Изучение противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в моделях генерализованной эпилепсии у крыс

Ницинская, Лариса Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в моделях генерализованной эпилепсии у крыс
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в моделях генерализованной эпилепсии у крыс"

На правах рукописи

• - Ницинская

Лариса Евгеньевна /

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОСУДОРОЖНОГО ДЕЙСТВИЯ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 кДа В МОДЕЛЯХ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ ЭПИЛЕПСИИ У КРЫС

03.03.01. - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 3 ОЕВ 2011

Санкт-Петербург 2010

4843618

Работа выполнена в лаборатории сравнительной термофизиологии Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Екимова Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Лукомская Hepa Яковлевна

доктор медицинских наук, профессор Шабанов Петр Дмитриевич

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита диссертации состоится «,/» Зр^ л ¿К 2011 года в _ часов на

заседании диссертационного совета (Д 002.1^7.(Л) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессо{

М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Среди наиболее актуальных проблем эпилепсии остаются резистентность более трети больных к медикаментозному лечению и побочные эффекты современных противосудорожных препаратов [Bumham, 2006; Mula et al. 2007]. Это указывает на необходимость дальнейшего изучения механизмов защиты мозга в различных моделях эпилепсии. Особое внимание уделяется поиску веществ, содержащихся в мозге и обладающих нейропротективными свойствами и способностью вмешиваться в ключевые звенья генерации судорожной активности. Перспективными в этом отношении могут оказаться шапероны семейства белков теплового шока Heat Shock Proteins 70 kDa (HSP70).

HSP70 являются одними из основных систем контроля качества белков и защиты клеток и организмов от различных повреждающих факторов. Благодаря шаперонной активности два члена семейства HSP70 - конститутивный (Hsc70) и индуцибельный (Hsp70i) - участвуют в процессах фолдинга и рефолдинга полипептидов, ускорении транслокации белков через мембраны, а также в протеолитической деградации нестабильных белков, сборке и разборке белковых комплексов [Hartl, Hayer-HartI, 2002; Ron, Walter, 2007; Morimoto, 2008]. В головном мозге млекопитающих высокие уровни Hsc70 обнаруживаются в нормальных условиях, a Hsp70i - в условиях действия на организм высоких температур, гипоксии, нейротоксических соединений и других повреждающих факторов [Sharp et al., 1991; Bechtold et al., 2000., Moon et al., 2001; Chen, Brown, 2007]. Усиление экспрессии Hsp70i показано в коре головного мозга при височно-лобной эпилепсии у людей [Yang et al., 2008] и в нейронах гиппокампа крыс после генерализованных судорог, спровоцированных каиновой [Vass et al., 1989] или иботеновой кислотами [Planas, 1995]. Какое значение в механизмах эпилептогенеза имеет увеличение экспрессии Hsp70i в структурах головного мозга, пока не вполне понятно. Некоторые исследователи считают, что при развитии эпилептиформной активности мозга увеличение экспрессии и содержания Hsp70i в различных отделах лимбической системы связано с нейропротективной функцией этого белка, поскольку те нейроны, в которых содержание Hsp70i повышается, остаются неповрежденными после генерализованных судорог [Yang et al., 1996; Ayala, Tapia, 2008]. Имеющиеся в литературе единичные данные указывают на возможное противосудорожное действие Hsp70i. Показано, что тепловое прекондиционирование, вызывающее экспрессию белков теплового шока Hsp70i и других членов семейств HSP, в модели наследственной аудиогенной эпилепсии увеличивает только латентный период генерализованных судорог [Худик, 2009]. Остается не ясным, может ли эта процедура изменить длительность моторных компонентов судорог, а также тяжесть судорожного припадка и послесудорожных двигательных нарушений в моделях генерализованных судорог, вызванных гиперактивацией глутаматных рецепторов NMDA-типа или ослаблением тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге.

В течение многих лет считалось, что большая молекула №р7(Н не способна проходить сквозь плазматическую мембрану клеток, но постепенно накапливались данные о выходе НБр7(Н из клеток. Шаперон Нзр7(И найден во внеклеточном пространстве, а также в плазме крови и ликворе [Ту1е11 й а1., 1986; ОшЬоуа сА а\. 1998, 2001; Сапцив! е1 а!., 2003; 81еешЬег£ е1 а!., 2006]; его уровень снижается с возрастом и возрастает при таких заболеваниях, как гипертония и атеросклероз [Роск1еу, 2001]. После введения №р701 в ликвор третьего желудочка мозга крыс он преодолевает ликвороэнцефалический барьер, проникает в нейроны и пресинаптические терминали лимбических структур мозга и при этом ослабляет тяжесть ЫМБА- индуцированных судорог [Екшоуа е1 а1., 2010]. Показано, что в нейронах коры головного мозга и гиппокампа НБр701 колокализуется с везикулярным белком синаптофизином и белком-катализатором синтеза ГАМК глутаматдекарбоксилазой. Остается не выясненным, способен ли Нзр701 вступать в белок-белковое взаимодействие с синаптофизином и глутаматдекарбоксилазой в головном мозге. Противосудорожное действие экзогенного №р701 в модели генерализованных судорог, вызванных ослаблением тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге, не исследовалось.

Цель исследования - определить поведенческие показатели противосудорожного действия индуцибельного белка теплового шока 70 кДа (Нзр701) в моделях генерализованных ЫМБА-индуцированных и коразоловых судорог у крыс Вистар и выяснить мишени его действия в гиппокампе.

Выделены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние ингибитора экспрессии №р701 кверцетина на поведенческие показатели генерализованных судорог, вызванных активацией центральных глутаматных рецепторов ЫМБА-типа и ослаблением тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге (при системном введении коразола), а также на содержание Нзр701 в плазме крови и структурах головного мозга.

2. Определить эффекты теплового прекондиционирования на поведенческие показатели генерализованных ММОА-индуцированных и коразоловых судорог и содержание №р701 в структурах головного мозга и плазме крови.

3. Выяснить, способен ли кверцетин предотвращать влияние теплового прекондиционирования на поведенческие показатели судорожной активности в моделях ММОА-индуцированных и коразоловых судорог и на уровень Нзр701 в плазме крови и структурах головного мозга.

4. Изучить изменения поведенческих показателей коразоловых судорог при микроинъекциях в ликвор третьего желудочка мозга препарата №р70 и сопоставить эти изменения с эффектами теплового прекондиционирования.

5. Выяснить способность индуцибельного НБр701 вступать во взаимодействие с везикулярным белком синаптофизином и белком-ферментом синтеза ГАМК, глутаматдекарбоксилазой 67, в гиппокампе - структуре мозга, критической для генерации и поддержания генерализованной судорожной активности.

Научная новизна

В двух моделях генерализованной эпилепсии у крыс Вистар - при гиперактивации ШША-типа глутаматных рецепторов и снижении активности тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге (при системном введении коразола) - впервые установлено: а) отчетливое противосудорожное действие теплового прекондиционирования; б) усиление тяжести судорожного припадка и предотвращение противосудорожного действия теплового прекондиционирования ингибитором экспрессии шаперона №р701 кверцетином; в) повышение (или уменьшение) содержания Нзр7(Н в структурах мозга, участвующих в генерации и поддержании судорог, совпадает по времени с противосудорожным действием (или его угнетением), что указывает на ключевую роль индуцибельнош белка №р701 в противосудорожных эффектах теплового прекондиционирования. В модели коразоловых судорог впервые обнаружено противосудорожное действие экзогенного Нзр70, сопоставимое по показателям поведения с тепловым прекондиционированием. Впервые выяснены молекулярные мишени противосудорожного действия экзогенного НБр7(Н в гиппокампе.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антиконвульсантные эффекты теплового прекондиционирования совпадают по срокам с увеличением, а проконвульсантные эффекты кверцетина - с уменьшением содержания Нзр7(Н в структурах мозга, участвующих в реализации генерализованных ЫМОА-индуцированных и коразоловых судорог.

2. Увеличение содержания в мозге эндогенного Нзр7(Н (путем теплового прекондиционирования) и экзогенного Нзр7(М (при введении препарата №р70 в третий желудочек мозга) вызывает сходные противосудорожные эффекты в модели коразоловых судорог.

3. Везикулярный белок синаптофизин и ключевой фермент синтеза ГАМК, глутаматдекарбоксилаза 67, вовлечены в противосудорожное действие индуцибельного члена семейства НБР70.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа имеет фундаментальное значение для понимания защитной роли белков теплового шока семейства 70 кДа при таком социально значимом заболевании как эпилепсия, при котором около трети больных резистентны к медикаментозному лечению. Полученные в ходе исследования данные о противосудорожных эффектах индуцибельного белка №р7(И в двух моделях генерализованной эпилепсии и выявленные синаптические мишени его противосудорожного действия могут служить основанием для апробации в клинике ряда известных ранее и новых лекарственных средств растительного происхождения, увеличивающих экспрессию и содержание в мозге шаперонов 70 кДа. Перспективным является также использование индукторов Нэр701 при разработке подходов, направленных на снижение побочных эффектов

традиционных противосудорожных препаратов. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций по физиологии для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на 9-й - 11-й Всероссийских конференциях молодых ученых «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006 - 2008), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), на 9-й - 13-й Международных конференциях «Stress and behavior» (Санкт-Петербург, 2005, 2007, 2008 - 2010), на XX и XXI Съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), на VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых статьи в рецензируемых журналах - 3, статьи в сборниках научных работ - 2, тезисы докладов -13.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав, содержащих результаты исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 31 отечественных и 205 зарубежных источников. Работа изложена на 186 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 69 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 235 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой тела 170 - 220 г. Поведенческие судороги вызывали микроинъекцией агониста NMDA-типа глутаматных рецепторов Ы-метил-О-аспарагиновой кислотой (NMDA) (80 нг, Sigma, США) в третий желудочек мозга (3-й ж.м.) или в/б инъекцией коразола (75 мг/кг, пентилентетразол, Sigma, США). Для введения фармакологических препаратов в 3-й ж.м. животным под общим нембуталовым наркозом (в/б, 50 мг/кг) имплантировали проводящие канюли (0.8 мм каудальнее брегмы, 0 мм от средней линии и 6.0 мм ниже поверхности черепа) [Paxinos, Watson, 1998]. Микроинъекции растворов препаратов в 3-й ж.м. (в объеме 2 л4кл) проводили со скоростью введения 0.5 мкл/мин. В модели NMDA-индуцированных судорог регистрировали: латентный период моторных судорог, длительность «дикого» бега, длительность клонических и тонических судорог, количество животных с клоническими и тоническими судорогами, общую продолжительность припадка, количество животных с послесудорожными симптомами атаксии и ротационным синдромом, длительность симптомов атаксии и ротационного синдрома. В модели коразоловых судорог оценивали следующие поведенческие показатели: латентный период судорожного припадка,

длительность клонического и тонического компонентов судорог, количество животных с клоническими и тоническими судорогами, количество животных с симптомами атаксии, их длительность. Тяжесть судорог и послесудорожных симптомов атаксии оценивали в баллах по модифицированной шкале Рэсин [Racine, 1972] и Стёрджин [Рукояткина и др., 2000], соответственно. Для записи и анализа судорожной активности и симптомов атаксии, вызванных NMDA и коразолом, применялась система видеонаблюдения фирмы Logitech (Швейцария).

Для блокады экспрессии Hsp70i использовали биофлавоноид кверцетин (5 мг/кг, ICN, США), который в объеме 0.2 мл вводили животным в/б за 4 ч до инъекции NMDA или коразола. Контрольным животных вводили растворитель кверцетина (в/б, физиологический раствор с добавлением 1% Твин-20) в объеме 0.2 мл. Для усиления эндогенной экспрессии Hsp70i животных подвергали тепловому прекондиционированию за 24 ч до инициации судорог. Для этого наркотизированных крыс (нембутал, 50 мг/кг) нагревали до ректальной температуры 41° С и держали их при такой температуре тела в течение 10 мин. Контрольным крысам за 24 ч до инициации судорог в/б вводили нембутал. Для того чтобы оценить вклад Hsp70i в механизмы развития моторных судорог и послесудорожных двигательных нарушений при тепловом прекондиционировании, животным вводили кверцетин за 4 ч до проведения процедуры теплового прекондиционирования.

В опытах использовали препарат Hsp70, выделенный из красных (медленных) волокон тазобедренной мышцы быка (лаборатория защитных механизмов клетки Института цитологии РАН). Препарат Hsp70 состоял из смеси Hsp70i и Hsc70 в соотношении 7:3. Степень очистки препарата Hsp70 проверялась с помощью электрофореза и составляла более 97% [Guzhova et al., 1998; Novoselova et al., 2005]. Для исследования применяли препарат Hsp70, освобожденный от липополисахарида (ЛПС) путем пропускания через колонку с полимиксин В-агарозным гелем (Sigma, США). Для проверки степени очистки Hsp70 от ЛПС использовали общепринятый LALA-тест (Limulus polyphemus amebocyte lysate assay). Для того чтобы оценить влияние остаточной концентрации ЛПС в препарате Hsp70 на моторные судороги и послесудорожные двигательные нарушения, животным вводили термоденатурированный Hsp70 (нагревание на водяной бане до 100 °С в течение 5 мин). Препарат Hsp70 (6 мкг), термоденатурированный Hsp70 (6 мкг), фосфатный буфер (контрольная группа) вводились в 3-й ж.м. за 2 ч до инициации коразоловых судорог.

Определение содержания Hsp70i в плазме крови проводили с помощью модифицированного метода иммуноферментного анализа [Новоселов и др., 2004] с использованием поликлональных кроличьих антител против Hsp70i (клон R2, разведение 1:2000). Для исследования содержания Hsp70i в структурах головного мозга применяли метод иммуноблоттинга с использованием моноклональных мышиных антител против Hsp70i (клон 2Е4, разведение 1:2000). Антитела были получены в лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН.

Исследование взаимодействия Hsp70i с синаптофизином и глутаматдекарбоксилазой 67 (ГДК 67) проводили с помощью метода ко-

иммунопреципитации. Для этого использовали лизат, приготовленный из гиппокампа в буфере TBS (150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl рН 7.5, 1 мМ ЭДТА (рН 8.0), 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз). К пробам, содержащим 1 мг общего белка и доведенным до объема 1000 мкл TBS буфером, добавляли по 20 мкг препарата Hsp70 и инкубировали в течение ночи. После центрифугирования к образцам добавляли по 3 мкл белок-G агарозы (Sigma, США) и 2 мкл антител к синаптофизину (Abeam, Великобритания) или к ГДК 67 (Chemicon, США). В другие образцы добавляли по 20 мкл белок-G агарозы и 20 мкл моноклональных антител против экзогенного Hsp70i (клон 116, полученные в лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН). После инкубации гель осаждали центрифугированием, а супернатант отбирали для приготовления электрофорезных проб. Гель три раза отмывали TBS буфером и использовали для приготовления электрофорезных проб. Определение Hsp70i, синаптофизина или ГДК 67 проводили с помощью электрофореза и иммуноблоттинга. Для контроля за неспецифическим связыванием готовили пробы из лизатов, проинкубированных с белок-G- агарозой.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Для сравнения 2-х независимых групп животных по количественному признаку использовали t-критерий Стьюдента (при нормальном распределении), U-критерий Манна-Уитни (при ненормальном распределении). При проведении анализа качественных признаков в 2 независимых группах (анализ таблиц 2x2) применяли точный критерий Фишера. Различия полученных результатов считались статистически достоверными при уровне значимости р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние кверцетина на содержание Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга, а также на поведенческие показатели генерализованных судорог у крыс линии Вистар.

В контрольных условиях содержание Hsp70i в плазме крови крыс Вистар составляет в среднем 5±0.9 нг/мл. Введение растворителя кверцетина не влияло на уровень Hsp70i в плазме крови. Через 4 ч после в/б введения кверцетина у 100% крыс содержание Hsp70i в плазме крови было ниже определяемого уровня.

Из данных литературы известно, что в механизмы генерации и поддержания NMDA-индуцированных и коразоловых судорог вовлечены пириформная кора, миндалина, гиппокамп, гипоталамус, таламус, средний мозг, ядра мозжечка и др. структуры [Avoli et al., 2002; Valisek et al., 2007; Miller et al., 1987; Snyder-Keller, Keller, 2001; Brevard et al., 2006]. Поэтому при изучении содержания Hsp70i в головном мозге именно этим структурам уделялось особое внимание. Методом иммуноблоттинга выяснено, что через 4 ч после введения кверцетина содержание Hsp70i снижалось в гиппокампе и таламусе по сравнению с контролем (в/б введение растворителя кверцетина). В миндалине, гипоталамусе, пириформной коре, мозжечке и среднем мозге содержание Hsp70i не изменялось.

Введение К1МЕ)А крысам Вистар приводило с латентным периодом 6 ± 0.6 с к развитию «дикого» бега (длительностью 24 ± 1.7 с). Фаза «дикого» бега у 86% животных заканчивалась клоническими судорогами (12 ± 1.3 с), которые у 33% крыс переходили в фазу тонических судорог (3 ± 0.9 с). Общая длительность судорожного припадка составляла 36 ± 2.2 с. Судороги, индуцированные ЫМОА, вызывали гибель у 13% крыс. Тяжесть припадка составляла 3.8 балла. После окончания генерализованных судорог у 43% животных наблюдались симптомы атаксии (продолжительностью 82 ± 15.6 с), которые проявлялись неуклюжими и резкими движениями, потерей баланса при вставании на задние лапы, редкими заваливаниями на бок. Тяжесть симптомов атаксии составляла 2.5 балла. Ротационный синдром длительностью 27 ±5.1 с наблюдался у 64% животных. Введение растворителя кверцетина за 4 ч до инициации судорог не влияло на моторные компоненты NMDA-индyциpoвaнныx судорог и послесудорожные двигательные нарушения.

Установлено, что ЫМОА-индухшрованные судороги не вызывали изменения содержания Нзр7СЛ в плазме крови крыс Вистар. Анализ содержания Н»р701 в структурах головного мозга выявил, что через 24 ч после ЫМБА-индуцированных судорог уровень №р701 увеличивался в гиппокампе и не изменялся в пириформной коре, миндалине и гипоталамусе по сравнению с контролем (микроинъекция фосфатного буфера в 3-й ж.м.).

Введение кверцетина за 4 ч до введения ММГ)А увеличивало длительность тонических судорог в 4.3 раза (р<0.05) (рис. 1 А) и общую длительность судорожного припадка в 1.2 раза (р<0.05) (рис. 1 А) по сравнению с контролем. Несмотря на усиление тяжести судорожного припадка (рис. 1 Б) (преимущественно за счет возрастания на 30% (р<0.05) числа крыс с наиболее опасными для жизни тоническими судорогами), ни одно животное при введении кверцетина не погибало. В период после окончания судорожного припадка наблюдалось увеличение на 62% (р<0.05) числа крыс с симптомами атаксии, их средней длительности в 7 раз (р<0.05) и тяжести (практически у всех животных выявлялись бочкообразные движения или полная неспособность к перемещению). Увеличивалось число крыс с ротационным синдромом (на 20%) и повышалась его средняя длительность в 1.9 раз (р<0.05) по сравнению с контролем.

□ контрольный р-р+ЫМРА а кверцетин+ЫМОА

¿С

Латентный "Дикий" Клонические Тонические Длительн период бег судороги судороги ость

припадка

Рис. 1 Влияние кверцетина на моторные компоненты ИМОА-индуцированных судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.

Здесь и на рисунках 2, 4-8 данные на рисунке А представлены как среднее арифметическое ± ошибка среднего; данные на рисунке Б представлены в виде усредненных значений баллов. Обозначения:

«контрольный р-р+ИМОА» - крысы, которым за 4 ч до инъекции КМ13А в/б вводили растворитель кверцетина (п=8)

«кверцетин+ЫМБА» - крысы, которым за 4 ч до инъекции в/б вводили

кверцетин (п=10)

Здесь и на последующих рисунках звездочками отмечены статистически значимые различия между экспериментальной и контрольной группами: * - при уровне значимостир<0.05, ** - при уровне значимостир<0-01.

Введение крысам линии Вистар коразола приводило с латентным периодом 42 ± 1.9 с к развитию судорожного припадка, начинавшегося с отдельных подергиваний скелетной мускулатуры туловища и развития орально-лицевых судорог. После этого у всех исследуемых животных следовала фаза клонических судорог (длительностью 12 ± 0.9 с), а затем у 90% - фаза тонических судорог (10 ±1.2 с). Коразоловые судороги вызывали смерть у 90% крыс. Тяжесть припадка составляла 6 баллов. После окончания судорожного припадка у 90% животных наблюдались двигательные нарушения в виде симптомов атаксии (продолжительностью 1233 ±63.2 с и тяжестью в 4.9 баллов), которые проявлялись в виде значительного ухудшения антигравитационных рефлексов, полной неспособности к перемещению. Введение растворителя кверцетина за 4 ч до инициации судорог не изменяло поведенческих показателей коразоловых судорог.

Коразоловые судороги, как и ММОА-индуцированные судороги, не влияли на содержание №р 701 в плазме крови крыс. Через 6 ч после окончания коразоловых судорог содержание Нзр701 увеличивалось в гиппокампе, а через 24 ч - в гиппокампе и мозжечке и не изменялось в остальных исследованных структурах по сравнению с контролем (в/б инъекция физиологического раствора).

Введение кверцетина увеличивало длительность клонических судорог в 2 раза (р<0.05) (рис. 2 А), а тонических - в 1.4 раза (р<0.05) (рис. 2 А). Блокада экспрессии №р701 кверцетином не влияла на гибель животных и тяжесть судорожного припадка по сравнению с контролем (рис. 2 Б). Изменений числа животных с симптомами атаксии, их длительности и тяжести не обнаружено.

□ контрольный р-

р+коразол а кверцетин+ко раз ол

Латентный период

Клоническне судороги

Тонические судороги

Рис. 2 Влияние кверцетина на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на

тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.

Обозначения:

«контрольный р-р+ коразол» - крысы, которым за 4 ч до инъекции коразола в/б вводили растворитель кверцетина (п=9)

«кверцетин+коразол» - крысы, которым за 4 ч до инъекции коразола в/б вводили кверцетин (п=11)

Увеличение длительности моторных компонентов судорожных припадков и послесудорожных двигательных нарушений, выявляемое в те же сроки, что и уменьшение содержания Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга, свидетельствует о возможном вовлечении шаперона Hsp70i в центральные механизмы регуляции генерализованных судорог. Снижение уровня Hsp70i в гиппокампе и таламусе, нейроны и нервные сети которых включены в механизмы инициации и поддержания эпилептиформной активности мозга [Avoli et al., 2002; Brevard, et al., 2006], по-видимому, приводит к усилению нарушений синаптических процессов в этих структурах, вызванных NMDA или коразолом, и, как следствие, к увеличению тяжести судорожного синдрома и послесудорожных двигательных нарушений. Основанием для данного предположения послужили исследования, в которых показано, что Hsp70 вовлечен в молекулярные механизмы экзоцитоза [Swaine et al., 2006] и клатрин-зависимого эндоцитоза синаптических везикул [Ungewickell et al., 1995, Morgan et al., 2001], а также модулирования работы N-типа Ca2+ каналов [Natochin et al., 2005; Miller et al., 2003].

2. Исследование эффектов теплового прекондиционирования на поведенческие показатели NMDA-индуцированных и коразоловых судорог и содержание Hsp70i в плазме крови н структурах головного мозга

Чтобы определить способность эндогенного белка Hsp70i оказывать противосудорожное действие в моделях генерализованной эпилепсии у крыс, представлялось важным исследовать влияние увеличения его содержания в головном мозге на судорожную активность и послесудорожные двигательные нарушения, индуцированные NMDA и коразолом. Для увеличения содержания Hsp70i в головном мозге использовали краткосрочное тепловое прекондиционирование крыс, которое, как известно, вызывает увеличение экспрессии и содержания белков теплового шока, в том числе и Hsp70i, в различных структурах мозга [Manzerra et al., 1997; Leoni et al., 2000]. Поскольку тепловое прекондиционирование проводилось в условиях нембулового наркоза, были выполнены контрольные серии экспериментов по изучению эффекта нембутала на исследуемые показатели через 24 ч с момента его введения.

Наше исследование показало, что введение нембутала не влияло на содержание Hsp70i в плазме крови крыс Вистар. Через 15 мин после теплового прекондиционирования содержание Hsp70i в плазме крови увеличивалось в 4.5 раз (р<0.01), а к 60 мин снижалось до контрольных значений. Через 6 ч после теплового прекондиционирования содержание Hsp70i увеличивалось в

пириформной коре, таламусе, гипоталамусе, гиппокампе, среднем мозге и мозжечке и не изменялось в миндалине, по сравнению с контролем (рис. 3). Через 24 ч после теплового прекондиционирования содержание Нзр7(Н увеличивалось во всех исследованных структурах (рис. 3).

К 24 ч ^ Квч

ГАФДГ _

н 70 ШШМШИШ

ГАФДГ

Нэр70I Г.ЛФДГ , . . . ,- \

ГАФДГ

Мозжечок

Гиппокамп

Пириформная кора

Средний мозг

Гипоталамус

Миндалина

Тала мус

Рис. 3 Влияние теплового прекондиционирования на содержание индуцибельного белка теплового шока 70 кДа (Нзр7(М) в структурах головного мозга крыс линии Вистар. Обозначения:

«К 6 ч», «К 24 ч» - в/б введение нембутала

контрольным крысам за 6 ч и 24 ч до

декапитации, соответственно;

«ТП 6 ч», «ТП 24 ч» - крысы, которых

декапитировали через 6 ч и 24 ч после

теплового прекондиционирования,

соответственно.

Выяснено, что введение нембутала не влияло на поведенческие компоненты ЫМОА-индуцированных судорог и послесудорожные двигательные нарушения. Проведение процедуры теплового прекондиционирования под нембуталовым наркозом увеличивало латентный период «дикого» бега (в 14 раз, р<0.01), снижало длительность клонических судорог (в 1.9 раза, р<0.05) и общую длительность судорожного припадка (в 1.5 раз, р<0.05) по сравнению с контролем (рис. 4 А). Тяжесть судорог после теплового прекондиционирования снижалась (рис. 4 Б) преимущественно за счет сокращения на 56% (р<0.05) количества крыс с клоническими судорогами. Обнаружено уменьшение в 2 раза числа крыс с симптомами атаксии (р<0.05) и ослабление их тяжести. В отличие от контрольной группы, симптомы атаксии после теплового прекондиционирования проявлялись в виде необычных, неуклюжих и резких движений. Количество животных с ротационным синдромом и его длительность не изменялись.

□ нембутал-нЫМОА и ТП+ЫМОА

Кпонические Длительность судороги припадка

Рис. 4 Влияние теплового прекондиционирования на моторные компоненты ЫМЕ>А-индуцированных судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар. Обозначения:

«нембутал+М1уЦЗА» - контрольные крысы, подвергавшиеся нембуталовому наркозу за 24 ч до введения КМОА (п=5);

«ТП+МуЮА» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения ЫМОА (п=9).

Показано, что инъекция нембутала не изменяла моторные компоненты судорог и послесудорожные симптомы атаксии, вызванные коразолом. Процедура теплового прекондиционирования в 1.8 раз (р<0.05) увеличивала латентный период коразоловых судорог и снижала тяжесть судорожного припадка по сравнению с контролем (рис. 5 А, Б). Снижение тяжести коразоловых судорог происходило за счет уменьшения числа животных с тоническими судорогами (на 50%, р<0.05) и снижения смертности (на 50%, р<0.05). Тепловое прекондиционирование вдвое (р<0.05) сокращало число животных с симптомами атаксии, их длительность (в 1.4 раза, р<0.05) и тяжесть. После теплового прекондиционирования животные уже могли поддерживать баланс во время вставания на лапы, однако, сохранялись резкие и неуклюжие движения.

л Б

О нембутал+коразол л 5 8

ЕЭ ТП+коразол

Латентный период

Кпонические судороги

Тонические судороги

Рис. 5 Влияние теплового прекондиционирования на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар. Обозначения:

«нембутал+коразол» - контрольные крысы, подвергавшиеся нембуталовому наркозу за 24 ч до введения коразола (п=9);

«ТП+коразол» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения коразола (п=10).

Полученные данные свидетельствуют, что при инициации NMDA и коразоловых судорог на сроках, совпадающих с увеличением содержания Hsp70i в структурах лимбической системы, наблюдается увеличение латентного периода судорожного припадка, уменьшение его тяжести и послесудорожных симптомов атаксии. Эти данные позволили нам высказать гипотезу, что основной вклад в противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования вносит индуцибельный белок Hsp70i.

3. Влияние кверцетина на поведенческие показатели судорожной активности в моделях генерализованных судорог и на уровень Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга после теплового прекондиционирования

Поскольку тепловое прекондиционирование вызывает экспрессию не только Hsp70i, но и других членов семейств белков теплового шока [Bechtold, Brown, 2003; Kim et al., 2004], которые могут обладать и антагонистическими свойствами, представлялось важным изучить влияние ингибитора экспрессии Hsp70i кверцетина на поведенческие показатели судорожной активности в моделях NMDA-индуцированных и коразоловых судорог и на уровень Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга после теплового прекондиционирования. Проведенное исследование показало, что введение кверцетина за 4 ч до теплового прекондиционирования предотвращало вызываемые им противосудорожные эффекты и повышение содержания Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга (пириформной коре, гиппокампе, миндалине, гипоталамусе, таламусе, среднем мозге). В этих опытах отмечено утяжеление судорожного припадка, вызванного введением NMDA. Об этом свидетельствовали: уменьшение латентного периода «дикого» бега в 12 раз (р<0.01), увеличение длительности клонических судорог в 1.7 раз (р<0.05) и общей длительности судорожного припадка в 1.5 раза (р<0.05) по сравнению с группой животных, которых подвергали тепловому прекондиционированию (рис. 6 А). При этом число крыс с клоническими судорогами возрастало на 56% (р<0.05) и тяжесть припадка увеличивалась (рис. 6 Б). После окончания судорог наблюдалось увеличение числа крыс с симптомами атаксии (на 78%, р<0.05), их длительности (в 2 раза, р<0.05) и тяжести по сравнению с тепловым прекондиционированием и контролем (в/б растворитель кверцетина, через 4 ч-введение нембутала). Практически у всех животных выявлялись бочкообразные движения или полная неспособность к перемещению. Количество животных с ротационным синдромом и его длительность не изменялись.

О контрольный р-р+нембутал+ЫМОА ТП+ММОА

кверцетин+ТП+ЫМРА

Латентный

период

Клонические Длительность судороги припадка

Рис. 6 Влияние кверцетина на моторные компоненты ЫМГОА-индуцированных судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) после теплового прекондиционирования у крыс линии Вистар. Обозначения:

«конярольный р-р+нембутал+ММОА» - крысы, которым за 24 ч до инъекции ЫМВА в/б вводили растворитель кверцетина и нембутал (п=5);

«ТП+ММБА» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения ММГОА (п=9);

«кверцетин+ТТМЧМОА» - крысы, которым вводили ЫМОА через 24 ч после теплового прекондиционирования, проведенного через 4 ч после введения кверцетина (п=5). Решетками отмечены статистически значимые различия между группами «ТП+ММОА» и «кверцетин+ТП+ЫМОА, # - при уровне значимости р<0.05, М - при уровне значимости р<0.01.

В модели коразоловых судорог введение кверцетина за 4 ч до теплового прекондиционирования, также как и при ММБА-индуцированных судорогах, усиливало тяжесть судорожного припадка. Об этом свидетельствовали снижение латентного периода судорог в 2 раза (р<0.05) и увеличение длительности тонических судорог в 1.4 раза (р<0.05) по сравнению с тепловым прекондиционированием (рис. 7 А). Тяжесть коразоловых судорог увеличивалась (рис. 7 Б) за счет увеличения количества животных с тоническими судорогами (на 36%, р<0.05) и увеличения гибели животных (на 46%, р<0.05). При введении кверцетина за 4 ч до теплового прекондиционирования наблюдалось увеличение на 36% (р<0.05) количества крыс с симптомами атаксии, их длительности (в 1.3 раза, р<0.05) и тяжести. Практически у всех животных симптомы атаксии проявлялись неспособностью к перемещению или бочкообразными движениями, чего не наблюдалось в группе с тепловым прекондиционированием.

А л □ контрольный р- Б

р+нембутал+коразол И ТП+коразол

I кверцетин+ТП+коразол

Латентный период

Клонические судороги

Тонические судороги

Рис. 7 Влияние кверцетина на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) после теплового прекондиционирования у крыс линии Вистар. Обозначения:

«контрольный р-р+нембутал+ коразол» - крысы, которым за 24 ч до инъекции коразола в/б вводили растворитель кверцетина и нембутал (п=7);

«ТП+ коразол» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения коразола (п=10);

«кверцетин+ТП+коразол» - крысы, которым вводили коразол через 24 ч после теплового прекондиционирования, проведенного через 4 ч после введения кверцетина (п=7). Решеткой отмечены статистически значимые различия между группами «ТП+коразол» и «кверцетин+ТП+коразол» при уровне значимостир<0.05.

Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что основной вклад в противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования вносит индуцибельный белок №р701, содержание которого значительно возрастает после теплового прекондиционирования в лимбических структурах головного мозга, вовлеченных в инициацию и поддержание генерализованных судорог. Противосудорожные эффекты №р7(Н могут быть связаны с его способностью модулировать пресинаптические процессы передачи сигнала в головном мозге. В пользу данного предположения указывают электрофизиологические исследования, выполненные на слайсах продолговатого мозга мыши и нервно-мышечном соединении личинки БгозорЫк, в которых показано, что тепловое прекондиционирование защищало синаптическую передачу от повреждающего действия высоких температур путем модулирования пресинаптических процессов высвобождения нейромедиаторов [КагипапкЫ е! а!., 1999; Кеку et а!., 2002].

4. Изучение противосудорожных эффектов препарата Нвр70

Увеличения содержания Нзр701 в структурах головного мозга можно достичь также путем введения в ликворную систему мозга препарата №р70 [Екитюуа е1 а!., 2010]. Проведенное исследование показало, что введение препарата №р70 в ликвор 3-го ж.м. увеличивало латентный период судорожного припадка в 1.2 раза (р<0.05) и в 1.7 раз (р<0.05) укорачивало длительность клонических судорог по сравнению с контролем (рис. 8 А). Количество животных с тоническими судорогами уменьшалось на 45% (р<0.05). Экзогенный №р70, как и тепловое прекондиционирование, понижал смертность крыс на 45% (р<0.05) и тяжесть судорог (рис. 8 Б). Отмечено уменьшение числа крыс с симптомами атаксии на 45% (р<0.05) и ослабление их тяжести. Симптомы атаксия проявлялись в виде резких, неуклюжих движений и редких заваливаний на бок. Введение растворителя №р70 (фосфатный буфер) и термоденатурированного №р70 в 3-й ж.м. крыс не оказывало влияния на моторные компоненты коразоловых судорог и послесудорожные двигательные нарушения.

□ фосфатный

бу фер+ коразол ® Нэр70+коразол

Рис. 8 Влияние экзогенного №р70 на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и

на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.

Обозначения:

«фосфатный буфер+коразол» - крысы, получавшие инъекцию фосфатного буфера в 3-й ж.м. за 2 ч до в/б введения коразола (п~9);

«Нзр70+коразол» - крысы, которым за 2 ч до введения коразола делали микроинъекцию Нэр70 в 3-й ж.м. (п=11).

Таким образом, увеличение содержания в мозге экзогенного Нзр701 (при введении его в 3-й ж. м.) оказывает сходный с тепловым прекондиционированием противосудорожный эффект в модели коразоловых судорог. Эти данные являются еще одним подтверждением противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в модели генерализованной эпилепсии.

5. Исследование белок-белкового взаимодействия экзогенного индуцибельного Шр701 с синаптофизином и глутаматдекарбоксилазой 67

С помощью метода конфокальной микроскопии недавно показано, что меченый флуоресцентным красителем препарат №р70, введенный в 3-й ж.м. крыс, способен проникать в структурные элементы мозга [ЕЫтоуа ег а!., 2010]. В гиппокампе экзогенный Нзр70 колокализовался с белком-катализатором синтеза ГАМК, глутаматгидроксилазой 67 (ГДК 67), и белком синаптических везикул, синаптофизином. Эти данные позволили предположить, что №р70 может физически связываться с синаптофизином и ГДК 67. С помощью метода ко-иммунопреципитации выяснено, что в гиппокампе экзогенный индуцибельный Нзр701 взаимодействует с синаптофизином (рис. 9), о чем свидетельствовало появление в преципитате Нэр701 (верхняя панель рис. 9) и синаптофизина (нижняя панель рис. 9). Синаптофизин и №р701 присутствовали также в супернатанте (фракция белков лизата, не связавшихся с антителами против синаптофизина или экзогенного Н$р700. Это свидетельствует об избыточном количестве Н5р701 и синаптофизина в инкубационной смеси.

ИП: Синаптофизин

иб: Нэр701

ип:Н5р70| ИБ: Синаптофизин

Нэр70

■ Синаптофизин

Рис. 9 Экзогенный индуцибельный Нзр701 вступает в белок-белковое взаимодействие с синаптофизином в гиппокампе крыс.

Верхняя панель рис.: после иммунопреципитации с антителами

против синаптофизина белковые комплексы осаждали белок-в- агарозой и анализировали методом ИБ с антителами против экзогенного №р701 Нижняя панель рис.: после иммунопреципитации с антителами против экзогенного №р701 белковые комплексы осаждали белок-О- агарозой и анализировали методом ИБ с антителами против синаптофизина Сокращения здесь и на рис. 10: ИП - иммунопреципитат ИБ - иммуноблоттинг

Выявлено, что экзогенный №р7(Н способен вступать во взаимодействие и с ГДК 67 в гиппокампе крыс. На это указывало появление в преципитате №р701 (рис. 10). На рис. 10 видно, что Нзр701 присутствует также в супернатанте, что указывает на избыточное количество Нвр701 в инкубационной смеси. Эти данные позволили предположить, что синаптофизин и ГДК 67 - ключевые мишени противосудорожного действия индуцибельного Нзр70ь

Рис. 10 Экзогенный индуцибельный Шр701 вступает в белок-белковое взаимодействие с ГДК 67 в гиппокампе крыс.

На рис. 10: после иммунопреципитации ■ Нзр70| с антителами против ГДК 67 белковые комплексы осаждали белок-й- агарозой и анализировали методом ИБ с антителами против экзогенного Нзр701

Таким образом, в ходе работы получены новые данные о том, что ингибитор экспрессии №р701 кверцетин, вызывающий уменьшение содержания Нзр701 в плазме крови и структурах головного мозга (гиппокамп, таламус), оказывал проконвульсантное действие в моделях генерализованной эпилепсии. Тепловое прекондиционирование, увеличивавшее содержания №р701 в структурах головного мозга, вовлеченных в генерацию и поддержание судорожной активности (гиппокамп, пириформная кора, миндалина, гипоталамус, таламус, средний мозг), напротив, оказывало противосудорожное действие и снижало послесудорожные двигательные нарушения, вызванные ММЕ)А и коразолом. В условиях действия ингибитора экспрессии №р701 кверцетина, тепловое прекондиционирование не вызывало увеличения содержание Нэр701 в структурах головного мозга крыс и не оказывало противосудорожного действия в моделях генерализованной эпилепсии. Эти данные указывают на то, что противосудорожное действие теплового прекондиционирования связано с

увеличением содержания индуцибельного НБр7(Н в структурах головного мозга, «критических» для реализации судорожной активности. В пользу данного предположения свидетельствуют и данные, полученные при введении экзогенного №р70 в 3-й ж.м. крыс. Экзогенный Нзр70 оказывал противосудорожное действие, сходное с тепловым прекондиционированием. В ходе исследования выяснено, что в гиппокампе молекулярными мишенями противосудорожного эффекта №р7(И могут являться везикулярный белок синаптофизин и ключевой фермент синтеза ГАМК, ГДК 67. Можно полагать, что противосудорожное действие Нзр7(Н связано с его способностью вовлекаться в молекулярные механизмы модуляции экзоцитоза синаптических везикул и функции фермента синтеза ГАМК, ГДК 67, в интернейронах гиппокампа. Возникновение судорожного синдрома связано с нарушением баланса между возбуждающими и тормозными процессами в мозге. По-видимому, увеличение содержания Нзр7(Л в головном мозге, достигнутое тепловым прекондиционированием или введением препарата Нзр70 в 3-й ж.м., усиливает ГАМК-связанные пресинаптические механизмы передачи тормозного сигнала в ЦНС. Эти тормозные механизмы являются ключевыми в процессах снижения активности возбуждающих систем и проявления противосудорожного эффекта НБр7(Н в моделях генерализованной эпилепсии.

ВЫВОДЫ

1. Ингибитор экспрессии №р701 кверцетин увеличивает а) длительность тонического компонента судорог, тяжесть припадка и послесудорожных симптомов атаксии в модели ИМБА-индуцированных судорог и б) длительность не только тонического, но и клонического компонента в модели коразоловых судорог; этим проконвульсантным эффектам кверцетина в обеих моделях генерализованных судорог у крыс соответствует по срокам (через 4 часа) уменьшение содержания шаперона Нзр7(Н в гиппокампе, таламусе и в плазме крови.

2. Кратковременное (в течение 10 мин) тепловое прекондиционирование в обеих моделях судорог вызывает увеличение латентного периода судорожной активности и ослабление тяжести судорожного припадка и послесудорожных симптомов атаксии; эти противосудорожные эффекты совпадают по срокам (через 24 ч) с повышением содержания шаперона №р701 в структурах мозга, участвующих в реализации генерализованных судорог (гиппокамп, пириформная кора, миндалина, гипоталамус, таламус, средний мозг).

3. В обеих моделях судорог введение кверцетина за 4 часа до теплового прекондиционирования предотвращает вызываемые им противосудорожные эффекты и повышение содержания №р701 в плазме крови и структурах головного мозга (гиппокампе, пириформной коре, миндалине, гипоталамусе, таламусе, среднем мозге).

ослабление тяжести припадка и послесудорожных симптомов атаксии), а также отчетливое уменьшение длительности клонических судорог.

5. Индуцибельный белок Hsp70i вступает в межмолекулярное взаимодействие с везикулярным белком синаптофизином и ферментом синтеза ГАМК, глутаматдекарбоксилазой 67 (ГДК67), в гиппокампе крыс. Синаптофизин и ГДК67 являются молекулярными мишенями противосудорожного действия Hsp70i.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Екимова И.В., Комарова Т.Г., Ницинская Л.Е., Пастухов Ю.Ф., Гужова И.В. Эффекты экзогенного белка теплового шока 70 кДа и кверцетина на NMDA-индуцированные судороги // Докл. РАН - 2008. - Т. 418. -№ 5. - С. 705-708.

2. Ницинская JI. Е., Екимова И. В., Гужова И. В., Фейзулаев Б. А., Пастухов Ю.Ф. Влияние кверцетина на тяжесть химически индуцированных судорог и содержание белка теплового шока 70 кДа в структурах головного мозга крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2010. - Т. 96. - № 3. - С. 283-292.

3. Ekimova I.V., Nitsinskaya L.E., Romanova I.V., Pastukhov Yu.F., Margulis B.A., Guzhova I.V. Exogenous protein Hsp70 can penetrate into the brain structures and attenuate the severity of chemically-induced seizures. J. Neurochem. - 2010. -V. 115.- №4. -P. 1035-1044.

Статьи в сборниках научных работ

1. Екимова И.В., Ницинская Л.Е., Комарова Т.Г., Пастухов Ю.Ф., Гужова И.В. Роль белка стресса в механизмах развития судорожных состояний // Стресс и висцеральные системы. - Мн: ПЧУП "Бизнесофсет". - 2005. - С. 80-84.

2. Ницинская Л.Е., Худик К.А., Пастухов Ю.Ф. Влияние теплового прекондиционирования на судорожную активность на разных моделях экспериментальной эпилепсии у крыс // Медико-биологические аспекты действия физических факторов. - Мн: ПЧУП "Бизнесофсет". - 2006. - С. 181184.

Тезисы докладов

1. Pastukhov Iu. F., Komarova Т. G., Nitsinskaya L. E., Ekimova I. V. Effects of HSP70 on NMDA-induced seizure in rats // Abstr. of the IXth Conference «Stress and Behavior». Psychopharmacology & biological narcology. - St.-Petersburg. -2005.-P. 900.

2. Chernyshev M.V., Nitsinskaya L.E. An inhibitor of HSP expression quercetin does not alter open field behavior in rats predisposed to audiogenic seizures // Abstr. of the IXth Conference «Stress and Behavior». Psychopharmacology & biological narcology. - St.-Petersburg. - 2005. - P. 123.

3. Комарова Т. Г., Ницинская Л. Е. Влияние белка теплового шока 70кДа и кверцетина на поведение белых крыс при гиперактивации NMDA типа глутаматных рецепторов // Тез. Всероссийской конференции молодых

исследователей «Физиология и медицина». - Вестник молодых ученых. -Санкт-Петербург. - 2005. - С. 56.

4. Ницинская Л.Е. Влияние теплового прекондиционирования на судорожную активность, вызванную пентилентетразолом // Материалы 9-ой Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2006. - С. 152-153.

5. Ницинская Л.Е., Худик К.А. Изучение противосудорожных эффектов Hsp70 у крыс линии Wistar и Крушинского-Молодкиной // Материалы 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2007. - С.309-310.

6. Екимова И.В, Пастухов Ю.Ф., Комарова Т.Г., Ницинская Л.Е. Шапероны в регуляции судорожной активности // Материалы XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва. - 2007. - С. 35-36.

7. Ekimova I.V., Nitsinskaya L.E., Pastukhov Iu.F., Guzhova I.V. Study of effects of thermal preconditioning and quercetin on seizure activity and content of heat shock protein 70 kDa in blood plasma in Wistar rats // Abstr. of the 10th Jubilee Multidisciplinaiy International Conference of Biological Psychiatry «Stress and behavior». - St.-Petersburg. - 2007. - P. 22.

8. Ницинская Л.Е. Влияние теплового прекондиционировния на содержание Hsp70 кДа в структурах головного мозга и на коразол-индуцированную судорожную активность // Материалы 11-ой Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. -2008. -. С.262-263.

9. Khudik К.А., Nitsinskaya L.E., Guzhova I.V., Ekimova I.V., Pastukhov Yu.F. Role of chaperones 70 kDa in pathogenesis of seizures with different etiology // Abstr. of the 11th Multidisciplinaiy International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference «Stress and behavior». - St.-Petersburg. - 2008. - P. 59-60.

10. Yakimchuk A., Nitsinskaya L., Ekimova I., Guzhova I. The role of the Hsp70 in the regulation of motor seizures // Abstr. of the 12th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference «Stress and behavior». - St.-Petersburg. - 2009. - P. 42.

11. Екимова И.В., Ницинская Л.Е., Романова И.В., Гужова И.В., Пастухов Ю.Ф. Центральные механизмы реализации сомато-висцеральных и противосудорожных эффектов белка теплового шока 70кДа // Материалы УП Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». — Санкт-Петербург. — 2009. -. С. 159-160.

12. Nitsinskaya L. The effects of thermal preconditioning and exogenous Hsp70 on motor disorders after chemically induced seizures // Abstr. of the 14th Multidisciplinaiy International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference «Stress and behavior». - St.-Petersburg. - 2010. - P. 43.

13. Ницинская Л.Е. Молекулярные мишени экзогенного белка теплового шока 70кДа в головном мозге // Материалы XXI Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Калуга. - 2010. - С. 442-443.

Ницинская Л.Е Изучение противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в моделях генерализованной эпилепсии у крыс // Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.03.01 - СПб., 2010. - 22 с.

Подписано в печать 27.12.2010. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ И-Ц . Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО «Принт-Экспресс» 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ницинская, Лариса Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Этиология и патогенез эпилепсии.

1.1.1. Механизмы возникновения и развития эпилепсии.

1.1.2. Экспериментальные модели эпилепсии.

1.2. Протективные свойства белков теплового шока.

1.2.1. Структура и функции белков теплового шока 70 кДа.

1.2.2. Защитные свойства внутриклеточных белков теплового шока 70 кДа

1.2.2.1. Терапевтический потенциал индукции внутриклеточных белков теплового шока 70 кДа.*.

1.2.2.2. Эффекты блокаторов белков теплового шока 70 кДа.

1.2.3. Защитные свойства внеклеточных белков теплового шока 70 кДа.

1.2.4. Защитные свойства экзогенных белков теплового шока 70 кДа.

1.2.5. Участие белков теплового шока 70 кДа в защите функции синапсов.

1.2.5.1. Участие эндогенных белков теплового шока 70 кДа в защите функции синапсов.

1.2.5.2. Участие экзогенных белков теплового шока 70 кДа в защите функции синапсов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Операции.

2.3. Используемые модели фармакологических судорог.

2.3.1. Генерализованные судороги, вызванные 1Ч-метил-Р-аспарагиновой кислотой.

2.3.2. Коразоловые судороги.

2.4. Использование биофлавоноида кверцетина для блокады экспресии индуцибельной изоформы Шр701.

2.5. Метод теплового прекондиционирования.

2.6. Метод получения, очистки и введения препарата экзогенного Hsp70i/Hsc70.

2.7. Метод определения содержания индуцибельной изоформы Hsp70i в плазме крови крыс.

2.7.1. Описание экспериментальных серий.

2.7.2. Метод иммуно-ферментного анализа.

2.8. Метод определения содержания индуцибельной изоформы Hsp70i в структурах головного мозга крыс.

2.8.1 Описание экспериментальных серий.

2.8.2. Приготовление электрофоретических проб.

2.8.3. Гель-электрофорез.

2.8.4. Перенос и иммуноблоттинг.

2.9. Метод изучения белок-белковых взаимодействий.

2.10. Методы статистической обработки данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Влияние ингибитора экспрессии Hsp70i кверцетина на судорожную активность и послесудорожные двигательные нарушения у крыс линии Вистар.

3.1. Изменение содержания индуцибельной изоформы Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга при системном введении кверцетина.

3.2. Влияние кверцетина на моторные судороги и послесудорожные двигательные нарушения, вызванные N-метил-Р-аспарагиновой кислотой.

3.2.1. Характеристика моторных компонентов судорожного припадка и послесудорожных двигательных нарушений, индуцированных N-Memim-D-аспарагиновой кислотой.

3.2.2. Исследование содержания индуцибельной изоформы Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга крыс после судорог, вызванных введением N-Memm-D-acnapazuHoeoü кислоты.

3.2.3. Влияние кверцетина на моторные компоненты судорог и послесудорожные двигательные нарушения, инициированные Ы-метил-В-аспарагиновой кислотой.

3.3. Изучение влияния кверцетина на моторные судороги и послесудорожные двигательные нарушения, вызванные коразолом у крыс линии Вистар.

3.3.1. Характеристика моторных компонентов судорожного припадка и послесудорожных двигательных нарушений, индуцированных коразолом.

3.3.2. Исследование содержания индуцибельной изоформы Няр701 в плазме крови и структурах головного мозга крыс после коразоловых судорог.

3.3.3. Влияние кверцетина на компоненты моторных судорог и послесудорожные двигательные нарушения, вызванные коразолом.

3.4. Резюме.

Глава 4. Исследование эффектов теплового прекондиционирования на моторные судороги и послесудорожные двигательные нарушения в моделях генерализованной эпилепсии.

4.1. Исследование содержания индуцибельной изоформы Нзр7(Н в плазме крови и структурах головного мозга крыс после процедуры теплового прекондиционирования.

4.2. Влияние теплового прекондиционирования на моторные компоненты судорог и послесудорожные двигательные нарушения, вызванные введением "Ы-метил-Р-аспарагиновой кислоты.

4.3. Изучение влияния теплового прекондиционирования на моторные компоненты судорог и послесудорожные двигательные нарушения, индуцированные коразолом.

4.4. Резюме.

Глава 5. Влияние кверцетина на противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования.

5.1. Влияние кверцетина на содержание индуцибельной изоформы Н5р701 в плазме крови и структурах головного мозга после процедуры теплового прекондиционирования.

5.2. Влияние кверцетина на противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования в модели судорог, вызванных введением N-метил-Р-аспарагиновой кислоты.

5.3. Влияние кверцетина на противосудорожное действие теплового прекондиционирования в модели коразоловых судорог.

5.4. Резюме.

Глава 6. Изучение противосудорожных эффектов препарата Hsp70i/Hsc70.

6.1. Влияние экзогенного Hsp70i/Hsc70 на компоненты моторных судорог и послесудорожные двигательные нарушения, вызванные введением коразола.

6.2. Изучение действия термоденатурированного препарата Hsp70i/Hsc70 на компоненты моторных судорог и послесудорожные двигательные нарушения, индуцированные коразолом.

6.3. Резюме.

Глава 7. Исследование белок-белкового взаимодействия индуцибельной изоформы экзогенного Hsp70 с синаптофнзином и глутаматдекарбокснлазой 67.

7.1. Резюме.

Глава 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в моделях генерализованной эпилепсии у крыс"

2007]. Это указывает на необходимость дальнейшего изучения механизмов защиты мозга в различных моделях эпилепсии. Особое внимание уделяется поиску веществ, содержащихся в мозге и обладающих нейропротективными свойствами и способностью вмешиваться в ключевые звенья генерации судорожной активности. Перспективными в этом отношении могут оказаться шапероны семейства белков теплового шока Heat Shock Proteins 70 kDa (HSP70).

2008]. В головном мозге млекопитающих высокие уровни Hsc70 обнаруживаются в нормальных условиях, a Hsp70i - в условиях действия на организм высоких температур, гипоксии, нейротоксических соединений и других повреждающих факторов [Sharp et al., 1991; Bechtold et al., 2000., Moon et al., 2001; Chen, Brown, 2007]. Усиление экспрессии Hsp70i показано в коре головного мозга при височно-лобной эпилепсии у людей [Yang et al., 2008] и в нейронах гиппокампа крыс после генерализованных судорог, спровоцированных каиновой [Yass et al., 1989] или иботеновой кислотами [Planas, 1995]. Какое значение в механизмах эпилептогенеза имеет увеличение экспрессии Hsp70i в структурах головного мозга, пока не вполне понятно. Некоторые исследователи считают, что при развитии эпилептиформной активности мозга увеличение экспрессии и содержания Hsp70i в различных отделах лимбической системы связано с нейропротективной функцией этого белка, поскольку те нейроны, в которых содержание Hsp70i повышается, остаются неповрежденными после генерализованных судорог [Yang et al., 1996; Ayala, Tapia, 2008]. Имеющиеся в литературе единичные данные указывают на возможное противосудорожное действие Hsp70i. Показано, что тепловое прекондиционирование, вызывающее экспрессию белков теплового шока Hsp70i и других членов семейств HSP, в модели наследственной аудиогенной эпилепсии увеличивает только латентный период генерализованных судорог [Худик, 2009]. Остается не ясным, может ли эта процедура изменить длительность моторных компонентов судорог, а также тяжесть судорожного припадка и послесудорожных двигательных нарушений в моделях генерализованных судорог, вызванных гиперактивацией глутаматных рецепторов NMDA-типа или ослаблением тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге.

В течение многих лет считалось, что большая молекула Hsp70i не способна проходить сквозь плазматическую мембрану клеток, но постепенно накапливались данные о выходе Hsp70i из клеток. Шаперон Hsp70i найден во внеклеточном пространстве, а также в плазме крови и ликворе [Tytell et al., 1986; Guzhova et al. 1998, 2001; Campisi et al., 2003; Steensberg et al., 2006]; ero уровень снижается с возрастом и возрастает при таких заболеваниях, как гипертония и атеросклероз [Pockley, 2002, 2003]. После введения Hsp70i в ликвор третьего желудочка мозга крыс он преодолевает ликвороэнцефалический барьер, проникает в нейроны и пресинаптические терминали лимбических структур мозга и при этом ослабляет тяжесть NMDA-индуцированных судорог [Ekimova et al., 2010]. Показано, что в нейронах коры головного мозга и гиппокампа Hsp70i колокализуется с везикулярным белком синаптофизином и белком-катализатором синтеза ГАМК глутаматдекарбоксилазой. Остается не выясненным, способен ли Нзр7(Л вступать в белок-белковое взаимодействие с синаптофизином и глутаматдекарбоксилазой в головном мозге. Противосудорожное действие экзогенного Нзр7(И в модели генерализованных судорог, вызванных ослаблением тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге, не исследовалось.

Цель исследования - определить поведенческие показатели противосудорожного действия индуцибельного белка теплового шока 70 кДа (НБр701) в моделях генерализованных ЫМОА-индуцированных и коразоловых судорог у крыс Вистар и выяснить мишени его действия в гиппокампе.

Выделены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние ингибитора экспрессии Нзр701 кверцетина на поведенческие показатели генерализованных судорог, вызванных активацией центральных глутаматных рецепторов ЫМБА-типа и ослаблением тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге (при системном введении коразола), а также на содержание Нзр701 в плазме крови и структурах головного мозга.

2. Определить эффекты теплового прекондиционирования на поведенческие показатели генерализованных ЫМЕ)А-индуцированных и коразоловых судорог и содержание Нэр701 в структурах головного мозга и плазме крови.

3. Выяснить, способен ли кверцетин предотвращать влияние теплового прекондиционирования на поведенческие показатели судорожной активности в моделях ЫМОА-индуцированных и коразоловых судорог и на уровень НБр701 в плазме крови и структурах головного мозга.

4. Изучить изменения поведенческих показателей коразоловых судорог при микроинъекциях в ликвор третьего желудочка мозга препарата Нэр70 и сопоставить эти изменения с эффектами теплового прекондиционирования.

5. Выяснить способность индуцибельного Нзр701 вступать во взаимодействие с везикулярным белком синаптофизином и белком-ферментом синтеза ГАМК, глутаматдекарбоксилазой 67, в гиппокампе - структуре мозга, критической для генерации и поддержания генерализованной судорожной активности.

Научная новизна

В двух моделях генерализованной эпилепсии у крыс Вистар - при гиперактивации ЫМОА-типа глутаматных рецепторов и снижении активности тормозных ГАМК-ергических процессов в головном мозге (при системном введении коразола) - впервые установлено: а) отчетливое противосудорожное действие теплового прекондиционирования; б) усиление тяжести судорожного припадка и предотвращение противосудорожного действия теплового прекондиционирования ингибитором экспрессии шаперона НБр701 кверцетином; в) повышение (или уменьшение) содержания Нзр7(Н в структурах мозга, участвующих в генерации и поддержании судорог, совпадает по времени с противосудорожным действием (или его угнетением), что указывает на ключевую роль индуцибельного белка Нэр701 в противосудорожных эффектах теплового прекондиционирования. В модели коразоловых судорог впервые обнаружено противосудорожное действие экзогенного НБр70, сопоставимое по показателям поведения с тепловым прекондиционированием. Впервые выяснены молекулярные мишени противосудорожного действия экзогенного Нзр7(Н в гиппокампе.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антиконвульсантные эффекты теплового прекондиционирования совпадают по срокам с увеличением, а проконвульсантные эффекты кверцетина - с уменьшением содержания Нзр7(Н в структурах мозга, участвующих в реализации генерализованных КМОА-индуцированных и коразоловых судорог.

2. Увеличение содержания в мозге эндогенного Нзр7СН (путем теплового прекондиционирования) и экзогенного Нзр7(Н (при введении препарата №р70 в третий желудочек мозга) вызывает сходные противосудорожные эффекты в модели коразоловых судорог.

3. Везикулярный белок синаптофизин и ключевой фермент синтеза ГАМЬС, глутаматдекарбоксилаза 67, вовлечены в противосудорожное действие индуцибельного члена семейства Н8Р70.

Теоретическая и практическая значимость

Работа имеет фундаментальное значение для понимания защитной роли белков теплового шока семейства 70 кДа при таком социально значимом заболевании как эпилепсия, при котором около трети больных резистентны к медикаментозному лечению. Полученные в ходе исследования данные о противосудорожных эффектах индуцибельного белка Нзр701 в двух моделях генерализованной эпилепсии и выявленные синаптические мишени его противосудорожного действия могут служить основанием для апробации в клинике ряда известных ранее и новых лекарственных средств растительного происхождения, увеличивающих экспрессию и содержание в мозге шаперонов 70 кДа. Перспективным является также использование индукторов Нзр701 при разработке подходов, направленных на снижение побочных эффектов традиционных противосудорожных препаратов. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций по физиологии для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.

Апробация работы

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых статьи в рецензируемых журналах - 3, статьи в сборниках научных работ - 2, тезисы докладов —13.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Ницинская, Лариса Евгеньевна

выводы

1. Ингибитор экспрессии Нзр7(Н кверцетин увеличивает а) длительность тонического компонента судорог, тяжесть припадка и послесудорожных симптомов атаксии в модели ММЮА-индуцированных судорог и б) длительность не только тонического, но и клонического компонента в модели коразоловых судорог; этим проконвульсантным эффектам кверцетина в обеих моделях генерализованных судорог у крыс соответствует по срокам (через 4 часа) уменьшение содержания шаперона Нзр701 в гиппокампе, таламусе и в плазме крови.

2. Кратковременное (в течение 10 мин) тепловое прекондиционирование в обеих моделях судорог вызывает увеличение латентного периода судорожной активности и ослабление тяжести судорожного припадка и послесудорожных симптомов атаксии; эти противосудорожные эффекты совпадают по срокам (через 24 ч) с повышением содержания шаперона НБр701 в структурах мозга, участвующих в реализации генерализованных судорог (гиппокамп, пириформная кора, миндалина, гипоталамус, таламус, средний мозг).

4. Введение препарата №р70 в ликвор третьего желудочка мозга в модели коразоловых судорог вызывает противосудорожный эффект, сходный с тепловым прекондиционированием (увеличение латентного периода судорог, ослабление тяжести припадка и послесудорожных симптомов атаксии), а также отчетливое уменьшение длительности клонических судорог.

5. Индуцибельный белок НБр701 вступает в межмолекулярное взаимодействие с везикулярным белком синаптофизином и ферментом синтеза ГАМК,

159 глутаматдекарбоксилазой 67 (ГДК67), в гиппокампе крыс. Синаптофизин и ГДК67 являются молекулярными мишенями противосудорожного действия Шр70ь

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ницинская, Лариса Евгеньевна, Санкт-Петербург

1. Андреева Л.И. Теоретическое и прикладное значение белков теплового шока 70 кДа, возможность практического применения и фармакологической коррекции // Обз. Клин. Фармакол. Лек. Тер. 2002. Т. 1. №2. С. 2-18.

2. Андреева Л.И., Горанчук В.В., Шустов Е.Б., Бойкова A.A., и др. Адаптация человека к гипертермии и изменения в лейкоцитах периферической крови // Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2001. Т.87. №9. С. 1208-1216.

3. Андреева Л.И., Шабанов П.Д., Маргулис Б.А. Экзогенный белок теплового шока 70 с молекулярной массой кДа изменяет поведение белых крыс // Докл. РАН. 2004. Т.394. №6. С. 835-839.

4. Андреева Л.И., Шабанов П.Д., Маргулис Б.А., Гужова И.В., Никифорова Д.В. Центральные эффекты белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа // ПФиБН. 2005. №1. С. 794-803.

5. Будагова K.P., Жмаева С.В., Григорьев А.Н., Гончарова А.Ю., Кабаков А.Е. Флавоноид дигидрокверцетин в отличие от кверцетина не ингибирует экспрессию белка теплового шока в условиях клеточного стресса // Биохимия. 2003. Т.68. №9. С. 1287-1294.

6. Веретенников H.A., Куликова Д.А., Панин В.М., Корочкин Л.И. Биологические аспекты эпилепсии: морфологические и молекулярные исследования аудиогенной эпилепсии // Усп. Совр. Биологии. 1996. Т. 116. №.4. С.407-417.

7. Гужова И.В. Ласунская Е.Б., Нильсон К. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937 // Цитология. 2000. Т.42. №7. С. 653-658.

8. Ещенко Н.Д. Биохимия психических и нервных болезней. СПб.: СПбГУ. 2004. 200 с.

9. Колпаков В.Г., Рицнер М.С., Корнетов H.A., Самохвалов В.П., Залевский Г.В., Короленко Ц.П. Генетические и эволюционные проблемы психиатрии. Новосибирск: Наука. 1985.

10. Крыжановский Г.Н., Шандра A.A., Годлевский JI.C., Мазарати A.M. Антиэпилептическая система // Успехи физиологических наук. 1992. Т.23. №3. С. 53-70.

11. Н.Лапшина К.В., Екимова И.В., Пастухов Ю.Ф. Влияние экзогенного белка теплового шока 70 кДа на сомато-висцеральные показатели и сон после эмоционального стресса // Стресс и висцеральные системы. Мн. 2006. С. 128-131.

12. Лукомская Н.Я., Рукояткина Н.И., Горбунова Л.В., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г. Исследование роли NMDA и АМРА глутаматных рецепторов в механизме коразоловых судорог у мышей // Рос. Физиол. Журнал им. И.М.Сеченова. 2003. Т.89. №3. С. 292-301.

13. Лукомская Н.Я., Жабко Е.П., Гмиро В.Е. Участие глутаматергической передачи в механизме двигательных нарушений, вызванным реверсивным вращением белых мышей // Рос. Физиол. Журнал им. И.М.Сеченова. 1999. Т.85. №4. С. 497-501.

14. Маньковская Т.Н., Пастухов Ю.Ф. Влияние стресса и белка теплового шока на содержание кортикостерона в плазме крови у крыс // Стресс и висцеральные системы. Мн. Издательство "Технопринт". 2005. С. 96-99.

15. Маргулис Б.А. Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке // Цитология. 2000. Т.42. №4. С. 323-328.

16. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Двойная роль шаперонов в ответе клетки и всего организма на стресс // Цитология. 2009. Т.51. №3. С. 219-228.

17. Маслова М.Н. Уровень гамма-аминомасляной кислоты в мозгу животных при различных функциональных состояниях // Материалы симпозиума по проблеме ГАМК. 1969. С.49-58.

18. Мокрушин A.A., Павлинова Л.И., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Эффекты экзогенного белка теплового шока (Hsp70) на глутаматергическую синаптическую передачу в обонятельной коре мозга крыс in vitro // Докл. РАН. 2004. Т.395. №4. С. 551-553.

19. Мокрушин A.A., Павлинова Л.И., Плеханов А.Ю. Белок теплового шока (HSP70) повышает толерантность кортикальных клеток к глутаматной эксайтотоксичности // Бюл. экспер. биол. и мед. 2005. Т. 140. №1. С. 1-5.

20. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Гужова И.В. Основной белок стресса обладает пирогенным действием // Докл. РАН. 2003. Т.388. №6. С.837-841.

21. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Гужова И.В. Белок 70кДа в контроле сна и терморегуляции // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2008. Т. 44. №1. С. 65-71.

22. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Гужова И.В. Белок теплового шока 70 кДа, свободный от липополисахарида, обладает гипотермическим и сомногенным действием // Докл. РАН. 2005. Т. 402. № 2. С. 275-278.

23. Петров В.И., Пиотровский Л.Б., Григорьев И.А. ВАК. Волгоград: Волгоград. 1997. 167 с.

24. Рукояткина Н.И., Горбунова Л.В., Гмиро В.Е, Лукомская Н.Я. Способность антагонистов глутаматных рецепторов ослаблять экспериментальнуюкаталепсию у крыс // Рос. Физиол. Журнал им. И.М.Сеченова. 2000. Т.86. №6. С. 626-632.

25. Семьянов А.В., Годухин О.В. Клеточно-молекулярные механизмы фокального эпилептогенеза // Успехи физиологических наук. 2001. Т.32. №1. С.60-78.

26. Alder G.M., Austen B.M., Bashford C.L., Mehlert A., Pasternak C.A. Heat shock proteins induce pores in membranes // Biosci. Rep. 1990. Vol.10. №6. P. 509-518.

27. AH A., Bharadwaj S., O'Carroll R., Ovsenek N. HSP90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes // Mol. Cell. Biol. 1998. Vol.18. №9. P. 4949-^960.

28. Amin V., Cumming D.V., Latchman D.S. Over-expression of heat shock protein 70 protects neuronal cells against both thermal and ischaemic stress but with different efficiencies //Neurosci. Lett. 1996. Vol.206. №1. P. 45-48.

29. Arispe N., De Maio A. ATP and ADP modulate a cation channel formed by Hsc70 in acidic phospholipid membranes // Biol. Chem. 2000. Vol.275. №40. P. 3083930843.

30. ArispeN., Doh M.,De Maio A. Lipid interaction differentiates the constitutive and stress-induced heat shock proteins Hsc70 and Hsp70 // Cell Stress and Chaperones. 2002. Vol.7. №4. P. 330-338.

31. Arnold-Schild D., Hanau D., Spehner D., Schmid C., Rammensee H.G., de la Salle H., Schild H. Cutting edge: receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigenpresenting cells // J. Immunol. 1999. Vol.162. №7. P. 3757-3760.

32. Asea A. Chaperokine-induced signal transduction pathways // Exerc. Immunol. Rev. 2003. Vol.9. P. 25-33.

33. Ayala G.X., Tapia R. HSP70 expression protects against hippocampal neurodegeneration induced by endogenous glutamate in vivo // Neuropharmacology. 2008. Vol.55. № 8. P. 1383-1390.

34. Barela A.J. An epilepsy mutation in the sodium channel SCN1A that decreases channel excitability // J. Neurosci. 2006. Vol.26. №10. P. 2714-2723.

35. Barnes P.J., Karin M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases // N. Engl. J. Med. 1997. Vol.336. №15. P. 10661071.

36. Bechtold D.A., Brown I.R. Induction of Hsp27 and Hsp32 stress proteins and vimentin in glial cells of the rat hippocampus following hyperthermia // Neurochem. Res. 2003. Vol.28. № 8. P. 1163-1173.

37. Bechtold D.A., Rush S.J., Brown I.R. Localization of the heat-shock protein Hsp70 to the synapse following hyperthermic stress in the brain // Neurochem. 2000. Vol.74. №2. P. 641-650.

38. Boone A.N., Vijayan M.M. Constitutive heat shock protein 70 (HSC70) expression in rainbow trout hepatocytes: effect of heat shock and heavy metal exposure // Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2002. Vol.132. №2. P. 223-233.

39. Bowery N.G., Hill D.R., Hudson A.L., Doble A., Middlemiss D.N., Shaw J., Turnbull M.J. (-) Baclofen decreases neurotransmitter release in the mammalian CNS by an action at a novel GAB A receptor // Nature. 1980. Vol.283. №5742. P. 92-94.

40. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol.72. №1. P. 248-254.

41. Brevard E., Kulkarni P., King A., Ferris CF. Imagine the neural substrates involved in the genesis of pentylenetetrazol-induced seizures // Epilepsia. 2006. Vol.47. №4. P. 745 754.

42. Brocchieri L., Conway de Macario E., and Macario A.J. Hsp70 genes in the human genome: Conservation and differentiation patterns predict a wide array of overlapping and specialized functions // BMC Evol. Biol. 2008. Vol.8. №19.

43. Broquet A.H., Thomas G., Masliah J., Trugnan G., Bachelet M. Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278. №24. P. 21601-21606.

44. Brown I.R. Heat shock proteins and protection of the nervous system // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007. Vol.1113. P. 147-158.

45. Burnham W.M. Anti-seizure drugs. In Principles of Medical Pharmacology 7th ed. (Kalant H., Grant D.M., Mitchell J., eds). Toronto: Elsevier. 2006. p. 223.

46. Buzzard K.A., Giaccia A.J., Killender M., Anderson R.L. Heat shock protein 72 modulates pathways of stress-induced apoptosis // Biol. Chem. 1998. Vol.273. №27. P. 17147-17153.

47. Campisi J., Fleshner M. The role of extracellular Hsp72 in acute stress-induced potentiation of innate immunity in physically active rats // Journal of Applied Physiology. 2003. Vol.94. №1. P. 43-52.

48. Campisi J., Leem T.H. and Fleshner M. Stress-induced extracellular Hsp72 is a functionally significant danger signal to the immune system // Cell Stress Chaperones. 2003. Vol.8. № 3. P. 272-286.

49. Chapman A.G., Smith S.E., Meldrum B.S. The anticonvulsant effect of the non-NMDA antagonists, NBQX and GYKI 52466 in mice // Epilepsy Res. 1991. Vol.9. №2. P. 92-96.

50. Chen S., Brown I.R. Translocation of constitutively expressed Heat Shock Protein Hsc70 to synapse-enriched areas of the cerebral cortex after hyperthermic stress // Neuroscience Research. 2007. Vol.85. №2. P. 402-409.

51. Chow A.M., Brown I.R. Induction of heat shock proteins in differentiated human and rodent neurons by celastrol // Cell Stress Chaperones. 2007. Vol.12. №3. P. 237-244.

52. Clayton A., Turkes A., Navabi H., Mason M.D., Tabi Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes // J. Cell Sci. 2005. Vol.118. №16. P. 3631-3638.

53. Cleren C., Calingasan N.Y., Chen J., Beal M.F. Celastrol protects against MPTP-and 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity // J. Neurochem. 2005. Vol.94. №4. P. 995-1004.t

54. Consroe P., Piccioni A., Chin L. Audiogenic seizure susceptible rats // Fed. Proc. 1979. Vol.38. P. 2411-2416.

55. Corda M.G., Orlandi M., Lecca D., Giorgi O. Decrease in'GABAergic function induced by pentylenetetrazol kindling in rats: antagonism by MK-801 // Pharmacol. Exp. Ther. 1992. Vol.262. №2. P. 792- 800.

56. Cull-Candy S., Brickley S., Farrant M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease // Curr. Opin. Neurobiol. 2001. Vol.11. №3. P. 327-335.

57. Daugaard M., Rohde M, Jaattela M. The heat shock protein 70 family: Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions // FEBS Lett. 2007. Vol.581. №19. P. 3702-3710.

58. Demidov O.N., Tyrenko V.V., Svistov A.S., Komarova E.Y., Karpishenko A.I., Margulis B.A., Shevchenko Y.L. Heat shock proteins in cardiosurgery patients // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1999. Vol.16. №4. P. 444-449.

59. Doretto M.C., Fonseca C.G., Lobo R.B., Terra V.C., Oliveira J.A., Garcia-Cairasco N. Quantitative study of the response to genetic selection of the Wistar audiogenic rat strain (WAR) // Behav. Genet. 2003. Vol.1. №33. P.33-42.

60. Duveau V., Arthaud S., Serre H., Rougier A., Salle G.L.G.L. Transient hyperthermia protects against subsequent seizures and epilepsy-induced cell damage in the rat // Neurobiology of Disease. 2005. Vol.19. №1-2. P. 142-149.

61. Fabian T.K., Toth Z., Fejerdy L., Kaan B., Csermely P., Fejerdy P. Photo-acoustic stimulation increases the amount of 70 kDa heat shock protein (Hsp70) in human whole saliva. A pilot study // Int. J. Psychophysiol. 2004. Vol.52. № 2. P. 211216.

62. Faingold C.L., Anderson C.F. Loss of intensity-induced inhibition in inferior colliculus neurons leads to audiogenic seizure susceptibility in behaving genetically epilepsy-prone rats // Exp. Neurol. 1991. Vol.3. №113. P. 354-363.

63. Fan C.Y., Lee S., Cyr D.M. Mechanisms for regulation of Hsp70 function by Hsp40 // Cell Stress Chaperones. 2003. Vol.8. №4. P. 309-316.

64. Fei G., Guo C., Sun H.S., Feng Z.P. Chronic hypoxia stress-induced differential modulation« of heat-shock protein 70 and presynaptic proteins // J. Neurochem. 2007. Vol.100. № l.P. 50-61.

65. Feinstein D.L., Galea E., Aquino D.A., Li G.C., Xu H., Reis D.J. Heat shock protein 70 suppresses astroglial-inducible nitric-oxide synthase expression by decreasing NFkappaB activation«// J. Biol. Chem. 1996. Vol.271. №30. P. 1772417732.

66. Fleshner M., Campisi J., Amiri L., Diamond D.M. Cat exposure induces both intra- and extracellular Hsp72: the role of adrenal hormones // Psychoneuroendocrinology. 2004. Vol.29. № 9. P. 1142-1152.

67. Frossard J.L. Heat shock protein 70 (HSP70) prolong survival in rats exposed to hyperthermia // European J. of Clin. Invest. 1999. Vol.29. P. 561-562.

68. Fujiki M., Kobayashi H., Abe T., Ishii K. Astroglial activation accompanies heat shock protein upregulation in rat brain following single oral dose of geranylgeranylacetone // Brain Res. 2003. Vol.991. №1-2. P. 254-257.

69. Gallucci S., Lolkema M., Matzinger P. Natural adjuvants: endogenous activators of dendritic cells //Nat. Med. 1999. Vol.5. №11. P. 1249-1255.

70. Gass P., Prior P., Kiessling M. Correlation between seizure intensity and stress protein expression after limbic epilepsy in the rat brain // Neuroscience. 1995. Vol.65. №1. P. 27-36.

71. Getova D., Froestl W., Bowery N.G. Effects of GABAB receptor antagonism on the development of pentylenetetrazol-induced kindling in mice // Brain Res. 1998. Vol.809. №2. P. 182-188.

72. Ghosh S., May M.J., Kopp E.B. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses // Annu. Rev. Immunol. 1998. Vol.16. P. 225-260.

73. Goodman L.S., Gilman A., Brunton L.L., Lazo J.S., Parker K.L. The pharmacological basis of therapeutics. N.Y.: McGraw-Hill Professional. 2006. 1905 p.

74. Gross C., Hansch D., Gastpar R. and Multhoff G. Interaction of heat shock protein 70 peptide with NK cells involves the NEC receptor CD94 // Biol. Chem. 2003. Vol.384. №2. P. 267-279.

75. Guzhova I.V., Darieva Z.A., Melo A.R., Margulis B.A. Major stress protein Hsp70 interacts with NF-KB regulatory complex in human T-lymphoma cells // Cell Stress Chaperones. 1997. Vol.2. №2. P. 132-139.

76. Hartl F.U. and Hayer-Hartl M. Molecular chaperons in cytosol: from nascent chain to folded protein // Science. 2002. Vol.295. №5561. P. 1852-1858.

77. Herding P.L, Emre M., Watkins J.C. D-CPPene (SDZ EAA 494) a competitive NMDA antagonist: pharmacology and results in humans. In Excitatory amino acids — clinical results with antagonists (ed. Herding P.L.). London: Academic Press. 1997. P. 7-22.

78. Hirakawa T., Rokutan K., Nikawa T., Kishi K. Geranylgeranylacetone induces heat shock proteins in cultured guinea pig gastric mucosal cells and rat gastric mucosa // Gastroenterology. 1996. Vol.111. №2. P. 345-57.

79. Hosokawa N., Hirayoshi K., Kudo H., Takechi H., Aoike A., Kawai K., Nagata K. Inhibition of the activation of heat shock factor in vivo and in vitro by flavonoids // Molecular and Cellular Biology. 1992. Vol.12. №8. P. 3490-3498.

80. Hotchkiss R. Nunnally I., Lindquist S., Taulien J., Perdrizet G., Karl I. Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. №6. P. 1447-1457.

81. Houenou L.J., Li L., Lei M., Kent C.R., Tytell M. Exogenous heat shock cognate protein Hsc70 prevents axotomy-induced death of spinal sensory neurons // Cell Stress Chaperones. 1996. Vol.1. №3. P. 161-166.

82. Houser C.R., Hendry S.H.C., Jones E.G., Vaughn J. E. Morphological diversity of immunocytochemically identified GABA neurons in the monkey sensory-motor cortex // J. Neurocytol. 1983. Vol.12. №4. P. 617-638.

83. Hunt C., Morimoto R.I. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Vol.82. №19. P. 6455-6459.

84. Imbrici P., Jaffe S.L., Eunson L.H., Davies N.P., Herd C., Robertson R., Kullmann D.M., Hanna M.G. Dysfunction of the brain calcium channel Cav2.1 in absence epilepsy and episodic ataxia // Brain. 2004. Vol.127. №12. P. 2682-2692.

85. Ishii Y., Kwong J.M., Caprioli J. Retinal ganglion cell protection with geranylgeranylacetone, a heat shock protein inducer, in a rat glaucoma model // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. Vol.44. №5. P. 1982-1992.

86. Jakubowicz-Gil J., Paduch R., Gawron A., Kandefer-Szerszen M. The effect of heat shock, cisplatin, etoposide and quercetin on Hsp27 expression in human normal and tumour cells // Pol. J. Patol. 2002. Vol.53. №3. P. 133-137.

87. Jefferys J.G.R. Basic mechanisms of focal epilepsies // Exp. Physiol. 1990. Vol.75. P. 127-162.

88. Johnson J. D., Campisi J., Sharkey C. M., Kennedy S., Nickerson M., Fleshner M. Adrenergic receptors mediate stress-induced elevation in extracellular Hsp72 // J. Appl. Physiol. 2005. Vol.99. P. 1789-1795.

89. Kabova R., Veresova S., Velisek L. West syndrome model: seek and you will find // Sb. Lek. 1997. Vol.98. №2. P. 115-126.

90. Kahraman A., Erkasap N., Koken T. The antioxidative and antihistamine properties of quercetin in ethanol-induced gastric lesions // Toxicology. 2003. Vol.183. №1-3. P. 133-142.

91. Karunanithi S., Barclay J.W., Brown I.R., Robertson R.M., Atwood H.L. Enhancement of presynaptic performance in transgenic Drosophila overexpressing heat shock protein Hsp70 // Synapse. 2002. Vol.44. №1. P. 8-14.

92. Karunanithi S., Barclay J.W., Robertson R.M., Brown I.R., Atwood H.L. Neuroprotection at Drosophila synapses conferred by prior heat shock // J. Neurosci. 1999. Vol.19. №11. P. 4360-4369.

93. Kelty J.D., Noserworthy P.A., Feder M.E., Robertson R.M., Ramirez J.M. Thermal preconditioning and heat-shock protein 72 preserve synaptic transmission during thermal stress //Neuroscience. 2002. Vol.22. №.1. P. 193.

94. Kiaei M., Kipiani K., Petri S., Chen J., Calingasan N.Y., Beal M.F. Celastrol blocks neuronal cell death and extends life in transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis // Neurodegenerative Dis. 2005. Vol.2. №5. P. 246254

95. Kim J.M., Kim J.C., Park W.C., Seo J.S., Chang H.R. Effect of thermal preconditioning before excimer laser photoablation // J. Korean Med. Sci. 2004. Vol.19. №3. P. 437-446.

96. King Y.T., Lin C.S., Lin J.H. Whole-body hyperthermia-induced thermotolerance is associated with the induction of Heat Shock Protein 70 in mice // The J. of Exp. Biol. 2002. Vol.205. №2. P. 273-278.

97. Komarova E.Y., Afanasyeva E.A., Bulatova M.M., Cheetham M.E., Margulis B.A., Guzhova I.V. Downstream caspases are novel targets for the antiapoptotic activity of the molecular chaperone hsp70 // Cell Stress Chaperones. 2004. Vol.9. №3. P. 265-275.

98. Kwong J.M., Lam T.T., Caprioli J. Hyperthermic pre-conditioning protects retinal neurons from N-methyl-D-aspartate (NMDA)-induced apoptosis in rat // Brain Res. 2003. Vol.970. №1-2. P. 119-130.

99. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 //Nature. 1970. Vol. 227. №5259. P. 680 685.

100. Lancaster G.I, Febbraio M.A. Exosome-dependent trafficking of HSP70: a novel secretory pathway for cellular stress proteins // J. Biol. Chem. 2005. Vol.280. № 24. P. 23349-23355.

101. Lang T., Jahn R. Core proteins of the secretory machinery // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. Vol.184. P. 107-127.

102. Lasunskaia E.B., Fridlianskaya I.I., Guzhova I.V., Bozhkov VM, Margulis BA. Accumulation of major stress protein 70 kDa protects myeloid and lymphoid cells from death by apoptosis // Apoptosis. 1997. Vol.2. №2. P. 156-163.

103. Latchman D.S. Heat shock protein and cardiac protection // Cardiovascular Res. 2001. Vol.51. №4. P. 637-646.

104. Leoni S., Brambilla D., Risuleo G. Effect of different whole body hyperthermic sessions on the heat shock response in mice liver and brain // Mol. Cell Biochem. 2000. Vol.204. №1-2. P. 41-47.

105. Li Z., Menoret A., Srivastava P. Roles of heat shock proteins in antigen presentation and cross presentation // Curr. Opin. Immunol. 2002. Vol.14. №1. P. 45-51.

106. Loones M.T, Chang Y., Morange M. The distribution of heat shock proteins in the nervous-system of the unstressed mouse embryo suggests a role in neuronal and non-neuronal differentiation // Cell Stress Chaperones. 2000. Vol.5. №4. P. 291-305.

107. Loscher W., Schmidt D. Which animal models should be used in the search for new antiepileptic drugs? A proposal based on experimental and clinical considerations // Epilepsy Res. 1988. Vol.2. №3. P. 145-181.

108. Lu A., Ran R., Parmentier-Batteur S., Nee A., Sharp F.R. Geldanamycin induces heat shock proteins in brain and protects against focal cerebral ischemia // J. Neurochem. 2002. Vol.81. №2. P. 355-364.

109. Lu T.Z., Quan Y., Feng Z.P. Multifaceted role of heat shock protein 70 in neurons // Mol. Neurobiol. 2010. Vol.42. №2. P. 114-23.

110. Luh S.P., Kuo P.H., Kuo T.F., Tsai T.P., Tsao T.C., Chen J.Y., Tsai C.H., Yang P.C. Effects of thermal preconditioning on the ischemia-reperfusion-induced acute lung injury in minipigs // Shock. 2007. Vol.28.' №5. P. 615-622.

111. Malyshev I.Yu., Bayda L.A., Trionov A.I., Larionov N.P., Kubrina L.D., Mikoyan V.D., Vanin A.F., Manukhina E.B. Cross-talk between nitric oxide and Hsp70 in atihypotensive effect of adaptation to heart // Physiol. Res. 2000. Vol.49. №1. P. 99-105.

112. Mambula S.S., Calderwood S.K. Heat shock protein 70 is secreted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes // J. Immunol. 2006. Vol.177. №11. P. 7849-7857.

113. Mambula S.S., Stevenson M.A., Ogawa K., Calderwood S.K. Mechanisms for Hsp70 secretion: crossing membranes without a leader // Methods. 2007. Vol.43. №3. P. 168-175.

114. Manzerra P., Rush S.J., Brown I.R. Tissue-specific differences in heat shock protein hsc70 and hsp70 in the control and hyperthermic rabbit // J. Cell. Physiol. 1997. Vol.170. №2. P. 130-137.

115. Mattson M.P., Magnus T. Ageing and neuronal vulnerability // Nat. Rev. Neurosci. 2006. Vol.7. №4. P. 278-294.

116. McNamara J.O. Cellular and Molecular Basis of Epilepsy // Neurosci. 1994. Vol.14. №6. P. 3413-3425.

117. Meldrum B.S. Neurotransmission in epilepsy // Epilepsia. 1995. Vol.36. P. 3035.

118. Meldrum B.S., Rogawski M.A. Molecular targets for antiepileptic drug development //Neurotherapeutics. 2007. Vol.4. №1. P. 18-61.

119. Melling C.W., Thorp D.B., Milne K.J., Krause M.P., Noble E.G. Exercise-mediated regulation of Hsp70 expression following aerobic exercise training // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2007. Vol.293. №6. P. 3692-3698.

120. Miller J.W., McKeon A.C., Ferrendelli J.A. Functional anatomy of pentylenetetrazol and electroshock seizures in the rat brainstem // Ann. Neurol. 1987. Vol.22. №5. P. 615-621.

121. Miller L.C., Swayne L.A., Kay J.G., Feng Z.P., Jarvis S.E., Zamponi G.W., Braun J.E. Molecular determinants of cysteine string protein modulation of N-type calcium channels // J. Cell Sci. 2003. Vol.116. №14. P. 2967-2974.

122. Moon I.S., Park I.S., Schenker L.T., Kennedy M.B., Moon J.I., Jin I. Presence of both constitutive and inducible forms of heat shock protein 70 in the cerebral cortex and hippocampal synapses // Cerebral Cortex. 2001. Vol.11. №3. P. 238248.

123. Morano K.A., Thiele D.J. Heat shock factor function and regulation in response to cellular stress, growth, and differentiation signals // Gene Expr. 1999. Vol.7. №4-6. P. 271-282.

124. Morgan J.R., Prasad K., Jin S., Augustine G.J., Lafer E.M. Uncoating of clathrin-coated vesicles in presynaptic terminals: roles for Hsc70 and auxilin // Neuron. 2001. Vol.32. №2. P. 289-300.

125. Morimoto R.I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging // Genes Dev. 2008. Vol.22. №11. P. 14271438.

126. Morimoto R.I. Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators // Genes Dev. 1998. Vol.12. №24. P. 3788-3796.

127. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L., Denis-Larose C., Massie B. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress- induced apoptosis // Mol. Cell Biol. 1997. Vol.17. №9. P. 5317-5327.

128. Mula M., Sander J.W. Negative effects of antiepileptic drugs on mood in patients with epilepsy // Drug Saf. 2007. Vol.30. №7. P. 555-567.

129. Nagai Y., Fujiki M., Inoue R., Uchida S., Abe T., Kobayashi H., Cetinalp N.E. Neuroprotective effect of geranylgeranylacetone, a noninvasive heat shock protein inducer, on cerebral infarction in rats // Neurosci. Lett. 2005. Vol.374. №3. P. 183-188.

130. Nakanoma T., Ueno M., Iida M., Hirata R., Deguchi N. Effects of quercetin on the heat-induced cytotoxicity of prostate cancer cells // Int. J. Urol. 2001. Vol.8. №11. P. 623-630.

131. Natochin M., Campbell T.N., Barren B., Miller L.C., Hameed S., Artemyev N.O., Braun J.E. Characterization of the G alpha(s) regulator cysteine string protein // J. Biol. Chem. 2005. Vol.280. №34. P. 30236-30241.

132. Ohtsuka K., Hata M. Molecular chaperone function of mammalian Hsp70 and Hsp40~a review // Int. J. Hyperthermia. 2000. Vol.16. №3. P. 231-245.

133. Panjwani N.N., Popova L. and. Srivastava P.K. Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs // J. Immunol. 2002. Vol: 168. №6. P. 2997-3003.

134. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. San Diego: Acad. Press. 1998. 207 p.

135. Pelham H.R. A regulatory upstream promoter element in the Drosophila hsp 70 heat-shock gene 11 Cell. 1982. Vol.30. №2. P. 517-528.169: Pitkanen A., Schwartzkroin< P., Moshe S. Models of seizures and epilepsy. N.Y.: Academic Press. 2006. 687 p.

136. Planas A.M. NMDA receptors mediate heat shock protein induction in the mouse brain following administration of the ibotenic acid analogue AMAA- // Brain Res. 1995. Vol.700. №1-2. P. 298-294.

137. Pockley A.G., de Faire U., Kiessling R., Lemne C., Thulin T., Frostegard J. Circulating heat shock protein and heat shock protein antibody levels in established hypertension // J. Hypertens. 2002. Vol.20. № 9. P. 1815-1820.

138. Pockley A.G., Georgiades A., Thulin T., de Faire U., Frostegard J. Serum heat shock protein 70 levels predict the development of atherosclerosis in subjects with established hypertension // Hypertension. 2003. Vol.42. №3. P. 235-238.

139. Pratt W.B., Morishima Y., Murphy M., Harrell M. Chaperoning of glucocorticoid receptors // Handb. Exp. Pharmacol. 2006. №172. P. 111-138.

140. Racine R. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure //Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 1972. Vol.32. №3. P. 281-294.

141. Ran R., Lu A., Zhang L., Tang Y., Zhu H., Xu H., Feng Y., Han C., Zhou G., Rigby A.C., Sharp F.R. Hsp70 promotes TNF-mediated apoptosis by binding IKK gamma and impairing NF-kappa B survival signaling // Genes Dev. 2004. Vol.18. №12. P. 1466-1481.

142. Raposo G., Nijman H.W., Stoorvogel W., Liejendekker R., Harding C.V., Melief C.J., Geuze H.J. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles J Exp Med. 1996 Mar 1;183(3):1161-1172.

143. Ravagnan L., Gurbuxani S., Susin S.A., Maisse C., Daugas E., Zamzami N., Mak T., Jaattela M., Penninger J.M., Garrido C., Kroemer G. Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor // Nat. Cell Biol. 2001. Vol.3. №9. P. 839-843.

144. Requena D.F., Parra L.A., Baust T.B., Quiroz M., Leak R.K., Garcia-Olivares J., Torres G.E. The molecular chaperone Hsc70 interacts with the vesicular monoamine transporter-2 // J. Neurochem. 2009. Vol.110. №2. P. 581-594.

145. Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in drosophila // Expirientia. 1962. Vol.18. №12. P. 571-573.

146. Rogawski M.A. KCNQ2/KCNQ3 K+ channels and the molecular pathogenesis of epilepsy:implications for therapy // Trends Neurosci. 2000. Vol.23. №9. P. 393398.

147. Rogawski M.A. Low affinity channel blocking (uncompetitive) NMDA receptor antagonists as therapeutic agents toward an understanding of their favorable tolerability // Amino Acids. 2000. Vol.19. №1. P. 133-149.

148. Ron D., Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. Vol.8. №7. P. 519-529.

149. Saleh A., Srinivasula S.M., Balkir L., Robbins P.D., Alnemri E.S. Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp70 // Nat.Cell Biol. 2000. Vol.2. №8. P. 476-483.

150. Scimemi A., Schorge S., Kullmann D.M. and Walker M.C. Epileptogenesis is associated with enhanced glutamatergic transmission in the perforant path // J. Neurophysiol. 2006. Vol.95. №8. P. 1213-1220.

151. Sharp F.R., Lowenstein D., Simon R., Hisanaga K. Heat shock protein hsp72 induction in cortical and striatal astrocytes and neurons following infarction // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1991. Vol.11. №4. P. 621-627.

152. Shen H.Y., He J.C., Wang Y., Huang Q.Y., Chen J.F. Geldanamycin induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice // J. Biol. Chem. 2005. Vol.280. №48. P. 39962-39969.

153. Sherman D.L., Tsai Y.C., Rossell L.A., Mirski M.A., Thakor N.V. Spectral analysis of a thalamus-to-cortex seizure pathway // IEEE Trans Biomed Eng. 1997. Vol.44. №8. P.657-664.

154. Smith P.E. Clinical recommendations for oxcarbazepine // Seizure. 2001. Vol.10. №2. P. 87-91.

155. Snyder-Keller A., Keller R.W. Spatiotemporal analysis of Fos expression associated with cocaine- and PTZ-induced seizures in prenatally cocaine-treated rats //Exp. Neurol. 2001. Vol.170. №1. P. 109-120.

156. Somogyi P., Soltesz I. Immunogold demonstration of GAB A in synaptic terminals of intracellularly recorded, horseradish peroxidasefilled basket cells and clutch cells in the cat's visual cortex //Neuroscience. 1986. Vol.19. №4. P. 10511056.

157. Sondermann H., Becker T., Mayhew M., Wieland F. and Hartl F.U. Characterization of a receptor for heat shock protein 70 on macrophages and monocytes //Biol. Chem. 2000. Vol.381. №12. P. 1165-1174.

158. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S., Binder R.J., McQuade K.L. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. 1998. Vol.8. №6. P. 657-665.

159. Steensberg A., Dalsgaard M.K., Secher N.H. and Pedersen B.K. Cerebrospinal fluid IL-6, HSP72, and TNF-a in exercising humans // Brain, Behavior, and Immunity. 2006. Vol.20. №6. P. 585-589.

160. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E., Costantini P., Loeffler M. et al. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor // Nature. 1999. Vol.397. №6718. P. 441-446.

161. Swartzwelder H.S., Bragdon A.C., Sutch C.P., Ault B., Wilson W.A. Baclofen suppresses hippocampal epileptiform activity at low concentrations without suppressing synaptic transmission // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1986. Vol.237. №3. P. 881-887.

162. Swayne L.A., Beck K.E., Braun J.E. The cysteine string protein multimeric complex // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. Vol.348. №1. P. 83-91.

163. Tavaria M., Gabriele T., Kola I., Anderson R.L. A hitchhiker's guide to the human Hsp70 family // Cell Stress Chaperones. 1996. Vol.1. №1. P. 23-28.

164. Thompson H.S., Maynard E.B., Morales E.R., Scordilis S.P. Exercise-induced HSP27, HSP70 and MAPK responses in human skeletal muscle // Acta. Physiol. Scand. 2003. Vol.178. №1. P. 61-72.

165. Thomsen C., Dalby N.O. Roles of metabotropic glutamate receptor subtypes in modulation of pentylenetetrazole-induced seizure activity in mice // Neuropharmacology. 1998. Vol.37. №12. P.1465-1473.

166. Tidwell J.L., Houenou L.J., Tytell M. Administration of Hsp70 in vivo inhibits motor and sensory neuron degeneration // Cell Stress Chaperones. 2004. Vol.9. №1. P. 88-98.

167. Triantafilou M., Miyake K., Golenbock D.T., Triantafilou K. Mediators of innate immune recognition of bacteria concentrate in lipid rafts and facilitate lipopolysaccharide-induced cell activation// J. Cell Sci. 2002. Voo.115. №12. P. 2603-2611.

168. Tytell M., Greenberg S.G., Lasek R.G. Heat shock-like protein is transferred from glia to axon // Brain Res. 1986. Vol.363. №1. P.161-164.

169. Ungewickell E., Ungewickell H., Holstein S.E., Lindner R., Prasad K., Barouch.W., Martin B., Greene L.E., Eisenberg E. Role of auxilin in uncoatingclathrin-coated vesicles // Nature. 1995. Vol.378. №6557. P. 632-635.

170. Vabulas R. M., Ahmad-Nejad-P:, Ghose S., Kirschning C.J., Issels R.D., Wagner H. HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/interleukin-1 receptor signal pathway//J. Biol. Chem. 2002. Vol.277. №17. P. 15107-15112.

171. Valtorta F., Pennuto M., Bonanomi D. and Benfenati F. Synaptophysin: leading actor or walk-on role in synaptic vesicle exocytosis? // Bioessays. 2004. Vol.26. №4. P. 445-453.

172. Vass K., Berger M.L., Nowak T.S Jr., Welch W.J., Lassmann H. Induction of stress protein HSP70 in nerve cells after status epilepticus in the rat // Neurosci. Lett. 1989. Vol.100. №1-3. P. 259-264.

173. Velisek L., Jehle K., Asche S., Vellskova J. Model of infantile spasms induced by N-methyl-D-aspartic acid in prenatally impaired brain // Ann. Neurol. 2007. Vol.61. № 2. P. 109-119.

174. Villar J. Ribeiro S.P., Mullen J.B., Kuliszewski M., Post M., Slutsky A.S. Induction of the heat shock response reduces mortality rate and organ damage in a sepsis-induced acute lung injury model // Crit. Care Med. 1994. Vol.22. №6. P. 914-921.

175. Wagner M., Hermanns I., Bittinger F., and Kirkpatrick C. J. Induction of stress proteins in human endothelial cells by heavy metal ions and heat shock // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1999. Vol.277. №5. P. 1026-1033.

176. Wallen E.S., Buettner G.R., Moseley P.L. Oxidants differentially regulate the heat shock response // Int. J. Hyperthermia. 1997. Vol.13. №5. P. 517-524.

177. Walsh D., Grantham J., Zhu X.O., Lin J.W., van Oosterum M., Taylor R., Edwards M. The role of heat shock proteins in mammalian differentiation and development // Environ. Med. 1999. Vol.43. №2. P. 79-87.

178. Walsh R.C., Koukoulas I., Garnham A., Moseley P.L., Hargreaves M., and Febbraio M.A. Exercise increases serum Hsp72 in humans // Cell Stress Chaperones. 2001. Vol.6. №4. P. 386-393.

179. Wright B.H., Corton J.M., El-Nahas A.M., Wood R.F., Pockley A.G. Elevated levels of circulating heat shock protein 70 (Hsp70) in peripheral and renal vascular disease // Heart Vessels. 2000. Vol.15. №1. P. 18-22.

180. Wu C. Two protein-binding sites in chromatin implicated in the activation of heat-shock genes //Nature. 1984. Vol.309. №5965. P. 229-234.

181. Xu L., Lee J.E., Giffard R.G. Overexpression of bcl-2, bcl-XL or hsp70 in murine cortical astrocytes reduces injury of co-cultured neurons // Neurosci. Lett. 1999. Vol.277. №3. P. 193-197.

182. Xu L., Ouyang Y.B., Giffard R.G. Geldanamycin reduces necrotic and apoptotic injury due tooxygen-glucose deprivation in astrocytes // Neurol. Res. 2003. Vol.25. №7. P. 697-700.

183. Yang R.C., Yang S.L, Chen S.W., Lai S.L., Chen S.S., Chiang C.S. Previous heat shock treatment attenuates bicuculline-induced convulsions in rats // Exp. Brain Res. 1996. Vol.108. №1. P. 18-22.

184. Yang T., Hsu C., Liao W., Chuang J.S. Heat shock protein 70 expression in epilepsy suggests stress rather than protection // Acta. Neuropathol. 2008. Vol.115. №2. P. 219-230.

185. Yang Y., Turner R.S., Gaut J.R. The chaperone BiP/GRP78 binds to amyloid precursor protein and decrease Abeta40 and Abeta42 secretion // J. Biol. Chem.1998. Vol.273. №40. P. 25552-25555.

186. Yao K., Rao H., Wu R., Tang X., Xu W. Expression of Hsp70 and Hsp27 in lens epithelial cells in contused eye of rat modulated by thermotolerance or quercetin // Molecular Vision. 2006. Vol.12. P. 445-450.

187. Yenari M.A., Fink S.L., Sun G.H., Chang L.K., Patel M.K., Kunis D.M., Onley D., Ho D.Y., Sapolsky R.M., Steinberg G.K. Gene therapy with HSP72 is neuroprotective in rat models of stroke and epilepsy // Ann. Neurol. 1998. Vol.44. №4. P. 584-591.

188. Yenari M.A., Giffard R.G., Sapolsky R.M., Steinberg G.K. The neuroprotective potential of heat shock protein 70 (HSP70) // Mol. Med. Today1999. Vol.5. №12. P. 525-531.

189. Yu Q., Kent C.R., Tytell M. Retinal uptake of intravitreally injected Hsc/Hsp70 and its effect on susceptibility to light damage // Mol. Vis. 2001. Vol.7. P. 48-56.

190. Zheng Z., Kim J.Y., Ma H., Lee J.E., Yenari M.A. Anti-inflammatory effects of the 70 kDa heat shock protein in experimental stroke // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2007. Vol.28. №1. P. 53-63.

191. Zitvogel L., Fernandez N., Lozier A., Wolfers J., Regnault A., Raposo G., Amigorena S. Dendritic cells or their exosomes are effective biotherapies of cancer // Eur. J. Cancer. 1999. Vol.35. №3. P. 36-38.

Информация о работе

Ницинская, Лариса Евгеньевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Изучение противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в моделях генерализованной эпилепсии у крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы