапг входов корковых нейронов опре долящее значение для развития ассоциативной пластичности глутаматоцеипзннх входов имеет совпадение во времени возбудительных фаз. реакций на Гл и АХ, а на величина В реакций на сочетаемые медиатора. Ассоциативная пластичность холиноцептивных входов проявилась в Солее глубоком угазюши В реакций на АХ.

5. Слвдовиа явления в активности нейронов в результате повторявшегося изолированного и ассоциированного подведения Гл и АХ.

Специальная сория экспериментов была проведена для оценки продолгительности сохранения изменений ФИ ж В реакций на Гл и АХ прп изолированном действии указанных нейроЕэредатчшсов. Вслед за первой серией из 20-40 изолированных шшроаппликацай Гл или АХ росле 20-60 -минутного перерыва проводили вторую серпа с прекпими параметрами стимуляции. При наличии достоверного тренда ФИ, ГлИ или АХИ в"' перв'ой" серии проводила статистическую оценку по непарному критерию Еалкоксона различий средней частоты Ф'Л л числа спайков на отрезке В компонента ответа нейрона на аппликацию медиатора для первых 10-20 предъявлений медиаторов в двух последовательных, сериях. При оценке продолжительности сохранения изменений импульсной активности в результэтэ ассоциированного подведения Гл и АХ такие при наличии трендов ФИ, ГлИ ила АХИ в процессе 60 предъявлений медиаторов проводили сравнение уровня ФИ и числа ссаЯков в В реакциях .на Тл-и, АХ в ,ходе предварительного тестирования или в процессе первых 20 сочетаний с соответствующими показателями з ходе 20 изолированных подведений Гл и АХ после предъявления 60 сочетаний.

В ходе как изолированных, так и сочетаЕЕых предъявлений Гл и

АХ индуцируются перестройки фоновой и вызываемой медиаторами спайковой активности различной продолжительности. У 30% нейронов 15® подведении одного Гл и у 62,5% нейронов при аппликациях одного АХ уровень реактзвнослг возвраиался к а сходно:.!? за 10-20 минутный перерыв в стимуляций, тогда как у остальных клеток измэненяя в течение этого периода сохранялись. В результате точэтэнных аппликаций медиаторов изменения ФИ и отбэтоб на Гл и АХ, которое сохранялись дольше 20 минут, наблюдались ссотвотствбено в 44,4%, в 66,7% и в 23,6% сдучаэв, причем при ассоциированной стимуляции глутаыато- и холиноцаптизпых входов длительность их модификаций у одного 2 того не нейрона также могла различаться. У 41,6% клеток с кратковременными и у 86,7% нейронов с более продолжительными измэнепшми спзйковой актизности в повторных сериях изолированны! , ш совместных цредьявлензй Гл п АХ воспроизводились ранее ваблгдавшеся усиление или снижение Ш, ГМ или АХИ. Возобновление или отсутствие динамики нейронной активности монет ^растеризовать - различную степень насыщения процессов функциональной пластичности.

амСЛШЕНИЕ

Результаты настоящего исследования, проведанного на клеточных аналогах привыкания и ассоциативного обучения с применением в качестве раздражителей ионофоретических аппликаций Гл и АХ позволят сделать вывод о различии пластических свойств глутамато-и холиноцептивнах нейрональных входов при их изолированной стимуляции, о взаимном влиянии входов при их сочетанной стимуляции и существенном значении совпадения во времени возбудительных реакций на Гл и АХ для развития ассоциативной пластичности нейронов. Результаты вашего исследования позволили сдавить роль глутаматоцептшзаых входов в характере динамки нейронной

активности, наблюдаемой при развитии привыкания (Bures, Buracova, 1967;, Пирогрв, Ленков, 1972; Виноградова, 1975; Шаглукоьа и др., . 1976). Пластичность, свойственная возбудительным фазным реакциям на Гл, свидетельствует ' о более вероятном участии глутаматоцеютвного входа в развитии сзнситвзации и последунцего угашения ответов на повторялцееся действие стимула.

Ассоциативные перестройки глутяматоцептивных входов при сочетаниях япшшкэцйях Гл и й ' проявляется в форме усиления реактивности к Гл. Данный тип ассоциативной пластичности может быть стнесеа к а-сбуслозливаниэ по Кэндалу (Кэндал, 1980), так как у зсзх исследованных нейронов при пропусках АХ сохраняется модифицированный ответ на Гл, но не воспроизводится реакция на подхреплящий стимул -АХ. Указанные воздействия вызывают такке изменения ультраструктуры синапсов, что рассматривается как улътраструктурнал основа ассоциативных процессов (Котляр и др., - 1934,1989; Хлудова и др., 1991,1992).

Полученные данные согласуются с результатами работ, выполненных в условиях in vito при экстраклоточной регистрации активности, и на срезах неокортекса л гишокампа при внутриклеточной регистрации мембранного потенциала и ионных токов (Ъапоиг et ai., 1988; Raemisscn, Bykea, 19S8; Tremblay et al., 1990; Anik3ztein et al., 1992; Сох et al., 1992; Иагкгал, Segal, 1990,1992; Hennevine et al-, 1992; Huerta, lismon, 1992). В зтшс работах показано увеличэние эффективности сшаптических связей и чувствительности нейронов к Гл при стимуляции ^лутаматоцептивннх входов нервных клеток на фоне действия АХ.

Согласно данным нааего исследования ведущим фактором, определяющим развитие ассоциативных перестроек реакций на Гл ври сочетаниях Гл и АХ, является не величина возбудительных реакций, на

медиаторы, а их. совпадение во времени, при этом ассоциативные перестройки реакций нейронов на аналог УС - Гл могут формироваться не только при полном (Еаешшвоп, Ьгукеь, 1938; ТгепЫсу et а1., 1930; Иэйеакг., 1991; ЗоЬгеигз. АЛкоц, 1952), но Ь. ГГиИ частичном перекрытии во времени нейронню. ответов, когда завершащий фрозт возбуздевия на Гл совпадает с началом возбудаельной регалии на АХ, т.е. при. временных отеоеэниях активности глутамато- к холиноцэптиввых вхо;рв, соответствующих условиям выработки поведенческого УР (Павлов, 1933; Паковая, 1957,1950; ВоЬаа^йбкил, 1966; 8т1гЬ et а!., 1969). '

В проведенном исследовании наряду с нейронами, проявившими длительное сохранение модифицированных ответов па медиаторы, обнаружены клетки с кратковременными перестройками реактивности, что подтверждает гипотезу о том, что при обучении лишь часть нейронов, проявивших условцорофлекторнце перестройкв. рнтзепости, имеет непосредственное отношение к фиксации л хранения временной связи и демонстрирует стабильные модификации хемораактивности (Коштоящ др., 1979).

Таким образом, обнаруженные наш ассоциативные перестройки глутаматоцептигадх входов могут леаать в основе механизма усиления реактивности корковых нейронов "к условному раздражителю при формировании поведенчоского УР.

выводи

«

I. Обнаружены различия в.реактивности нейронов сенсокоторной корт крыс к микроионофсретическзм аппликациям Гл я А1-. Ответы нейронов на Гл состоят из короткого возбудительного компонента, тогда как ответы на АХ характеризуются более продолютелыдзми возбудительными реакциями, а таете , развитием торкозных

к0мп0н9етов.

2. Многократные изолированные и сочэтапше аппликации медиаторов , приводят к модификациям фоновой активности и реакций нейронов на

Гл и АХ. Изменяется величина реакций, тогда как состав и последовательность компонентов остаются без изменений. Показано, что сншщпие холинореактивности характерно для клеток с тсриозно-возбудительвыми ответами на АХ.

3. Сравнительный анализ рзактавЕоста нзйршов к изолированным воздействиям медиаторов показал большую пластичность глутаматоцептжзных входов нейронов относительно холдооцептивных входов, что проявляется в глубине угашения реакций на Гл. Повторяющиеся аппликации Гл вызывают преимущественно снижение частоты фоновой импудьсацил нейронов, тогда как при ашйикациях АХ наблюдается ее рост.

4. Ассоциативная пластичность глутаматоцептивных входов в ходе сочетаниях предъявлений Гл и АХ проявляется в усиления реакций нейройов на Гл, тогда 'как холиверипэскне возбудительные реакции демонстрируют более глубокое угашэние.

5. Условием для развития ассоциативной пластичности глутаматоцептивных входов является совпадение во времени возбудительных компонентов реакций нейронов на Гл и АХ при ссчетанвых предъявлениях медиаторов. При отсутствии перекрытия наблюдается утешение возбудительных реакций на Гл как и в случае его изолированного действия. Не обнаружено зависимости пластичности ответов на Гл от величин возбудительных реакций на Гл и АХ при их последовательных предъявлениях в парах.

6. Между пластическими перестройками реакций на Гл я АХ при ех ассоциированном действии обнаружена взаимосвязь: в 55,6" случаев проявляется положительная корреляция и в 22,2% -отрицательная. У

36,32 Еийронов изменяется рэактивность только к одному из апшшцируемых мэдаатороз.

7. Нейроны сенссмотсрнсй кора различаются по длительности сохранения следовых . эффектов посла . отмени мзогокрэтнах изолированных и сочетании. подведений Гл а АХ. Ври вазобнсвл&ниа повторяющегося воздействия медиаторов через 20-60 мщгт у половины исследованных клеток происходит дальнейшее развитие пластических перестроек, что макет сщдетельсгзоЕать о разлзгсаой стапена насыщения пластических перестроек.

ШКСОа РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ по та® ДИССЖГАШИ.

1. Гусев П.А., Мясников А.А. ¡Значение мэгстимульного интервала в повторяющихся сочетании, предъявлениях ь-глукгмата и ацетзшзлина для .изменения ^реактивности корковых, нейрсновЛ' Куря., высц. нарз. деят.-1994.-Т.44, внз.2.-С.261-268. '

2. Гусев П. А. Дина'йака реактивности корковкх нейронов к твторящемуся" изолированному действию ь-глутамата" и ацетилхолина// Журн. высш. норв. деят.-1ЭЭ4.-1.44, вып. I.-С.135-142.

3. Гусев П.А. Зависимость динамики холикореактивгости с? паттзрна ответов корковых нейронов на ацетилхслин и активации рецепторов глутамата// Шйрсфкмолоп1Я/НеигорЬуз1о1обу. -1994.-Т.2, & 1.-С.

4. Гусев П.А. Динакика реактивности корковых нейронов по отноиввию а повторяющемуся сочетанному дэйстьз» ь-глутамата ъ ацэстаолЕна // Нейрофизиология /МеигорЬуз1о1оет.- 1993. - Т.1, * 2. -С. 94-98.

. 5. .Гусев П.А. Динамическая структура реактивности нейронов микросистем в коре головного мозга ери многократной локальной стимуляции-// Проблемы современной биологии: Тр. XIX научн. копф. мол. ученых биол. фак. МГУ. -М., 1933.-Дан. в ВИНИТИ■ й 6712-В88,.

-23Ч. З.-С. 39-43.

6. Котляр Б.It., Мясников A.A., Гусев П.А. Реакщш. нейронов сбнсомоторной облгсти за разное количество апплицируемого ацетилхолина// Биол, наука.-1987.-Ja 7.-C.6I-67.

7. Gusev P.A.. Interaoticn between oliangas of neurons responses to L-glutaaate and aoetylchQ-line applied in pairea and duration of activity modifications in the rat neooortex// European J.Nenrosoi.-1ЗЭЗ.-Suppl. Ко 6.-P.243. (Abstr.).

8. Gusev P.A. Information processing in the glutamats- and cholinergic neuro transmitter sy3tea3 in ths cerebral cortex at the level of postsynaptic neurons// European J. Neurosci.-1992.-Suppl. No 5.-P.53. (Afcstr.).

9. Gusev P.A. Cellular analogs of negative and associative learning: Determinants for. the ..slow dynamics of responsiveness оt single oortioal neurons to Ь-glutamate and acetylcholine// Program and Proceedings of the Fifth Conference on the Neurobiology of Learning and Memory, Irvine, California.-1992. (Abetr.).

10. Gusev P.A. Dynamics of spontaneous activity and glutamate- and aostylcholine-induccd spike responses of single rat sensorimotor cortical neurons during repeated separate and paired iontophoretic applications of . transmitters// Abstracts of Third 1БЯ0 World Congress of Ueurosoieuoa, 'lentreal, Canada.- 1991.- P.301.

11. Khludova, G.G., Uyasnikov, A.A., Gusev, P.A. & lyalks, V.?. Ihe significance of inters tinulus tizns interval for effective intsraotica of stimuli in small groups- of sensorinotor oortioal neurons in rats //Abstraots oi-Third IBRD World Congress of Naurosoienos, Montreal, Canada.-1991P.300.

12. Kotlyar,. 3.1., Khludova, G.G., Hyftonikov, A.A., Gusov, P.A. & Lyaliia, V.J. A niorosystGm of oortioal печгопз as a pro3peotive

element ol the neurocomputer //In: A.Y. Eoldon & Y.I. Kryukov (eds.), Heurocomputers anl Attention. - London: "ianchostor University irons.-1991.-Y.1.-P.33-43.